JP2004339157A - Therapeutic medicine for diabetes mellitus - Google Patents

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a therapeutic medicine for hypoglycaemia scarcely having adverse effect such as hypoglycemic disorder which existing insulin or insulin secretion promoter has and effective for diabetes mellitus. <P>SOLUTION: The therapeutic medicine for diabetes mellitus comprises cyclin-dependent kinase (Cdk)5 inhibitor, which is particularly auromocin, roscovitine, purvalanol A or analogue thereof. An insulin secretion promotor comprises the Cdk5 inhibitor, which is particularly auromocin, roscovitine, purvalanol A or analogue thereof. <P>COPYRIGHT: (C)2005,JPO&NCIPI

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、副作用の少ない糖尿病治療薬に関する。詳しくは、サイクリン依存性キナーゼ（以下、Ｃｄｋと略す）５阻害剤を有効成分とする糖尿病治療薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】
糖尿病は膵臓インスリンの絶対的または相対的欠乏により起こる。もっとも有効な糖尿病治療法としては、ヒトインスリンの皮下投与が知られている。特に糖尿病性昏睡、インスリン依存性糖尿病などにおいては、ヒトインスリンの皮下投与が絶対に必要な治療法である。
【０００３】
また、軽症の成人型糖尿病においては、食事療法、運動療法だけでは調節できない場合、血糖値の正常化、尿糖消失などを目的として、経口血糖降下薬が用いられている。代表的な経口血糖降下薬として、トルブタミドなどのスルホニル尿素類が知られている（たとえば、非特許文献１参照）。
【０００４】
スルホニル尿素類は、ランゲルハンス島β細胞にあるＡＴＰで抑制されるＫチャネルを抑制することにより、β細胞を脱分極し、電位依存性カルシウムチャネルを開き、細胞内カルシウムを上昇することにより内因性インスリン分泌を促進して血糖を降下する（たとえば、非特許文献１参照）。
【０００５】
このような作用機構から、インスリンやスルホニル尿素類は、過血糖、糖尿、多尿、多飲、血管障害などの症状を呈する代謝疾患である糖尿病には有効であるが、インスリン過剰によって引き起こされる低血糖により意識障害、痙攣、心悸亢進などの副作用が問題となっている（たとえば、非特許文献２参照）。これらの副作用は、脳を障害するものであり、特に注意が必要とされる。
【０００６】
一方、オロモーシンは、式（Ｉ）：
【０００７】
【化１】

【０００８】
の構造を有する化合物であり、一般にサイクリン依存性キナーゼの阻害剤として知られている（たとえば、非特許文献３参照）。
【０００９】
現在オロモーシンは、前記作用にもとづき細胞の増殖の同期、インターロイキンに刺激されたリンパ細胞のＤＮＡ合成の阻害を目的に研究で使用されている（たとえば、非特許文献３参照）のみであり、医薬としての使用は報告されていない。
【００１０】
オロモーシンによって阻害されるサイクリン依存性キナーゼとしては、Ｃｄｋ２／サイクリンＡ（ＩＣ_５０＝７μＭ）、Ｃｄｋ２／サイクリンＥ（ＩＣ_５０＝７μＭ））およびＣｄｋ５（ＩＣ_５０＝３μＭ）があり、このうち、Ｃｄｋ２／サイクリンＡおよびＣｄｋ２／サイクリンＥは、通常増殖する細胞でのみ働き、分化した膵臓β細胞では活性をもたないことが知られている（たとえば、非特許文献３参照）。一方、Ｃｄｋ５は、主に分化した神経細胞や膵臓β細胞に豊富に存在しているが、神経細胞におけるＣｄｋ５の機能がよく研究されているものの、β細胞においてＣｄｋ５の活性がインスリン分泌を調節していることは、これまでまったく報告されていない。
【００１１】
【非特許文献１】
「スティミュレーション オブ インスリン リリース バイ レパグリニドアンド グリベングラミド インボルブズ ボス コモン アンド ディスティンクト プロセシズ（Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｎｓｕｌｉｎ Ｒｅｌｅａｓｅ ｂｙ Ｒｅｐａｇｌｉｎｉｄｅ ａｎｄ Ｇｌｉｂｅｎｃｌａｍｉｄｅ Ｉｎｖｏｌｖｅｓ Ｂｏｔｈ Ｃｏｍｍｏｎ ａｎｄ Ｄｉｓｔｉｎｃｔ Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ）」、ダイアビース（Ｄｉａｂｅｔｅｓ）、１９９８年、５月、４７巻、ｐ．３４５〜３５１
【非特許文献２】
「ニュー ドラッグ ターゲッツ フォー タイプ２ ダイアビース アンドザ メタボリック シンドローム（Ｎｅｗ ｄｒｕｇ ｔａｒｇｅｔｓ ｆｏｒ ｔｙｐｅ ２ ｄｉａｂｅｔｅｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）」、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、２００１年、１２月、４１４巻、ｐ．８２１〜８２７
【非特許文献３】
「インヒビション オブ サイクリン−ディペンデント キナーゼズ バイ プリン アナログズ（Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｃｙｃｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｋｉｎａｓｅｓ ｂｙ ｐｕｒｉｎｅ ａｎａｌｏｇｕｅｓ）」、ユーロピアン ジャーナル オブ バイオケミストリー（Ｅｕｒｏｐｅａｎ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、１９９４年、２２４巻、ｐ．７７１〜７８６
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
本発明はかかる従来の問題点を解決し、既存のインスリンあるいはインスリン分泌促進剤が有する低血糖障害などの副作用が少なく、かつ糖尿病に有効な血糖降下治療薬を提供することを目的とする。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
前記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、オロモーシンなどのＣｄｋ５阻害剤が糖尿病の治療薬として極めて有用であり、低血糖を引き起こす副作用がまったくなく、インスリンの分泌を促進させ、血糖値を正常な値にまで降下させることを見出した。
【００１４】
すなわち本発明は、サイクリン依存性キナーゼ（Ｃｄｋ）５阻害剤を含有してなる糖尿病治療薬に関する。
【００１５】
前記治療薬において、Ｃｄｋ５阻害剤がオロモーシン、ロスコビチン（Ｒｏｓｃｏｖｉｔｉｎｅ）、パーバラノールＡ（Ｐｕｒｖａｌａｎｏｌ Ａ）またはそれらの類似体であることが好ましい。
【００１６】
本発明はまた、Ｃｄｋ５阻害剤を含有してなるインスリンの分泌促進剤に関する。
【００１７】
前記促進剤において、Ｃｄｋ５阻害剤がオロモーシン、ロスコビチン、パーバラノールＡまたはそれらの類似体であることが好ましい。
【００１８】
【発明の実施の形態】
本発明に使用するＣｄｋ５阻害剤としては、Ｃｄｋ５の５０％阻害濃度（ＩＣ_５０）が５０μＭ以下のものであれば、特に制限なく使用することができる。具体的には、オロモーシン、ロスコビチン、パーバラノールＡ
【００１９】
【化２】

