JP2005533102A

JP2005533102A - 微小器官によって生物学的プロセスを誘発する方法と装置

Info

Publication number: JP2005533102A
Application number: JP2004521062A
Authority: JP
Inventors: エドゥアルド，エヌ．ミトラニ，; ドヴ，エリエゼルミトラニ，
Original assignee: イッサムリサーチディベロップメントカンパニーオブザヘブリューユニバーシティーオブエルサレム
Priority date: 2002-07-12
Filing date: 2003-07-13
Publication date: 2005-11-04
Also published as: AU2003242967A1; WO2004006831A2; AU2003242967A8; EP1534345A2; EP1534345A4; US20060127366A1; WO2004006831A3

Abstract

哺乳類の組織内に血管の新生を誘発する方法、抽出物及び医薬組成物並びに微小器官を作製し送達する装置が提供される。

Description

本発明は、哺乳類の組織内に血管の新生を誘発する方法、抽出物及び医薬組成物並びに微小器官（本明細書では微小器官の移植体とも呼ぶ）を作製し送達する装置に関する。

過去数年間に、多数の研究業績によって、細胞増殖、特に血管新生を誘発し制御する分子機構に新しい知見が提供されている。血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、アンギオポエチン（ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ）などの血管新生因子が発見されたので、研究者達は、これらの因子を、虚血組織領域の血管再生のための薬剤として使用することを検討している。遺伝子療法又は組み換えタンパク質法を利用するいくつもの異なる方法が試みられている。動物による予備試験の結果は前途有望であったが、これまで行われた臨床試験は、期待はずれの試験結果になっている（ＦｅｒｒａｒａとＡｌｉｔａｌｏ，ＮａｔｕｒｅＭｅｄｉｃｉｎｅ５（１２）巻１３５９〜１３６４頁１９９９年）。

臨床レベルで成功していないのは、これらの実験に利用される遺伝子療法又は組み換えタンパク質技術が、少なくとも一部分、原因になっている。

生体内での血管新生は、スティミュレーターとインヒビターの両者を含む因子の複雑で動的な組み合わせによって行われかつ制御されていることがわかっている（Ｉｒｕｅｌａ−ＡｒｉｓｐｅとＤｖｏｒａｋ，ＴｈｒｏｍｂｏｓｉｓａｎｄＨａｅｍｏｓｔａｓｉｓ７８（１）巻６７２〜６７７頁１９９７年；ＧａｌｅとＹａｎｃｏｐｏｌｏｕｓ，ＧｅｎｅｓａｎｄＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ１３巻１０５５〜１０６６頁１９９９年参照）。さらに、血管新生を誘発するには刺激を長時間維持することが必要であると考えられている。したがって、これらの問題に取り組まない現在の遺伝子療法及び組み換え増殖因子技術は、生体内の血管新生を促進するのに必要な状態を作ることができない。

最近、本発明の発明者らは、身体の外部で、自律的に機能する状態を長期間にわたって維持できる微小器官を製造する方法を発表した。このような微小器官、その調製、その保存といくつかの使用は、例えば米国特許第５８８８７２０号、米国特許願第０９／４２５２３３号及び国際特許願第ＰＣＴ／ＵＳ９８／００５９４号に記載されている。

本発明の一側面によって、第一哺乳類の組織に血管新生を誘発させる方法であって、第一哺乳類の組織内に少なくとも一つの微小器官を移植するステップを含んでなり、その少なくとも一つの微小器官が複数種の血管新生因子を産生して血管新生を誘発する方法が提供される。

本発明の追加の側面によって、前記少なくとも一つの微小器官が第二哺乳類の器官組織由来の器官である。

本発明の追加の側面によって、第一哺乳類と第二哺乳類は単一個体の哺乳類である。

本発明の追加の側面によって、前記器官は、肺臓、肝臓、腎臓、筋肉、脾臓、皮膚又は心臓からなる群から選択される。

本発明の追加の側面によって、前記少なくとも一つの微小器官は二種以上の細胞型を含有している。

本発明の追加の側面によって、第一哺乳類はヒトである。

本発明の追加の側面によって、前記少なくとも一つの微小器官は、第一哺乳類の組織内に移植される前に、身体外で少なくとも４時間培養される。

本発明の追加の側面によって、前記少なくとも一つの微小器官が、哺乳類の組織に移植されたとき、生存性を保持するように調製される。

本発明の追加の側面によって、前記少なくとも一つの微小器官の寸法が、その少なくとも一つの微小器官内に最も深く位置している細胞の少なくとも一つの微小器官の最も近い表面からの距離が少なくとも約８０〜１００ミクロンでかつ約２２５〜３７５ミクロンまでであるような寸法である。

本発明の追加の側面によって、複数の血管新生因子各々が前記少なくとも一つの微小器官内で独特の発現パターンを有している。

本発明の追加の側面によって、前記少なくとも一つの微小器官の細胞の少なくとも一部が、血管新生を制御するために選択される少なくとも一種の外因性ポリヌクレオチド配列を含有している。

本発明の追加の側面によって、前記少なくとも一種の外因性ポリヌクレオチド配列が、前記少なくとも一つの微小器官の細胞の少なくとも一部分のゲノムに組み込まれている。

本発明の追加の側面によって、前記少なくとも一種の外因性ポリヌクレオチド配列が、前記複数種の血管新生因子のうち少なくとも一種の血管新生因子の発現を制御するように設計されている。

本発明の追加の側面によって、前記少なくとも一種の外因性ポリヌクレオチド配列が、エンハンサー又はサプレッサーの配列を含有している。

本発明の追加の側面によって、前記少なくとも一種の外因性ポリヌクレオチド配列の発現産物が、前記複数種の血管新生因子のうちの少なくとも一種の血管新生因子の発現を制御することができる。

本発明の追加の側面によって、前記少なくとも一種の外因性ポリヌクレオチド配列が、少なくとも一種の組み換え血管新生因子をコードしている。

本発明の他の側面によって、第一哺乳類の組織に血管新生を誘発する方法であって：
（ａ）少なくとも一つの微小器官から可溶性分子を抽出し、次に
（ｂ）ステップ（ａ）で抽出された可溶性分子の少なくとも一つの予め定められた投与量を、第一哺乳類の組織に投与する、
ことを含んでなる方法が提供される。

本発明の追加の側面によって、前記可溶性分子は、ステップ（ｂ）の前に医薬として許容できる担体と混合される。

本発明の追加の側面によって、前記少なくとも一つの微小器官を、少なくとも４時間培養した後、前記可溶性分子が抽出される。

本発明の別の側面によって、有効成分として少なくとも一つの微小器官からの可溶性分子の抽出物及び医薬として許容できる担体を含んでなる医薬組成物が提供される。

本発明の別の側面によって、複数種の細胞を含んでなる微小器官であって、その複数種の前記細胞の少なくとも一部が、少なくとも一種の外因性ポリヌクレオチド配列を含有し、そして前記少なくとも一種の外因性ポリヌクレオチド配列が、これら細胞で発現される少なくとも一種の血管新生因子の発現を制御することができる微小器官が提供される。

本発明の別の側面によって、微小器官が第二哺乳類の器官組織由来の器官である。

本発明の別の側面によって、第一哺乳類と第二哺乳類は単一個体の哺乳類である。

本発明の別の側面によって、前記器官は、肺臓、肝臓、その他の消化器官由来器官、腎臓、脾臓又は心臓からなる群から選択される。

本発明の別の側面によって、前記少なくとも一つの微小器官は二種以上の細胞型を含有している。

本発明の別の側面によって、少なくとも一つの微小器官の寸法が、微小器官内に最も深く位置している細胞の少なくとも一つの微小器官の最も近い表面からの距離が少なくとも約８０〜１００ミクロンでかつ約２２５〜３７５ミクロンまでであるような寸法である。

本発明の追加の側面によって、前記少なくとも一種の外因性ポリヌクレオチド配列が前記複数種の前記細胞の少なくとも一部分のゲノムに組み込まれる。

本発明の追加の側面によって、前記少なくとも一種の外因性ポリヌクレオチド配列の発現産物が、前記少なくとも一種の血管新生因子の発現を制御することができる。

本発明のさらに他の側面によって、第一哺乳類の組織に血管新生を誘発する方法であって：
少なくとも一つの微小器官を増殖培地で培養してならし培地をつくり、
少なくとも一つの予め定められた培養期間の後、そのならし培地を収集し、次いで
ステップ（ｂ）で収集したならし培地の少なくとも一つの予め定められた投与量を、第一哺乳類の組織に投与して、その組織に血管新生を誘発する、
ことを含んでなる方法が提供される。

本発明の追加の側面によって、前記少なくとも一つの微小器官を、少なくとも４時間培養した後、前記ならし培地を収集する。

本発明の追加の側面によって、前記増殖培地は最少必須培地である。

本発明の別の側面によって、組織の生検試料から微小器官を生成させ次いでその微小器官を被検者に移植する装置が提供され、その装置は、
（ａ）組織の生検試料を複数の微小器官に切断する切断チャンバー、及び
（ｂ）その複数の微小器官を被検者に移植する移植機構であって、前記切断チャンバーに連結されて作動する移植機構、
を含んでいる。

本発明の追加の側面によって、前記切断チャンバーは試薬の導入及び取り出しを行う入口／出口を備えている。

本発明の追加の側面によって、前記切断チャンバーはその中に組織の生検試料を導入する入口を備えている。

本発明の追加の側面によって、前記装置は、前記切断チャンバーに連結されて作動し前記複数の微小器官のうち少なくとも一つの犠牲微小器官の生存能力を試験する生存能力試験チャンバーを備えている。

本発明の追加の側面によって、前記移植機構は、多チャネルインプランター（ｍｕｌｔｉ−ｃｈａｎｎｅｌｉｍｐｌａｎｔｅｒ）及び前記複数の微小器官を前記切断チャンバーから前記多チャンネルインプランターの方に前進させそしてさらに複数の微小器官を被験者に移植する対応する前進素子を備えている。本発明の追加の側面によって、前記装置は、前記切断チャンバー及び前記移植機構に連結されて作動し前記微小器官を前記移植を行う前に処理する処理チャンバーを備えている。

本発明の追加の側面によって、前記処理チャンバーは処理試薬を導入し取り出すための入口／出口を備えている。

本発明の追加の側面によって、前記切断チャンバーは組織の生検試料を前記複数の微小器官に切断する移動可能な複数の刃を有する切断機構を備えている。

本発明の追加の側面によって、前記刃は、組織の生検試料が一旦前記複数の微小器官すなわち前記の各微小器官に切断されたならば前記複数の微小器官の微小器官内に最も深く位置している細胞が前記微小器官の最も近くの表面から少なくとも約８０〜１００ミクロン離れかつ２２５〜３７５ミクロンを超えて離れないように、互いに配置されている。

本発明の追加の側面によって、前記複数の刃は平行移動できる傾斜した切断刃先を持っている。

本発明の別の側面によって、前記複数の刃は各々回転可能な円板刃である。

本発明の別の側面によって、組織の生検試料から微小器官を作製する装置が提供され、その装置は、
（ａ）組織の生検試料を複数の微小器官に切断するための切断チャンバー、及び
（ｂ）前記切断チャンバーに連結されて作動し、前記複数の微小器官のうちの少なくとも一つの犠牲微小器官の生存能力を試験するための生存能力試験チャンバー、
を備えている。

本発明の追加の側面によって、前記切断チャンバーは試薬の導入及び取出しを行う入口／出口を持っている。

本発明の追加の側面によって、前記切断チャンバーは組織の生検試料をその中に導入する入口を備えている。

本発明の追加の側面によって、前記切断チャンバーは、組織の生検試料を前記複数の微小器官に切断する移動可能な複数の刃を有する切断機構を備えている。

本発明の追加の側面によって、前記複数の刃は各々平行移動できる傾斜した切断刃先を持っている。

本発明の別の側面によって、組織の生検試料から微小器官を作製する装置が提供され、その装置は、
（ａ）組織の生検試料を複数の微小器官に切断するための切断チャンバー、
（ｂ）前記切断チャンバーに連結されて作動し前記微小器官を処理するための処理チャンバー、
（ｃ）前記微小器官を前記切断チャンバーから前記処理チャンバーへ前進させる前進機構、
を備えている。

本発明の追加の側面によって、前記処理チャンバーは処理試薬の導入及び取出しを行うための入口／出口を備えている。

本発明の追加の側面によって、前記切断チャンバーは生検試料をその中に導入する入口を備えている。

本発明の追加の側面によって、前記切断チャンバーは、組織の生検試料を前記複数の微小器官に切断する複数の刃を有する切断機構を有している。

本発明の別の側面によって、組織の生検試料から微小器官を作製し次いでその微小器官を被検者に移植する方法が提供され、その方法は、
（ａ）組織の生検試料を複数の微小器官に切断する切断チャンバー、及び
（ｂ）前記切断チャンバーに連結されて作動する、複数の微小器官を被験者に移植する移植機構、
を有する装置を提供し、
組織の生検試料を前記切断チャンバー内に入れてその組織の生検試料を複数の微小器官に切断し、次いで
前記移植機構を使って前記複数の微小器官を被検者に移植する、
ステップを含んでいる。

本発明の追加の側面によって、微小器官はアンギオポンプ（ａｎｇｉｏｐｕｍｐ）として働く。

本発明の追加の側面によって、前記切断チャンバーは試薬の導入及び取出しを行う入口／出口を有し、前記方法は前記微小器官を前記切断チャンバー内で洗浄した後、前記移植機構を使って複数の微小器官を被検者に移植するステップをさらに含んでいる。

本発明の追加の側面によって、前記切断チャンバーはその中に組織の生検試料を導入する入口を有し、前記方法はその組織生検試料を前記入り口を通じて前記切断チャンバー内に入れるステップを含んでいる。

本発明の追加の側面によって、前記装置は前記切断チャンバーに連結されて作動して前記複数の微小器官のうちの少なくとも一つの犠牲微小器官の生存能力を検査する生存能力試験チャンバーをさらに備え、前記方法は前記複数の微小器官のうちの前記少なくとも一つの犠牲微小器官の前記生存能力を試験した後、前記移植機構を使って複数の微小器官を被検者に移植するステップを含んでいる。

