JP2005535282A - 抗体のポリシストロニック発現 - Google Patents

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Abstract

単一のポリシストロニック構築物から、目的の複数の遺伝子産物を生成するための新規発現系が、本明細書中に記載される。特に、この発現系は、真核生物宿主細胞において機能的抗体を発現し得るポリシストロニックベクターを含み、このベクターは、５’から３’の方向で作動可能に連結された、少なくとも以下のエレメントを含む：真核生物細胞において作動可能なプロモーター；抗体軽鎖の少なくとも可変領域をコードするＤＮＡ配列；内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）；および抗体重鎖をコードする少なくとも１つのＤＮＡ配列。ポリシストロニック発現ベクターを含む哺乳動物細胞、およびこのポリシストロニック発現ベクターでトランスフェクトされた哺乳動物細胞において機能的抗体を生成する方法もまた、開示される。

Description

（関連出願）
本願は、仮特許出願６０／３３１，４８１（２００１年１１月１６日出願）および仮特許出願６０／４００，６８７（２００２年８月５日出願）に関し、これらに対する優先権を主張し、両方は、本明細書中で参考として援用される。さらに、本願は、ＰＣＴ／ＵＳ０２／０２３７３およびＰＣＴ／ＵＳ０２／０２３７４（共に２００２年１月２９日出願）に対する優先権を主張する。
（発明の分野）
本発明は、新しいポリシストロニック（多シストロン性）発現系および本発現系を用いて真核細胞において抗体を作製するための方法に関する。より詳細には、本発明は、真核生物のポリシストロニック発現系に関し、この系では、抗体の重鎖遺伝子および軽鎖遺伝子が、同じプロモーターから転写され、そして好ましくは、抗体の重鎖遺伝子および軽鎖遺伝子が、１つ以上の内部のリボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）によって分離される。
（発明の背景）
ポリシストロニック発現ベクターを利用する組換え宿主細胞における選択した遺伝子の発現の方法は、周知である。歴史的には、転写領域の５’末端側での所望される産生遺伝子配列および３’側選択マーカー遺伝子配列を組み込むポリシストロニック発現ベクターが、利用されてきた。このようなベクターは、ポリシストロニックｍＲＮＡの５’末端側での所望される遺伝子配列を優先的に翻訳する間に、３’側選択可能遺伝子の非効率的な翻訳を示す。所望される遺伝子産物の高いレベルを発現する組換え宿主細胞は、選択可能な培地中で最初のトランスフェクト体を培養する工程を包含する１つの工程の方法を介して得られる。このようなベクターの欠点は、予測不可能な影響であり、上流のリーディングフレームが、選択マーカー配列の翻訳に対して影響を及ぼし得る。Ｋａｕｆｍａｎ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１８５：４８７（１９９０）を参照のこと。
例えば、Ｌｅｖｉｎｓｏｎに発行された米国特許第４，７１３，３３９号（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．に対して譲渡された）は、真核宿主細胞中の目的の遺伝子産物を作製し得るポリシストロニック発現系を開示する。Ｌｅｖｉｎｓｏｎらによる特許された系において、第１のシストロンによってコードされた目的の所望の遺伝子を発現する、トランスフェクト体または形質転換体の検出を提供するタンパク質を、第２のシストロンの遺伝子配列が、コードする。特定の増殖条件が、宿主細胞中の検出遺伝子の増幅された発現を誘導し、これによってポリシストロニック転写ユニット上に含まれた所望される遺伝子をコードする関連した配列の発現を高める。特に、Ｌｅｖｉｎｓｏｎは、Ｂ型肝炎表面抗原をコードする配列が、スクリーニングマーカージヒドロ葉酸レダクターゼをコードする配列の上流に配置された、ポリシストロンを含むベクターを構築した。Ｌｅｖｉｎｓｏｎベクターのポリシストロニック配置に起因して、第２のシストロンの下流のマーカー遺伝子配列の不均等な発現が、第１のシストロン配列の発現と比較して生じる。
さらに、ポリシストロニック発現系は、複数鎖のポリペプチドを発現するために用いられてきた。例えば、複数鎖のポリペプチドのポリシストロニック発現が、Ｄｉｒｋｓらに対する米国特許第６，０６０，２７３号；Ｂｕｂｌｏｔに対する米国特許第６，０３３６７０号；Ｓｅｌｂｙらに対する米国特許第６，０９６，５０５号；Ｍａｒａｓｃｏらに対する米国特許第６，１４３，５２０号；Ａｕｄｏｎｎｅｔらに対する米国特許第６，１５３，１９９号；およびＪｏｈｎｓｔｏｎらに対する米国特許第６，１５６，５５８号において報告されている。
研究者らは、ポリシストロン中の第２の遺伝子のレベルが、ポリシストロン中の遺伝子の間の内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）の組み込みにより改善されることを決定してきた。ピコルナウイルスにおいて最初に同定されたＩＲＥＳエレメントは、代表的なリボソーム走査に関与する７−メチル グアノシンキャップをバイパスして、メッセージに対してリボソームを直接補充し、結合することによって翻訳の開始を媒介する。ＩＲＥＳ配列の存在は、所望されるタンパク質のキャップ非依存性翻訳のレベルを増加し得る。初期の刊行物は、ＩＲＥＳ配列を、「翻訳エンハンサー」と記述的にいう。例えば、カーディオウイルスＲＮＡ「翻訳エンハンサー」が、Ｐａｌｍｅｎｂｅｒｇらに対する米国特許第４，９３７，１９０号およびＢｏｒｉｓ−Ｌａｗｒｉｅに対する米国特許第５，７７０，４２８号において記載される。
いくつかのＩＲＥＳ含有レポーターシストロン（例えば、ＸＩＡＰ ＩＲＥＳ（Ｋｏｒｎｅｌｕｋに対する米国特許第６，１７１，８２１号および同第６，１５９，７０９号））が、特許を与えられてきた。ポリシストロニック発現ベクターにおける公知の用途を有する１つのＩＲＥＳ配列は、ヘルペスウイルスの配列であり；他のウイルスの配列も同様に用いられ得る（米国特許第６，１９３，９８０号を参照のこと）。Ｋｏｒｎｅｌｕｋは、β−ガラクトシダーゼおよびクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼレポーター配列を、ＣＭＶプロモーターを有するプラスミドに挿入することによって構築されるバイシストロニックベクターを開示し、その結果、２つのシストロンが、ＩＲＥＳ配列を含む１００ｂｐのシストロニック間リンカー領域によって分離される。β−ガラクトシダーゼをコードする最初のシストロンが、従来のキャップ依存機構を介して翻訳された。クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼをコードする第２のシストロンが、前述のリンカー領域がＩＲＥＳ部位を含んだ場合のみ、翻訳された。従って、Ｋｏｒｎｅｌｕｋが、ＩＲＥＳが配列がストレスに対する細胞応答を測定するために設計されたバイシストロニックｍＲＮＡ構築物における第２のオープンリーディングフレームの翻訳を媒介し得ることを示した。しかし、当該技術分野の水準により、バイシストロニック配置において第２の配列の発現と関連する非効率が理解されたために、マーカー配列のみが、第２のシストロンにおいて利用された。
さらに、ポリシストロニック発現系を用いる増幅可能なマーカーの同時発現が、記載されてきた。例えば、ＷＯ９２／１７５６６は、イントロンで修飾された選択可能な遺伝子および目的のタンパク質をコードする遺伝子で宿主細胞を同時にトランスフェクトする方法を開示する。イントロンで修飾された遺伝子が、選択可能な遺伝子の転写された領域へのイントロンの挿入を介して生成され、その結果イントロンが、減少した効率でｍＲＮＡから正確にスプライシングされる。この性質の非効率なスプライシングが、イントロンで修飾されない選択可能な遺伝子配列と比較してイントロンで修飾された選択可能な遺伝子から生成する、少量の選択可能なマーカータンパク質を生じる。選択可能な遺伝子の減少した量が、目的のタンパク質と同時に生成される間、このモデルは、２つの配列が別のプロモーターから駆動される場合、選択可能な遺伝子と目的の所望される遺伝子配列との間の転写の関連を利用しない。
ジシストロニック発現ベクターを用いる抗体産生が、開示され、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）と所望の抗体産物をコードするヌクレオチド配列との間の転写の関連を示すベクターを利用する。Ｃｒｏｗｌｅｙに対する米国特許第５，５６１，０５３号を参照のこと。Ｃｒｏｗｌｅｙの方法は、１つのプロモーターを有するＤＮＡ構築物を利用して、選択マーカー配列および目的のタンパク質をコードする１つの配列の発現を駆動する。所望された抗体の重鎖が、選択可能な遺伝子である、ＤＨＦＲの下流に挿入され、この遺伝子は、ＤＮＡ構築物の５’末端にてイントロン内に配置された。このイントロンが、サイトメガロウイルス即時初期プロモーター（ＣＭＶ）と抗体重鎖をコードする配列との間に配置された。この抗体の軽鎖が、ＣＭＶ／プロモーター／エンハンサーおよびＳＶ４０ｐｏｌｙ−Ａによって駆動されたＳＶ４０プロモーター／エンハンサーおよび選択可能なハイグロマイシンＢ耐性遺伝子配列の制御下で軽鎖配列を配置するよう構築した第２のベクター内に配置された。軽鎖配列および重鎖配列を含むベクターは、直線化され、発現および後に続く軽鎖と重鎖との間のジスルフィド結合のために宿主細胞に同時にトランスフェクトされた。従って、Ｃｒｏｗｌｅｙによる完全な抗体構造を得るために、２つのベクターが、抗体の重鎖成分および軽鎖成分の別個の発現のために構築されなければならない。この方法は、複数のベクターの使用に起因して非効率である。
Ｃｒｏｗｌｅｙの方法は、伝統的ポリシストロン性発現系に関連した位置効果によって与えられる、複数サブユニットタンパク質発現についての限界を例示する。ポリシストロンにおける５’遺伝子と３’遺伝子との間の発現不均衡は、目的の多重鎖タンパク質または類似の産物の商業スケールの製造が行われ得る効率を低下させる。
Ｄｉｒｋｓに対する米国特許第６，０６０，２７３号は、対応するシストロンに存在する遺伝子の等モル発現を可能にする、多シストロン性発現ユニットを開示する。Ｄｉｒｋｓによれば、二シストロン性発現ベクターは、ＩＲＥＳの助けを借りて、目的の２つの遺伝子（例えば、ＰＤＧＦ−ＡおよびＰＤＧＦ−Ｂ）を発現するために構成され得る。二シストロン性発現ベクターにおけるＩＲＥＳ依存性翻訳は、第２のシストロンの発現を増強するＸｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ ５’ＵＴＲ β−グロビン配列によって補助され、その結果、シストロン１および２の等モル発現が達成される。二シストロン性ベクターは、以下のように配置され得る：プロモーター−第１シストロン−ＩＲＥＳ−β−グロビン配列−第２シストロン。
Ｄｉｒｋｓの教示は、いくつかの多重鎖タンパク質サブユニットのポリシストロン性発現に関連する効率の悪さを克服する方法を示唆するが、この教示は、当業者からは、下流のシストロンの発現の予測不能性に対する満足な解決策とは考えられていない。Ｍｉｚｕｇｕｃｈｉら（ＩＲＥＳ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｓｅｃｏｎｄ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｓ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｌｏｗｅｒ ｔｈａｎ ｃａｐ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｆｉｒｓｔ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ａ ｂｉｃｉｓｔｒｏｎｉｃ ｖｅｃｔｏｒ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒａｐｙ，１（４）：３７６−３８２（Ａｐｒｉｌ，２０００））は、ＩＲＥＳ依存性の第２遺伝子発現の効率を、ｃａｐ依存性の第１遺伝子発現と比較して、いくつかの培養細胞株においてインビトロで、ならびにマウス肝臓においてインビボで、調査した。ＩＲＥＳ依存性の第２遺伝子の発現は、その細胞型およびレポーター遺伝子をベクター構築物において用いたかに依存して、第１遺伝子の発現の６〜１００％の間であった。さらに、どの遺伝子を二シストロン性ベクター中に最初に配置するかの選択は、下流に配置される遺伝子の発現に影響を及ぼした。
さらに、Ｂｏｒｍａｎらは、ＩＲＥＳが第２シストロン配列のｃａｐ依存性翻訳を駆動する効率は、発現宿主として選択される細胞の種類によって大いに影響を受けることに注目した（Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒａｌ ＩＲＥＳ−ｄｒｉｖｅｎ ｉｎｔｅｒｎａｌ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｃｅｌｌ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｏｒｉｇｉｎｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，２５（５）：９２５−９３２（１９９７））。活性における劇的なバリエーションが、異なる細胞株へとトランスフェクトされたベクターの個々のＩＲＥＳ要素について注目された。
ポリシストロン性発現系における配列の下流の翻訳の予測不能性に関するこれらの懸念は、抗体の効率的な産生に特に関連がある。なぜなら、重鎖発現に対する軽鎖発現の比率は、抗体の適切な折畳みおよび分泌を確実にするために重要であるからである。これに関して、Ｈｏｒｗｉｔｚおよび共同研究者らは、いくつかの抗体軽鎖は天然ではほとんど分泌されないので、軽鎖および重鎖の共発現および適切な会合は、少なくともいくつかの抗体全体の効率的な分泌に重要であると結論した（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎｓ ａｒｅ ｓｅｃｒｅｔｅｄ ａｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｌｅｖｅｌｓ ：ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ｆｒａｍｅｗｏｒｋ−１ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ．Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎ．３１（９）：６８３− ６９９（１９９４））。
興味深いことに、Ｋｏｌｂらは、以下のゲノムＤＮＡ二シストロン性発現ベクターにおける第２シストロン性遺伝子の非効率的な発現を報告した：ＣＭＶプロモーター−抗体軽鎖遺伝子配列−ＩＲＥＳ−抗体重鎖配列−ポリアデニル化（ｐｏｌｙａｄｅｎａｔｉｏｎ）シグナル（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｒｏｍ ａ ｂｉｃｉｓｔｒｏｎｉｃ ｍＲＮＡ．Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，１６（５）：４２１−４２６（１９９７））。ウェスタンブロッティングは、マウス骨髄腫細胞へのトランスフェクション後、かなりの量の軽鎖がこの構築物によって産生されるが、重鎖タンパク質はほとんど検出されないことを示した。この研究者らは、不対重鎖によって誘発される宿主細胞の毒性に関する懸念に起因して、重鎖を非効率的に発現するようにこの二シストロン性発現構築物を特に設計した。完全な機能的抗体は、カラム精製後にのみ、これらの細胞の上清において検出された。このことは、このＩＲＥＳベクター／細胞の組み合わせが、商業的に有用な規模で選り抜きの抗体を産生するための貧弱なモデルであることを示唆する。
本発明者らの知る限り、商業的な製造スキームに適切な単一のポリシストロン性発現系を用いて機能的な多重鎖タンパク質（例えば、抗体）を産生するための有効な手段は、これまで文献で報告されていない。従って、単一の構築物が、２以上の所望のタンパク質産物（例えば、所望の抗体の軽鎖および重鎖）の発現のために利用され得る、組換え宿主細胞系において商業的に受け入れられる量の抗体を産生する効率的手段についての必要性が存在する。
（発明の要旨）
本発明は、真核生物宿主細胞中でのポリシストロン性発現系を介した、適切なレベルの発現での、機能的（抗原結合）抗体の発現に関する。
より詳細には、本発明は、真核生物細胞（好ましくは、哺乳動物細胞、真菌細胞または酵母細胞）における機能的抗体分子の発現に関し、そしてより好ましくは、ポリシストロン性発現系を用いた、（チャイニーズハムスター卵巣）ＣＨＯ細胞における機能的抗体分子の発現に関する。