【００２０】
およびそれらの類似体などがあげられ、Ｃｄｋ５に対する特異性や作用機構の点からオロモーシンが好ましい。
【００２１】
候補分子のＣｄｋ５に対するＩＣ_５０は、以下の方法により決定することができる。
【００２２】
トレーサーとして放射性同位体であるガンマ^３２Ｐ−ＡＴＰを用いて、Ｃｄｋ５およびその活性化サブユニットであるｐ３５を含有する溶液に基質となるヒストンＨ１を添加する。異なる濃度のＣｄｋ５阻害剤存在下におけるヒストンＨ１のガンマ^３２Ｐの取り込みを測定することによりＣｄｋ５のＩＣ_５０を決定することができる。
【００２３】
本発明によれば、Ｃｄｋ５阻害剤はβ細胞に存在するＣｄｋ５に作用し、Ｃｄｋ５の酵素活性を阻害することによって細胞内のインスリン貯蓄を増加させ、高血糖の刺激を受け最終的にインスリンの分泌量を増大させ、血糖値を降下させる。
【００２４】
Ｃｄｋ５阻害剤の１つであるオロモーシンは、前述したように、式（Ｉ）：
【００２５】
【化３】

【００２６】
の構造を有する化合物である。
【００２７】
また、オロモーシンは細胞の異常増殖を引き起こすことがなく、その安全性は高い。
【００２８】
本発明において、「類似体」とは、オロモーシン、ロスコビチンまたはパーバラノールＡと類似した構造を有し、Ｃｄｋ５の酵素活性を阻害し、それぞれオロモーシン、ロスコビチンまたはパーバラノールＡと同様の作用を有するものを言う。
【００２９】
これらのオロモーシン類似体は、当業者に既知の方法を用いて製造することができる。
【００３０】
糖尿病はインスリン依存型とインスリン非依存型にわけられる。インスリン依存型は若年に発症し、膵臓ランゲルハンス島β細胞の病変によりインスリンの絶対的欠如によって起こる。インスリン非依存型は肥満や遺伝子の変異などにより、体細胞のインスリンに対する応答性が悪化したり、インスリンの分泌が低下するなどして起こる。Ｃｄｋ５阻害剤は、β細胞に作用してインスリンの分泌を促進することができるため、β細胞がすべて消失していないかぎりすべての型の糖尿病において大きな治療効果が期待できる。
【００３１】
本発明の治療薬の投与経路としては、経皮、静脈内、筋肉内、皮下、経口があげられる。高血糖時にすみやかに作用できるように食前の経口投与が好ましい。
【００３２】
治療剤の剤形は、投与方法によって適宜設定することができる。具体的には、たとえば、水溶液、乳剤、懸濁液などの液剤、または錠剤などがあげられる。通常は、経口投与が好ましいため、水溶液または錠剤が好ましい。
【００３３】
投与量は、投与方法、適用する患者の年齢、体重、病状などによって適宜設定することができるが、有効成分に換算して一回に０．０００３〜０．０３ｍｇ／ｋｇ体重が好ましく、０．００３ｍｇ／ｋｇ体重〜０．０１５ｍｇ／ｋｇ体重がより好ましい。０．０００３ｍｇ／ｋｇ体重より少ないと糖尿病治療薬としての効果が得られなくなる恐れがある。
【００３４】
本発明の治療剤としての製剤化には、その剤形に合わせて通常当業者により使用される様々な添加物を使用することができる。たとえば、希釈剤、等張化剤、担体、ｐＨ安定剤などがあげられる。
【００３５】
投与方法の具体例としては、点滴静注する場合、一回につき有効成分０．００３〜０．０１５ｍｇ／ｋｇ体重を生理食塩水に溶解して１０〜５０μＭとし投与することができる。筋肉注射の場合、一回につき有効成分０．００３〜０．０１５ｍｇ／ｋｇ体重を生理食塩水に溶解して投与することができる。投与は一日三回、食前に行われることが好ましい。
【００３６】
Ｃｄｋ５阻害剤、たとえば、オロモーシンまたはオロモーシン類似体の血糖降下作用は、単離したランゲルハンス島における糖負荷に対するインスリンの分泌量を測定することにより評価することができる。オロモーシン存在下でインスリンの分泌量が増加すると、結果的に糖の代謝を促すことになり、血糖値が降下する。
【００３７】
【実施例】
ここで、本発明の糖尿病治療薬の効果を実施例にもとづいて、さらに詳細に説明するが、本発明はかかる実施例のみに限定されるものではない。
【００３８】
実施例１
低糖濃度時におけるオロモーシンの作用
（１）ランゲルハンス島の調製
後藤らの文献（Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｉｏｎ、第４３巻、７２５〜７３０頁、１９８７年）にしたがい、６週齢のオスのウィスターラットよりランゲルハンス島を単離した。ラットをエーテル麻酔下で開胸し、總胆管を剥離してコラゲナーゼ溶液（３２０Ｕ／ｍｌ、シグマ社製）をゆっくり注入し、膨らんだ膵臓を摘出した。コラゲナーゼを含んだ膵臓を３７℃のウォーターバスにて３０分間消化したのち、ピペットで分散し、Ｆｉｃｏｌｌ溶液（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）の濃度勾配を用いてランゲルハンス島を単離した。ランゲルハンス島を、９５％Ｏ_２および５％ＣＯ_２の混合ガスで飽和させたリンガー液（１１９ｍＭ 塩化ナトリウム、４．７４ｍＭ 塩化カリウム、１．１９ｍＭ リン酸二水素一ナトリウム、２５ｍＭ 炭酸水素ナトリウム、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２．５４ｍＭ 塩化カルシウム、１．１９ｍＭ 塩化マグネシウム、０．２％ ＢＳＡ）中に３７℃に保ちながら３０分インキュベーションした。
【００３９】
（２）オロモーシンの作用
