JP2006052150A - 抗酸化剤 - Google Patents
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Abstract
【課題】 医薬品、医薬部外品、化粧品及び食品等の分野で有用なジヒドロフェルロイルアミド類を含む抗酸化剤あるいはチロシナーゼ活性阻害剤を提供する。
【解決手段】 本発明は、下記一般式（Ａ）で表わされる化合物を含有することを特徴とする抗酸化剤あるいはチロシナーゼ活性阻害剤である。
【化１】
【解決手段】 本発明は、下記一般式（Ａ）で表わされる化合物を含有することを特徴とする抗酸化剤あるいはチロシナーゼ活性阻害剤である。
【化１】
Description
本発明は、医薬品、医薬部外品、化粧品及び食品等の分野において好適に使用できる抗酸化剤あるいはチロシナーゼ活性阻害剤に関する。
近年、活性酸素やフリーラジカルが、様々な疾病を引き起こすことが明らかになってきている。元来活性酸素は生体の免疫機構の中で生成し、外部から侵入した病原菌などを攻撃する働きをもっている。しかし活性酸素が過剰に生成し残存してしまうと、生体内の構成成分、すなわち脂質、タンパク質、ＤＮＡなどと反応し悪影響を及ぼす。なかでも生体膜等の構成成分である不飽和脂肪酸は酸化され易く、フリーラジカル中間体を経て過酸化脂質を生成する。この過酸化脂質は、動脈硬化、高血圧症、肝機能障害などを誘起することが知られており、老化現象にも密接に関係しているとも言われている。最近では腋臭の原因としても不飽和脂肪酸の酸化分解物が挙げられている（例えば、非特許文献１参照）。また、酸化を受け易い不飽和脂肪酸を含む食品、医薬品、化粧品等は保存中の品質低下が起こり易いという問題もあった。
かかる不飽和脂肪酸等の酸化を防止するためには、抗酸化剤を使用する必要がある。抗酸化剤としては多数の化合物が知られており、具体的にはブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）やブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、トコフェロール類、アスコルビン酸及びその誘導体、ユビキノン及びその誘導体、フラボン誘導体、没食子酸誘導体、並びにポリフェノール類が挙げられる（例えば、非特許文献２および非特許文献３参照）。しかしながら、上記ＢＨＴ、ＢＨＡ等の合成化学物質は、人体への安全性に欠け使用に制約があり、他の天然の抗酸化物質は性能的に劣っていたり、入手が困難であるという問題があった。
一方、しみ、そばかすは紫外線の暴露などに起因して表皮色素細胞内でメラニン色素が形成され、表皮に対して色素沈着することにより発生する。メラニン色素は、アミノ酸の一種であるＬ−チロシンが酸化酵素であるチロシナーゼの作用によりＬ−ドーパ、Ｌ−ドーパキノンへと代謝され、さらに各種の過程を経ることにより合成される（例えば非特許文献４および非特許文献５参照）。したがって、しみ、そばかすなどの色素沈着を防止するには、メラニン色素の合成に重要な役割を果たしているチロシナーゼの活性を阻害することが重要である。
これまで、しみ、そばかすなどの予防・改善には、胎盤抽出物、ビタミンＣ及びその誘導体、コウジ酸、アルブチンなどの薬剤が使用されているが、必ずしも充分な効果は得られていない。また、欧米では、ハイドロキノンが色素斑の脱色を目的に用いられているが、安全性の点で問題があるために使用制限がなされている。さらに最近、コウジ酸にも発ガン性がある可能性が指摘されて問題となっている。
大麦中に存在する化合物としてＮ−フェルロイルグリシンが知られており、この化合物の関連酵素であるＮ−フェルロイルグリシンアミドヒドロラーゼの研究に際して、Ｎ−ジヒドロフェルロイルグリシンが合成されている。しかし、合成されたＮ−ジヒドロフェルロイルグリシンは、前記関連酵素の基質特異性研究の比較対照として使用されたのみで、抗酸化活性及びチロシナーゼ阻害活性に関する事項は記載されていない（非特許文献６参照）。
Ｎ−ジヒドロフェルロイルグリシンに構造が類似した化合物であるカフェ酸アミド誘導体に、抗酸化活性及びチロシナーゼ阻害活性を有することが知られている（特許文献１参照）。しかし、カフェ酸アミド誘導体はアミド基とフェニル基との間が炭素−炭素二重結合であり、アミド基とフェニル基との間が飽和炭化水素で結ばれているＮ−ジヒドロフェルロイルグリシンとは構造上の特徴が異なる。
また、Ｎ−フェルロイルグリシン類の赤外線吸収スペクトルの研究に際して、Ｎ−ジヒドロフェルロイルグリシンが合成されているが、該化合物の抗酸化活性やチロシナーゼ阻害活性に関する報告はない（非特許文献７参照）。
本発明の目的は、上述のような状況をふまえ、優れた抗酸化剤、あるいはチロシナーゼ活性阻害剤を提供することにある。