本発明のこの好ましい実施形態の局面は、少なくとも１つの抗体軽鎖コード配列および少なくとも１つの抗体重鎖コード配列に作動可能に連結された真核生物プロモーターを含むポリシストロン性発現系を用いた、哺乳動物細胞における機能的抗体の発現であり、ここで、このような抗体コード配列は、少なくとも１つのＩＲＥＳによって隔てられている。この発現系では、このプロモーターの最も３’側の遺伝子はその３’末端にポリＡ配列を有し、他方のコード配列は、このポリシストロンにおいてポリＡ配列を欠き、そして各遺伝子は、前に開始コドンがあり、そして終止コドンで終わる。
本発明の別の実施形態は、５’から３’の方向で、開始コドンおよび終止コドンが隣接した抗体軽鎖コード配列に作動可能に連結されたＣＭＶプロモーター、続いて１遺伝子上の抗体重鎖コード配列を含む、ポリシストロン性発現単位を提供する。各重鎖コード配列もまた、開始コドンおよび終止コドンが隣接している。重鎖コード配列の各対は、少なくとも１つのＩＲＥＳ（好ましくは、カーディオウイルス（例えば、ヒト脳心筋炎ウイルスまたはポリオウイルスのＩＲＥＳ）によって隔てられる。抗体軽鎖をコードするＤＮＡ配列は好ましくは、抗体重鎖をコードするＤＮＡ配列の発現に対して１０：１と１：２との間の範囲の比で発現される。より好ましくは、この抗体軽鎖は、重鎖に対して比較的バランスのとれた比（すなわち、約５／１〜１／１）で、そしてなおより好ましくは約３／１〜約１／１、そしてなおより好ましくは約１．５／１〜１／１で発現される。
本発明の別の実施形態は、抗体を分泌する真核生物細胞株（例えば、ＣＨＯ細胞株）であり、ここで、この抗体の発現は、本明細書中に記載されるようなポリシストロンを介してである。本発明の１つの局面では、このポリシストロンは、５’から３’の方向で、以下のＣＭＶプロモーターを含む：分泌シグナル；開始コドンおよび終止コドンを含むが、ポリＡ配列を含まない、抗体軽鎖コード配列；ＩＲＥＳ（好ましくは、カーディオウイルス、ポリオウイルスおよびヘルペスウイルスからなる群より選択されるＩＥＲＳ）；各々、分泌シグナル配列に作動可能に連結された、少なくとも１つの抗体重鎖コード配列；ならびに各重鎖コード配列の３’側に、ＩＲＥＳ（好ましくは、カーディオウイルス、ポリオウイルスおよびヘルペスウイルスからなる群より選択されるＩＲＥＳ）、ＩＲＥＳ、およびポリシストロンの３’末端に位置する遺伝子の３’末端に含まれるポリＡ配列。好ましくは、ポリシストロンを含む真核生物細胞は、１日に１細胞あたり約５〜１００ピコグラムの機能的抗体を分泌する。好ましくは、少なくとも１〜５ピコグラムの抗体が、少なくとも連続３〜４日間にわたって１日当たり１細胞あたり分泌される。好ましい実施形態では、この真核生物細胞は、ＣＨＯ細胞または酵母細胞（例えば、Ｐｉｃｈｉａ）である。
本発明の別の実施形態は、機能的抗体を産生し得るポリシストロン性発現系を含む、哺乳動物細胞または酵母細胞の培養物である。本発明によるポリシストロン性配列を含むベクターは、哺乳動物細胞または酵母細胞に導入され得る。細胞培養の間、所望の外因性ＤＮＡ配列は、外因性ＤＮＡが、相同組換えを介して哺乳動物細胞または酵母細胞のゲノム中に挿入されるように、標的の哺乳動物細胞または酵母細胞に導入され得る。用いられる配列に依存して、機能的抗体は、細胞培養物のバイオマスから、または細胞培養培地から、回収され得る。相同組換えを介して真核生物細胞（例えば、哺乳動物細胞）において特定の部位に遺伝子を組み込む方法およびこのような組換えプロセスに適切なベクターは、米国特許第５，９９８，１４４号、同第５，８３０，６９８号、および同第６，４１３，７７７号に開示される。これらの内容全体は、本明細書中に参考として援用される。
なお別の実施形態は、抗体の軽鎖配列および重鎖配列を発現するポリシストロン性発現系を含む真核生物細胞（好ましくは、哺乳動物細胞または酵母細胞）を培養する工程、ならびに機能的抗体をこの細胞培養物から回収する工程を包含する、機能的抗体を産生する方法である。この機能的抗体は、バッチ供給細胞培養物において、治療用途に適切なレベルで、最大の商業的生産高に最適化された条件下で産生され得る。例えば、グルコースレベルが連続して制御されるバッチ供給培養物において増殖させたＣＨＯ細胞は、組換えタンパク質を少なくとも１２日間以上産生し得る。例えば、バッチ供給培養物において増殖させた細胞による組換えタンパク質の生産高に関する考察については、米国特許第６，１８０，４０１号を参照のこと。
（実施形態の詳細な説明）
好ましい実施形態の詳細な説明を提供する前に、以下の定義を提供する。
「ＩＲＥＳ」すなわち内部リボソーム進入部位は、キャップ非依存性翻訳についてのアッセイ（例えば、米国特許第６，７１５，８２１号に記載される二シストロン性レポーターアッセイ）において翻訳を開始するのに十分な内部リボソームの進入／結合を可能にする核酸分子（例えば、ｍＲＮＡ分子）の領域を意味する。ｍＲＮＡ分子内のＩＲＥＳの存在は、そうでなければ翻訳されない連結されたタンパク質コード配列のキャップ非依存性翻訳を可能にする。ＩＲＥＳは、ピコルナウイルスにおいて最初に同定され、そしてキャップ非依存性翻訳のパラダイムであると考えられる。全てのピコルナウイルスの５’ＵＴＲは長く、そしてリボソームを直接的に補充および結合し、それによって最初のキャップ結合工程を回避することにより、翻訳開始を媒介する。
ＩＲＥＳエレメントは、ウイルスｍＲＮＡにおいてしばしば見出され、そして非ウイルスｍＲＮＡにおいてはほとんど見出されない。今日までに、各々の５’ＵＴＲに機能的ＩＲＥＳエレメントを含むことが示されている非ウイルスｍＲＮＡとしては、免疫グロブリン重鎖結合タンパク質（ＢＩＰ）をコードするｍＲＮＡ（Ｍａｃｅｊａｋ，Ｄ．Ｊ．ら，Ｎａｔｕｒｅ ３５３：９０−９４（１９９４））；Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ＡｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａをコードするｍＲＮＡ（Ｏｈ，Ｓ．Ｋ．ら，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．６：１６４３−５３（１９９２））；およびＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ ＵｌｔｒａｂｉｔｈｏｒａｎをコードするｍＲＮＡ（Ｙｅ，Ｘ．ら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１７：１７１４−２１（１９９７））；線維芽細胞増殖因子２をコードするｍＲＮＡ（Ｖａｇｎｅｒら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１５：３５−４７（１９１５））；開始因子をコードするｍＲＮＡ（Ｇａｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：５００６−１２（１９９２））；タンパク質オンコジーンｃ−ｍｙｃをコードするｍＲＮＡ（Ｎａｍｂｒｕら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：３２０６１−６（１９９５）；Ｓｔｏｎｅｌｙ Ｍ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １６：４２３−８（１９９８））；血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）（Ｓｔｅｉｎ Ｊ．ら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１８：３１１２−９（１９９８））をコードするｍＲＮＡが挙げられる。細胞ＩＲＥＳエレメントは、ＩＲＥＳ配列に対してもお互いにも明白な配列も構造類似性も有さず、従って、翻訳アッセイを用いて同定される。別の公知のＩＲＥＳは、本明細書中でその全体が参考として援用される、米国特許第６，１７１，８２１号に開示されるＸＩＡＰ ＩＲＥＳである。
「キャップ依存性翻訳」は、７−グアノキャップ、７−メチルグアノシンキャップが、ｍＲＮＡからタンパク質への翻訳を開始するために、ｍＲＮＡ分子の５’末端に存在しなければならないことを意味する。
「キャップ非依存性翻訳」は、ｍＲＮＡ分子の翻訳に、７−メチルグアノシンキャップが必要とされないことを意味する。キャップ非依存性翻訳機構は、リボソーム再開始、リボソーム入れ替え、および内部リボソーム結合を含む。
「シストロン」は、「コード配列」または単一のタンパク質もしくはポリペプチドをコードする核酸の配列を意味する。
「レポーターシストロン」は、検出可能な遺伝子産物をコードする核酸のセグメントを意味する；これは、ＩＲＥＳの翻訳制御下で発現され得る。
「レポーター遺伝子」は、その発現が免疫学的アッセイ、化学的アッセイ、生化学的アッセイ、または生物学的アッセイにより検出可能および／または定量可能である産物をコードする任意の遺伝子または翻訳可能な核酸配列を意味する。レポーター遺伝子は、例えば、以下の特性のうちの一つを有し得る：蛍光（例えば、緑色蛍光タンパク質）、毒性（例えば、リシン）酵素活性（例えば、ｌａｃｚ／β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコールトランスフェラーゼ）、および第２の分子（例えば、ビオチンまたは検出可能な標識抗体）により結合される能力。
「プロモーター」は、（好ましくは、真核生物細胞における）転写を指示するのに十分な最小の配列を意味する。具体的には、プロモーター依存性遺伝子発現を細胞型特異的、組織特異的、もしくは時間特異的な様式で制御可能にする、または外部シグナルもしくは薬剤により誘導性にするのに十分なプロモーターエレメントが含まれそのようなエレメントは、特定の遺伝子の５’側もしくは３’側に、またはイントロン配列領域に位置し得る。本発明において使用するのに好ましいプロモーターとしては、高レベルの発現を提供するウイルスプロモーター、哺乳動物プロモーター、および酵母プロモーター（例えば、哺乳動物ＣＭＶプロモーター、酵母アルコールオキシダーゼ、ホスホグリセロキナーゼプロモーター、ラクトース誘導性プロモーター、ガラクトシダーゼプロモーター、アデノ随伴ウイルスプロモーター、バキュロウイルスプロモーター、ポックスウイルスプロモーター、レトロウイルスプロモーター、アデノウイルスプロモーター、ＳＶ４０プロモーターＨＭＧ（ヒドロキシメチルグルタリルコエンザイムＡ）プロモーター、ＴＫ（チミジンキナーゼ）プロモーター、７．５ＫまたはＨ５Ｒポックスウイルスプロモーター、アデノウイルス２型ＭＰＣ後期プロモーター、αアントリプシン（ａｎｔｒｙｐｓｉｎｅ）プロモーター、第ＩＸ因子プロモーター、免疫グロブリンプロモーター、ＣＦＴＲサーファクタントプロモーター、アルブミンプロモーター、およびトランスフェリンプロモーター）が挙げられる。
「発現ベクター」は、下流の遺伝子、シストロン、またはＲＮＡコード領域に作動可能に連結された少なくとも１つのプロモーターを含むＤＮＡ構築物を意味する。本明細書中では、プロモーターは、各々開始コドンが先行し終止コドンが追随する１つ以上の遺伝子またはシストロンに作動可能に連結され得る。発現ベクターのレシピエント細胞（すなわち、真核生物細胞（例えば、哺乳動物細胞、真菌細胞、酵母細胞））へのトンラスフェクションは、細胞が、発現ベクターによりコードされるＲＮＡを発現することを可能にする。発現ベクターとしては、例えば、遺伝子操作されたプラスミドまたはウイルスが挙げられる。
「形質転換」または「トランスフェクション」は、多シストロン性ベクターまたは構築物の、それらの中の遺伝子の発現に適した真核生物細胞への導入をいう。
「真核生物細胞」は、本発明の多シストロン性発現系を用いて目的の遺伝子を生成または発現する任意の真核生物細胞をいう。これとしては、例えば、哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞、骨髄腫細胞、ＢＨＫ細胞、免疫細胞）、昆虫細胞、鳥類細胞、両性類細胞（例えば、カエル卵母細胞）、真菌細胞、および酵母細胞が挙げられる。発現のために有用な酵母としては、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ、Ｙａｒｒｏｗｉａ、Ｐｉｃｈｉａなどが挙げられる。発現のために特に好ましい酵母としては、メチル好性酵母株（例えば、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｐｉｃｈｉａ ｇｕｉｌｌｅｒｍｏｒｄｉｉ、Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ ｉｎｏｓｉｔｏｖｅｒａなどが挙げられる（例えば、米国特許第４，８１２，４０５号、同第４，８１８，７００号、同第４，９２９，５５５号、同第５，７３６，３８３号、同第５，９５５，３４９号、同第５，８８８，７６８号、および同第６，２５８，５５９号を参照のこと）。これらおよび他の特許はさらに、プロモーター、ターミネーター、エンハンサー、シグナル配列、および酵母における異種遺伝子（例えば、本発明におけるような抗体遺伝子）発現を容易にするのに有用な他の調節配列を記載する。
本明細書から明らかなように、本発明の多シストロン性発現系を用いて抗体を産生するのに有用な遺伝子配列は、多くの異なる供給源から取得され得る。例えば、種々のヒト抗体遺伝子は、公的にアクセス可能な寄託物の形態で入手可能である。抗体および抗体コード遺伝子の多くの配列が公開されており、そして適切な抗体遺伝子は、本明細書中に記載される配列と同様、これらの配列からも合成され得る。あるいは、抗体産生細胞株は、当業者に周知の技術を用いて選択および培養され得る。このような技術は、種々の実験マニュアルおよび主要な刊行物に記載されている。これに関して、以下に記載されるような本発明における使用に適切な技術は、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｉｇａｎら編，Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９１）（捕遺を含む）（本明細書中でその全体が参考として援用される）に記載されている。
本発明の範囲はさらに、本明細書中に開示されるＤＮＡ配列の全ての対立遺伝子、改変体、および変異体を含むことがさらに理解される。
周知のように、抗体をコードするＲＮＡは、元の抗体産生ハイブリドーマ細胞から単離され得るか、または標準的な技術（例えば、グアニジニウムイソチオシアネート抽出および沈殿、その後の遠心分離またはクロマトグラフィー）により他の形質転換細胞から単離され得る。所望の場合、ｍＲＮＡは、標準的な技術（例えば、オリゴｄＴセルロースでのクロマトグラフィー）により総ＲＮＡから単離され得る。これらの目的に適切な技術は、当該分野で認知されており、前述の参考文献に記載されている。
抗体の軽鎖および重鎖をコードするｃＤＮＡは、周知の方法に従い逆転写酵素およびＤＮＡポリメラーゼを用いて、同時にかまたは別々にかのいずれかで、作製され得る。それは、コンセンサス定常領域プライマーによるかまたは公開されている重鎖および軽鎖のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列に基づく、より特別なプライマーにより開始され得る。上で議論したように、ＰＣＲはまた、抗体の軽鎖および重鎖をコードするＤＮＡクローンを単離するために使用され得る。この場合、ライブラリーは、コンセンサスプライマーまたはより長い相同なプローブ（例えば、マウス定常領域プローブ）によりスクリーニングされ得る。
軽鎖および重鎖をコードするＤＮＡは、本明細書中に記載されるような細胞から、組換えＤＮＡ技術に関する前述の参考文献に詳細に記載される標準的な周知の技術に従い、代表的にはプラスミドＤＮＡの形態で単離され、制限マッピングされ、そして配列決定され得る。当然、ＤＮＡは、本発明に従って、単離プロセスまたはその後の分析の間の任意の時点で改変され得る。
本発明の組成物および方法は、任意の抗体、または実際は任意の多鎖タンパク質に適しているが、好ましい抗体配列が本明細書中に開示される。本発明のこの局面と適合するオリゴヌクレオチド合成技術は当業者に周知であり、そしていくつかの市販の自動合成機のいずれかを用いて実施され得る。さらに、本明細書中に示されるいくつかの型の重鎖および軽鎖をコードするＤＮＡ配列は、商業的ＤＮＡ販売元のサービスを通して取得され得る。次いで、前述の方法のいずれかを用いて得られる遺伝子物質は変更または改変されて、本発明と適合する抗体およびそのような抗体の所望の用途を提供し得る。