本発明の追加の側面によって、前記移植機構は、多チャネルインプランター及び前記複数の微小器官を前記切断チャンバーから前記多チャンネルインプランターに前進させそしてさらに複数の微小器官を被検者に移植する対応する前進素子を備え、前記方法は前記前進素子を使って複数の微小器官を被検者に移植するステップをさらに含んでいる。

本発明の追加の側面によって、前記装置は、前記切断チャンバーに連結されて作動する処理チャンバー、及び前記移植を行う前に前記微小器官を処理する前記移植機構を備え、前記方法が前記移植を行う前に前記微小器官を処理するステップをさらに含んでいる。

本発明の追加の側面によって、前記移植を行う前に前記微小器官を処理する前記ステップは、洗浄、形質転換、培養及びそれらの組合わせからなる群から選択される少なくとも一つの処理を含んでいる。

本発明の追加の側面によって、前記移植を行う前に前記微小器官を処理する前記ステップは、少なくとも１時間培養するステップを含んでいる。

本発明の追加の側面によって、前記移植を行う前に前記微小器官を処理する前記ステップは、前記微小器官の細胞の少なくとも一部に、血管新生を調節するため選択された少なくとも一つの外因性ポリヌクレオチド配列を導入することによって形質転換するステップを含んでいる。

本発明の追加の側面によって、前記少なくとも一つの外因性ポリヌクレオチド配列は、前記微小器官の前記細胞の前記少なくとも一部のゲノムに組み込まれる。

本発明の追加の側面によって、前記少なくとも一つの外因性ポリヌクレオチド配列は、前記複数の血管新生因子のうちの少なくとも一つの血管新生因子の発現を調節するように設計されている。

本発明の追加の側面によって、前記少なくとも一つの外因性ポリヌクレオチド配列は、エンハンサー又はサプレッサーの配列を含んでいる。

本発明の追加の側面によって、前記少なくとも一つの外因性ポリヌクレオチド配列は、前記複数の血管新生因子のうちの少なくとも一つの血管新生因子の発現を調節することができる。

本発明の追加の側面によって、前記少なくとも一つの外因性ポリヌクレオチド配列は、少なくとも一つの組み換え血管新生因子をコードしている。

本発明の追加の側面によって、前記処理チャンバーは処理試薬の導入及び取出しを行う入口／出口を備え、前記方法は少なくとも一つの処理試薬を前記入口／出口を通じて前記処理チャンバーに導入するステップを含んでいる。

本発明の追加の側面によって、前記切断チャンバーは、組織の生検試料を前記複数の微小器官に切断するための移動可能な複数の刃を有する切断機構を有し、前記方法は前記複数の刃を使って組織の生検試料を前記複数の微小器官に切断するステップを含んでいる。

本発明の追加の側面によって、前記切断チャンバーは、一旦組織の生検試料が前記複数の微小器官すなわち前記各微小器官に切断されたならば、前記複数の微小器官のうちの微小器官内に最も深く位置している細胞が前記微小器官の最も近くの表面から少なくとも約８０〜１００ミクロン離れかつ２２５〜３７５ミクロンを超えて離れないように設計されかつ構築され、前記方法は、前記切断チャンバーを使用して、前記複数の微小器官のうちの微小器官内に最も深く位置している細胞が前記微小器官の最も近くの表面から少なくとも約８０〜１００ミクロン離れかつ２２５〜３７５ミクロンを超えて離れないように、組織の生検試料を、前記複数の微小器官すなわち前記の各微小器官に切断するステップをさらに含んでいる。

本発明の追加の側面によって、前記複数の刃は各々平行移動可能な傾斜刃先を有し、前記方法は、前記傾斜刃先を組織の生検試料に対して平行移動させて、組織の生検試料を前記複数の微小器官に切断するステップを含んでいる。

本発明の別の側面によって、前記複数の刃は各々回転可能な円板刃であり、前記方法は前記回転可能な円板刃を組織の生検試料に対して回転させてその組織の生検試料を前記複数の微小器官に切断するステップを含んでいる。

本発明の追加の側面によって、前記組織の生検試料は、肺臓、肝臓、腎臓、筋肉、脾臓、皮膚、心臓、リンパ節及び骨髄からなる群から選択される組織又は器官由来の試料である。

本発明の追加の側面によって、組織の生検試料のドナーと被検者は同じ個体である。

本発明の別の側面によって、組織の生検試料のドナーと被検者は異なる個体である。

本発明の追加の側面によって、組織の生検試料のドナーはヒトである。

本発明の別の側面によって、組織の生検試料のドナーはヒト以外の哺乳類である。

本発明の追加の側面によって、前記被検者はヒト以外の哺乳類である。

本発明の別の側面によって、前記被検者はヒトである。

本発明の追加の側面によって、複数の微小器官を被検者に移植する前記ステップが経粘膜又は非経口の投与経路で行われる。

本発明の追加の側面によって、前記経粘膜又は非経口の投与経路は、筋肉内、皮下、骨髄内、くも膜下、直接心室内（ｄｉｒｅｃｔｉｎｔｒａｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ）、静脈内、腹腔内、鼻腔内及び眼内の投与経路からなる群から選択される。

本発明の好ましい側面によって、
組織の生検試料を得るための組織スクレーパー、
組織の生検試料を複数のフラグメントに切断して複数の微小器官を作製する組織切断器、及び
前記組織切断器に取外し可能に連結される少なくとも一つの移植器であって、前記組織切断器に取り付けられたときに、前記複数の微小器官のうちの一つの微小器官を受け取り、そして前記組織切断器から連結を解除された後、前記微小器官を被検者に移植する移植器、
を備えた微小器官を作製し送達する装置が提供される。

本発明の追加の側面によって、前記装置は、基板、ランプ及びケーシング内に密封されている。

本発明の追加の側面によって、前記装置は制御システムを含んでいる。

本発明の追加の側面によって、前記装置は、組織の生検試料を前記装置の一領域から別の領域に移送する少なくとも一つの自動走行機構を含んでいる。

本発明の追加の側面によって、前記組織スクレーパーは前記組織を予め定められた幅にスクレープするように構成されている。

本発明の追加の側面によって、前記組織スクレーパーは前記組織を予め定められた長さにスクレープするように構成されている。

本発明の追加の側面によって、前記組織スクレーパーは前記組織を予め定められた厚さにスクレープするように構成されている。

本発明の追加の側面によって、前記組織スクレーパーは取替え可能な刃を有している。

本発明の追加の側面によって、前記装置は組織の生検試料をすすぐための洗浄装置を備えている。

本発明の追加の側面によって、前記洗浄装置は培地を組織の生検試料に加えるように作動する。

本発明の追加の側面によって、前記装置はさらに組織処理チャンバーとして作動する。

本発明の追加の側面によって、前記装置はその中の温度を制御する手段を含んでいる。

本発明の追加の側面によって、前記組織切断器は、微小器官のうちのいずれか一つの中に最も深く位置している細胞が最も近い表面から少なくとも約８０〜１００ミクロン離れかつ約２２５〜３７５ミクロンを超えて離れないように、組織の生検試料を前記複数のフラグメントに切断して前記微小器官を作製するように設計された複数の平行な外科グレードの刃を備えている。

本発明の追加の側面によって、前記組織切断器は、組織の生検試料に対し角度をつけて配置されている複数の平行な外科グレードの刃を備えている。

本発明の別の側面によって、前記組織切断器は、回転可能な円板刃として配置されている複数の平行な外科グレードの刃を備えている。

本発明の追加の側面によって、前記装置は前記複数の微小器官のうちの少なくとも一つの微小器官の生存能力を試験するための生存能力試験チャンバーを備えている。

本発明の追加の側面によって、前記組織切断器は、組織の生検試料を切断し、前記微小器官を作製し、次に前記微小器官各々を、複数の微小器官ガイドのうちの単一の微小器官ガイド上に単一の操作で配置するように作動する。

本発明の追加の側面によって、前記少なくとも一つの移植器は、経皮挿入用でかつ前記複数の微小器官ガイドのうちの一つを受け入れるように作動する細いハウジングを含んでいる。

本発明の追加の側面によって、前記少なくとも一つの移植器は、前記複数の微小器官ガイドのうちの一つを受け入れるように作動する複数の移植器を含んでいる。

本発明の追加の側面によって、前記複数の微小器官ガイドは各々、そのガイドに配置された前記微小器官を移植するため位置決めするときに示す位置マーカーを含んでいる。

本発明の追加の側面によって、前記複数の微小器官ガイドは各々、そのガイドの遠位部分を破断して、そのガイドに配置された前記微小器官に先端を形成させるノッチを含んでいる。

本発明の追加の側面によって、前記複数の微小器官ガイドは各々、そのガイドに配置されている前記微小器官が移植されるときに示す位置マーカーを含んでいる。

本発明の追加の側面によって、前記装置は使い捨て装置である。

本発明の別の好ましい側面によって、
組織の生検試料をスクレープし、
その組織の生検試料を複数のフラグメントに切断して複数の微小器官を作製し、次いで
前記複数の微小器官のうちの少なくとも一つを移植する、
ステップを含んでなる微小器官を作製し送達する方法が提供される。

本発明の別の好ましい側面によって、
組織の生検試料を得るため使用する組織スクレーパー、
その組織の生検試料を複数のフラグメントに切断して複数の微小器官を作製するために使用する組織切断器、及び
前記組織切断器に取外し可能に連結された少なくとも一つの移植器であって、前記組織切断器に連結されているときに前記複数の微小器官のうちの一つの微小器官を受け取り、そして前記組織切断器から外された後、前記微小器官を被検者に移植するために使う移植器、
を備えた、微小器官を作製し送達する装置を利用し、
その組織の生検試料を前記組織スクレーパーでスクレープし、
その組織の生検試料を、前記組織切断器で前記複数のフラグメントに切断して前記複数の微小器官を作製し、
前記複数の微小器官のうちの前記一つの微小器官を前記少なくとも一つの移植器に取り付け、
前記少なくとも一つの移植器を取り外し、次いで
前記微小器官を、前記少なくとも一つの移植器で移植する、
ステップを含む、微小器官を作製し送達する方法が提供される。

本発明の追加の側面によって、前記微小器官はアンギオポンプとして働く。

本発明の追加の側面によって、前記方法は前記組織の生検試料を処置した後に移植するステップを含んでいる。

本発明の追加の側面によって、前記処置は、洗浄、形質転換、培養及びこれらの組合わせからなる群から選択される。

本発明の追加の側面によって、前記切断のステップは、前記微小器官の各々を複数の微小器官ガイドのうちの単一の微小器官ガイド上に配置するステップを含んでいる。

本発明の追加の側面によって、前記方法は、前記装置を一回使用したのち廃棄するステップを含んでいる。

本発明の追加の側面によって、
前記切断ステップは、第一の複数の組織フラグメントに切断して第一の複数の微小器官を作製するステップをさらに含み、そして
前記移植するステップは、第二の複数の微小器官を移植するステップをさらに含み、前記第二の複数は、前記第一の複数に等しい複数、前記第一の複数より１小さい複数及び前記第一の複数より２小さい複数からなる群から選択される。

本発明の別の側面によって、
前記切断ステップは、第一の複数の組織フラグメントに切断して第一の複数の微小器官を作製するステップをさらに含み、そして
前記移植するステップは、第二の複数のフラグメントを移植するステップをさらに含み、前記第二の複数は前記第一の複数より１小さく、
前記方法は、生存能力試験のために端縁フラグメントを使う
ステップをさらに含んでいる。

本発明の別の側面によって、
前記切断ステップは、第一の複数の組織フラグメントに切断して第一の複数の微小器官を作製するステップをさらに含み、そして
前記移植するステップは、第二の複数の組織フラグメントを移植するステップをさらに含み、その第二の複数は前記第一の複数より２小さく、
前記方法は、第一端縁フラグメントを生存能力試験のために使用し、そして
第二端縁フラグメントを廃棄する、
ステップをさらに含んでいる。

本発明の追加の側面によって、前記切断ステップは、前記微小器官のいずれか一つの中に最も深く位置している細胞が、最も近い表面から少なくとも約８０ミクロン離れかつ約３７５ミクロンを超えて離れないように、組織の生検試料を前記複数のフラグメントに切断して前記微小器官を作製するステップを含んでいる。

本発明の追加の側面によって、前記切断ステップは、前記微小器官のいずれか一つの中に最も深く位置している細胞が、最も近い表面から少なくとも約１００ミクロン離れかつ約２２５ミクロンを超えて離れないように、組織の生検試料を前記複数のフラグメントに切断して前記微小器官を作製するステップを含んでいる。

本発明の追加の側面によって、前記移植ステップは、複数の微小器官を前記被検者の予め選択された領域に、微小器官の予め定められた領域濃度で移植するステップをさらに含んでいる。

本発明の追加の側面によって、前記移植ステップは、複数の微小器官を被検者の予め選択された容積に、微小器官の予め定められた容積濃度で移植するステップをさらに含んでいる。

本発明の追加の側面によって、前記組織の生検試料は分層厚さ（ｓｐｌｉｔｔｈｉｃｋｎｅｓｓ）の組織生検試料である。

本発明は、血管新生を哺乳類の組織中に誘発する方法、抽出物及び医薬組成物並びに微小器官を作製し哺乳類に送達する方法を提供することによって現在知られている配置構成の欠点を処置することに成功している。

