JP2006055164A - TGF−β型受容体cDNAおよびその用途 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】特定のヌクレオチド配列を有するTGF−βIII型受容体をコードするDNA若しくはその配列の一部分、それらによりコードされたTGF−βIII型受容体ポリペプチド、TGF−βIII型受容体を特異的に認識する抗体が提供される。また、これらを用いて形質転換された細胞系を利用したTGF−βの結合を妨害する化合物のスクリーニングアッセイ系も提供される。
【選択図】なし
Description
トランスフォーミング成長因子−ベータ(TGF−β)は、多くの異なる細胞型において増殖、分化、形態形成をはじめとする様々な応答を誘導する構造的に近縁のサイトカイン類のファミリーに属する物質である[例えば、非特許文献1および非特許文献2参照]。脊椎動物では、TGF−β1ないしTGF−β5と呼ばれる少なくとも5種類の型のTGF−βが同定されており、これらはいずれも高度(60%〜80%)のアミノ酸配列相同性を共有している。TGF−β1は当初、正常ラット腎臓細胞の足場非依存性増殖を誘導する能力を有することが特徴であるとされたが、ほとんどの細胞型に及ぼすその作用は抗***促進的である[例えば、非特許文献3および非特許文献4参照] 。TGF−β1は、正常なものと形質転換されたものの両者の上皮細胞、内皮細胞、繊維芽細胞、神経細胞、リンパ系細胞、および造血細胞をはじめとする多くの型の細胞に対して強力な増殖阻害性を示す。また、TGF−βは、細胞外マトリックスおよび細胞とマトリックスの接着プロセスの形成の調節において中心的な役目を果たす。
[1] 図1のヌクレオチド配列若しくはTGF−βIII型受容体をコードするのに充分な図1のヌクレオチド配列の一部分、又はTGF−βIII型受容体をコードするのに充分な図1のヌクレオチド配列のすべて若しくは一部分とハイブリダイズするヌクレオチド配列を有する脊椎動物由来のTGF−βIII型受容体をコードする単離されたDNA;
[2] 哺乳類由来である[1]の単離されたDNA;
[3] ネズミ若しくはヒト由来である[2]の単離されたDNA;
[4] 図2のヌクレオチド配列若しくはTGF−βII型受容体をコードするのに充分な図2のヌクレオチド配列の一部分、又はTGF−βII型受容体をコードするのに充分な図2のヌクレオチド配列のすべて若しくは一部分とハイブリダイズするヌクレオチド配列を有する脊椎動物由来のTGF−βII型受容体をコードする単離されたDNA;
[5] ネズミ若しくはヒト由来である[4]の単離されたDNA;
[6] 図1のアミノ酸配列若しくはTGF−βと結合するアミノ酸配列を有する単離されたTGF−βIII型受容体;
[7] 図3のアミノ酸配列若しくはTGF−βと結合するアミノ酸配列を有する単離されたTGF−βII型受容体;
[8] 図1、図3及びTGF−βと結合するアミノ酸配列からなる群より選ばれたアミノ酸配列を有する、組み換えで生産された哺乳類のTGF−βIII受容体若しくはTGF−βII型受容体;
[9] アミノ酸配列が図1のアミノ酸1から785までを含み、若しくは可溶性TGF−βIII型受容体をコードするアミノ酸配列であり、TGF−βに結合する可溶性TGF−βIII型受容体;
[10] アミノ酸配列が図3のアミノ酸1から166までを含み、若しくは可溶性TGF−βII型受容体をコードするアミノ酸配列であり、TGF−βに結合する可溶性TGF−βII型受容体;
[11] 哺乳類のTGF−βIII型受容体、哺乳類の可溶性TGF−βIII型受容体、又は哺乳類の可溶性TGF−βII型受容体を特異的に認識する抗体;
[12] それがモノクローナル抗体である[11]の抗体;
[13] 可溶性TGF−β受容体とTGF−βとの結合に適した条件下で、可溶性TGF−βII型若しくはIII型受容体を細胞と結合させることからなる、これによりTGF−βを発現する細胞表面におけるTGF−βのTGF−β受容体への結合が減少する、TGF−βを発現する細胞表面上に存在するTGF−βII型若しくはIII型受容体へのTGF−βの結合を阻害する方法;
[14] TGF−βの結合が阻害される[13]の方法;