前記ランゲルハンス島を実体顕微鏡（オリンパス光学工業（株）製）下で１５個を一組としてピックアップし、図１に示した各濃度のオロモーシン（シグマ社製）を含むリンガー液（３．３ｍＭグルコース）０．５ｍｌに入れ３０分間インキュベーションしたのち、同じ糖濃度およびオロモーシン濃度のリンガー液０．５ｍｌを刺激液として入れ替えた。入れ替えから３０分後の刺激液中に含まれるインスリンをインスリン検出キット（Ａｂビーズインスリン、栄研化学（株）製）を用いて、該キットのプロトコールにしたがって検出した。各濃度群につきｎ＝６で試験を行なった。
【００４０】
図１に示したように、３．３ｍＭグルコース下でのインスリン濃度はオロモーシンの存在に関わらずほぼ同程度であった。すなわち、低糖濃度時においてオロモーシンはランゲルハンス島のインスリン分泌にまったく影響を及ぼさなかった。これは、オロモーシンは低血糖時に服用しても、より低血糖になり重大な副作用を引き起こすことがまったくないということを示す。
【００４１】
実施例２
高糖濃度時におけるオロモーシンの作用
実施例１の（１）と同様にして調製したランゲルハンス島を、実体顕微鏡（オリンパス光学工業（株）製）下で１５個を一組としてピックアップし、図２に示した各濃度オロモーシンを含むリンガー液（３．３ｍＭグルコース）０．５ｍｌに入れ３０分間インキュベーションしたのち、同じ濃度のオロモーシン（シグマ社製）を含む高糖濃度リンガー液（１７．３ｍＭグルコース）０．５ｍｌを刺激液として入れ替えた。入れ替えから３０分後の刺激液中に含まれるインスリンをインスリン検出キット（Ａｂビーズインスリン、栄研化学（株）製）を用いて、該キットのプロトコールにしたがって検出した。各濃度群につきｎ＝６で試験を行なった。
【００４２】
図２に示したように、オロモーシン存在下でのインスリン分泌量は、オロモーシン非存在下と比べて有意に上昇した。またインスリン分泌量はオロモーシンの濃度の高さに依存して増加した。これは、オロモーシンの濃度を調節することにより異なる症状の糖尿病に対応できることを示す。
【００４３】
実施例３
ロスコビチンのインスリン分泌促進作用
（１）インスリン分泌細胞ＭＩＮ６の培養
インスリン分泌能を有するＭＩＮ６細胞（千葉県千葉市稲毛区弥生町１−３３、千葉大学大学院医学研究院先端応用医学講座細胞分子医学の清野進教授より提供）を南らの方法（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎａｌ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ、２０００年、第２７４巻、７７３〜７８１頁）に従って培養した。５×１０^５個の細胞をＤＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ社製）に懸濁し、直径３５ミリのカルチャーディッシュ（コーニング社製）に撒き５％ＣＯ_２濃度のインキュベーター（サンヨウ社製）の中で２日間培養した。
【００４４】
（２）ロスコビチンの作用
（１）で培養したＭＩＮ６細胞の培養液を、予め２０μＭのロスコビチン（カルバイオケム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）社製）を含む低糖濃度のリンガー液（３．３ｍＭグルコース）０．５ｍｌおよび２０μＭのオロモーシン（シグマ社製）を含む低糖濃度のリンガー液（３．３ｍＭグルコース）０．５ｍｌでそれぞれ入れ替え３０分インキュベーションしたのち、同じ濃度のロスコビチンを含む高糖濃度のリンガー液（１７．６ｍＭグルコース）０．５ｍｌおよび同じ濃度のオロモーシンを含む高糖濃度のリンガー液（１７．６ｍＭグルコース）０．５ｍｌをそれぞれ刺激液として入れ替えた（それぞれ、ｎ＝６）。対照としてはロスコビチンおよびオロモーシンのいずれも含有しないリンガー液を用いた（ｎ＝６）。２時間培養したのち、培地中に含まれるインスリンをインスリン検出キット（Ａｂビーズインスリン、栄研化学（株）製）を用いて、該キットのプロトコールに従って検出した。
【００４５】
図３に示したように、ロスコビチン存在下ではＭＩＮ６細胞のインスリン分泌が促進された。このことは、ロスコビチンは同じＣｄｋ５阻害剤であるオロモーシンと同様にインスリン分泌を促す作用を有することを意味するものである。
【００４６】
試験例１
実施例１の（１）と同様にして調製したランゲルハンス島を、実体顕微鏡（オリンパス光学工業（株）製）下で１５個を一組としてピックアップし、１０μＭのオロモーシンまたは１０μＭのイソオロモーシン（カルバイオケム社製）を含むリンガー液（３．３ｍＭグルコース）０．５ｍｌに入れ３０分間インキュベーションしたのち、同じ濃度のオロモーシン（シグマ社製）またはイソオロモーシン（カルバイオケム社製）を含む低糖濃度リンガー液（３．３ｍＭグルコース）０．５ｍｌを刺激液として入れ替えた（それぞれ、ｎ＝６）。対照としては、オロモーシンおよびイソオロモーシンのどちらも含まないリンガー液を用いた（ｎ＝６）。入れ替えから３０分後の刺激液中に含まれるインスリンをインスリン検出キット（Ａｂビーズインスリン、栄研化学（株）製）を用いて、該キットのプロトコールにしたがって検出した。
【００４７】
オロモーシンと類似した構造を持ちながらもＣｄｋ５阻害効果のない異性体であるイソオロモーシンを用いて、インスリン分泌促進効果はオロモーシンの作用によるものであること確認した。結果を図４に示す。イソオロモーシンの構造は以下の通りである。
【００４８】
【化４】