種々の異なる型の抗体が、本発明に従い発現され得る。本明細書中で使用される場合、「抗体」は、抗原（例えば、腫瘍関連抗原）に対する有意な既知の特別な免疫反応活性を有し、軽鎖および重鎖を含む（それらの間に共有結合を有するかまたは有さない）集合体をいい、従って、単鎖抗体などを含む。本発明に従う「改変抗体」は、１つ以上の定常領域ドメインの少なくとも１つの部分が、免疫原性がほぼ同一の変更されていない大抗体主体（ｓｃＡｂ）と比較した場合、所望の生化学的特徴（例えば、非共有的に二量体化する能力、増大した腫瘍局在化、または改変された血清半減期）を提供するよう欠失されているかまたはそうでなければ変更されている免疫グロブリン、抗体、またはその免疫反応性フラグメントもしくは組換え体を意味すると考えられる。本適用の目的のために、定常領域ドメインが変更されているかまたは削除されている免疫反応性単鎖抗体構築物は、改変抗体であるとみなされ得る。上で議論するように、本発明の多シストロン系を用いて発現される好ましい改変抗体またはドメイン欠失抗体は、定常ドメインの１つの少なくとも一部が欠失され得る。より好ましくは、改変抗体の定常領域の１つのドメイン全体が欠失され、さらにより好ましくは、ＣＨ２ドメイン全体が欠失される。
脊椎動物系における基本的な免疫グロブリン構造（例えば、抗体など）は、比較的十分に理解されている。以下により詳細に議論されるように、包括的用語「免疫グロブリン」は、生化学的に識別され得る５つの別個の抗体クラスを含む。５つ全てのクラスが、明らかに本発明の範囲内であるが、以下の議論は、一般に、ＩｇＧ分子のクラスに関する。ＩｇＧに関して、免疫グロブリンは、約２３，０００ダルトンの分子量の、２つの同一の軽鎖ポリペプチド、および５３，０００〜７０，０００の分子量の、２つの同一の重鎖を含む。これら４つの鎖は、「Ｙ」配置でジスルフィド結合によって連結され、ここで、軽鎖は、「Ｙ」の口で開始してその可変領域まで続く重鎖を挟んでいる。本明細書中で開示される二量体アセンブリは、２つの結合したＹ（Ｈ４Ｌ４）に連結され得、その結果、４つの結合部位が存在する。従って、これが、用語「四価」抗体である。
より詳細には、軽鎖と重鎖との両方が、構造および機能的相同性の領域に分類される。用語「定常」および「可変」は、機能的に使用される。この点に関して、軽鎖（ＶＬ）と重鎖（ＶＨ）との両方の可変ドメインが、抗原の認識および特異性を決定することが理解される。逆に、軽鎖（ＣＬ）と重鎖（ＣＨ１、ＣＨ２またはＣＨ３）との両方の定常ドメインは、重要な生物学的特性（例えば、分泌、経胎盤移動度、Ｆｃレセプター結合、相補性結合など）を与える。慣習によって、この定常領域ドメインの番号付けは、これらのドメインが抗原結合部位また抗体のアミノ末端からより離れるにつれて、増加する。従って、ＣＨ３ドメインおよびＣＬドメインは、実際には、それぞれ、重鎖および軽鎖のカルボキシ末端を含む。
軽鎖は、κまたはλ（κ、λ）のいずれかとして分類される。各重鎖は、κ軽鎖またはλ軽鎖のいずれかと結合され得る。一般に、これらの軽鎖および重鎖は、互いに共有結合され、そしてこれら２つの重鎖の「テイル」部分は、免疫グロブリンが、ハイブリドーマ、Ｂ細胞または遺伝子操作された宿主細胞のいずれかによって作製された場合に、共有結合的なジスルフィド結合によって互いに結合される。その重鎖において、アミノ酸配列は、そのＹ配置の分岐末端においてＮ末端から、各鎖の底部のＣ末端まで走る。Ｎ末端は可変領域であり、Ｃ末端は定常領域である。当業者は、重鎖が、それらの間にいくつかのサブクラスを有する、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、またはイプシロン（γ、μ、α、δ、またはε）として分類されることを認識する。この鎖の性質は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、またはＩｇＭのような、抗体の「クラス」を決定する。免疫グロブリンのサブクラス（アイソタイプ）（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１など）は、十分に特徴付けられており、機能的特異性を与えることが知られている。これらのクラスおよびアイソタイプの各々の改変バージョンは、例示的な開示から、当業者に容易に識別可能であり、従って、本発明の範囲内である。
上に示されるように、可変領域は、抗体が免疫反応性抗原上のエピトープを選択的に認識し、そしてこのエピトープを特異的に結合するのを可能にする。すなわち、抗体のＶＬドメインおよびＶＨドメインを合わせて、３次元の抗原結合部位を規定する可変領域を形成する。この四次抗体構造は、そのＹの各アームの末端にて存在する抗原結合部位を提供する。より詳細には、この抗原結合部位は、ＶＨ鎖およびＶＬ鎖の各々の３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）によって規定される。
各単量体抗体（Ｈ２Ｌ２）上に存在する６つのＣＤＲは、短い、不連続のアミノ酸配列であり、この配列は、抗体が水性環境においてその３次元配置をとる場合に、抗原結合部位を形成するように特異的に位置決めされている。重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインの残りは、アミノ酸配列において分子間可変性をほとんど示さず、フレームワーク領域と称される。このフレームワーク領域は、大部分が、βシートコンホメーションをとり、そのＣＤＲは、ループ接続を形成し、そしていくつかの場合、このβシート構造の一部を形成する。従って、これらのフレームワーク領域は、鎖間の非共有的な相互作用によって、６つのＣＤＲを正確な方向に位置決めするスカホールドを形成するように作用する。任意の事象において、この位置決めされたＣＤＲによって形成される抗原結合部位は、免疫反応性抗原上のエピトープに相補的な表面を規定する。この相補的な表面は、免疫反応性抗原エピトープへの抗体の非共有結合を促進する。
本発明の目的のために、本発明のポリシストロニック発現系を使用して発現される抗体は、抗体と選択された抗原との結合を提供する可変領域の任意の型を含み得ることが理解されるべきである。この点に関して、この可変領域は、体液性応答を開始し（ｍｏｕｎｔ）、所望の抗原に対する免疫グロブリンを作製するように誘導され得る哺乳類の任意の型を含み得るかまたはそれに由来し得る。このように、改変された抗体の可変領域は、例えば、ヒト、マウス、非ヒト霊長類（例えば、カニクイザル、マカク属など）またはルピナス起源のものであり得る。特定の好ましい実施形態において、改変された適合性抗体の可変領域と定常領域との両方が、ヒトである。他の選択された実施形態において、（通常、非ヒト供給源由来の）適合性抗体の可変領域は、操作され得るか、またはその結合特性を改善するかもしくはその分子の免疫原性を低下されるように特別に変更され得る。この観点から、本発明において有用な可変領域は、ヒト化され得るか、またはそうでなければ、移入されたＤＮＡもしくはアミノ酸配列の封入を介して変更され得る。
本出願の目的のために、用語「ヒト化抗体」は、親抗体の抗原結合特性を維持するかまたは実質的に維持するが、ヒトにおいてほとんど免疫原性ではない、非ヒト抗体由来の抗体、代表的には、マウス抗体由来の抗体を意味する。これは、種々の方法によって達成され得る。これらの方法は、以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を包含する：（ａ）非ヒト可変ドメインをヒト定常領域上に移植して、キメラ抗体を作製する工程；（ｂ）１つ以上の非ヒト相補性決定領域（ＣＤＲ）のうちの少なくとも一部を、ヒトフレームワークおよび重要なフレームワーク残基を保持しているかもしくは保持していないヒト定常領域に移植する工程、または（ｃ）全非ヒト可変ドメインを移植するが、表面残基の置き換えによって、ヒト様切片を用いてこれらを「覆い隠す」工程。このような方法は、Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１：６８５１−５（１９８４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４４：６５−９２（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４−１５３６（１９８８）；Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎ．２８：４８９−４９８（１９９１）；Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎ．３１：１６９−２１７（１９９４）、ならびに米国特許第５，５８５，０８９号、同第５，６９３，７６１号および同第５，６９３，７６２号（これら全ては、それら全体が本明細書中で参考として援用される）において開示されている。
当業者は、上記の選択肢（ａ）に記載される技術が、「古典的な」キメラ抗体を産生することを理解する。本出願の文脈において、用語「キメラ抗体」は、免疫反応性領域または免疫反応性部位が第一の種から得られるかまたはこの第一の種由来であり、かつ定常領域（これは、本発明に従って、インタクトな部分であり得るかまたは改変され得る）が第二の種から得られる、任意の抗体を意味するように適用される。好ましい実施形態において、抗原結合領域または抗原結合部位は、非ヒト供給源（例えば、マウス）由来であり、定常領域は、ヒト供給源由来である。その可変領域の免疫原性特異性は、一般に、その供給源によって影響を受け、ヒト定常領域は、非ヒト供給源由来の定常領域よりも、ヒト被験体からの免疫応答をほとんど誘発しないようである。特定のキメラ抗体は、サルを所望の抗原で最初に免疫し、この抗原に対して惹起される抗体を単離し、そしてその重鎖および軽鎖の定常領域を、所望の機能（例えば、ヒトエフェクター機能など）を有する定常領域（例えば、ヒト）で置換することによって、作製され得る。このような「Ｐｒｉｍａｔｉｚｅｄ（登録商標）」抗体およびこの抗体を作製する方法は、米国特許第５，６５８，５７０号（その全体が本明細書中で参考として援用される）にさらに記載されている。
好ましくは、キメラ抗体の重鎖および軽鎖の両方における可変ドメインは、１つ以上のＣＤＲの少なくとも一部分の置換によって変更され、必要であれば、部分的なフレームワーク領域の置換および配列変化によって変更される。ＣＤＲは、同じクラスまたはフレーム領域が由来する抗体のサブクラスから誘導され得るが、ＣＤＲは、異なるクラスの抗体、好ましくは異なる種からの抗体から由来することが考えられる。１つの可変ドメインの抗原結合能力を別に移すために、ドナー可変領域からの完全ＣＤＲを有するＣＤＲの全てを置換することは必要ではないかもしれないことが、強調されなければならない。むしろ、これは、抗原結合部位の活性を維持するのに必要な残基を移すためだけに必要であるかもしれない。米国特許第５，５８５，０８９号、同第５，６９３，７６１号および同第５，６９３，７６２号に記載される説明を考慮すると、これは、慣習的な実験を実施することによってか、または減少した免疫原性を有する機能的抗体を得るための試行錯誤試験によって、十分に当業者の能力の範囲内である。
可変領域の変更に関わらず、本発明に適合する可変抗体が、抗体またはその免疫反応性フラグメントを含み、これらの定常領域ドメインの１つ以上の少なくとも１つの画分が欠失されているか、そうでなければ所望の生化学的特性（例えば、増加した腫瘍局在、またはネイティブな定常領域または変更されていない定常領域を含むほぼ同じ免疫原性の抗体と比較して改変された（例えば、減少された）血清半減期）を提供するように変更されてることは、当業者に明らかである。好ましい実施形態において、対象の多シストロンベクターを用いて発現された抗体の定常領域は、ヒト定常領域を含む。本発明に適合する定常領域についての改変は、１つ以上のドメインにおける１つ以上のアミノ酸の付加、欠失または置換を含む。すなわち、本明細書中に開示される改変された抗体は、３つの重鎖定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２またはＣＨ３）の１つ以上および／または軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）に対する変更または改変を含み得る。以下および実施例においてより詳細に議論されるように、本発明の特定の実施形態は、１つ以上のドメインが部分的または全体的に欠失されている（「ドメインの欠失した抗体」）改変された定常領域を有する抗体の発現を含む。特に好ましい実施形態において、適合可能な改変抗体は、ドメイン欠失構築物またはＣＨ２ドメイン全体が除去されている改変体（ΔＣＨ２構築物）を含む。他の好ましい実施形態において、短いアミノ酸スペーサーは欠失ドメインに置換され得、可変領域に可撓性および移動の自由を与える。
先に記載されるように、サブユニット構造および種々の免疫グロブリンクラスの定常領域三次元構造は、周知である。例えば、ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインは、通常、慣習的な番号付けスキームを用いて、残基約２３１〜残基約３４０に広がる。ＣＨ２ドメインは、別のドメインと密接に対合しない独特なドメインである。むしろ、２つのＮ連結分枝炭水化物鎖は、インタクトなネイティブのＩｇＧ分子の２つのＣＨ２ドメイン間に挿入される。ＣＨ３ドメインは、ＣＨ２ドメインからＩｇＧ分子のＣ末端に広がり、そして約１０８残基を含むが、一方、ＩｇＧ分子のヒンジ領域はＣＨ１ドメインとＣＨ２とを結合することもまた、十分に証明されている。このヒンジ領域は、およそ２５残基を含み、可撓性であり、それによって２つのＮ末端抗原結合領域は独立して移動可能である。
これらの構成に加えて、定常領域がいくつかのエフェクター機能を媒介することが当該分野で公知である。例えば、抗体への補体のＣ１成分の結合は、補体システムを活性化する。補体の活性化は、細胞の病原のオプソニン化および溶解に重要である。補体の活性化はまた、免疫応答を刺激し、そして自己免疫過敏症に関連し得る。さらに、抗体は、細胞のＦｃレセプター（ＦｃＲ）に結合する抗体Ｆｃ領域上のＦｃレセプター部位を有するＦｃ領域を介して細胞に結合する。種々のクラスの抗体に特異的な、多くのＦｃレセプターが存在し、これらとしては、ＩｇＧ（γレセプター）、ＩｇＥ（ηレセプター）、ＩｇＡ（αレセプター）およびＩｇＭ（μレセプター）が挙げられる。細胞表面上のＦｃレセプターへの抗体の結合は、多くの重要であり、かつ多様な生物学的応答（抗体コート粒子の増強および破壊、免疫複合体の排除、キラー細胞による抗体コート標的細胞の溶解（抗体依存性細胞媒介型細胞毒性またはＡＤＣＣと称される）、免疫メディエータの放出、胎盤移行および免疫グロブリン産生の制御を含む）を誘発する。種々のＦｃレセプターおよびレセプター部位はある程度まで研究されてきたが、これらの局在、構造および機能化については、未だ十分に知られていない。
上に議論されるように、本明細書中に記載されるいくつかの方法による定常領域の改変は、開示された改変抗体を自然に構成させ得るか、または安定な抗体に会合させ得る。さらに、本発明の範囲を限定するのではなく、本明細書中に記載されるように改変された定常領域を含む抗体が、投与された抗体の生物学的プロフィールに順に影響を与える変更されたエフェクター機能を提供することが考えられる。例えば、定常領域ドメインの欠失または不活性化（点変異または他の手段による）は、循環改変抗体のＦｃレセプター結合を減少させ得、それによって腫瘍局在化を増強する。他の場合において、本発明の中程度のコンプリメント結合（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔ ｂｉｎｄｉｎｇ）と一致し、従って血清半減期および結合体化した細胞毒素の非特異的な会合を減少させることがあり得る。さらに他の定常領域の改変を使用して、ジスルフィド結合またはオリゴ糖部分（抗原特異性または抗体可撓性の増加起因して促進された局在化を可能にする）を排除し得る。さらに、一般的に、当業者は、本明細書中に記載されるような改変された抗体が、容易に評価されてもされなくてもよい、多くの適切な影響を発揮し得ることを理解する。しかし、生じる生理学的プロフィール、バイオアベイラビリティおよび他の改変の生化学的影響（例えば、腫瘍局在化および血清半減期）は、過度の実験を伴わずに、周知の免疫学的技術を使用して容易に測定および定量化され得る。
同様に、本発明の従う定常領域の改変は、十分に当業者の範囲内であり、周知の生化学学的操作または分子操作を使用して容易に作製され得る。この局面において、本明細書に添付される実施例は、本発明の従って改変された定常領域を有する種々の構築物を提供する。さらに詳細に、例示の構築物は、ＣＨ２ドメインを欠失するように操作されたヒト定常領域を有するキメラ抗体およびヒト化抗体を含む。当業者は、このような構築物が、抗体の代謝速度に関してＣＨ２ドメインの調節特性に起因して特に好ましいことを理解する。
