JP2006056879A - Insulin resistance-improving agent and method for screening the same - Google Patents

Insulin resistance-improving agent and method for screening the same Download PDF

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Masahito Kasuga
雅人 春日
Hiroshi Sakagami
浩 阪上
Takehiro Nakamura
武寛 中村
Yasushi Matsuki
泰 松木
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Kobe University NUC
Sumitomo Chemical Co Ltd
Sumitomo Pharma Co Ltd
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Kobe University NUC
Sumitomo Dainippon Pharma Co Ltd
Sumitomo Chemical Co Ltd
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Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide an insulin resistance-improving agent having a new action mechanism. <P>SOLUTION: This insulin resistance-improving agent containing a substance for accelerating the decrease of number of fat cells; a method for screening a substance capable of improving the insulin resistance comprises the evaluation of whether the tested substance accelerates the decrease of number of the fat cells or not; and an apoptosis-inducing agent containing a prescribed purine derivative are provided. <P>COPYRIGHT: (C)2006,JPO&NCIPI

Description

本発明は、インスリン抵抗性の改善剤、及びそのスクリーニング方法などに関する。   The present invention relates to an insulin sensitizer and a screening method thereof.

肥満、２型糖尿病の世界的な多発は、健康上の重要な問題である。肥満はまた、インスリン抵抗性を主に伴う２型糖尿病の発症リスクを増加させる。肥満における脂肪組織重量の増加は、エネルギー摂取と消費との間の慢性的な不均衡から生じる。肥満における脂肪組織重量の増加は、しばしば、細胞サイズの増加（脂肪細胞の肥大）、細胞数の増加（脂肪細胞の過形成）を伴うことが知られている。また、脂肪組織は、その多寡により生体の糖代謝維持に重要な役割を果たし、構成する脂肪細胞のサイズにより生体の糖代謝に与える影響が異なること、並びに個々の脂肪細胞には、ヒトを含め哺乳動物において、その大きさには限界があることが知られている。   The worldwide incidence of obesity and type 2 diabetes is an important health problem. Obesity also increases the risk of developing type 2 diabetes mainly associated with insulin resistance. The increase in adipose tissue weight in obesity results from a chronic imbalance between energy intake and consumption. It is known that an increase in adipose tissue weight in obesity is often accompanied by an increase in cell size (adipocyte hypertrophy) and an increase in cell number (adipocyte hyperplasia). In addition, adipose tissue plays an important role in maintaining glucose metabolism in the body due to its size, and the influence on the glucose metabolism in the living body varies depending on the size of the adipocytes, and individual fat cells include humans. It is known that the size of mammals is limited.

具体的には、現在までに、脂肪細胞と生体の糖代謝との関係について、下記の通り報告がなされている。
例えば、非特許文献１には、非常に多彩な分泌タンパク(アディポサイトカイン)が脂肪組織から産生・分泌されていること、並びに脂肪細胞の肥大化によりその産生・分泌バランスが破綻し、糖尿病などの生活習慣病発症・進展に深く関わっていることが記載されている。
非特許文献２には、内臓脂肪が過剰に蓄積したモデルマウスでは、糖尿病、高脂血症、血圧上昇などの代謝異常を引き起こすことが記載されている。
非特許文献３には、脂肪組織が完全に欠如している脂肪萎縮性糖尿病では、著明なインスリン血症、高遊離脂肪酸血症、インスリン抵抗性を示すことが記載されている。
非特許文献４には、インスリン抵抗性改善薬のチアゾリジン誘導体が、PPARγを介して肥大した脂肪細胞を小型化することが記載されている。
非特許文献５には、ｐ２７Ｋｉｐ１又はｐ２１Ｃｉｐ１ノックアウトマウスでは、脂肪細胞数が多いこと、および加齢に伴い肥満し、耐糖能異常を示すこと、並びにｐ２７Ｋｉｐ１及びｐ２１Ｃｉｐ１のダブルノックアウトマウスでは、脂肪細胞数が６倍になり、それぞれのシングルノックアウトマウスより著明な肥満と耐糖能異常を起こすことが記載されている。
特許文献１には、サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）５阻害剤であるオロモウシン、ロスコビチン、プルバラノールＡがインスリン分泌促進作用を有し、糖尿病治療薬として有用であり得ることが記載されている。 Specifically, to date, the following reports have been made on the relationship between adipocytes and biological sugar metabolism.
For example, Non-Patent Document 1 discloses that a wide variety of secreted proteins (adipocytokines) are produced and secreted from adipose tissue, and that the production and secretion balance is broken due to the enlargement of adipocytes. It is described that it is deeply involved in the development and progression of lifestyle-related diseases.
Non-Patent Document 2 describes that a model mouse in which visceral fat has accumulated excessively causes metabolic abnormalities such as diabetes, hyperlipidemia, and increased blood pressure.
Non-Patent Document 3 describes that lipoatrophic diabetes completely lacking adipose tissue exhibits marked insulinemia, high free fatty acidemia, and insulin resistance.
Non-Patent Document 4 describes that a thiazolidine derivative, which is an insulin sensitizer, reduces the size of adipocytes that are enlarged through PPARγ.
Non-Patent Document 5 discloses that p27 Kip1 or p21 Cip1 knockout mice have a large number of adipocytes, become obese with aging, exhibit abnormal glucose tolerance, and in p27 Kip1 and p21 Cip1 double knockout mice, It has been described that the number of fat cells becomes 6 times, and obesity and glucose intolerance are markedly greater than each single knockout mouse.
Patent Document 1 describes that olomoucine, roscovitine, and purvalanol A, which are cyclin-dependent kinase (CDK) 5 inhibitors, have an insulin secretion promoting action and can be useful as a therapeutic drug for diabetes.

しかしながら、このような脂肪組織がその総量を増加させる病態（肥満）において、脂肪細胞数が増加すること（増殖）が、生体の糖代謝にどのような影響を与えるかは明らかではない。
特開2004-339157号公報 前田和久 Adiposcience Vol.1 No.1 p.33 (2004) 益崎裕章 Molecular Medicine Vol.39 No.4 p.464 (2002) 海老原健 Molecular Medicine Vol.39 No.4 p.456 (2002) 山内敏正 最新医学 Vol.149 p.1773 (2003) Paul et al., KEYSTONE SYMPOSIA, Molecular Control of Adipogenesis and Obesity (x2)March 4-10, 2004, Abstract Book, p.186, Abstract No.122 However, it is not clear how the increase in the number of adipocytes (growth) affects the sugar metabolism of the living body in the pathological condition (obesity) in which the adipose tissue increases its total amount.
JP 2004-339157 A Kazuhisa Maeda Adiposcience Vol.1 No.1 p.33 (2004) Hiroaki Masasaki Molecular Medicine Vol.39 No.4 p.464 (2002) Ken Ebihara Molecular Medicine Vol.39 No.4 p.456 (2002) Toshimasa Yamauchi Latest Medicine Vol.149 p.1773 (2003) Paul et al., KEYSTONE SYMPOSIA, Molecular Control of Adipogenesis and Obesity (x2) March 4-10, 2004, Abstract Book, p.186, Abstract No.122

インスリン抵抗性の発症機序の解明は、糖尿病などに対する新たな作用機序を有する医薬品の開発につながる。本発明は、インスリン抵抗性の改善剤、及びそのスクリーニング方法などを提供することを目的とする。   The elucidation of the pathogenesis of insulin resistance leads to the development of a drug having a new mechanism of action against diabetes and the like. An object of the present invention is to provide an insulin resistance improving agent, a screening method thereof, and the like.

本発明者らは、ロスコビチン(Roscovitine) をマウスに投与したところ、インスリン抵抗性が顕著に改善することを見出した。そこで、ロスコビチンのどのような性質がインスリン抵抗性の改善に寄与したのかを考察したところ、非特許文献５の知見（上述）より、ロスコビチンが脂肪細胞のサイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）を阻害することで、脂肪細胞の増殖を抑制し、脂肪細胞数の低下をもたらすことにより、インスリン抵抗性が改善する可能性が想定された。そこで、かかる仮説を実験により検証したところ、実際に、脂肪細胞ＣＤＫの阻害により、インスリン抵抗性を改善し得ることが明らかとなった。   The present inventors have found that insulin resistance is markedly improved when roscovitine is administered to mice. Then, when what kind of property of roscovitine contributed to the improvement of insulin resistance was examined, from the knowledge of nonpatent literature 5 (above), roscovitine inhibits cyclin dependent kinase (CDK) of adipocytes. Thus, it was assumed that insulin resistance could be improved by suppressing the proliferation of fat cells and causing a decrease in the number of fat cells. Thus, when this hypothesis was verified by experiment, it was found that insulin resistance can actually be improved by inhibiting adipocyte CDK.

また、ロスコビチンの作用についてさらに詳細に検討したところ、驚くべきことに、ロスコビチンは細胞増殖抑制活性のみならず、脂肪細胞特異的なアポトーシス誘導活性をも有することを見出した。従って、本発明者らが今回確認したインスリン抵抗性の顕著な改善は、ロスコビチンが細胞増殖抑制活性、アポトーシス誘導活性を併有するためであると考えられた。また、ロスコビチンに限らず、ロスコビチンと類似の化合物は、細胞増殖抑制活性および脂肪細胞特異的なアポトーシス誘導活性を有すると考えられるので、かかる化合物は、インスリン抵抗性の改善剤として興味深い。   Further, when the action of roscovitine was examined in more detail, it was surprisingly found that roscovitine has not only a cell growth inhibitory activity but also an adipocyte-specific apoptosis inducing activity. Therefore, the remarkable improvement in insulin resistance confirmed by the present inventors was thought to be because roscovitine has both cell growth inhibitory activity and apoptosis-inducing activity. Further, not only roscovitine but also compounds similar to roscovitine are considered to have cytostatic activity and adipocyte-specific apoptosis-inducing activity, and therefore such compounds are interesting as agents for improving insulin resistance.

以上より、本発明者らは、脂肪細胞ＣＤＫを阻害する物質が、インスリン抵抗性を予防・治療し得る物質であること、並びにインスリン抵抗性を予防・治療し得る物質を開発するためには、脂肪細胞ＣＤＫを阻害する物質をスクリーニングすればよいことを着想した。   From the above, the present inventors have developed a substance capable of preventing / treating insulin resistance, and a substance capable of preventing / treating insulin resistance, as a substance that inhibits adipocyte CDK. The idea was to screen for substances that inhibit adipocyte CDK.

以上の着想に基づき、本発明者らは、本発明を完成するに至った。即ち、本発明は下記の通りである：
（１）脂肪細胞数の低下を促進する物質を含有してなる、インスリン抵抗性の改善剤；
（２）脂肪細胞数の低下を促進する物質が、前駆細胞から脂肪細胞への分化を抑制し得る物質、または脂肪細胞のアポトーシスを誘導し得る物質である、上記（１）の剤；
（３）脂肪細胞数の低下を促進する物質が、ＣＤＫの発現又は活性を抑制する物質である、上記（１）の剤；
（４）ＣＤＫの発現又は活性を抑制する物質が、以下（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）のいずれかである、上記（３）の剤：
（ｉ）ＣＤＫアンチセンス核酸、ＣＤＫリボザイム、ＣＤＫデコイ核酸、ＣＤＫ ｓｉＲ
ＮＡ、ＣＤＫ抗体、およびＣＤＫ抗体をコードする核酸からなる群より選ばれるＣＤＫの発現を抑制する物質；
（ｉｉ）ドミナントネガティブ変異体、および当該変異体をコードする核酸からなる群より選ばれるＣＤＫの活性を抑制する物質；あるいは
（ｉｉｉ）（ｉ）、（ｉｉ）のいずれかの核酸を含む発現ベクター；
（５）ＣＤＫが、ＣＤＫ１、ＣＤＫ２、ＣＤＫ５またはＣＤＫ７である、上記（３）の剤；
（６）脂肪細胞数の低下を促進する物質が、下記式（Ｉ）： Based on the above idea, the present inventors have completed the present invention. That is, the present invention is as follows:
(1) An insulin resistance improving agent comprising a substance that promotes a decrease in the number of fat cells;
(2) The agent according to (1) above, wherein the substance that promotes a decrease in the number of adipocytes is a substance that can suppress differentiation of progenitor cells into adipocytes, or a substance that can induce apoptosis of adipocytes;
(3) The agent according to (1) above, wherein the substance that promotes a decrease in the number of fat cells is a substance that suppresses the expression or activity of CDK;
(4) The agent of (3) above, wherein the substance that suppresses the expression or activity of CDK is any one of (i), (ii), and (iii) below:
(I) CDK antisense nucleic acid, CDK ribozyme, CDK decoy nucleic acid, CDK siR
A substance that suppresses the expression of CDK selected from the group consisting of NA, a CDK antibody, and a nucleic acid encoding a CDK antibody;
(Ii) a substance that suppresses the activity of CDK selected from the group consisting of a dominant negative mutant and a nucleic acid encoding the mutant; or (iii) an expression vector comprising any nucleic acid of (i) or (ii) ;
(5) The agent according to (3) above, wherein the CDK is CDK1, CDK2, CDK5 or CDK7;
(6) A substance that promotes a decrease in the number of fat cells is represented by the following formula (I)

〔式中、Ｒ1、Ｒ２は、各々独立して、水素原子、置換されていてもよいＣ１ 〜Ｃ８アルキル基、置換されていてもよいＣ２〜Ｃ８アルケニル基、置換されていてもよいＣ２ 〜Ｃ８アルキニル基、置換されていてもよいＣ１〜Ｃ８アシル基、置換されていてもよい芳香族または非芳香族のＣ３〜Ｃ１４炭化水素環基、あるいは置換されていてもよい芳香族または非芳香族のＣ３〜Ｃ１４複素環基であり；
Ｒ３は、水素原子、置換されていてもよいＣ１〜Ｃ８アルキル基、置換されていてもよいＣ２ 〜Ｃ８アルケニル基、置換されていてもよいＣ２ 〜Ｃ８アルキニル基、置換されていてもよいＣ１ 〜Ｃ８アシル基であり；
環Ａは、置換されていてもよい芳香族または非芳香族のＣ３〜Ｃ１４炭化水素環基、あるいは置換されていてもよい芳香族または非芳香族のＣ３〜Ｃ１４複素環基であり；
Ｘは、−Ｏ−、−Ｓ−または−ＮＲ４−（式中、Ｒ４は、水素原子、置換されていてもよいＣ1 〜Ｃ８アルキル基、置換されていてもよいＣ２ 〜Ｃ８アルケニル基、置換されていてもよいＣ２〜Ｃ８アルキニル基、置換されていてもよいＣ1 〜Ｃ８アシル基、置換されていてもよい芳香族または非芳香族のＣ３〜Ｃ１４炭化水素環基、置換されていてもよい芳香族または非芳香族のＣ３〜Ｃ１４複素環基である）であり；
Ｙは、結合手または−（ＣＨ２）ｎ−（式中、ｎは１〜３である）である。〕で表される化合物、あるいはその塩である、上記（１）の剤；
（７）ＣＤＫの発現又は活性を抑制する物質が、ＣＤＫインヒビター、ＣＤＫインヒビターをコードする核酸、あるいは当該核酸を含む発現ベクターである、上記（３）の剤；
（８）ＣＤＫインヒビターがｐ２７Ｋｉｐ１またはｐ２１Ｃｉｐ１である、上記（７）の剤；
（９）脂肪細胞数の低下を促進する物質が、サイクリンの発現を抑制する物質である、上記（１）の剤；
（１０）インスリン抵抗性が肥満に起因するものである、上記（１）の剤；
（１１）被験物質が脂肪細胞数の低下を促進するか否かを評価することを含む、インスリン抵抗性を改善し得る物質のスクリーニング方法；
（１２）前駆細胞から脂肪細胞への分化を抑制し得る物質、または脂肪細胞のアポトーシスを誘導し得る物質を探索する、上記（１１）の方法；
（１３）以下の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含むＣＤＫの活性を抑制し得る物質のスクリーニング方法である、上記（１１）の方法：
（ａ）被験物質を、ＣＤＫ、サイクリンに接触させる工程；
（ｂ）上記（ａ）の工程に起因して生じるＣＤＫの活性を測定し、該活性を被験物質を接触させない場合のＣＤＫの活性と比較する工程；
（ｃ）上記（ｂ）の比較結果に基づいて、ＣＤＫの活性の抑制をもたらす被験物質を選択する工程；
（１４）ＣＤＫが、ＣＤＫ１、ＣＤＫ２、ＣＤＫ５またはＣＤＫ７である、上記（１１）の方法；
（１５）工程（ａ）において、被験物質がさらにＣＤＫインヒビターと接触される、上記（１１）の方法；
（１６）下記の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含むＣＤＫの発現を抑制し得る物質のスクリーニング方法である、上記（１１）の方法：
（ａ）被験物質を、ＣＤＫの発現を測定可能な細胞に接触させる工程；
（ｂ）被験物質を接触させた細胞におけるＣＤＫの発現量を測定し、該発現量を被験物質を接触させない対照細胞におけるＣＤＫの発現量と比較する工程；
（ｃ）上記（ｂ）の比較結果に基づいて、ＣＤＫの発現量を抑制する被験物質を選択する工程；
（１７）下記の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含むＣＤＫインヒビターの発現を促進し得る物質のスクリーニング方法である、上記（１１）の方法：
（ａ）被験物質を、ＣＤＫインヒビターの発現を測定可能な細胞に接触させる工程；
（ｂ）被験物質を接触させた細胞におけるＣＤＫインヒビターの発現量を測定し、該発現量を被験物質を接触させない対照細胞におけるＣＤＫインヒビターの発現量と比較する工程；
（ｃ）上記（ｂ）の比較結果に基づいて、ＣＤＫインヒビターの発現量を促進する被験物質を選択する工程；
（１８）ＣＤＫインヒビターが、ｐ２７Ｋｉｐ１またはｐ２１Ｃｉｐ１である、上記（１１）の方法；
（１９）下記の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含むサイクリンの発現を抑制し得る物質のスクリーニング方法である、上記（１１）の方法：
（ａ）被験物質を、サイクリンの発現を測定可能な細胞に接触させる工程；
（ｂ）被験物質を接触させた細胞におけるサイクリンの発現量を測定し、該発現量を被験物質を接触させない対照細胞におけるサイクリンの発現量と比較する工程；
（ｃ）上記（ｂ）の比較結果に基づいて、サイクリンの発現量を抑制する被験物質を選択する工程；
（２０）インスリン抵抗性が肥満に起因するものである、上記（１１）の方法；
（２１）上記（１１）〜（２０）のいずれかの方法により得られうるインスリン抵抗性を改善し得る物質；
（２２）上記式（Ｉ）で表される化合物、あるいはその塩を含有するアポトーシス誘導剤；
（２３）ＣＤＫの阻害活性をさらに有する、上記（２２）の剤；
（２４）上記式（Ｉ）で表される化合物、あるいはその医薬上許容され得る塩（但し、ＣＤＫ５阻害剤、特にオロモウシン、ロスコビチン、プルバラノールＡまたはそれらの類似体を除く）を含有する、糖尿病の予防・治療剤。 [Wherein R 1 and R 2 are each independently a hydrogen atom, an optionally substituted C 1 -C 8 alkyl group, an optionally substituted C 2 -C 8 alkenyl group, or a substituted group. which may be C 2 -C 8 alkynyl group, an optionally substituted C 1 -C 8 acyl group, an aromatic substituted or non-aromatic C 3 -C 14 hydrocarbon ring group or a substituted, An aromatic or non-aromatic C 3 to C 14 heterocyclic group which may be substituted;
R 3 is a hydrogen atom, an optionally substituted C 1 -C 8 alkyl group, an optionally substituted C 2 -C 8 alkenyl group, an optionally substituted C 2 -C 8 alkynyl group, a substituted It is be a good C 1 -C 8 acyl group;
Ring A is an optionally substituted aromatic or non-aromatic C 3 to C 14 hydrocarbon ring group, or an optionally substituted aromatic or non-aromatic C 3 to C 14 heterocyclic group. Yes;
X is —O—, —S— or —NR 4 — (wherein R 4 is a hydrogen atom, an optionally substituted C 1 -C 8 alkyl group, or an optionally substituted C 2 -C 8 alkenyl groups, optionally substituted C 2 -C 8 alkynyl groups, optionally substituted C 1 -C 8 acyl groups, optionally substituted aromatic or non-aromatic C 3 -C 14 A hydrocarbon ring group, which is an optionally substituted aromatic or non-aromatic C 3 -C 14 heterocyclic group);
Y is a bond or — (CH 2 ) n — (wherein n is 1 to 3). The agent of (1) above, which is a compound represented by the formula:
(7) The agent according to (3) above, wherein the substance that suppresses the expression or activity of CDK is a CDK inhibitor, a nucleic acid encoding a CDK inhibitor, or an expression vector containing the nucleic acid;
(8) The agent according to (7) above, wherein the CDK inhibitor is p27 Kip1 or p21 Cip1 ;
(9) The agent according to (1) above, wherein the substance that promotes a decrease in the number of fat cells is a substance that suppresses the expression of cyclin;
(10) The agent according to (1) above, wherein the insulin resistance is caused by obesity;
(11) A screening method for a substance that can improve insulin resistance, comprising evaluating whether a test substance promotes a decrease in the number of fat cells;
(12) The method according to (11) above, wherein a substance capable of suppressing differentiation from a progenitor cell to an adipocyte or a substance capable of inducing apoptosis of an adipocyte is searched;
(13) The method of (11) above, which is a screening method for a substance capable of suppressing the activity of CDK, comprising the following steps (a), (b) and (c):
(A) contacting the test substance with CDK or cyclin;
(B) a step of measuring the activity of CDK resulting from the step (a) and comparing the activity with the activity of CDK when not contacting the test substance;
(C) a step of selecting a test substance that brings about suppression of CDK activity based on the comparison result of (b) above;
(14) The method according to (11) above, wherein the CDK is CDK1, CDK2, CDK5 or CDK7;
(15) The method according to (11) above, wherein in step (a), the test substance is further contacted with a CDK inhibitor;
(16) The method according to (11) above, which is a screening method for a substance capable of suppressing the expression of CDK including the following steps (a), (b) and (c):
(A) contacting the test substance with a cell capable of measuring the expression of CDK;
(B) measuring the expression level of CDK in cells contacted with the test substance, and comparing the expression level with the expression level of CDK in control cells not contacted with the test substance;
(C) selecting a test substance that suppresses the expression level of CDK based on the comparison result of (b) above;
(17) The method according to (11) above, which is a screening method for a substance capable of promoting the expression of a CDK inhibitor comprising the following steps (a), (b) and (c):
(A) contacting the test substance with a cell capable of measuring the expression of a CDK inhibitor;
(B) measuring the expression level of the CDK inhibitor in the cell contacted with the test substance, and comparing the expression level with the expression level of the CDK inhibitor in the control cell not contacted with the test substance;
(C) a step of selecting a test substance that promotes the expression level of the CDK inhibitor based on the comparison result of (b) above;
(18) The method of (11) above, wherein the CDK inhibitor is p27 Kip1 or p21 Cip1 ;
(19) The method according to (11) above, which is a screening method for a substance capable of suppressing the expression of cyclin, comprising the following steps (a), (b) and (c):
(A) contacting the test substance with a cell capable of measuring cyclin expression;
(B) measuring the expression level of cyclin in a cell contacted with a test substance, and comparing the expression level with the expression level of cyclin in a control cell not contacted with the test substance;
(C) a step of selecting a test substance that suppresses the expression level of cyclin based on the comparison result of (b) above;
(20) The method of (11) above, wherein the insulin resistance is caused by obesity;
(21) a substance capable of improving insulin resistance obtainable by any one of the above methods (11) to (20);
(22) An apoptosis inducer containing a compound represented by the above formula (I) or a salt thereof;
(23) The agent according to the above (22), further having a CDK inhibitory activity;
(24) A diabetic compound comprising a compound represented by the above formula (I) or a pharmaceutically acceptable salt thereof (excluding a CDK5 inhibitor, particularly olomoucine, roscovitine, purvalanol A or an analog thereof). Prophylactic / therapeutic agent.

本発明の改善剤は、ＣＤＫ阻害因子の発現・活性の調節という新規作用機序によりインスリン抵抗性の改善が所望される疾患・状態の予防・治療に有用である。本発明のスクリーニング方法は、インスリン抵抗性を改善し得る物質の開発を可能とするため有用である。本発明の化合物又はその塩は、アポトーシス誘導作用により、あるいはアポトーシス誘導作用とＣＤＫの阻害作用との相乗効果により、糖尿病等の疾患の予防・治療、あるいは研究用試薬などに有用である。   The ameliorating agent of the present invention is useful for the prophylaxis or treatment of diseases / conditions in which improvement of insulin resistance is desired by a novel mechanism of action of regulating the expression / activity of CDK inhibitors. The screening method of the present invention is useful because it enables the development of a substance that can improve insulin resistance. The compound of the present invention or a salt thereof is useful for the prevention / treatment of diseases such as diabetes or a research reagent by the apoptosis-inducing action or the synergistic effect of the apoptosis-inducing action and CDK-inhibiting action.

１．インスリン抵抗性の改善剤
本発明は、脂肪細胞数の低下を促進する物質を含有してなる、インスリン抵抗性の改善剤を提供する。 1. Insulin resistance improving agent The present invention provides an insulin resistance improving agent comprising a substance that promotes a decrease in the number of fat cells.

脂肪細胞は、任意の動物の細胞であり得るが、哺乳動物の細胞が好ましい。本明細書中で使用される場合、「哺乳動物」としては、例えば、霊長類、実験用動物、家畜、ペット等が挙げられ特に限定されるものではないが、具体的には、ヒト、サル、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ネコなどである。   The adipocytes can be any animal cell, but mammalian cells are preferred. As used herein, “mammal” includes, for example, primates, laboratory animals, domestic animals, pets and the like, and is not particularly limited. Rat, mouse, guinea pig, rabbit, horse, cow, goat, sheep, dog, cat and the like.