図面の簡単な説明
本発明を、例示だけを目的として添付図面を参照して説明する。ここで図面について詳述するが、図示されている詳細部分は、例示として、本発明の好ましい実施態様を例示考察することだけを目的とするものであり、本発明の原理と概念の側面の最も有用でかつ容易に理解される説明であると考えられることを提供するために提供されることを強調するものである。この点について、本発明を基本的に理解するのに必要以上に詳細に本発明の構造の詳細を示すこころみはせずに、本発明のいくつもの形態がどのように実施されるかを当業技術者に対して明らかにするため、図面で説明を行う。
図１は移植された微小器官（矢印で示す）のまわりの新しい血管形成を示す写真である。
図２は移植された微小器官に発現された各種の血管新生因子の相対レベルを示すグラフである。Ａｎｇ１−アンギオポエチン１、Ａｎｇ２−アンギオポエチン２、ＭＥＦ２Ｃ−ミオサイトエンハンサー因子２Ｃ、ＶＥＧＦ−血管内皮増殖因子。
図３は調製後、各種の期間、身体外で培養された微小器官から抽出されたＲＮＡの血管新生因子特異的ＰＴ−ＰＣＲ産物である。Ａｃｔｉｎ−β−アクチン（対照）。
図４はβ−アクチンＲＴ−ＰＣＲ産物（対照）のインテンシティーに対して正規化した、図３に示すＲＴ−ＰＣＲ産物のデンシトメトリーで得た半定量データを示すグラフである。
図５は微小器官を移植されたか又は擬似移植された（対照）総腸骨結紮ラットの歩行パターンを示すヒストグラムである。（ｎ）＝１３。三つの時間グループのＰ値は左から右へ順に０．１６，１及び０．８４１である。得点：０−完全な機能性、９−四肢を全く動かすことができない、１０−四肢の損失。
図６は動物を歩行挙動について採点する前に身体運動を行わせたことを除いて図５の実験グループと同じグループを示すヒストグラムである。三つの時間グループのＰ値は左から右へ順に０．０００１，０．００６９及び０．０６である。
図７は微小器官を移植されたか又は擬似移植された総腸骨動脈結紮マウスの歩行パターンを示すヒストグラムである。０−完全な機能性、９−四肢を全く動かせない、１０−四肢の損失。三つの時間グループのＰ値は、左から右へ順に０．０００２５，０．００５７１及び０．０７３６２である。
図８は同系マウスの皮下領域中に移植してから６ヶ月後のマウス脾臓由来の微小器官（ＭＣ矢印で示す）を示す画像である。その微小器官を囲んでいる新しく形成された血管のうちの一つを矢印で示している。
図９は同系ラット由来の肺臓微小器官を移植されたラットの角膜を示す画像である。その移植された微小器官（矢印で示す）が新しく形成された血管で囲まれている。
図１０Ａ〜Ｂは本発明の好ましい実施態様による、微小器官を作製し送達する装置を図式的に示す。
図１１は本発明の好ましい実施態様による組織スクレーパーを図式的に示す。
図１２は本発明の好ましい実施態様による前記組織スクレーパーを図式的に示す。
図１３Ａ〜Ｂは本発明の好ましい実施態様による組織切断器を図式的に示す。
図１４Ａ〜Ｄは本発明の好ましい実施態様による前記組織切断器を図式的に示す。
図１５は本発明の好ましい実施態様による、切断が完了したときの組織切断器を図式的に示す。
図１６Ａ〜Ｂは本発明の好ましい実施態様による、微小器官の湿潤を保持するため培地を適用するステップを図式的に示す。
図１７Ａ〜Ｅは本発明の好ましい実施態様による、微小器官を移植器に挿入するステップを図式的に示す。
図１８Ａ〜Ｃは本発明の好ましい実施態様による、微小器官を身体内に移植するステップを図式的に示す。
図１９Ａ〜Ｃは移植された皮膚の微小器官（ＳＭＯ）における移植後１日目、３日目及び７日目の血管新生を示す（矢印は新しく形成された血管を示す）。
図２０Ａ〜Ｂは移植されたＳＭＯ中の局所血流（図２０Ａ）を肺のＭＯによって誘発された血流（図２０Ｂ）と比較して示す。血流の強さを測定するため蛍光ビーズを使った。
図２１Ａ〜Ｂは若いマウス由来のＳＭＯと老マウス由来のＳＭＯを若いマウスに移植して１ヶ月後の、これらＳＭＯにおける血管の形成を示す。
図２２Ａ〜Ｂは若いマウス由来のＳＭＯと老マウス由来のＳＭＯを若いマウスに移植して２週間後の、これらＳＭＯ内の血流を示す。
図２３Ａ〜ＧはＳＭＯを移植されていない筋肉組織（図２３Ａ、Ｇ）とＳＭＯを移植された筋肉組織（図２３Ｂ〜Ｄ）における血管の形成を示す蛍光顕微鏡で撮った写真である。
図２４は被検ウサギに移植して７日後にレスキュー（ｒｅｓｃｕｅ）された単一ＳＭＯ中の血管の形成を示す。
図２５Ａ〜Ｎは本発明による微小鉗子の製作段階と作動を示す。
図２６は本発明の好ましい実施態様による微小器官を作製し送達する第二装置を図式的に示す。
図２７Ａ〜Ｄは本発明の好ましい実施態様による複数の刃で切断する段階を有する第二装置を図式的に示す。
図２８Ａ〜Ｃ、２９Ａ〜Ｃは本発明の方法と装置に関連する本発明の微小鉗子の使用を図式的に示す。

本発明は、哺乳類の組織内に血管の新生を誘発する方法、抽出物及び医薬組成物並びに微小器官を作製し哺乳動物中に送達する装置の発明である。

本発明の原理と作用は、図面とその説明によって十分に理解することができる。

本発明の少なくとも一つの実施態様の詳細な説明を行う前に、本発明は、以下の説明に記載されるか、又は以下の実施例の章に例示されている要素の詳細な構成と配置にその用途を限定されないと解すべきである。本発明は、他の実施態様を実施することができるか又は各種の方式で実行又は実施することができる。また、本願で利用される語法と専門用語は説明を目的とするものであり、限定とみなすべきではないと解すべきである。

用語「微小器官（ｍｉｃｒｏ−ｏｒｇａｎ）」は、本願で使用する場合、身体から取り出され、以下にさらに説明するように、細胞の生存性と機能を助成する方式で調製される器官組織を意味する。このような調製は、身体の外部で、予め定められた期間培養することによって行われる。用語「アンギオポンプ（ａｎｇｉｏｐｕｍｐ）」は、処理された微小器官を意味し、好ましくは細胞の生存能力について確認されかつすぐに投与できる方式で（必ずしもすぐに投与されるわけではないが）作製された微小器官を意味する。

複雑な多細胞生物は、あらゆる細胞各々が必要とする酸素、栄養素及び***物の除去を支える血管のネットワークに依存している。血管のこの複雑なネットワークは、血管新生のプロセスによって創成され維持される。ヒトの場合、血管ネットワークの衰退は閉塞性動脈疾患をもたらし、この疾患は、西欧世界では病的状態と死亡の主要原因である。現在利用可能な大部分の治療法の選択肢は、血管バイパスの作成又は血管形成術などの外科的方法などの侵襲性の方法に基づいている。これらの解決策は、大体は成功しているが、短命であるか、又はすべての患者に適用できるわけではない。血管新生は、組織と器官の形成の基本要素であるから、大部分の組織は、再生中に、新しい血管の生成を誘発する性能を保持している。従って、本発明の発明者らは、身体から取り出された組織は、本質的に、少なくとも再生しようとしているので、血管新生の刺激剤として、さらに広くは細胞増殖プロセスの刺激剤として利用できると想定している。

本発明は、微小器官を利用することに基づいた、血管新生及びその他の細胞増殖特性を誘発する新しい方法を提供するものである。このような微小器官は、器官組織の基本的な微小構造を保持しているが、同時に、器官移植体が栄養素や気体のソースからの距離が１００〜４５０ミクロンまでであるように調製されている。このような微小器官は、自律的に機能し、かつエクスビボの培養物として及び移植された状態で、長期間にわたって生存し続ける。さらに、かような微小器官は、機能するだけでなくその近傍に重要な血管網を誘発する血管新生因子の全レパートリーを分泌する。

微小器官は調製後ただちに利用できるが、場合によっては、身体の外部で長期間培養することが、生存能力を増大するため有利なことがあるということはわかるであろう。例えば、可溶性分子を抽出する場合、微小器官の培養が予め定められた期間（４時間という短時間又は数日もしくは数週間という長時間でもよい）行われる。

したがって、これらの微小器官又はその器官から抽出した抽出物を、血管新生及びその他の細胞増殖特性を誘発するのに使用することは、その細胞の機能が、移植する前の各種の期間保存されていることに依存している。本発明は、特定の環境下で、器官移植体の各種組織層、例えば間葉層及び上皮層での細胞の増殖が活性化されて、培養中に増殖し、分化し次いで機能するという発見に一部基づいている。

移植体自体において提供される細胞−細胞の相互作用と細胞−マトリックスの相互作用は細胞の恒常性を支えるのに十分であるので、器官の微小構造と機能を、長期間にわたって保持する。用語「恒常性」は、本願で使用する場合、細胞の増殖と細胞損失とが平行していることと定義する。

細胞の恒常性が保持されると、例えば、ソースの器官中に存在する自然の細胞−細胞相互作用と細胞−マトリックス相互作用が保持される。従って、細胞のお互いの配向また他の固定培養基（ａｎｃｈｏｒａｇｅｓｕｂｓｔｒａｔｅ）に対する配向、及びホルモンなどの制御物質の存在の有無によって、ソースの器官の生化学的活性と生物学的活性を適当に維持することができる。さらに、微小器官は、有意な壊死なしで、少なくとも４８日以上培養によって維持することができる。

微小器官の移植体のソース
微小器官を分離できる哺乳類の例としては、ヒトなどの霊長類、ブタ例えば全面的もしくは部分的に近交交配させたブタ（例えばミニアチュアブタ及びトランスジェニックブタ）、げっ歯類などがある。適切な器官の例としては、限定されないが、肝臓、肺臓、他の腸管由来の器官、心臓、脾臓、腎臓、皮膚及び膵臓がある。

増殖培地
動物由来の細胞を培養するのに用いる組織培養培地が多数存在している。これらのうちいくつかは複雑で、いくつかは単純である。微小器官は、複雑な培地で増殖できると予想されるが、ダルベッコの最少必須培地（ＤＭＥＭ）などの単純な培地で、培養物を維持できるということが米国特許願第０８／４８２３６４号に示されている。さらに、微小器官は、血清又は他の生物学的抽出物例えば下垂体抽出物を含有する培地で培養できるが血清又は他の生物学的抽出物を必要としないことが、米国特許願第０８／４８２３６４号に示されている。さらに、微小器官の培養物は、血清なしで長期間にわたって維持することができる。本発明の好ましい実施態様では、微小器官の培養物を生体外で維持する際に、増殖因子は培地に含まれていない。

最少培地での増殖に関する点が重要である。現在、哺乳類の細胞を長期間増殖させるのに使用する大部分の培地又は系は、未定義（ｕｎｄｅｆｉｎｅｄ）のタンパク質を取り込むか又は支持細胞を利用して、このような増殖を維持するのに必要なタンパク質を提供する。このような未定義のタンパク質が存在すると、微小器官の目的とする最終用途を妨害することがあるので、未定義のタンパク質の存在を最少限にする条件下で外植片を培養することが一般に好ましい。

用語「最少培地」は、本願で使用する場合、細胞が培養中に、生存し続けて増殖するのに必要な栄養素だけを含有している化学的に定義された培地を意味する。一般に、最少培地は、生物学的抽出物、例えば増殖因子、血清、下垂体抽出物、又は培養中の細胞集団の生存と増殖を支えるのに必要でない他の物質を含有していない。例えば、最少培地は一般に、少なくとも一種のアミノ酸、少なくとも一種のビタミン、少なくとも一種の塩、少なくとも一種の抗生物質、少なくとも一種の指示薬例えば水素イオン濃度を確認するために使用されるフェノールレッド、及び少なくとも一種の抗生物質、並びに細胞が生存し増殖するのに必要な他の種々の成分を含有している。最少培地は血清を含有していない。各種の最少培地が、最少必須培地として、米国メリーランド州ゲイサーズバーグ所在のＧｉｂｃｏＢＲＬから市販されている。

しかし、増殖因子及び制御因子は前記培地に添加する必要はないが、これらの因子の添加又は他の分化した細胞の接種を利用して、培養物中の増殖と細胞成熟を促進し、変化させ又は変調させることができる。培養中の細胞の増殖と活性は、各種の増殖因子、例えばインシュリン、増殖ホルモン、ソマトメジン類、コロニー刺激因子類、エリトロポエチン、上皮増殖因子、肝性骨髄性因子（ｈｅｐａｔｉｃｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｃｆａｃｔｏｒ）（ヘパトポエチン）、ならびに他の細胞増殖因子類、例えばプロスタグランジン類、インターロイキン類、及び天然の負の増殖因子類、繊維芽細胞増殖因子類及びトランスフォーミング増殖因子−β−ファミリーのメンバーによって影響を受ける。

培養容器
微小器官は適切な培養容器中に維持され、かつ３７℃にて、５％ＣＯ_２雰囲気内に保持される。培養物は、通気を改善するため振盪する。

微小器官を中に／上に提供することが好ましい培養容器については、好ましい実施態様で、かような容器は一般にいかなる材料及び／又は形態のものでもよいといえる。培養容器は、各種の材料を使用して製造することができる。その材料としては、限定されないが、ナイロン（ポリアミド類）、ダクロン（ポリエステル類）、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリアクリレート類、ポリビニル化合物類（例えばポリ塩化ビニル）、ポリカーボネート（ＰＶＣ）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ；テフロン）、サーマノックス（ｔｈｅｒｍａｎｏｘ）（ＴＰＸ）、ニトロセルロース、綿、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、腸線縫合糸類、セルロース、ゼラチン、デキストランなどがある。これらの材料はいずれも織ってメッシュにすることができる。

培養物を、長期間維持しなければならないか又は凍結保存しなければならない場合、劣化しない材料、例えばナイロン、ダクロン、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリアクリレート類、ポリビニル類、テフロン類、綿などが好ましい。本発明に使用できる便利なナイロンメッシュはＮｉｔｅｘであり、これは通孔の平均の大きさが２１０μｍでナイロン繊維の平均直径が９０μｍのナイロン製濾過メッシュ（Ｔｅｔｋｏ，Ｉｎｃ．，米国ニューヨーク州）である。

外植片の寸法
起源の組織の細胞−細胞、細胞−マトリックス及び細胞−ストロマ（ｃｅｌｌ−ｓｔｒｏｍａ）の構造を保持している外植片を分離することに加えて、その外植片の寸法が、例えばその微小器官を長期間にわたって例えば７〜２１日以上維持しようとする場合、外植片内の細胞の生存度にとって極めて重要である。

したがって、組織外植片の寸法は、三次元の微小器官中のあらゆる細胞に、十分な栄養素と酸素などの気体を拡散させ、かつ細胞***物を外植片から拡散させて、細胞毒性と微小器官中への***物の局在が原因で付随して起こる死とを最少限にするように選択される。したがって外植片の寸法は、専用の送達構造又は合成基体なしで、各細胞に対する最少レベルの接近能（ａｃｃｅｓｓｉｂｉｌｉｔｙ）が必要なことに基づいて決定される。米国特許願第０８／４８２３６４号に記載されているように、この接近能は、表面積−容積指数が特定の範囲内にある場合に維持できることが発見されている。