[15] TGF−βIII型受容体の発現及び、適切な発現系においてTGF−βIII型受容体をコードするDNAから発現されたTGF−βIII型受容体とのTGF−βの結合に適した条件下で、TGF−βIII型受容体を発現するのに適した発現系において、細胞をTGF−βIII型受容体をコードするDNAと結合することからなる、TGF−βを発現する細胞表面上に存在するTGF−βIII型受容体へのTGF−βの結合を阻害する方法;
[16] TGF−βIII型受容体へのTGF−βの結合性、TGF−βII型受容体へのTGF−βの結合性、若しくはその両方を改変するのに充分な量において、TGF−βIII型受容体、TGF−βII型受容体、可溶性TGF−βIII型受容体、可溶性TGF−βII型受容体、TGF−βIII型受容体に結合したTGF−β若しくはそれらの組み合わせからなる群から選ばれたTGF−β受容体を哺乳類に投与することからなる、哺乳類においてTGF−βの効果を制御する方法;
[17] 治療に用いられる、 [6]〜[10]いずれか記載のTGF−β受容体;
[18] 治療に用いられる、[11]又は[12]のいずれか記載の抗体;
[19] 細胞表面上のTGF−βII型若しくはIII型受容体へのTGF−βの結合性を改変(例えば、阻害)する薬剤を製造するための、[6]〜[10]いずれか記載のTGF−β受容体の使用;
[20] 哺乳類においてTGF−βの影響を制御する際に用いられる薬剤の製造のための、TGF−βIII型受容体、TGF−βII型受容体、可溶性TGF−βIII型受容体、可溶性TGF−βII型受容体、TGF−βIII型受容体に結合したTGF−β若しくはそれらの組み合わせからなる群から選ばれたTGF−β受容体の使用;
[21] a)
1)TGF−βIII型受容体を発現する哺乳類の細胞、
2)標識化TGF−β、及び
3)評価される化合物、
を結合し、
b)TGF−βがTGF−βIII型受容体に結合するのに充分な条件下で(a)の生産物を維持し、
c)評価される化合物の存在下でTGF−βのTGF−βIII型受容体への結合性の程度を測定し、並びに
d)(c)でなされた測定と評価される化合物の非存在下で起きたTGF−βのTGF−βIII型受容体への結合性の程度を比較する、
工程からなる、ここで、もしTGF−βIII型受容体へのTGF−βの結合性が、評価される化合物の非存在下においてより評価される化合物の存在下においての方が小さいなら、評価される化合物はTGF−βIII型受容体へのTGF−βの結合を妨害することになる、TGF−βIII型受容体へのTGF−βの結合を妨害する化合物の能力の評価方法;
[22] TGF−βIII型受容体を発現する細胞が一つの細胞系である[21]の方法;
[23] TGF−βIII型受容体を発現する細胞がTGF−βIII型受容体を発現するように改変された細胞である[22]の方法;
[24] TGF−βIII型受容体を発現するように改変された細胞が、適切なベクター中のTGF−β受容体cDNAがそれらに組み込まれた若しくはTGF−β受容体RNAを顕微注入された細胞である[23]の方法;
[25] a)
1)TGF−βII型受容体を発現する哺乳類の細胞、
2)標識化TGF−β、及び
3)評価される化合物、
を結合し、
b)TGF−βがTGF−βII型受容体に結合するのに充分な条件下で(a)の生産物を維持し、
c)評価される化合物の存在下でのTGF−βのTGF−βII型受容体への結合性の程度を測定し、並びに
d)(c)でなされた測定と評価される化合物の非存在下で起きたTGF−βのTGF−βII型受容体への結合性の程度を比較する、
工程からなる、ここで、もしTGF−βII型受容体へのTGF−βの結合性が評価される化合物の非存在下においてより、評価される化合物の存在下においての方が小さいなら、評価される化合物はTGF−βII型受容体へのTGF−βの結合を妨害すると評価される、TGF−βII型受容体へのTGF−βの結合を妨害する化合物の能力の評価方法;
[26] TGF−βII型受容体を発現する細胞が一つの細胞系である[25]の方法;
[27] TGF−βII型受容体を発現する細胞がTGF−βII型受容体を発現するように改変された細胞である[26]の方法;
[28] TGF−βII型受容体を発現するように改変された細胞が、適切なベクター中のTGF−β受容体cDNAがそれらに組み込まれた若しくはTGF−β受容体RNAを顕微注入された細胞である[27]の方法;ならびに