本明細書中で使用される場合、「インスリン抵抗性」とは、生体においてインスリンに対する感受性が損なわれている状態をいう。インスリン抵抗性としては、肥満により誘導されるもの、遺伝的素因によるものなどが挙げられる。肥満により誘導されるインスリン抵抗性に限らず、その他の原因によるものも、脂肪細胞数の低下によりその症状が間接的に緩和し得ると考えられるためである。勿論、より直接的に病因を攻略するという観点からは、肥満により誘導されるインスリン抵抗性が好ましい。   As used herein, “insulin resistance” refers to a state in which sensitivity to insulin is impaired in a living body. Insulin resistance includes those induced by obesity and those due to genetic predisposition. This is because not only insulin resistance induced by obesity but also other causes can be indirectly alleviated by a decrease in the number of fat cells. Of course, insulin resistance induced by obesity is preferable from the viewpoint of more directly capturing the etiology.

脂肪細胞数の低下を促進する物質は、脂肪細胞数を減少させる物質である限り特に限定されない。脂肪細胞数の低下を促進する物質としては、例えば、脂肪細胞分化を抑制する物質、脂肪細胞にアポトーシスを誘導する物質、脂肪細胞の脱分化を促進する物質などが挙げられるが、なかでも脂肪細胞分化を抑制する物質、脂肪細胞にアポトーシスを誘導する物質が好ましい。   The substance that promotes the decrease in the number of fat cells is not particularly limited as long as it is a substance that decreases the number of fat cells. Examples of the substance that promotes the decrease in the number of fat cells include a substance that suppresses adipocyte differentiation, a substance that induces apoptosis in fat cells, and a substance that promotes dedifferentiation of fat cells. Substances that suppress differentiation and substances that induce apoptosis in adipocytes are preferred.

脂肪細胞分化を抑制する物質は、脂肪細胞の前駆細胞から脂肪細胞への分化を阻害するものである限り特に限定されない。脂肪細胞分化を抑制する物質としては、例えば、サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）の発現又は活性を抑制する物質、サイクリンの発現又は活性を抑制する物質などが挙げられる。   The substance that suppresses adipocyte differentiation is not particularly limited as long as it inhibits the differentiation of adipocyte precursor cells into adipocytes. Examples of substances that suppress adipocyte differentiation include substances that suppress the expression or activity of cyclin-dependent kinase (CDK), substances that suppress the expression or activity of cyclin, and the like.

本明細書中で使用される場合、「発現」とは、蛋白質が産生され且つ機能的な状態でその作用部位に局在することをいう。従って、「発現を抑制する物質」は、遺伝子の転写、転写後調節、蛋白質への翻訳、翻訳後修飾、局在化（即ち、核内移行）及び蛋白質フォールディング等の、いかなる段階で作用するものであってもよい。一方、「活性を抑制する物質」とは、核内に移行した蛋白質に作用して、当該蛋白質の作用を妨げる物質をいう。   As used herein, “expression” means that a protein is produced and functionally localized at its site of action. Therefore, a “substance that suppresses expression” acts at any stage of gene transcription, post-transcriptional regulation, translation into protein, post-translational modification, localization (ie, nuclear translocation) and protein folding. It may be. On the other hand, the “substance that suppresses activity” refers to a substance that acts on a protein transferred into the nucleus and prevents the action of the protein.

（ＣＤＫの発現を抑制する物質）
脂肪細胞分化を抑制する物質は、ＣＤＫの発現を抑制する物質であり得る。 (Substance that suppresses CDK expression)
The substance that suppresses adipocyte differentiation can be a substance that suppresses the expression of CDK.

サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）は、サイクリンと結合して活性化される酵素である。ＣＤＫとしてはＣＤＫ１〜ＣＤＫ１１が挙げられるが、なかでもロスコビチンにより活性が阻害されるＣＤＫ１、ＣＤＫ２、ＣＤＫ５、ＣＤＫ７(J. Virol. 78(6): 2853 (2004)) が好ましい。   Cyclin-dependent kinases (CDKs) are enzymes that are activated by binding to cyclins. Examples of CDK include CDK1 to CDK11. Among them, CDK1, CDK2, CDK5, and CDK7 (J. Virol. 78 (6): 2853 (2004)) whose activity is inhibited by roscovitine are preferable.

具体的には、ＣＤＫの発現を抑制する物質としては、転写抑制因子、ＲＮＡポリメラーゼ阻害剤、ＲＮＡ分解酵素、蛋白質合成阻害剤、核内移行阻害剤、蛋白質分解酵素、蛋白質変性剤等が例示されるが、細胞内で発現する他の遺伝子・蛋白質に及ぼす悪影響を最小限にするためには、標的分子に特異的に作用し得る物質であることが重要である。   Specifically, examples of substances that suppress CDK expression include transcriptional repressors, RNA polymerase inhibitors, RNases, protein synthesis inhibitors, nuclear translocation inhibitors, proteolytic enzymes, and protein denaturing agents. However, in order to minimize the adverse effects on other genes and proteins expressed in cells, it is important that the substance be able to act specifically on the target molecule.

ＣＤＫの発現を抑制する物質の好ましい一態様は、ＣＤＫのｍＲＮＡもしくは初期転写産物のアンチセンス核酸である。「アンチセンス核酸」とは、標的ｍＲＮＡ（初期転写産物）を発現する細胞の生理的条件下で該標的ｍＲＮＡ（初期転写産物）とハイブリダイズし得る塩基配列からなり、且つハイブリダイズした状態で該標的ｍＲＮＡ（初期転写産物）にコードされるポリペプチドの翻訳を阻害し得る核酸をいう。アンチセンス核酸の種類はＤＮＡであってもＲＮＡであってもよいし、あるいはＤＮＡ／ＲＮＡキメラであってもよい。また、天然型のアンチセンス核酸は、細胞中に存在する核酸分解酵素によってそのリン酸ジエステル結合が容易に分解されるので、本発明のアンチセンス核酸は、分解酵素に安定なチオリン酸型（リン酸結合のＰ＝ＯをＰ＝Ｓに置換）や２’-Ｏ-メチル型等の修飾ヌクレオチドを用いて合成もできる。アンチセンス核酸の設計に重要な他の要素として、水溶性及び細胞膜透過性を高めること等が挙げられるが、これらはリポソームやマイクロスフェアを使用するなどの剤形の工夫によっても克服できる。   A preferred embodiment of the substance that suppresses the expression of CDK is an antisense nucleic acid of CDK mRNA or early transcription product. “Antisense nucleic acid” means a nucleotide sequence that can hybridize to the target mRNA (initial transcript) under physiological conditions of a cell that expresses the target mRNA (early transcript), and A nucleic acid capable of inhibiting translation of a polypeptide encoded by a target mRNA (early transcript). The type of the antisense nucleic acid may be DNA or RNA, or may be a DNA / RNA chimera. In addition, since the phosphodiester bond of a natural type antisense nucleic acid is easily degraded by a nucleolytic enzyme present in cells, the antisense nucleic acid of the present invention has a thiophosphate type (phosphorus) that is stable to the degrading enzyme. It is also possible to synthesize using modified nucleotides such as P′O of acid bond and P═S) or 2′-O-methyl type. Other important factors for the design of antisense nucleic acid include enhancement of water solubility and cell membrane permeability. These can also be overcome by devising dosage forms such as the use of liposomes and microspheres.

アンチセンス核酸の長さは、ＣＤＫのｍＲＮＡもしくは初期転写産物と特異的にハイブリダイズし得る限り特に制限はなく、短いもので約１５塩基程度、長いものでｍＲＮＡ（初期転写産物）の全配列に相補的な配列を含むような配列であってもよい。合成の容易さや抗原性の問題等から、例えば約１５塩基以上、好ましくは約１５〜約３０塩基からなるオリゴヌクレオチドが例示される。   The length of the antisense nucleic acid is not particularly limited as long as it can specifically hybridize with the CDK mRNA or initial transcription product. The short nucleic acid length is about 15 bases, and the long one is complementary to the entire mRNA (initial transcription product) sequence. Such a sequence may be included. From the viewpoint of ease of synthesis, antigenicity problems, etc., for example, oligonucleotides comprising about 15 bases or more, preferably about 15 to about 30 bases are exemplified.

アンチセンス核酸の標的配列は、アンチセンス核酸がハイブリダイズすることにより、ＣＤＫもしくはその機能的断片の翻訳が阻害される配列であれば特に制限はなく、ＣＤＫのｍＲＮＡの全配列であっても部分配列であってもよいし、あるいは初期転写産物のイントロン部分であってもよいが、アンチセンス核酸としてオリゴヌクレオチドを使用する場合は、標的配列はＣＤＫのｍＲＮＡの５’末端からコード領域のＣ末端までに位置することが望ましい。   The target sequence of the antisense nucleic acid is not particularly limited as long as the antisense nucleic acid is hybridized to inhibit the translation of CDK or a functional fragment thereof. It may be a sequence or an intron portion of an initial transcript, but when an oligonucleotide is used as an antisense nucleic acid, the target sequence is from the 5 ′ end of the CDK mRNA to the C terminus of the coding region. It is desirable to be located by.

さらに、アンチセンス核酸は、ＣＤＫのｍＲＮＡもしくは初期転写産物とハイブリダイズして翻訳を阻害するだけでなく、二本鎖ＤＮＡであるＣＤＫ遺伝子と結合して三重鎖（トリプレックス）を形成し、ｍＲＮＡへの転写を阻害し得るものであってもよい。   Furthermore, antisense nucleic acids not only hybridize with CDK mRNA or initial transcription products to inhibit translation, but also bind to CDK gene, which is a double-stranded DNA, to form a triplex. It may be one that can inhibit transcription into the.

ＣＤＫの発現を抑制する物質の別の好ましい一態様は、ＣＤＫのｍＲＮＡもしくは初期転写産物を、コード領域の内部（初期転写産物の場合はイントロン部分を含む）で特異的に切断し得るリボザイムである。「リボザイム」とは核酸を切断する酵素活性を有するＲＮＡをいうが、最近では当該酵素活性部位の塩基配列を有するオリゴＤＮＡも同様に核酸切断活性を有することが明らかになっているので、本発明では配列特異的な核酸切断活性を有する限りＤＮＡをも包含する概念として用いるものとする。リボザイムとして最も汎用性の高いものとしては、ウイロイドやウイルソイド等の感染性ＲＮＡに見られるセルフスプライシングＲＮＡがあり、ハンマーヘッド型やヘアピン型等が知られている。また、リボザイムを、それをコードするＤＮＡを含む発現ベクターの形態で使用する場合には、細胞質への移行を促進するために、ｔＲＮＡを改変した配列をさらに連結したハイブリッドリボザイムとすることもできる［Nucleic Acids Res., 29(13): 2780-2788 (2001)］。   Another preferred embodiment of the substance that suppresses the expression of CDK is a ribozyme capable of specifically cleaving the CDK mRNA or the initial transcription product within the coding region (including the intron portion in the case of the initial transcription product). . “Ribozyme” refers to RNA having an enzyme activity for cleaving nucleic acids, but recently it has been clarified that oligo DNA having the base sequence of the enzyme active site also has a nucleic acid cleaving activity. Then, as long as it has sequence-specific nucleic acid cleavage activity, it will be used as a concept including DNA. The most versatile ribozyme is self-splicing RNA found in infectious RNA such as viroid and virusoid, and the hammerhead type and hairpin type are known. Further, when the ribozyme is used in the form of an expression vector containing DNA encoding the ribozyme, it can be a hybrid ribozyme in which a sequence modified with tRNA is further linked in order to promote the transfer to the cytoplasm [ Nucleic Acids Res., 29 (13): 2780-2788 (2001)].

ＣＤＫの発現を抑制する物質のさらに別の態様は、デコイ核酸である。デコイ核酸とは、転写調節因子が結合する領域を模倣する核酸分子をいい、ＣＤＫの発現を抑制する物質としてのデコイ核酸は、ＣＤＫに対する転写活性化因子が結合する領域を模倣する核酸分子であり得る。ＣＤＫに対する転写活性化因子としては、例えば、p53、Sp1（J. Biol. Chem. 271(21): 12199 (1996)）が挙げられる。   Yet another embodiment of the substance that suppresses the expression of CDK is a decoy nucleic acid. A decoy nucleic acid refers to a nucleic acid molecule that mimics a region to which a transcriptional regulatory factor binds. A decoy nucleic acid as a substance that suppresses CDK expression is a nucleic acid molecule that mimics a region to which a transcriptional activator for CDK binds. obtain. Examples of transcription activators for CDK include p53, Sp1 (J. Biol. Chem. 271 (21): 12199 (1996)).

デコイ核酸としては、例えば、リン酸ジエステル結合部分の酸素原子を硫黄原子で置換したチオリン酸ジエステル結合を有するオリゴヌクレオチド（Ｓ−オリゴ）、又はリン酸ジエステル結合を電荷を持たないメチルホスフェート基で置換したオリゴヌクレオチドなど、生体内でオリゴヌクレオチドが分解を受けにくくするために改変したオリゴヌクレオチドなどが挙げられる。デコイ核酸は転写活性化因子が結合する領域と完全に一致していてもよいが、ＣＤＫに対する転写活性化因子が結合し得る程度の同一性を保持していればよい。デコイ核酸の長さは転写活性化因子が結合する限り特に制限されない。また、デコイ核酸は、同一領域を反復して含んでいてもよい。   As a decoy nucleic acid, for example, an oligonucleotide (S-oligo) having a thiophosphate diester bond in which the oxygen atom of the phosphodiester bond portion is replaced with a sulfur atom, or a phosphodiester bond is replaced with an uncharged methyl phosphate group And oligonucleotides modified to make the oligonucleotide less susceptible to degradation in vivo. The decoy nucleic acid may completely coincide with the region to which the transcriptional activator binds, but it is sufficient that the decoy nucleic acid retains the identity that allows the transcriptional activator to bind to CDK. The length of the decoy nucleic acid is not particularly limited as long as a transcriptional activator binds. The decoy nucleic acid may contain the same region repeatedly.

ＣＤＫの発現を抑制する物質のさらに別の一態様は、ＣＤＫのｍＲＮＡもしくは初期転写産物のコード領域内の部分配列（初期転写産物の場合はイントロン部分を含む）に相補的な二本鎖オリゴＲＮＡ、いわゆるｓｉＲＮＡである。短い二本鎖ＲＮＡを細胞内に導入するとそのＲＮＡに相補的なｍＲＮＡが分解される、いわゆるＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）と呼ばれる現象は、以前から線虫、昆虫、植物等で知られていたが、最近、この現象が動物細胞でも起こることが確認されたことから［Nature, 411(6836): 494-498 (2001)］、リボザイムの代替技術として注目されている。ｓｉＲＮＡとしては、後述の通り自ら合成したものを使用できるが、市販のものを用いてもよい。ｓｉＲＮＡとしては、例えば、ＣＤＫ２に対するものが報告されている（J Exp Ther Oncol., 3(4), 194-204 (2003)）。   Yet another embodiment of the substance that suppresses the expression of CDK is a double-stranded oligo RNA complementary to a partial sequence (including an intron portion in the case of the initial transcript) of CDK mRNA or the coding region of the initial transcript. , So-called siRNA. When a short double-stranded RNA is introduced into a cell, a phenomenon called RNA interference (RNAi), in which mRNA complementary to the RNA is degraded, has been known in nematodes, insects, plants, etc. Recently, it has been confirmed that this phenomenon also occurs in animal cells [Nature, 411 (6836): 494-498 (2001)], and has attracted attention as an alternative to ribozyme. As siRNA, one synthesized by itself can be used as described later, but a commercially available one may be used. For example, siRNA against CDK2 has been reported (J Exp Ther Oncol., 3 (4), 194-204 (2003)).

アンチセンスオリゴヌクレオチド及びリボザイムは、ＣＤＫのｃＤＮＡ配列もしくはゲノミックＤＮＡ配列に基づいてｍＲＮＡもしくは初期転写産物の標的配列を決定し、市販のＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機（アプライド・バイオシステムズ社、ベックマン社等）を用いて、これに相補的な配列を合成することにより調製できる。デコイ核酸、ｓｉＲＮＡは、センス鎖及びアンチセンス鎖をＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機でそれぞれ合成し、適当なアニーリング緩衝液中、約９０〜約９５℃で約１分程度変性させた後、約３０〜約７０℃で約１〜約８時間アニーリングさせることにより調製できる。また、相補的なオリゴヌクレオチド鎖を交互にオーバーラップするように合成して、これらをアニーリングさせた後リガーゼでライゲーションすることにより、より長い二本鎖ポリヌクレオチドを調製できる。   Antisense oligonucleotides and ribozymes determine mRNA or initial transcript target sequences based on CDK cDNA or genomic DNA sequences, and commercially available DNA / RNA automatic synthesizers (Applied Biosystems, Beckman, etc.) Can be prepared by synthesizing a complementary sequence thereto. For decoy nucleic acid and siRNA, the sense strand and the antisense strand were respectively synthesized by a DNA / RNA automatic synthesizer, denatured at about 90 to about 95 ° C. for about 1 minute in an appropriate annealing buffer, and then about 30 to It can be prepared by annealing at about 70 ° C. for about 1 to about 8 hours. In addition, longer double-stranded polynucleotides can be prepared by synthesizing complementary oligonucleotide strands so as to overlap each other, annealing them, and ligating with ligase.

ＣＤＫの発現を抑制する物質の他の好ましい態様は、ＣＤＫ抗体である。ＣＤＫ抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれであってもよく、周知の免疫学的手法により作製できる。また、ＣＤＫ抗体は、抗体のフラグメント（例えば、Fab、F(ab’)2）、組換え抗体（例えば、単鎖抗体）であってもよい。さらに、ＣＤＫ抗体をコードする核酸もまた、ＣＤＫの発現を抑制する物質として好ましい。 Another preferred embodiment of the substance that suppresses the expression of CDK is a CDK antibody. The CDK antibody may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody, and can be prepared by a well-known immunological technique. The CDK antibody may be an antibody fragment (eg, Fab, F (ab ′) 2 ) or a recombinant antibody (eg, a single chain antibody). Furthermore, a nucleic acid encoding a CDK antibody is also preferable as a substance that suppresses the expression of CDK.

例えば、ポリクローナル抗体は、ＣＤＫあるいはそのフラグメント（必要に応じて、ウシ血清アルブミン、ＫＬＨ（Keyhole Limpet Hemocyanin）等のキャリア蛋白質に架橋した複合体とすることもできる）を抗原として、市販のアジュバント（例えば、完全または不完全フロイントアジュバント）とともに、動物の皮下あるいは腹腔内に２〜３週間おきに２〜４回程度投与し（部分採血した血清の抗体価を公知の抗原抗体反応により測定し、その上昇を確認しておく）、最終免疫から約３〜約１０日後に全血を採取して抗血清を精製することにより取得できる。抗原を投与する動物としては、ラット、マウス、ウサギ、ヤギ、モルモット、ハムスターなどの哺乳動物が挙げられる。   For example, a polyclonal antibody can be obtained by using a commercially available adjuvant (eg, a complex cross-linked to a carrier protein such as bovine serum albumin or KLH (Keyhole Limpet Hemocyanin) as an antigen, using CDK or a fragment thereof as necessary. And complete or incomplete Freund's adjuvant) administered subcutaneously or intraperitoneally 2-4 times every 2 to 3 weeks (the antibody titer of the partially collected serum is measured by a known antigen-antibody reaction, and its rise It can be obtained by collecting whole blood about 3 to about 10 days after the final immunization and purifying the antiserum. Examples of animals to which the antigen is administered include mammals such as rats, mice, rabbits, goats, guinea pigs, and hamsters.

また、モノクローナル抗体は、細胞融合法（例えば、渡邊武、細胞融合法の原理とモノクローナル抗体の作成、谷内昭、高橋利忠編、「モノクローナル抗体とがん―基礎と臨床―」、第2-14頁、サイエンスフォーラム出版、1985年）により作成することができる。例えば、マウスに該因子を市販のアジュバントと共に２〜４回皮下あるいは腹腔内に投与し、最終投与の約３日後に脾臓あるいはリンパ節を採取し、白血球を採取する。この白血球と骨髄腫細胞（例えば、NS-1,P3X63Ag8など）を細胞融合して該因子に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得る。細胞融合はＰＥＧ法［J. Immunol.Methods,81(2): 223-228 (1985)］でも電圧パルス法［Hybridoma, 7(6): 627-633 (1988)］であってもよい。所望のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、周知のＥＩＡまたはＲＩＡ法等を用いて抗原と特異的に結合する抗体を、培養上清中から検出することにより選択できる。モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの培養は、インビトロ、またはマウスもしくはラット、このましくはマウス腹水中等のインビボで行うことができ、抗体はそれぞれハイブリドーマの培養上清および動物の腹水から取得できる。   Monoclonal antibodies can be obtained by cell fusion methods (for example, Takeshi Watanabe, Principles of Cell Fusion Methods and Production of Monoclonal Antibodies, Akira Taniuchi, Toshitada Takahashi, “Monoclonal Antibodies and Cancer: Basic and Clinical”, 2-14). Page, Science Forum Publishing, 1985). For example, the factor is administered to a mouse subcutaneously or intraperitoneally 2-4 times together with a commercially available adjuvant, and about 3 days after the final administration, the spleen or lymph node is collected and white blood cells are collected. The leukocytes and myeloma cells (for example, NS-1, P3X63Ag8, etc.) are fused to obtain a hybridoma that produces a monoclonal antibody against the factor. The cell fusion may be performed by the PEG method [J. Immunol. Methods, 81 (2): 223-228 (1985)] or the voltage pulse method [Hybridoma, 7 (6): 627-633 (1988)]. A hybridoma producing a desired monoclonal antibody can be selected by detecting an antibody that specifically binds to an antigen from the culture supernatant using a well-known EIA or RIA method. The hybridoma producing the monoclonal antibody can be cultured in vitro, or in vivo such as mouse or rat, or preferably mouse ascites, and the antibody can be obtained from the culture supernatant of the hybridoma and the ascites of the animal, respectively.

しかしながら、ヒトにおける治療効果と安全性を考慮すると、本発明の抗体は、キメラ抗体、ヒト化又はヒト型抗体であってもよい。キメラ抗体は、例えば「実験医学（臨時増刊号）, Vol.6, No.10, 1988」、特公平3-73280号公報等を、ヒト化抗体は、例えば特表平4-506458号公報、特開昭62-296890号公報等を、ヒト抗体は、例えば「Nature Genetics,Vol.15, p.146-156, 1997」、「Nature Genetics, Vol.7, p.13-21, 1994」、特表平4-504365号公報、国際出願公開WO94/25585号公報、「日経サイエンス、６月号、第４０〜第５０頁、１９９５年」、「Nature, Vol.368, p.856-859, 1994」、特表平6-500233号公報等を参考にそれぞれ作製することができる。   However, considering the therapeutic effect and safety in humans, the antibody of the present invention may be a chimeric antibody, a humanized or humanized antibody. Chimeric antibodies include, for example, “Experimental Medicine (Special Issue), Vol. 6, No. 10, 1988”, Japanese Patent Publication No. 3-73280, and humanized antibodies include, for example, Japanese Patent Publication No. 4-506458, JP-A-62-296890 and the like, human antibodies include, for example, `` Nature Genetics, Vol.15, p.146-156, 1997 '', `` Nature Genetics, Vol.7, p.13-21, 1994 '', Japanese Patent Publication No. 4-504365, International Application Publication No. WO94 / 25585, “Nikkei Science, June, 40 to 50, 1995”, “Nature, Vol.368, p.856-859, 1994 ", Japanese Patent Publication No. 6-500233, and the like.

ＣＤＫの発現を抑制する物質が、アンチセンス核酸等の核酸分子（以下、必要に応じて有効核酸分子ともいう）である場合、本発明の改善剤は、該有効核酸分子をコードする発現ベクターを有効成分とすることもできる。当該発現ベクターは、上記の核酸分子をコードするオリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドが、投与対象である哺乳動物の脂肪細胞（例えば、白色脂肪細胞）内でプロモーター活性を発揮し得るプロモーターに機能的に連結されているか、あるいは投与された動物の脂肪細胞内で、一定の条件下に機能的に連結された形態に変化し得るような位置に配置されていなければならない。使用されるプロモーターは、投与対象である哺乳動物の脂肪細胞内で機能し得るものであれば特に制限はないが、例えば、ＳＶ４０由来初期プロモーター、サイトメガロウイルスＬＴＲ、ラウス肉腫ウイルスＬＴＲ、ＭｏＭｕＬＶ由来ＬＴＲ、アデノウイルス由来初期プロモーター等のウイルスプロモーター、並びにβ−アクチン遺伝子プロモーター、ＰＧＫ遺伝子プロモーター、トランスフェリン遺伝子プロモーター等の哺乳動物の構成蛋白質遺伝子プロモーターなどが挙げられる。「一定の条件下に機能的に連結された形態に変化し得るような位置に配置される」とは、例えば、以下でさらに詳述するように、プロモーターと有効核酸分子をコードするオリゴ（ポリ）ヌクレオチドが、該プロモーターからの有効核酸分子の発現を妨げるのに十分な長さを有するスペーサー配列により隔てられた、同方向に配置される２つのリコンビナーゼ認識配列によって分断された構造を有し、該認識配列を特異的に認識するリコンビナーゼの存在下に該スペーサー配列が切り出されて、有効核酸分子をコードするポリヌクレオチドがプロモーターに機能的に連結されるように配置されることをいう。   When the substance that suppresses the expression of CDK is a nucleic acid molecule such as an antisense nucleic acid (hereinafter also referred to as an effective nucleic acid molecule if necessary), the improving agent of the present invention uses an expression vector encoding the effective nucleic acid molecule. It can also be an active ingredient. In the expression vector, the oligonucleotide or polynucleotide encoding the nucleic acid molecule is operably linked to a promoter capable of exhibiting promoter activity in a mammalian adipocyte (eg, white adipocyte) to be administered. Or must be located within the adipocyte of the administered animal so that it can change into a functionally linked form under certain conditions. The promoter used is not particularly limited as long as it can function in the adipocyte of the mammal to be administered. For example, SV40-derived early promoter, cytomegalovirus LTR, Rous sarcoma virus LTR, MoMuLV-derived LTR And viral promoters such as adenovirus-derived early promoters, and mammalian constituent protein gene promoters such as β-actin gene promoter, PGK gene promoter, transferrin gene promoter, and the like. “Arranged in a position that can change into a functionally linked form under certain conditions” means, for example, an oligo (polyester) encoding a promoter and an effective nucleic acid molecule, as described in more detail below. ) The nucleotide has a structure separated by two recombinase recognition sequences arranged in the same direction, separated by a spacer sequence having a length sufficient to prevent expression of an effective nucleic acid molecule from the promoter; The spacer sequence is cut out in the presence of a recombinase that specifically recognizes the recognition sequence, and the polynucleotide encoding an effective nucleic acid molecule is arranged so as to be operably linked to a promoter.