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究を重ねた結果、Ｎ−フェルロイルグリシン等のジヒドロフェルロイルアミド化合物が、優れた抗酸化活性及びチロシナーゼ阻害活性を有することを見出し、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は、下記一般式（Ａ）で表わされる化合物を含有することを特徴とする抗酸化剤、及び一般式（Ａ）で表わされる化合物を含有することを特徴とするチロシナーゼ活性阻害剤である。
すなわち、本発明は、下記一般式（Ａ）で表わされる化合物を含有することを特徴とする抗酸化剤、及び一般式（Ａ）で表わされる化合物を含有することを特徴とするチロシナーゼ活性阻害剤である。
本発明において、優れた抗酸化活性及びチロシナーゼ阻害活性を有することが見出されたジヒドロフェルロイルアミド化合物は、医薬品、医薬部外品、化粧品及び食品等の分野において、抗酸化剤あるいはチロシナーゼ活性阻害剤として使用される。
○一般式（Ａ）で表わされる化合物
一般式（Ａ）において、Ｒ1は水素原子又は炭素数１〜１８の炭化水素基である。炭化水素基としては、メチル基、エチル基、ｎ−ブチル基、ステアリル基などの直鎖の飽和炭化水素基、イソプロピル基、２−エチルヘキシル基などの分枝構造を有する飽和炭化水素基、メタリル基、ベンジル基、ゲラニル基、オレイル基などの不飽和結合を有する炭化水素基が例示され、原料の入手容易なメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ベンジル基が好適である。
一般式（Ａ）において、Ｒ1は水素原子又は炭素数１〜１８の炭化水素基である。炭化水素基としては、メチル基、エチル基、ｎ−ブチル基、ステアリル基などの直鎖の飽和炭化水素基、イソプロピル基、２−エチルヘキシル基などの分枝構造を有する飽和炭化水素基、メタリル基、ベンジル基、ゲラニル基、オレイル基などの不飽和結合を有する炭化水素基が例示され、原料の入手容易なメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ベンジル基が好適である。
一般式（Ａ）で表わされる化合物は、たとえば、下記式（１）で表わされるジヒドロフェルラ酸（以下、単に化合物１ともいう。その他の式で表わされる後記の化合物についても同様に略記する場合もある。）と、下記一般式（Ｂ）で表わされる化合物を縮合させることにより合成することができる。縮合反応は、脱水縮合剤を用いる方法や、化合物１を活性エステル化合物に変換した後化合物Ｂと反応させる方法など、常法に従って実施することができる。
一般式（Ｂ）で表わされる化合物としては、ω−位にアミノ基を有するカルボン酸（塩）及び炭素数１〜１８の炭化水素基を有するエステルが挙げられ、より具体的には、グリシン（ｎ＝１）、β−アミノプロピオン酸（ｎ＝２）、γ−アミノ酪酸（ｎ＝３）、６−アミノカプロン酸（ｎ＝５）、ω−アミノヘプタン酸（ｎ＝６）、ω−アミノノナン酸（ｎ＝８）、ω−アミノウンデカン酸（ｎ＝１０）等のω−アミノカルボン酸が例示できる。これらのω−アミノカルボン酸は市販のものを使用することができる。
ω−アミノカルボン酸塩としては、カルボキシル基がナトリウムやカリウムなどのアルカリ金属塩、カルシウムやマグネシウムなどのアルカリ土類金属塩、アンモニウム塩等や、あるいはω−アミノ基が、塩酸、リン酸、硫酸、クエン酸、酢酸などの無機酸又は有機酸等の酸成分と塩を形成したものが挙げられる。
ω−アミノカルボン酸のエステルとしては、炭素数１〜１８の炭化水素基が挙げれら、より具体的には、メチル基、エチル基、ｎ−ブチル基、ステアリル基などの直鎖のエステル基、イソプロピル基、２−エチルヘキシル基などの分枝構造を有するエステル基、メタリル基、ベンジル基、ゲラニル基、オレイル基などの不飽和結合を有するエステル基が例示され、原料の入手容易なメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ベンジル基が好適である。
一般式（Ａ）で表わされる化合物の合成法として、化合物１をＮ−ヒドロキシスクシンイミドと反応させて活性エステル化合物（化合物２）に変換した後、化合物Ｂとの反応を行う方法を例に説明する。
化合物２は、有機溶媒中で化合物１とＮ−ヒドロキシスクシンイミドとを縮合剤を用いて反応させることにより、調製することができる。
本反応で使用するＮ−ヒドロキシスクシンイミドの量は、基本的には化合物１に対して１化学当量であり、０．７〜１．３化学当量であることが好ましく、さらに好ましくは、０．９〜１．１化学当量である。
本反応で使用するＮ−ヒドロキシスクシンイミドの量は、基本的には化合物１に対して１化学当量であり、０．７〜１．３化学当量であることが好ましく、さらに好ましくは、０．９〜１．１化学当量である。
縮合剤としては、Ｎ，Ｎ−ジシクロヘキシルカルボジイミド、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３ジメチルアミプロピル）カルボジイミド、４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウムクロリド、ジ−２−ピリジルカルボネート、ジ−２−ピリジルチオノカルボネートなどが例示され、なかでも、Ｎ，Ｎ−ジシクロヘキシルカルボジイミドが好適に使用することができる。縮合剤の使用量は、基本的には化合物１に対して１化学当量であり、０．７〜１．３化学当量であることが好ましく、さらに好ましくは、０．９〜１．１化学当量である。