表面積−容積指数がこのような選択された範囲にあると、細胞を、単層中の細胞と類似の方式の拡散によって、栄養素に、及び***物廃棄の経路にアクセスさせる。このレベルの接近能は、本願で、「アレフ又はアレフ指数（Ａｌｅｐｈｉｎｄｅｘ）」として定義される表面積−容積指数が少なくとも約２．６ｍｍ^−１である場合に、得ることができて維持することができる。第三次元（ｔｈｅｔｈｉｒｄｄｉｍｅｎｓｉｏｎ）は、第三次元が変化すると、容積と表面積の両方に比率計的変化（ｒａｔｉｏｍｅｔｒｉｃｖａｒｉａｔｉｏｎ）を起こすので、表面積−容積指数を決定する際に無視した。しかし、アレフを決定する場合のａとｘは組織断片（フラグメント）の二つの最少寸法と定義しなければならない。

用語「アレフ」は式１／ｘ＋１／ａ［式中、ｘは組織の厚みであり、そしてａは組織の幅である（単位ｍｍ）］で表される表面積−容積指数を意味する。好ましい実施態様で、外植片のアレフは、約２．７ｍｍ^−１〜約２５ｍｍ^−１の範囲内であり、より好ましくは約２．７ｍｍ^−１〜約１５ｍｍ^−１の範囲内であり、さらに一層好ましくは約２．７ｍｍ^−１〜約１０ｍｍ^−１の範囲内である。

アレフの例を表１に示す。例えば、厚み（ｘ）が０．１ｍｍで幅（ａ）が１ｍｍの組織は、アレフ指数が１１ｍｍ^−１である。

したがって、例えば、個々の微小器官内に最も深く位置している細胞は、個々の微小器官の最も近い表面からの距離が少なくとも約８０ミクロンでかつ３７５ミクロンまでである。これらの数値範囲は生体内の構造の保持を促進し、細胞が気体や栄養素のソースから約２２５〜３００ミクロンを超えて離れないことを同時に保証する。

特定の理論にとらわれることなく、三次元の培養系によって提供されるいくつもの因子が、その成功に寄与している。

第一に、例えば上記アレフの計算結果を利用することによって外植片の大きさを適当に選択すると、栄養素を外植片のすべての細胞に十分に拡散させかつ細胞の***物を外植片のすべての細胞から外部へ十分に拡散させる。

第二に、外植片は三次元の形態であるから、各種の細胞が、集密的に増殖し接触阻止を示しそして増殖と***を停止する単層培養物中の細胞とは対照的に、活発に増殖し続ける。外植片の細胞を複製することによる増殖因子と制御因子の生成は、例えば全容積にわたって静的である微小器官に対してさえも、培養中の細胞の増殖の刺激と分化の制御に部分的に関与している。

第三に、外植片の三次元マトリックスは、生体内の対応する器官に見られるのと極めて近い細胞要素の空間分布を保持している。

第四に、細胞−細胞の相互作用と細胞−マトリックスの相互作用によって、細胞の成熟を助ける局在微小環境を達成することができる。分化した細胞表現型を維持するには、増殖／分化因子のみならず、適当な細胞の相互作用が必要であることが認められている。

本発明を実施する場合、以下の実施例の章でさらに説明するように、微小器官は、被移植者に移植されると、複雑なレパートリーの血管新生因子及びその他の細胞増殖因子及びサイトカイン類の投与量を維持して移植を受けた宿主の組織内に新しい血管を形成することが発見された。また、微小器官が、正常な動物と老齢動物の両者の宿主組織の虚血を逆行できることも発見された。さらに、生体外で培養された微小器官も、同じレパートリーの血管新生因子及びその他の増殖因子及びサイトカイン類を発現することが発見された。

したがって、本発明の一つの側面によって、哺乳類、例えばヒトなどの組織に血管新生及び細胞増殖を誘発する方法が提供される。この方法は、少なくとも一つの微小器官を、哺乳類の組織内に移植することによって行われる。微小器官を移植するのに適切な組織の例としては、限定されないが器官組織又は筋肉組織がある。

このような移植は、標準の外科技法によって、又は微小器官を投与するのに適切なゲージの針を使用する特別に改造したシリンジを利用して、哺乳類の目的とする組織の領域に、微小器官の調整物を移植することによって実施できる。

移植するのに利用される微小器官は、移植を受ける哺乳類又は同系の哺乳類の微小組織から調製することが好ましいが、移植する前又は移植中に、移植片拒絶及び／又は移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を避けるために処置をするならば、異種組織も微小器官を調製するのに利用することができる。移植片の拒絶又はＧＶＨＤを予防又は軽減する多数の方法が当業技術界では知られているので、本願ではそれ以上詳細に説明しない。

例えばブタ−ヒト間の移植のような異種移植を利用する場合、宿主によって免疫学的攻撃を受けるかもしれない移植体の移植を容易にするため、微小器官を、再充填できる器具又は生物分解性の器具中に挿入するかもしくは封入し次いで受容被検者に移植することは分かるであろう。かような細胞が産生する遺伝子産物は、例えば、タンパク質性生物医薬を含む薬物などの化合物の送達を制御するように設計されたポリマー製器具で送達できる。生物分解性ポリマー及び非生物分解性ポリマーの両者を含む各種の生体適合性ポリマー（ヒドロゲル類を含む）を使って、特定の標的部位における、本発明の細胞集団の遺伝子産物の放出を抑制された移植体を製造できる。このよう移植体の生成は当該技術分野で広く知られている（例えば、ＤａｖｉｄＷｉｌｌｉａｍｓ編「ＣｏｎｃｉｓｅＥｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａｏｆＭｅｄｉｃａｌ＆ＤｅｎｔａｌＭａｔｅｒｉａｌｓ」（ＭＩＴＰｒｅｓｓ：米国マサチューセッツ州ケンブリッジ所在、１９９０年）；Ｓａｂｅｌらの米国特許第４８８３６６６号；Ａｅｂｉｓｃｈｅｒらの米国特許第４８９２５３８号；Ａｅｂｉｓｃｈｅｒらの米国特許第５１０６６２７号；Ｌｉｍの米国特許第４３９１９０９号；及びＳｅｆｔｏｎの米国特許第４３５３８８８号参照）。

本発明の好ましい一実施態様によれば、微小器官の細胞の少なくとも一部が少なくとも一種の外因性ポリヌクレオチド配列を含有している。このような単一もしくは複数種のポリヌクレオチド配列は、これらの細胞のゲノム中に安定して組み込まれていることが好ましいが、過渡的（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ）ポリヌクレオチド配列も利用できる。このような外因性ポリヌクレオチド類は、移植を行った後に、哺乳類の器官組織から微小器官の細胞中に導入することができ、又は代わりに、哺乳類を、器官組織の外植片を調製する前に、外因性ポリヌクレオチドで形質転換することができる。哺乳類の細胞を形質転換する方法は、以下に詳細に説明する。

単一もしくは複数のこのような外因性ポリヌクレオチドは、例えば、これら細胞内に発現される一種以上の内因性血管新生因子又は増殖因子又はサイトカイン類の発現を上方制御又は下方制御することによって、血管新生又は細胞増殖を促進する働きをする。この場合、前記単一もしくは複数のポリヌクレオチドは、これら細胞内で発現される内因性血管新生因子及び／又は増殖因子又はサイトカイン類の転写もしくは翻訳を制御するトランス作用もしくはシス−作用のエンハンサー要素もしくはサプレッサー要素を含んでいてもよい。哺乳類の細胞に利用できる適切な翻訳制御要素又は転写制御要素の多数の例が当業技術界で知られている。

例えば、転写制御要素は、特定のプロモーターからの転写を活性化するために必要なシス作用もしくはトランス作用の要素である（Ｃａｒｅｙら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２０９巻４２３〜４３２頁１９８９年；Ｃｒｅｓｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２５１巻８７〜９０頁１９９１年；及びＳａｄｏｗｓｋｉら、Ｎａｔｕｒｅ３３５巻５６３〜５６４頁１９８８年）。

翻訳アクチベーターとして代表的なものは、カリフラワーモザイクウイルス翻訳アクチベーター（ＴＡＶ）である（例えば、ＦｕｔｔｅｒｅｒとＨｏｈｎ，ＥＭＢＯＪ．１０巻３８８７〜３８９６頁１９９１年参照）。この系では、ジ−シストロニックｍＲＮＡ（ｄｉ−ｃｉｓｔｒｏｎｉｃｍＲＮＡ）が産生される。すなわち、二つのコード領域が、同じプロモーターから同じｍＲＮＡに転写される。ＴＡＶがない場合、第一シストロンだけがリボソームによって翻訳される。しかし、ＴＡＶを発現する細胞内では、両方のシストロンが翻訳される。

シス作用制御要素のポリヌクレオチド配列は、通常行われる遺伝子ノックイン技法によって、微小器官の細胞中に導入することができる。遺伝子ノックイン／ノックアウト法を調べるには、たとえば以下の文献を参照されたい。すなわち、米国特許の５４８７９９２号、５４６４７６４号、５３８７７４２号、５３６０７３５号、５３４７０７５号、５２９８４２２号、５２８８８４６号、５２２１７７８号、５１７５３８５号、５１７５３８４号、５１７５３８３号、４７３６８６６号；ＢｕｒｋｅとＯｌｓｏｎ，ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ１９４号２５１〜２７０頁１９９１年；Ｃａｐｅｃｃｈｉ，Ｓｃｉｅｎｃｅ２４４巻１２８８〜１２９２頁１９８９年；Ｄａｖｉｅｓら、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ２０（１１）巻２６９３〜２６９８頁１９９２年；Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎら、ＨｕｍａｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＧｅｎｅｔｉｃｓ２（８）巻１２９９〜１３０２頁１９９３年；ＤｕｆｆとＬｉｎｃｏｌｎ，「ＩｎｓｅｒｔｉｏｎｏｆａｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｍｕｔａｔｉｏｎｉｎｔｏａｙｅａｓｔａｒｔｉｆｉｃｉａｌｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｔｈｅｈｕｍａｎＡＰＰｇｅｎｅａｎｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎＥＳｃｅｌｌｓ」，ＲｅｓｅａｒｃｈＡｄｖａｎｃｅｓｉｎＡｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓＤｉｓｅａｓｅａｎｄＲｅｌａｔｅｄＤｉｓｏｒｄｅｒｓ，１９９５年；Ｈｕｘｌｅｙら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ９巻７４２〜７５０頁１９９１年；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｎａｔｕｒｅ３６２巻２５５〜２６１頁１９９３年；Ｌａｍｂら、ＮａｔｕｒｅＧｅｎｅｔｉｃｓ５巻２２〜２９頁１９９３年；ＰｅａｒｓｏｎとＣｈｏｉ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０巻１０５７８〜１０５８２頁１９９３年；Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ，ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ１９４巻２８１〜３０１頁１９９１年；Ｓｃｈｅｄｌら、Ｎａｔｕｒｅ３６２巻２５８〜２６１頁１９９３年、Ｓｔｒａｕｓｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２５９巻１９０４〜１９０７頁１９９３年であり、国際特許願公開のＷＯ９４／２３０４９号、ＷＯ９３／１４２００号、ＷＯ９４／０６９０８号及びＷＯ９４／２８１２３号も情報を提供する。

また、内因性血管新生因子及び／又は増殖因子又はサイトカイン類の下方制御は、アンチセンスＲＮＡによって達成できる。この場合、単一もしくは複数種のポリヌクレオチドが、微小器官の細胞内で転写された血管新生因子及び／又は増殖因子又はサイトカイン類のｍＲＮＡ配列に相補的な配列をコードすることができる。また下方制御は、遺伝子ノックアウト法によって行うことができる。

また上方制御は、過剰発現により、又は高いコピー数の一種以上の血管新生因子及び／又は増殖因子又はサイトカイン類コード配列を提供することによって達成できる。この場合、外因性ポリヌクレオチド配列は、一種以上の血管新生因子又は増殖因子又はサイトカイン類をコードすることができ、このような血管新生因子又は増殖因子又はサイトカイン類としては、例えば限定されないが、哺乳類発現ベクターの適切なプロモーターの転写制御下に配置することができるＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、Ａｎｇ１又はＡｎｇ２がある。適切な哺乳発現ベクターとしては、限定されないが、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手できるｐｃＤＮＡ３，ｐｃＤＮＡ３．１（＋／−），ｐＺｅｏＳＶ２（＋／−），ｐＳｅｃＴａｇ２，ｐＤｉｓｐｌａｙ，ｐＥＦ／ｍｙｃ／ｃｙｔｏ，ｐＣＭＶ／ｍｙｃ／ｃｙｔｏ，ｐＣＲ３．１、及びそれらの誘導体；Ｐｒｏｍｅｇａから入手できるｐＣＩ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手できるｐＢＫ−ＲＳＶとｐＢＫ−ＣＭＶ；Ｃｌｏｎｔｅｃｈから入手できるｐＴＲＥＳがある。

外因性ポリヌクレオチド配列を、哺乳類の細胞に導入する多数の方法が当業技術界に知られている。このような方法としては、限定されないが直接ＤＮＡアップティク法（ｄｉｒｅｃｔＤＮＡｕｐｔａｋｅｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）及びウイスルもしくはリポソーム仲介形質転換法（さらに詳細を知るためには、例えば「ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」１〜３１７巻ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ参照）がある。核酸をコートされた粒子によって、微小器官に衝撃を与える方法も考えられる。

微小器官内で発現される血管新生因子及び／又は増殖因子又はサイトカイン類は、微小組織から、粗製もしくは精製された抽出物として可溶性相で抽出し、次いで、例えば血管新生又はその他の細胞増殖プロセスを誘発するため、直接利用するか又は宿主組織中に局所投与するため医薬組成物の一部として利用できることは分かるであろう。微小器官は、移植後又は培養中の異なる時点で、異なるレベルの各種の血管新生因子及び／又は増殖因子及びサイトカイン類を発現するので、続けて局所投与すると、移植された微小器官又は培養された微小器官の一過性発現物に似ている可溶性分子を、異なる微小器官培養物から異なる時点に抽出することができる。