本発明の発現ベクターは、好ましくは有効核酸分子をコードするオリゴ（ポリ）ヌクレオチドの下流に転写終結シグナル、すなわちターミネーター領域を含有する。さらに、形質転換細胞選択のための選択マーカー遺伝子（テトラサイクリン、アンピシリン、カナマイシン、ハイグロマイシン、ホスフィノスリシン等の薬剤に対する抵抗性を付与する遺伝子、栄養要求性変異を相補する遺伝子等）をさらに含有することもできる。発現ベクターが上述のようにリコンビナーゼ認識配列に挟まれたスペーサー配列を有する場合、該選択マーカー遺伝子は当該スペーサー配列内に配置することもできる。   The expression vector of the present invention preferably contains a transcription termination signal, that is, a terminator region, downstream of an oligo (poly) nucleotide encoding an effective nucleic acid molecule. In addition, selectable marker genes for selection of transformed cells (such as genes that confer resistance to drugs such as tetracycline, ampicillin, kanamycin, hygromycin, phosphinothricin, genes that complement auxotrophic mutations, etc.) You can also When the expression vector has a spacer sequence sandwiched between recombinase recognition sequences as described above, the selectable marker gene can also be placed in the spacer sequence.

本発明において発現ベクターに使用されるベクターは特に制限されないが、ヒト等の哺乳動物への投与に好適なベクターとしては、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンドビスウイルス、センダイウイルス等のウイルスベクターが挙げられる。アデノウイルスは、遺伝子導入効率が極めて高く、非***細胞にも導入可能である等の利点を有する。但し、導入遺伝子の宿主染色体への組込みは極めて稀であるので、遺伝子発現は一過性で通常約４週間程度しか持続しない。治療効果の持続性を考慮すれば、比較的遺伝子導入効率が高く、非***細胞にも導入可能で、且つ逆位末端繰り返し配列（ＩＴＲ）を介して染色体に組み込まれ得るアデノ随伴ウイルスの使用もまた好ましい。   The vector used as the expression vector in the present invention is not particularly limited, and suitable vectors for administration to mammals such as humans include retrovirus, adenovirus, adeno-associated virus, herpes virus, vaccinia virus, poxvirus, Examples thereof include viral vectors such as poliovirus, Sindbis virus and Sendai virus. Adenovirus has advantages such as extremely high gene transfer efficiency and can be transferred to non-dividing cells. However, since integration of the transgene into the host chromosome is extremely rare, gene expression is transient and usually lasts only about 4 weeks. Considering the persistence of the therapeutic effect, use of an adeno-associated virus that has relatively high gene transfer efficiency, can be introduced into non-dividing cells, and can be integrated into the chromosome via an inverted terminal repeat (ITR) Also preferred.

アンチセンス核酸やリボザイム等の有効核酸分子は本来異物であり、これらの構成的且つ過剰な発現は、当該遺伝子を導入された宿主動物にとって毒性が強く、副作用を引き起こす場合も考えられる。従って、本発明の好ましい態様においては、発現ベクターは、不要な時期及び／又は不要な部位での有効核酸分子の過剰発現による悪影響を防ぐために、有効核酸分子を時期特異的及び／又は脂肪細胞（例えば、白色脂肪細胞）特異的に発現させることができる。このようなベクターの第一の実施態様としては、投与対象となる動物の脂肪細胞において特異的に発現する遺伝子由来のプロモーターに機能的に連結した有効核酸分子をコードするオリゴ（ポリ）ヌクレオチドを含むベクターが挙げられる。脂肪細胞において特異的に発現する遺伝子由来のプロモーターとしては、例えば、aP2プロモーター等の脂肪細胞特異的遺伝子のプロモーターが挙げられる。   Effective nucleic acid molecules such as antisense nucleic acids and ribozymes are inherently foreign, and their constitutive and excessive expression is highly toxic to host animals into which the gene has been introduced, and may cause side effects. Therefore, in a preferred embodiment of the present invention, the expression vector can be used to treat the effective nucleic acid molecule with time-specific and / or adipocytes (in order to prevent adverse effects due to overexpression of the effective nucleic acid molecule at an unnecessary time and / or unnecessary site. For example, white adipocytes) can be expressed specifically. A first embodiment of such a vector includes an oligo (poly) nucleotide encoding an effective nucleic acid molecule operably linked to a promoter derived from a gene that is specifically expressed in the adipocyte of the animal to be administered. Vector. Examples of promoters derived from genes that are specifically expressed in adipocytes include promoters of adipocyte-specific genes such as the aP2 promoter.

本発明の時期特異的且つ脂肪細胞特異的発現ベクターの第二の実施態様として、外因性の物質によってトランスに発現が制御される誘導プロモーターに機能的に連結した有効核酸分子をコードするオリゴ（ポリ）ヌクレオチドを含むベクターが挙げられる。誘導プロモーターとして、例えば、メタロチオネイン−１遺伝子プロモーターを用いた場合、金、亜鉛、カドミウム等の重金属、デキサメサゾン等のステロイド、アルキル化剤、キレート剤またはサイトカインなどの誘導物質を、所望の時期に脂肪細胞（例えば、白色脂肪細胞）を含む組織に局所投与することにより、任意の時期に脂肪細胞特異的に有効核酸分子の発現を誘導することができる。   As a second embodiment of the time-specific and adipocyte-specific expression vector of the present invention, an oligo (poly) encoding an effective nucleic acid molecule operably linked to an inducible promoter whose expression is controlled in trans by an exogenous substance. ) Vectors containing nucleotides. For example, when a metallothionein-1 gene promoter is used as an inducible promoter, an inducer such as a heavy metal such as gold, zinc or cadmium, a steroid such as dexamethasone, an alkylating agent, a chelating agent, or a cytokine is added at a desired time. By locally administering to a tissue containing (for example, white adipocytes), the expression of an effective nucleic acid molecule can be induced in an adipocyte-specific manner at any time.

本発明の時期特異的且つ脂肪細胞特異的発現ベクターの別の好ましい態様は、プロモーターと有効核酸分子をコードするオリゴ（ポリ）ヌクレオチドとが、該プロモーターからの有効核酸分子の発現を妨げるのに十分な長さを有するスペーサー配列により隔てられた、同方向に配置される２つのリコンビナーゼ認識配列によって分断された構造を有するベクターである。該ベクターが脂肪細胞内に導入されただけではプロモーターは有効核酸分子の転写を指示することができない。しかしながら、所望の時期に脂肪細胞（例えば、白色脂肪細胞）に該認識配列を特異的に認識するリコンビナーゼを局所投与するか、あるいは該リコンビナーゼをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを局所投与して該リコンビナーゼを脂肪細胞内で発現させると、該認識配列間で該リコンビナーゼを介した相同組換えが起こり、その結果、該スペーサー配列が切り出され、有効核酸分子をコードするオリゴ（ポリ）ヌクレオチドがプロモーターに機能的に連結されて、所望の時期に脂肪細胞特異的に有効核酸分子が発現される。   Another preferred embodiment of the time-specific and adipocyte-specific expression vector of the present invention is that the promoter and the oligo (poly) nucleotide encoding the effective nucleic acid molecule are sufficient to prevent expression of the effective nucleic acid molecule from the promoter. A vector having a structure separated by two recombinase recognition sequences arranged in the same direction, separated by a spacer sequence having a long length. A promoter cannot direct transcription of an effective nucleic acid molecule simply by introducing the vector into an adipocyte. However, a recombinase that specifically recognizes the recognition sequence is locally administered to an adipocyte (eg, white adipocyte) at a desired time, or an expression vector containing a polynucleotide encoding the recombinase is locally administered to When recombinase is expressed in adipocytes, homologous recombination occurs between the recognition sequences via the recombinase. As a result, the spacer sequence is excised and an oligo (poly) nucleotide encoding an effective nucleic acid molecule is used as a promoter. Functionally linked, an effective nucleic acid molecule is expressed specifically in adipocytes at a desired time.

上記ベクターに使用されるリコンビナーゼ認識配列は、投与対象に内在のリコンビナーゼによる組換えを防ぐために、内在のリコンビナーゼによっては認識されない異種リコンビナーゼ認識配列であることが望ましい。したがって、該ベクターにトランスに作用するリコンビナーゼもまた異種リコンビナーゼであることが望ましい。このような異種リコンビナーゼと該リコンビナーゼ認識配列の組み合わせとしては、大腸菌のバクテリオファージＰ１由来のCreリコンビナーゼとlox P配列、あるいは酵母由来のFlpリコンビナーゼとfrt配列が好ましく例示されるが、それらに限定されるものではない。   The recombinase recognition sequence used in the vector is preferably a heterologous recombinase recognition sequence that is not recognized by the endogenous recombinase in order to prevent recombination by the endogenous recombinase in the administration subject. Therefore, it is desirable that the recombinase acting in trans on the vector is also a heterologous recombinase. Preferred examples of the combination of the heterologous recombinase and the recombinase recognition sequence include Cre recombinase and lox P sequence derived from bacteriophage P1 of Escherichia coli, or Flp recombinase and frt sequence derived from yeast, but are not limited thereto. It is not a thing.

有効核酸分子をコードする発現ベクターを有効成分とする本発明の改善剤の投与は、投与対象の体内に直接ベクターを投与して導入を行うin vivo法で行われる。この場合、ウイルスベクターは、注射剤等の形態で静脈内、動脈内、皮下、皮内、筋肉内、腹腔内等に投与される。あるいは、静脈内注射などによりベクターを投与すると、ウイルスベクターに対する中和抗体の産生が問題となるが、脂肪細胞付近に局所的にベクターを注入すれば（in situ法）、抗体の存在による悪影響を軽減することができる。   Administration of the improving agent of the present invention comprising an expression vector encoding an effective nucleic acid molecule as an active ingredient is performed by an in vivo method in which the vector is directly introduced into the body of the administration subject. In this case, the viral vector is administered intravenously, intraarterially, subcutaneously, intradermally, intramuscularly, intraperitoneally, etc. in the form of an injection or the like. Alternatively, when a vector is administered by intravenous injection or the like, the production of neutralizing antibody against the viral vector becomes a problem, but if the vector is injected locally in the vicinity of adipocytes (in situ method), the adverse effect due to the presence of the antibody Can be reduced.

（ＣＤＫの活性を抑制する物質）
脂肪細胞分化を抑制する物質はまた、ＣＤＫの活性を抑制する物質であり得る。 (Substance that suppresses CDK activity)
The substance that suppresses adipocyte differentiation can also be a substance that suppresses the activity of CDK.

ＣＤＫの活性を抑制する物質としては、ＣＤＫの活性を低減させ得る物質である限り特に限定されないが、他の遺伝子・蛋白質に及ぼす悪影響を最小限にするためには、標的分子に特異的に作用し得る物質であることが重要である。ＣＤＫの活性を特異的に抑制する物質としては、ＣＤＫドミナントネガティブ変異体、サイクリン依存性キナーゼインヒビター（ＣＤＫインヒビター）、ＣＤＫ−サイクリン（例えば、ＣＤＫ２−サイクリンＡ）と安定な複合体を形成し、かつそのキナーゼ活性を阻害するペプチド（例えば、実施例参照）、これらをコードする核酸、当該核酸を含む発現ベクター、低分子有機化合物等が例示される。ここで、発現ベクターは上記と同様である。   The substance that suppresses the activity of CDK is not particularly limited as long as it is a substance that can reduce the activity of CDK. In order to minimize the adverse effect on other genes and proteins, it acts specifically on the target molecule. It is important that the substance be capable of. Substances that specifically inhibit the activity of CDK include forming stable complexes with CDK dominant negative mutants, cyclin dependent kinase inhibitors (CDK inhibitors), CDK-cyclins (eg, CDK2-cyclin A), and Peptides that inhibit the kinase activity (see, for example, Examples), nucleic acids that encode these, expression vectors containing the nucleic acids, low molecular organic compounds, and the like are exemplified. Here, the expression vector is the same as described above.

ＣＤＫのドミナントネガティブ変異体とは、ＣＤＫに対する変異の導入によりその活性が低減したものをいう。ＣＤＫのドミナントネガティブ変異体は、天然のＣＤＫと競合することで間接的にその活性を阻害することができる。ＣＤＫのドミナントネガティブ変異体は、ＣＤＫに変異を導入することによって作製することができる。変異としては、例えば、ＡＴＰ結合部位、触媒部位、サイクリン結合部位、ＣＤＫインヒビター結合部位等の部位における、活性の低下をもたらすようなアミノ酸の変異（例えば、１以上のアミノ酸の欠失、置換、付加）が挙げられる。アミノ酸変異は、ＰＣＲや公知のキットを用いる自体公知の方法により導入できる。   A dominant negative mutant of CDK refers to one whose activity has been reduced by introducing a mutation into CDK. A dominant negative mutant of CDK can indirectly inhibit its activity by competing with natural CDK. A dominant negative mutant of CDK can be produced by introducing a mutation into CDK. As the mutation, for example, an amino acid mutation (for example, deletion, substitution or addition of one or more amino acids) that causes a decrease in activity at a site such as an ATP binding site, a catalytic site, a cyclin binding site, or a CDK inhibitor binding site. ). The amino acid mutation can be introduced by a method known per se using PCR or a known kit.

（ＣＤＫインヒビター）
ＣＤＫの活性を抑制する物質は、ＣＤＫインヒビターの発現を促進する物質であり得る。ここで、ＣＤＫインヒビターの発現を促進するとは、ＣＤＫインヒビター自体を補充することを含む。 (CDK inhibitor)
The substance that suppresses the activity of CDK can be a substance that promotes the expression of a CDK inhibitor. Here, promoting CDK inhibitor expression includes supplementing the CDK inhibitor itself.

サイクリン依存性キナーゼインヒビター（ＣＤＫインヒビター）は、サイクリン−ＣＤＫ複合体に結合することにより、又はサイクリン−ＣＤＫ複合体の形成を妨害することにより、ＣＤＫ活性を抑制するタンパク質をいう。ＣＤＫインヒビターとしては、Ｉｎｋ４ファミリーに属するタンパク質（例えば、ｐ１５Ｉｎｋ４ｂ、ｐ１６Ｉｎｋ４ａ、ｐ１８Ｉｎｋ４ｃ、ｐ１９Ｉｎｋ４ｄ）、Ｃｉｐ／Ｋｉｐファミリーに属するタンパク質（例えば、ｐ２１Ｃｉｐ１、ｐ２７Ｋｉｐ１、ｐ５７Ｋｉｐ２）が挙げられるが、なかでもｐ２７ｋｉｐ１、ｐ２１Ｃｉｐ１が好ましい。なお、ｐ２７ｋｉｐ１、ｐ２１Ｃｉｐ１は、例えば、ＣＤＫ２、ＣＤＫ５又はＣＤＫ７と相互作用することが知られている。 A cyclin-dependent kinase inhibitor (CDK inhibitor) refers to a protein that suppresses CDK activity by binding to a cyclin-CDK complex or by preventing the formation of a cyclin-CDK complex. Examples of the CDK inhibitor include proteins belonging to the Ink4 family (for example, p15 Ink4b , p16 Ink4a , p18 Ink4c , p19 Ink4d ) and proteins belonging to the Cip / Kip family (for example, p21 Cip1 , p27 Kip1 , p57 Kip2 ). Of these, p27 kip1 and p21 Cip1 are preferable. It is known that p27 kip1 and p21 Cip1 interact with, for example, CDK2, CDK5, or CDK7.

ＣＤＫインヒビターの発現を促進する物質としては、例えば、ＣＤＫインヒビター遺伝子からのＲＮＡ転写を促進し得るトランス活性化因子、スプライシングやｍＲＮＡの細胞質移行を促進し得る因子、ｍＲＮＡの分解を抑制する因子、リボソームのｍＲＮＡへの結合を促進し得る因子、ＣＤＫインヒビターの分解を抑制する因子、ＣＤＫインヒビターの核内への移行を促進する因子等が挙げられるが、より直接的且つ特異的な物質として、ＣＤＫインヒビターが好ましく例示される。   Examples of substances that promote the expression of CDK inhibitors include transactivators that can promote RNA transcription from CDK inhibitor genes, factors that can promote splicing and cytoplasmic translocation of mRNA, factors that inhibit degradation of mRNA, and ribosomes Include a factor that can promote the binding of mRNA to the mRNA, a factor that suppresses the degradation of the CDK inhibitor, a factor that promotes the transfer of the CDK inhibitor into the nucleus, and the like. Is preferably exemplified.

ＣＤＫインヒビターは、例えばヒト又はマウス、ウシ、ブタ、サル、ラット等の他の哺乳動物の血液から、ＣＤＫインヒビター抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーにより単離することができる。あるいは、当該組織由来のｃＤＮＡライブラリーもしくはゲノミックライブラリーから、ＣＤＫインヒビターのｃＤＮＡクローンをプローブとして単離されるＤＮＡクローンを適当な発現ベクター中にクローニングし、宿主細胞に導入して発現させ、細胞培養物の培養上清からＣＤＫインヒビター抗体や、His-tag、GST-tag等を用いたアフィニティークロマトグラフィーにより精製することもできる。   CDK inhibitors can be isolated from the blood of humans or other mammals such as mice, cows, pigs, monkeys, rats, etc. by affinity chromatography using CDK inhibitor antibodies. Alternatively, from a cDNA library or genomic library derived from the tissue, a DNA clone isolated using a CDK inhibitor cDNA clone as a probe is cloned into an appropriate expression vector and introduced into a host cell for expression, and a cell culture The culture supernatant can be purified by affinity chromatography using a CDK inhibitor antibody, His-tag, GST-tag or the like.

ＣＤＫインヒビターを有効成分とする改善剤は、上記したように、ポリＬ−リジン、アビジン、コレステロール又はリン脂質成分等の付属基を結合させることによって、細胞膜透過性を向上させることができる。あるいは、本発明の改善剤は、ＣＤＫインヒビターをカチオン性リポソームに被包して製剤化することもできる。蛋白質はポリアニオン性であるので、カチオン性リポソームと混合することにより容易に複合体を形成する。また、リポソーム膜に脂肪細胞（例えば、白色脂肪細胞）で特異的に発現する細胞表面分子に対する抗体もしくはリガンドを組み込むことにより、細胞特異的なターゲッティングを行うこともできる。   As described above, an improving agent containing a CDK inhibitor as an active ingredient can improve cell membrane permeability by binding an attached group such as poly-L-lysine, avidin, cholesterol, or a phospholipid component. Alternatively, the improving agent of the present invention can be formulated by encapsulating a CDK inhibitor in a cationic liposome. Since proteins are polyanionic, a complex is easily formed by mixing with cationic liposomes. Cell-specific targeting can also be performed by incorporating antibodies or ligands against cell surface molecules that are specifically expressed in adipocytes (eg, white adipocytes) into the liposome membrane.

また、ＣＤＫインヒビターの発現を促進する物質は、ＣＤＫインヒビターをコードする核酸、当該核酸を含む発現ベクターであり得る。ここで、発現ベクターは上記と同様である。   In addition, the substance that promotes the expression of a CDK inhibitor can be a nucleic acid encoding a CDK inhibitor and an expression vector containing the nucleic acid. Here, the expression vector is the same as described above.

（ＣＤＫの活性を抑制する低分子有機化合物）
また、ＣＤＫの活性を抑制する物質は、低分子有機化合物であり得る。ＣＤＫの活性を抑制する低分子有機化合物としては、実に様々なものが知られている。例えば、かかる低分子有機化合物としては、種々のプリン誘導体が知られている（例えば、ＷＯ９７／１６４５２、ＷＯ９７／２０８４２、ＷＯ９９／０２１６２、ＷＯ９９／０７７０５、ＷＯ９９／４３６７６、ＷＯ９９／４３６７５、ＷＯ０１／０７０２３１参照）。また、ＣＤＫの活性を抑制する低分子有機化合物として、種々の非プリン誘導体も知られている（例えば、ＷＯ９９／２４４１６、ＷＯ９９／３０７１０、ＷＯ９９／５０２５１、ＷＯ０１／０１２１８９、ＷＯ０１／０４９６８８参照）。 (Low molecular organic compounds that suppress CDK activity)
In addition, the substance that suppresses the activity of CDK can be a low molecular weight organic compound. Various kinds of low molecular weight organic compounds that suppress the activity of CDK are known. For example, as such low-molecular organic compounds, various purine derivatives are known (see, for example, WO 97/16452, WO 97/20842, WO 99/02162, WO 99/07705, WO 99/43676, WO 99/43675, WO 01/070231). ). Various non-purine derivatives are also known as low molecular weight organic compounds that suppress CDK activity (see, for example, WO99 / 24416, WO99 / 30710, WO99 / 50251, WO01 / 012189, WO01 / 049688).

一実施形態では、ＣＤＫの活性を抑制する低分子有機化合物は、下記式（Ｉ）   In one embodiment, the low molecular weight organic compound that suppresses the activity of CDK has the following formula (I):

〔式中、Ｒ1、Ｒ２は、各々独立して、水素原子、置換されていてもよいＣ１ 〜Ｃ８アルキル基、置換されていてもよいＣ２〜Ｃ８アルケニル基、置換されていてもよいＣ２ 〜Ｃ８アルキニル基、置換されていてもよいＣ１〜Ｃ８アシル基、置換されていてもよい芳香族または非芳香族のＣ３〜Ｃ１４炭化水素環基、あるいは置換されていてもよい芳香族または非芳香族のＣ３〜Ｃ１４複素環基であり；
Ｒ３は、水素原子、置換されていてもよいＣ１〜Ｃ８アルキル基、置換されていてもよいＣ２ 〜Ｃ８アルケニル基、置換されていてもよいＣ２ 〜Ｃ８アルキニル基、置換されていてもよいＣ１ 〜Ｃ８アシル基であり；
環Ａは、置換されていてもよい芳香族または非芳香族のＣ３〜Ｃ１４炭化水素環基、あるいは置換されていてもよい芳香族または非芳香族のＣ３〜Ｃ１４複素環基であり；
Ｘは、−Ｏ−、−Ｓ−または−ＮＲ４−（式中、Ｒ４は、水素原子、置換されていてもよいＣ1 〜Ｃ８アルキル基、置換されていてもよいＣ２ 〜Ｃ８アルケニル基、置換されていてもよいＣ２〜Ｃ８アルキニル基、置換されていてもよいＣ1 〜Ｃ８アシル基、置換されていてもよい芳香族または非芳香族のＣ３〜Ｃ１４炭化水素環基、置換されていてもよい芳香族または非芳香族のＣ３〜Ｃ１４複素環基である）であり；
Ｙは、結合手または−（ＣＨ２）ｎ−（式中、ｎは１〜３である）である。〕で表される化合物、あるいはその塩である。 [Wherein R 1 and R 2 are each independently a hydrogen atom, an optionally substituted C 1 -C 8 alkyl group, an optionally substituted C 2 -C 8 alkenyl group, or a substituted group. which may be C 2 -C 8 alkynyl group, an optionally substituted C 1 -C 8 acyl group, an aromatic substituted or non-aromatic C 3 -C 14 hydrocarbon ring group or a substituted, An aromatic or non-aromatic C 3 to C 14 heterocyclic group which may be substituted;
R 3 is a hydrogen atom, an optionally substituted C 1 -C 8 alkyl group, an optionally substituted C 2 -C 8 alkenyl group, an optionally substituted C 2 -C 8 alkynyl group, a substituted It is be a good C 1 -C 8 acyl group;
Ring A is an optionally substituted aromatic or non-aromatic C 3 to C 14 hydrocarbon ring group, or an optionally substituted aromatic or non-aromatic C 3 to C 14 heterocyclic group. Yes;
X is —O—, —S— or —NR 4 — (wherein R 4 is a hydrogen atom, an optionally substituted C 1 -C 8 alkyl group, or an optionally substituted C 2 -C 8 alkenyl groups, optionally substituted C 2 -C 8 alkynyl groups, optionally substituted C 1 -C 8 acyl groups, optionally substituted aromatic or non-aromatic C 3 -C 14 A hydrocarbon ring group, which is an optionally substituted aromatic or non-aromatic C 3 -C 14 heterocyclic group);
Y is a bond or — (CH 2 ) n — (wherein n is 1 to 3). Or a salt thereof.

「置換されていてもよいＣ1 〜Ｃ８アルキル基」の「Ｃ1 〜Ｃ８アルキル基」としては、直鎖または分岐鎖のいずれでもよく、好ましくは炭素数１〜６であり、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル等が挙げられる。 The "C 1 -C 8 alkyl group" of the "optionally substituted C 1 -C 8 alkyl group optionally" may be either a straight chain or branched chain, preferably 1 to 6 carbon atoms, for example, And methyl, ethyl, propyl, isopropyl, butyl, isobutyl, sec-butyl, tert-butyl and the like.

「置換されていてもよいＣ２〜Ｃ８アルケニル基」の「Ｃ２ 〜Ｃ８アルケニル基」としては、直鎖または分岐鎖のいずれでもよく、好ましくは炭素数２〜６であり、例えば、エテニル、１−プロペニル、２−プロペニル、２−メチル−１−プロペニル、１−ブテニル、２−ブテニル、３−ブテニル等が挙げられる。 The "C 2 -C 8 alkenyl group" of the "optionally substituted C 2 -C 8 alkenyl group optionally" may be either a straight chain or branched chain, preferably 2 to 6 carbon atoms, for example, Examples include ethenyl, 1-propenyl, 2-propenyl, 2-methyl-1-propenyl, 1-butenyl, 2-butenyl, 3-butenyl and the like.

「置換されていてもよいＣ２〜Ｃ８アルキニル基」の「Ｃ２ 〜Ｃ８アルキニル基」としては、直鎖または分岐鎖のいずれでもよく、好ましくは炭素数２〜６であり、例えば、エチニル、１−プロピニル、２−プロピニル、１−ブチニル、２−ブチニル、３−ブチニル等が挙げられる。 The "C 2 -C 8 alkynyl group" of the "optionally substituted C 2 -C 8 alkynyl group optionally" may be either a straight chain or branched chain, preferably 2 to 6 carbon atoms, for example, Examples include ethynyl, 1-propynyl, 2-propynyl, 1-butynyl, 2-butynyl, 3-butynyl and the like.