ＰＣＴ／ＵＳ０２／０２３７３およびＰＣＴ／ＵＳ０２／０２３７４（２００２年１月２９日出願、これらの両方はその全体が参考として援用される）に記載されるΔＣＨ２ドメイン欠失抗体は、ＣＤ２０パンＢ細胞抗原に免疫特異的なキメラＣ２Ｂ８抗体およびＴＡＧ７２抗原に特異的なヒト化ＣＣ４９抗体に由来する。以下により詳細に記載されるように、ドメインを欠失した構築物の両方がＩｇＧ１ヒト定常ドメインをコードする独自のベクター（ＩＤＥＣ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）に由来した。本質的に、このベクターを、ＣＨ２ドメインを欠失するように設計し、そしてドメインの欠失したＩｇＧ１定常領域を発現する改変ベクターを提供する。Ｃ２Ｂ８抗体のマウス可変領域またはヒト化ＣＣ４９抗体の可変領域をコードする遺伝子を、次いで改変ベクターに挿入し、クローニングした。形質転換細胞において発現した場合、これらのベクターは、ｈｕＣＣ４９．ΔＣＨ２またはＣ２Ｂ８．ΔＣＨ２のそれぞれを生じた。以下に説明するように、これらの構築物は、単量体サブユニットのために特に魅力的な候補を生じる多くの特性を示した。
以前の例示的な構築物は、それぞれの改変された抗体のヒンジ領域に直接的にＣＨ３ドメインを融合するように設計されたことに留意すべきである。これらを構築するために、ヒンジ領域と改変されたＣＨ２および／またはＣＨ３ドメインとの間にペプチドスペーサーを与えることが所望され得る。例えば、ＣＨ２ドメインが欠失され、残りのＣＨ３ドメイン（改変または未改変）が、５〜２０アミノ酸スペーサーを有するヒンジ領域に結合された、適合性の構築物が発現される。このようなスペーサーは付加され得、例えば、構築物ドメインの調節エレメントが存在せず、接近可能であるか、あるいはヒンジ領域が可動性であるかことを確実にする。しかし、いくつかの場合、アミノ酸スペーサーが、免疫原性を提供し得るか、または単量体サブユニットの所望の二量体を阻害し得ることを留意されたい。例えば、ドメインの欠失したＣＣ４９構築物（これは、ＣＨ２ドメイン（ＣＣ４９．ΔＣＨ２［ｇｌｙ／ｓｅｒ］）に置換された短いアミノ酸スペーサーＧＧＳＳＧＧＧＧＳＧ（配列番号１）を有する）を、実施例においてコントロールとして使用する。なぜなら、この構築物は、二量形態に自然に組み立てられないからである。従って、本発明に適合する任意のスペーサーは、比較的非免疫原性であり、そして改変された抗体の非共有結合を阻害しない。
全体の構築物領域ドメインの欠失に加えて、本発明の多シストロン抗体構築物は、単量体サブユニット間の所望の非共有結合が可能な限り、いくつかのアミノ酸または単一のアミノ酸の部分的欠失または置換によって提供され得ることが理解される。例えば、ＣＨ２ドメインの選択された領域における単一アミノ酸の変異は、Ｆｃ結合を実質的に減少させるのに十分であり得、それによって腫瘍の局在化を増加させ得る。同様に、調節されるべきエフェクター機能（例えば、相補的ＣＬＱ結合）を制御する１つ以上の定常領域ドメインの一部を単に欠失することが所望され得る。定常領域のこのような部分的な欠失は、抗体の選択された特徴（血清半減期）を改善し得るが、目的の定常領域ドメインに関連する他の所望の機能がインタクトなままである。さらに、上記のように、開示された抗体の定常領域は、生じる構築物のプロフィールを増強する１つ以上のアミノ酸の変異または置換によって改変され得る。この局面において、保存された結合部位（例えば、Ｆｃ結合）によって提供される活性を破壊することが可能であり得るが、改変された抗体の構成および免疫原性プロフィールは実質的に残ったままである。他のさらに好ましい実施形態は、定常領域への１つ以上のアミノ酸の付加を含み、所望の特徴（例えば、エフェクター機能）を増強し得るか、またはより多くの細胞毒性もしくは炭水化物結合を提供し得る。このような実施形態において、選択された定常領域ドメインに由来する特定の配列を挿入または複製することが所望され得る。
上記のような抗体および改変された抗体遺伝子を提供するために、単離された遺伝的物質を操作した後、遺伝子を、宿主細胞に導入するための本発明に従う多シストロン発現ベクター（所望量の抗体を産生するために使用され得る）に挿入する。このような構築物の構成を、以下に詳細に記載する。
用語「ベクター」または「発現ベクター」は、本明細書および特許請求の範囲の目的のために使用され、細胞に所望の遺伝子を導入し発現させるためのビヒクルとしての、本発明に従って使用されるベクターを意味する。当業者に公知なように、このようなベクターは、プラスミド、ファージ、ウイルスおよびレトロウイルスからなる群より容易に選択され得る。一般に、本発明に適合するベクターは、選択マーカー、所望の遺伝子のクローニングならびに真核生物細胞または原核生物細胞に進入および／または複製する能力を促進する適切な制限部位を含む。
本発明の目的のために、多くの多シストロン発現ベクター系が使用され得る。例えば、多シストロンベクターは、動物ウイルス（例えば、ウシパピローマウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルス、レトロウイルス（ＲＳＶ、ＭＭＴＶまたはＭＯＭＬＶ）またはＳＶ４０ウイルス）から由来するＤＮＡエレメントを含み得る。さらに、それらの染色体に多シストロン構築物ＤＮＡを統合する細胞は、トランスフェクトされた宿主細胞の選択を可能にする１つ以上のマーカーを導入することによって選択され得る。このマーカーは、栄養素要求株宿主に対する原型（ｐｒｏｔｏｔｒｏｐｈｙ）、殺生剤耐性（例えば、抗生物質）または重金属（例えば、銅）に対する耐性を提供し得る。選択マーカー遺伝子は、発現されるＤＮＡ配列に直接連結されても、同時形質転換によって同じ細胞に導入されてもよい。さらなる要素はまた、ｍＲＮＡの最適な合成のために必要とされ得る。これらのエレメントは、スプライス信号、ならびに転写プロモーター、エンハンサー、および終結シグナルを含み得る。
好ましい実施形態において、本発明は、対象の新規の多シストロン発現系を使用して、抗体（改変された抗体を含む）を発現させる。これらの新規の発現系において、目的の複数の遺伝子産物（例えば、抗体の重鎖および軽鎖）は、単一の多シストロン構築物から産生され得る。これらの系は、内部リボソームの部位全体（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｅｎｔｒｙ ｓｉｔｅ（ＩＲＥＳ））を有利に使用して、真核生物宿主細胞において比較的高レベルの改変された抗体を提供する。適合可能なＩＲＥＳ配列は、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．６，１９３，９８０（これはまた、その全体が本明細書中に援用される）に開示されている。当業者は、このような発現系を使用して、本願に開示される改変された抗体の全範囲を効率的に産生し得ることを理解する。
より一般的に、一旦単量体サブユニット（例えば、改変された抗体）をコードするベクターまたはＤＮＡ配列が調製されると、発現ベクターは、適切な宿主細胞に導入され得る。すなわち、宿主細胞は形質転換され得る。宿主細胞へのプラスミドの導入は、当業者に周知の種々の技術によって達成され得る。これらとしては、トランスフェクション（電気泳動およびエレクトロポレーションを含む）、プロトプラスト融合、リン酸カルシウム沈降、エンベロープＤＮＡとの細胞融合、マイクロ注入、およびインタクトウイルスへの感染が挙げられるが、これらに限定されない。Ｒｉｄｇｗａｙ，Ａ．Ａ．Ｇ．「Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒｓ」第２４．２章、４７０−４７２頁 Ｖｅｃｔｏｒｓ，ＲｏｄｒｉｇｕｅｚおよびＤｅｎｈａｒｄｔ編、（Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ，Ｂｏｓｔｏｎ，Ｍａｓｓ．１９８８）を参照のこと。最も好ましくは、宿主へのプラスミドの導入は、エレクトロポレーションによる。形質導入された細胞は、軽鎖および重鎖の産生に適切な条件下で増殖され、そして重鎖および／または軽鎖のタンパク質合成について評価される。目的の遺伝子産物を同定および定量化するための例示的なアッセイ技術としては、酵素結合免疫反応吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、または蛍光細胞分析分離装置（ＦＡＣＳ）、免疫組織化学などが挙げられる。
本明細書中で使用される場合、用語「形質転換」は、レシピエント宿主細胞へのＤＮＡの任意の導入（遺伝子型を変更し、宿主細胞における変化を結果的に生じる）を言及するように広い範囲で使用される。
本明細書中で使用される場合、「宿主細胞」は、組換えＤＮＡ技術を使用して構築されたベクターおよび少なくとも１つの異種遺伝子をコードするベクターを形質導入した細胞をいう。本明細書中で規定するように、抗体またはそれらの改変は、宿主細胞によって、すなわちこの形質転換、組換えによって産生される。組換え宿主からの抗体の単離についてのプロセスの記載において、用語「細胞」および「細胞培養物」は、別の点で明らかに特定化されない限り、抗体の供給源を記載するために相互交換可能に使用される。言い換えると、「細胞」からの抗体の回収は、遠心分離した細胞全体、または培地および懸濁された細胞の両方を含む細胞培養物を意味し得る。
タンパク質発現のために使用される宿主細胞株は、哺乳動物起源が最も好ましい；当業者は、所望の遺伝子産物の発現に最も適した特定の宿主細胞株を容易に決定し得る。例示的な宿主細胞としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＤＧ４４およびＤＵＸＢ１１（チャイニーズハムスター卵巣株、ＤＨＦＲ−）、ＨＥＬＡ（ヒト頸部癌腫）、ＣＶＩ（サル腎臓株）、ＣＯＳ（ＳＶ４０ Ｔ抗原とＣＶＩとの誘導体）、Ｒ１６１０（チャイニーズハムスター線維芽細胞）ＢＡＬＢＣ／３Ｔ３（マウス線維芽細胞）、ＨＡＫ（ハムスター腎臓細胞）、ＳＰ２／Ｏ（マウス骨髄腫）、Ｐ３．ｔｉｍｅｓ．６３−Ａｇ３．６５３（マウス骨髄腫）、ＢＦＡ−１ｃ１ＢＰＴ（ウシ内皮細胞）、ＲＡＪＩ（ヒトリンパ球）および２９３（ヒト腎臓）。ＣＨＯ細胞が、特に好ましい。宿主細胞株は、代表的に商業サービス、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎまたは発行された文献から入手可能である。
インビトロ産生は、多シストロン発現系（好ましくは、抗体）を使用して、産生される多量の所望のポリペプチドを得るために拡大することが可能である。組織培養条件下での真核生物細胞（例えば、哺乳動物細胞および酵母細胞）の培養についての技術は、当業者に公知であり、これらとしては、均一懸濁培養（例えば、エアーリフト反応器内または連続攪拌反応器内）、あるいは固定細胞培養または捕捉細胞培養（例えば、ハローファイバ中、マイクロカプセル内、アガロースミクロビーズ上またはセラミックカートリッジ上）が挙げられる。抗体の単離および回収について、培養物懸濁液中の免疫グロブリンは、まず、例えば、硫酸アンモニウムでの沈降、吸湿物質（例えば、ＰＥＧ）に対する透析、選択膜による濾過などによって濃縮され得る。必要とされる場合および／または所望される場合、多価抗体の濃縮溶液は、慣習的なクロマトグラフィー法（例えば、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、ＤＥＡＥ−セルロースクロマトグラフィーまたは（免疫）親和性クロマトグラフィー）によって精製される。
単一多シストロン構築物から目的の複数の遺伝子産物を産生する新規の発現系が、本明細書中に開示される。以前から公知の多シストロン構築物と違って、本発明の発現系は、商業的に有用な第１のシストロンおよびその結果生じたシストロンの両方において、十分なレベルの所望の遺伝子を産生する。以下に記載するように、第１のシストロンにおいて発現される遺伝子配列と比べて、多シストロン発現系における第１のシストロンの後に局在された遺伝子配列が、非常に低レベルで発現されることは、驚くべきことである。従って、以前の多シストロン発現系は、一般的に、第２のシストロンにおいて目的の遺伝子配列ではなく、マーカー配列を発現するように限定されていた。あるいは、この第２のシストロン遺伝子は、十分に発現されず、それによって各シストロンに含まれる遺伝子からの検出可能な翻訳産物の産生を排除した。対照的に、所望であれば、本発明に従う多シストロン構築物は、目的の遺伝子を各々コードする、２つ、３つ、またはそれ以上のシストロンを含み得る。
好ましい実施形態において、本発明は、多シストロン性の発現系を使用して、抗体を発現し、これらの抗体は、本明細書中で記載されるように改変され得、さらに二量体抗体を含む。ここで２つ以上の抗体遺伝子が同じ真核生物プロモーターから発現され、ここで、このような抗体遺伝子が１つ以上のＩＲＥＳにより分離される。特に、上記のように、本発明は、ドメイン欠失抗体およびＰＣＴ／ＵＳ０２／０２３７３およびＰＣＴ／ＵＳ０２／０２３７４（いずれも２００２年１月２９日に出願され、これらの全体が本明細書中に参考として援用される）に記載されるような他の改変抗体の発現を含む。発現に使用される真核生物細胞は、好ましくは、哺乳動物細胞または酵母細胞であり、最も好ましくは、高レベルのタンパク質産生のために効率良く培養され得るＣＨＯ細胞または他の細胞である。上記のように、本発明に従って多シストロン性の発現系に組み込むための抗体重鎖遺伝子および軽鎖遺伝子の獲得またはクローニングは、十分に業者の範囲内である。記載のように、このような抗体遺伝子は、成熟した重鎖もしくは軽鎖の抗体遺伝子（例えば、マウス、ウサギ、ヒト、ハムスターなど）をコードし得るか、または、これらの重鎖および／もしくは軽鎖の遺伝子は、例えば、キメラ化、ヒト化、ドメイン欠失もしくは部位特異的変異誘発によって改変され得る。
本発明はさらに、任意の重鎖および軽鎖の配列の発現を企図し、これらの配列が、本発明の多シストロン性の発現系を使用して発現される場合、機能的抗体（すなわち、標的抗原（例えば、腫瘍関連抗原）に特異的に結合する抗体）を産生することに関連する。
上で議論するように、多シストロン性の構築物における重鎖および軽鎖の遺伝子のコピー数が、軽鎖／重鎖の好ましい割合が得られるよう（例えば、軽鎖が、重鎖に対して代表的には１０／１、より好ましくは５／１、そしてなおより好ましくは約３／１〜１／１の範囲であるレベルで発現される）に選択され得る。
好ましい実施形態において、この発現系は、真核生物細胞中、好ましくは哺乳動物細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ベイビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、線維芽細胞株および骨髄腫細胞）中で抗体を、産生する。例えば、ＣＨＯ細胞が、５’から３’の方向に少なくとも以下の配列を有する多シストロンを含む発現系の宿主として使用される：発現に使用される特定の真核生物細胞で機能する真核生物プロモーター配列（例えば、ＣＭＶプロモーター配列、ＳＶ４０初期プロモーター配列またはアクチンプロモーター配列、好ましくはＣＭＶ）；抗体軽鎖をコードするＤＮＡ配列および、好ましくはその５’末端に真核生物分泌リーダー配列；内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、好ましくはカーディオウイルス、ポリオウイルス、またはヘルペスウイルスのＩＲＥＳであり、抗体軽鎖配列の後に配置される；抗体重鎖をコードする少なくとも１つのＤＮＡ配列であり、各重鎖配列は好ましくは真核生物分泌リーダー配列であり、そして、５’の開始コドンおよび３’の終止コドンによって挟まれており、ここで、の抗体重鎖をコードするＤＮＡのいくつかまたは全てが、ＩＲＥＳによってそれに続く重鎖配列と分離され、そして、ここで、最終的な抗体重鎖をコードする配列が、３’末端にポリＡ配列を含む。重鎖配列と軽鎖配列の間のＩＲＥＳ部位の適切な場所は、図２のＮＥＯＳＰＬＡベクターに例示される。
本明細書中に記載するように、真核生物細胞は、好ましくは哺乳動物細胞を含み、そして好ましくはＣＨＯ細胞を含む。好ましい実施形態において、プロモーターはＣＭＶプロモーターであり、ＩＲＥＳはカーディオウイルス（例えば、脳心筋炎ウイルス、メンゴウイルス、ムーサ−エルバーフィエル（Ｍｏｕｓ−Ｅｌｂｅｒｆｉｅｌｌ）ウイルス、ＭＭウイルスおよびコロンビアＳＫウイルス、最も好ましくはヒト脳心筋炎ウイルス（ｈＥＭＣＶ））由来である。
本発明の多シストロンは、好ましくは、１つの抗体軽鎖コード配列および１つまたは２つの抗体重鎖コード配列を含む。しかし、本発明に従う多シストロン構築物は、３または４つの遺伝子配列またはシストロン（例えば、１つの軽鎖および２つ以上の重鎖）を含み得ることが企図される。さらに、対象の多シストロンは、好ましくはポリＡ配列（好ましくはウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）遺伝子のポリＡ配列）を含む。多シストロン系は、必要に応じて、相同組換えによる遺伝子座標的化において使用され得る。
この実施形態において、多シストロン性構築物は、標的化部位で相同組換えを促進する配列（例えば、組換え後に不活性化される遺伝子）を含む。