【００４９】
オロモーシン（１０μＭ）存在下で高糖濃度のリンガー液はインスリン分泌を有意に促進したが、オロモーシンの異性体であるイソオロモーシン（１０μＭ）はまったくインスリンの分泌を促進しなかった。これは、オロモーシンのＣｄｋ５阻害効果がインスリンの分泌を促進していることを意味するものである。
【００５０】
試験例２
実施例１の（１）と同様にして調製したランゲルハンス島を、実体顕微鏡（オリンパス光学工業（株）製）下で１５個を一組としてピックアップし、それぞれ対照（ｎ＝６）、試料Ａ（ｎ＝６）、試料Ｂ（ｎ＝６）、試料Ｃ（ｎ＝６）とした。対照および試料Ａは、リンガー液（３．３ｍＭグルコース）０．５ｍｌに入れ、試料Ｂおよび試料Ｃは、１０μＭのオロモーシンを含むリンガー液０．５ｍｌに入れ３０分間インキュベーションしたのち、対照はオロモーシンもグリベングラミドも含まない低糖濃度リンガー液（３．３ｍＭグルコース）０．５ｍｌを用い、試料Ａは２００ｎＭのグリベングラミドを含有する低糖濃度リンガー液（３．３ｍＭグルコース）０．５ｍｌ、試料Ｂは１０μＭのオロモーシンを含有する低糖濃度リンガー液（３．３ｍＭグルコース）０．５ｍｌ、試料Ｃは２００ｎＭのグリベングラミドと１０μＭのオロモーシンとを含有する低糖濃度リンガー液（３．３ｍＭグルコース）０．５ｍｌを刺激剤として入れ替えた。入れ替えから３０分後の刺激液中に含まれるインスリンをインスリン検出キット（Ａｂビーズインスリン、栄研化学（株）製）を用いて、該キットのプロトコールにしたがって検出した。さらに、ランゲルハンス島を超音波処理することにより細胞を破壊し、ランゲルハンス島内のインスリン含有量を前記と同様にインスリン検出キット（Ａｂビーズインスリン、栄研化学（株）製）を用いて、該キットのプロトコールにしたがって検出した。
【００５１】
低糖濃度時においてオロモーシンと糖尿病治療薬として使用されているスルホニル尿素類であるグリベングラミドとの効果を、ランゲルハンス島内のインスリン含有量に対するインスリンの分泌割合により比較した。なお、インスリンの分泌割合は以下の式により算出した。
【００５２】
【数１】