「置換されていてもよいＣ１〜Ｃ８アシル基」の「Ｃ１ 〜Ｃ８アシル基」としては、直鎖または分岐鎖のいずれでもよく、好ましくは炭素数２〜６であり、例えば、ホルミル、アセチル、プロピノイル、ブタノイル、２−メチルプロピノイル等が挙げられる。 The "C 1 -C 8 acyl group" of the "optionally substituted C 1 -C 8 acyl group optionally" may be either a straight chain or branched chain, preferably 2 to 6 carbon atoms, for example, Examples include formyl, acetyl, propinoyl, butanoyl, 2-methylpropinoyl and the like.

「置換されていてもよい芳香族Ｃ３〜Ｃ１４炭化水素環基」の「芳香族Ｃ３〜Ｃ１４炭化水素環基」としては、単環式、二環式または三環式のいずれでもよく、好ましくは炭素数３〜１２であり、例えば、フェニル、ナフチルが挙げられる。 "Aromatic C 3 -C 14 hydrocarbon ring group" of the "optionally substituted aromatic are C 3 -C 14 hydrocarbon ring group" refers to monocyclic, either bi- or tricyclic It is preferably 3 to 12 carbon atoms, and examples thereof include phenyl and naphthyl.

「置換されていてもよい非芳香族Ｃ３〜Ｃ１４炭化水素環基」の「非芳香族Ｃ３〜Ｃ１４炭化水素環基」としては、飽和または不飽和の単環式、二環式または三環式のいずれでもよく、好ましくは炭素数３〜１２であり、例えば、シクロアルキル基（例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル）、シクロアルケニル基（例えば、２−シクロペンテン−１−イル、３−シクロペンテン−１−イル、２−シクロヘキセン−１−イル、３−シクロヘキセン−１−イル）、シクロアルカジエニル基（例えば、２，４−シクロペンタジエン−１−イル、２，４−シクロヘキサジエン−１−イル、２，５−シクロヘキサジエン−１−イル）等が挙げられる。 The “non-aromatic C 3 to C 14 hydrocarbon ring group” of the “optionally substituted non-aromatic C 3 to C 14 hydrocarbon ring group” is a saturated or unsaturated monocyclic or bicyclic ring Alternatively, it may be any of tricyclic, preferably 3 to 12 carbon atoms, for example, a cycloalkyl group (for example, cyclopropyl, cyclobutyl, cyclopentyl, cyclohexyl, cycloheptyl, cyclooctyl), a cycloalkenyl group (for example, 2 -Cyclopenten-1-yl, 3-cyclopenten-1-yl, 2-cyclohexen-1-yl, 3-cyclohexen-1-yl), cycloalkadienyl groups (for example, 2,4-cyclopentadien-1-yl 2,4-cyclohexadien-1-yl, 2,5-cyclohexadien-1-yl) and the like.

「置換されていてもよい芳香族Ｃ３〜Ｃ１４複素環基」の「芳香族Ｃ３〜Ｃ１４複素環基」としては、環構成原子として炭素原子以外に酸素原子、硫黄原子および窒素原子から選ばれるヘテロ原子を１〜５個含有する単環式、二環式または三環式の芳香族複素環基であり、好ましくは炭素数３〜１２である。単環式芳香族Ｃ３〜Ｃ１４複素環基の例としては、フリル、チエニル、ピロリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、イミダゾリル、ピラゾリル、オキサジアゾリル、フラザニル、チアジアゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、ピリジル、ピリミジニル、ピリダジニル、ピラジニル、トリアジニルなどが挙げられる。また、２環式または３環式の芳香族複素環基の例としては、ベンゾフラニル、イソベンゾフラニル、ベンゾ［ｂ］チエニル、インドリル、イソインドリル、１Ｈ−インダゾリル、ベンズイミダゾリル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾチアゾリル、１Ｈ−ベンゾトリアゾリル、キノリル、イソキノリル、シンノリル、キナゾリル、キノキサリニル、フタラジニル、ナフチリジニル、プリニル、プテリジニル、カルバゾリル、α−カルボニリル、β−カルボニリル、γ−カルボニリル、アクリジニル、フェノキサジニル、フェノチアジニル、フェナジニル、フェノキサチイニル、チアントレニル、インドリジニル、ピロロ［１，２−ｂ］ピリダジニル、ピラゾロ［１，５−ａ］ピリジル、イミダゾ［１，２−ａ］ピリジル、イミダゾ［１，５−ａ］ピリジル、イミダゾ［１，２−ｂ］ピリダジニル、イミダゾ［１，２−ａ］ピリミジニル、１，２，４−トリアゾロ［４，３−ａ］ピリジル、１，２，４−トリアゾロ［４，３−ｂ］ピリダジニルなどが挙げられる。 The “aromatic C 3 -C 14 heterocyclic group” of the “optionally substituted aromatic C 3 -C 14 heterocyclic group” includes oxygen atoms, sulfur atoms and nitrogen atoms in addition to carbon atoms as ring constituent atoms It is a monocyclic, bicyclic or tricyclic aromatic heterocyclic group containing 1 to 5 heteroatoms selected from: preferably 3 to 12 carbon atoms. Examples of monocyclic aromatic C 3 -C 14 heterocyclic groups include furyl, thienyl, pyrrolyl, oxazolyl, isoxazolyl, thiazolyl, isothiazolyl, imidazolyl, pyrazolyl, oxadiazolyl, furazanyl, thiadiazolyl, triazolyl, tetrazolyl, pyridyl, pyrimidinyl, Examples include pyridazinyl, pyrazinyl, triazinyl and the like. Examples of the bicyclic or tricyclic aromatic heterocyclic group include benzofuranyl, isobenzofuranyl, benzo [b] thienyl, indolyl, isoindolyl, 1H-indazolyl, benzimidazolyl, benzoxazolyl, and benzothiazolyl. 1H-benzotriazolyl, quinolyl, isoquinolyl, cinnolyl, quinazolyl, quinoxalinyl, phthalazinyl, naphthyridinyl, purinyl, pteridinyl, carbazolyl, α-carbonylyl, β-carbonylyl, γ-carbonylyl, acridinyl, phenoxazinyl, phenothiazinyl, phenothiazinyl, phenothiazinyl Sachiinyl, thiantenyl, indolizinyl, pyrrolo [1,2-b] pyridazinyl, pyrazolo [1,5-a] pyridyl, imidazo [1,2-a] pyridyl, imidazo [1,5-a] pi Gills, imidazo [1,2-b] pyridazinyl, imidazo [1,2-a] pyrimidinyl, 1,2,4-triazolo [4,3-a] pyridyl, 1,2,4-triazolo [4,3- b] pyridazinyl and the like.

「置換されていてもよい非芳香族Ｃ３〜Ｃ１４複素環基」の「非芳香族Ｃ３〜Ｃ１４複素環基」としては、環構成原子として炭素原子以外に酸素原子、硫黄原子および窒素原子から選ばれるヘテロ原子を１〜５個含有する単環式、二環式または三環式の飽和又は不飽和の複素環基であり、好ましくは炭素数３〜１２であり、例えば、オキシラニル、アゼチジニル、オキセタニル、チエタニル、ピロリジニル、テトラヒドロフリル、テトラヒドロピラニル、モルホリニル、チオモルホリニル、ピペラジニル、ピロリジニル、ピペリジノ、モルホリノ、チオモルホリノなどが挙げられる。 The “non-aromatic C 3 to C 14 heterocyclic group” of the “optionally substituted non-aromatic C 3 to C 14 heterocyclic group” includes an oxygen atom, a sulfur atom and a ring atom other than a carbon atom. A monocyclic, bicyclic or tricyclic saturated or unsaturated heterocyclic group containing 1 to 5 heteroatoms selected from nitrogen atoms, preferably 3 to 12 carbon atoms, such as oxiranyl Azetidinyl, oxetanyl, thietanyl, pyrrolidinyl, tetrahydrofuryl, tetrahydropyranyl, morpholinyl, thiomorpholinyl, piperazinyl, pyrrolidinyl, piperidino, morpholino, thiomorpholino and the like.

置換されていてもよい任意の基における置換基としては、例えば１〜３個のハロゲン原子（例、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素など）で置換されていてもよい炭素数１〜６のアルキル基、１〜３個のハロゲン原子（例、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素など）で置換されていてもよい炭素数２〜６のアルケニル基、炭素数３〜１０のシクロアルキル基、炭素数６〜１４の芳香族炭化水素基（即ち、アリール基）（例、フェニル、ナフチルなど）、芳香族複素環基（例、チエニル、フリル、ピリジル、オキサゾリル、チアゾリルなど）、非芳香族複素環基（例、テトラヒドロフリル、モルホリノ、チオモルホリノ、ピペリジノ、ピロリジニル、ピペラジニルなど）、炭素数７〜９のアラルキル基、アミノ基、炭素数１〜４のアルキル基あるいは炭素数２〜８のアシル基（例、アルカノイル基など）でモノあるいはジ置換されたアミノ基、アミジノ基、炭素数２〜８のアシル基（例、アルカノイル基など）、カルバモイル基、炭素数１〜４のアルキル基でモノあるいはジ置換されたカルバモイル基、スルファモイル基、炭素数１〜４のアルキル基でモノあるいはジ置換されたスルファモイル基、カルボキシル基、炭素数２〜８のアルコキシカルボニル基、ヒドロキシ基、１〜３個のハロゲン原子（例、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素など）で置換されていてもよい炭素数１〜６のアルコキシ基、１〜３個のハロゲン原子（例、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素など）で置換されていてもよい炭素数２〜５のアルケニルオキシ基、炭素数３〜７のシクロアルキルオキシ基、炭素数７〜９のアラルキルオキシ基、炭素数６〜１４のアリールオキシ基（例、フェニルオキシ、ナフチルオキシなど）、チオール基、１〜３個のハロゲン原子（例、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素など）で置換されていてもよい炭素数１〜６のアルキルチオ基、炭素数７〜９のアラルキルチオ基、炭素数６〜１４のアリールチオ基（例、フェニルチオ、ナフチルチオなど）、スルホ基、シアノ基、アジド基、ニトロ基、ニトロソ基、ハロゲン原子（例、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素）などが挙げられる。置換基の数は、例えば１〜３個である。   Examples of the substituent in an arbitrary group which may be substituted include, for example, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms which may be substituted with 1 to 3 halogen atoms (eg, fluorine, chlorine, bromine, iodine, etc.). , An alkenyl group having 2 to 6 carbon atoms, a cycloalkyl group having 3 to 10 carbon atoms, and 6 to 6 carbon atoms which may be substituted with 1 to 3 halogen atoms (eg, fluorine, chlorine, bromine, iodine, etc.) 14 aromatic hydrocarbon groups (ie, aryl groups) (eg, phenyl, naphthyl, etc.), aromatic heterocyclic groups (eg, thienyl, furyl, pyridyl, oxazolyl, thiazolyl, etc.), non-aromatic heterocyclic groups (eg, , Tetrahydrofuryl, morpholino, thiomorpholino, piperidino, pyrrolidinyl, piperazinyl, etc.), an aralkyl group having 7 to 9 carbon atoms, an amino group, an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms or a carbon number A mono- or di-substituted amino group, amidino group, C2-C8 acyl group (e.g., alkanoyl group, etc.), carbamoyl group, C1-C4 A carbamoyl group mono- or di-substituted with an alkyl group, a sulfamoyl group, a sulfamoyl group mono- or di-substituted with an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms, a carboxyl group, an alkoxycarbonyl group with 2 to 8 carbon atoms, a hydroxy group, 1 C 1-6 alkoxy group optionally substituted with 3 halogen atoms (eg, fluorine, chlorine, bromine, iodine, etc.), 1-3 halogen atoms (eg, fluorine, chlorine, bromine, An alkenyloxy group having 2 to 5 carbon atoms, a cycloalkyloxy group having 3 to 7 carbon atoms, and an aralkylo group having 7 to 9 carbon atoms, which may be substituted with iodine, etc.) Substituted with Si group, aryloxy group having 6 to 14 carbon atoms (eg, phenyloxy, naphthyloxy, etc.), thiol group, 1 to 3 halogen atoms (eg, fluorine, chlorine, bromine, iodine, etc.) A C1-C6 alkylthio group, a C7-C9 aralkylthio group, a C6-C14 arylthio group (e.g., phenylthio, naphthylthio, etc.), a sulfo group, a cyano group, an azido group, a nitro group, Examples thereof include a nitroso group and a halogen atom (eg, fluorine, chlorine, bromine, iodine). The number of substituents is, for example, 1 to 3.

好ましくは、置換基は、アミノ基、炭素数１〜４のアルキル基あるいは炭素数２〜８のアシル基（例、アルカノイル基など）でモノあるいはジ置換されたアミノ基、アミジノ基、炭素数２〜８のアシル基（例、アルカノイル基など）、カルバモイル基、炭素数１〜４のアルキル基でモノあるいはジ置換されたカルバモイル基、スルファモイル基、炭素数１〜４のアルキル基でモノあるいはジ置換されたスルファモイル基、カルボキシル基、炭素数２〜８のアルコキシカルボニル基、ヒドロキシ基、１〜３個のハロゲン原子（例、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素など）で置換されていてもよい炭素数１〜６のアルコキシ基、１〜３個のハロゲン原子（例、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素など）で置換されていてもよい炭素数２〜５のアルケニルオキシ基、炭素数３〜７のシクロアルキルオキシ基、炭素数７〜９のアラルキルオキシ基、炭素数６〜１４のアリールオキシ基（例、フェニルオキシ、ナフチルオキシなど）、チオール基、１〜３個のハロゲン原子（例、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素など）で置換されていてもよい炭素数１〜６のアルキルチオ基、炭素数７〜９のアラルキルチオ基、炭素数６〜１４のアリールチオ基（例、フェニルチオ、ナフチルチオなど）、スルホ基、シアノ基、アジド基、ニトロ基、ニトロソ基、ハロゲン原子（例、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素）であり得る。置換基の数は、例えば１〜３個である。   Preferably, the substituent is an amino group, an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms, or an amino group mono- or disubstituted with an acyl group having 2 to 8 carbon atoms (eg, an alkanoyl group), an amidino group, or 2 carbon atoms. -8 acyl groups (eg, alkanoyl groups, etc.), carbamoyl groups, carbamoyl groups mono- or di-substituted with alkyl groups having 1 to 4 carbon atoms, sulfamoyl groups, mono- or di-substituted with alkyl groups having 1 to 4 carbon atoms A sulfamoyl group, a carboxyl group, an alkoxycarbonyl group having 2 to 8 carbon atoms, a hydroxy group, 1 to 3 carbon atoms which may be substituted with 1 to 3 halogen atoms (eg, fluorine, chlorine, bromine, iodine, etc.) Alkenyloxy having 2 to 5 carbon atoms which may be substituted with 1 to 6 alkoxy groups and 1 to 3 halogen atoms (eg, fluorine, chlorine, bromine, iodine, etc.) Group, cycloalkyloxy group having 3 to 7 carbon atoms, aralkyloxy group having 7 to 9 carbon atoms, aryloxy group having 6 to 14 carbon atoms (eg, phenyloxy, naphthyloxy, etc.), thiol group, 1 to 3 An alkylthio group having 1 to 6 carbon atoms, an aralkylthio group having 7 to 9 carbon atoms, and an arylthio group having 6 to 14 carbon atoms (eg, fluorine, chlorine, bromine, iodine, etc.) For example, phenylthio, naphthylthio, etc.), sulfo group, cyano group, azide group, nitro group, nitroso group, halogen atom (eg, fluorine, chlorine, bromine, iodine). The number of substituents is, for example, 1 to 3.

以下、式（Ｉ）で表される化合物の好ましい実施形態を説明する。   Hereinafter, preferred embodiments of the compound represented by the formula (I) will be described.

式（Ｉ）中、Ｒ１、Ｒ２は、上述した通りであるが、なかでも、水素原子、置換されていてもよいＣ１〜Ｃ８アルキル基、置換されていてもよいＣ２ 〜Ｃ８アルケニル基、置換されていてもよいＣ２〜Ｃ８アルキニル基、置換されていてもよい非芳香族のＣ３〜Ｃ１４炭化水素環基が好ましく、水素原子、置換されていてもよいＣ１〜Ｃ８アルキル基、置換されていてもよい非芳香族のＣ３〜Ｃ１４炭化水素環基がより好ましく、水素原子、置換されていてもよいＣ１〜Ｃ８アルキル基がさらにより好ましい。 In formula (I), R 1 and R 2 are as described above. Among them, a hydrogen atom, an optionally substituted C 1 to C 8 alkyl group, and an optionally substituted C 2 to C Preferred are an 8 alkenyl group, an optionally substituted C 2 -C 8 alkynyl group, and an optionally substituted non-aromatic C 3 -C 14 hydrocarbon ring group, a hydrogen atom, an optionally substituted C A 1 to C 8 alkyl group and an optionally substituted non-aromatic C 3 to C 14 hydrocarbon ring group are more preferred, and a hydrogen atom and an optionally substituted C 1 to C 8 alkyl group are even more preferred. .

式（Ｉ）中、Ｒ３は、上述した通りであるが、なかでも、水素原子、置換されていてもよいＣ１〜Ｃ８アルキル基が好ましく、置換されていてもよいＣ１ 〜Ｃ８アルキル基がより好ましい。 In formula (I), R 3 is as described above, and among them, a hydrogen atom and an optionally substituted C 1 to C 8 alkyl group are preferable, and optionally substituted C 1 to C 8. An alkyl group is more preferred.

式（Ｉ）中、環Ａは、上述した通りであるが、なかでも、置換されていてもよい芳香族または非芳香族のＣ３〜Ｃ１４炭化水素環基が好ましく、置換されていてもよい芳香族のＣ３〜Ｃ１４炭化水素環基がより好ましい。 In formula (I), ring A is as described above, and among these, an aromatic or non-aromatic C 3 to C 14 hydrocarbon ring group which may be substituted is preferable, and may be substituted. C 3 -C 14 hydrocarbon ring group and an aromatic is more preferable.

式（Ｉ）中、Ｘは、上述した通りであるが、なかでも、−Ｏ−または−ＮＲ４−が好ましく、−ＮＲ４−がより好ましい。 In formula (I), X is as described above. Among them, —O— or —NR 4 — is preferable, and —NR 4 — is more preferable.

式（Ｉ）中、Ｒ４は、上述した通りであるが、なかでも、水素原子、置換されていてもよいＣ1 〜Ｃ８アルキル基、置換されていてもよいＣ２ 〜Ｃ８アルケニル基、置換され
ていてもよいＣ２〜Ｃ８アルキニル基、置換されていてもよいＣ1 〜Ｃ８アシル基が好ましく、水素原子、置換されていてもよいＣ1 〜Ｃ８アルキル基がより好ましく、水素原子がさらにより好ましい。 In formula (I), R 4 is as described above, and in particular, a hydrogen atom, an optionally substituted C 1 -C 8 alkyl group, and an optionally substituted C 2 -C 8 alkenyl group. , optionally substituted C 2 -C 8 alkynyl group, preferably a good C 1 -C 8 acyl group that may be substituted, a hydrogen atom, a substituted C 1 optionally -C 8 alkyl group and more preferably Even more preferred are hydrogen atoms.

式（Ｉ）中、Ｙは、上述した通りであるが、なかでも、結合手または−ＣＨ２−（即ち、ｎ＝１）が好ましく、−ＣＨ２−がより好ましい。 In formula (I), Y is as described above, and in particular, a bond or —CH 2 — (that is, n = 1) is preferable, and —CH 2 — is more preferable.

式（Ｉ）で表される化合物の代表例は、下記の表１に示される通りである。   Representative examples of the compound represented by the formula (I) are as shown in Table 1 below.

式（Ｉ）で表される化合物の塩としては、特に限定されないが、医薬上許容され得る塩が好ましく、例えば無機塩基（例えば、ナトリウム、カリウムなどのアルカリ金属；カルシウム、マグネシウムなどのアルカリ土類金属；アルミニウム、アンモニウム）、有機塩基（例えば、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、ジシクロヘキシルアミン、Ｎ，Ｎ−ジベンジルエチレンジアミン）、無機酸（例えば、塩酸、臭化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸）、有機酸（例えば、ギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、フマル酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸）、塩基性アミノ酸（例えば、アルギニン、リジン、オルニチン）または酸性アミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）との塩などが挙げられる。   The salt of the compound represented by the formula (I) is not particularly limited, but a pharmaceutically acceptable salt is preferable. For example, an inorganic base (for example, alkali metal such as sodium and potassium; alkaline earth such as calcium and magnesium) Metal; aluminum, ammonium), organic base (for example, trimethylamine, triethylamine, pyridine, picoline, ethanolamine, diethanolamine, triethanolamine, dicyclohexylamine, N, N-dibenzylethylenediamine), inorganic acid (for example, hydrochloric acid, bromide) Hydrogen acid, nitric acid, sulfuric acid, phosphoric acid), organic acid (eg formic acid, acetic acid, trifluoroacetic acid, fumaric acid, oxalic acid, tartaric acid, maleic acid, citric acid, succinic acid, malic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfone Acid, p-toluenesulfonic acid), salt Sex acids (e.g., arginine, lysine, ornithine), or acidic amino acid (e.g., aspartic acid, glutamic acid) salts and the like and.

上記式（Ｉ）の化合物は、プリン誘導体に関して言及した箇所で挙げた文献に記載の方法により製造できる。   The compound of the said formula (I) can be manufactured by the method as described in the literature quoted in the location mentioned regarding the purine derivative.

（サイクリンの発現又は活性を抑制する物質）
脂肪細胞分化を抑制する物質はまた、サイクリンの発現又は活性を抑制する物質であり得る。 (Substance that suppresses the expression or activity of cyclin)
The substance that suppresses adipocyte differentiation can also be a substance that suppresses the expression or activity of cyclin.

サイクリンは、ＣＤＫと結合し、そのタンパク質リン酸化酵素活性を発揮させるタンパク質である。サイクリンとしては、サイクリンＡ〜Ｋ、サイクリンＭ、サイクリンＴ、サイクリンＶが挙げられるが、なかでもＣＤＫ１、ＣＤＫ２、ＣＤＫ５、ＣＤＫ７（これら分子は、ロスコビチンにより活性が阻害される）との相互作用が知られているサイクリンＡ、サイクリンＢ、サイクリンＥ、サイクリンＧ、サイクリンＨ、サイクリンＪ、サイクリンＭ、あるいはｐ２７ｋｉｐ１およびｐ２１Ｃｉｐ１との相互作用が知られているサイクリンＤ、サイクリンＥが好ましい。より好ましくは、サイクリンは、ロスコビチンにより阻害され、且つｐ２７ｋｉｐ１およびｐ２１Ｃｉｐ１との相互作用が知られているサイクリンＥである。 Cyclin is a protein that binds to CDK and exerts its protein kinase activity. Cyclins include cyclins A to K, cyclin M, cyclin T, and cyclin V. Among them, interaction with CDK1, CDK2, CDK5, and CDK7 (these molecules are inhibited by roscovitine) is known. Preferred are cyclin A, cyclin B, cyclin E, cyclin G, cyclin H, cyclin J, cyclin M, or cyclin D and cyclin E, which are known to interact with p27 kip1 and p21 Cip1 . More preferably, the cyclin is cyclin E, which is inhibited by roscovitine and known to interact with p27 kip1 and p21 Cip1 .

具体的には、サイクリンの発現を抑制する物質としては、転写抑制因子、ＲＮＡポリメラーゼ阻害剤、ＲＮＡ分解酵素、蛋白質合成阻害剤、核内移行阻害剤、蛋白質分解酵素、蛋白質変性剤等が例示されるが、細胞内で発現する他の遺伝子・蛋白質に及ぼす悪影響を最小限にするためには、標的分子に特異的に作用し得る物質であることが重要である。   Specifically, examples of substances that suppress the expression of cyclin include transcriptional repressors, RNA polymerase inhibitors, RNA degrading enzymes, protein synthesis inhibitors, nuclear translocation inhibitors, proteolytic enzymes, and protein denaturing agents. However, in order to minimize the adverse effects on other genes and proteins expressed in cells, it is important that the substance be able to act specifically on the target molecule.

サイクリンの発現を抑制する物質としては、例えば、アンチセンス核酸、リボザイム、デコイ核酸、ｓｉＲＮＡ、サイクリン抗体、およびサイクリン抗体をコードする核酸などが挙げられる。また、サイクリンの活性を抑制する物質としては、例えば、ドミナントネガティブ変異体、および当該変異体をコードする核酸などが挙げられる。さらに、これらを含む発現ベクター、当該発現ベクターを含む宿主細胞もまた、サイクリンの発現又は活性を抑制する物質として提供される。サイクリンの発現又は活性を抑制する物質は、ＣＤＫの発現又は活性を抑制する物質と同様に作製できる。   Examples of substances that suppress cyclin expression include antisense nucleic acids, ribozymes, decoy nucleic acids, siRNA, cyclin antibodies, and nucleic acids encoding cyclin antibodies. Examples of the substance that suppresses the activity of cyclin include a dominant negative mutant and a nucleic acid encoding the mutant. Furthermore, an expression vector containing these and a host cell containing the expression vector are also provided as substances that suppress the expression or activity of cyclin. A substance that suppresses the expression or activity of cyclin can be prepared in the same manner as a substance that suppresses the expression or activity of CDK.

本発明の改善剤は、上記のような脂肪細胞数の低下を促進する物質に加え、任意の担体、例えば医薬上許容される担体を含むことができる。   The improving agent of the present invention can contain any carrier, for example, a pharmaceutically acceptable carrier, in addition to the substance that promotes the reduction in the number of fat cells as described above.