[29] a)結合性が評価される個体から得られたサンプル中の細胞によるTGF−βのTGF−βIII型受容体若しくはTGF−βII型受容体への結合の程度を測定し、それによりテスト結合値を取得し、及び
b)(a)の結果と、対照結合値となる、TGF−βのTGF−βIII型受容体若しくはTGF−βII型受容体への異常な結合が既に知られた細胞である対照細胞の細胞表面において起こる結合の程度とを比較する、
ことからなる、ここで、対照結合値と同程度のテスト結合値はTGF−βのTGF−βIII型受容体若しくはTGF−βII型受容体への異常な結合を示す、細胞表面上のTGF−βIII型受容体又はTGF−βII型受容体に対するTGF−βの異常結合の検出方法
に関する。
本発明は、哺乳類由来のTGF−βIII型受容体をコードするDNAおよび哺乳類由来のTGF−βII型受容体をコードするDNAの単離、配列決定、およびキャラクタライゼーションに関する。本発明はさらに、上記コードされたTGF−βIII型およびII型受容体、ならびにそれぞれの可溶性型、上記受容体をコードする遺伝子と受容体そのものの用途、TGF−βIII型受容体特異的抗体およびTGF−βII型受容体特異性抗体に関する。とりわけ、本発明は、ラットおよびヒト由来のTGF−βIII型受容体をコードするDNAおよびヒト由来のTGF−βII型受容体をコードするDNA、ならびにそれぞれの類似体に関する。
本発明は、TGF−βIII型受容体をコードする脊椎動物とくに哺乳類由来のDNAおよびTGF−βII型受容体をコードする哺乳類由来DNAの単離および配列決定、上記コード化物の発現、および上記発現物のキャラクタライゼーションに基づくものである。上述のように、TGF−β受容体III型をコードする全長cDNAがラット血管平滑筋細胞系から構築したcDNAライブラリーから単離されており、TGF−βII型受容体をコードする全長cDNAがヒトcDNAライブラリーから単離されている。III型遺伝子のヒトの類似体もクローン化されている。プラスミドpBSK中のヒトTGF−βIII型cDNAの寄託がブダペスト条約の規定に従い寄託番号75127でAmerican Type Culture Collection(10/21/91)でなされている。上記寄託物の入手可能性に関するすべての制限は、本願に基づく米国特許が認められると同時に最終的に消失するものとする。
本明細書に説明するとおり、TGF−βIII型受容体cDNAの単離のために2つの異なる手法を用いた。一つのアプローチでは、III型受容体タンパク質に対するモノクローナル抗体を作成して受容体の精製に使い、次いで受容体をミクロシークエンシングに付した(実施例1参照)。精製受容体の部分タンパク質分解で生じた数個のペプチドのミクロシークエンシングで4つのオリゴペプチド配列が得られ、これらを用いて縮重オリゴヌクレオチドを構築した。縮重オリゴヌクレオチドは、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を使用するクローン化法においてプライマーとして使用するか、cDNAライブラリーのスクリーニングにおいてプローブとして使用した。この方式は生産的でないことが判明したが、オリゴヌクレオチド配列は第2の方式によって単離した受容体クローンの同一性を確認する際に有用であった。
COS細胞中での発現クローン化を用い、II型TGF−β受容体をコードするcDNAも単離した。高ストリンジェンシー(high stringency)でのハイブリダイゼーションによりヒトHepG2細胞cDNAライブラリーから全長cDNA(クローン3FFと命名)を単離した(実施例6参照)。分析により、対応するmRNA分子は異なる細胞系や組織において発現される5kbのmRNA分子であることが示された。配列分析で、該cDNAは572個のアミノ酸残基より成るコアタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを有することが示された。全長II型TGF−β受容体cDNAクローン3FFのヌクレオチド配列を図2に示し、アミノ酸配列を図3に示す。