従って、本発明の別の側面によって、哺乳類の組織中に、血管新生又はその他の細胞プロセスを誘発する別の方法が提供される。この方法は、微小器官から可溶性分子を抽出し、次にその抽出された可溶性分子の少なくとも一つの予め定められた投与量を、哺乳類の組織に局所投与することによって実施される。多数の投与方法が当業技術界で知られている。医薬組成物に関するこれらの方法のいくつかの詳細な説明を以下に述べる。

上記のように、本発明の別の好ましい実施態様によって、可溶性抽出物は医薬組成物に含有されており、またその医薬組成物は、可溶性抽出物の身体標的組織に対する接近能又は標的指向性を安定化及び／又は促進するのに役立つ医薬として許容できる担体も含有している。

医薬として許容できる担体の例としては、限定されないが、生理的溶液、ウイルスカプシド担体、リポソーム担体、ミセル担体、錯カチオン剤担体、ポリカチオン担体例えばポリリシン及び細胞担体がある。

医薬組成物の「有効成分」を構成する前記可溶性抽出物は、個体に、各種の投与方式で投与することができる。

適切な投与経路としては、例えば、筋肉内、皮下及び髄内の移植、ならびに髄腔内、直接脳質内、静脈内、腹腔内、鼻腔内又は眼内の移植を含む経粘膜又は非経口の送達経路がある。

組成物又は抽出物は、全身方式ではなくて、例えば、個体の虚血組織領域に直接注射することによって局所に投与する方が好ましい。

本発明の医薬組成物は、当業技術界で公知の方法、例えば通常の混合、溶解、顆粒化、糖衣錠製造、研和、乳化、被包、エントラッピング（ｅｎｔｒａｐｐｉｎｇ）又は凍結乾燥の方法によって製造することができる。

したがって、本発明で使用する医薬組成物は、有効成分を医薬として使用できる製剤に加工しやすくする添加剤及び助剤を含む一種以上の生理学的に許容できる担体を使用する通常の方式で配合することができる。適正な配合は、選択された投与経路によって決まる。

移植用に、有効成分は、水溶液に配合することができ、生理的に適合性の緩衝液、例えばハンクス液、リンゲル液又は生理的塩緩衝液に配合することが好ましい。経粘膜投与の場合、透過すべきバリヤーに対して適当な浸透剤が配合に使用される。このような浸透剤は当業技術界では広く知られている。

本願に記載されている組成物は、例えばボーラス注入又は持続静脈注射による非経口投与用に配合することができる。移植用配合物は、単位剤形で、例えばアンプル又は任意に保存剤を添加した多用量（ｍｕｌｔｉｄｏｓｅ）容器で提供できる。これらの組成物は、油性もしくは水性の賦形剤による懸濁液、溶液又は浮濁液でもよく、そして懸濁化剤、安定剤及び／又は分散剤などの配合剤を含有していてもよい。

非経口投与用の医薬組成物としては、水溶性の形態の有効成分の水溶液がある。さらに、有効成分の懸濁液は、適当な油又は水がベースの移植用懸濁液として製造することができる。適切な親油性の溶媒又は賦形剤としては、脂肪油例えばゴマ油又は合成脂肪酸エステル例えばオレイン酸エチル、トリグリセリド類もしくはリポソーム類がある。水性移植用懸濁液は、その懸濁液の粘度を高くする物質、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール又はデキストランを含有していてもよい。また、この懸濁液は、高濃度の溶液を製造できるように、有効成分の溶解度を増大する適切な安定剤もしくは薬剤を任意に含有していてもよい。

さらに本発明の組成物は、局在ポンプ（ｌｏｃａｌｉｚｅｄｐｕｍｐ）又は個体の虚血組織内に移植できる徐放容器を通じて送達することができる。

血管新生因子及びその他の増殖因子及びサイトカイン類は一般に、プロデューシング細胞（ｐｒｏｄｕｃｉｎｇｃｅｌｌ）から分泌されるので、微小器官を適切な培地で培養し、次に分泌された血管新生因子を含有するならし培地を予め定められた時点で集めて、可溶性抽出物について先に述べたように利用することができる。

したがって、本発明のさらに別の側面によって、第一哺乳類の組織内に血管新生又はその他の細胞プロセスを誘発する方法が提供される。本発明のこの側面による方法は、少なくとも一つの微小器官を増殖培地内で培養してならし培地をつくり、少なくとも一つの予め定められた培養期間の後、ならし培地を集め、次いでそのならし培地の少なくとも一つの予め定められた投与量を、第一哺乳類の組織内に投与して、その組織内に血管新生又はその他の細胞増殖プロセスを誘発することによって行われる。

好ましくは、前記増殖培地は、前記ならし培地の目的とする機能を妨害するか又は投与された哺乳類に望ましくない反応を起こす未定義のタンパク質又は他の増殖因子を含有していない（上記の）最少必須培地である。

前記収集したならし培地は、アフィニティーカラムなどのクロマトグラフィーの技術を使用して処理され、哺乳類に投与したとき血管新生又はその他の細胞増殖プロセスを誘発するのに適切な一連の血管新生因子又はその他の増殖因子を含有する実質的に純品の製剤を精製することができることが分かるであろう。

さらに、本願に記載のならし培地と可溶性抽出物が、先に述べたような外因性ポリヌクレオチドを含有する微小器官から誘導することができることが分かるであろう。このような場合、利用される外因性ポリヌクレオチドが血管新生因子又はその他の増殖因子又はサイトカイン類をコードしているとき、目的としている投与される哺乳類に適した外因性ポリヌクレオチドの配列を選択する。例えば、可溶性抽出物又はならし培地がヒトの宿主（ｒｅｃｉｐｉｅｎｔ）に投与される場合、ヒトのポリヌクレオチド又はヒト化外因性ポリヌクレオチドを利用することが好ましい。

本発明が教示する微小器官は、調製に引き続いて利用することができ、あるいは冷凍保存して使用するまで−１６０℃で貯蔵することができる。例えば、微小器官は、１０％のＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）と２０％の血清の存在下、徐々に冷凍することによって冷凍保存することができる。

この冷凍は、例えば微小器官を平坦なシート（例えば、アルギネートなどの半透性マトリックス）内に被包し、その被包された微小器官を、その大きさとごく近い寸法の密封可能な滅菌合成プラスチック製バッグ内に挿入することによって行うことができる。前記バッグは一方の末端に一つのプラスチック製チューブ入口を備え、バッグの反対側の末端に一つのプラスチック製チューブ出口を備えている。微小器官を被包している前記平坦シートが入っている前記密封されたプラスチック製バッグを次に、１０％のＤＭＳＯと２０％の血清を含有するＨａｍのＦ１２などの標準培養培地で灌流し次いで徐々に冷凍して−１６０℃で貯蔵できる。

心臓血管医療の重要な目標は、外科によるバイパス形成を、治療的血管新生で代替することである。しかし、血管新生因子を、冠動脈又は四肢の虚血の動物モデルに使用したとき、かなりの効力が観察されたにもかかわらず、臨床試験の結果は期待はずれであった。最近、臨床試験の不首尾は、利用される血管新生因子又はこれら因子の組み合わせを使用することが原因であるかもしれないということが示唆された。本発明の血管新生法は、従来技術の方法のこのような限界を克服するものである。

本発明は、血管新生及びその他の細胞増殖プロセスが、いくつもの制御因子によって仲介される複雑で高度に制御されて維持されているプロセスであることを確認する新規な方法を提供するものである。本発明が提供する試験結果は、身体の内外の両方における血管新生及び細胞増殖の誘発を研究することができ、その結果、重要な制御因子の発現パターンの立証のためのモデルを提供する。本願に提供した試験結果は、移植された微小器官が、身体の内外の両方で協調方式にていくつもの重要な血管新生因子及びその他の細胞増殖因子を発現することを示している。さらに、生体内の実験で示されているように、微小器官は、血管新生因子及びその他の増殖因子を転写することによってのみならず、新しい血管の形成を誘発することによって真正のアンギオポンプ（ｇｅｎｕｉｎｅａｎｇｉｏｐｕｍｐ）として機能する。さらに、その誘発の程度は、形成される血管が、周囲の領域を灌注して、マウスやラットに人工的に誘発させた低酸素性組織領域を救出するのに十分な程度である。

下記実施例の章で述べるラットの虚血のモデルは、不可逆損傷が全く起こらないので慢性虚血に似ているようである。未処置の動物の場合、虚血は身体運動（ｅｘｅｒｔｉｏｎ）の後だけ現れた。恐らく、側副循環が、四肢を生存可能に保つのに十分であるが、追加の誘発（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）に直面したときに正常に機能させるには不十分である。微小器官の移植は、虚血領域への血液の供給を増大することによって、この症状を逆行させたようである。この試験結果は微小器官で処置したグループと対照グループとの間に有意な差を示しており、その差は疑いもなく、微小器官による血管新生及びその他の細胞増殖プロセスの誘発が原因である。

本願で提供されるマウスシリーズの生体内救助実験では、虚血障害が増大した。マウスは、ラットに比べて尾動脈の発達が低いため後脚への側副循環が劣っている。このグループでは、壊死や自己切断（ａｕｔｏａｍｐｕｔａｔｉｏｎ）などの急性の不可逆虚血損傷の徴候が対照グループに検出された。この知見は、本発明が救済法にも有用であることを示唆しているが、さらなる試験が必要である。

以下に示す追加の一連の試験では、すでに病気にかかっていた動物に虚血を誘発することによって、虚血の誘発を一層増大させた。やはり、不可逆の虚血損傷が、対照の動物にのみ起こった。対照動物に対する損傷は非常に重篤であったので、ストレステストは最高度であるとみなされた。試料の大きさが小さかったが差は顕著であった。これらの結果は、微小器官が、特定タイプの末梢血管の疾患に冒されている組織内にさえも血管新生及びその他の細胞増殖プロセスを誘発できることを示しているので特に重要である。

従って、本発明は、細胞増殖を刺激するために、虚血組織を救助するために及び／又は閉塞した血管のまわりに自然のバイパスを形成するために、宿主組織内に血管の形成及びその他の細胞プロセスを誘発し維持する方法と組成物を提供するものである。

本発明は、外来患者の環境で迅速かつ容易に投与できる生育可能な滅菌アンギオポンプを増殖し産生する方法及び組成物を提供するものである。アンギオポンプの調達、試験及び投与はこのように最も容易に達成することができ、あるいはまた同様に後の段階で投与するために貯蔵することができることは分かるであろう。

微小器官を製造し送達する新規の装置がさらに本発明によって提供されかつ開示される。この装置の詳細は下記実施例の章の実施例７に開示する。

本発明の追加の目的、利点及び新規な特徴は、下記実施例を考察すれば、当業技術者には明らかになるであろう。なおこれら実施例は本発明を限定するものではない。さらに、先に詳述されかつ本願の特許請求の範囲の項に特許請求されている本発明の各種実施態様と側面は各々、下記実施例の実験によって支持されている。

上記説明とともに、以下の実施例を参照して本発明を例示する。なおこれら実施例によって本発明は限定されない。

本願で使用される用語と、本発明で利用される実験方法には、分子生化学、微生物学及び組み換えＤＮＡの技法が広く含まれている。これらの技法は文献に詳細に説明されている［例えば以下の諸文献を参照されたい。「ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡｌａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ」Ｓａｍｂｒｏｏｋら１９８９年；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．編１９９４年「ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ」Ｉ〜ＩＩＩ巻；Ａｕｓｕｂｅｌら著１９８９年「ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ」ＪｏｈｎＷｉｌｅｙａｎｄＳｏｎｓ，米国メリーランド州バルチモア；Ｐｅｒｂａｌ著「ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＧｕｉｄｅｔｏＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ」ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，米国ニューヨーク１９８８年；Ｗａｔｓｏｎら、「ＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＤＮＡ」ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＡｍｅｒｉｃａｎＢｏｏｋｓ、米国ニューヨーク；Ｂｉｒｒｅｎら編「ＧｅｎｏｍｅＡｎａｌｙｓｉｓ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌＳｅｒｉｅｓ」１〜４巻、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ、米国ニューヨーク１９９８年；米国特許の４６６６８２８号、４６８３２０２号、４８０１５３１号、５１９２６５９号及び５２７２０５７号に記載される方法；Ｃｅｌｌｉｓ，Ｊ．Ｅ．編「ＣｅｌｌＢｉｏｌｏｇｙ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＨａｎｄｂｏｏｋ」Ｉ〜ＩＩＩ巻１９９４年；Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｊ．Ｅ．編「ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」Ｉ〜ＩＩＩ巻１９９４年；Ｓｔｉｔｅｓら編「ＢａｓｉｃａｎｄＣｌｉｎｉｃａｌＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（第８版）、Ａｐｐｌｅｔｏｎ＆Ｌａｎｇｅ、米国コネティカット州ノーウォーク１９９４年；ＭｉｓｈｅｌｌとＳｈｉｉｇｉ編「ＳｅｌｅｃｔｅｄＭｅｔｈｏｄｓｉｎＣｅｌｌｕｌａｒＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、Ｗ．Ｈ．ＦｒｅｅｍａｎａｎｄＣｏ．、米国ニューヨーク１９８０年；また利用可能な免疫検定法は、例えば以下の特許と科学文献に広範囲にわたって記載されている。米国特許の３７９１９３２号、３８３９１５３号、３８５０７５２号、３８５０５７８号、３８５３９８７号、３８６７５１７号、３８７９２６２号、３９０１６５４号、３９３５０７４号、３９８４５３３号、３９９６３４５号、４０３４０７４号、４０９８８７６号、４８７９２１９号、５０１１７７１号及び５２８１５２１号；Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．編「ＯｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓ」１９８４年；Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．及びＨｉｇｇｉｎｓＳ．Ｊ．編「ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」１９８５年；Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．及びＨｉｇｇｉｎｓＳ．Ｊ．編「ＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｎｄＴｒａｎｓｌａｔｉｏｎ」１９８４年；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．編「ＡｎｉｍａｌＣｅｌｌＣｕｌｔｕｒｅ」１９８６年；「ＩｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄＣｅｌｌｓａｎｄＥｎｚｙｍｅｓ」ＩＲＬＰｒｅｓｓ１９８６年；Ｐｅｒｂａｌ，Ｂ．著「ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＧｕｉｄｅｔｏＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ」１９８４年及び「ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」１〜３１７巻、ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ；「ＰＣＲＰｒｏｔｏｃｏｌｓ：ＡＧｕｉｄｅＴｏＭｅｔｈｏｄｓＡｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ、米国カリフォルニア州サンディエゴ１９９０年；Ｍａｒｓｈａｋら、「ＳｔｒａｔｅｇｉｅｓｆｏｒＰｒｏｔｅｉｎＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ−ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＣｏｕｒｓｅＭａｎｕａｌ」、ＣＳＨＬＰｒｅｓｓ、１９９６年；なおこれらの文献類は、あたかも本願に完全に記載されているように援用するものである］。その外の一般的な文献は、本明細書を通じて提供される。本明細書に記載の方法は当業技術界で周知であると考えられ、読者の便宜のために提供される。本明細書に含まれるすべての情報は本願に援用するものである。