医薬上許容される担体としては、例えば、ショ糖、デンプン、マンニット、ソルビット、乳糖、グルコース、セルロース、タルク、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム等の賦形剤、セルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリプロピルピロリドン、ゼラチン、アラビアゴム、ポリエチレングリコール、ショ糖、デンプン等の結合剤、デンプン、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、ナトリウム−グリコール−スターチ、炭酸水素ナトリウム、リン酸カルシウム、クエン酸カルシウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、エアロジル、タルク、ラウリル硫酸ナトリウム等の滑剤、クエン酸、メントール、グリシルリシン・アンモニウム塩、グリシン、オレンジ粉等の芳香剤、安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、メチルパラベン、プロピルパラベン等の保存剤、クエン酸、クエン酸ナトリウム、酢酸等の安定剤、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ステアリン酸アルミニウム等の懸濁剤、界面活性剤等の分散剤、水、生理食塩水、オレンジジュース等の希釈剤、カカオ脂、ポリエチレングリコール、白灯油等のベースワックスなどが挙げられるが、それらに限定されるものではない。   Examples of the pharmaceutically acceptable carrier include excipients such as sucrose, starch, mannitol, sorbit, lactose, glucose, cellulose, talc, calcium phosphate, calcium carbonate, cellulose, methylcellulose, hydroxypropylcellulose, polypropylpyrrolidone , Gelatin, gum arabic, polyethylene glycol, sucrose, starch and other binders, starch, carboxymethylcellulose, hydroxypropyl starch, sodium-glycol starch, sodium bicarbonate, calcium phosphate, calcium citrate and other disintegrants, magnesium stearate , Aerosil, Talc, Lubricant such as sodium lauryl sulfate, Citric acid, Menthol, Glycyllysine / Ammonium salt, Glycine, Orange powder and other fragrances, Sodium benzoate Preservatives such as sodium, sodium bisulfite, methylparaben, propylparaben, stabilizers such as citric acid, sodium citrate, acetic acid, suspensions such as methylcellulose, polyvinylpyrrolidone, aluminum stearate, dispersants such as surfactants, Examples include, but are not limited to, water, physiological saline, diluents such as orange juice, base waxes such as cacao butter, polyethylene glycol, and white kerosene.

経口投与に好適な製剤は、水、生理食塩水、オレンジジュースのような希釈液に有効量の物質を溶解させた液剤、有効量の物質を固体や顆粒として含んでいるカプセル剤、サッシェ剤または錠剤、適当な分散媒中に有効量の物質を懸濁させた懸濁液剤、有効量の物質を溶解させた溶液を適当な分散媒中に分散させ乳化させた乳剤等である。   Formulations suitable for oral administration include a solution in which an effective amount of a substance is dissolved in a diluent such as water, saline, orange juice, a capsule containing an effective amount of the substance as a solid or granule, a sachet or Examples thereof include tablets, suspensions in which an effective amount of a substance is suspended in an appropriate dispersion medium, and emulsions in which a solution in which an effective amount of a substance is dissolved is dispersed in an appropriate dispersion medium and emulsified.

非経口的な投与（例えば、皮下注射、筋肉注射、局所注入、腹腔内投与など）に好適な製剤としては、水性および非水性の等張な無菌の注射液剤があり、これには抗酸化剤、緩衝液、制菌剤、等張化剤等が含まれていてもよい。また、水性および非水性の無菌の懸濁液剤が挙げられ、これには懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、防腐剤等が含まれていてもよい。当該製剤は、アンプルやバイアルのように単位投与量あるいは複数回投与量ずつ容器に封入することができる。また、有効成分および医薬上許容される担体を凍結乾燥し、使用直前に適当な無菌のビヒクルに溶解または懸濁すればよい状態で保存することもできる。   Formulations suitable for parenteral administration (eg, subcutaneous injection, intramuscular injection, local infusion, intraperitoneal administration, etc.) include aqueous and non-aqueous isotonic sterile injection solutions, which include antioxidants Further, a buffer solution, an antibacterial agent, an isotonic agent and the like may be contained. Aqueous and non-aqueous sterile suspensions are also included, which may contain suspending agents, solubilizers, thickeners, stabilizers, preservatives and the like. The preparation can be enclosed in a container in unit doses or multiple doses like ampoules and vials. Alternatively, the active ingredient and a pharmaceutically acceptable carrier can be lyophilized and stored in a state that may be dissolved or suspended in a suitable sterile vehicle immediately before use.

また、本発明の改善剤が非経口的投与される場合には、脂肪細胞（例えば、白色脂肪細胞）への局所投与もまた好ましいので、かかる局所投与に適当な製剤化処理が行われる。   In addition, when the improving agent of the present invention is administered parenterally, local administration to adipocytes (for example, white adipocytes) is also preferable, and thus a formulation treatment suitable for such local administration is performed.

本発明の製剤の投与量は、有効成分の活性や種類、病気の重篤度、投与対象となる動物種、投与対象の薬物受容性、体重、年齢等によって異なり一概に云えないが、通常、成人１日あたり有効成分量として約０．００１〜約５００ｍｇ／ｋｇである。   The dosage of the preparation of the present invention varies depending on the activity and type of the active ingredient, the severity of the disease, the animal species to be administered, the drug acceptability of the administration target, body weight, age, etc. The amount of active ingredient per day for an adult is about 0.001 to about 500 mg / kg.

本発明の改善剤は、インスリン抵抗性の改善が所望される疾患・状態、例えば糖尿病（例えば、２型糖尿病）、高脂血症、高血圧、動脈硬化、高尿酸血症・痛風、冠動脈疾患・心筋梗塞・狭心症、脳梗塞・脳血栓・一過性脳虚血発作、肥満・肥満症、なかでも糖尿病（例えば、２型糖尿病）の予防・治療に有用である。   The ameliorating agent of the present invention is used for diseases / conditions in which improvement of insulin resistance is desired, such as diabetes (for example, type 2 diabetes), hyperlipidemia, hypertension, arteriosclerosis, hyperuricemia / gout, coronary artery disease / It is useful for the prevention and treatment of myocardial infarction / angina pectoris, cerebral infarction / cerebral thrombosis / transient ischemic attack, obesity / obesity, especially diabetes (for example, type 2 diabetes).

２．インスリン抵抗性を改善し得る物質のスクリーニング方法
本発明はまた、被験物質が脂肪細胞数の低下を促進するか否かを評価することを含む、インスリン抵抗性を改善し得る物質のスクリーニング方法、並びに当該方法により得られうる物質を提供する。 2. Method for screening substance capable of improving insulin resistance The present invention also includes a method for screening a substance capable of improving insulin resistance, comprising evaluating whether the test substance promotes a decrease in the number of fat cells, and A substance obtainable by the method is provided.

本発明のスクリーニング方法に供される被験物質は、いかなる公知化合物及び新規化合物であってもよく、例えば、核酸、糖質、脂質、蛋白質、ペプチド、有機低分子化合物、コンビナトリアルケミストリー技術を用いて作製された化合物ライブラリー、固相合成やファージディスプレイ法により作製されたランダムペプチドライブラリー、あるいは微生物、動植物、海洋生物等由来の天然成分等が挙げられる。   The test substance used in the screening method of the present invention may be any known compound and novel compound, and for example, prepared using nucleic acid, carbohydrate, lipid, protein, peptide, organic low molecular weight compound, combinatorial chemistry technology Compound libraries, random peptide libraries prepared by solid phase synthesis or phage display methods, natural components derived from microorganisms, animals and plants, marine organisms, and the like.

本発明のスクリーニング方法は、脂肪細胞数の低下を促進する物質を選択可能である限り特に限定されない。例えば、本発明のスクリーニング方法は、脂肪細胞にアポトーシスを誘導する物質、脂肪細胞分化を抑制する物質、脂肪細胞の脱分化を促進する物質などを選択可能なものであるが、なかでも脂肪細胞にアポトーシスを誘導する物質、脂肪細胞分化を抑制する物質を選択可能なものが好ましい。   The screening method of the present invention is not particularly limited as long as a substance that promotes a decrease in the number of fat cells can be selected. For example, the screening method of the present invention can select a substance that induces apoptosis in adipocytes, a substance that suppresses adipocyte differentiation, a substance that promotes dedifferentiation of adipocytes, and the like. Those capable of selecting a substance that induces apoptosis and a substance that suppresses adipocyte differentiation are preferred.

被験物質が脂肪細胞にアポトーシスを誘導するか否かは、自体公知の方法、例えば、脂肪細胞におけるDNAラダー化の測定、TUNEL染色（例えば、実施例記載の方法）により解析できる。   Whether or not a test substance induces apoptosis in adipocytes can be analyzed by a method known per se, for example, measurement of DNA laddering in adipocytes, TUNEL staining (for example, the method described in Examples).

被験物質が脂肪細胞分化を抑制するか否かは、例えば、被験物質が、前駆細胞から脂肪細胞への分化を抑制するか否か、あるいはＣＤＫ又はサイクリンの発現又は活性を抑制するか否かの評価により解析できる。   Whether the test substance suppresses adipocyte differentiation is, for example, whether the test substance suppresses differentiation from progenitor cells to adipocytes, or whether expression or activity of CDK or cyclin is suppressed. It can be analyzed by evaluation.

（前駆細胞から脂肪細胞への分化を抑制する物質のスクリーニング）
具体的には、被験物質が、前駆細胞から脂肪細胞への分化を抑制するか否かを評価するスクリーニング方法は、以下の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含む：
（ａ）被験物質を、脂肪細胞への分化誘導条件下にある脂肪細胞の前駆細胞に接触させる工程；
（ｂ）上記（ａ）の工程により分化誘導された脂肪細胞数を評価し、該活性を被験物質を接触させない場合に分化誘導された脂肪細胞数と比較する工程；
（ｃ）上記（ｂ）の比較結果に基づいて、脂肪細胞への分化を抑制する被験物質を選択する工程。 (Screening for substances that suppress differentiation of progenitor cells into adipocytes)
Specifically, the screening method for evaluating whether or not the test substance suppresses differentiation from progenitor cells to adipocytes includes the following steps (a), (b) and (c):
(A) contacting the test substance with a progenitor cell of an adipocyte under conditions for inducing differentiation into an adipocyte;
(B) a step of evaluating the number of adipocytes induced to differentiate by the step (a) and comparing the activity with the number of adipocytes induced to be differentiated when the test substance is not contacted;
(C) A step of selecting a test substance that suppresses differentiation into adipocytes based on the comparison result of (b) above.

脂肪細胞の前駆細胞は、脂肪細胞に分化し得るものである限り特に限定されないが、例えば、線維芽細胞（例えば、胎児性線維芽細胞）、3T3-L1細胞、Ob1771細胞、3T3-F442A細胞、OP-9細胞、C3H10T1/2細胞などが挙げられる。   The adipocyte progenitor cells are not particularly limited as long as they can differentiate into adipocytes. For example, fibroblasts (eg, fetal fibroblasts), 3T3-L1 cells, Ob1771 cells, 3T3-F442A cells, Examples include OP-9 cells and C3H10T1 / 2 cells.

脂肪細胞の前駆細胞を脂肪細胞に分化誘導する条件は、公知の条件を使用できる。例えば、分化誘導条件としては、インスリン、デキサメサゾン、イソブチルメチルキサンチン、トログリタゾン活性を有する物質等の分化誘導物質が一種以上添加された培地にて培養するような処理条件下等を意味する。具体的には、Wu Z. et al., Genes & Dev. 9, 2350-2363（1992）等に記載された方法に準じて行えばよい。   Known conditions can be used as conditions for inducing differentiation of adipocyte progenitor cells into adipocytes. For example, the differentiation-inducing condition means treatment conditions such as culturing in a medium to which one or more differentiation-inducing substances such as insulin, dexamethasone, isobutylmethylxanthine, and a substance having troglitazone activity are added. Specifically, it may be performed according to the method described in Wu Z. et al., Genes & Dev. 9, 2350-2363 (1992) and the like.

被験物質と脂肪細胞の前駆細胞との接触は、培養培地中で行われる。培養培地は、例えば、約５〜２０％のウシ胎仔血清を含む最少必須培地（ＭＥＭ）、ダルベッコ改変最少必須培地（ＤＭＥＭ）、ＲＰＭＩ１６４０培地、１９９培地などである。培養条件も同様に適宜決定されるが、例えば、培地のｐＨは約６〜約８であり、培養温度は通常約３０〜約４０℃である。詳細については、例えば、H. Sakaue et al., Mol. Endocrinol. 11, 1552 (2004); Miki et al., Mol. Cell. Biol. 21, 2521 (2001); H. Sakaue et al., Genes & Dev. 16,908 (2002) を参照のこと。   Contact between the test substance and progenitor cells of adipocytes is performed in a culture medium. Examples of the culture medium include a minimum essential medium (MEM) containing about 5 to 20% fetal calf serum, Dulbecco's modified minimum essential medium (DMEM), RPMI 1640 medium, and 199 medium. The culture conditions are appropriately determined in the same manner. For example, the pH of the medium is about 6 to about 8, and the culture temperature is usually about 30 to about 40 ° C. For details, see, for example, H. Sakaue et al., Mol. Endocrinol. 11, 1552 (2004); Miki et al., Mol. Cell. Biol. 21, 2521 (2001); H. Sakaue et al., Genes See & Dev. 16,908 (2002).

脂肪細胞の前駆細胞からの脂肪細胞への分化は、自体公知の方法により確認できる。例えば、かかる分化は、細胞質脂質蓄積の測定（例えば、オイルレッドＯによる染色）、公知の脂肪細胞分化マーカー（例えばａＰ２等）の発現量、や脂肪細胞分化マーカー遺伝子の発現調節領域を機能可能な形で連結されてなるレポーター遺伝子の発現量等を測定するにより確認できる。   Differentiation of adipocytes from precursor cells into adipocytes can be confirmed by a method known per se. For example, such differentiation can function in the measurement of cytoplasmic lipid accumulation (eg, staining with oil red O), the expression level of a known adipocyte differentiation marker (eg, aP2), and the expression regulatory region of the adipocyte differentiation marker gene. This can be confirmed by measuring the expression level of the reporter gene linked in a form.

脂肪細胞数の比較は、好ましくは、有意差の有無に基づいて行なわれ得る。なお、被験物質を接触させない場合に分化誘導された脂肪細胞数は、被験物質を接触させた場合の分化誘導に対し、事前に測定したものであっても、同時に測定した発現量であってもよいが、実験の精度、再現性の観点から同時に測定した脂肪細胞数であることが好ましい。   The comparison of the number of fat cells can be preferably performed based on the presence or absence of a significant difference. Note that the number of adipocytes induced to differentiate when the test substance is not contacted may be measured in advance for the induction of differentiation when the test substance is contacted or may be the expression level measured simultaneously. Although it is good, it is preferably the number of fat cells measured simultaneously from the viewpoint of the accuracy and reproducibility of the experiment.

（ＣＤＫの発現を抑制する物質のスクリーニング）
被験物質がＣＤＫの発現を抑制するか否かを評価するスクリーニング方法は、例えば、以下の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含む：
（ａ）被験物質を、ＣＤＫの発現を測定可能な細胞に接触させる工程；
（ｂ）被験物質を接触させた細胞におけるＣＤＫの発現量を測定し、該発現量を被験物質を接触させない対照細胞におけるＣＤＫの発現量と比較する工程；
（ｃ）上記（ｂ）の比較結果に基づいて、ＣＤＫの発現量を抑制する被験物質を選択する工程。 (Screening of substances that suppress CDK expression)
A screening method for evaluating whether a test substance suppresses the expression of CDK includes, for example, the following steps (a), (b) and (c):
(A) contacting the test substance with a cell capable of measuring the expression of CDK;
(B) measuring the expression level of CDK in cells contacted with the test substance, and comparing the expression level with the expression level of CDK in control cells not contacted with the test substance;
(C) A step of selecting a test substance that suppresses the expression level of CDK based on the comparison result of (b).

「発現を測定可能な細胞」とは、測定対象のｍＲＮＡ又は蛋白質の発現レベルを直接的又は間接的に評価可能な細胞をいう。測定対象のｍＲＮＡ又は蛋白質の発現レベルを直接的に評価可能な細胞としては、測定対象を天然で発現可能な細胞が挙げられ、一方、測定対象のｍＲＮＡ又は蛋白質の発現レベルを間接的に評価可能な細胞としては、測定対象の転写調節領域についてレポーターアッセイを可能とする細胞が挙げられる。   The “cell whose expression can be measured” refers to a cell capable of directly or indirectly evaluating the expression level of mRNA or protein to be measured. Cells that can directly evaluate the expression level of the mRNA or protein to be measured include cells that can naturally express the measurement object, while the expression level of the mRNA or protein to be measured can be indirectly evaluated. Examples of such cells include cells that enable a reporter assay for the transcriptional regulatory region to be measured.

測定対象、例えばＣＤＫを天然で発現可能な細胞は、ＣＤＫｍＲＮＡを潜在的に発現するものである限り特に限定されず、ＣＤＫを恒常的に発現している細胞、ＣＤＫを誘導条件下（例えば、薬物での処理）で発現する細胞などであり得る。また、当該細胞として、初代培養細胞、当該初代培養細胞から誘導された細胞株、市販の細胞株、セルバンクより入手可能な細胞株などを用いることができる。   The measurement target, for example, a cell capable of naturally expressing CDK is not particularly limited as long as it can potentially express CDK mRNA, and is a cell that constantly expresses CDK, under conditions that induce CDK (eg, drug And the like. In addition, as the cells, primary cultured cells, cell lines derived from the primary cultured cells, commercially available cell lines, cell lines available from cell banks, and the like can be used.

測定対象、例えばＣＤＫの転写調節領域についてレポーターアッセイを可能とする細胞は、ＣＤＫの転写調節領域、当該領域に機能可能に連結されたレポーター遺伝子を含む細胞である。ＣＤＫの転写調節領域、レポーター遺伝子は、好ましくは、複製可能なベクター中に挿入されている。   A cell that enables a reporter assay for a measurement target, for example, a transcriptional regulatory region of CDK, is a cell that includes a transcriptional regulatory region of CDK and a reporter gene operably linked to the region. The transcriptional regulatory region of CDK and the reporter gene are preferably inserted into a replicable vector.

ＣＤＫの転写調節領域は、ＣＤＫの発現を制御している領域である限り特に限定されないが、例えば、転写開始点から上流約２ｋｂｐの塩基配列からなるＤＮＡ等のＤＮＡ、あるいは当該ＤＮＡの塩基配列において１以上の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、ＣＤＫの転写を制御する能力を有するＤＮＡなどを挙げることができる。   The transcriptional regulatory region of CDK is not particularly limited as long as it is a region that controls the expression of CDK. For example, in DNA such as DNA consisting of a base sequence of about 2 kbp upstream from the transcription start point, or in the base sequence of the DNA Examples thereof include DNA having a base sequence in which one or more bases are deleted, substituted or added, and having the ability to control the transcription of CDK.

レポーター遺伝子は、検出可能なタンパク又は酵素をコードする遺伝子であればよく、例えばＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）遺伝子、ＧＵＳ（β−グルクロニダーゼ）遺伝子、ＬＵＳ（ルシフェラーゼ）遺伝子、ＣＡＴ（クロラムフェニコルアセチルトランスフェラーゼ）遺伝子等が挙げられる。   The reporter gene may be any gene that encodes a detectable protein or enzyme. For example, the GFP (green fluorescent protein) gene, GUS (β-glucuronidase) gene, LUS (luciferase) gene, CAT (chloramphenicol acetyltransferase) ) Genes and the like.

ＣＤＫの転写調節領域、当該領域に機能可能に連結されたレポーター遺伝子が導入される細胞は、ＣＤＫの転写調節機能を評価できる限り、即ち、該レポーター遺伝子の発現量が定量的に解析可能である限り特に限定されない。しかしながら、ＣＤＫに対する生理的な転写調節因子を発現し、ＣＤＫの発現調節の評価により適切であると考えられることから、該導入される細胞としては、脂肪細胞（例えば、白色脂肪細胞）が好ましい。   A cell into which a transcriptional regulatory region of CDK and a reporter gene operably linked to the region are introduced can be quantitatively analyzed as long as the transcriptional regulatory function of CDK can be evaluated, that is, the expression level of the reporter gene. There is no particular limitation. However, the cells to be introduced are preferably adipocytes (for example, white adipocytes) because they express a physiological transcriptional regulatory factor for CDK and are considered to be more appropriate for evaluation of CDK expression regulation.

被験物質と脂肪細胞の前駆細胞との接触は、培養培地中で行われる。培養培地は、ＣＤＫの発現を測定可能な細胞に応じて適宜選択されるが、例えば、約５〜２０％のウシ胎仔血清を含む最少必須培地（ＭＥＭ）、ダルベッコ改変最少必須培地（ＤＭＥＭ）、ＲＰＭＩ１６４０培地、１９９培地などである。培養条件も同様に適宜決定されるが、例えば、培地のｐＨは約６〜約８であり、培養温度は通常約３０〜約４０℃であり、培養時間は約１２〜約７２時間である。   Contact between the test substance and progenitor cells of adipocytes is performed in a culture medium. The culture medium is appropriately selected depending on the cells capable of measuring the expression of CDK. For example, a minimal essential medium (MEM) containing about 5 to 20% fetal calf serum, Dulbecco's modified minimal essential medium (DMEM), RPMI 1640 medium, 199 medium, and the like. The culture conditions are appropriately determined in the same manner. For example, the pH of the medium is about 6 to about 8, the culture temperature is usually about 30 to about 40 ° C., and the culture time is about 12 to about 72 hours.

ＣＤＫを発現可能な細胞を用いた場合、発現量の測定は、ｍＲＮＡ又は蛋白質を対象として行なわれる。ｍＲＮＡの発現量は、例えば、細胞からtotal ＲＮＡを調製し、ＲＴ−ＰＣＲ、ノザンブロッティング等により測定される。蛋白質の発現量は、例えば、細胞から抽出液を調製し、免疫学的手法により測定することができる。免疫学的手法としては、放射性同位元素免疫測定法（ＲＩＡ法）、ＥＬＩＳＡ法（Methods in Enzymol. 70: 419-439 (1980)）、蛍光抗体法などを用いることができる。また、レポーター遺伝子を含む細胞が用いられた場合、発現量は、レポーター遺伝子のシグナル強度に基づき測定される。   When cells capable of expressing CDK are used, the expression level is measured for mRNA or protein. The expression level of mRNA is measured, for example, by preparing total RNA from cells and performing RT-PCR, Northern blotting or the like. The amount of protein expression can be measured, for example, by preparing an extract from cells and immunologically. As an immunological technique, a radioisotope immunoassay (RIA method), an ELISA method (Methods in Enzymol. 70: 419-439 (1980)), a fluorescent antibody method, or the like can be used. When cells containing a reporter gene are used, the expression level is measured based on the signal intensity of the reporter gene.

また、ＣＤＫを発現可能な細胞を用いた場合、核内ＣＤＫの発現量（即ち、細胞質から核内に移行したＣＤＫ量）を測定、評価してもよい。細胞内局在は、自体公知の方法により測定できる。例えば、レポーター遺伝子と融合させたＣＤＫ遺伝子を適切な細胞に導入し、培養培地において被験物質の存在下で培養する。次いで、共焦点顕微鏡により細胞内、核内における蛍光シグナルを観察し、被験物質の非存在下での共焦点顕微鏡像と比較すればよい。また、ＣＤＫ抗体を用いる免疫染色によっても、ＣＤＫの細胞内局在を測定できる。   When cells capable of expressing CDK are used, the expression level of nuclear CDK (that is, the amount of CDK transferred from the cytoplasm into the nucleus) may be measured and evaluated. The intracellular localization can be measured by a method known per se. For example, a CDK gene fused with a reporter gene is introduced into an appropriate cell and cultured in a culture medium in the presence of a test substance. Next, the fluorescence signal in the cell and nucleus can be observed with a confocal microscope and compared with a confocal microscope image in the absence of the test substance. Further, the intracellular localization of CDK can also be measured by immunostaining using a CDK antibody.

発現量の比較は、好ましくは、有意差の有無に基づいて行なわれ得る。なお、被験物質を接触させない対照細胞におけるＣＤＫの発現量は、被験物質を接触させた細胞におけるＣＤＫの発現量の測定に対し、事前に測定した発現量であっても、同時に測定した発現量であってもよいが、実験の精度、再現性の観点から同時に測定した発現量であることが好ましい。   The comparison of expression levels can be preferably performed based on the presence or absence of a significant difference. It should be noted that the expression level of CDK in the control cells not contacted with the test substance is the expression level measured at the same time, even if the expression level was measured in advance with respect to the CDK expression level in the cells contacted with the test substance. Although it may be present, it is preferably the expression level measured simultaneously from the viewpoint of the accuracy and reproducibility of the experiment.

（ＣＤＫの活性を抑制する物質のスクリーニング）
被験物質がＣＤＫの活性を抑制するか否かを評価するスクリーニング方法は、例えば、以下の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含む：
（ａ）被験物質を、ＣＤＫ、サイクリンに接触させる工程；
（ｂ）上記（ａ）の工程に起因して生じるＣＤＫの活性を測定し、該活性を被験物質を接触させない場合のＣＤＫの活性と比較する工程；
（ｃ）上記（ｂ）の比較結果に基づいて、ＣＤＫの活性の抑制をもたらす被験物質を選択する工程。 (Screening for substances that suppress CDK activity)
A screening method for evaluating whether a test substance suppresses the activity of CDK includes, for example, the following steps (a), (b) and (c):
(A) contacting the test substance with CDK or cyclin;
(B) a step of measuring the activity of CDK resulting from the step (a) and comparing the activity with the activity of CDK when not contacting the test substance;
(C) A step of selecting a test substance that brings about suppression of CDK activity based on the comparison result of (b) above.

ＣＤＫの活性は、測定又は評価が可能なものである限り特に限定されないが、例えば、サイクリンとＣＤＫとの結合活性、サイクリン−ＣＤＫ複合体とＣＤＫインヒビターとの結合活性、あるいはＣＤＫインヒビター存在下、非存在下におけるＣＤＫのキナーゼ活性などに基づき測定、評価される。従って、工程（ａ）において、被験物質は、さらにＣＤＫインヒビターと接触されてもよい。   The activity of CDK is not particularly limited as long as it can be measured or evaluated. For example, the activity of binding between cyclin and CDK, the activity of binding between cyclin-CDK complex and CDK inhibitor, or in the presence of CDK inhibitor, It is measured and evaluated based on the kinase activity of CDK in the presence. Therefore, in the step (a), the test substance may be further contacted with a CDK inhibitor.