好ましい実施形態において、本発明の多シストロンは、特定の抗体重鎖および軽鎖の遺伝子の発現の化学両論に依存して、１または２コピーの重鎖コード配列を含む。この点に関して、多シストロン性の発現系において、第２の遺伝子は代表的に第１の遺伝子よりも低い効率で発現されることが周知である。従って、１つの実施形態において、第１のシストロンが抗体軽鎖をコードする本発明の多シストロンは、必要と判断される場合、２つ以上の重鎖コード配列をコードする第２のシストロンを含み得、軽鎖に対して重鎖の十分な発現を促進する。一般に、重鎖は、非多シストロン性の発現系を使用して同じ真核生物細胞で発現される場合、非多シストロン性の重鎖と軽鎖の同時発現で観察されるレベルと少なくとも同じレベルで発現されることが好ましい。
抗体重鎖に対してより多くの抗体軽鎖が発現されることが許容でき、そして実際望ましい。なぜならば、このことは、内因性の抗体産生細胞において生じることに類似するからである。軽鎖は、抗体重鎖および軽鎖の適切な組み立てを方向付けるのに役立つので、色々な発現レベルが存在し、そして過剰の不対重鎖が細胞傷害性を誘導すると考えられる。軽鎖はまた、組み立てられた抗体重鎖および軽鎖の折り畳みを方向付けるのに重要であり、小胞体で機能的な（抗原結合）抗体を産生する。好ましくは、抗体軽鎖は抗体重鎖に対して約１０／１〜１／１で発現される。
しかし、重鎖のレベルは、最小限でなければならず、そして、市販可能なレベルにおいて機能的で分泌可能な抗体の産生を可能にするために、軽鎖に関して十分な割合で存在すべきである。従って、軽鎖に対して重鎖発現が低すぎることは望ましくない。なぜならば、発現下で機能的抗体の不十分な収量が生じるためである。産業利用の目的のために、機能的抗体の不充分な収量は商業的に実行し得ない発現系を与え、バッチ培養物からの完全な抗体分子の回収を達成困難にする。一般に、機能的抗体は、１細胞あたり１日あたり約５〜１００ピコグラムの範囲の量で培養細胞から回収されるが、より多いレベルの発現が達成され得る。例えば、培養細胞は、１日ごとに１細胞あたり少なくとも１〜５ピコグラム、または少なくとも３〜４日で少なくとも３〜１０ｍｇ／Ｌの機能的抗体を分泌し得る。
上記の点に関して、所定の多シストロン性発現系が、他の発現系と割合べて
適度なレベルの抗体産生を生じるかどうかは一般に予測不可能である。この予測不可能性は、例えば、多シストロン性複合体の第２の所望の遺伝子が第１の遺伝子と比べてかなり低いレベルで発現され得るために生じる。従って、多シストロン性ベクターの好ましい実施形態は、抗体重鎖発現に対する抗体軽鎖発現の割合を約１０：１〜約１：１の範囲内で提供すべきである。より好ましくは、重鎖遺伝子発現に対する軽鎖遺伝子発現の割合は、約３：１〜約１．５：１である。
初期ＩＲＥＳ構築物を第１シストロンに抗体軽鎖配列を含み、それに２つのＩＲＥＳ−抗体ＣＨ２ドメイン欠失重鎖配列の対が続き、それによって適切なレベルの抗体が宿主細胞から産生および分泌されることを可能にするために十分な重鎖タンパク質の生成を保証するように作製した。
本発明の多シストロン性ベクターは、必要レベルの重鎖および軽鎖の発現を、適切な重鎖抗体配列の選択によってか、効率的なＩＲＥＳ（例えば、ｈＥＭＣＶのＩＲＥＳ）の選択によってかまたは複数コピーの抗体重鎖遺伝子を組み込むことによって達成し得る。なおさらに、重鎖遺伝子の５’末端に対応するＤＮＡが、コード構造がＡＴＧコドン（代表的には最初の１０コドン）の周囲が変更されないままの様式で、部位特異的変異誘発によって改変され得るが、この改変は、未改変の重鎖遺伝子に関連する重鎖コード配列の変更された発現をもたらす。
対象の多シストロン性発現系を使用した重鎖の収量は、内因性抗体産生細胞の代表的な発現関係性のように、代表的には軽鎖の収量より少ない。重鎖収量に対する軽鎖収量の割合は、タンパク質の分泌および折り畳みを可能にするように十分である。重鎖発現に対する軽鎖発現の割合は、例えば、第１シストロンの軽鎖配列に続くＩＲＥＳ連結下流遺伝子配列の数の増加によって変動され得る。特定のＩＲＥＳおよび発現細胞の組み合せは、好ましくは系の第２のシストロン発現の量を増加するように選択され得る。
対象の発現系に従って発現される抗体は、任意の所望の抗原に特異的であり得る。好ましくは、抗体は、治療的効果を誘発する機能的抗体（例えば、自己免疫疾患、炎症疾患、アレルギー性疾患または腫瘍性疾患を処置するために有用な抗体）である。この抗体は、相乗効果のために、他の治療剤と合わせられ得る。例えば、この抗体は、癌化学療法剤として使用するための放射性供給源と合わされ得る。
一般に、本発明に従って発現される抗体は、多くの結合体化（すなわち、免疫結合体）形態または非結合体化形態の任意の１つにおいて使用され得る。特に、本発明の抗体は、細胞毒素（例えば、放射性同位体、治療剤、細胞増殖抑制剤、生物毒素またはプロドラッグ）に結合体化され得る。あるいは、本発明の抗体は、被験体の天然防御機構を抑制して悪性細胞を排除するために、非結合体化形態または裸形態で使用され得る。特に好ましい実施形態において、本発明の発現系に従って生成される抗体は、例えば、放射性同位体への結合体化によって、改変され得る。本発明に従って有用な放射性同位体の例としては、周知の多くのキレート剤または直接標識のいずれかを使用する、９０Ｙ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１２３Ｉ、１１１Ｉｎ、１０５Ｒｈ、１５３Ｓｍ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、１６５Ｈｏ、１７７Ｌｕ、１８６Ｒｅおよび１８８Ｒｅが挙げられる。結合体化抗体および非結合体化抗体は、例えば、特定の非ホジキンリンパ腫の処置のためにＺｅｖａｌｉｎを使用する現在承認された治療レジメンにおいて使用されるのと同じ治療レジメンにおいて、一緒に使用され得る。
他の実施形態において、本発明の抗体は、薬物、プロドラッグまたは生物学的応答改変剤（例えば、メトトレキサート、アドリアマイシンおよびリンホカイン（例えば、インターフェロン））に連結された改変抗体を含む組成物中に、含まれ得る。本発明のなお他の実施形態は、特定の生物学的毒素（例えば、リシンまたはジフテリア毒素）に結合された改変抗体の使用を包含する。なお他の実施形態において、改変抗体は、他の免疫学的に活性なリガンド（例えば、抗体またはそのフラグメント）と複合体化され得、ここで、得られた分子は、腫瘍性細胞およびエフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）の両方に結合する。結合体化改変抗体および／または非結合体化改変抗体の使用のための選択は、癌の型および病期、補助処置（例えば、化学療法または外部照射）の使用、ならびに患者の状態に依存する。当業者は、本明細書中の教示を鑑みて、このような選択を容易に行い得ることが、理解される。
本明細書中で使用する場合、「細胞毒素または細胞傷害性剤」は、細胞の成長および／または増殖に対して有害であり、そしてこれに曝露された場合に、細胞または悪性疾患を低減、阻害または破壊するように作用し得る、任意の薬剤を意味する。例示的な細胞毒素としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：放射性核種、生物毒素、酵素的に活性な毒素、細胞増殖抑制性または細胞傷害性の治療剤、プロドラッグ、免疫学的に活性なリガンドおよび生物学的応答改変剤（例えば、サイトカイン）。以下により詳細に考察されるように、放射性核種細胞毒素は、本発明における使用のために特に好ましい。しかし、免疫反応性細胞もしくは悪性細胞の増殖を遅延もしくは減速させるようにか、またはこれらの細胞を排除するように作用し、そして本明細書中に開示される多シストロン性由来の機能的抗体に関連し得る任意の細胞毒素が、本発明の範囲内である。
以前の研究において、上記同位体で標識された抗腫瘍抗体は、動物モデルおよびヒトにおいて、固形腫瘍ならびにリンパ腫／白血病において細胞を破壊するために首尾よく使用されてきたことが理解される。この放射性核種は、核ＤＮＡにおける複数の鎖の断絶を引き起こす電離放射線を生成し、細胞死を導くことによって作用する。治療結合体を生成するために使用される同意体は、短いパス長を有する、高エネルギーのα粒子またはβ粒子を、代表的に生成する。このような放射性核種は、近位にある細胞（例えば、結合体が結合されたかまたは侵入した、腫瘍性細胞）を殺傷する。これらは、非局在化細胞に対して、影響をほとんどまたは全く有さない。放射性核種は、本質的に非免疫原性である。
本発明と組み合わせた放射性標識結合体の使用に関して、改変抗体は、（例えば、ヨウ素化によって）直接的に標識され得るか、またはキレート剤の使用によって間接的に標識され得る。本明細書中で使用される場合、句「間接的標識化」および「間接的標識化アプローチ」は共に、キレート剤が抗体に共有結合されていること、および少なくとも１つの放射性核種が、このキレート剤と会合していることを意味する。このようなキレート剤は、代表的に、ポリペプチドおよび放射性同位体の両方に結合する場合に、二重機能的キレート剤と称される。特に好ましいキレート剤としては、１−イソチオシアネートベンジル−３−メチルジエチレン（ｍｅｔｈｙｌｄｉｏｔｈｅｌｅｎｅ）トリアミンペンタン酸（「ＭＸ−ＤＴＰＡ」）誘導体およびシクロヘキシルジエチレントリアミンペンタン酸（「ＣＨＸ−ＤＴＰＡ」）誘導体が挙げられる。他のキレート剤は、Ｐ−ＤＯＴＡ誘導体およびＥＤＴＡ誘導体を含む。間接的標識化に特に適切な放射性核種としては、１１１Ｉｎおよび９０Ｙが挙げられる。
本明細書中で使用される場合、語句「直接標識」および「直接標識アプローチ」とは、両方、放射性核種が、抗体に（代表的に、アミノ酸残基を介して）直接共有結合することを意味する。より具体的には、これらの結合技術としては、ランダムな標識および部位特異的な標識が挙げられる。後者の場合において、標識は、抗体上の特定の部位（例えば、結合体のＦｃ部分のみに存在するＮ結合した糖残基）に指向される。直接標識は、標識によって結合された、多量体抗体を生じ得る。種々の直接標識技術およびプロトコルが、本発明と適合性である。例えば、テクネチウム−９９ｍで標識された四価抗体は、リガンド交換プロセスによってか、スズイオン溶液で過テクネチウム酸（ＴｃＯ４ −）を還元することによってか、Ｓｅｐｈａｄｅｘカラムに還元されたテクネチウムをキレート化させ、そしてこのカラムに抗体を適用することによってか、またはバッチ標識技術（例えば、過テクネチウム酸、ＳｎＣｌ２のような還元剤、フタル酸ナトリウムカリウム溶液のような緩衝液、および抗体をインキュベートすることによる）によって、調製され得る。いずれにしても、抗体を直接標識するために好ましい放射性核種は、当該分野において周知であり、そして直接標識に特に好ましい放射性核種は、１３１Ｉであり、これは、チロシン残基を介して共有結合し得る。本発明に従って改変された抗体は、例えば、放射活性なヨウ化ナトリウムまたはヨウ化カリウムおよび化学的酸化剤（例えば、次亜塩素酸ナトリウム、クロラミンＴなど）または酵素的酸化剤（例えば、ラクトペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ）およびグルコースで誘導体化され得る。しかし、本発明の目的で、間接的標識アプローチが一般に好ましい。
キレート剤およびキレート剤結合体に関する特許が、当該分野において公知である。例えば、Ｇａｎｓｏｗの米国特許第４，８３１，１７５号は、多置換されたジエチレントリアミン五酢酸キレートおよびこれを含むタンパク質結合体、ならびにこれらの調製方法に関する。同様にＧａｎｓｏｗに対する、米国特許第５，０９９，０６９号、同第５，２４６，６９２号、同第５，２８６，８５０号、同第５，４３４，２８７号、および同第５，１２４，４７１号は、多置換されたＤＴＰＡキレートに関する。これらの特許は、その全体が、本明細書中に援用される。適合性の金属キレート剤の他の例は、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＰＴＡ）、１，４，８，１１−テトラアザテトラデカン、１，４，８，１１−テトラアザテトラデカン−１，４，８，１１−四酢酸、１−オキサ−４，７，１２，１５−テトラアザヘプタデカン−４，７，１２，１５−四酢酸などである。シクロヘキシル−ＤＴＰＡまたはＣＨＸ−ＤＴＰＡは、特に好ましく、そして以下に広範に例示される。なお他の適合性のキレート剤（未発見のものを含む）は当業者によって容易に認識され得、そして明らかに、本発明の範囲内である。
適合性のキレート剤（同時係属中の出願番号０８／４７５，８１３号、０８／４７５，８１５号および０８／４７８，９６７号においてキレート化を容易にするために使用される、特定の二官能性キレート剤を含む）は、好ましくは、三価金属に対する高い親和性、増加した腫瘍対非腫瘍比を示し、そして低下した骨取り込み、および標的部位（すなわち、Ｂ細胞リンパ腫腫瘍部位）における放射性核種のより大きいインビボ保持を提供するように選択される。しかし、これらの特徴の全てを有しても有さなくてもよい、他の二官能性キレート剤が、当該分野において公知であり、そしてまた、腫瘍治療において有用であり得る。
本明細書中の教示に従って、改変された抗体は、診断および治療の目的で、異なる放射線標識に結合体化され得ることもまた、理解される。治療抗体の投与の前の、腫瘍の診断「画像化」のための、放射線標識された治療結合体が、調製され得る。「Ｉｎ２Ｂ８」結合体は、二官能性キレート剤（すなわち、ＭＸ−ＤＴＰＡであり、これは、１−イソチオシアナトベンジル−３−メチル−ＤＴＰＡおよび１−メチル−３−イソチオシアナトベンジル−ＤＴＰＡの１：１混合物からなる）を介して１１１Ｉｎに結合した、ヒトＣＤ２０抗原に特異的なマウスモノクローナル抗体である２Ｂ８（リツキシマブ）から構成される。１１１Ｉｎは、診断放射性核種として特に好ましい。なぜなら、約１ｍＣｉと約１０ｍＣｉとの間が、検出可能な毒性なしに安全に投与され得；そして画像化データは、一般に、引き続く９０Ｙ標識された抗体分布を予測するからである。ほとんどの画像化研究は、約５ｍＣｉの１１１Ｉｎ標識抗体を使用する。なぜなら、この用量は、安全であり、かつより低い容量と比較して増加した画像化効率を有するからである。最適な画像化は、抗体投与の３〜６日目に生じる。例えば、Ｍｕｒｒａｙ，Ｊ．Ｎｕｃ．Ｍｅｄ．２６：３３２８（１９８５）およびＣａｒｒａｇｕｉｌｌｏら、Ｊ．Ｎｕｃ．Ｍｅｄ．２６：６７（１９８５）を参照のこと。
上に示されるように、種々の放射性核種が本発明に適用可能であり、そして当業者は、どの放射性核種が、種々の状況下で最も適切であるかを容易に決定する能力があると考えられる。例えば、１３１Ｉは、標的化免疫療法のために使用される、周知の放射性核種である。しかし、１３１Ｉの臨床的有用性は、いくつかの要因によって限定され得る。この要因としては、以下が挙げられる：８日間の物理的半減期；血液と腫瘍部位との両方における、ヨウ素化抗体の脱ハロゲン化；および腫瘍における局在した用量堆積に最適ではなくあり得る、放射特性（例えば、大きいγ線含有量）。優れたキレート剤の出現によって、金属キレート基をタンパク質に付着させる機会は、他の放射性核種（例えば、１１１Ｉｎおよび９０Ｙ）を利用する機会を増加させた。９０Ｙは、放射免疫療法の適用における利用に、いくつかの利点を提供する：９０Ｙの６４時間の半減期は、腫瘍による抗体蓄積を可能にするために十分に長く、そして例えば、１３１Ｉとは異なり、９０Ｙは、その崩壊においてγ放射を伴わない、高いエネルギーの純粋なβ放射物質であり、組織において、細胞直径の１００〜１，０００倍の範囲を有する。さらに最小量の浸入放射線は、９０Ｙ標識された抗体の外来患者への投与を可能にする。さらに、標識抗体の内在化が、細胞殺傷のために必要とされず、そして電離放射線の局所的な放射は、標的抗原を欠く隣接腫瘍細胞に対して致死性であるはずである。
９０Ｙ標識された改変抗体の有効な単一処置投薬量（すなわち、治療有効量）は、約５ｍＣｉと約７５ｍＣｉとの間、より好ましくは、約１０ｍＣｉと約４０ｍＣｉとの間の範囲である。１３１Ｉ標識抗体の、有効な単一処置の非骨髄剥離性の投薬量は、約５ｍＣｉと約７０ｍＣｉとの間、より好ましくは、約５ｍＣｉと約４０ｍＣｉとの間の範囲である。１３１Ｉ標識抗体の、有効な単一処置の剥離性の投薬量（すなわち、自己由来の骨髄の移植を必要とし得る）は、約３０ｍＣｉと約６００ｍＣｉとの間、より好ましくは、約５０ｍＣｉと約５００ｍＣｉ未満との間の範囲である。キメラ抗体と組み合わせると、マウス抗体と比較して、より長い循環半減期に起因して、ヨウ素−１３１標識キメラ抗体の有効な単一処置の非骨髄剥離性の投薬量は、約５ｍＣｉと約４０ｍＣｉとの間、より好ましくは、約３０ｍＣｉ未満の範囲である。