本反応は有機溶媒中、なかでも、非プロトン性の溶媒中で行うことが好ましく、テトラヒドロフラン、１，４−ジオキサン、ジエチルエーテル、１，２−ジメトキシエタン、Ｎ，Ｎ−ジメチルプロピレンウレア及びこれらの混合溶媒等を好適に使用することができる。
上記反応の温度は、０〜５０℃が好ましく、より好ましくは、１０〜３０℃である。この反応温度が低すぎる場合は温度維持にコストがかかり、また、反応温度が高すぎる場合は副反応が進行する場合がある。
本反応時間は条件により異なるが、通常、数時間である。
この反応終了後、化合物２を未精製のまま使用することもでき、また、再結晶等の公知の方法により、化合物２を単離精製することもできる。
上記反応の温度は、０〜５０℃が好ましく、より好ましくは、１０〜３０℃である。この反応温度が低すぎる場合は温度維持にコストがかかり、また、反応温度が高すぎる場合は副反応が進行する場合がある。
本反応時間は条件により異なるが、通常、数時間である。
この反応終了後、化合物２を未精製のまま使用することもでき、また、再結晶等の公知の方法により、化合物２を単離精製することもできる。
上述のように調製した化合物２に化合物Ｂを反応させることにより、化合物Ａを合成することができる。
本反応で使用する化合物Ｂの量は、基本的には化合物２に対して１化学当量であり、０．７〜１．３化学当量であることが好ましく、さらに好ましくは、０．９〜１．１化学当量である。
本反応は、塩基性条件下で行うことが好ましく、好適には炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウムを化合物Ｂに対して、０．７〜５．０化学当量、より好適には１．０〜３．０化学当量使用する。
本反応で使用する化合物Ｂの量は、基本的には化合物２に対して１化学当量であり、０．７〜１．３化学当量であることが好ましく、さらに好ましくは、０．９〜１．１化学当量である。
本反応は、塩基性条件下で行うことが好ましく、好適には炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウムを化合物Ｂに対して、０．７〜５．０化学当量、より好適には１．０〜３．０化学当量使用する。
本反応は、化合物Ｂ、化合物２及び炭酸水素ナトリウムなどの塩基性物質を溶解する溶媒中で実施することが好ましく、テトラヒドロフラン、１，４−ジオキサン、ジエチルエーテル、１，２−ジメトキシエタン、Ｎ，Ｎ−ジメチルプロピレンウレア、メタノール、エタノール、イソプロピリアルコール、トルエン、塩化メチレンなどの有機溶媒と、水とを併用することが好適である。
上記反応の温度は、０〜５０℃が好ましく、より好ましくは、１０〜３０℃である。この反応温度が低すぎる場合は温度維持にコストがかかり、また、反応温度が高すぎる場合は副反応が進行する場合がある。
この反応時間は条件により異なるが、通常、数時間から数１０時間である。
この反応終了後は、溶媒抽出、カラムクロマトグラフィー、再結晶等の公知の方法により、化合物Ａを単離精製することができる。
上記反応の温度は、０〜５０℃が好ましく、より好ましくは、１０〜３０℃である。この反応温度が低すぎる場合は温度維持にコストがかかり、また、反応温度が高すぎる場合は副反応が進行する場合がある。
この反応時間は条件により異なるが、通常、数時間から数１０時間である。
この反応終了後は、溶媒抽出、カラムクロマトグラフィー、再結晶等の公知の方法により、化合物Ａを単離精製することができる。
一般式（Ａ）で表わされる化合物は、抗酸化活性及びチロシナーゼ阻害活性を有することから、医薬品、医薬部外品、化粧品及び食品等の分野において、抗酸化剤あるいはチロシナーゼ活性阻害剤として、例えば、食品添加物や美白化粧料成分などに用いることができる。
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
＜合成例１＞
ジヒドロフェルラ酸（化合物１）とＮ−ヒドロキシスクシンイミドとの縮合反応を行い、化合物２を得た。
すなわち、ジヒドロフェルラ酸（２３．６ｇ，１２０ｍｍｏｌ）、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド（１３．９ｇ，１２１ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（２５０ｍｌ）溶液に、Ｎ，Ｎ−ジシクロヘキシルカルボジイミド（２５．０ｇ，１２１ｍｍｏｌ）を加えた。室温で３時間攪拌後、蒸留水５ｍｌを加え、１６時間放置した。つぎに、生成した不溶物を濾別し、濾液を濃縮した。得られた残渣を酢酸エチルとｎ−ヘキサンとの混合溶媒から再結晶し、無色結晶性の化合物（２５．０ｇ、収率７１％）を得た。1Ｈ−ＮＭＲスペクトルおよび赤外線吸収（ＩＲ）スペクトル分析（以下、特に記載しないかぎり、ＩＲスペクトルはＫＢｒペレット法による。）を行ない、得られた化合物が化合物２であることを確認した。