サイクリン、ＣＤＫ、ＣＤＫインヒビターには、それぞれ、機能性複合体を形成可能な組合せが存在する。従って、サイクリン、ＣＤＫ、ＣＤＫインヒビターは、それぞれ適切な組合せで用いられる。これら適切な組合せは当該分野で公知であり、また、当業者であれば容易に決定できる。例えば、ｐ２７Ｋｉｐ１はサイクリンＤ及びサイクリンＥと結合することが知られている。また、サイクリンＤはＣＤＫ４／６と、サイクリンＥはＣＤＫ２と結合することが知られている。従って、例えば、サイクリン、ＣＤＫ、ＣＤＫインヒビターを用いる場合には、サイクリンＥ、ＣＤＫ２、ｐ２７Ｋｉｐ１の組合せを使用できる。 There are combinations of cyclins, CDKs, and CDK inhibitors that can each form a functional complex. Therefore, cyclin, CDK, and CDK inhibitor are used in an appropriate combination. These appropriate combinations are known in the art and can be readily determined by one skilled in the art. For example, p27 Kip1 is known to bind to cyclin D and cyclin E. Cyclin D is known to bind to CDK4 / 6 and cyclin E to CDK2. Thus, for example, when using a cyclin, CDK, or CDK inhibitor, a combination of cyclin E, CDK2, and p27 Kip1 can be used.

ＣＤＫ、サイクリン、ＣＤＫインヒビターの各タンパク質は、自体方法により入手できる。例えば、これらのタンパク質は、それぞれ、哺乳動物においてこれらを発現している任意の組織より、又はこれらを発現している哺乳動物由来の細胞株より入手できる。また、これらのタンパク質は、当該タンパク質をコードする核酸分子を用いて細胞系・無細胞系にて合成できる。また、市販されている場合には、市販のタンパク質を使用できる。なお、これらタンパク質は、必ずしも精製される必要はなく、ＣＤＫ活性を測定することができる限り、他のタンパク質等の共雑物を含んでいてもよい。   CDK, cyclin, and CDK inhibitor proteins can be obtained by their own methods. For example, each of these proteins can be obtained from any tissue that expresses them in mammals, or from cell lines derived from mammals that express them. In addition, these proteins can be synthesized in a cell system or a cell-free system using a nucleic acid molecule encoding the protein. Moreover, when it is marketed, commercially available protein can be used. These proteins are not necessarily purified, and may contain other contaminants such as other proteins as long as CDK activity can be measured.

結合活性は、当該分野で公知の相互作用解析法、例えば、免疫学的手法、表面プラズモン共鳴、バインディングアッセイ（binding assay）等によって測定、評価できる。例えば、ＣＤＫ、サイクリンのいずれか一方をチップ上に固定し、他方のタンパク質及び被験物質を含有する溶液を該チップ上にロードし、ＣＤＫ、サイクリン、被験物質を接触させる。次いで、表面プラズモン共鳴法により、被験物質の存在下でサイクリンとＣＤＫの結合及び解離を測定し、上記２種の蛋白質を含有するが、被験物質を含有しない溶液をチップ上にロードした場合の結合及び解離と比較する。そして、結合及び解離の速度あるいは結合量についての比較結果に基づいて、サイクリンとＣＤＫとの結合を抑制する被験物質が選択される。   The binding activity can be measured and evaluated by an interaction analysis method known in the art, for example, immunological technique, surface plasmon resonance, binding assay, and the like. For example, either CDK or cyclin is immobilized on a chip, a solution containing the other protein and a test substance is loaded on the chip, and CDK, cyclin, and a test substance are brought into contact with each other. Subsequently, the binding and dissociation of cyclin and CDK are measured by surface plasmon resonance in the presence of the test substance, and the binding when the solution containing the above two proteins but not the test substance is loaded on the chip. And compare with dissociation. Then, a test substance that suppresses the binding between cyclin and CDK is selected based on the comparison result of the binding and dissociation rates or binding amounts.

ＣＤＫのキナーゼ活性は、自体公知の方法により測定、評価できる。例えば、キナーゼ活性は、放射性同位体を用いて測定、評価される。具体的には、ＣＤＫ存在下において、基質蛋白質（例えば、ヒストンＨ１）のセリンまたはスレオニン残基に、32Ｐ標識したＡＴＰを作用させ、標識モノリン酸基を導入し、基質蛋白質に取り込まれた32Ｐ量をオートラジオグラフィーまたはシンチレーションカウンターで検出することによりリン酸化された基質蛋白質の量が測定され、その基質蛋白質の量からＣＤＫの活性が算出される。 The kinase activity of CDK can be measured and evaluated by a method known per se. For example, kinase activity is measured and evaluated using a radioisotope. Specifically, in the presence of CDK, a substrate protein (e.g., histone H1) to serine or threonine residues, reacted with 32 P-labeled ATP, labeled monophosphate groups introduced, was incorporated into the substrate protein 32 The amount of phosphorylated substrate protein is measured by detecting the amount of P by autoradiography or a scintillation counter, and the activity of CDK is calculated from the amount of the substrate protein.

また、ＣＤＫのキナーゼ活性は、放射性同位体を用いずに測定、評価できる（例えば、特開２００２−３３５９９７参照）。また、他の方法としては、サイクリン／ＣＤＫ複合体の、ＲＢタンパク質またはその部分ペプチドに対するリン酸化酵素活性の測定（例えば、ＷＯ０１／０１１３６７参照）、リン酸化ＲＢを特異的に認識する抗ＲＢ抗体を用いる方法（例えば、特開２００２−３５０４３８参照）などが挙げられる。   The kinase activity of CDK can be measured and evaluated without using a radioisotope (see, for example, JP-A-2002-335997). Other methods include measurement of phosphorylase activity of cyclin / CDK complex against RB protein or a partial peptide thereof (for example, refer to WO01 / 011367), and anti-RB antibody that specifically recognizes phosphorylated RB. The method used (for example, refer to JP-A-2002-350438).

活性の比較は、好ましくは、有意差の有無に基づいて行なわれ得る。なお、被験物質を接触させない場合におけるＣＤＫの活性は、被験物質を接触させた場合におけるＣＤＫの活性の測定に対し、事前に測定した活性であっても、同時に測定した活性であってもよいが、実験の精度、再現性の観点から同時に測定した活性であることが好ましい。   The comparison of activity can be preferably performed based on the presence or absence of a significant difference. The CDK activity in the case where the test substance is not contacted may be the activity measured in advance or the activity measured simultaneously with respect to the measurement of the CDK activity in the case where the test substance is contacted. The activity measured simultaneously from the viewpoint of the accuracy and reproducibility of the experiment is preferable.

（ＣＤＫインヒビターの発現を促進する物質のスクリーニング方法）
また、ＣＤＫの活性を抑制する物質のスクリーニング方法は、ＣＤＫインヒビターの発現を促進する物質のスクリーニング方法であり得る。 (Method of screening for substance that promotes expression of CDK inhibitor)
Moreover, the screening method for a substance that suppresses CDK activity can be a screening method for a substance that promotes the expression of a CDK inhibitor.

被験物質がＣＤＫインヒビターの発現を促進するか否かを評価するスクリーニング方法は、例えば、以下の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含む：
（ａ）被験物質を、ＣＤＫインヒビターの発現を測定可能な細胞に接触させる工程；
（ｂ）被験物質を接触させた細胞におけるＣＤＫインヒビターの発現量を測定し、該発現量を被験物質を接触させない対照細胞におけるＣＤＫインヒビターの発現量と比較する工程；
（ｃ）上記（ｂ）の比較結果に基づいて、ＣＤＫインヒビターの発現量を促進する被験物質を選択する工程。 A screening method for evaluating whether a test substance promotes the expression of a CDK inhibitor includes, for example, the following steps (a), (b) and (c):
(A) contacting the test substance with a cell capable of measuring the expression of a CDK inhibitor;
(B) measuring the expression level of the CDK inhibitor in the cell contacted with the test substance, and comparing the expression level with the expression level of the CDK inhibitor in the control cell not contacted with the test substance;
(C) A step of selecting a test substance that promotes the expression level of the CDK inhibitor based on the comparison result of (b).

ＣＤＫインヒビターの発現を測定可能な細胞とは、測定対象としてＣＤＫインヒビターｍＲＮＡ又は蛋白質の発現レベルを直接的又は間接的に評価可能な細胞である。   A cell capable of measuring the expression of a CDK inhibitor is a cell capable of directly or indirectly evaluating the expression level of CDK inhibitor mRNA or protein as a measurement target.

本スクリーニング方法は、ＣＤＫの発現を抑制する物質のスクリーニング方法（上述）に準じて行うことができる。例えば、発現量の測定は、ｍＲＮＡ又は蛋白質を対象として行なわれる。また、核内ＣＤＫインヒビターの発現量（即ち、細胞質から核内に移行したＣＤＫインヒビター量）を測定、評価してもよい。   This screening method can be performed in accordance with a screening method for substances that suppress CDK expression (described above). For example, the expression level is measured for mRNA or protein. Further, the expression level of a CDK inhibitor in the nucleus (that is, the amount of CDK inhibitor transferred from the cytoplasm into the nucleus) may be measured and evaluated.

（サイクリンの発現を抑制する物質のスクリーニング方法）
被験物質がサイクリンの発現を抑制するか否かを評価するスクリーニング方法は、例えば、以下の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含む：
（ａ）被験物質を、サイクリンの発現を測定可能な細胞に接触させる工程；
（ｂ）被験物質を接触させた細胞におけるサイクリンの発現量を測定し、該発現量を被験物質を接触させない対照細胞におけるサイクリンの発現量と比較する工程；
（ｃ）上記（ｂ）の比較結果に基づいて、サイクリンの発現量を抑制する被験物質を選択する工程。 (Screening method for substances that suppress cyclin expression)
A screening method for evaluating whether a test substance suppresses the expression of cyclin includes, for example, the following steps (a), (b), and (c):
(A) contacting the test substance with a cell capable of measuring cyclin expression;
(B) measuring the expression level of cyclin in a cell contacted with a test substance, and comparing the expression level with the expression level of cyclin in a control cell not contacted with the test substance;
(C) A step of selecting a test substance that suppresses the expression level of cyclin based on the comparison result of (b).

サイクリンの発現を測定可能な細胞とは、測定対象としてサイクリンｍＲＮＡ又は蛋白質の発現レベルを直接的又は間接的に評価可能な細胞である。   A cell capable of measuring the expression of cyclin is a cell capable of directly or indirectly evaluating the expression level of cyclin mRNA or protein as a measurement target.

本スクリーニング方法は、ＣＤＫの発現を抑制する物質のスクリーニング方法（上述）に準じて行うことができる。例えば、発現量の測定は、ｍＲＮＡ又は蛋白質を対象として行なわれる。また、核内サイクリンの発現量（即ち、細胞質から核内に移行したサイクリン量）を測定、評価してもよい。   This screening method can be performed in accordance with a screening method for substances that suppress CDK expression (described above). For example, the expression level is measured for mRNA or protein. Further, the expression level of cyclin in the nucleus (that is, the amount of cyclin transferred from the cytoplasm into the nucleus) may be measured and evaluated.

本発明のスクリーニング方法は、インスリン抵抗性の改善が所望される疾患・状態、例えば糖尿病（例えば、２型糖尿病）、高脂血症、高血圧、動脈硬化、高尿酸血症・痛風、冠動脈疾患・心筋梗塞・狭心症、脳梗塞・脳血栓・一過性脳虚血発作、肥満・肥満症、なかでも糖尿病（例えば、２型糖尿病）の予防・治療剤の有効成分として有用である。   The screening method of the present invention comprises a disease / condition in which improvement in insulin resistance is desired, such as diabetes (for example, type 2 diabetes), hyperlipidemia, hypertension, arteriosclerosis, hyperuricemia / gout, coronary artery disease / It is useful as an active ingredient of a prophylactic / therapeutic agent for myocardial infarction / angina pectoris, cerebral infarction / cerebral thrombosis / transient cerebral ischemic attack, obesity / obesity, especially diabetes (for example, type 2 diabetes).

３．アポトーシス誘導剤
本発明は、上述した式（Ｉ）で表される化合物またはその塩を含有するアポトーシス誘導剤を提供する。 3. Apoptosis Inducing Agent The present invention provides an apoptosis inducing agent containing the compound represented by the above formula (I) or a salt thereof.

本発明のアポトーシス誘導剤は、脂肪細胞（例えば、白色脂肪細胞）に対するアポトーシスを誘導できる。また、アポトーシス誘導は、脂肪細胞特異的であり得る。例えば、本発明のアポトーシス誘導剤は、膵臓細胞、肝細胞に対するアポトーシスを実質的に誘導しない。   The apoptosis inducer of the present invention can induce apoptosis of adipocytes (for example, white adipocytes). Apoptosis induction can also be adipocyte specific. For example, the apoptosis inducer of the present invention does not substantially induce apoptosis of pancreatic cells and hepatocytes.

上記式（Ｉ）で表される化合物またはその塩は、さらに細胞増殖抑制活性（例えば、ＣＤＫ阻害活性）をさらに有し得る。従って、本発明のアポトーシス誘導剤は、細胞（特に、脂肪細胞）数の低下作用に優れる。   The compound represented by the above formula (I) or a salt thereof may further have cytostatic activity (for example, CDK inhibitory activity). Therefore, the apoptosis-inducing agent of the present invention is excellent in the effect of reducing the number of cells (particularly adipocytes).

本発明のアポトーシス誘導剤は、糖尿病（例えば、２型糖尿病）、肥満・肥満症等の疾患の予防・治療において、あるいは研究用試薬として有用である。また、本発明のアポトーシス誘導剤は、インスリン抵抗性を示す癌患者、例えば癌と糖尿病とを併発した患者に対して特に有用である。   The apoptosis-inducing agent of the present invention is useful in the prevention and treatment of diseases such as diabetes (for example, type 2 diabetes), obesity and obesity, or as a research reagent. In addition, the apoptosis inducer of the present invention is particularly useful for cancer patients exhibiting insulin resistance, for example, patients with cancer and diabetes.

本明細書中で挙げられた特許および特許出願明細書を含む全ての刊行物に記載された内容は、本明細書での引用により、その全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれるものである。   The contents of all publications, including patents and patent application specifications cited in this specification, are hereby incorporated by reference herein to the same extent as if all were explicitly stated. Is.

以下に実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説明するが、本発明は下記実施例等に何ら制約されるものではない。   The present invention will be described in more detail with reference to the following examples, but the present invention is not limited to the following examples.

（材料及び方法）
抗体、試薬、ペプチド
PCNAに対するマウスモノクローナル抗体は、Santa-Cruz Biotechnologyから購入した。ロスコビチンは、Sigma-Aldrichcorporation (St. Louis, Missouri) から入手した。活性型カスパーゼ３、CDK2に対するポリクローナル抗体は、それぞれCell Signaling Technology、Santa-Cruz Biotechnologyから購入した。プルバラノールA はCalbiochemから入手した。HIV-TAT蛋白より同定された蛋白導入ペプチド（RRRQRRKKRG：配列番号１）を有するCDK2阻害ペプチド（TYTKKQVLRMAHLVLKVLTFDLCRRRQRRKKRG：配列番号２）は、既報[C. Gondeau et al., J. Biol. Chem. 280(14):13793-800 (2005)]に従い、Sigma Aldrich Japanにて合成し入手した。 (Materials and methods)
Antibodies, reagents, peptides
Mouse monoclonal antibody against PCNA was purchased from Santa-Cruz Biotechnology. Roscovitine was obtained from Sigma-Aldrichcorporation (St. Louis, Missouri). Polyclonal antibodies against activated caspase 3 and CDK2 were purchased from Cell Signaling Technology and Santa-Cruz Biotechnology, respectively. Purvalanol A was obtained from Calbiochem. A CDK2 inhibitory peptide (TYTKKQVLRMAHLVLKVLTFDLCRRRQRRKKRG: SEQ ID NO: 2) having a protein transduction peptide (RRRQRRKKRG: SEQ ID NO: 1) identified from HIV-TAT protein has been reported [C. Gondeau et al., J. Biol. Chem. 280 (14 ): 13793-800 (2005)] and synthesized and obtained at Sigma Aldrich Japan.

細胞培養
3T3-L1細胞は、既報〔H. Sakaue et al., Mol. Endocrinol. 11, 1552 (2004)〕記載の通り維持し、5μg/mlインスリン、1μM デキサメタゾン、0.5 mM イソブチルメチルキサンチン、及び10μM トログリタゾンでの刺激により脂肪細胞への分化を誘導した。p27Kip1発現3T3-L1細胞は、既報〔J.Yamamoto et al., J. Biol. Chem. 279(17): 16954-62 (2004)〕に従い、組換えレトロウイルスベクターを使用して作製した。オイルレッドOでの細胞染色は、既報〔E.Hu et al., Science. 274, 2100 (1996)〕に従い行った。 Cell culture
3T3-L1 cells were maintained as described previously [H. Sakaue et al., Mol. Endocrinol. 11, 1552 (2004)], and were treated with 5 μg / ml insulin, 1 μM dexamethasone, 0.5 mM isobutylmethylxanthine, and 10 μM troglitazone. The differentiation into adipocytes was induced by stimulation. p27 Kip1- expressing 3T3-L1 cells were prepared using a recombinant retroviral vector according to a previous report [J. Yamamoto et al., J. Biol. Chem. 279 (17): 16954-62 (2004)]. Cell staining with oil red O was performed according to a report [E. Hu et al., Science. 274, 2100 (1996)].

組織学
脂肪組織は、各動物から取り出し、緩衝化10%ホルムアルデヒド中で一晩固定し、パラフィンに包埋した。
白色脂肪組織（WAT）をおよそ5μmの切片に切断し、シラン化スライドに載せた。脂肪組織はH&Eで染色した。無作為に選択した少なくとも300個の脂肪細胞の平均直径は、画像解析ソフトMacSCOPE (Mitani Corporation, Fukui, Japan) を用いて解析、計算した。脂肪細胞のアポトーシスは、DNAラダー化及び市販のキットDeadEnd(登録商標) Colorimetric TUNEL System (Promega) により検出した。 Histology Adipose tissue was removed from each animal, fixed in buffered 10% formaldehyde overnight and embedded in paraffin.
White adipose tissue (WAT) was cut into approximately 5 μm sections and mounted on silanized slides. Adipose tissue was stained with H & E. The average diameter of at least 300 adipocytes selected at random was analyzed and calculated using the image analysis software MacSCOPE (Mitani Corporation, Fukui, Japan). Adipocyte apoptosis was detected by DNA laddering and the commercially available kit DeadEnd® Colorimetric TUNEL System (Promega).

TUNEL法
TUNEL法によるアポトーシスの測定は、DeadEnd TM Colorimetric TUNEL System(Promega)を用いて行った。具体的には、まず、切片を脱パラフィンしたあと20μg/ml のproteinase Kで抗原の賦活化を行い、その後、アポトーシスの生化学的指標となる核DNA断片の3’-OH末端を、TDT(terminal deoxynucleotidyl transferase) を用いてビオチン化ヌクレオチドで標識した。その後、ホースラディシュペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジンを、ビオチン化DNA断片に結合させて、ペルオキシダーゼの基質である過酸化水素と安定化色素diaminobenzidine(DAB) により、発色させ、アポトーシス細胞の核を検出した。 TUNEL method
Apoptosis was measured by the TUNEL method using the DeadEnd ™ Colorimetric TUNEL System (Promega). Specifically, first, the sections were deparaffinized, antigens were activated with 20 μg / ml proteinase K, and then the 3′-OH end of a nuclear DNA fragment serving as a biochemical index of apoptosis was replaced with TDT ( Terminal deoxynucleotidyl transferase) was used to label with biotinylated nucleotides. Subsequently, horseradish peroxidase-labeled streptavidin was bound to a biotinylated DNA fragment and developed with hydrogen peroxide as a substrate for peroxidase and a stabilizing dye diaminobenzidine (DAB) to detect the nuclei of apoptotic cells.

CDK2活性測定法
各動物から取りだした脂肪組織を、既報[O. Tetsu et al., Cancer Cell. 3:233-45 (2003)]に従い、抗CDK2特異抗体を用いて免疫沈降した後、ヒストンH1を用いて、ヒストンH1のリン酸化能によってCDK2活性を測定した。 CDK2 activity measurement method Adipose tissue taken from each animal was immunoprecipitated with anti-CDK2 specific antibody according to the report [O. Tetsu et al., Cancer Cell. 3: 233-45 (2003)], and then histone H1 Was used to measure CDK2 activity by the phosphorylation ability of histone H1.

統計学的解析
データは、平均±SEMとして示した。２群間の有意差は、Student’s unpaired two-tailed t検定で評価した。解析は、StatViewソフトウェアプログラムを用いて行った。 Statistical analysis data were expressed as mean ± SEM. Significant differences between the two groups were evaluated by Student's unpaired two-tailed t test. Analysis was performed using the StatView software program.

実施例１：脂肪細胞数が低下すると、インスリン抵抗性が改善する
１．１．ロスコビチンの投与により、インスリン抵抗性が改善される
糖代謝に対するロスコビチンの影響を検討するため、ロスコビチン投与時、非投与時における普通食（NC:normal content）給餌C57BL/6マウス、db/db肥満マウス、高脂肪食（HF:high fat）給餌C57BL/6マウスの空腹時、食後血糖値、インスリンレベルを解析した。
その結果、7週齢db/db肥満マウスへのロスコビチンの腹腔内投与は、9週齢又は10週齢マウスの食後血糖値を劇的に低下 (P<0.05) させた（図１）。対照的に、7-10週齢のC57BL/6マウスでは、食後血糖値に全く差異はなかった（図１）。db/db肥満マウスへのロスコビチン投与はまた、空腹時血糖値、血漿インスリンレベルの低下(それぞれ、261.20±22.42 vs. 138.66±17.71; P<0.05、2442.55±729.47 vs. 1551.70±161.00;P<0.05) を引き起こした（図２）。ロスコビチン処置C57BL/6マウスにおける空腹時グルコース及びインスリンレベルは、緩衝液処置C57BL/6マウスのそれと同様であった。グルコース経口投与後のグルコース消失率は、緩衝液処置db/db肥満マウスよりもロスコビチン処置db/dbマウスで高かった（データ示さず）。ロスコビチン投与肝臓中のトリグリセリド（TG）含量は、緩衝液投与のものよりも低かった（図３）。摂食量もまた、ロスコチビン処置db/dbマウスと緩衝液処置db/dbマウスとの間で非常に類似していた（表２）。これらの知見は、ロスコビチンが遺伝性肥満に伴うインスリン抵抗性を顕著に改善することを示す。
ロスコビチン処置したHF給餌マウスの食後及び空腹時グルコース濃度は、緩衝液処置したHF給餌マウスのそれと同様であった（図４（Ａ））。しかしながら、ロスコビチン処置HF給餌マウスの食後インスリンレベルは、緩衝液処置HF給餌マウスのそれよりも低かった(1463.35±191.19 vs.2568.52±306.90: P<0.05)（図４（Ｂ））。経口糖負荷は、ロスコビチン処置HF給餌マウスで僅かに改善されたが（図５（Ａ））、これは、30分に、2-3倍低いインスリン濃度を必要とした（図５（Ｂ））。このことは、ロスコビチンがHF食によるインスリン抵抗性を顕著に改善することを示す。
以上より、ロスコビチンの投与によりインスリン抵抗性が顕著に改善されることが示された。 Example 1: Insulin resistance improves when the number of fat cells decreases
1.1. In order to investigate the effect of roscovitine on glucose metabolism, which improves insulin resistance by administration of roscovitine, C57BL / 6 mice and db / db obese mice fed normal content (NC) with and without roscovitine administration The fasting, postprandial blood glucose level, and insulin level of C57BL / 6 mice fed with high fat diet (HF) were analyzed.
As a result, intraperitoneal administration of roscovitine to 7-week-old db / db obese mice dramatically reduced the postprandial blood glucose level of 9-week-old or 10-week-old mice (P <0.05) (FIG. 1). In contrast, there was no difference in postprandial blood glucose levels in 7-10 week old C57BL / 6 mice (FIG. 1). Roscovitine administration to db / db obese mice also reduced fasting blood glucose and plasma insulin levels (261.20 ± 22.42 vs. 138.66 ± 17.71; P <0.05, 2445.55 ± 729.47 vs. 1551.70 ± 161.00; P <0.05, respectively) ) (Fig. 2). Fasting glucose and insulin levels in roscovitine-treated C57BL / 6 mice were similar to those of buffer-treated C57BL / 6 mice. The rate of glucose disappearance after oral administration of glucose was higher in roscovitine-treated db / db mice than in buffer-treated db / db obese mice (data not shown). The triglyceride (TG) content in the roscovitine-treated liver was lower than that in the buffer-treated (FIG. 3). Food intake was also very similar between roscotivine-treated and buffer-treated db / db mice (Table 2). These findings indicate that roscovitine significantly improves insulin resistance associated with hereditary obesity.
Postprandial and fasting glucose concentrations of HF-fed mice treated with roscovitine were similar to those of HF-fed mice treated with buffer (FIG. 4 (A)). However, postprandial insulin levels in roscovitine treated HF fed mice were lower than that in buffer treated HF fed mice (1463.35 ± 191.19 vs. 2568.52 ± 306.90: P <0.05) (FIG. 4B). Oral glucose tolerance was slightly improved in roscovitine-treated HF-fed mice (FIG. 5 (A)), which required 2-3-fold lower insulin concentrations in 30 minutes (FIG. 5 (B)). . This indicates that roscovitine significantly improves insulin resistance due to the HF diet.
From the above, it was shown that administration of roscovitine significantly improves insulin resistance.