かなり多くの臨床経験が、１３１Ｉおよび９０Ｙを用いて得られたが、他の放射性標識が、当該分野において公知であり、そして類似の治療目的で使用されている。なお他の放射性同位元素が、画像化のために使用されている。例えば、本発明の範囲と適合性であるさらなる放射性同位元素としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：１２３Ｉ、１２５Ｉ、３２Ｐ、５７Ｃｏ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、７７Ｂｒ、８１Ｒｂ、８１Ｋｒ、８７Ｓｒ、１１３Ｉｎ、１２７Ｃｓ、１２９Ｃｓ、１３２Ｉ、１９７Ｈｇ、２０３Ｐｂ、２０６Ｂｉ、１７７Ｌｕ、１８６Ｒｅ、２１２Ｐｂ、２１２Ｂｉ、４７Ｓｃ、１０５Ｒｈ、１０９Ｐｄ、１５３Ｓｍ、１８８Ｒｅ、１９９Ａｕ、２２５Ａｃ、２１１Ａｔ、および２１３Ｂｉ。この局面において、α線放射体、γ線放射体およびβ線放射体は、すべて、本発明と適合性である。さらに、本開示の観点において、当業者は、どの放射性核種が、選択された処置経過と適合性であるかを、過度な実験なしに容易に決定し得ることが提唱される。この目的で、臨床診断においてすでに使用されているさらなる放射性核種としては、１２５Ｉ、１２３Ｉ、９９Ｔｃ、４３Ｋ、５２Ｆｅ、６７Ｇａ、６８Ｇａおよび１１１Ｉｎが挙げられる。抗体もまた、標的化免疫療法における潜在的な使用のために、種々の放射性核種で標識されている。Ｐｅｉｒｅｒｓｚら、Ｉｍｍｎｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．６５：１１１−１２５（１９８７）。これらの放射性核種としては、１８８Ｒｅおよび１８６Ｒｅ、ならびにより少ない程度まで、１９９Ａｕおよび６７Ｃｕが挙げられる。米国特許第５，４６０，７８５号は、このような放射性同位元素に関するさらなるデータを提供し、そして本明細書中に参考として援用される。
放射性核種に加えて、本発明の機能的抗体は、多数の生物的反応修飾物質、薬学的薬剤、毒素または免疫学的に活性なリガンドの任意の１つと結合体化され得るか、または会合し得る。当業者は、これらの非放射活性結合体が、選択された細胞毒に依存して、種々の技術を使用して構築され得ることを理解する。例えば、ビオチンとの結合体は、例えば、二量体抗体を、ビオチンの活性化エステル（例えば、ビオチンＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）と反応させることによって、調製される。同様に、蛍光マーカーとの結合体は、カップリング剤（例えば、上に列挙されたもの）の存在下で、またはイソチオシアネート（好ましくは、フルオレセイン−イソチオシアネート）との反応によって、調製され得る。本発明の四価抗体の、細胞増殖抑制性／細胞傷害性物質および金属キレートとの結合体は、類似の様式で調製される。
本発明において使用するために好ましい薬剤は、細胞傷害性薬剤（特に、癌治療において使用されるもの）である。このような薬物としては、一般に、細胞増殖抑制剤、アルキル化物質、代謝拮抗物質、抗増殖剤、チューブリン結合剤、ホルモンおよびホルモンアンタゴニストなどが挙げられる。本発明と適合性の、例示的な細胞増殖抑制剤としては、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、トリエチレンホスホルアミド、シクロホスファミド、イホスファミド、クロラムブシル、ブスルファン、メルファランまたはトリアジコン）、およびニトロソウレア化合物（例えば、カルムスチン、ロムスチン、またはセムスチン）が挙げられる。他の好ましいクラスの細胞毒性剤としては、例えば、アントラサイクリン（ａｎｔｈｒａｃｙｃｌｉｎｅ）ファミリーの薬物、ビンカアルカロイドファミリーの薬物、マイトマイシン、ブレオマイシン、細胞傷害性ヌクレオシド、プテリジンファミリーの薬物、ジインエン、およびポドフィロトキシンが挙げられる。これらのクラスの特に有用なメンバーとしては、例えば、アドリアマイシン、カルミノマイシン（ｃａｒｍｉｎｏｍｙｃｉｎ）、ダウノルビシン（ダウノマイシン）、ドキソルビシン、アミノプテリン、メトトレキサート、メトプテリン、ミトラマイシン、ストレプトニグリン、ジクロロメトトレキサート、マイトマイシンＣ、アクチノマイシン−Ｄ、ポルフィロマイシン、５−フルオロウラシル、フロクスウリジン、フトラフール、６−メルカプトプリン、シタラビン、シトシンアラビノシド、ポドフィロトキシン、またはポドフィロトキシン誘導体（例えば、エトポシドまたはリン酸エトポシド）、メルファラン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ロイロシジン（ｌｅｕｒｏｓｉｄｉｎｅ）、ビンデシン、ロイロシン（ｌｅｕｒｏｓｉｎｅ）などが挙げられる。本明細書中の教示と適合性である、なお他の細胞毒素としては、タキソール、タキサン、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、エチジウムブロマイド、エメチン、テノポシド（ｔｅｎｏｐｏｓｉｄｅ）、コルヒチン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール（ｐｒｏｐｒａｎｏｌｏｌ）、およびプロマイシンおよびそのアナログまたはホモログが挙げられる。適切な細胞毒素としてはまた、メイタンシノイド（ｍａｙｔａｎｓｉｎｏｉｄ）が挙げられる。ホルモンおよびホルモンアンタゴニスト（例えば、コルチコステロイド（例えば、プレドニゾン）、プロゲスチン（例えば、ヒドロキシプロゲステロンまたはメドロプロゲステロン）、エストロゲン（例えば、ジエチルスチルベストロール）、抗エストロゲン（例えば、タモキシフェン）、アンドロゲン（例えば、テストステロン）、およびアロマターゼインヒビター（例えば、アミノグルテチミド（ａｍｉｎｏｇｌｕｔｈｅｔｉｍｉｄｅ））もまた、本明細書中の教示と適合性である。先に記載されたように、当業者は、所望の化合物の反応を本発明の結合体を調製する目的でより好都合にするために、この化合物に化学修飾を行い得る。
特に好ましい細胞毒素の１つの例は、抗腫瘍抗生物質のエンジインファミリーの誘導体のメンバーを含み、カリケアマイシン（ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ）、エスペラマイシン（ｅｓｐｅｒａｍｉｃｉｎ）またはダイネマイシン（ｄｙｎｅｍｉｃｉｎ）が挙げられる。これらの毒素は、非常に強力であり、そして核ＤＮＡを切断し、細胞死を導くことによって、作用する。インビボで切断されて多くの不活性であるが免疫原性のポリペプチドを与え得るタンパク質毒素とは異なり、カリケアマイシン、エスペラマイシンおよび他のエンジインのような毒素は、本質的に非免疫原性の低分子である。これらの非ペプチド毒素は、モノクローナル抗体および他の分子を標識するために以前に使用された技術によって、二量体または四量体に化学結合される。これらの結合技術としては、その構築物のＦｃ部分のみに存在するＮ結合糖残基を介する、部位特異的結合が挙げられる。このような部位特異的結合方法は、構築物の結合特性に対する結合の可能な影響を減少させるという利点を有する。
先に言及されたように、適合性の細胞毒素は、プロドラッグを含み得る。本明細書中で使用される場合、用語「プロドラッグ」とは、親薬物と比較して、腫瘍細胞に対して細胞毒性が低く、そしてより活性な親形態に、酵素的に活性化され得るか、または転換され得る、薬学的に活性な物質の前駆体形態または誘導体形態をいう。本発明に適合性のプロドラッグとしては、ホスフェート含有プロドラッグ、チオホスフェート含有プロドラッグ、スルフェート含有プロドラッグ、ペプチド含有プロドラッグ、β−ラクタム含有プロドラッグ、必要に応じて置換されたフェノキシアセトアミド含有プロドラッグ、または必要に応じて置換されたフェニルアセトアミド含有プロドラッグ、５−フルオロシトシンプロドラッグおよびより活性な細胞毒性遊離薬物に転換され得る他の５−フルオロウリジンプロドラッグが挙げられるが、これらに限定されない。本発明における使用のためのプロドラッグ形態に誘導体化され得る、細胞毒性薬物のさらなる例は、上記化学療法剤を含む。
細胞毒素のうちでも、抗体がまた、生物毒素（ｂｉｏｔｏｘｉｎ）（例えば、リシンサブユニットＡ、アブリン、ジフテリア毒素、ボツリヌス菌、シアンギノシン（ｃｙａｎｇｉｎｏｓｉｎ）、サキシトキシン、シガトキシン（ｓｈｉｇａｔｏｘｉｎ）、破傷風、テトロドトキシン、トリコテセン（ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｅｎｅ）、ベルコロゲン（ｖｅｒｒｕｃｏｌｏｇｅｎ）または毒性酵素）と会合し得る。好ましくは、このような構築物は、抗体−毒素構築物の直接の発現を可能にする、遺伝子工学技術を使用して作製される。本発明の改変された抗体と会合し得る、他の生物的反応修飾物質としては、サイトカイン（例えば、リンホカインおよびインターフェロン）が挙げられる。本開示の観点において、当業者は、従来の技術を使用して、このような構築物を容易に形成し得ることが提唱される。
開示される抗体との結合体化において使用され得る、別のクラスの適合性の細胞毒素は、腫瘍細胞または免疫反応性細胞に効果的に指向し得る、放射線感受性薬物である。このような薬物は、電離放射線に対する感受性を増強させ、これによって、放射線療法の効力を増加させる。腫瘍細胞によって内在化された抗体結合体は、放射線増感剤を、核のより近くに送達し、ここで、放射線増感が最大になる。未結合の放射線増感剤に結合した改変された抗体は、血液から迅速に除去され，残りの放射線増感剤が、標的腫瘍中に局在し、そして正常組織中の最小の取り込みを提供する。血液からの迅速な除去の後に、補助的な放射線療法が、以下の３つの様式のうちの１つで施される：１）腫瘍に特に指向される、外部ビーム放射、２）腫瘍に直接移植された放射能、または３）同じ標的化抗体を用いる全身放射線免疫療法。このアプローチの潜在的に魅力的なバリエーションは、治療放射性同位元素の、放射線感受性免疫結合体への結合であり、これによって、患者に単一の薬物を投与するという好都合を提供する。
開示された機能的抗体が、結合体化形態で使用されるか非結合体化形態で使用されるかにかかわらず、本発明の主要な利点は、これらの抗体構築物を、骨髄抑制された（ｍｙｅｌｏｓｕｐｐｒｅｓｓｅｄ）患者（特に、放射線療法または化学療法のような補助的な治療を受けているか、または受けたことがある患者）において使用する能力である。すなわち、二量体抗体の有利な送達プロフィール（すなわち、比較的短い血清滞留時間、高い結合親和性および増強された局在）は、これらの抗体を、赤色骨髄の貯蔵が減少しており、そして骨髄毒性に感受性である患者を処置するために、特に有用にする。この点に関して、機能的抗体の独特の送達プロフィールは、これらの抗体を、放射線標識された結合体の、骨髄抑制された癌患者への投与のために非常に効果的にする。従って、改変された抗体は、以前に補助的な治療（例えば、外部ビーム照射または化学療法）を受けたことのある患者において、結合体化形態または非結合体化形態で有用である。
本発明に従って産生される機能的抗体は、腫瘍特異的抗原または腫瘍関連抗原、特定の細胞型（例えば、Ｔ細胞またはＢ細胞）において発現される抗原、ウイルス抗原、細菌抗原、あるいは寄生虫に結合し得る。適切な抗体としては、ＴＡＧ−７２、ＣＤ４、ＣＤ１１、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ３７、ＣＤ４０、ＣＤ４５、ＣＤ８０、ＣＤ８６およびＣＤ１５４が挙げられる。本発明の好ましい実施形態において、この抗体は、Ｔ細胞またはＢ細胞によって発現される抗原（例えば、ＣＤ４、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ４０、ＣＤ８０、およびＣＤ１５４）に結合する。別の好ましい実施形態において、この抗体は、癌抗原（例えば、ＣＥＡ、前立腺特異抗原、ＨＥＲ−２（ｅｒｂＢ２）、腫瘍接着分子など）に指向される。選り抜きの抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体であり得る。特に、この抗体は、ＣＤ２０またはＴＡＧ−７２に特異的なヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体であり得る。ＣＤ２０は、Ｂ細胞によって発現される抗原であり、これは、Ｂ細胞障害（例えば、Ｂ細胞リンパ腫および白血病）の処置のために標的化されている。Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標）は、非ホジキンリンパ腫の処置のために、ＦＤＡによって認可された、キメラ抗ＣＤ２０抗体である。
Ｔａｇ−７２は、多数のヒト癌（消化器の癌（胃癌、結腸直腸癌、膵臓癌）および生殖器官に関連する癌（前立腺癌、卵巣癌、乳癌）ならびに他の癌（例えば、頭部および頸部の癌、ならびにリンパ節転移が挙げられる）が挙げられる）によって過剰発現されることが公知の抗原である（例えば、Ｇａｌｉｅｔｔａら、Ｏｎｃｏｌ．Ｒｅｐ．９（１）：１３５−４０（２００２）；Ｍｅｒｅｄｉｔｈら、Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｔｈｅｒ．Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ １６（４）：３０３−１５（２００１）；Ｋａｒａｎら、Ｏｎｃｏｌ．Ｒｅｐ．８（５）：１１２３−２６（２００１）；Ａｌｌｅｎｄｅら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍａｒｋｅｒ １５（２）：１９９７−９９（２０００）およびＡｌｔｉｍｉｓｓｉら、ＨＮＯ ３８＊１０）：３６４−６６（１９９８）を参照のこと。全て、その全体が参考として援用される）。抗ＴＡＧ−７２抗体は、このような癌を処置する際に、治療効力を有すると報告されている。
抗体の軽鎖および重鎖をコードするＤＮＡ配列は、インタクトかまたは改変された、可変領域および定常領域を含み得る。この定常領域は、好ましくは、ヒトである。この可変領域は、霊長類起源であり得るか、またはげっ歯類起源であり得、そしてヒト化され得る。霊長類可変領域は、ヒト起源であり得る。げっ歯類可変領域は、例えば、ラットまたはマウス起源であり得る。記載されるように、定常領域が欠失したドメインは、本発明の範囲内である。
特定の癌の型によって特徴的に過剰発現される抗原は、当該分野において周知である。好ましい実施形態は、ＣＤ２２またはＣＤ２０を認識する抗体の発現を包含する。最も好ましい実施形態において、この抗体は、ＣＤ２２を特異的に結合する。なおより好ましくは、この抗体は、例えば、米国特許第５，７３６，１３７号；同第５，７７６，４５６号；および同第５，８４３，４３９号に議論されるように、抗体リツキシマブ（ＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標）、ＩＤＥＣ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）の重鎖および軽鎖を含む。本発明において使用するために適切な抗体の例は、Ｈａｎｎａらに対する米国特許第６，１３６，３１０号（ＣＤ４）；Ｒｅｆｆに対する米国特許第６，０１１，１３８号（ＣＤ２３）；Ａｎｄｅｒｓｏｎに対する米国特許第６，１１３，８９８号（ＣＤ８０）；およびＢｌａｃｋに対する米国特許第６，００１，３５８号（ＣＤ５４）に開示されている。これらの特許の全内容は、本明細書中に参考として援用される。
本発明は、抗体を利用して説明されてきたが、本発明は、それらの哺乳動物細胞宿主の生存度を損なわない、任意の多鎖タンパク質を発現するために適切である。第一のシストロンおよび引き続くシストロンの遺伝子産物の比は、第一のシストロンに続くサブユニットの数の増加によって、変動し得る。従って、例えば、２つ以上のシストロン（各々が、同じ所望の遺伝子産物をコードする）が、所望の遺伝子によって産生されるペプチドの絶対量を増加させるために、ポリシストロン発現ベクターに組み込まれ得る。しかし、第一のシストロンに引き続く各シストロンは、望ましい場合、異なる産物をコードし得る。
本発明は、以下の非限定的な実施例によって、さらに説明される。
（実施例１）
ポリシストロンＤＮＡ発現ベクターを、本発明に従って構築した。これは、ヒト化抗ＴＡＧ７２抗体の重鎖および軽鎖を発現し、ＨｕＣＣ４９と命名される。
（Ａ．発現ベクターの構築）
図１に示される発現構築物は、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子をコードする配列の発現を駆動するように構築物中に配置された、マウスβ−グロブリン主要プロモーター（β）を含む。ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（これは、細菌起源である）は、２つのエキソン（Ｎ１およびＮ２）からなり、そして人工イントロンを含む。発現ベクター系における遺伝子産物発現を増強するように設計された選択マーカーの、イントロン挿入の方法は、例えば、米国特許第５，６４８，２６７号、米国特許第５，７３３，７７９号、米国特許第６，０１７，７３３号、および米国特許第６，１５９，７３０号（全て、Ｒｅｆｆに対する）に開示されている。これらの特許の各々の全内容は、本明細書中に参考として援用される。選択される抗体は、固体腫瘍を処置するための適切性により当該分野において公知である。高レベルの組織浸入が、固体腫瘍細胞に影響を与えるために必要とされ、従って、この抗体は、Ｆａｂフラグメントを用いて見られるより比較的長い、血清半減期を有するべきである。この実施例において使用される、ドメインが欠失された構築物は、ヒトγ１重鎖定常ドメインを含み、ここで、ヒンジ領域に続くＣＨ２の最初の９個のアミノ酸を除く、ＣＨ２ドメインの大部分が欠失されている。