本明細書で説明する研究の結果、3つの高親和性細胞表面TGF−β受容体のうちの2つをコードするDNAがはじめて単離され、その配列と発現パターンが決定され、コードされたタンパク質のキャラクタライゼーションが行なわれた。通常は該受容体を発現しない細胞においてTGF−βIII型受容体を発現させ、次いでリガンド結合測定を行ったところ、クローン化されたIII型受容体をコードするDNA(すなわち全長クローンR3−OFFまたは部分クローンR3−OF)が該受容体をコードすることが確認された。また、本明細書で説明する研究から、III型DNAを発現する細胞においてはII型受容体へのTGF−βの結合が2.5倍増大するという驚くべき知見が得られた。
以下は本明細書で説明する研究で使用した材料の説明である。
組替えヒトTGF−β1は、ジェネンテック社(Genentech)のリック・デリンク(Rik Derynck)から提供された。COS−M6細胞は、マサチューセッツ総合病院(Massachusetts General Hospital)のブライアン・シード(Brian Seed)およびブリストル−マイヤーズ−スクイブ社(Bristol-Myers-Squibb)のアレジャンドロ・アルーフォ(Alejandro Aruffo)から提供された。ヘパリチナーゼは、MITのテツヒト・コジマ(Tetsuhito Kojima)およびロバート・ローゼンバーグ(Robert Rosenberg)から提供された。LLC−PK1 細胞は、マサチューセッツ総合病院(Massachusetts General Hospital)のデニス・アウシエロ(Dennis Ausiello)の贈与物であった。YH−16細胞は、マサチューセッツ総合病院(Massachusetts General Hospital)のエドワード・イー(Edward Yeh)の贈与物であった。3−4細胞は、ホワイトヘッド生化学研究所(Whitehead Institute for Biomedical Research)のユージン・カジ(Eugene Kaji)の贈与物であった。注記ある場合を除き、その他の細胞系はいずれもATCCより購入し、販売者の指定どおりに培養した。
cDNAライブラリーの構築とプラスミドプールの作成
プロテイナーゼ−K/SDS法によりA10細胞から10μgのポリアデニル化mRNAを調製した[ゴンダら(Gonda et al.), Molec. Cell. Biol. 2:617-624 (1982)]。二重ら旋cDNAを合成し、既報[シードとアルーフォ(Seed, B. and A. Aruffo), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:3365-3369 (1987) ]に従い非パリンドロームBstX1アダプターに結合させた。アダプターを結合させた(acaptored)cDNAを5ないし20%酢酸カリウム勾配上でサイズ分画し、1kbより大きい挿入断片をプラスミドベクターpcDNA−1につなぎ、大腸菌MC1061/P3中でエレクトロポレーションしたところ、力価>107個組替え体を有する一次ライブラリーが得られた。cDNAの一部を、7.5mg/mlテトラサイクリンと12.5mg/mlアンピシリンを含有するルリア−ブロス寒天を入れた15cmペトリ皿上で培養した約1x104個組替え細菌コロニーのプールとして平板培養した。10mlのルリア−ブロス中で細胞を平板からかきとり、プールした細菌のグリセリン液を−70℃で保存した。残りの細菌は、アルカリ溶菌ミニ−プレップ法[サムブルックら(Sambrook, J. et al.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d Ed. (Cold Spring Harbor, NY, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)]を用いてプラスミドDNAを精製するために使った。
シードとアルーフォ(Seed, B. and A. Aruffo)によって記載されているDEAE−デキストラン/クロロキン法[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:3365-3369 (1987)]によりプラスミドプール(それぞれ約1x104 個のクローンを含む)をCOS−M6(COS−7細胞のサブクローン)に移入した。移入後48時間目に、細胞を50pMの 125I−TGF−β1(100ないし200Ci/mmol)とともに4℃で4時間インキュベートし、実質的に既報[ゲアリングら(Gearing, D.P. et al.), EMBO J. 8:3667-3676 (1989)]と同様にしてNT−B2写真乳剤[コダック社(Kodak)]を用いて移入細胞のオートラジオグラフィー分析を行なった。スライドガラス現像後、細胞を風乾し、マウンティング剤とともにカバーガラスでマウントした。暗視野照明用分解トランスイルミネーターを使用して、オリンパスOM−T1倒立位相差顕微鏡下でスライドガラスを分析した。