１．２．ロスコビチンの投与により、脂肪細胞数が低下する
実施例１の結果を踏まえ、ロスコビチンのどのような性質がインスリン抵抗性の改善に寄与したのかを考察したところ、非特許文献５の知見（上述）より、脂肪細胞数の低下がインスリン抵抗性を改善し得る可能性が考えられた。即ち、ロスコビチンが脂肪細胞のサイクリン依存性キナーゼ(CDK) を阻害することで脂肪細胞の増殖を抑制し、脂肪細胞数の低下をもたらすことにより、インスリン抵抗性が改善される可能性が想定された。そこで、上記仮説を検証するため、ロスコビチンの投与により脂肪細胞数が低下するか否かを評価した。なお、脂肪細胞数の評価は、白色脂肪組織(WAT) における脂肪細胞を対象とした。
その結果、ロスコビチン100mg/kgを1日間、1日2回、7週齢のNC給餌C57BL/6マウス、HF給餌C57BL/6マウス、db/db肥満マウスに腹腔内投与したところ、DNA合成マーカーである増殖細胞核抗原(PCNA) の発現が急速に低下した（データ示さず）。興味深いことに、ロスコビチン100mg/kgを5日間、1日2回、7週齢のNC給餌マウスではなく、HF給餌C57BL/6マウス、db/db肥満マウスに腹腔内投与したところ、試験した全てのWAT重量が13週齢で有意に減少した（図６、表２）。ロスコビチン処置マウスと緩衝液処置マウスとの間で、BAT、肝臓、筋肉の重量に差異はなかった（表２）。組織学的解析（図７）に示される通り、ロスコビチン処置db/dbマウス、HF給餌マウスの精巣上体WATの脂肪細胞サイズは、緩衝液処置マウスのものと同様であった。脂肪細胞直径の測定は、平均脂肪細胞サイズもまた同様であることを示した（図８、９）。同じ結果がまた、皮下WATで観察された（データ示さず）。
以上より、ロスコビチンの投与によりWATにおける脂肪細胞数が低下することが示された。
また、１．１．及び１．２．より、脂肪細胞数を低下させると、インスリン抵抗性が改善することが示唆された。 1.2. Based on the results of Example 1 in which the number of adipocytes decreases due to the administration of roscovitine, what properties of roscovitine contributed to the improvement of insulin resistance were examined. Therefore, it was considered that a decrease in the number of fat cells may improve insulin resistance. In other words, it was assumed that roscovitine could inhibit insulin cells by suppressing the proliferation of adipocytes by inhibiting adipocyte cyclin-dependent kinase (CDK), resulting in a decrease in the number of adipocytes. . Therefore, in order to verify the above hypothesis, it was evaluated whether or not the number of adipocytes was reduced by administration of roscovitine. The number of adipocytes was evaluated for adipocytes in white adipose tissue (WAT).
As a result, roscovitine 100 mg / kg was intraperitoneally administered to 7-week-old NC-fed C57BL / 6 mice, HF-fed C57BL / 6 mice, and db / db obese mice once a day for 2 days. The expression of certain proliferating cell nuclear antigen (PCNA) decreased rapidly (data not shown). Interestingly, roscovitine 100 mg / kg was administered intraperitoneally to HF-fed C57BL / 6 mice and db / db obese mice instead of 7-week-old NC-fed mice twice daily for 5 days. The WAT weight decreased significantly at 13 weeks of age (FIG. 6, Table 2). There were no differences in BAT, liver, or muscle weight between roscovitine-treated and buffer-treated mice (Table 2). As shown in histological analysis (FIG. 7), the fat cell size of epididymal WAT of roscovitine-treated db / db mice and HF-fed mice was similar to that of buffer-treated mice. Measurement of adipocyte diameter showed that the average adipocyte size was also similar (FIGS. 8, 9). The same results were also observed with subcutaneous WAT (data not shown).
From the above, it was shown that administration of roscovitine reduces the number of fat cells in WAT.
In addition, 1.1. And 1.2. From these results, it was suggested that insulin resistance improves when the number of fat cells is decreased.

１．３．プルバラノールAの投与により、脂肪細胞数が低下し、インスリン抵抗性が改善される
１．１．並びに１．２．と同様にプルバラノールAの影響を検討した。７週齢db/db肥満マウスへのプルバラノールAの腹腔内投与は、９週齢または１０週齢の食後血糖を低下させた（図１０（Ａ）、（Ｂ））。またdb/db肥満マウスへのプルバラノールAの投与はまた、食後血漿インスリンレベルの低下（4445.84±995.18 vs. 3075.00±496.23）を引き起こした（図１０（Ｃ））。さらにdb/db肥満マウスへのプルバラノールAの投与は、１１週齢のWAT重量の減少を誘導したが（図１１（Ａ））、脂肪細胞直径の測定では、脂肪細胞サイズに変化は与えなかった（図１１（Ｂ））。
以上より、ロスコビチンと同様に、プルバラノールAは、脂肪細胞数が低下させることで、インスリン抵抗性を改善させることが示された。 1.3. Administration of purvalanol A reduces the number of fat cells and improves insulin resistance 1.1. And 1.2. The effect of purvalanol A was examined in the same manner as above. Intraperitoneal administration of purvalanol A to 7-week-old db / db obese mice reduced postprandial blood glucose at 9 or 10 weeks of age (FIGS. 10A and 10B). Also, administration of purvalanol A to db / db obese mice also caused a decrease in postprandial plasma insulin levels (4445.84 ± 995.18 vs. 3075.00 ± 496.23) (FIG. 10 (C)). Furthermore, administration of purvalanol A to db / db obese mice induced a decrease in the weight of WAT at 11 weeks of age (FIG. 11 (A)), but the adipocyte size did not change in the measurement of adipocyte diameter. (FIG. 11B).
From the above, it was shown that, like roscovitine, purvalanol A improves insulin resistance by reducing the number of fat cells.

実施例２：CDKインヒビターの過剰発現により、前駆細胞からの脂肪細胞の分化が抑制される
次いで、本発明者らは、ロスコビチン以外の、脂肪細胞数の低下を促進する物質を探索するため、CDKインヒビターが脂肪細胞数の低下を引き起こすか否かを3T3-L1細胞（白色脂肪細胞分化の研究用に十分に特徴付けられたモデル）を用いて検討した。
その結果、3T3-L1細胞におけるp27Kip1過剰発現は、細胞質脂質蓄積により確認したところ、コントロールに比し、インスリン、デキサメタゾン、及びイソブチルメチルキサンチン(MDI) +トログリタゾン処理による脂肪細胞への分化を阻害し（データ示さず）、そして、誘導8日後の脂肪細胞マーカーの発現を阻害した（図１２）。
以上より、CDKインヒビターは、前駆細胞からの脂肪細胞の分化を抑制することにより脂肪細胞数を低下させ得ることが示された。従って、CDKインヒビターの投与によりインスリン抵抗性が改善し得ると考えられる。 Example 2: Overexpression of CDK inhibitor suppresses differentiation of adipocytes from progenitor cells Next, the present inventors searched for a substance other than roscovitine that promotes a decrease in the number of adipocytes. Whether the inhibitor caused a decrease in the number of adipocytes was examined using 3T3-L1 cells (a well-characterized model for white adipocyte differentiation studies).
As a result, overexpression of p27 Kip1 in 3T3-L1 cells was confirmed by cytoplasmic lipid accumulation, and compared to controls, differentiation into adipocytes by insulin, dexamethasone, and isobutylmethylxanthine (MDI) + troglitazone treatment was inhibited. (Data not shown) and adipocyte marker expression 8 days after induction was inhibited (FIG. 12).
From the above, it was shown that CDK inhibitors can reduce the number of adipocytes by suppressing the differentiation of adipocytes from progenitor cells. Therefore, it is considered that insulin resistance can be improved by administration of a CDK inhibitor.

実施例３：ロスコビチン、プラバラノールAは活性型カスパーゼ3およびアポトーシスの誘導能を有する
３．１．ロスコビチンはアポトーシス誘導能を有する
ロスコビチンによるインスリン抵抗性の顕著な改善は、ＣＤＫの阻害に基づく脂肪細胞増殖抑制作用のみならず、その他の作用との相乗効果に起因する可能性が考えられた。インスリン抵抗性の改善に寄与する脂肪細胞増殖抑制作用以外の作用としては、脂肪細胞に対するアポトーシス誘導能、脂肪細胞の脱分化作用等が考えられたため、先ず、ロスコビチンがアポトーシス誘導能を有するか否かについて検討した。
その結果、緩衝液処置C57BL/6マウス、および緩衝液処置HF給餌マウスの精巣上体WATでは、ほとんどアポトーシスが検出されなかったのに対し（それぞれ2.92% 1.92%）、ロスコビチン処置C57BL/6マウス、およびロスコビチン処置HF給餌マウスでは、3割前後(それぞれ26.52% 30.29%)の脂肪細胞がアポトーシス陽性細胞であった（図１３、１４）。また、緩衝液またはロスコビチン処置HF給餌マウスの肝臓、膵臓では、アポトーシスはほとんど検出されなかった（図１５）。
以上より、ロスコビチン処置により、脂肪細胞においてアポトーシスが亢進することが明らかとなった。また、ロスコビチンによるインスリン抵抗性の顕著な改善は、脂肪細胞増殖抑制作用と脂肪細胞特異的アポトーシス誘導作用の相乗効果に起因し得ることが示された。さらに、ロスコビチンによるアポトーシス誘導能は脂肪細胞に高い選択性を有することから、ロスコビチンはインスリン抵抗性の改善剤として極めて有用であることが明らかとなった。 Example 3: Roscovitine and plavalanol A have the ability to induce active caspase 3 and apoptosis
3.1. Roscovitine has the ability to induce apoptosis, and the remarkable improvement in insulin resistance by roscovitine may be attributed not only to the adipocyte proliferation-suppressing action based on the inhibition of CDK but also to synergistic effects with other actions. Other than the adipocyte growth-inhibiting action that contributes to the improvement of insulin resistance, apoptosis induction ability for adipocytes, dedifferentiation action of adipocytes, etc. were considered. First, whether roscovitine has apoptosis induction ability or not Was examined.
As a result, almost no apoptosis was detected in the epididymal WAT of buffer-treated C57BL / 6 mice and buffer-treated HF-fed mice (2.92% 1.92% respectively), whereas roscovitine-treated C57BL / 6 mice, In the HF-fed mice treated with roscovitine, about 30% (each 26.52% 30.29%) of adipocytes were apoptosis-positive cells (FIGS. 13 and 14). In addition, almost no apoptosis was detected in the liver and pancreas of HF-fed mice treated with buffer or roscovitine (FIG. 15).
From the above, it was clarified that apoptosis is enhanced in adipocytes by roscovitine treatment. Moreover, it was shown that the remarkable improvement of insulin resistance by roscovitine can be attributed to a synergistic effect of the adipocyte proliferation inhibitory action and the adipocyte-specific apoptosis inducing action. Furthermore, since the apoptosis-inducing ability by roscovitine has high selectivity for adipocytes, it was revealed that roscovitine is extremely useful as an agent for improving insulin resistance.

３．２．ロスコビチン、プルバラノールAは、活性型カスパーゼ３を誘導する
次いで、ロスコビチン、プルバラノールAが活性型カスパーゼ３を誘導するか否かについて検討した。
その結果、緩衝液処置db/db肥満マウスに比べ、ロスコビチンのdb/db肥満マウスへの投与は、精巣上体WATでの活性型カスパーゼ３の著明な誘導を引き起こした（図１６（Ａ））。同様にプルバラノールAの投与も、精巣上体WATでの活性型カスパーゼ３の著明な誘導を引き起こした（図１６（Ｂ））。またロスコビチンと同様に、プルバラノールAの投与のdb/db肥満マウスへの投与は、DNA合成マーカーである増殖細胞核抗原（PCNA）の発現を急速に低下させた（データ示さず）。
以上より、プルバラノールAのインスリン抵抗性の顕著な改善は、ロスコビチンと同様に、脂肪細胞増殖抑制作用と脂肪細胞特異的アポトーシス誘導作用の相乗効果に起因し得ることが示された。 3.2. Roscovitine and purvalanol A induce active caspase 3 Next, whether roscovitine and purvalanol A induce active caspase 3 was examined.
As a result, compared to buffer-treated db / db obese mice, administration of roscovitine to db / db obese mice caused a marked induction of active caspase 3 in epididymal WAT (FIG. 16A). ). Similarly, administration of purvalanol A also caused a significant induction of active caspase 3 in epididymal WAT (FIG. 16 (B)). Similarly to roscovitine, administration of purvalanol A to db / db obese mice rapidly reduced the expression of proliferating cell nuclear antigen (PCNA), a DNA synthesis marker (data not shown).
From the above, it was shown that the remarkable improvement in the insulin resistance of purvalanol A can be attributed to the synergistic effect of the adipocyte proliferation inhibitory action and the adipocyte-specific apoptosis inducing action, similarly to roscovitine.

実施例４：肥満によりWATでのCDK2活性が誘導され、CDK2特異的阻害ペプチドは血糖を改善する
４．１．肥満によりWATでのCDK2活性が誘導される
肥満によるWATでのCDK2活性が誘導されるか検討するため、NC給餌C57BL/6マウス（１５週齢）、HF給餌C57BL/6マウス（１５週齢）、db/db肥満マウス（１０週齢）の精巣上体WATにおけるCDK2活性を測定した。
その結果、HF給餌C57BL/6マウス、db/db肥満マウスにおいて、著明なCDK2活性が検出された（図１７）。これは肥満における脂肪細胞増殖を示すものである。
４．２．CDK2阻害ペプチドは血糖を改善する
７週齢db/db肥満マウスへのCDK2阻害ペプチドの腹腔内投与(30mg/kg)は、９週齢または１０週齢の食後血糖を低下させた（図１８（Ａ））。また3mg/kgでの投与では、９週齢の食後血糖を低下させた（図１８（Ｂ））。
以上より、CDK2の阻害により、血糖が改善し得ることが示された。 Example 4: Obesity induces CDK2 activity in WAT and CDK2-specific inhibitory peptides improve blood glucose
4.1. Obesity induces CDK2 activity in WAT In order to investigate whether CDK2 activity in WAT is induced by obesity, NC fed C57BL / 6 mice (15 weeks old), HF fed C57BL / 6 mice (15 weeks old) CDK2 activity in epididymal WAT of db / db obese mice (10 weeks old) was measured.
As a result, remarkable CDK2 activity was detected in HF-fed C57BL / 6 mice and db / db obese mice (FIG. 17). This indicates adipocyte proliferation in obesity.
4.2. CDK2 inhibitory peptide improves blood glucose Intraperitoneal administration (30 mg / kg) of CDK2 inhibitory peptide to 7-week-old db / db obese mice reduced postprandial blood glucose at 9 or 10 weeks of age (FIG. 18 ( A)). In addition, administration at 3 mg / kg reduced postprandial blood glucose at 9 weeks of age (FIG. 18B).
From the above, it was shown that blood glucose can be improved by inhibiting CDK2.

実施例５：脂肪細胞分化を評価する、インスリン抵抗性を改善し得る物質のスクリーニング
脂肪細胞の前駆細胞として3T3-L1細胞を用いる。脂肪細胞の前駆細胞を、インスリン、デキサメタゾン、及びイソブチルメチルキサンチン (MDI)+トログリタゾンで48時間処理し、被験物質の存在下、非存在下37℃で7日培養する。培養後、細胞質脂質量をオイルレッドOでの染色により測定する。被験物質の存在下で培養された細胞における細胞質脂質量を、被験物質の非存在下で培養された細胞における細胞質脂質量と比較し、被験物質が前駆細胞から脂肪細胞への分化を抑制したか否かを評価する。 Example 5: Screening for a substance capable of improving insulin resistance for evaluating adipocyte differentiation 3T3-L1 cells are used as progenitor cells for adipocytes. Adipocyte progenitor cells are treated with insulin, dexamethasone, and isobutylmethylxanthine (MDI) + troglitazone for 48 hours, and cultured in the presence of the test substance at 37 ° C. for 7 days. After incubation, the amount of cytoplasmic lipid is measured by staining with oil red O. Whether the amount of cytoplasmic lipid in cells cultured in the presence of the test substance was compared with the amount of cytoplasmic lipid in cells cultured in the absence of the test substance, and the test substance suppressed differentiation from progenitor cells to adipocytes Evaluate whether or not.

実施例６：サイクリンとCDKとの結合活性を測定する、インスリン抵抗性を改善し得る物質のスクリーニング
６．１．組換えp27 kip1 の調製
ヒトp27kip1をコードするcDNAを、pET21a (Novagen製) にサブクローニングし、C末端にヘキサヒスチジン配列が付加されたp27kip1をコードするコンストラクトを作製する。p27kip1をBL21(DE3) 細胞で発現させ、8 M尿素、50 mM Tris-HCL (pH 7.4)、20 mMイミダゾールを含有する溶液中で該細胞をソニケーションする。次いで、遠心分離により清澄化し、Ni2+-NTAアガロースに4℃で1時間結合させる。カラムを、0.5M塩化ナトリウム、50mMTris (pH 7.4)、20% グリセロール中、6 M - 0.75 M尿素の逆勾配により洗浄し、200 mMイミダゾール、20mM HEPES (pH7.4)、1 M KCl、100 mM EDTAで溶出させる。溶出液をHBB緩衝液 (25 mM HEPES-KOH (pH 7.7),25 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 0.05% NP-40, 1 mM DTT)に対して一晩透析することにより組換えp27kip1を精製し、使用時まで-80℃で保存する。 Example 6: Screening for a substance capable of improving insulin resistance by measuring the binding activity between cyclin and CDK
6.1. Preparation of recombinant p27 kip1 A cDNA encoding human p27 kip1 is subcloned into pET21a (manufactured by Novagen) to produce a construct encoding p27 kip1 with a hexahistidine sequence added to the C-terminus. p27 kip1 is expressed in BL21 (DE3) cells and sonicated in a solution containing 8 M urea, 50 mM Tris-HCL (pH 7.4), 20 mM imidazole. It is then clarified by centrifugation and bound to Ni 2+ -NTA agarose for 1 hour at 4 ° C. The column is washed with a reverse gradient of 6 M-0.75 M urea in 0.5 M sodium chloride, 50 mM Tris (pH 7.4), 20% glycerol, 200 mM imidazole, 20 mM HEPES (pH 7.4), 1 M KCl, 100 mM Elute with EDTA. Recombinant p27 kip1 was dialyzed overnight against HBB buffer (25 mM HEPES-KOH (pH 7.7), 25 mM NaCl, 5 mM MgCl 2 , 0.05% NP-40, 1 mM DTT). Purify and store at -80 ° C until use.

６．２．BIACORE（登録商標）によるスクリーニング
既報[Anal Biochem. 1998; 265 (2):340-50.]に従う一般的な方法によりBIACORE（登録商標）を用いる。組換えサイクリンE（例えば1〜10μg）を10mMの酢酸バッファー（pH4）に溶解し、BIACORE（登録商標）のセンサーチップCM5の表面のマトリックスにカルボキシル基を介して固定化する。HBSバッファー（アマシャムファルマシア バイオテク株式会社製）をセンサーチップに20μl/分の流速で流し、バックグラウンドの値を記録する。途中から10nM〜10μMの被験物質、実施例４．１．で調製したp27kip1、既報に従い調製したCDK2を含有するHBSバッファーに切り替えて１分間流し、被験物質の結合に伴う値の変化を記録する。次いで、被験物質を含有しないがp27kip1、CDK2を含有するHBSバッファーに切り替え、被験物質の不在下での値の変化を記録する。結合と解離の速度、あるいは最大結合量から、サイクリンE- CDK2複合体に対するp27kip1の結合を調節する被験物質を選択する。 6.2. BIACORE (registered trademark ) is used by a general method according to the previous screening report [Anal Biochem. 1998; 265 (2): 340-50.] By BIACORE (registered trademark). Recombinant cyclin E (for example, 1 to 10 μg) is dissolved in 10 mM acetate buffer (pH 4) and immobilized on a matrix on the surface of BIACORE® sensor chip CM5 via a carboxyl group. Flow HBS buffer (Amersham Pharmacia Biotech Co., Ltd.) through the sensor chip at a flow rate of 20 μl / min, and record the background value. Test substance of 10 nM to 10 μM from the middle, Example 4.1. Switch to HBS buffer containing p27 kip1 and CDK2 prepared according to the previous report for 1 minute, and record the change in value associated with the binding of the test substance. Subsequently, the test substance is not contained but is switched to an HBS buffer containing p27 kip1 and CDK2, and the change in the value in the absence of the test substance is recorded. A test substance that modulates the binding of p27 kip1 to the cyclin E-CDK2 complex is selected based on the rate of binding and dissociation, or the maximum amount of binding.

本発明の改善剤は、ＣＤＫ阻害因子の発現・活性の調節という新規作用機序によりインスリン抵抗性の改善が所望される疾患・状態を予防・治療し得る。本発明のスクリーニング方法は、インスリン抵抗性を改善し得る物質の開発を可能とする。本発明の化合物又はその塩は、アポトーシス誘導作用、およびアポトーシス誘導作用とＣＤＫの阻害作用との相乗効果により、糖尿病等の疾患の予防・治療し得、あるいは研究用試薬として使用し得る。   The ameliorating agent of the present invention can prevent or treat diseases / conditions for which improvement of insulin resistance is desired by a novel mechanism of action of regulating the expression / activity of CDK inhibitors. The screening method of the present invention enables the development of a substance that can improve insulin resistance. The compound of the present invention or a salt thereof can prevent or treat diseases such as diabetes or can be used as a research reagent due to an apoptosis-inducing action and a synergistic effect of apoptosis-inducing action and CDK-inhibiting action.