【００５３】
結果を図５に示す。
【００５４】
グリベングラミドは、低濃度におけるランゲルハンス島のインスリン分泌を有意に上昇させたが、オロモーシンは、インスリン分泌に影響を及ぼさなかった。これは、オロモーシンはスルホニル尿素類の治療薬と異なり、低血糖を引き起こすことがまったくなく、高糖濃度時にのみインスリン分泌を促進することを意味するものである。
【００５５】
【発明の効果】
本発明による、Ｃｄｋ５阻害剤を有効成分とする糖尿病治療剤は、副作用が少なく、ほとんどの型の糖尿病にたいして有効であり、高血糖を改善させる。
【図面の簡単な説明】
【図１】単離ランゲルハンス島を低糖濃度刺激する時のインスリン分泌量に対するオロモーシンの効果を示した図である。
【図２】単離ランゲルハンス島を高糖濃度刺激する時のインスリン分泌量に対するオロモーシンの効果を示した図である。図中の＊はＰ＜０．０５を示す。
【図３】ＭＩＮ６細胞を高糖濃度刺激する時のインスリン分泌量に対するロスコビチンおよびオロモーシンの効果を示した図である。
【図４】オロモーシンとイソオロモーシンのインスリン分泌量に対する効果を示した図である。
【図５】低糖濃度時においてオロモーシンとグリベングラミドとの効果を比較した図である。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a therapeutic agent for diabetes having few side effects. More specifically, the present invention relates to a therapeutic agent for diabetes containing a cyclin-dependent kinase (hereinafter abbreviated as Cdk) 5 inhibitor as an active ingredient.
[0002]
[Prior art]
Diabetes is caused by an absolute or relative deficiency of pancreatic insulin. As the most effective treatment for diabetes, subcutaneous administration of human insulin is known. In particular, in diabetic coma, insulin-dependent diabetes, etc., subcutaneous administration of human insulin is an absolutely necessary treatment.
[0003]
In mild adult-type diabetes, oral glucose-lowering drugs are used for the purpose of normalizing blood sugar levels and eliminating urinary glucose when adjustment is not possible only by diet therapy and exercise therapy. As typical oral hypoglycemic agents, sulfonylureas such as tolbutamide are known (for example, see Non-Patent Document 1).
[0004]
Sulfonylureas depolarize β-cells by suppressing ATP-suppressed K channels in islet of Langerhans β-cells, open voltage-gated calcium channels, and increase endogenous insulin by increasing intracellular calcium. It promotes secretion and lowers blood glucose (for example, see Non-Patent Document 1).
[0005]
Due to this mechanism of action, insulin and sulfonylureas are effective for diabetes, which is a metabolic disease presenting with symptoms such as hyperglycemia, diabetes, polyuria, polydipsia, and vascular disorders, but insulin and sulfonylureas are low in metabolic diseases caused by excessive insulin. Blood sugar causes side effects such as impaired consciousness, convulsions and palpitations (for example, see Non-Patent Document 2). These side effects damage the brain and require special attention.
[0006]
On the other hand, olomoocin has the formula (I):
[0007]
Embedded image

[0008]
And is generally known as an inhibitor of cyclin-dependent kinase (for example, see Non-Patent Document 3).
[0009]
Currently, olomoucine is only used in research for the purpose of synchronizing cell proliferation and inhibiting interleukin-stimulated lymphocyte DNA synthesis based on the above-mentioned effects (for example, see Non-patent Document 3). No use has been reported.
[0010]
Cyclin-dependent kinases inhibited by olomosin include Cdk2 / cyclin A (IC ₅₀ = 7 μM), Cdk2 / cyclin E (IC ₅₀ = 7 μM)) and Cdk5 (IC ₅₀ = 3 μM), of which Cdk2 / It is known that cyclin A and Cdk2 / cyclin E act only on normally proliferating cells and have no activity on differentiated pancreatic β cells (for example, see Non-Patent Document 3). On the other hand, Cdk5 is abundantly present mainly in differentiated neurons and pancreatic β cells. Although the function of Cdk5 in neurons has been well studied, Cdk5 activity in β cells regulates insulin secretion. Has never been reported before.
[0011]
[Non-patent document 1]
"Stimulation of Insulin Release by Repaglinide and Glivences, Diabetes Dice, Canada, Driving, Dove, Dice, Driving, Dove, Dice, Driving, Driving, Driving, Dice, Driving, Stimulation of Insulin Release by Repaglinide and Glibengramide, Involves Boss Common and Distinct Processes" 47, p. 345-351
[Non-patent document 2]
"New drug targets for type 2 diabetes and the metabolic syndrome", Nature, December 2001, Volume 414, p. 414. 821-827
[Non-Patent Document 3]
"Inhibition of cyclin-dependent kinases by purine analogs", European Journal of Biochemistry, Vol. 24, 2004, Journal of Biochemistry, 24 years, European Journal of Biochemistry. 771-786
[0012]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to solve such a conventional problem and to provide a therapeutic drug for hypoglycemia which is effective for diabetes with few side effects such as hypoglycemia disorder of existing insulin or insulin secretagogue.
[0013]
[Means for Solving the Problems]
As a result of intensive studies to solve the above-mentioned problems, Cdk5 inhibitors such as olomoucine are extremely useful as therapeutic agents for diabetes, have no side effects that cause hypoglycemia, promote insulin secretion, and increase blood glucose levels. It was found to drop to a normal value.
[0014]
That is, the present invention relates to a therapeutic agent for diabetes comprising a cyclin-dependent kinase (Cdk) 5 inhibitor.
[0015]
In the therapeutic agent, the Cdk5 inhibitor is preferably olomoucine, roscovitine, purvalanol A, or an analog thereof.
[0016]
The present invention also relates to an insulin secretagogue comprising a Cdk5 inhibitor.
[0017]
In the above accelerator, it is preferable that the Cdk5 inhibitor is olomoucine, roscovitine, pervalanol A or an analog thereof.
[0018]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
As the Cdk5 inhibitor to be used in the present invention, any Cdk5 inhibitor having a 50% inhibitory concentration (IC ₅₀ ) of 50 μM or less can be used without particular limitation. Specifically, olomoucine, roscovitine, parvalanol A
[0019]
Embedded image