スクリーニングした86個のプールのうち1個のプール(#13)が陽性と判定され、このプールに対応する細菌グリセリン液を滴定し、1000個のクローンの25個のプールを作成し、これらのプール由来のミニプレッププラスミドを上記のようにしてCOS細胞に移入した。1000個のうち数個の陽性プールが同定され、1個を100個のコロニーの25枚プレートとして再び平板培養した。この陽性プレートの複製を作成し、集菌した。陽性プールが同定されたら、個々のコロニーを対応するマスタープレートから取り上げ、3mlの液体培地中で1夜培養した。100個のコロニーに相当する2次元格子を作成し、単一のクローンR3−OFを単離した。
ラムダZAPII[ストラタジーン社(Stratagene)]に保持させた208Fラット繊維芽細胞ライブラリーをクローンR3−OF挿入断片によって、高ストリンジェンシーでスクリーニングし、約6kbの挿入断片を有する数個のクローンを単離したが、そのうちの1つをR3−OFFと呼ぶ。
シークエナーゼ(Sequenase)試薬[ユナイテッドステーツバイオケミカルズ社(United States Biochemicals)]を用いるジデオキシチェーンターミネーター法により二重ら旋DNAの配列を決定した。BLAST[アルトシュールら(Altschcul, S.F. et al.), J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)]を用いて配列をデータベースと比較した。
既報のクロラミン−T法[チャイフェッツとアンドレ(Cheifetz, S. and J.L. Andres),J. Biol. Chem. 263:16984-16991 (1988)]を用いてTGF−β1をヨウ素標識した。
10cmペトリ皿上で培養した移入COS細胞または3.5cmペトリ皿上で培養したサブコンフルーエントな(subconfluent)L6およびA−10細胞を 125I−TGF−β1とともに結合緩衝液(20mM Hepes、pH7.5、5mM MgSO4、0.5%BSAで緩衝したフレブス・リンゲル液)中でインキュベートし、BSA不含氷冷結合緩衝液で4回洗い、60ng/mlジスクシニミジルスベラートを含有するBSA不含結合緩衝液とともに4℃、回転速度一定下で15分インキュベートした。結合緩衝液に7%ショ糖を加えることによって架橋を停止させた。細胞をかきとり、集め、遠心分離によりペレット化し、次いで溶菌緩衝液(10mMトリス、pH7.4、1mM EDTA、pH8.0、1%トリトン−X100、10μg/mlペプスタチン、10μg/mlロイペプチン、10μg/mlアンチパイン、100μg/ml塩酸ベンズアミジン、100μg/mlダイズトリプシンインヒビター、50μg/mlアプロトニン、および1mMフェニルメチルスルホニルフルオライド)に再懸濁した。可溶化物を7%SDS−PAGEによって分析し、−70℃でX−ARフィルム「コダック社(Kodak)]に密着させてオートラジオグラフィー分析に付した。
既報[チャイフェッツとアンドレ(Cheifetz, S. and J.L. Andres), J. Biol. Chem. 263:16984-16991(1988) ,セガリニとセイェジン(Segarini, P.R. and S.M. Seyedin), J. Biol. Chem. 263:8366-8370(1988) ]に従い、コンドロイチナーゼとヘパリチナーゼによる可溶化TGF−β受容体の消化を行なった。
L6筋芽細胞を10cmペトリ皿に10分の1づつ分割し、翌日、リン酸カルシウム法[チェンとオカヤマ(Chen, C. and H. Okayama), Molec. Cell. Biol. 7:2745-2752 (1987)]により、ベクターpcDNA−neo[インビトロゲン社(InVitrogen)]に保持させたクローンR3−OFとR3−OFFを前後両方向に移入した。細胞は、肉眼で個々のコロニーが見える様になるまで数週間、G418[ゲネチシン(Geneticin),ギブコ社(GIBCO)]の存在下の選抜に付した。これらのクローンを単離、増幅した。