ジヒドロフェルラ酸（化合物１）とＮ−ヒドロキシスクシンイミドとの縮合反応を行い、化合物２を得た。
すなわち、ジヒドロフェルラ酸（２３．６ｇ，１２０ｍｍｏｌ）、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド（１３．９ｇ，１２１ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（２５０ｍｌ）溶液に、Ｎ，Ｎ−ジシクロヘキシルカルボジイミド（２５．０ｇ，１２１ｍｍｏｌ）を加えた。室温で３時間攪拌後、蒸留水５ｍｌを加え、１６時間放置した。つぎに、生成した不溶物を濾別し、濾液を濃縮した。得られた残渣を酢酸エチルとｎ−ヘキサンとの混合溶媒から再結晶し、無色結晶性の化合物（２５．０ｇ、収率７１％）を得た。1Ｈ−ＮＭＲスペクトルおよび赤外線吸収（ＩＲ）スペクトル分析（以下、特に記載しないかぎり、ＩＲスペクトルはＫＢｒペレット法による。）を行ない、得られた化合物が化合物２であることを確認した。
化合物２の融点は１４０−１４２℃であった。化合物２の重クロロホルム中で測定した1Ｈ−ＮＭＲスペクトルのケミカルシフト値は、2.80-2.92(6H,m), 2.96-3.02(2H,m), 3.89(3H,s), 5.57(1H,s), 6.70-6.75(2H,m), 6.85(1H,d,J=7.6Hz)であった。
また、ＩＲスペクトルで吸収のあった波数（ｃｍ-1）は、3430, 2940, 1820, 1780, 1730, 1520, 1370, 1220, 1070, 820, 650であった。
また、ＩＲスペクトルで吸収のあった波数（ｃｍ-1）は、3430, 2940, 1820, 1780, 1730, 1520, 1370, 1220, 1070, 820, 650であった。
＜合成例２＞
化合物２とグリシンとを反応させることにより、Ｎ−ジヒドロフェルロイルグリシン（以下、化合物３という）を合成した。
すなわち、グリシン（３７５ｍｇ，５．０１ｍｍｏｌ）及び炭酸水素ナトリウム（４２１ｍｇ，５．０１ｍｍｏｌ）に蒸留水（５ｍｌ）を加えた。この溶液に、攪拌しながら、化合物２（１．４７ｇ，５．０１ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（１０ｍｌ）に溶解した溶液を加えた。室温で１８時間攪拌後、１Ｎ塩酸（５ｍｌ）を加えて中和した。つぎに、反応混合物に飽和食塩水（１０ｍｌ）及び酢酸エチル（１５ｍｌ）を加えて分配した。有機層を回収後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製することにより、無色結晶性の化合物（４９０ｍｇ、収率４８％）を得た。得られた化合物の融点及びＩＲスペクトルが文献記載の値に一致したことから、本化合物が化合物３であることを確認した。
化合物２とグリシンとを反応させることにより、Ｎ−ジヒドロフェルロイルグリシン（以下、化合物３という）を合成した。
すなわち、グリシン（３７５ｍｇ，５．０１ｍｍｏｌ）及び炭酸水素ナトリウム（４２１ｍｇ，５．０１ｍｍｏｌ）に蒸留水（５ｍｌ）を加えた。この溶液に、攪拌しながら、化合物２（１．４７ｇ，５．０１ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（１０ｍｌ）に溶解した溶液を加えた。室温で１８時間攪拌後、１Ｎ塩酸（５ｍｌ）を加えて中和した。つぎに、反応混合物に飽和食塩水（１０ｍｌ）及び酢酸エチル（１５ｍｌ）を加えて分配した。有機層を回収後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製することにより、無色結晶性の化合物（４９０ｍｇ、収率４８％）を得た。得られた化合物の融点及びＩＲスペクトルが文献記載の値に一致したことから、本化合物が化合物３であることを確認した。
○化合物３の構造式
＜合成例３＞
合成例１におけるジヒドロフェルラ酸（化合物１）の代わりにフェルラ酸を用い、引き続き、合成例２と同様の操作を行なうことにより、フェルラ酸とグリシンとが縮合したＮ−フェルロイルグリシン（以下、化合物４という）を合成した。
合成例１におけるジヒドロフェルラ酸（化合物１）の代わりにフェルラ酸を用い、引き続き、合成例２と同様の操作を行なうことにより、フェルラ酸とグリシンとが縮合したＮ−フェルロイルグリシン（以下、化合物４という）を合成した。
得られた化合物の融点及びＩＲスペクトルが文献記載の値に一致したことから、本化合物が化合物４であることを確認した。
○化合物４の構造式
＜合成例４＞
化合物２とグリシンエチルエステル塩酸塩とを反応させることにより、化合物５を合成した。