図１に示されるように、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ発現カセットの第一のエキソン（Ｎ１）に続いて、かつネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子のイントロンの内部に、シミアンウイルスＳＶ４０複製起点（ＳＶＯ）が位置し、これは、一過性トランスフェクションの後に、ＣＯＳ細胞における発現構築物（ベクター）の複製を容易にする。その後、目的の遺伝子配列についての発現カセットが位置し、これは、この場合、免疫グロブリンコード領域である。このカセットの最初のものは、ヒトサイトメガロウイルスプロモーター（ＣＭＶ）であり、これは、ポリシストロン免疫グロブリン（Ｉｇ）メッセージの発現を駆動する。この構築物におけるＩｇメッセージは、ヒト化抗ＴＡＧ−７２抗体（ＨｕＣＣ４９と命名される）をコードし、これは、引き続いて、（提示される順で）以下から構成される：軽鎖リーダー（Ｌ）／ＨｕＣＣ４９軽鎖可変（ＶＬ）／ヒトκ定常（κ）／脳心筋炎ウイルス由来のＩＲＥＳ（ＩＲＥＳ）／合成重鎖リーダー（Ｌ）／ＨｕＣＣ４９重鎖可変（ＶＨ）／ヒトγ１ ＣＨ２ドメイン欠失定常領域（ＣＨ２結合Ｇ１ ＤｅｌＣＨ２）。Ｉｇメッセージに続いて、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル（ＢＧＨ）がある。その後、ジヒドロ葉酸レダクターゼコード領域についての発現カセットが位置し、ここで、マウスβ−グロビン主要プロモーター（β）が、マウスジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子（ＤＨＦＲ）の発現を駆動する。ＤＨＦＲ配列に続いて、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル（ＢＧＨ）がある。
ネオマイシンイントロンに続いて、ネオマイシン発現カセットの第二のエキソン（Ｎ２）があり、次に、これに続いて、ＳＶ４０初期ポリアデニル化シグナル（ＳＶ）が存在する。
このベクターはまた、細菌中での複製のために必要とされる配列（ｃｏｌＥ１複製起点およびアンピシリン耐性（Ａｍｐ）を与えるためのβ−ラクタマーゼ遺伝子が挙げられる）を含む。
ＥＭＣＶは、市販されており、そしてＡＴＣＣから入手可能であった（ＶＲ−１２９Ｂ脳心筋炎株：ＥＭＣ（ＴＣ適合））。ウイルス粒子を破壊し、そして一本鎖ウイルスＲＮＡを単離するための当該分野において公知の方法に供した。ウイルスゲノム内のＩＲＥＳ領域に対して特異的なｃＤＮＡを産生した。このＤＮＡを増幅するため、ならびに軽鎖および重鎖のＩｇコードドメインの間への挿入に適切な５’末端および３’末端を付加するために、このｃＤＮＡのＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）増幅を実施した。ＩＲＥＳの直前の軽鎖の後に、ポリアデニル化シグナルを配置しなかった。位置８３４〜８３６のＡＴＧ三ヌクレオチド（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＣ−００１４７９）を、合成重鎖リーダー配列のための開始コドンとして使用した。
文献は、ＩＲＥＳの下流のオープンリーディングフレームの翻訳が、上流のオープンリーディングフレーム（翻訳が５’ＣＡＰによって開始する）より効率が低いことを示すので、ＩＲＥＳおよび重鎖配列がベクター中で重複され得るように、制限部位を導入した。Ｍｕｎ ＩおよびＢｇｌ ＩＩ部位を、ＢａｍＨ Ｉ部位の下流に導入した。ＥｃｏＲ ＩおよびＢａｍＨ Ｉでの消化に続いて、ＩＲＥＳおよび重鎖遺伝子配列を含むフラグメントは、Ｍｕｎ Ｉ部位およびＢｇｌ ＩＩ部位に容易に挿入され得た。得られた構築物は、以下を含む：ＣＭＶ−軽鎖−ＩＲＥＳ−重鎖−ＩＲＥＳ−重鎖。第二の重鎖の付加は、内部リボソーム進入に付随する任意の非効率を補償するために行った。
（Ｂ．ＣＨＯ細胞発現）
ＳＶ４０エンハンサーを利用して１つの重鎖を発現する発現ベクターを含むプラスミドを、一過性トランスフェクションプロトコルと、高い発現能力を有する安定なトランスフェクトされた細胞株を得るために設計されたプロトコルとの両方を使用して、ＣＨＯ細胞にトランスフェクトした。これらのトランスフェクションを、独立した軽鎖および重鎖のカセット（ＣＭＶ−Ｌｉｇｈｔ−ＢＧＨ）（ＣＭＶ−Ｈｅａｖｙ−ＢＧＨ）を含む従来の発現構築物と並行して実施した。実験結果は、起こった発現レベルに明らかな差異がないことを示し、このことは、非効率なＩＲＥＳ機能の結果としての重鎖翻訳の減少が検出されなかったことを意味する。従って、本発明のポリシストン構築物の実施形態は、第一のシストロンおよび引き続くシストロンに含まれる、他の目的の遺伝子配列を、同様に、満足な量で発現すると予測される。実験は、本明細書中以下に議論されるように、これらの構築物が、二シストロン構築物における下流重鎖遺伝子を、従来の非ポリシストン発現系を使用して得られるレベルと等価なレベルで発現することを示す。
（実施例２）
（Ａ．Ｇ４１８耐性細胞株の生成）
この実施例における、ポリシストロン発現構築物は、ヒトＴＡＧ ７２タンパク質に対する特異性を有する、改変されたヒト化抗体をコードする。この抗体は、ヒト化マウス可変ドメイン（軽鎖と重鎖との両方）ヒトκ軽鎖定常ドメイン、およびヒトγ１重鎖定常領域から構成され、ＣＨ２ドメインが特異的に欠失している。この発現構築物は、「ＨｕＣＣ４９ ＣＨ２ Ｌｉｎｋｅｒ ｉｎ Ｎ５ＫＩＲＥＳＧ１ＤｅｌＣＨ２」と称され、これのマップは、図３に示されており、そしてそれの配列は、図６に示されている。ＨｕＣＣ４９ ＣＨ２ Ｌｉｎｋｅｒ ｉｎ Ｎ５ＫＩＲＥＳＧ１ＤｅｌＣＨ２を、ＣＨＯ−ＤＧ４４親細胞株にトランスフェクトした。トランスフェクトを、９６ウェルプレートあたり４×１０６個のＣＨＯ細胞あたり０．５μｇ、１．０μｇ、２．０μｇ、または４．０μｇの線状化ＤＮＡを使用して実施した。安定にトランスフェクトされる細胞の優勢な選択を、ネオマイシン耐性マーカーをコードする発現構築物およびＧ４１８を含有する培地（ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭ ＩＩ ＋ ＨＴ）を介して達成した。
生存可能なウェルを同定し、小規模（１２０ｍｌ）スピナー培養に拡張し、そして細胞産生性を、ＥＬＩＳＡアッセイによって評価した。種々のＧ４１８耐性細胞単離物を得、容易に検出可能な分泌された抗体を生成した。特に、２２Ｂ６，２２Ｅ６，２２Ｈ１０および２５Ａ２の４つは、３〜４日間で３〜１０ｍｇ／Ｌ、または１〜５ｐｇ／細胞／日（ｐｃｄ）を産生することが決定された。図４および５に示されるように、サザンブロット分析を実施し、そしてこれら４つの細胞株の各々が、各細胞株における単一部位において一体化された、発現構築物を保有することが観察された。「Ｍ」と表示されたレーンは、サイズマーカーを含んだ。チャイニーズハムスター卵巣細胞核酸は、陰性コントロールとして働き、そして「ＣＨＯ」と表示されるレーンにおいて泳動した。サンプル１４Ｈ９ＣＤは、ＮＥＯＳＰＬＡ構築物であった。
（Ｂ．軽鎖対重鎖の比を確認するＥＬＩＳＡアッセイ）
これらの細胞株の生成と並行して、同じ抗体のＮＥＯＳＰＬＡ発現構築物を構築し、そしてトランスフェクトした。ＨｕＣＣ４９ ＣＨ２ Ｌｉｎｋｅｒ ｉｎ Ｎ５ＫＧ１ＤｅｌＣＨ２（図３に示される）は、免疫グロブリンの軽鎖遺伝子および重鎖遺伝子を、独立した転写カセット上にコードし、各々の翻訳は、５’ＣＡＰ翻訳開始複合体によって媒介される。この発現構築物のトランスフェクションによって単離した、特定のＧ４１８耐性細胞株を、１４Ｈ９と命名した。１４Ｈ９由来の培養上清およびポリシストンの単離された２２Ｂ６の分析を実施して、分泌された軽鎖と重鎖との相対比を試験した。分析を、軽鎖または重鎖のいずれかに特異的な二次抗体で捕捉および検出することにより、ＥＬＩＳＡによって実施した。二連サンプルの結果を、表１に示す。データは、免疫グロブリン標準と比較した、ｍｇ／Ｌとして表されている。比の欄において、測定された全軽鎖（κκ）を、測定された全構築抗体（γκ）と比較する。
細胞株１４Ｈ９は、高い遺伝子コピー数の結果として、異常に高く産生するＧ４１８細胞株である。本明細書中で興味深いものは、遊離免疫グロブリンまたは構築された免疫グロブリンの、軽鎖と重鎖とのほぼ等しい相対比である。このデータは、驚くべきことに、ＩＲＥＳ後に配置された、ポリシストロン発現系における免疫グロブリン重鎖の発現が、ＮＥＯＳＰＬＡ系と比較した場合に、有意には低下されないことを実証する。κκ／γκの比の観測結果は、予測されたより大きく、そして遊離軽鎖の許容細胞分泌の結果であるようである。従って、このポリシストロン発現系において、ＩＲＥＳにより駆動される重鎖タンパク質産生は、非常に効率的であるようである。
（Ｃ．軽鎖と重鎖との発現された比を比較するさらなるＥＬＩＳＡアッセイ）
ＮＥＯＳＰＬＡまたはポリシストロン発現系のいずれかによって産生された、種々の細胞株由来の培養上清の分析を、後に行って、分泌された軽鎖および重鎖の相対比を試験した。この分析を、軽鎖または重鎖のいずれかに特異的な二次抗体で捕捉および検出することにより、ＥＬＩＳＡによって実施した。二連のサンプルの結果が、本明細書中に示され、そして免疫グロブリン標準と比較したｍｇ／Ｌとして表される。
ＥＬＩＳＡを、「捕捉」抗体を有する９６ウェルマイクロタイタープレートによるコーティング、続いて、細胞培養物上清の結合、その後のＨＲＰＯ（西洋ワサビペルオキシダーゼ）に結合体化された二次抗体の結合を介する「検出」、続く比色（ｃｏｌｏｒｏｍｅｔｒｉｃ）定量により実施する。
κκは、ヤギ抗ヒトκによる捕捉：ヤギ抗ヒトκ−ＨＲＰＯによる検出を示す
γγは、ヤギ抗ヒトＩｇＧによる捕捉：ヤギ抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰＯによる検出を示す
γκは、ヤギ抗ヒトＩｇＧによる捕捉：ヤギ抗ヒトκ−ＨＲＰＯによる検出を示す
γγは、ヤギ抗ヒトκによる捕捉：ヤギ抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰＯによる検出を示す
このデータはさらに、驚くべきことに、ＩＲＥＳ後に配置された、ポリシストロニック発現系内での免疫グロブリン重鎖の発現は、ＮＥＯＳＰＬＡ系と比較して有意に減少しないことを実証する。κκ／γγ比が、１より大きいという観測値は、遊離の軽鎖の許容性の細胞分泌の結果である可能性がある。それゆえに、このポリシストロニック発現系において、ＩＲＥＳ駆動の重鎖タンパク質産生は、非常に効率的であるようである。
（実施例３）
（Ａ．ゲノム増幅を介する発現の増加）
ＮＥＯＳＰＬＡ発現系およびポリシストロニック発現系の両方は、マウスＤＨＦＲ遺伝子をコードする発現カセットを含む。発現に使用される親ＣＨＯ−ＤＧ４４細胞株は、ＤＨＦＲ酵素活性を完全に欠損しているので（二重欠失）、統合された標的遺伝子（マウスＤＨＦＲ）の増幅は、メトトレキサート（ＭＴＸ）を含む培地における増殖選択により可能である。この増幅の間、直接連結された免疫グロブリン遺伝子は、同時に増幅される。従って、上昇した量の免疫グロブリンを産生する細胞株を単離することが可能である。Ｇ４１８耐性細胞株の本発明者らの第１回目の選択を、５ｎＭのＭＴＸ中で実施する。最も高いレベルの産生体（ＥＬＩＳＡによって決定されるように）を同定し、次いで、漸増の濃度のＭＴＸ（５０ｎＭ、次いで、５００ｎＭ）での２つの引き続く回の増幅に供する。
ＭＴＸにおける３回の連続した回の増幅後、５００ｎＭの耐性細胞株を同定し得る。Ｇ４１８耐性細胞株２５Ａ２由来のポリシストロニック細胞系統について、種々の単離物についての各工程における発現レベルを、以下に列挙する。比較目的のために、ＮＥＯＳＰＬＡ発現系を使用して発現される関連のない抗体（抗ＣＤ２３）についての発現レベルを、その下に列挙する。この抗体は、Ｐｒｉｍａｔｉｚｅｄ（登録商標）抗体であり、この抗体は、霊長類由来の軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメイン、ヒトκ軽鎖定常領域および完全ヒトγ１重鎖（ＣＨ２ドメインを含む）領域を保有する。
制御されたバイオリアクター中で増殖するポリシストロニック系およびＮＥＯＳＰＬＡ系の産生レベルの比較もまた、含まれる。バイオリアクター中で実行される複製を、各系（ポリシストロニックおよびＮＥＯＳＰＬＡ）について表す。
上記表３から見られ得るように、選択の各段階での発現レベル（Ｇ４１８、５ｎＭ、５０ｎＭまたは５００ｎＭ ＭＴＸ）は、ポリシストロニック発現系とＮＥＯＳＰＬＡ発現系との間で匹敵する。また、制御されたバイオリアクター増殖条件からの産生レベルは、匹敵するようである。従って、この系において、免疫グロブリン重鎖を軽鎖の下流のＥＭＣＶ ＩＲＥＳの翻訳制御下に置くことは、効率的な免疫グロブリン産生をもたらす。
（実施例４）
（発現構築物の生成のための方法）
本発明に従うポリシストロニック発現構築物の生成についての一般的方法を、本明細書に記載する。この方法論において、最終発現構築物を、単一のクローニング工程における目的の遺伝子（すなわち、免疫部グロブリン軽鎖および重鎖）をコードするＤＮＡフラグメントの挿入により生成する。ＤＮＡフラグメントは、従来の組換えＤＮＡ技術（オリゴ合成および連結、オーバーラップＰＣＲ、完全ＤＮＡ合成、または以前に記載されたようなこれらの方法論の任意の組み合わせ）の使用によって生成され得る。
図７は、哺乳動物細胞における免疫グロブリン（例えば、ＨｕＣＣ４９）の発現に適するベクターを生成するのに利用される工程を要約した概略を含む。この方法論は、オーバーラップＰＣＲを使用して、軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインの両方をコードするＤＮＡフラグメントを生成することを実証する。次いで、このフラグメントを、所望のベクターＤＮＡの単一挿入部位に単一の工程でクローニングし、最終免疫グロブリン発現構築物を生成する。しかし、このことは好ましいが、他の方法もまた、使用され、例えば、それぞれの重鎖遺伝子および軽鎖遺伝子は、交互に、ベクター構築物における異なる挿入部位に挿入され得る。また、ポリシストロニック構築物中の軽鎖遺伝子および重鎖遺伝子の数は、変化し得る。
論じられたように、免疫グロブリン軽鎖可変ドメインは、適切な供給源（すなわち、ハイブリドーマ、Ｂ細胞、プラスミドクローン）から単離またはクローニングされ、そして、軽鎖リーダー（これは、状況に依存して、保持されても、保持されなくてもよい）、軽鎖定常ドメイン、ＩＲＥＳ配列、および重鎖リーダー配列を含む適切なベクター（例えば、ＰＣＥＭＰＴＹ Ａ４）中にクローニングされる。また、重鎖可変ドメインが単離され、そして同じ空のベクター（これは、軽鎖可変ドメインを含まない）中にクローニングされる。別々のベクターに含まれる軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインを初期に有することは、望ましい。なぜなら、それにより、他の可変領域に潜在的に影響を及ぼすことなく、１つの遺伝子の可変領域に対する続くヌクレオチド改変が可能になるからである。
軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインを含む２つの別個のベクターは、独立した同種のＰＣＲ増幅反応についてのＤＮＡテンプレートとして機能する。５’ＰＣＲプライマーおよび３’ＰＣＲプライマーの設計は、２つの生じるＰＣＲ産物の間に共通するヌクレオチド配列が存在するような設計である。次いで、この共通配列は、続くＰＣＲ増幅工程についての重複領域を可能にする。次いで、この最終ＰＣＲ増幅工程の産物は、軽鎖リーダー／軽鎖可変ドメイン／定常ドメイン／ＩＲＥＳドメイン／合成重鎖リーダードメイン／重鎖可変ドメインまたはそれらのフラグメント（例えば、ドメイン欠失フラグメント）をコードする。図７は、ＩＲＥＳによって分離される軽鎖および重鎖を含む単一のＤＮＡ配列が、ベクター上の単一の制限部位に挿入される１つの例を示す。
上記５’ＰＣＲプライマーおよび３’ＰＣＲプライマーの賢明な設計によって、隣接制限エンドヌクレアーゼ切断部位（例えば、Ｎｈｅ Ｉ）が、含まれる。これらのＮｈｅ Ｉまたは他の制限部位は、次いで、哺乳動物細胞における免疫グロブリンの効率的な発現についての全ての他のエレメントを含む適切なベクター（例えば、ＰＣＥＭＰＴＹ Ｂ）中にＤＮＡフラグメントをクローニングすることを可能にする。次いで、この最終ベクター（例えば、Ｐｏｌｙｃｉｓ２中のＨｕＣＣ４９ Ｇｌｙ／Ｓｅｒ）を、所望の細胞にトランスフェクトして、目的の遺伝子産物（例えば、免疫グロブリン）を生成する。