[0020]
And analogs thereof, and olomoucine is preferred from the viewpoint of specificity and action mechanism for Cdk5.
[0021]
The IC ₅₀ for Cdk5 of a candidate molecule can be determined by the following method.
[0022]
Using the radioactive isotope gamma ³² P-ATP as a tracer, the substrate histone H1 is added to a solution containing Cdk5 and its activating subunit p35. It is possible to determine an _{IC 50} of Cdk5 by measuring the gamma ³² P incorporation histone H1 in Cdk5 inhibitors presence of different concentrations.
[0023]
According to the present invention, a Cdk5 inhibitor acts on Cdk5 present in β cells, inhibits the enzymatic activity of Cdk5, increases intracellular insulin storage, stimulates hyperglycemia, and finally secretes insulin. Increases volume and lowers blood glucose.
[0024]
One of the Cdk5 inhibitors, olomoucine, has the formula (I):
[0025]
Embedded image

[0026]
Is a compound having the structure:
[0027]
In addition, olomocin does not cause abnormal cell proliferation, and its safety is high.
[0028]
In the present invention, the term "analog" refers to an analog having a structure similar to olomoucine, roscovitine or pervalanol A, inhibiting the enzyme activity of Cdk5, and having the same action as olomocine, roscovitine or pervalanol A, respectively.
[0029]
These olomoucine analogs can be produced using methods known to those skilled in the art.
[0030]
Diabetes is divided into insulin-dependent and non-insulin-dependent. Insulin dependence develops at an early age and is caused by an absolute lack of insulin due to lesions of the pancreatic islet β-cells. The non-insulin-dependent type is caused by, for example, obesity or mutation of a gene, resulting in a decrease in responsiveness of somatic cells to insulin or a decrease in insulin secretion. Since the Cdk5 inhibitor can act on β cells to promote insulin secretion, a great therapeutic effect can be expected in all types of diabetes as long as all β cells are not lost.
[0031]
Administration routes of the therapeutic agent of the present invention include transdermal, intravenous, intramuscular, subcutaneous, and oral. Oral administration before meals is preferred so that it can act promptly during hyperglycemia.
[0032]
The dosage form of the therapeutic agent can be appropriately set depending on the administration method. Specific examples include liquid preparations such as aqueous solutions, emulsions and suspensions, and tablets. Usually, oral administration is preferred, so aqueous solutions or tablets are preferred.
[0033]
The dose can be appropriately set depending on the administration method, the age, weight, and medical condition of the patient to be applied, but is preferably 0.0003 to 0.03 mg / kg body weight at a time in terms of the active ingredient. 003 mg / kg body weight to 0.015 mg / kg body weight is more preferred. If the amount is less than 0.0003 mg / kg body weight, the effect as a therapeutic agent for diabetes may not be obtained.
[0034]
Various additives usually used by those skilled in the art can be used in formulating the therapeutic agent of the present invention according to the dosage form. For example, diluents, isotonic agents, carriers, pH stabilizers and the like can be mentioned.
[0035]
As a specific example of the administration method, in the case of intravenous drip infusion, 0.003 to 0.015 mg / kg body weight of the active ingredient can be dissolved in physiological saline at a time and administered at 10 to 50 μM. In the case of intramuscular injection, 0.003 to 0.015 mg / kg body weight of the active ingredient can be dissolved in physiological saline at a time and administered. The administration is preferably performed three times a day before a meal.
[0036]
The hypoglycemic effect of a Cdk5 inhibitor, such as olomoucine or an olomoucine analog, can be assessed by measuring the amount of insulin secreted relative to the glucose load in the isolated islets of Langerhans. Increased insulin secretion in the presence of olomoucine results in increased glucose metabolism and lowers blood glucose.
[0037]
【Example】
Here, the effects of the therapeutic agent for diabetes of the present invention will be described in more detail based on examples, but the present invention is not limited to only these examples.
[0038]
Example 1
Effect of Olomoucine at Low Sugar Concentration (1) Preparation of Islets of Langerhans According to Goto et al., Transplantion, Vol. 43, pp. 725-730 (1987), islets of Langerhans were isolated from 6-week-old male Wistar rats. did. The rats were thoracotomized under ether anesthesia, the common bile duct was peeled off, and a collagenase solution (320 U / ml, manufactured by Sigma) was slowly injected to remove the swollen pancreas. After the pancreas containing collagenase was digested for 30 minutes in a water bath at 37 ° C., the mixture was dispersed with a pipette, and islets of Langerhans were isolated using a concentration gradient of Ficoll solution (manufactured by Amersham Pharmacia). Ringer's solution (119 mM sodium chloride, 4.74 mM potassium chloride, 1.19 mM monosodium dihydrogen phosphate, 25 mM sodium bicarbonate, 10 mM HEPES) was used to saturate the islets of Langerhans with a gas mixture of 95% O ₂ and 5% CO _2. , 2.54 mM calcium chloride, 1.19 mM magnesium chloride, 0.2% BSA) at 37 ° C. for 30 minutes.