すなわち、グリシンエチルエステル塩酸塩（１．４０ｇ，１０．０ｍｍｏｌ）及び炭酸水素ナトリウム（８５０ｍｇ，１０．１ｍｍｏｌ）に蒸留水（１０ｍｌ）を加えた。この溶液に、攪拌しながら、化合物２（２．９４ｇ，１０．０ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（３０ｍｌ）に溶解した溶液を加えた。室温で、１８時間攪拌後、２０％炭酸ナトリウム水溶液（１０ｍｌ）、飽和食塩水（２０ｍｌ）及び酢酸エチル（１０ｍｌ）を加えて分配した。有機層を回収後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製することにより、無色の高粘度液状化合物（２．６４ｇ、収率９４％)を得た。1Ｈ−ＮＭＲスペクトル及びＩＲスペクトル分析を行ない、得られた化合物が化合物５であることを確認した。
化合物２とグリシンエチルエステル塩酸塩とを反応させることにより、化合物５を合成した。
すなわち、グリシンエチルエステル塩酸塩（１．４０ｇ，１０．０ｍｍｏｌ）及び炭酸水素ナトリウム（８５０ｍｇ，１０．１ｍｍｏｌ）に蒸留水（１０ｍｌ）を加えた。この溶液に、攪拌しながら、化合物２（２．９４ｇ，１０．０ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（３０ｍｌ）に溶解した溶液を加えた。室温で、１８時間攪拌後、２０％炭酸ナトリウム水溶液（１０ｍｌ）、飽和食塩水（２０ｍｌ）及び酢酸エチル（１０ｍｌ）を加えて分配した。有機層を回収後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製することにより、無色の高粘度液状化合物（２．６４ｇ、収率９４％)を得た。1Ｈ−ＮＭＲスペクトル及びＩＲスペクトル分析を行ない、得られた化合物が化合物５であることを確認した。
○化合物５の構造式
化合物５の重クロロホルム中で測定した1Ｈ−ＮＭＲスペクトルのケミカルシフト値は、1.28(3H,t,J=7.2Hz), 2.53(2H,t,J=7.6Hz), 2.91(2H,t,J=7.6Hz), 3.87(3H,s), 4.01(2H,d,J=5.2Hz), 4.21(2H,q,J=7.2Hz), 5.65(1H,br), 6.02(1H,br), 6.69(1H,d,J=8.0Hz), 6.72(1H,s), 6.83(1H,d,J=8.0Hz)であった。
また、ＩＲスペクトルで吸収があった波数（ｃｍ-1）は、3400, 2940, 1740, 1660, 1520, 1210, 1130, 1030, 820であった。
また、ＩＲスペクトルで吸収があった波数（ｃｍ-1）は、3400, 2940, 1740, 1660, 1520, 1210, 1130, 1030, 820であった。
＜合成例５＞
合成例４で用いたグリシンエチルエステル塩酸塩の代わりに、β−アラニンエチルエステル塩酸塩を用いることにより、化合物６を合成した（収率９５％）。
合成例４で用いたグリシンエチルエステル塩酸塩の代わりに、β−アラニンエチルエステル塩酸塩を用いることにより、化合物６を合成した（収率９５％）。
○化合物６の構造式
1Ｈ−ＮＭＲスペクトルおよびＩＲスペクトル分析を行ない、得られた化合物が化合物６であることを確認した。
化合物６の融点は８０．６−８１．８℃であった。化合物６の重クロロホルム中で測定した1Ｈ−ＮＭＲスペクトルのケミカルシフト値は、1.26(3H,t,J=7.2Hz), 2.40,2.50(4H,m), 2.87(2H,t,J=7.6Hz), 3.47(2H,q,J=5.9Hz), 3.86(3H,s), 4.12(2H,q,J=7.2Hz), 5.73(1H,br), 6.06(1H,br), 6.66(1H,d,J=8.0Hz), 6.70(1H,s), 6.81(1H,d,J=8.0Hz)であった。
また、ＩＲスペクトルで吸収があった波数（ｃｍ-1）は、3520, 3310, 2990, 1730, 1640, 1560, 1520, 1280, 1180, 1030であった。
化合物６の融点は８０．６−８１．８℃であった。化合物６の重クロロホルム中で測定した1Ｈ−ＮＭＲスペクトルのケミカルシフト値は、1.26(3H,t,J=7.2Hz), 2.40,2.50(4H,m), 2.87(2H,t,J=7.6Hz), 3.47(2H,q,J=5.9Hz), 3.86(3H,s), 4.12(2H,q,J=7.2Hz), 5.73(1H,br), 6.06(1H,br), 6.66(1H,d,J=8.0Hz), 6.70(1H,s), 6.81(1H,d,J=8.0Hz)であった。
また、ＩＲスペクトルで吸収があった波数（ｃｍ-1）は、3520, 3310, 2990, 1730, 1640, 1560, 1520, 1280, 1180, 1030であった。
＜合成例６＞
合成例５で得られた化合物６のエステル基を加水分解することで、化合物７を合成した。