実施例１
微小器官
材料と実験方法
動物実験の認可は、ヘブライ大学のｔｈｅＡｎｉｍａｌＣａｒｅａｎｄＵｓｅＣｏｍｍｉｔｔｅｅｏｆｔｈｅＦａｃｕｌｔｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅから得た。

微小器官の調製：
成熟動物（Ｃ５７Ｂｌ／６マウス又はＳｐｒａｇｕｅＤａｗｌｅｙラット）をＣＯ_２で窒息させて殺し次いで肺臓を滅菌条件下で取り出した。その肺臓を氷上に保持し、次にリンゲル液又は４．５ｇ／ｌＤ−グルコース含有ＤＭＥＭで一回すすいだ。その肺臓をＳｏｒｖａｌｌ組織チョッパーで刻んで幅が約３００μｍの小片にすることによって微小器官を調製した。その微小器官を、５００単位／ｍｌのペニシリン、０．５ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン及び２ｍＭのＬ−グルタミン（ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）を含有するＤＭＥＭで２回すすぎ次いで使用するまで氷上に保持した。

微小器官の移植：
体重１ｇ当たり０．６ｍｇのナトリウムペントバルビトールを使用して、成熟Ｃ５７Ｂｌ／６マウスを麻酔した。マウスの毛をそって、胃の上方の領域の皮膚に長さが約２ｃｍの切開部分を作った。止血鉗子を使用して、前記切開部分の両側に皮下「ポケット」をつくり、８〜９個の微小器官を各ポケットに移植した。なお移植は、微小器官を筋肉層の上に単に層状に挿入することによって行った。切開部を縫合し、次にこれら動物を暖かくて明かりをつけた部屋に数時間保持し、次いで動物ハウスに移した。４頭の動物を、移植を行った後、４時間後、２４時間後、７２時間後又は７日後に殺し、移植した微小器官を、外科顕微鏡下でまわりの組織から切り離してＲＮＡを抽出するのに利用した。その抽出したＲＮＡを逆転写させ、得られたｃＤＮＡを、標準の方法を利用して、ＰＣＲ分析用の鋳型として使用した。そのＰＣＲ反応に利用したオリゴヌクレオチドプライマーの配列、予想される産物の大きさ及び関連事項を下記表２に示す。

＊約３２０ｂｐの別の分離したバンドが検出されることが多い。なおこのバンドの起源は不明である。＊＊プライマー（Ａｎｇ１）又はプライマー配列（ＶＥＧＦ）はご親切に、イスラエルのＥｌｉＫｅｓｈｅｔ教授から提供していただいた。＊＊＊ＶＥＧＦｍＲＮＡは選択的スプライシングを受ける。ＰＣＲ産物の大きさは、ＶＥＧＦ_１２１の場合４４４ｂｐであり、ＶＥＧＦ_１６５の場合５７３ｂｐであり、そしてＶＥＧＦ_１８９の場合６４５ｂｐである。＊＊＊＊Ｉｂｒａｈｉｍら、ＢｉｏｃｈｉｍｉｃａｅｔＢｉｏｐｈｙｓｉｃａＡｃｔａ１４０３巻２５４〜２６４頁１９９８年。

濃度測定分析（ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｒｉｃａｎａｌｙｓｉｓ）と定量：
各ＰＣＲ反応生成物１０μｌずつを、臭化エチジウムで染色した１．５％アガロースゲル中に電気泳動させた。得られたゲルを、ＭａｃｉｎｔｏｓｈＣｅｎｔｒｉｓ６６０ＡＶコンピュータ、及びＴｏｙｏＯｐｔｉｃｓＴＶズームレンズ（７５〜１２５ｍｍ、Ｆ＝１．８、Ｃｏｌｋｉｎオレンジ０２フィルター付き）を具備するＦｕｊｉｆｉｌｍＴｈｅｒｍａｌＩｍａｇｉｎｇＳｙｓｔｅｍを利用して画像にした。濃度測定分析は、パブリック・ドメイン・ソフトウェアのＮＩＨ１．６１分析ソフトウェアを使用して実施した。定量は、各ＰＣＲ産物の発現レベルを、β−アクチンの場合に得られたものに正規化することによって行った。ＰＣＲ反応はすべて２回ずつ行った。各種ＶＥＧＦアイソフォームの相対発現レベルの統計的分析を、移植の前後の非対試料について、ウェルチのｔ−検定法を使って平均値を比較することによって行った。

虚血組織の救助実験：
１〜４ヶ月齢で体重が２００〜３００ｇの３２頭のＳｐｒａｇｕｅＤａｗｌｅｙラットを利用した。各ラットの左総腸骨動脈を結紮し、腸骨分岐部のすぐ近位側の大動脈分岐部に、体重１ｇ当たり０．９〜１．１ｍｇのペントタールを使用して麻酔したラットから切りとった。１６頭のラットに、虚血を誘発してから各々２４時間後に３〜４個の微小器官を移植した。これらの微小器官は、筋肉内と皮下に、大腿動脈にそって（内側に）及び坐骨神経にそって（外側に）移植した。残りの１６頭のラットには、虚血を誘発してから２４時間後に疑似移植（ｓｈａｍｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）を行った。

１〜３ヶ月齢で体重が１９〜２７ｇの２６頭のＣ５７Ｂｌ／６マウスも試験した。麻酔をかけたマウスの左総腸骨動脈を結紮して、腸骨分岐部のすぐ近位側の該動脈分岐部で切り取った。３〜４個の微小器官を、各マウスに、虚血を誘発してから２４時間後に移植した。９頭のマウスは、筋肉内と皮下に、近位左後足の大腿骨動脈にそって（内側に）及び坐骨神経にそって（外側に）移植された。１７頭の対照マウスは、虚血誘発後、移植するために準備したが移植は行わなかった。手術中に静脈又は神経を損傷した動物及び著しく出血した動物は試験から除外した。

２２ヶ月齢で体重が２４〜２８ｇの７頭の老Ｃ５７Ｂｌ／６マウスも、先に述べたのと同様に、左総腸骨動脈の結紮と切取りを行った。３頭には、健常の同系マウスから取り出した微小器官を、直ちに移植した。４頭には直ちに疑似移植を行った。手術中に、静脈もしくは神経の損傷又は著しい出血はなかった。

機能検定：
動物は、移植後、第一日目と第二日目に、神経の損傷を除外するために試験を行った。この試験は、動物が浮かんだままでいるためにはすべての四肢を常に動かしている必要があるように水位を設定された微温の水浴で、動物を泳がせることからなる試験である。運動の時限を徐々に増大した。第一週中は、浮かんだままでいようとする努力が失われるまでの時限を３分間とした。第二週中、その時限を５分間まで上げたが、第三週から、時限はさらに６分間にした。跛行度を評価するため０から１０までの尺度を作った。０〜１の得点は正常又は正常に近い歩行を示す。２〜３の得点は体重を正常に支持する軽い（ｓｌｉｇｈｔ）かないしは中位の跛行を意味する。４〜５の得点は、体重支持に障害がある中位の跛行を示す。６〜７の得点は過酷な跛行を示す。

８〜９の得点は、機能しない四肢、萎縮又はれん縮を示し、そして得点１０は壊死又は自己切断（ａｕｔｏａｍｐｕｔａｔｉｏｎ）を意味する。これらの得点は、実験に参画しておらずかつその前の動物の処置を知らない独立した観察者が与えた。

血管造影：
移植後、４日目、１４日目、２６日目と３１日目に何頭かのラットの血管造影を行った。これらのラットは先に述べたのと同様に麻酔をかけて、Ｐ１０カテーテルを、右表在大腿動脈を通じて導入して、大動脈中に配置した。１ｃｃＴｅｌｅｂｒｉｘのボーラス移植液を注射して、０．５秒間毎に写真を撮影した。血管造影を行った動物は、その後、試験グループから除外した。

実験結果
移植された微小器官は血管新生を誘発する：
図１は、移植された微小器官に対する周囲組織の反応を示す。微小器官は、同系動物の皮下に移植すると、その微小器官の方に（図１の矢印）血管新生反応を誘発する。主要血管が生成し、分枝してより細い血管になって、移植された微小器官を囲む毛細血管のネットに枝分かれしている。

微小器官は、同系マウスの皮下に移植されると、血管新生因子の持続性の動的アレイ（ｓｕｓｔａｉｎｅｄａｎｄｄｙｎａｍｉｃａｒｒａｙ）を転写する。図２は、微小器官から抽出したＲＮＡについて行ったＲＴ−ＰＣＲ分析によって確認された、いくつかの既知の血管新生因子の代表的な半定量的分析の結果を示す。上記結果から分かるように、血管新生因子の強い誘発が、移植後（ＰＩ）４時間の時点で起こっている。この初期誘発に続いて、個々の因子は各々、以下に詳述するように異なる発現パターンをとる。

ＶＥＧＦ：ＶＥＧＦの転写レベルは、ＰＩ２４時間まで上昇し続けた。ＰＩ３日目に、ＶＥＧＦの転写レベルが低下する。その後の数日間、この血管新生因子の低いｍＲＮＡレベルが検出されたが、このレベルは、このようにして形成された新しい血管新生状態を維持するために恐らく必要である。ＰＩ７日目に、ＶＥＧＦｍＲＮＡは、移植の時点（ｔ_０）で、微小器官に検出されたのと類似のレベルに戻った。

アンギオポエチン１：Ａｎｇ１ｍＲＮＡのレベルは、最初のＰＩ４時間には増大したが変動が大きかった。ＰＩ１日目〜３日目に、転写は、移植の時点（ｔ_０）の微小器官について検出されたレベルより一層低いレベルまで低下した（Ｍａｉｓｏｎｐｉｅｒｒｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２７７巻５５〜６０頁１９９７年；ＧａｌｅとＹａｎｃｏｐｏｌｏｕｓ１９９９年の前掲文献参照）。ＰＩ７日目に、Ａｎｇ１のｍＲＮＡは、ｔ_０の時点で検出されたのと類似のレベルまで戻った。

アンギオポエチン２：Ａｎｇ２（Ａｎｇ１のアンタゴニスト）は、ＰＩ２４時間にて、高レベルで転写された。ｍＲＮＡのレベルはＰＩ３日目と７日目に低下したが、これらのレベルはｔ_０において検出されたレベルより依然として高かった。これは恐らく、移植された微小器官中及びそのまわりに血管が再形成されているためである。

したがって、これらの結果から明らかなように、移植された微小器官は、血管新生の制御に関与している因子すなわちスティミュレーターとインヒビターの両者の動的アレイを転写する。移植された微小器官のまわりの新しい血管の生成に関与するこの転写パターンは、少なくともＰＩ１週間の期間にわたって維持される。

微小器官は、培養されると、血管新生因子の持続性の動的アレイを転写する：
微小器官がエクスビボで培養されたときに、血管新生因子を転写する性能を確認するため、上記のようにして調製した微小器官を、１ヶ月にわたる期間、血清なしで増殖させた。試料を各種の時点で取り出して、いく種類もの因子のｍＲＮＡのレベルを検定した。図４は、培養した微小器官から抽出したＲＮＡについて行ったＲＴ−ＰＣＲで確認されたいくつもの既知の血管新生因子（図３）の代表的な半定量分析の結果を示す。図３と４に示されているように、血管新生因子発現の強い誘発が、培養をはじめて４時間後に起こっている。この初期誘発に続いて、異なる因子は各々、以下に詳細に説明するように、異なる発現パターンを示している。

ＶＥＧＦ：ＶＥＧＦの発現レベルは、培養をはじめてから２４時間上昇し続けた。培養してから３日目にＶＥＧＦの発現レベルは低下したが、ＰＩ７日目に再び上昇した。その後の数日は、ＶＥＧＦの発現レベルが、低下し、次いで培養開始の時点で微小器官が発現したレベルと類似のレベルまで戻る。

アンギオポエチン１：Ａｎｇ１発現のレベルは、培養をはじめて最初の４時間は増大したが、変動が大きかった。培養をはじめてから１日目〜３日目は発現が、培養の時点で検定したレベルよりさらに低いレベルまで低下した。培養をはじめてから７日目に、Ａｎｇ１の発現は、培養の時点のレベルに類似のレベルまで戻った。

アンギオポエチン２：Ａｎｇ２（Ａｎｇ１のアンタゴニスト）は、培養をはじめて第１日中、高レベルで発現された。この発現レベルは、培養をはじめてから３日目と７日目に低下したが、培養の時点の発現レベルより依然として高い。

これらの試験結果から明らかなように、身体外で培養される微小器官は生体外で１ヶ月にわたって生存可能でかつ機能し、血管新生の制御に関与するスティミュレーターとインヒビターの両者を含む血管新生因子の動的アレイを発現する。

微小器官を移植すると、ラットとマウスの四肢の虚血を逆行させる：
シリーズ１：３２頭のラットの左総腸骨動脈を先に述べたのと同様にして結紮して切り取った。これらラットのうち１６頭に微小器官を移植し、残りの１６頭のラットは対照群（疑似手術）として利用した。３２頭のラットはすべて手術後、生存していた。身体運動を行う前は、これら２群の間に有意差は検出されなかった（図５）。身体運動を行った後、有意差が検出された。すなわち、対照群の累積平均跛行得点は４．８であったが一方微小器官を移植された群の得点は１．６であった（図６）。類似の結果が、試験期間全体を通じて記録された。対照群の得点は、手術後（ＰＯ）６〜１０日では５であり、ＰＯ１１〜１５日では５であり、そしてＰＯ１７日では４であった。微小器官を移植された群の得点はそれぞれ１．６７，１．５及び１．７であった。微小器官移植群には平均得点が６．５のラット一頭が含まれていたことに注目すべきである。組織学的検査の結果、このラットに移植した微小器官は壊疽器官であることが明らかになった。