緩衝液又はロスコビチン処置した7-10週齢のC57BL/6マウス、db/db肥満マウスの食後グルコース濃度を示す図である。□：緩衝液処置C57BL/6マウス；■：ロスコビチン処置C57BL/6マウス；○：緩衝液処置db/db肥満マウス；●：ロスコビチン処置db/db肥満マウス。It is a figure which shows the postprandial glucose level of the C57BL / 6 mouse | mouth of a 7-10 week old and db / db obesity mouse | mouth treated with the buffer solution or roscovitine. □: Buffer-treated C57BL / 6 mice; ■: Roscovitine-treated C57BL / 6 mice; ○: Buffer-treated db / db obese mice; ●: Roscovitine-treated db / db obese mice. （Ａ）緩衝液 (Ｂ)、又はロスコビチン (Ｒ) 処置したC57BL/6マウス (Ｃｏｎｔ)、db/db肥満マウス (ｄｂ／ｄｂ) における空腹時グルコース濃度を示す図である。 （Ｂ）緩衝液 (Ｂ)、又はロスコビチン (Ｒ) 処置したC57BL/6マウス (Ｃｏｎｔ)、db/db肥満マウス (ｄｂ／ｄｂ) における空腹時インスリン濃度を示す図である。(A) Fasting glucose concentration in C57BL / 6 mice (Cont) and db / db obese mice (db / db) treated with buffer (B) or roscovitine (R). (B) Fasting insulin concentrations in C57BL / 6 mice (Cont) and db / db obese mice (db / db) treated with buffer (B) or roscovitine (R). （Ａ）緩衝液 (Ｂ)、又はロスコビチン (Ｒ) 処置したdb/db肥満マウス肝臓の組織学的切片の拡大図である。 （Ｂ）緩衝液 (Ｂ)、又はロスコビチン (Ｒ) 処置したdb/db肥満マウスの肝トリグリセリド (TG) 含量を示す図である。(A) Enlarged view of histological section of liver of db / db obese mouse treated with buffer (B) or roscovitine (R). (B) It is a figure which shows the liver triglyceride (TG) content of the buffer solution (B) or the roscovitine (R) treated db / db obese mouse. （Ａ）緩衝液 (Ｂ)、又はロスコビチン (Ｒ) 処置したHF給餌肥満マウスの空腹時、食後グルコース濃度を示す図である。 （Ｂ）緩衝液 (Ｂ)、又はロスコビチン (Ｒ) 処置したHF給餌肥満マウスの空腹時、食後インスリン濃度を示す図である。(A) Buffer solution (B) or roscovitine (R) is a graph showing fasting and postprandial glucose concentrations in HF-fed obese mice treated. (B) Fasting and postprandial insulin concentrations in HF-fed obese mice treated with buffer (B) or roscovitine (R). （Ａ）緩衝液 (●)、又はロスコビチン (○) 処置したHF給餌肥満マウスの経口糖負荷試験の結果を示す図である。 （Ｂ）緩衝液 (Ｂ)、又はロスコビチン (Ｒ) 処置したHF給餌肥満マウスの経口糖負荷試験におけるインスリン濃度の経時的変化を示す図である。(A) It is a figure which shows the result of the oral glucose tolerance test of the buffer solution ((circle)) or roscovitine ((circle)) treatment HF feeding obese mouse | mouth. (B) It is a figure which shows the time-dependent change of the insulin concentration in the oral glucose tolerance test of the buffer solution (B) or the roscovitine (R) treatment HF feeding obese mouse | mouth. NC食給餌C57BL/6マウス (Cont)、HF給餌C57BL/6マウス (ＨＦ)、db/db肥満マウス (ｄｂ/ｄｂ) の精巣上体WAT重量／体重(BW) を示す図である。It is a figure which shows the epididymis WAT weight / body weight (BW) of NC food feeding C57BL / 6 mouse (Cont), HF feeding C57BL / 6 mouse (HF), and db / db obese mouse (db / db). 緩衝液 (Ｂ)、又はロスコビチン (Ｒ) 処置したdb/db肥満マウス (ｄｂ／ｄｂ)、HF給餌C57BL/6マウス (ＨＦ) の精巣上体WATの組織学的切片の拡大図である。It is an enlarged view of the histological section of epididymal WAT of db / db obese mice (db / db) or HF-fed C57BL / 6 mice (HF) treated with buffer (B) or roscovitine (R). 緩衝液 (Ｂ)、又はロスコビチン (Ｒ) 処置したHF給餌C57BL/6マウス (ＨＦ)、db/db肥満マウス (ｄｂ／ｄｂ) の脂肪細胞について平均細胞サイズを示す図である。It is a figure which shows the average cell size about the fat cell of the HF feeding C57BL / 6 mouse | mouth (HF) and db / db obese mouse | mouth (db / db) treated with the buffer solution (B) or the roscovitine (R). （Ａ）緩衝液 (○)、又はロスコビチン (●) 処置したHF給餌C57BL/6マウス精巣上体WATに存在する脂肪細胞のサイズ分布を示す図である。 （Ｂ）緩衝液 (○)、又はロスコビチン (●) 処置したdb/db肥満マウス精巣上体WATに存在する脂肪細胞のサイズ分布を示す図である。(A) Buffer solution (◯) or roscovitine (●) is a graph showing the size distribution of adipocytes present in the treated HF-fed C57BL / 6 mouse epididymal WAT. (B) Buffer solution (◯) or roscovitine (●) is a diagram showing the size distribution of adipocytes present in the epididymal WAT of db / db obese mice treated. （Ａ）、（Ｂ）緩衝液、又はプルバラノールA(30mg/kgと10mg/kg)処置したdb/db肥満マウスの食後グルコース濃度を示す図である。○：緩衝液処置db/db肥満マウス；●プルバラノールA処置db/db肥満マウス。（Ｃ）緩衝液（Ｂ）、又はプルバラノールA（Ｐ）を10mg/kgにて投与開始後3週間目（10週齢）における食後インスリン濃度を示す図である。It is a figure which shows the postprandial glucose level of the db / db obesity mouse | mouth treated with (A), (B) buffer solution or purvalanol A (30 mg / kg and 10 mg / kg). O: Buffer-treated db / db obese mice; ● Pulvalanol A-treated db / db obese mice. (C) It is a figure which shows the postprandial insulin density | concentration in the 3rd week (10-week-old) after a start of a buffer solution (B) or the administration of a purvalanol A (P) at 10 mg / kg. （Ａ）緩衝液（Ｂ）、又はプルバラノールA（Ｐ）処置したdb/db肥満マウスの精巣上体WAT/体重を示す図である。P-10、P-30はそれぞれ10mg/kg、30mg/kg投与を示す。 （Ｂ）緩衝液（○）、又はプルバラノールA（●）処置したdb/db肥満マウスの精巣上体WATに存在する脂肪細胞のサイズ分布を示す図である。(A) Epididymal WAT / body weight of db / db obese mice treated with buffer (B) or purvalanol A (P). P-10 and P-30 indicate 10 mg / kg and 30 mg / kg administration, respectively. (B) Size distribution of adipocytes present in epididymal WAT of db / db obese mice treated with buffer (◯) or purvalanol A (●). p27Kip1過剰発現3T3-L1細胞における脂肪細胞マーカーmRNAの、正常3T3-L1細胞のそれに対する相対的発現(RT-PCRにより解析) を示す図である。It is a figure which shows the relative expression (analyzed by RT-PCR) with respect to that of the normal 3T3-L1 cell of the adipocyte marker mRNA in p27 Kip1 overexpression 3T3-L1 cell. 緩衝液 (Ｂ)、又はロスコビチン (Ｒ) 処置した普通食 (ＮＣ) 又は高脂肪食 (ＨＦ) を与えたC57BL/6マウスの精巣上体白色脂肪組織についてTUNEL法の結果を示す図である。It is a figure which shows the result of the TUNEL method about the epididymis white adipose tissue of the C57BL / 6 mouse | mouth which gave the buffer solution (B) or the roscovitine (R) treatment normal diet (NC), or the high fat diet (HF). （Ａ）緩衝液 (Ｂ)、又はロスコビチン (Ｒ) 処置した普通食 (ＮＣ) を与えたC57BL/6マウス精巣上体の白色脂肪組織におけるアポトーシス頻度を示す図である。 （Ｂ）緩衝液 (Ｂ)、又はロスコビチン (Ｒ) 処置した高脂肪食 (ＨＦ) を与えたC57BL/6マウスの精巣上体白色脂肪組織におけるアポトーシス頻度を示す図である。(A) It is a figure which shows the apoptosis frequency in the white adipose tissue of the C57BL / 6 mouse epididymis which gave the buffer solution (B) or the roscovitine (R) treated normal diet (NC). (B) It is a figure which shows the apoptosis frequency in the epididymal white adipose tissue of the C57BL / 6 mouse | mouth which gave the buffer solution (B) or the roscovitine (R) treated high fat diet (HF). （Ａ）緩衝液 (Ｂ)、又はロスコビチン (Ｒ) 処置した高脂肪食 (ＨＦ) を与えたC57BL/6マウスの膵臓についてTUNEL法の結果を示す図である。 （Ｂ）緩衝液 (Ｂ)、又はロスコビチン (Ｒ) 処置した高脂肪食 (ＨＦ) を与えたC57BL/6マウスの肝臓についてTUNEL法の結果を示す図である。(A) It is a figure which shows the result of the TUNEL method about the pancreas of the C57BL / 6 mouse | mouth which gave the buffer solution (B) or the roscovitine (R) treatment high fat diet (HF). (B) It is a figure which shows the result of a TUNEL method about the liver of the C57BL / 6 mouse | mouth which gave the buffer solution (B) or the roscovitine (R) treated high fat diet (HF). （Ａ）緩衝液、又はロスコビチン処置（３回投与直後）したdb/db肥満マウスの精巣上体における活性型カスパーゼ３の発現を、特異抗体でウエスタンブロットにより確認した結果を示す図である。 （Ｂ）（Ａ）と同様の検討をプルバラノールA(30mg/kg)にて実施した図である。(A) It is a figure which shows the result of having confirmed the expression of the active caspase 3 in the epididymis of the db / db obese mouse | mouth treated with buffer solution or roscovitine (immediately after 3 times administration) with the specific antibody by the western blot. (B) It is the figure which implemented the examination similar to (A) with the purvalanol A (30 mg / kg). NC給餌C57BL/6マウス（１５週齢）、HF給餌C57BL/6マウス（１５週齢）、db/db肥満マウス（１０週齢）の精巣上体WATにおけるCDK2活性を示す図である。It is a figure which shows CDK2 activity in epididymis WAT of NC feeding C57BL / 6 mouse (15 weeks old), HF feeding C57BL / 6 mouse (15 weeks old), and db / db obese mice (10 weeks old). （Ａ）緩衝液、又はCDK2阻害ペプチド(30mg/kg)処置したdb/db肥満マウスの食後グルコース濃度を示す図である。○：緩衝液処置db/db肥満マウス；●CDK2阻害ペプチド処置db/db肥満マウス。 （Ｂ）（Ａ）と同様の検討をCDK2阻害ペプチド(3mg/kg)にて実施した図である。(A) It is a figure which shows the postprandial glucose concentration of the db / db obesity mouse | mouth treated with the buffer solution or the CDK2 inhibitory peptide (30 mg / kg). O: Buffer-treated db / db obese mice; ● CDK2-inhibiting peptide-treated db / db obese mice. (B) It is the figure which implemented the same examination as (A) with the CDK2 inhibitory peptide (3 mg / kg).

Claims (24)

脂肪細胞数の低下を促進する物質を含有してなる、インスリン抵抗性の改善剤。 An agent for improving insulin resistance, comprising a substance that promotes a decrease in the number of fat cells. 脂肪細胞数の低下を促進する物質が、前駆細胞から脂肪細胞への分化を抑制し得る物質、または脂肪細胞のアポトーシスを誘導し得る物質である、請求項１記載の剤。 The agent according to claim 1, wherein the substance that promotes a decrease in the number of fat cells is a substance that can suppress differentiation of progenitor cells into adipocytes, or a substance that can induce apoptosis of adipocytes. 脂肪細胞数の低下を促進する物質が、ＣＤＫの発現又は活性を抑制する物質である、請求項１記載の剤。 The agent according to claim 1, wherein the substance that promotes a decrease in the number of fat cells is a substance that suppresses the expression or activity of CDK. ＣＤＫの発現又は活性を抑制する物質が、以下（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）のいずれかである、請求項３記載の剤：
（ｉ）ＣＤＫアンチセンス核酸、ＣＤＫリボザイム、ＣＤＫデコイ核酸、ＣＤＫｓｉＲＮＡ、ＣＤＫ抗体、およびＣＤＫ抗体をコードする核酸からなる群より選ばれるＣＤＫの発現を抑制する物質；
（ｉｉ）ドミナントネガティブ変異体、および当該変異体をコードする核酸からなる群より選ばれるＣＤＫの活性を抑制する物質；あるいは
（ｉｉｉ）（ｉ）、（ｉｉ）のいずれかの核酸を含む発現ベクター。 The agent according to claim 3, wherein the substance that suppresses the expression or activity of CDK is any one of the following (i), (ii), and (iii):
(I) a substance that suppresses the expression of CDK selected from the group consisting of CDK antisense nucleic acid, CDK ribozyme, CDK decoy nucleic acid, CDK siRNA, CDK antibody, and nucleic acid encoding CDK antibody;
(Ii) a substance that suppresses the activity of CDK selected from the group consisting of a dominant negative mutant and a nucleic acid encoding the mutant; or (iii) an expression vector comprising any nucleic acid of (i) or (ii) . ＣＤＫが、ＣＤＫ１、ＣＤＫ２、ＣＤＫ５またはＣＤＫ７である、請求項３記載の剤。 The agent according to claim 3, wherein the CDK is CDK1, CDK2, CDK5 or CDK7. 脂肪細胞数の低下を促進する物質が、下記式（Ｉ）：
〔式中、Ｒ1、Ｒ２は、各々独立して、水素原子、置換されていてもよいＣ１〜Ｃ８アルキル基、置換されていてもよいＣ２ 〜Ｃ８アルケニル基、置換されていてもよいＣ２〜Ｃ８アルキニル基、置換されていてもよいＣ１ 〜Ｃ８アシル基、置換されていてもよい芳香族または非芳香族のＣ３〜Ｃ１４炭化水素環基、あるいは置換されていてもよい芳香族または非芳香族のＣ３〜Ｃ１４複素環基であり；
Ｒ３は、水素原子、置換されていてもよいＣ１ 〜Ｃ８アルキル基、置換されていてもよいＣ２〜Ｃ８アルケニル基、置換されていてもよいＣ２ 〜Ｃ８アルキニル基、置換されていてもよいＣ１〜Ｃ８アシル基であり；
環Ａは、置換されていてもよい芳香族または非芳香族のＣ３〜Ｃ１４炭化水素環基、あるいは置換されていてもよい芳香族または非芳香族のＣ３〜Ｃ１４複素環基であり；
Ｘは、−Ｏ−、−Ｓ−または−ＮＲ４−（式中、Ｒ４は、水素原子、置換されていてもよいＣ1 〜Ｃ８アルキル基、置換されていてもよいＣ２ 〜Ｃ８アルケニル基、置換されていてもよいＣ２〜Ｃ８アルキニル基、置換されていてもよいＣ1 〜Ｃ８アシル基、置換されていてもよい芳香族または非芳香族のＣ３〜Ｃ１４炭化水素環基、置換されていてもよい芳香族または非芳香族のＣ３〜Ｃ１４複素環基である）であり；
Ｙは、結合手または−（ＣＨ２）ｎ−（式中、ｎは１〜３である）である。〕で表される化合物、あるいはその塩である、請求項１記載の剤。 A substance that promotes a decrease in the number of fat cells is represented by the following formula (I):
[Wherein R 1 and R 2 are each independently a hydrogen atom, an optionally substituted C 1 -C 8 alkyl group, an optionally substituted C 2 -C 8 alkenyl group, or a substituted group. which may be C 2 -C 8 alkynyl group, an optionally substituted C 1 -C 8 acyl group, an aromatic substituted or non-aromatic C 3 -C 14 hydrocarbon ring group or a substituted, An aromatic or non-aromatic C 3 to C 14 heterocyclic group which may be substituted;
R 3 is a hydrogen atom, an optionally substituted C 1 -C 8 alkyl group, an optionally substituted C 2 -C 8 alkenyl group, an optionally substituted C 2 -C 8 alkynyl group, a substituted It is be a good C 1 -C 8 acyl group;
Ring A is an optionally substituted aromatic or non-aromatic C 3 to C 14 hydrocarbon ring group, or an optionally substituted aromatic or non-aromatic C 3 to C 14 heterocyclic group. Yes;
X is —O—, —S— or —NR 4 — (wherein R 4 is a hydrogen atom, an optionally substituted C 1 -C 8 alkyl group, or an optionally substituted C 2 -C 8 alkenyl groups, optionally substituted C 2 -C 8 alkynyl groups, optionally substituted C 1 -C 8 acyl groups, optionally substituted aromatic or non-aromatic C 3 -C 14 A hydrocarbon ring group, which is an optionally substituted aromatic or non-aromatic C 3 -C 14 heterocyclic group);
Y is a bond or — (CH 2 ) n — (wherein n is 1 to 3). The agent of Claim 1 which is a compound represented by this, or its salt. ＣＤＫの発現又は活性を抑制する物質が、ＣＤＫインヒビター、ＣＤＫインヒビターをコードする核酸、あるいは当該核酸を含む発現ベクターである、請求項３記載の剤。 The agent according to claim 3, wherein the substance that suppresses the expression or activity of CDK is a CDK inhibitor, a nucleic acid encoding a CDK inhibitor, or an expression vector containing the nucleic acid. ＣＤＫインヒビターがｐ２７Ｋｉｐ１またはｐ２１Ｃｉｐ１である、請求項７記載の剤。 The agent according to claim 7, wherein the CDK inhibitor is p27 Kip1 or p21 Cip1 . 脂肪細胞数の低下を促進する物質が、サイクリンの発現を抑制する物質である、請求項１記載の剤。 The agent according to claim 1, wherein the substance that promotes a decrease in the number of fat cells is a substance that suppresses the expression of cyclin. インスリン抵抗性が肥満に起因するものである、請求項１記載の剤。 The agent according to claim 1, wherein insulin resistance is caused by obesity. 被験物質が脂肪細胞数の低下を促進するか否かを評価することを含む、インスリン抵抗性を改善し得る物質のスクリーニング方法。 A method for screening a substance capable of improving insulin resistance, comprising evaluating whether a test substance promotes a decrease in the number of fat cells. 前駆細胞から脂肪細胞への分化を抑制し得る物質、または脂肪細胞のアポトーシスを誘導し得る物質を探索する、請求項１１記載の方法。 The method according to claim 11, wherein a substance capable of suppressing differentiation of progenitor cells into adipocytes or a substance capable of inducing apoptosis of adipocytes is searched. 以下の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含むＣＤＫの活性を抑制し得る物質のスクリーニング方法である、請求項１１記載の方法：
（ａ）被験物質を、ＣＤＫ、サイクリンに接触させる工程；
（ｂ）上記（ａ）の工程に起因して生じるＣＤＫの活性を測定し、該活性を被験物質を接触させない場合のＣＤＫの活性と比較する工程；
（ｃ）上記（ｂ）の比較結果に基づいて、ＣＤＫの活性の抑制をもたらす被験物質を選択する工程。 The method according to claim 11, which is a screening method for a substance capable of suppressing the activity of CDK, comprising the following steps (a), (b) and (c):
(A) contacting the test substance with CDK or cyclin;
(B) a step of measuring the activity of CDK resulting from the step (a) and comparing the activity with the activity of CDK when not contacting the test substance;
(C) A step of selecting a test substance that brings about suppression of CDK activity based on the comparison result of (b) above. ＣＤＫが、ＣＤＫ１、ＣＤＫ２、ＣＤＫ５またはＣＤＫ７である、請求項１１記載の方法。 12. The method according to claim 11, wherein the CDK is CDK1, CDK2, CDK5 or CDK7. 工程（ａ）において、被験物質がさらにＣＤＫインヒビターと接触される、請求項１１記載の方法。 The method according to claim 11, wherein in step (a), the test substance is further contacted with a CDK inhibitor. 下記の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含むＣＤＫの発現を抑制し得る物質のスクリーニング方法である、請求項１１記載の方法：
（ａ）被験物質を、ＣＤＫの発現を測定可能な細胞に接触させる工程；
（ｂ）被験物質を接触させた細胞におけるＣＤＫの発現量を測定し、該発現量を被験物質を接触させない対照細胞におけるＣＤＫの発現量と比較する工程；
（ｃ）上記（ｂ）の比較結果に基づいて、ＣＤＫの発現量を抑制する被験物質を選択する工程。 The method according to claim 11, which is a screening method for a substance capable of suppressing the expression of CDK, comprising the following steps (a), (b) and (c):
(A) contacting the test substance with a cell capable of measuring the expression of CDK;
(B) measuring the expression level of CDK in cells contacted with the test substance, and comparing the expression level with the expression level of CDK in control cells not contacted with the test substance;
(C) A step of selecting a test substance that suppresses the expression level of CDK based on the comparison result of (b). 下記の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含むＣＤＫインヒビターの発現を促進し得る物質のスクリーニング方法である、請求項１１記載の方法：
（ａ）被験物質を、ＣＤＫインヒビターの発現を測定可能な細胞に接触させる工程；
（ｂ）被験物質を接触させた細胞におけるＣＤＫインヒビターの発現量を測定し、該発現量を被験物質を接触させない対照細胞におけるＣＤＫインヒビターの発現量と比較する工程；
（ｃ）上記（ｂ）の比較結果に基づいて、ＣＤＫインヒビターの発現量を促進する被験物質を選択する工程。 The method according to claim 11, which is a screening method for a substance capable of promoting the expression of a CDK inhibitor comprising the following steps (a), (b) and (c):
(A) contacting the test substance with a cell capable of measuring the expression of a CDK inhibitor;
(B) measuring the expression level of the CDK inhibitor in the cell contacted with the test substance, and comparing the expression level with the expression level of the CDK inhibitor in the control cell not contacted with the test substance;
(C) A step of selecting a test substance that promotes the expression level of the CDK inhibitor based on the comparison result of (b). ＣＤＫインヒビターが、ｐ２７Ｋｉｐ１またはｐ２１Ｃｉｐ１である、請求項１１記載の方法。 12. The method of claim 11, wherein the CDK inhibitor is p27 Kip1 or p21 Cip1 . 下記の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含むサイクリンの発現を抑制し得る物質のスクリーニング方法である、請求項１１記載の方法：
（ａ）被験物質を、サイクリンの発現を測定可能な細胞に接触させる工程；
（ｂ）被験物質を接触させた細胞におけるサイクリンの発現量を測定し、該発現量を被験物質を接触させない対照細胞におけるサイクリンの発現量と比較する工程；
（ｃ）上記（ｂ）の比較結果に基づいて、サイクリンの発現量を抑制する被験物質を選択する工程。 The method according to claim 11, which is a screening method for a substance capable of suppressing the expression of cyclin, comprising the following steps (a), (b) and (c):
(A) contacting the test substance with a cell capable of measuring cyclin expression;
(B) measuring the expression level of cyclin in a cell contacted with a test substance, and comparing the expression level with the expression level of cyclin in a control cell not contacted with the test substance;
(C) A step of selecting a test substance that suppresses the expression level of cyclin based on the comparison result of (b). インスリン抵抗性が肥満に起因するものである、請求項１１記載の方法。 The method of claim 11, wherein the insulin resistance is due to obesity. 請求項１１〜２０のいずれか１項記載の方法により得られうるインスリン抵抗性を改善し得る物質。 The substance which can improve the insulin resistance which can be obtained by the method of any one of Claims 11-20. 下記式（Ｉ）：
〔式中、Ｒ1、Ｒ２は、各々独立して、水素原子、置換されていてもよいＣ１〜Ｃ８アルキル基、置換されていてもよいＣ２ 〜Ｃ８アルケニル基、置換されていてもよいＣ２〜Ｃ８アルキニル基、置換されていてもよいＣ１ 〜Ｃ８アシル基、置換されていてもよい芳香族または非芳香族のＣ３〜Ｃ１４炭化水素環基、あるいは置換されていてもよい芳香族または非芳香族のＣ３〜Ｃ１４複素環基であり；
Ｒ３は、水素原子、置換されていてもよいＣ１ 〜Ｃ８アルキル基、置換されていてもよいＣ２〜Ｃ８アルケニル基、置換されていてもよいＣ２ 〜Ｃ８アルキニル基、置換されていてもよいＣ１〜Ｃ８アシル基であり；
環Ａは、置換されていてもよい芳香族または非芳香族のＣ３〜Ｃ１４炭化水素環基、あるいは置換されていてもよい芳香族または非芳香族のＣ３〜Ｃ１４複素環基であり；
Ｘは、−Ｏ−、−Ｓ−または−ＮＲ４−（式中、Ｒ４は、水素原子、置換されていてもよいＣ1 〜Ｃ８アルキル基、置換されていてもよいＣ２ 〜Ｃ８アルケニル基、置換されていてもよいＣ２〜Ｃ８アルキニル基、置換されていてもよいＣ1 〜Ｃ８アシル基、置換されていてもよい芳香族または非芳香族のＣ３〜Ｃ１４炭化水素環基、置換されていてもよい芳香族または非芳香族のＣ３〜Ｃ１４複素環基である）であり；
Ｙは、結合手または−（ＣＨ２）ｎ−（式中、ｎは１〜３である）である。〕で表される化合物、あるいはその塩を含有するアポトーシス誘導剤。 The following formula (I):
[Wherein R 1 and R 2 are each independently a hydrogen atom, an optionally substituted C 1 -C 8 alkyl group, an optionally substituted C 2 -C 8 alkenyl group, or a substituted group. which may be C 2 -C 8 alkynyl group, an optionally substituted C 1 -C 8 acyl group, an aromatic substituted or non-aromatic C 3 -C 14 hydrocarbon ring group or a substituted, An aromatic or non-aromatic C 3 to C 14 heterocyclic group which may be substituted;
R 3 is a hydrogen atom, an optionally substituted C 1 -C 8 alkyl group, an optionally substituted C 2 -C 8 alkenyl group, an optionally substituted C 2 -C 8 alkynyl group, a substituted It is be a good C 1 -C 8 acyl group;
Ring A is an optionally substituted aromatic or non-aromatic C 3 to C 14 hydrocarbon ring group, or an optionally substituted aromatic or non-aromatic C 3 to C 14 heterocyclic group. Yes;
X is —O—, —S— or —NR 4 — (wherein R 4 is a hydrogen atom, an optionally substituted C 1 -C 8 alkyl group, or an optionally substituted C 2 -C 8 alkenyl groups, optionally substituted C 2 -C 8 alkynyl groups, optionally substituted C 1 -C 8 acyl groups, optionally substituted aromatic or non-aromatic C 3 -C 14 A hydrocarbon ring group, which is an optionally substituted aromatic or non-aromatic C 3 -C 14 heterocyclic group);
Y is a bond or — (CH 2 ) n — (wherein n is 1 to 3). ] The apoptosis-inducing agent containing the compound represented by these, or its salt. ＣＤＫの阻害活性をさらに有する、請求項２２記載の剤。 The agent according to claim 22, further having an inhibitory activity on CDK. 下記式（Ｉ）：
〔式中、Ｒ1、Ｒ２は、各々独立して、水素原子、置換されていてもよいＣ１〜Ｃ８アルキル基、置換されていてもよいＣ２ 〜Ｃ８アルケニル基、置換されていてもよいＣ２〜Ｃ８アルキニル基、置換されていてもよいＣ１ 〜Ｃ８アシル基、置換されていてもよい芳香族または非芳香族のＣ３〜Ｃ１４炭化水素環基、あるいは置換されていてもよい芳香族または非芳香族のＣ３〜Ｃ１４複素環基であり；
Ｒ３は、水素原子、置換されていてもよいＣ１ 〜Ｃ８アルキル基、置換されていてもよいＣ２〜Ｃ８アルケニル基、置換されていてもよいＣ２ 〜Ｃ８アルキニル基、置換されていてもよいＣ１〜Ｃ８アシル基であり；
環Ａは、置換されていてもよい芳香族または非芳香族のＣ３〜Ｃ１４炭化水素環基、あるいは置換されていてもよい芳香族または非芳香族のＣ３〜Ｃ１４複素環基であり；
Ｘは、−Ｏ−、−Ｓ−または−ＮＲ４−（式中、Ｒ４は、水素原子、置換されていてもよいＣ1 〜Ｃ８アルキル基、置換されていてもよいＣ２ 〜Ｃ８アルケニル基、置換されていてもよいＣ２〜Ｃ８アルキニル基、置換されていてもよいＣ1 〜Ｃ８アシル基、置換されていてもよい芳香族または非芳香族のＣ３〜Ｃ１４炭化水素環基、置換されていてもよい芳香族または非芳香族のＣ３〜Ｃ１４複素環基である）であり；
Ｙは、結合手または−（ＣＨ２）ｎ−（式中、ｎは１〜３である）である。〕で表される化合物、あるいはその医薬上許容され得る塩（但し、ＣＤＫ５阻害剤を除く）を含有する、糖尿病の予防・治療剤。 The following formula (I):
[Wherein R 1 and R 2 are each independently a hydrogen atom, an optionally substituted C 1 -C 8 alkyl group, an optionally substituted C 2 -C 8 alkenyl group, or a substituted group. which may be C 2 -C 8 alkynyl group, an optionally substituted C 1 -C 8 acyl group, an aromatic substituted or non-aromatic C 3 -C 14 hydrocarbon ring group or a substituted, An aromatic or non-aromatic C 3 to C 14 heterocyclic group which may be substituted;
R 3 is a hydrogen atom, an optionally substituted C 1 -C 8 alkyl group, an optionally substituted C 2 -C 8 alkenyl group, an optionally substituted C 2 -C 8 alkynyl group, a substituted It is be a good C 1 -C 8 acyl group;
Ring A is an optionally substituted aromatic or non-aromatic C 3 to C 14 hydrocarbon ring group, or an optionally substituted aromatic or non-aromatic C 3 to C 14 heterocyclic group. Yes;
X is —O—, —S— or —NR 4 — (wherein R 4 is a hydrogen atom, an optionally substituted C 1 -C 8 alkyl group, or an optionally substituted C 2 -C 8 alkenyl groups, optionally substituted C 2 -C 8 alkynyl groups, optionally substituted C 1 -C 8 acyl groups, optionally substituted aromatic or non-aromatic C 3 -C 14 A hydrocarbon ring group, which is an optionally substituted aromatic or non-aromatic C 3 -C 14 heterocyclic group);
Y is a bond or — (CH 2 ) n — (wherein n is 1 to 3). Or a pharmaceutically acceptable salt thereof (excluding a CDK5 inhibitor).
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2000515550A (en) * 1996-08-02 2000-11-21 スィーヴィー セラピューティクス インコーポレイテッド Purine inhibitors of cyclin-dependent kinase 2 and IκB-α
JP2004339157A (en) * 2003-05-15 2004-12-02 Kazuhito Tomizawa Therapeutic medicine for diabetes mellitus

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2000515550A (en) * 1996-08-02 2000-11-21 スィーヴィー セラピューティクス インコーポレイテッド Purine inhibitors of cyclin-dependent kinase 2 and IκB-α
JP2004339157A (en) * 2003-05-15 2004-12-02 Kazuhito Tomizawa Therapeutic medicine for diabetes mellitus

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023249904A1 (en) * 2022-06-20 2023-12-28 Arizona Board Of Regents On Behalf Of The University Of Arizona Compositions and methods for treating diabetes

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