塩化リチウム/尿素法[アウフレーとラウゲオン(Auffrey, C. and F. Raugeon), Eur. J. Biochemistry 107:303-313 (1980)]によりラット組織ポリアデニル化mRNAを調製した後、オリゴ−dTセルロースクロマトグラフィー[アビブとレデル(Aviv and Leder), 1972]を行なった。複数の細胞系からポリアデニル化mRNAをプロテイナーゼK/SDS法[ゴンダら(Gonda, T.J. et al.), Molec. Cell. Biol. 2:617-624 (1982)]により調製した。mRNAの試料を1%アガロース−2.2Mホルムアルデヒドゲル上の電気泳動によって分析し、ナイロン膜[バイオトリンス(Biotrns),ICN社]上にブロットし、ランダムプライミングにより32Pで標識したクローンRe−OFの2.9kb挿入断片をプローブとしてインキュベートした[サムブロックら(Sambrook, J. et al.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d Ed. Cold Spring Harbor, NY, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)]。50%ホルムアミドを含有するハイブリダイゼーション緩衝液中42℃で1夜ハイブリダイゼーションを行ない、−70℃でX−ARフィルムに密着させる前に、ブロットを55℃で0.2X SSC、0.1%SDSで洗った。
まず、細胞性プロテオグリカンをヒト胎盤から精製し、次いで、ヘパリチナーゼとコンドロイチナーゼによる酵素的脱グリコシル化に付した。100〜130キロダルトンの分子量範囲のタンパク質コアを調製用ゲル電気泳動によりさらに精製した。これらのものはIII型受容体を含んでいるはずであった。この部分精製物をマウスの抗原として用いた。免疫化マウスから得られた850個のハイブリドーマ系のスクリーニング後、3系が100〜120kDの脱グリコシル化ポリペプチドを特異的に認識し免疫沈降させる抗体を産生することがわかった。このものは、全細胞を 125I−TGF−βとともにインキュベートした後で共有架橋を行なうことによって放射標識することができた。そのサイズはIII型受容体について既報のタンパク質コアサイズと一致している[マッサーグら(Massague, J.), Annu. Rev. Cell. Biol. 6:597-641 (1990)]。
ペプチドII:QAPFPINFMIA(SEQ ID NO.6)
ペプチドIII:QPIVPSVQ(SEQ ID NO.7)
ペプチドIV:FYVEQGYGR(SEQ ID NO.8)
COS細胞における発現クローンニング方法として、移入を受けたCOS細胞中で個々のcDNAが顕著な増幅を示すことを利用する手順をTGF−β受容体クローンを単離する代替法として用いた。上記増幅は、cDNAベクター中でSV40複製起点と相互作用するCOS細胞によって発現されたSV40大型T抗原が介在する[ゲアリングら(Gearing, D. et al.), EMBO J. 8:3667-3676 (1989);リンら(Lin, H.Y. et al.), Proc. Natl. Acad. Sci. 88:3185-3189 (1991a);リンら(Lin, H.Y. et al.), Science, in press (1991);マシューズとバーレ(Mathews, L.S. and Vale, W.W.), Cell 65:973-982 (1991) ]。
3つのTGF−β受容体のうちのどれを特定するかを決めるために、全長クローンR3−OFF産物のキャラクタライゼーションを行なった。そうするために、COS移入体を放射標識TGF−βとともにインキュベートし、化学架橋剤を加え、標識化受容体をポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析した。