シリーズ２：２６頭の若いＣ５７Ｂｌ／６マウスを、手術による損傷又は手術前の死亡なしで先に述べたようにして手術した。これらのマウスのうち９頭に微小器官を移植し、残りの１７頭は対照（疑似手術）として利用した。１７頭の対照マウスのうち４頭が、虚血誘発四肢に壊疽を発生してＰＯ２〜３日目に死んだ（２３．５％）。この群の他の一頭のマウスが、手術後８日目に、萎縮した一本の肢の自己切断が起こった（５．９％）。微小器官を移植したマウスには、壊疽、自己切断又は手術後の死は全く発生しなかった（０％）。対照群の身体運動後の平均累積跛行得点は６であり、各得点は、ＰＯ５〜９日では７．７で、ＰＯ１３〜１９では６．２で、そしてＰＯ２１〜２５日では４．１であった。微小器官移植群の平均累積跛行得点は２．４であり、各得点は、ＰＯ５〜９日では１．８で、ＰＯ１３〜１９日では２．２であり、そしてＰＯ２１〜２５日では３．１であった（図７）。

微小器官の移植によって、老マウスの虚血四肢が救助される：
ステージ３：７頭の老齢Ｃ５７Ｂｌ／６マウスの手術を行ったが、手術による損傷又は死亡はなかった。３頭のマウスに微小器官の移植を行い、４頭のマウスは対照として利用した。対照群のうち１頭は壊疽を発生してＰＯ３日目に死亡し（２５％）、１頭はＰＯ５日目に一本の萎縮肢の自己切断を起こした（２５％）。残りの２頭のマウスは、四肢が全く機能せず静止していた（跛行指数の得点は８であった）。微小器官を移植したマウスはいずれも壊疽又は自己切断を全く起こさず（０％）、１週間目の時点の平均跛行得点は５．７であった。

移植された微小器官は生存可能であり血管を新生する：
サンプリングしたラットの試料において、微小器官移植片は生存可能であり、かつその構造が保存されかつ拒絶の証拠は全くなかった。微小器官と周囲の筋肉組織に、肉眼で見える血管が新生した。

血管造影は、微小器官移植ラットの血管新生活性を明確に示す：
ＰＯ４日目、１４日目、２６日目及び３１日目に血管造影を行った。微小器官で処置した群と対照群の間には、微小であるが検出可能な差があった。移植をうけた四肢に増大した血管新生活性の証拠は、ＰＯ４日目という早期に検出された。大きさが中位の新しい血管が、移植をうけた四肢に、ＰＯ１６日目に目視できた。

実施例２
脾臓の微小器官
マウスの脾臓の微小器官を、先に述べたのと同様にして調製して、同系のマウスに移植した。図８は、同系のマウスの皮下に移植し、移植してから６ヶ月後の時点で検査した微小器官（矢印）を示す。図８に明瞭に示されているように、該微小器官は血管新生を誘発した。実際に、形成された血管のパターンは、その微小器官が宿主の固有器官であったという印象を与えている。

実施例３
微小器官の角膜への移植
角膜は、血管を欠いている身体の唯一の組織である。それ故、角膜は血管新生を試験するのに優れたモデル組織である。ラット肺臓の微小器官を、同系ラットの角膜に移植した。図９に示すように、最も顕著な血管新生パターンがこの角膜にも誘発された。これらの顕著な試験結果は、やはり、微小器官が血管新生を誘発し促進するのに有効であることを立証している。

実施例４
Ｃ５７ＢＬマウスに移植したマウス皮膚ＭＯ
材料及び実験方法：
成熟Ｃ５７ＢＬマウスにペントバルビタールナトリウムを使って麻酔をかけた。そのマウスの毛を剃って、腹部中央の皮膚を約１ｃｍの長さにわたって切開した。止血鉗子を使って切開部分の両側に皮下ポケットをつくり、先に述べたようにして調製した約１０個の皮膚ＭＯ（ＳＭＯ）を、各ポケット内に並列状態で（それらＭＯの面が全組織層に暴露されるように）配置した。その切開部分を、手術用縫合糸を使って閉じた。移植してから１日、３日、７日及び３０日後に、それら被検マウスを殺し、次いでＳＭＯを外科用顕微鏡下で周囲の組織から切り取った（図１９Ａ〜Ｃ）。１０個のＭＯをゼロ時点で採取した。

局所血流の確認：
ＳＭＯを移植されたマウスにペントバルビトールナトリウム（０．０６ｍｇ／ｇ体重）を使って麻酔をかけて、ヘパリン添加食塩水（２０Ｕ／ｍｌ）を充填された、血管に挿入する部分を細くしたＰＥ−１０チュービングを右頚動脈にカニューレ挿入した。このチュービングを利用して、１０^５個のポリスチレンイエロー−グリーン蛍光マイクロスフェア（直径１５μｍの分子プローブ）を左心室に注射し、このマイクロスフェアの注射に続いて０．１５ｍｌの食塩水を左心室に３０秒間かけてゆっくり注射した。

そのマイクロスフェアは、移植された皮膚微小器官全体にわたって分布されていることが発見され、これは血液がＳＭＯ中に流入し、血管網がさらに全組織にわたって拡大したことを示している（図２０Ａ）。

実施例５
加齢のモデル
個体が年を重ねると、アテローム性動脈硬化症などの心臓血管と末梢血管の疾患の危険が増大し、一方、とりわけ創傷の治癒に寄与する再生能力が減退することは周知の事実である。

この危険の増大と再生能力の減退に寄与する一要因は、血管新生を刺激する身体の能力の減退である。

この原理を証明するため、老マウス由来のＳＭＯと若いマウス由来のＳＭＯとを被検宿主の血管新生を刺激する性能について比較した。

材料と実験方法：
ＲＮＡの抽出とｃＤＮＡの合成：Ｅ，Ｃ．Ｊ．編「Ｃｅｌｌｂｉｏｌｏｇｙ：ａｌａｂｏｒａｔｏｒｙｈａｎｄｂｏｏｋ」（ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，ｖｏｌ．１，ｐｐ．６８０〜６８３Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ）のＣｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ，Ｐ．（１９９４）の論文に記載の酸−グアニジン−フェノール法を使って、全ＲＮＡを等量の皮膚ＭＯから抽出した。さらに、例えばＰｒｏｍｅｇａＵＳＡから入手したポリ−ｄ（Ｔ）_{１２−１８}プライマー及び例えばＰｒｏｍｅｇａＵＳＡから入手したＭｏｌｏｎｅｙマウス白血病ウイルス逆転写酵素を使って、ｃＤＮＡを１〜２μｇの全ＲＮＡから合成した。

逆転写（ＲＴ）のＰＣＲ分析：
１μｌのｃＤＮＡの試料のＰＣＲ増幅を、１．５ｍＭのＭｇＣｌ_２中で行った。ＰＣＲのサイクル数は全血管新生因子については３６であるがアクチンは２４サイクルで増幅した。各一連のプライマーについては、ゼロ時点で抽出した肺のＭＯのｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡを使って行う正の対照のＰＣＲ反応及び鋳型無しで行う負の反応を実施した。前記表２に記載したのと同じプライマーを使用した。

実験結果：
Ｃ５７ＢＬマウスの体内のマウス皮膚ＭＯ（ＳＭＯ）移植体：前記負の対照は検出可能な信号を発しなかった。皮膚ＭＯは、すべての被検血管新生因子（Ａｎｇ１、Ａｎｇ２、ＨＧＦ、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦの３種のアイソフォーム、Ｅｐｈｒｉｎ３ｂ及びＭｅｆ２Ｃ）を転写し、肺のＭＯとは幾分異なる発現機構を示した。さらに皮膚ＭＯの血管新生誘導活性は、肺ＭＯが示すのと少なくとも等しく強力であった。

老マウス（２年齢）と若いマウス（２ヶ月齢）から調製したＳＭＯの血管新生性を、若いマウスに移植してから１ヶ月後に比較したところ、老マウス由来のＳＭＯに血管形成の減少は全く検出できなかった（図２１Ａ〜Ｂ）。

さらに、老マウス（２年齢）と若いマウス（２ヶ月齢）から調製したＳＭＯの血流を、若いマウスに移植してから２週間後に比較したところ、老マウス由来のＳＭＯを移植されたマウスの血流は、若いマウス由来のＳＭＯを移植されたマウスより高くないにしても同等に高い量であった（図２２Ａ〜Ｂ）。

したがって、老マウスから調製したＳＭＯが、血管新生を誘発する性能を失わなかったことは明らかである。

実施例６
ウサギに対する皮膚ＭＯの移植
この試験では、上記方法を利用してウサギに血管新生を刺激する。ウサギは大きい動物であるから、ウサギを使ってヒトの血管新生誘発のプロセスをより正確にモデル化できる。

材料と実験方法：
各々体重が約２．５ｋｇのウサギに麻酔をかけ次いで腹部中央から皮膚片を切り取り、マウスのＳＭＯについて先に述べたのと類似の方法でＳＭＯを調製するのに使用した。４個のＳＭＯを、ウサギの各脚部の筋肉組織内に一直線上に５〜８ｍｍの間隔をとって移植した。移植してから７日後、先に述べたマイクロスフェアと方法を使って、血流分布の検定を各ウサギに実施した。

実験結果：
図２３Ａ〜Ｇに示すように、注射したマイクロスフェアは移植されたＳＭＯ全体に分布していることが発見されたが、これは血液がＳＭＯに流入して血管網が全組織にわたってさらに拡大したことを示している。

さらに、移植されていない筋肉組織に見られたビーズの平均量（図２３ＡとＧ）はＳＭＯを移植された筋肉組織（図２３Ｂ〜Ｆ）よりはるかに少なかった。

血流量を測定した後、単一のＳＭＯを取り出し、そのＳＭＯに直接到達している局所血流量をそのＳＭＯの蛍光強度を測定することによって測定した。負の対照の生存できないＳＭＯは検出可能な蛍光を全く生じないことが発見され、蛍光を発するビーズは死んだＳＭＯ内には全く観察されなかった。対照的に、図２４に示すように、単一の生存可能なＳＭＯは、受容被検ウサギに移植してから７日後に観察された有意な数のグリーン蛍光のビーズで例証されているように有意な量の血管形成を誘発した。

実施例7
微小器官の作製と送達を行う第一装置
本発明はまた、哺乳類の組織内に血管新生を誘発させるアンギオポンプなどの微小器官を作製し送達する装置に関する。

さらに図面を見ると、図１０Ａは、本発明の好ましい実施態様の微小器官を作製し送達する第一装置１０を図式的に示す。第一装置１０は、
ｉ．組織の生検試料を得るため使用する組織スクレーパー２０、
ｉｉ．組織の生検試料を複数のフラグメントに切断して微小器官を作製する組織切断器４０、及び
ｉｉｉ．移植チャンバー７０内に配置されかつ第一装置１０に取り外し可能に連結され、第一装置１０に連結されているときは単一の微小器官を受け取りそして第一装置１０から外された後、微小器官を被検者に移植する（図示せず）少なくとも一つの移植器６０、
を備えている。

さらに、第一装置１０は、ケーシング２２、ベース２１Ａ及びランプ２１Ｂを備えており、これらはともに密閉できる封入体を形成している。第一装置１０は好ましくは、幅が約１００ｍｍで長さが約３００ｍｍである。この寸法より幾分大きいか又は小さい寸法も可能であることは分かるであろう。

さらに図面を参照すると、図１０Ｂは第一装置１０の制御システム１２を図式的に示している。制御システム１２は、ＰＣコンピュータ、卓上コンピュータ、パームコンピュータなど、又はプロセッサ及び好ましくはメモリを備えた第一装置１０の専用制御システムでもよい。制御システム１２は好ましくは、いくつものノブもしくはボタン１４、キーボード１１、対話型表示パネルを有する表示パネル１５、システムが作動していることを示す少なくとも一つのライト１６、例えば温度が推奨値を超えたこと又は移動機構が作動しなくなっていることを示す１もしくは２以上の警告灯１７、及び予め定められた順序のタスクを実行もしくは記録するためのディスケット駆動装置、ＣＤ駆動装置、ミニディスク駆動装置などのような読み込みと好ましくは書き込みを行う装置９を有する制御パネル１３を備えている。さらに制御システム１２は、複数の装置１０をいつでも同時に制御できる。１又は２以上の装置１０と制御システム１２の間の通信は有線でも無線でもよい。

あるいは制御システムは全く使わないが、第一装置１０のいくつかの機能は自動化され第一装置１０のノブ３８で制御される（図１０Ａ）。あるいは又はさらに、ボタン又はスイッチ３８などを第一装置１０に使用できる。

さらに図面を参照すると、図１１と１２は図１０Ａとともに、本発明の好ましい実施態様による組織スクレーパー２０を図式的に示す。組織スクレーパー２０は、例えばＲｏｂｂｉｎｓＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓＩｎｃ．又はＡｅｓｃｕｌａｐ（登録商標）が製造しているような標準の手動で操作されるダーマトーム又は類似の好ましくは電気ダーマトームでよい。

組織スクレーパー２０は好ましくは、分層厚さの皮膚（ｓｐｌｉｔ−ｔｈｉｃｋｎｅｓｓｓｋｉｎ）生検試料（ＳＰＳ）２５をスクレープするように構成されたスクレーピング刃２４（図１２）を備えている。分層皮膚生検試料は、通常、例えば市販のダーマトームで、予め定められた厚さの平坦な器官の移植体を、器官の表面に平行に切断することによって得られる。刃の位置が、平坦な生検試料の切断深さしたがって厚さを決定する。各種厚さのＳＰＳのいくつかの図が文献にみられる（例えば、ＫｏｎｄｏＳ．，ＨｏｚｕｍｉＹ．，ＡｓｏＫ．，「Ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍｏｒｇａｎｃｕｌｔｕｒｅｏｆｒａｂｂｉｔｓｋｉｎ：ｅｆｆｅｃｔｏｆＥＧＦｏｎｅｐｉｄｅｒｍａｌｓｔｒｕｃｔｕｒｅｉｎｖｉｔｒｏ」Ｊ．ＩｎｖｅｓｔＤｅｒｍａｔｏｌ．１９９０Ｏｃｔ；９５（４）：３９７〜４０２参照）。