[0039]
(2) Action of olomoocin Ringer's solution containing olomoucine (Sigma) of each concentration shown in FIG. 1 was picked up as a set of 15 under the stereo microscope (Olympus Optical Industry Co., Ltd.). (3.3 mM glucose) After incubating in 0.5 ml for 30 minutes, 0.5 ml of Ringer's solution having the same sugar concentration and olomoucine concentration was replaced as a stimulating solution. Insulin contained in the stimulus solution 30 minutes after the replacement was detected using an insulin detection kit (Ab beads insulin, manufactured by Eiken Chemical Co., Ltd.) according to the protocol of the kit. The test was performed with n = 6 for each concentration group.
[0040]
As shown in FIG. 1, the insulin concentration under 3.3 mM glucose was almost the same regardless of the presence of olomoucine. That is, at low sugar concentrations, olomoucine had no effect on insulin secretion in the islets of Langerhans. This indicates that olomoucine, when taken during hypoglycemia, is less hypoglycemic and does not cause any significant side effects.
[0041]
Example 2
Effect of Olomoucine at High Sugar Concentration 15 Langerhans islets prepared in the same manner as (1) of Example 1 were picked up as a set under a stereoscopic microscope (manufactured by Olympus Optical Industry Co., Ltd.), and FIG. After incubating for 30 minutes in 0.5 ml of Ringer's solution (3.3 mM glucose) containing each indicated concentration of olomoucine, a high sugar concentration Ringer's solution (17.3 mM glucose) containing the same concentration of olomoucine (manufactured by Sigma) was added. 5 ml was replaced as the stimulus. Insulin contained in the stimulus solution 30 minutes after the replacement was detected using an insulin detection kit (Ab beads insulin, manufactured by Eiken Chemical Co., Ltd.) according to the protocol of the kit. The test was performed with n = 6 for each concentration group.
[0042]
As shown in FIG. 2, the amount of insulin secreted in the presence of olomoucine was significantly increased as compared to the absence of olomoucine. Insulin secretion increased depending on the concentration of olomoucine. This indicates that adjusting the concentration of olomoucine can respond to diabetes with different symptoms.
[0043]
Example 3
Insulin secretion promoting effect of roscovitine (1) Culture of insulin secreting cells MIN6 Insulin secreting MIN6 cells (1-33, Yayoimachi, Inage-ku, Chiba-shi, Chiba, Chiba Univ. (Provided by Professor Susumu) was cultured according to the method of Minami et al. (American Journal of Physiological Endocrine Metabolism, 2000, vol. 274, pp. 773-781). 5 × 10 ⁵ cells were suspended in a DMEM medium (manufactured by GIBCO), spread on a culture dish (manufactured by Corning) having a diameter of 35 mm, and cultured in a 5% CO ₂ concentration incubator (manufactured by Sanyo) for 2 days. did.
[0044]
(2) Action of roscovitine 0.5 ml of a low sugar concentration Ringer's solution (3.3 mM glucose) containing 20 µM roscovitine (manufactured by Calbiochem) and 20 µM After replacing each with 0.5 ml of a low sugar concentration Ringer's solution (3.3 mM glucose) containing olomoucine (manufactured by Sigma) for 30 minutes, and then incubating for 30 minutes, a high sugar concentration Ringer's solution (17.6 mM glucose) containing the same concentration of roscovitine 0 0.5 ml of a high sugar concentration Ringer's solution (17.6 mM glucose) containing 0.5 ml and the same concentration of olomoucine were replaced as stimulants (n = 6 each). As a control, a Ringer solution containing neither roscovitine nor olomoucine was used (n = 6). After culturing for 2 hours, insulin contained in the medium was detected using an insulin detection kit (Ab beads insulin, manufactured by Eiken Chemical Co., Ltd.) according to the protocol of the kit.
[0045]
As shown in FIG. 3, insulin secretion of MIN6 cells was promoted in the presence of roscovitine. This means that roscovitine has an action of promoting insulin secretion like olomoucine, which is the same Cdk5 inhibitor.
[0046]
Test example 1
15 pairs of Langerhans islands prepared in the same manner as (1) of Example 1 were picked up as a set under a stereoscopic microscope (manufactured by Olympus Optical Industry Co., Ltd.), and 10 μM olomosin or 10 μM isoolomosin (manufactured by Calbiochem) ) In 0.5 ml of Ringer's solution (3.3 mM glucose) and incubated for 30 minutes, and then a low-sugar concentration Ringer's solution (3.3 mM glucose) containing the same concentration of olomosin (Sigma) or iso-olomosin (Calbiochem). 0.5 ml was replaced as the stimulus (n = 6 each). As a control, a Ringer solution containing neither olomoucine nor iso-olomocin was used (n = 6). Insulin contained in the stimulus solution 30 minutes after the replacement was detected using an insulin detection kit (Ab beads insulin, manufactured by Eiken Chemical Co., Ltd.) according to the protocol of the kit.
[0047]
Using iso-olomoucine, which is an isomer having a structure similar to olomocin but having no Cdk5 inhibitory effect, it was confirmed that the insulin secretion-promoting effect was due to the action of olomocin. FIG. 4 shows the results. The structure of isoolomocine is as follows:
[0048]
Embedded image