ノーザンブロット分析によって、III型受容体mRNAは数種類のラット組織中で単一の6kbのmRNA分子として発現されることが示された。肝臓中のmRNA発現レベルはその他の組織中より低かったが、この結果は放射性ヨウ素標識TGF−β1を用いて行なわれた様々な組織の、より以前の研究から予想されたことである。この情報に基づけば、約6kbのcDNA挿入断片を有するクローンR3−OFFは全長ラットIII型cDNAクローンに該当すると思われる。
実施例4で説明する全長cDNAクローン(R3−OFF)を配列分析に付した。全長リーディングフレームをフランキング配列とともに図1に示す。このリーディングフレームは853個のアミノ酸残基から成るタンパク質をコードするが、これは完全脱グリコシル化TGF−β1III型受容体で見られる100kDのサイズと一致する。
当業者であれば、単に常識的実験手法を用いて、ここに述べた発明の具体的態様に対する多くの均等物を認識しまた確認し得るであろう。そのような均等物は下記のクレームの範疇に含まれるものである。
Claims (29)
- 図1のヌクレオチド配列若しくはTGF−βIII型受容体をコードするのに充分な図1のヌクレオチド配列の一部分、又はTGF−βIII型受容体をコードするのに充分な図1のヌクレオチド配列のすべて若しくは一部分とハイブリダイズするヌクレオチド配列を有する脊椎動物由来のTGF−βIII型受容体をコードする単離されたDNA。
- 哺乳類由来である請求項1の単離されたDNA。
- ネズミ若しくはヒト由来である請求項2の単離されたDNA。
- 図2のヌクレオチド配列若しくはTGF−βII型受容体をコードするのに充分な図2のヌクレオチド配列の一部分、又はTGF−βII型受容体をコードするのに充分な図2のヌクレオチド配列のすべて若しくは一部分とハイブリダイズするヌクレオチド配列を有する脊椎動物由来のTGF−βII型受容体をコードする単離されたDNA。
- ネズミ若しくはヒト由来である請求項4の単離されたDNA。
- 図1のアミノ酸配列若しくはTGF−βと結合するアミノ酸配列を有する単離されたTGF−βIII型受容体。
- 図3のアミノ酸配列若しくはTGF−βと結合するアミノ酸配列を有する単離されたTGF−βII型受容体。
- 図1、図3及びTGF−βと結合するアミノ酸配列からなる群より選ばれたアミノ酸配列を有する、組み換えで生産された哺乳類のTGF−βIII受容体若しくはTGF−βII型受容体。
- アミノ酸配列が図1のアミノ酸1から785までを含み、若しくは可溶性TGF−βIII型受容体をコードするアミノ酸配列であり、TGF−βに結合する可溶性TGF−βIII型受容体。
- アミノ酸配列が図3のアミノ酸1から166までを含み、若しくは可溶性TGF−βII型受容体をコードするアミノ酸配列であり、TGF−βに結合する可溶性TGF−βII型受容体。
- 哺乳類のTGF−βIII型受容体、哺乳類の可溶性TGF−βIII型受容体、又は哺乳類の可溶性TGF−βII型受容体を特異的に認識する抗体。
- それがモノクローナル抗体である請求項11の抗体。
- 可溶性TGF−β受容体とTGF−βとの結合に適した条件下で、可溶性TGF−βII型若しくはIII型受容体を細胞と結合させることからなる、これによりTGF−βを発現する細胞表面におけるTGF−βのTGF−β受容体への結合が減少する、TGF−βを発現する細胞表面上に存在するTGF−βII型若しくはIII型受容体へのTGF−βの結合を阻害する方法。
- TGF−βの結合が阻害される請求項13の方法。
- TGF−βIII型受容体の発現及び、適切な発現系においてTGF−βIII型受容体をコードするDNAから発現されたTGF−βIII型受容体とのTGF−βの結合に適した条件下で、TGF−βIII型受容体を発現するのに適した発現系において、細胞をTGF−βIII型受容体をコードするDNAと結合することからなる、TGF−βを発現する細胞表面上に存在するTGF−βIII型受容体へのTGF−βの結合を阻害する方法。
- TGF−βIII型受容体へのTGF−βの結合性、TGF−βII型受容体へのTGF−βの結合性、若しくはその両方を改変するのに充分な量において、TGF−βIII型受容体、TGF−βII型受容体、可溶性TGF−βIII型受容体、可溶性TGF−βII型受容体、TGF−βIII型受容体に結合したTGF−β若しくはそれらの組み合わせからなる群から選ばれたTGF−β受容体を哺乳類に投与することからなる、哺乳類においてTGF−βの効果を制御する方法。