すなわち、化合物６（１．４８ｇ，５．０１ｍｍｏｌ）をイソプロピルアルコール（１５ｍｌ）に溶解した後、１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液（５ｍｌ）を加えて室温で攪拌した。３時間後、反応溶液に１Ｎ塩酸（５ｍｌ）を加えて中和した。溶媒を減圧濃縮後、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、無色結晶性の化合物（５０１ｍｇ、収率４６％）を得た。1Ｈ−ＮＭＲスペクトル及びＩＲスペクトル分析を行ない、得られた化合物が化合物７であることを確認した。
合成例５で得られた化合物６のエステル基を加水分解することで、化合物７を合成した。
すなわち、化合物６（１．４８ｇ，５．０１ｍｍｏｌ）をイソプロピルアルコール（１５ｍｌ）に溶解した後、１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液（５ｍｌ）を加えて室温で攪拌した。３時間後、反応溶液に１Ｎ塩酸（５ｍｌ）を加えて中和した。溶媒を減圧濃縮後、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、無色結晶性の化合物（５０１ｍｇ、収率４６％）を得た。1Ｈ−ＮＭＲスペクトル及びＩＲスペクトル分析を行ない、得られた化合物が化合物７であることを確認した。
○化合物７の構造式
化合物７の融点は１２９−１３０℃であった。化合物７の重ジメチルスルフィド中で測定した1Ｈ−ＮＭＲスペクトルのケミカルシフト値は、2.26-2.40(4H,m), 2.68(2H,t,J=7.8Hz), 3.22(2H,d,J=6.0,6.8Hz), 3.73(3H,s), 6.56(1H,d,J=8.0Hz), 6.65(1H,d,J=8.0Hz), 6.74(1H,s), 7.88(1H,br), 8.65(1H,br), 12.20(1H,br)であった。
また、ＩＲスペクトルで吸収があった波数（ｃｍ-1）は3520, 3320, 1700, 1640, 1550, 1520, 1280, 1270, 1220, 1030, 690であった。
また、ＩＲスペクトルで吸収があった波数（ｃｍ-1）は3520, 3320, 1700, 1640, 1550, 1520, 1280, 1270, 1220, 1030, 690であった。
＜実施例１＞
抗酸化活性を確認するための試験として、常法である１，１−Ｄｉｐｈｅｎｙｌ−２−ｐｉｃｒｙｌｈｙｄｒａｚｙｌ（ＤＰＰＨと略記）ラジカルの消去試験を行った。すなわち、上述の合成例で得られた化合物３、５、６、７、ならびに比較対照としてｄｌ−α−トコフェロール（東京化成工業製）及び化合物４を用いて、ＤＰＰＨラジカルの消去試験を行った。
具体的な試験手順は以下のとおりである。
抗酸化活性を確認するための試験として、常法である１，１−Ｄｉｐｈｅｎｙｌ−２−ｐｉｃｒｙｌｈｙｄｒａｚｙｌ（ＤＰＰＨと略記）ラジカルの消去試験を行った。すなわち、上述の合成例で得られた化合物３、５、６、７、ならびに比較対照としてｄｌ−α−トコフェロール（東京化成工業製）及び化合物４を用いて、ＤＰＰＨラジカルの消去試験を行った。
具体的な試験手順は以下のとおりである。
９６穴プレートの各ウェルに１００ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）（８０μＬ）と被験試料（最終濃度５０μｇ／ｍｌ）のエタノール溶液（２０μＬ）を分注し混合した。ここに８００μＭのＤＰＰＨエタノール溶液（１００μＬ，最終４００μＭ）を添加し良く攪拌した。これを室温、暗所にて２０分間静置した後、５４０ｎｍの吸光度を測定した（試料溶液の吸光度）。
対照として１００ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）（８０μＬ）、エタノール（２０μＬ）及び８００μＭのＤＰＰＨエタノール溶液（１００μＬ）を用いて上記と同様に操作し、吸光度を測定した（対照溶液の吸光度）。
それぞれ化合物について4回同様の測定を行い、その平均値を以下の式に代入し、ＤＰＰＨラジカル消去率を算出した。
ＤＰＰＨラジカル消去率（％）＝［１−（ａ／ｂ）］×１００
ａ＝試料溶液の吸光度
ｂ＝対照溶液の吸光度
対照として１００ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）（８０μＬ）、エタノール（２０μＬ）及び８００μＭのＤＰＰＨエタノール溶液（１００μＬ）を用いて上記と同様に操作し、吸光度を測定した（対照溶液の吸光度）。
それぞれ化合物について4回同様の測定を行い、その平均値を以下の式に代入し、ＤＰＰＨラジカル消去率を算出した。
ＤＰＰＨラジカル消去率（％）＝［１−（ａ／ｂ）］×１００
ａ＝試料溶液の吸光度
ｂ＝対照溶液の吸光度
構造類似の化合物３と化合物４とを比較した場合、アミド基とフェニル基との間が炭素−炭素二重結合である化合物４に対して、アミド基とフェニル基との間が飽和炭化水素で結ばれている本発明の化合物３の方が、ラジカル消去率が高いことが分かった。また、本発明の化合物は、ｄｌ−α−トコフェロール以上のラジカル消去活性を有することがわかった。したがって、本発明の化合物は活性酸素、特にヒドロキシラジカルの消去剤として使用できると考えられる。