[0049]
Ringer's solution with a high sugar concentration significantly enhanced insulin secretion in the presence of olomoucine (10 μM), whereas iso-olomocine (10 μM), an isomer of olomocine, did not stimulate insulin secretion at all. This means that the inhibitory effect of olomocin on Cdk5 promotes insulin secretion.
[0050]
Test example 2
Fifteen pairs of Langerhans islands prepared in the same manner as in (1) of Example 1 were picked up under a stereoscopic microscope (manufactured by Olympus Optical Co., Ltd.), and a control (n = 6) and a sample A ( n = 6), sample B (n = 6), and sample C (n = 6). Control and sample A were placed in 0.5 ml of Ringer's solution (3.3 mM glucose) and samples B and C were placed in 0.5 ml of Ringer's solution containing 10 μM olomoucine and incubated for 30 minutes. 0.5 ml of a low-sugar concentration Ringer solution (3.3 mM glucose) containing no liposome, sample A contained 0.5 ml of a low-sugar concentration Ringer solution (3.3 mM glucose) containing 200 nM glibenclamide, and sample B contained 10 μM olomosin 0.5 ml of a low-sugar concentration Ringer solution (3.3 mM glucose), and 0.5 ml of a low-sugar concentration Ringer solution (3.3 mM glucose) containing 200 nM glibenclamide and 10 μM olomosin were replaced as stimulants. Insulin contained in the stimulus solution 30 minutes after the replacement was detected using an insulin detection kit (Ab beads insulin, manufactured by Eiken Chemical Co., Ltd.) according to the protocol of the kit. Further, the cells are destroyed by sonicating the islets of Langerhans, and the insulin content in the islets of Langerhans is determined using the insulin detection kit (Ab beads insulin, manufactured by Eiken Chemical Co., Ltd.) in the same manner as described above. Detected according to the protocol.
[0051]
The effects of olomoucine and glibenclamide, a sulfonylurea used as a therapeutic agent for diabetes, at low sugar concentration were compared based on the insulin secretion ratio to the insulin content in the islets of Langerhans. The insulin secretion ratio was calculated by the following equation.
[0052]
(Equation 1)

[0053]
FIG. 5 shows the results.
[0054]
Glibenclamide significantly increased insulin secretion in islets of Langerhans at low concentrations, whereas olomoucine did not affect insulin secretion. This means that unlike sulphonylureas, olomoucine never causes hypoglycemia and promotes insulin secretion only at high sugar concentrations.
[0055]
【The invention's effect】
The therapeutic agent for diabetes comprising a Cdk5 inhibitor according to the present invention as an active ingredient has few side effects, is effective for most types of diabetes, and improves hyperglycemia.
[Brief description of the drawings]
BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS FIG. 1 is a graph showing the effect of olomoucine on insulin secretion when stimulating isolated islets of Langerhans at a low sugar concentration.
FIG. 2 is a view showing the effect of olomoucine on the amount of insulin secretion when stimulating isolated islets of Langerhans at a high sugar concentration. * In the figure indicates P <0.05.
FIG. 3 is a graph showing the effects of roscovitine and olomoucine on insulin secretion when MIN6 cells are stimulated with a high sugar concentration.
FIG. 4 shows the effects of olomoucine and isoolomocin on insulin secretion.
FIG. 5 is a graph comparing the effects of olomoucine and glibengramide at low sugar concentrations.

Claims (4)

サイクリン依存性キナーゼ（Ｃｄｋ）５阻害剤を含有してなる糖尿病治療薬。A therapeutic agent for diabetes comprising a cyclin dependent kinase (Cdk) 5 inhibitor. Ｃｄｋ５阻害剤がオロモーシン、ロスコビチン、パーバラノールＡまたはそれらの類似体である請求項１記載の治療薬。The therapeutic agent according to claim 1, wherein the Cdk5 inhibitor is olomoucine, roscovitine, pervalanol A or an analog thereof. Ｃｄｋ５阻害剤を含有してなるインスリンの分泌促進剤。An insulin secretagogue comprising a Cdk5 inhibitor. Ｃｄｋ５阻害剤がオロモーシン、ロスコビチン、パーバラノールＡまたはそれらの類似体である請求項３記載の促進剤。The accelerator according to claim 3, wherein the Cdk5 inhibitor is olomoucine, roscovitine, pervalanol A or an analog thereof.

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