- 治療に用いられる、請求項6〜10いずれか記載のTGF−β受容体。
- 治療に用いられる、請求項11又は12のいずれか記載の抗体。
- 細胞表面上のTGF−βII型若しくはIII型受容体へのTGF−βの結合性を改変(例えば、阻害)する薬剤を製造するための、請求項6〜10いずれか記載のTGF−β受容体の使用。
- 哺乳類においてTGF−βの影響を制御する際に用いられる薬剤の製造のための、TGF−βIII型受容体、TGF−βII型受容体、可溶性TGF−βIII型受容体、可溶性TGF−βII型受容体、TGF−βIII型受容体に結合したTGF−β若しくはそれらの組み合わせからなる群から選ばれたTGF−β受容体の使用。
- a)
1)TGF−βIII型受容体を発現する哺乳類の細胞、
2)標識化TGF−β、及び
3)評価される化合物、
を結合し、
b)TGF−βがTGF−βIII型受容体に結合するのに充分な条件下で(a)の生産物を維持し、
c)評価される化合物の存在下でTGF−βのTGF−βIII型受容体への結合性の程度を測定し、並びに
d)(c)でなされた測定と評価される化合物の非存在下で起きたTGF−βのTGF−βIII型受容体への結合性の程度を比較する、
工程からなる、ここで、もしTGF−βIII型受容体へのTGF−βの結合性が、評価される化合物の非存在下においてより評価される化合物の存在下においての方が小さいなら、評価される化合物はTGF−βIII型受容体へのTGF−βの結合を妨害することになる、TGF−βIII型受容体へのTGF−βの結合を妨害する化合物の能力の評価方法。 - TGF−βIII型受容体を発現する細胞が一つの細胞系である請求項21の方法。
- TGF−βIII型受容体を発現する細胞がTGF−βIII型受容体を発現するように改変された細胞である請求項22の方法。
- TGF−βIII型受容体を発現するように改変された細胞が、適切なベクター中のTGF−β受容体cDNAがそれらに組み込まれた若しくはTGF−β受容体RNAを顕微注入された細胞である請求項23の方法。
- a)
1)TGF−βII型受容体を発現する哺乳類の細胞、
2)標識化TGF−β、及び
3)評価される化合物、
を結合し、
b)TGF−βがTGF−βII型受容体に結合するのに充分な条件下で(a)の生産物を維持し、
c)評価される化合物の存在下でのTGF−βのTGF−βII型受容体への結合性の程度を測定し、並びに
d)(c)でなされた測定と評価される化合物の非存在下で起きたTGF−βのTGF−βII型受容体への結合性の程度を比較する、
工程からなる、ここで、もしTGF−βII型受容体へのTGF−βの結合性が評価される化合物の非存在下においてより、評価される化合物の存在下においての方が小さいなら、評価される化合物はTGF−βII型受容体へのTGF−βの結合を妨害すると評価される、TGF−βII型受容体へのTGF−βの結合を妨害する化合物の能力の評価方法。 - TGF−βII型受容体を発現する細胞が一つの細胞系である請求項25の方法。
- TGF−βII型受容体を発現する細胞がTGF−βII型受容体を発現するように改変された細胞である請求項26の方法。
- TGF−βII型受容体を発現するように改変された細胞が、適切なベクター中のTGF−β受容体cDNAがそれらに組み込まれた若しくはTGF−β受容体RNAを顕微注入された細胞である請求項27の方法。
- a)結合性が評価される個体から得られたサンプル中の細胞によるTGF−βのTGF−βIII型受容体若しくはTGF−βII型受容体への結合の程度を測定し、それによりテスト結合値を取得し、及び
b)(a)の結果と、対照結合値となる、TGF−βのTGF−βIII型受容体若しくはTGF−βII型受容体への異常な結合が既に知られた細胞である対照細胞の細胞表面において起こる結合の程度とを比較する、
ことからなる、ここで、対照結合値と同程度のテスト結合値はTGF−βのTGF−βIII型受容体若しくはTGF−βII型受容体への異常な結合を示す、細胞表面上のTGF−βIII型受容体又はTGF−βII型受容体に対するTGF−βの異常結合の検出方法。
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