＜実施例２＞
上述の合成例で得られた化合物３及び比較対照としてｄｌ−α−トコフェロール（東京化成工業製）を用いて、リノール酸における過酸化脂質生成抑制試験を行った。
上述の合成例で得られた化合物３及び比較対照としてｄｌ−α−トコフェロール（東京化成工業製）を用いて、リノール酸における過酸化脂質生成抑制試験を行った。
具体的な試験手順は以下のとおりである。
１）スクリューバイアル（容量５０ｍｌ）に取ったリノール酸（０．２ｇ、東京化成工業
製）、化合物３（０．０１ｇ）、および界面活性剤ニッサンＯＴ−２２１（０．４ｇ、
日本油脂（株）製）にエタノール（２．０ｇ）を添加して溶解させた後、蒸留水
（１７．３９ｇ）を加え攪拌し、密栓をして４０℃の恒温槽に放置した。これを２個調
製した。
化合物４、ｄｌ−α―トコフェロール及び検体無添加（ブランク）についても同様
に行った。
２）試験開始から１０日後、２０日後、および３０日後のリノール酸残量をＨＰＬＣによ
り定量した。
ＨＰＬＣの分析条件は、検出波長：２１０ｎｍ、移動相：ｐＨ２．６に調整したＭ
ｃＩｌｖａｉｎｅ緩衝液とメタノールとの混合溶液（１０：９０）、流速：１ｍｌ／ｍ
ｉｎ、カラム：ＯＤＳ−８０Ｔｓ（４．６φｍｍ×１５０ｍｍ）、カラム温度４０℃の
条件にて実施した。
３）ＨＰＬＣでの定量はそれぞれの試料について１回ずつ行い、計２回の測定値の平均値
からリノール酸残存率を算出した。この結果を表２に示した。
１）スクリューバイアル（容量５０ｍｌ）に取ったリノール酸（０．２ｇ、東京化成工業
製）、化合物３（０．０１ｇ）、および界面活性剤ニッサンＯＴ−２２１（０．４ｇ、
日本油脂（株）製）にエタノール（２．０ｇ）を添加して溶解させた後、蒸留水
（１７．３９ｇ）を加え攪拌し、密栓をして４０℃の恒温槽に放置した。これを２個調
製した。
化合物４、ｄｌ−α―トコフェロール及び検体無添加（ブランク）についても同様
に行った。
２）試験開始から１０日後、２０日後、および３０日後のリノール酸残量をＨＰＬＣによ
り定量した。
ＨＰＬＣの分析条件は、検出波長：２１０ｎｍ、移動相：ｐＨ２．６に調整したＭ
ｃＩｌｖａｉｎｅ緩衝液とメタノールとの混合溶液（１０：９０）、流速：１ｍｌ／ｍ
ｉｎ、カラム：ＯＤＳ−８０Ｔｓ（４．６φｍｍ×１５０ｍｍ）、カラム温度４０℃の
条件にて実施した。
３）ＨＰＬＣでの定量はそれぞれの試料について１回ずつ行い、計２回の測定値の平均値
からリノール酸残存率を算出した。この結果を表２に示した。
試験の結果、本発明の化合物３は、既存の過酸化脂質生成抑制剤であるｄｌ−α−トコフェロールと同等の効果を有することがわかった。
＜実施例３＞
上述の合成例で得られた化合物３、５、６、７、ならびに比較対照としてアルブチン（東京化成工業製）及び化合物４を用いて、Ｌ−ドーパを基質としたチロシナーゼ活性阻害試験を行った。
上述の合成例で得られた化合物３、５、６、７、ならびに比較対照としてアルブチン（東京化成工業製）及び化合物４を用いて、Ｌ−ドーパを基質としたチロシナーゼ活性阻害試験を行った。
具体的な試験手順は以下のとおりである。
はじめに以下の［１］〜［４］溶液をそれぞれ調製した。
［１］リン酸二水素ナトリウム（１．０００ｇ）及びリン酸水素二ナトリウム
（１．１８６ｇ）を蒸留水（５００ｍＬ）に溶解し、リン酸緩衝液を調製した。
［２］Ｌ−ＤＯＰＡ（３２．７ｍｇ）を蒸留水（２００ｍＬ）に溶解し、基質溶液を調製
した。
［３］検体のジメチルスルホキシド溶液を、リン酸緩衝液で１０倍に希釈し、試験溶液を
調製した。
［４］マッシュルームチロシナーゼ（３．０ｍｇ，２４００ｕｎｉｔ）を蒸留水（７．０
ｍＬ）に溶解した後、さらにリン酸緩衝液で5倍に希釈しチロシナーゼ溶液を調製し
た。
はじめに以下の［１］〜［４］溶液をそれぞれ調製した。
［１］リン酸二水素ナトリウム（１．０００ｇ）及びリン酸水素二ナトリウム
（１．１８６ｇ）を蒸留水（５００ｍＬ）に溶解し、リン酸緩衝液を調製した。
［２］Ｌ−ＤＯＰＡ（３２．７ｍｇ）を蒸留水（２００ｍＬ）に溶解し、基質溶液を調製
した。
［３］検体のジメチルスルホキシド溶液を、リン酸緩衝液で１０倍に希釈し、試験溶液を
調製した。
［４］マッシュルームチロシナーゼ（３．０ｍｇ，２４００ｕｎｉｔ）を蒸留水（７．０
ｍＬ）に溶解した後、さらにリン酸緩衝液で5倍に希釈しチロシナーゼ溶液を調製し
た。
次に、下記の１）及び２）の手順で試験を行った。
１）９６穴プレートの各ウェルにＬ−ＤＯＰＡ溶液（８０μＬ）及び被検試料溶液
（８０μＬ）を分注し混合した。ここにチロシナーゼ溶液（８０μＬ）を加えて、１５
秒間攪拌した。得られた溶液を２５℃で保持し、１分４５秒後および２分４５秒間後の
４９０ｎｍでの吸光度をマイクロプレートリーダーで測定した。
２）上記１）の試験操作をそれぞれの検体およびブランク試験（ジメチルスルホキシドの