（実施例５）
（ゲノム増幅を介する発現の増加）
Ｎ５ＫＩＲＥＳＧ１ＤｅｌＣＨ２中のＨｕＣＣ４９はまた、マウスＤＨＦＲ遺伝子をコードする発現カセットを含む。親ＣＨＯ−ＤＧ４４細胞株は、ＤＨＦＲ酵素活性を完全に欠損しているので（二重欠失）、統合された標的遺伝子（マウスＤＨＦＲ）の増幅は、メトトレキサート（ＭＴＸ）を含む培地における増殖選択により可能である。この増幅の間、直接連結されたＨｕＣＣ４９免疫グロブリン遺伝子は、同時に増幅される。従って、上昇した量の免疫グロブリンを産生する細胞株を単離することが可能である。Ｇ４１８耐性細胞株の第１回目の選択を、５ｎＭのＭＴＸ中で実施した。最も高いレベルの産生体（ＥＬＩＳＡによって決定されるように）を同定し、次いで、漸増の濃度のＭＴＸ（５０ｎＭ、次いで、５００ｎＭ）での２つの引き続く回の増幅に供した。
ＭＴＸにおける３回の連続した回の増幅後、３つの５００ｎＭの耐性細胞株を同定した。Ｇ４１８耐性細胞株２５Ａ２由来の細胞系統について、各工程における発現レベルを、表４に列挙する。比較目的のために、表５は、ＮＥＯＳＰＬＡ発現系を使用して発現される関連のない抗体（抗ＣＤ２３）についての発現レベル示す。この抗体は、Ｐｒｉｍａｔｉｚｅｄ（登録商標）抗体であり、この抗体は、霊長類由来の軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメイン、ヒトκ軽鎖定常領域ならびに完全ヒトγ１重鎖（ＣＨ２ドメインを含む）領域を保有する。
上記表４および５において見られ得るように、選択の各段階での発現レベル（Ｇ４１８、５ｎＭ、５０ｎＭまたは５００ｎＭ ＭＴＸ）は、ポリシストロニック発現系とＮＥＯＳＰＬＡ発現系との間で匹敵する。従って、この系において、免疫グロブリン重鎖を軽鎖の下流のＥＭＣＶ ＩＲＥＳの翻訳制御下に置くことは、効率的な免疫グロブリン産生をもたらす。
本発明は、特定の実施形態およびその実施例と関連して記載されているが、開示される発明は、さらなる明らかな改変が可能であることが、当業者に理解される。この開示は、当該分野で公知の実施または慣習的な実施内に入る好ましい実施形態からの、このような明らかな離脱を包含することを意図され、そして本明細書で上記に示された必須の特徴ならびに添付の特許請求の範囲に適用され得る。
本発明は、本明細書中で議論される図においてさらに例示される。
図１は、ヒト化抗ＴＡＧ７２抗体であるＨｕＣＣ４９をコードする多シストロン性発現構築物の概略図を示す。 図２は、ＮＥＯＳＰＬＡベクターおよび軽鎖配列と重鎖配列との間のＩＲＥＳの位置の概略図を示す。 図３は、免疫グロブリン軽鎖遺伝子配列および免疫グロブリン重鎖遺伝子配列が、独立した転写カセットに位置するＮＥＯＳＰＬＡベクターの概略図を示す。 図４は、ＨｕＣＣ４９重鎖でプローブした、多シストロン性ＨｕＣＣ４９ Ｇ４１８耐性細胞単離体２２Ｅ６および２２Ｂ６のサザンブロットである。 図５は、ＨｕＣＣ４９重鎖でプローブした、多シストロン性ＨｕＣＣ４９ Ｇ４１８耐性細胞単離体２５Ａ２および２２Ｈ１０のサザンブロットである。 図６は、ＴＡＧ７２を結合するヒト化抗体である発現構築物ＨｕＣＣ４９の配列を示す。 図６は、ＴＡＧ７２を結合するヒト化抗体である発現構築物ＨｕＣＣ４９の配列を示す。 図６は、ＴＡＧ７２を結合するヒト化抗体である発現構築物ＨｕＣＣ４９の配列を示す。 図６は、ＴＡＧ７２を結合するヒト化抗体である発現構築物ＨｕＣＣ４９の配列を示す。 図６は、ＴＡＧ７２を結合するヒト化抗体である発現構築物ＨｕＣＣ４９の配列を示す。 図６は、ＴＡＧ７２を結合するヒト化抗体である発現構築物ＨｕＣＣ４９の配列を示す。 図６は、ＴＡＧ７２を結合するヒト化抗体である発現構築物ＨｕＣＣ４９の配列を示す。 図６は、ＴＡＧ７２を結合するヒト化抗体である発現構築物ＨｕＣＣ４９の配列を示す。 図６は、ＴＡＧ７２を結合するヒト化抗体である発現構築物ＨｕＣＣ４９の配列を示す。 図６は、ＴＡＧ７２を結合するヒト化抗体である発現構築物ＨｕＣＣ４９の配列を示す。 図６は、ＴＡＧ７２を結合するヒト化抗体である発現構築物ＨｕＣＣ４９の配列を示す。 図６は、ＴＡＧ７２を結合するヒト化抗体である発現構築物ＨｕＣＣ４９の配列を示す。 図６は、ＴＡＧ７２を結合するヒト化抗体である発現構築物ＨｕＣＣ４９の配列を示す。 図６は、ＴＡＧ７２を結合するヒト化抗体である発現構築物ＨｕＣＣ４９の配列を示す。 図６は、ＴＡＧ７２を結合するヒト化抗体である発現構築物ＨｕＣＣ４９の配列を示す。 図６は、ＴＡＧ７２を結合するヒト化抗体である発現構築物ＨｕＣＣ４９の配列を示す。 図７は、本発明に従う多シストロン性発現構築物の構築を概略的に示す。「Ｌ」は、リーダー配列を示し、ＶＬは抗体可変軽鎖をコードするＤＮＡを示し、そしてＶＨは抗体可変重鎖をコードするＤＮＡを示す。 図７は、本発明に従う多シストロン性発現構築物の構築を概略的に示す。「Ｌ」は、リーダー配列を示し、ＶＬは抗体可変軽鎖をコードするＤＮＡを示し、そしてＶＨは抗体可変重鎖をコードするＤＮＡを示す。 図７は、本発明に従う多シストロン性発現構築物の構築を概略的に示す。「Ｌ」は、リーダー配列を示し、ＶＬは抗体可変軽鎖をコードするＤＮＡを示し、そしてＶＨは抗体可変重鎖をコードするＤＮＡを示す。 図８は、本発明に従う多シストロン性ベクターを構築するために使用されるプラスミドＰＣＥＭＰＴＹ Ａ４を示す。 図９は、ＰＣＥＭＰＴＹ Ａ４プラスミドの核酸配列を含む。 図９は、ＰＣＥＭＰＴＹ Ａ４プラスミドの核酸配列を含む。 図９は、ＰＣＥＭＰＴＹ Ａ４プラスミドの核酸配列を含む。 図９は、ＰＣＥＭＰＴＹ Ａ４プラスミドの核酸配列を含む。 図９は、ＰＣＥＭＰＴＹ Ａ４プラスミドの核酸配列を含む。 図９は、ＰＣＥＭＰＴＹ Ａ４プラスミドの核酸配列を含む。 図９は、ＰＣＥＭＰＴＹ Ａ４プラスミドの核酸配列を含む。 図９は、ＰＣＥＭＰＴＹ Ａ４プラスミドの核酸配列を含む。 図９は、ＰＣＥＭＰＴＹ Ａ４プラスミドの核酸配列を含む。 図１０は、本発明に従う多シストロン性ベクターを構築するために使用されるプラスミドＰＣＥＭＰＴＹ Ｂを示す。 図１１は、ＰＣＥＭＰＴＹ Ｂプラスミドの核酸配列を含む。 図１１は、ＰＣＥＭＰＴＹ Ｂプラスミドの核酸配列を含む。 図１１は、ＰＣＥＭＰＴＹ Ｂプラスミドの核酸配列を含む。 図１１は、ＰＣＥＭＰＴＹ Ｂプラスミドの核酸配列を含む。 図１１は、ＰＣＥＭＰＴＹ Ｂプラスミドの核酸配列を含む。 図１１は、ＰＣＥＭＰＴＹ Ｂプラスミドの核酸配列を含む。 図１１は、ＰＣＥＭＰＴＹ Ｂプラスミドの核酸配列を含む。 図１１は、ＰＣＥＭＰＴＹ Ｂプラスミドの核酸配列を含む。 図１１は、ＰＣＥＭＰＴＹ Ｂプラスミドの核酸配列を含む。 図１１は、ＰＣＥＭＰＴＹ Ｂプラスミドの核酸配列を含む。 図１１は、ＰＣＥＭＰＴＹ Ｂプラスミドの核酸配列を含む。 図１１は、ＰＣＥＭＰＴＹ Ｂプラスミドの核酸配列を含む。 図１１は、ＰＣＥＭＰＴＹ Ｂプラスミドの核酸配列を含む。 図１１は、ＰＣＥＭＰＴＹ Ｂプラスミドの核酸配列を含む。 図１１は、ＰＣＥＭＰＴＹ Ｂプラスミドの核酸配列を含む。 図１１は、ＰＣＥＭＰＴＹ Ｂプラスミドの核酸配列を含む。 図１１は、ＰＣＥＭＰＴＹ Ｂプラスミドの核酸配列を含む。 図１２は、本発明に従う多シストロン性ベクターである、ＨｕＣＣ４９ Ｇｌｙ／Ｓｅｒを発現するＰｏｌｙｃｉｓ２を示す。 図１３は、Ｐｌｙｃｉｓ２ベクターに含まれるＨｕＣＣ４９ Ｇｌｙ／Ｓｅｒの核酸配列を含む。 図１３は、Ｐｌｙｃｉｓ２ベクターに含まれるＨｕＣＣ４９ Ｇｌｙ／Ｓｅｒの核酸配列を含む。 図１３は、Ｐｌｙｃｉｓ２ベクターに含まれるＨｕＣＣ４９ Ｇｌｙ／Ｓｅｒの核酸配列を含む。 図１３は、Ｐｌｙｃｉｓ２ベクターに含まれるＨｕＣＣ４９ Ｇｌｙ／Ｓｅｒの核酸配列を含む。 図１３は、Ｐｌｙｃｉｓ２ベクターに含まれるＨｕＣＣ４９ Ｇｌｙ／Ｓｅｒの核酸配列を含む。 図１３は、Ｐｌｙｃｉｓ２ベクターに含まれるＨｕＣＣ４９ Ｇｌｙ／Ｓｅｒの核酸配列を含む。 図１３は、Ｐｌｙｃｉｓ２ベクターに含まれるＨｕＣＣ４９ Ｇｌｙ／Ｓｅｒの核酸配列を含む。 図１３は、Ｐｌｙｃｉｓ２ベクターに含まれるＨｕＣＣ４９ Ｇｌｙ／Ｓｅｒの核酸配列を含む。 図１３は、Ｐｌｙｃｉｓ２ベクターに含まれるＨｕＣＣ４９ Ｇｌｙ／Ｓｅｒの核酸配列を含む。 図１３は、Ｐｌｙｃｉｓ２ベクターに含まれるＨｕＣＣ４９ Ｇｌｙ／Ｓｅｒの核酸配列を含む。 図１３は、Ｐｌｙｃｉｓ２ベクターに含まれるＨｕＣＣ４９ Ｇｌｙ／Ｓｅｒの核酸配列を含む。 図１３は、Ｐｌｙｃｉｓ２ベクターに含まれるＨｕＣＣ４９ Ｇｌｙ／Ｓｅｒの核酸配列を含む。 図１３は、Ｐｌｙｃｉｓ２ベクターに含まれるＨｕＣＣ４９ Ｇｌｙ／Ｓｅｒの核酸配列を含む。 図１３は、Ｐｌｙｃｉｓ２ベクターに含まれるＨｕＣＣ４９ Ｇｌｙ／Ｓｅｒの核酸配列を含む。 図１３は、Ｐｌｙｃｉｓ２ベクターに含まれるＨｕＣＣ４９ Ｇｌｙ／Ｓｅｒの核酸配列を含む。 図１３は、Ｐｌｙｃｉｓ２ベクターに含まれるＨｕＣＣ４９ Ｇｌｙ／Ｓｅｒの核酸配列を含む。 図１３は、Ｐｌｙｃｉｓ２ベクターに含まれるＨｕＣＣ４９ Ｇｌｙ／Ｓｅｒの核酸配列を含む。 図１３は、Ｐｌｙｃｉｓ２ベクターに含まれるＨｕＣＣ４９ Ｇｌｙ／Ｓｅｒの核酸配列を含む。 図１３は、Ｐｌｙｃｉｓ２ベクターに含まれるＨｕＣＣ４９ Ｇｌｙ／Ｓｅｒの核酸配列を含む。 図１３は、Ｐｌｙｃｉｓ２ベクターに含まれるＨｕＣＣ４９ Ｇｌｙ／Ｓｅｒの核酸配列を含む。 図１３は、Ｐｌｙｃｉｓ２ベクターに含まれるＨｕＣＣ４９ Ｇｌｙ／Ｓｅｒの核酸配列を含む。

Claims (35)

  1. 真核生物宿主細胞において機能的抗体を発現するためのポリシストロニックベクターであって、該ベクターは、５’から３’の方向で作動可能に連結された以下のエレメントを含むポリシストロニック転写系を含み：
    （ｉ）真核生物細胞において作動可能なプロモーター；
    （ｉｉ）抗体軽鎖をコードする第一のＤＮＡ配列を含む第一のシストロンであって、該第一のＤＮＡ配列は、その５’末端に真核生物細胞において作動可能なシグナルペプチドコード配列を必要に応じて含み、ここで、該第一のＤＮＡ配列は、その３’末端にポリＡ配列を含まず、そして該第一のＤＮＡ配列は、５’開始コドンおよび３’末端終止コドンを含む、第一のシストロン；
    （ｉｉｉ）カーディオウイルス、ヘルペスウイルスおよびポリオウイルスからなる群より選択されるメンバーから得られた、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）；ならびに
    （ｉｖ）以下のエレメントを含む少なくとも１つの第二のシストロン：（ａ）抗体重鎖をコードする第二のＤＮＡ配列であって、該第二のＤＮＡは、その５’末端に真核生物細胞において作動可能なシグナルペプチドコード配列を必要に応じて含み、ここで、該第二のＤＮＡ配列は、該ＤＮＡ配列がポリシストロン中の最も３’側のコード配列である場合にのみ、その３’末端にポリＡ配列を含み、そしてさらに、該第二のＤＮＡ配列の５’末端および３’末端に、それぞれ、開始コドンおよび終止コドンを含む、第二のシストロン、
    ここで、該第一のＤＮＡ配列は、該ポリシストロニックベクターを含む真核生物宿主細胞において、該第二のＤＮＡ配列に対して、１０：１と１：１との間の範囲の比率で発現される、
    ポリシストロニックベクター。
  2. 前記第一のＤＮＡ配列および第二のＤＮＡ配列が、それぞれ、霊長類起源の抗体重鎖定常領域および抗体軽鎖定常領域をコードする、請求項１に記載のポリシストロニックベクター。
  3. 前記霊長類が、ヒトである、請求項２に記載のポリシストロニックベクター。
  4. 前記第一のＤＮＡ配列および第二のＤＮＡ配列が、それぞれ、霊長類起源の抗体重鎖可変領域および抗体軽鎖可変領域をコードする、請求項１に記載のポリシストロニックベクター。
  5. 前記霊長類が、ヒトである、請求項４に記載のポリシストロニックベクター。
  6. 前記重鎖可変領域および軽鎖可変領域がヒト化されている、請求項５に記載のポリシストロニックベクター。
  7. 前記第一のＤＮＡ配列および第二のＤＮＡ配列が、それぞれ、げっ歯類起源の抗体重鎖定常領域および抗体軽鎖定常領域をコードする、請求項１に記載のポリシストロニックベクター。
  8. 前記げっ歯類が、マウスである、請求項７に記載のポリシストロニックベクター。
  9. 前記第一のＤＮＡ配列および第二のＤＮＡ配列が、それぞれ、げっ歯類起源の抗体重鎖可変領域および抗体軽鎖可変領域をコードする、請求項１に記載のポリシストロニックベクター。
  10. 抗体重鎖可変領域および抗体軽鎖可変領域をコードする前記ＤＮＡ配列が、マウス起源である、請求項９に記載のポリシストロニックベクター。
  11. 前記真核生物プロモーターが、哺乳動物プロモーターまたはウイルスプロモーターである、請求項１に記載のポリシストロニックベクター。
  12. 前記プロモーターが、ＣＭＶプロモーターである、請求項１１に記載のポリシストロニックベクター。
  13. 前記ＩＲＥＳが、カーディオウイルスから得られる、請求項１に記載のポリシストロニックベクター。
  14. 前記カーディオウイルスが、ヒト脳心筋炎ウイルスである、請求項１３に記載のポリシストロニックベクター。
  15. 前記ポリシストロニックベクターによって発現される機能的抗体が、腫瘍関連抗原、Ｂ細胞上で発現される抗原またはＴ細胞上で発現される抗原に特異的に結合する、請求項１に記載のポリシストロニックベクター。
  16. 前記ポリシストロニックベクターによって発現される機能的抗体が、ＴＡＧ−７２、ＣＤ４、ＣＤ１１、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ３７、ＣＤ４０、ＣＤ４５、ＣＤ８０、ＣＤ８６およびＣＤ１５４からなる群より選択される抗原に特異的に結合する、請求項１５に記載のポリシストロニックベクター。
  17. 前記抗原が、ＴＡＧ−７２である、請求項１６に記載のポリシストロニックベクター。
  18. 前記機能的抗体が、ＴＡＧ−７２に特異的な、ヒト抗体、ヒト化抗体、霊長類化抗体またはキメラ抗体である、請求項１６に記載のポリシストロニックベクター。
  19. 前記抗体が、リツキシマブまたはイブリツモマブである、請求項１５に記載のポリシストロニックベクター。
  20. 前記抗体軽鎖をコードするＤＮＡ配列が、前記抗体重鎖に対して、３：１と１：１との間の範囲の比率で発現される、請求項１に記載のポリシストロニックベクター。
  21. 請求項１〜２０のいずれか１項に記載のポリシストロニックベクターを含む、真核生物細胞であって、該真核生物細胞は、一日当たり、約５〜１００ｐｇの機能的抗体を分泌する、真核生物細胞。
  22. 前記真核生物細胞が、哺乳動物細胞または酵母細胞である、請求項２１に記載の真核生物細胞。
  23. 前記哺乳動物細胞が、ベイビーハムスター腎臓細胞、線維芽細胞、骨髄腫細胞およびチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）からなる群より選択されるメンバーである、請求項２２に記載の哺乳動物細胞。
  24. ＣＨＯ細胞である、請求項２３に記載の哺乳動物細胞。
  25. 前記酵母細胞が、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈｏｒｉｏｍｙｃｅｓ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｙａｒｒｏｗｉａ、ＰｉｃｈｉａおよびＣａｎｄｉｄａからなる群より選択される、請求項２２に記載の酵母細胞。
  26. 前記Ｐｉｃｈｉａ株が、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓである、請求項２５に記載の酵母細胞。
  27. 機能的抗体を生成する方法であって、該方法は、細胞培養物中で請求項２１に記載の真核生物細胞を培養して、機能的抗体を生成する工程、および該真核生物細胞培養物から該機能的抗体を回収する工程、を包含する、方法。
  28. 前記培養された真核生物細胞が、一日当たり、少なくとも約１〜５ｐｇの抗体／細胞を生成する、請求項２７に記載の方法。
  29. 前記真核生物細胞が、哺乳動物細胞または酵母細胞である、請求項２８に記載の方法。
  30. 前記機能的抗体が、細胞培養培地から回収される、請求項２８に記載の方法。
  31. 前記機能的抗体が、ＴＡＧ−７２に特異的に結合する、請求項２８に記載の方法。
  32. 前記機能的抗体が、ヒト化抗ＣＨ２ドメイン欠失ＨｕＣＣ４９抗体、ヒト抗ＣＨ２ドメイン欠失ＨｕＣＣ４９抗体またはキメラ抗ＣＨ２ドメイン欠失ＨｕＣＣ４９抗体を含む、請求項３１に記載の方法。
  33. 前記キメラ抗体が、リツキシマブまたはイブリツモマブである、請求項２８に記載の方法。
  34. 前記機能的抗体の生成が、相同組換え工程をさらに包含する、請求項２７に記載の方法。
  35. 前記機能的抗体が、バッチ供給細胞培養物中で生成される、請求項２８に記載の方法。
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