み）について各4回行い、得られた数値を下記計算式に代入して、その平均値をチロシ
ナーゼ活性阻害率（％）とした。
チロシナーゼ活性阻害率（％）＝［（Ｔ１−Ｔ２）／Ｔ１］×１００
Ｔ１＝ブランク溶液の２分４５秒間後と１分４５秒後の吸光度の差
Ｔ２＝試験溶液の２分４５秒間後と１分４５秒後の吸光度の差
１）９６穴プレートの各ウェルにＬ−ＤＯＰＡ溶液（８０μＬ）及び被検試料溶液
（８０μＬ）を分注し混合した。ここにチロシナーゼ溶液（８０μＬ）を加えて、１５
秒間攪拌した。得られた溶液を２５℃で保持し、１分４５秒後および２分４５秒間後の
４９０ｎｍでの吸光度をマイクロプレートリーダーで測定した。
２）上記１）の試験操作をそれぞれの検体およびブランク試験（ジメチルスルホキシドの
み）について各4回行い、得られた数値を下記計算式に代入して、その平均値をチロシ
ナーゼ活性阻害率（％）とした。
チロシナーゼ活性阻害率（％）＝［（Ｔ１−Ｔ２）／Ｔ１］×１００
Ｔ１＝ブランク溶液の２分４５秒間後と１分４５秒後の吸光度の差
Ｔ２＝試験溶液の２分４５秒間後と１分４５秒後の吸光度の差
本発明の化合物３及び化合物５〜７、比較例としてアルブチン及び化合物４をそれぞれ、酵素反応液中に２．００ｍｇ／ｍｌ用いた場合の結果を表３に示した。
試験の結果、本発明の化合物は、既存のチロシナーゼ活性阻害剤であるアルブチンと同様に、チロシナーゼ阻害活性を有することがわかった。また、構造類似の化合物である化合物３と化合物４との比較において、アミド基とフェニル基との間が炭素−炭素二重結合である化合物４に対して、アミド基とフェニル基との間が飽和炭化水素で結ばれている化合物３のチロシナーゼ阻害活性が高いことが分かった。
本発明の一般式（Ａ）で表わされる化合物は、優れた抗酸化活性及びチロシナーゼ阻害活性を有しており、医薬品、医薬部外品、化粧品及び食品等の分野で、抗酸化剤あるいはチロシナーゼ活性阻害剤として使用することができる。
Claims (2)
- 下記一般式（Ａ）で表わされる化合物を含有することを特徴とする抗酸化剤。
- 前記一般式（Ａ）で表わされる化合物を含有することを特徴とするチロシナーゼ活性阻害剤。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2004233096A JP2006052150A (ja) | 2004-08-10 | 2004-08-10 | 抗酸化剤 |
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| JP (1) | JP2006052150A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2932179A1 (fr) * | 2008-06-09 | 2009-12-11 | Inst Rech Developpement Ird | Procede microbiologique de synthese de derives cinnamoyl amides d'acides amines |
| JP2023015294A (ja) * | 2014-10-21 | 2023-01-31 | 丸善製薬株式会社 | 皮膚化粧料、頭髪化粧料および飲食品 |
-
2004
- 2004-08-10 JP JP2004233096A patent/JP2006052150A/ja active Pending
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2932179A1 (fr) * | 2008-06-09 | 2009-12-11 | Inst Rech Developpement Ird | Procede microbiologique de synthese de derives cinnamoyl amides d'acides amines |
| WO2010000964A1 (fr) * | 2008-06-09 | 2010-01-07 | Institut De Recherche Pour Le Developpement | Procede microbiologique de synthese de derives cinnamoyl amides d'acides amines |
| US8497302B2 (en) | 2008-06-09 | 2013-07-30 | Institut De Recherche Pour Le Development | Microbiological method for synthesizing cinnamoyl amide derivatives of amino acids |
| JP2023015294A (ja) * | 2014-10-21 | 2023-01-31 | 丸善製薬株式会社 | 皮膚化粧料、頭髪化粧料および飲食品 |
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