さらに組織スクレーパー２０はケーシング２２とランプ２１Ｂを備えている。ケーシング２２は移動可能な部分１８を有し、その部分は矢印２３で示すように上下できる。その移動可能部分は、上げると、ＳＰＳ２５を導入するウインド１９（図１１）を露出させる。さらに、移動可能部分１８はギロチン様刃２６を備え、その刃を下げるとＳＰＳ２５が身体から切断される。移動可能部分１８の移動は、手動によるか又は制御システム１２によって制御されるか又は第一装置１０のスイッチ類３８の一つで行われる。

好ましくは、スクレーピング刃２４は、ＳＰＳ２５を、好ましくは６〜８ｍｍの幅Ａで切断するように構成されている（図１１）。ＳＰＳ２５の長さＢは約２ｃｍである（図１０Ａ）。ＳＰＳ２５の厚さＣは約１．０〜１．４ｍｍであり、好ましくは少なくとも約６５０ミクロンである（図１１）。予め決められた幅Ａのスクレーピング刃２４を選択しそして予め定められた長さをスクレープした後ギロチン様刃２６を下げることによって、幅Ａと長さＢの両方を予め決めることができる。さらに、スクレーピング刃２４とランプ２１Ｂ間の距離Ｒを調節することによって厚さＣを予め決めることができる。換言すれば、刃２４の高さを２１Ｂに対して上下してＳＰＳの厚さを調節できる。スクレーピング刃２４は例えば異なる幅Ａを作り出す刃と取り替えることができることは分かるであろう。あるいは又はさらに、刃２４は切れ味が悪くなったときに取り替えることができる。

好ましくは、ＳＰＳ２５をスクレープする身体の領域２７（図１１）は患者の腹部である。あるいは領域２７は腕の背部、臀部、腰部又は他の領域でもよく、これら領域は一般に露出されておらずかつ毛髪は一般に剃りとられる。ＳＰＳ２５は患者以外のドナーとして活動する別の人から採取できることは分かるであろう。さらに、ＳＰＳ２５は、霊長類、ブタ例えば全面的に又は部分的に近交交配されたブタ（例えばミニアチュアブタ及びトランスジェニックブタ）、げっ歯類などの哺乳類から採取できることは分かるであろう。

スクレープする前に、領域２７は標準の外科の方法に則って剃り徹底的に洗浄し次いで滅菌消毒する。同様に第一装置１０は徹底的に滅菌する。好ましい実施態様で、第一装置１０は使用後、廃棄される。

図１１で分かるように、スクレーピング操作は手動の操作である。オペレーターの手８が第一装置１０を領域２７の方に押して組織生検試料をスクレープする。

図１２で分かるように、移動可能部分１８が下がりそしてギロチン様刃２６がＳＰＳ２５を切断すると、密閉された封入体３０がＳＰＳ２５の周りに形成される。ローラ２９に配置された少なくとも二つのコンベヤベルト２８（図１０Ａ）は、ＳＰＳ２５をヒトの接触なしで密閉封入体３０中に移送する。ＳＰＳ２５を移送する他の自動装置、例えば幅がＳＰＳ２５の幅Ａより広い幅広コンベアベルトを使用できることは分かるであろう。あるいは移動架台の上に安座させた剛性プラットホームも使用できる。あるいは、知られているようにＳＰＳ２５の他の自動移送装置も利用できる。ＳＰＳ２５の密閉封入体３０内への移送は制御システム１２で制御することが好ましい。あるいは、この移送は第一装置１０のスイッチ類３８の内の一つで制御される。あるいは、コンベアベルト２８は、ワインディングハンドル（ｗｉｎｄｉｎｇｈａｎｄｌｅ）又は類似の装置によって手動で制御できる。

さらに、図１２で分かるように、第一装置１０は、洗浄溶液のディスペンサー３２、入口３５及び排液口３４を有する洗浄装置３１を備えている。ディスペンサー３２は、適正な洗浄溶液３６をＳＰＳ２５の上に吹き付けてＳＰＳ２５を徹底的にすすぐ。洗浄溶液３６としては、例えば５００単位／ｍｌのペニシリン、０．５ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含有する標準培養培地ＤＭＥＭがある。洗浄溶液３６は、入口３５を通じてディスペンサー３２に入れそして排液口３４から廃棄する。こうして、すすぎはＳＰＳ２５の頂部から行われる。ＳＰＳ２５をすすぐ他の装置も利用できることは分かるであろう。例えば、複数のスプリンクラーを使ってＳＰＳ２５に噴霧することができる。あるいは、ＳＰＳ２５を予め定められた時間、洗浄溶液３６の浴中ですすいでもよい。ＳＰＳ２５のすすぎは制御システム１２で制御することが好ましい。あるいは、それは第一装置１０のスイッチ３８の一つによって制御される。あるいは、第一装置１０を手動によって洗浄溶液３６で満たし次いで洗浄溶液３６によるすすぎと洗浄溶液の廃棄は重力で行う。

図１０Ａに見られるように、すすぎに続いて、ローラ３９で作動する少なくとも一つの第二コンベヤベルト４２そして好ましくは二つの第二コンベヤベルト４２が、好ましくは無菌でかつ好ましくはヒトが直接介入することなく、ＳＰＳ２５を組織切断器４０に移送する。先に述べたように、ＳＰＳ２５を移送する他の自動装置も使用できることは分かるであろう。同様に、制御システム１２，スイッチ類３８の内の一つ又は手動制御器を使って、ＳＰＳ２５を組織切断器４０に自動的に移送できる。

図面を参照すると、図１３Ａ〜１３Ｂ、１４Ａ〜１４Ｄは図１０Ａとともに、本発明の好ましい実施態様の組織切断器４０を図式的に示す。

図１０Ａと１３Ａで分かるように、組織切断器４０において、コンベヤベルト４２がＳＰＳ２５を領域４１に移送し、その領域でＳＰＳ２５は、一直線に配列されて微小器官ガイド５４を形成している複数のロッド５４で支持されている。微小器官ガイド５４は好ましくは、内径が約０．４ｍｍで長さが約１６ｃｍである医療グレードのポリカーボネートで製造される。微小器官ガイド５４の内径は約０．４ｍｍで長さは約１５〜１６ｃｍである。寸法の価は幾分大きいか又は小さい価でもよいことは分かるであろう。

図１４Ａ〜１４Ｂで分かるように、微小器官ガイド５４は、円形断面の第一セクション５６及び半円形として形成されかつ凹面形の内面６２を有する第二セクション５８を有している。セクション５６と５８の両者は中実又は中空でもよいことは分かるであろう。しかし、本発明の好ましい実施態様では、セクション５６は中空でありセクション５８は中実である。さらに微小器官ガイド５４は、位置マーカー６８、ノッチ６４及び遠位端縁５９を備えている。位置マーカー６８とノッチ６４の目的は、図１７Ａ〜１７Ｅを参照して以下に説明する。ＳＰＳ２５を支持する領域４１は、半割りロッド５８で形成され、微小器官に切断される前のＳＰＳの中実で平坦な又は好ましくは凹面形の支持体を提供する。

さらに、図１３Ａと１３Ｂから分かるように、組織切断器４０は、ハンドル４８によって手動で操作される移動式架台４６の上に配置された複数の平行な外科グレードの刃４４を備えている。レバー４８がスリット窓５０を通じてケーシング２２から突出し、この窓によって、架台４６を手動で制御することができ、さらにその最大行程を規定できる。架台４６は、好ましくはまっすぐな端縁４５にそって摺動する。本発明の別の実施態様では、架台４６の行程は、制御システム１２又は第一装置１０のスイッチ類３８の中の一つで自動化され制御される。

本発明の好ましい実施態様で、刃４４は、図１３Ｂと１４Ｂに示すようにＳＰＳ２５に対して角度をなして配置されている。あるいは、刃４４は、回転しながら切断する回転式のピザカッターに似た回転式ディスク刃でもよい。あるいは、チーズ又は卵のカッターに似たワイヤカッターも使用できる。刃４４は平行移動できる傾斜切断刃先を有している。

好ましくは、複数の刃４４は、単一の集合体として同時に作動し、ＳＰＳ２５に完全にかつ同時に接触して、切断中、ＳＰＳ２５を動かしたり皺を付けたり又は折りたたんだりすることを避けるように構成されている。

刃４４は手動又は電動機で作動させることができる。あるいは、刃４４は、ばね荷重式でギロチン様方式で作動させてもよい。本発明の好ましい実施態様で、架台４６と刃４４は、異なるタイプの刃４４を異なる時点で使用できるように、取り外し可能でかつ取替え可能である。

本発明では、隣接する刃４４の間の距離ｄ（図１３Ｂ）は、微小器官ガイド５４を形成する半割りロッド５８の直径ｅにほぼ等しいか又は該直径ｅより小さい（図１４Ｂ）。したがって、図１４Ｂから分かるように、刃４４がＳＰＳ２５を複数のフラグメント６６に切断するとき、各フラグメント６６は（恐らく、端のフラグメント５３と５５を除いて）半割りロッド５８の中の一つ６２によって支持される。好ましくは、１１枚の刃を使って１２個のフラグメント６６に切断する。しかし、別の数も同様に採用できることも分かるであろう。

本発明の重要な特徴は、隣接する刃４４の間の距離ｄである。その距離はフラグメントの幅をつくる。その距離は、フラグメント６６内に最も深く位置する細胞がフラグメント６６の最も近くの表面から少なくとも８０ミクロン離れかつ約３７５ミクロンを超えて離れないことを保証するため、１６０〜７５０ミクロンであり好ましくは３００ミクロンである。その最も近い表面は表面６３と６５の内の一方である。したがって、フラグメント６６は、単一の微小器官６６又は複数の微小器官６６として作動する。

厚さＣ（図１１）も７５０ミクロン未満であるので（記載されているように、厚さは６５０ミクロンを超えているが）、微小器官６６内に最も深く位置している細胞の、二つの最も近くの表面からの距離は３７５ミクロン未満であることは分かるであろう。

本発明の実施態様で、架台４６と刃４４は、隣接する刃４４間の距離ｄを、微小器官５４の直径ｅより小さいままであるような長さに調節することができる。あるいは又はさらに、架台４６と微小器官５４は取外し可能でかつ異なるパラメータｄとｅを有する別のものと取り替えることができる。

幅が一般にｄより小さい端のフラグメント５３と５５は通常は廃棄する。しかし一方の端のフラグメントは、図１６Ａと１６Ｂを参照して以下に説明するように生存能力の試験に使える。図１３Ｂで分かるように、微小器官５４の第一セクション５６は、好ましくは、ＳＰＳ２５が刃４４の力によって一つの半割りロッド５８の凹面６２に沿って摺動するのを防止するストッパーとして作動する。

あるいは又はさらに、図１４Ｃと１４Ｄで分かるように、ＳＰＳ２５は、例えば矢印５７で示すように端のフラグメント５３と５５を把持して、刃４４の力で起こることがある皺又は摺動を防止できるサイドクランプ５２又は類似の装置によって正しい位置に保持できる。サイドクランプ５２はコンベヤベルト４２（図１３Ａ）の幅まで延ばせるが、架台４６と刃４４はコンベヤベルト４２のスパン内で作動できる。

さらに図面を参照すると、図１５は、本発明の好ましい実施態様で、切断が完了したときの刃４４とハンドル４８を図式的に示す。好ましくは、切断が完了したとき、レバー４８をその作動位置４９から係止位置４９’まで上げることによって、刃４４を、微小器官６６の間の位置４９から微小器官６６の上の位置４９’まで上げる。

第一装置１０はさらに、密閉処理チャンバーとして、特に領域４１で作動することは分かるであろう（図１０Ａ）。処理は切断前又は切断後に実施できる。処理には指定の温度でのインキュベーションが含まれており、この場合、第一装置１０はさらにヒーター／クーラー６７及びサーモスタット６９を備えている。あるいは又はさらに、処理には、洗浄装置３１を通じて導入される特定の溶液又はホルモンでＳＰＳ２５を処理することが含まれている。処理は、スイッチ類３８の中の一つ又は手動によって制御システム１２で制御できる。

さらに図面を参照すると、図１６Ａと１６Ｂは、本発明の好ましい実施態様で、微小器官６６を湿潤状態に保持するため又は栄養素を供給するために行う培地７１の添加を図式的に示す。培地７１は洗浄装置３１を通じて加えられ、その洗浄装置は、この場合、中空チューブとして製造される微小器官ガイド５４の第一セクション５６に連結されている（図１４Ｂ）。これらは、微小器官６６が支持される第二セクション５８に至る。

さらに又はあるいは、微小器官６６は、洗浄装置３１によって類似の方法ですすぐことができる。

本発明では、処理はさらに、少なくとも１時間を要する培養を含んでいる。

さらに又はあるいは、処理には形質転換が含まれている。形質転換は、微小器官６６の細胞の少なくとも一部分に、好ましくは血管新生を制御するために選択された少なくとも一つの外因性ポリヌクレオチド配列を導入することを含んでいる。その少なくとも一つの外因性ポリヌクレオチド配列は、微小器官６６一部のゲノムに組み込まれる。

前記少なくとも一つの外因性ポリヌクレオチド配列は、例えば複数の血管新生因子のうちの少なくとも一つの血管新生因子の発現を制御するように設計される。さらに前記少なくとも一つの外因性ポリヌクレオチド配列は、エンハンサー又はサプレッサーの配列を含んでいてもよい。さらにこの少なくとも一つの外因性ポリヌクレオチド配列の発現産物は、複数の血管新生因子のうちの少なくとも一つの血管新生因子の発現を制御する。さらにこの少なくとも一つの外因性ポリヌクレオチド配列は、少なくとも一つの組み換え血管新生因子をコードしている。

微小器官６６を形成する複数のフラグメント６６のうち、少なくとも一つの端のフラグメントは廃棄されそしてもう一つの端のフラグメントは生存能力試験用の生存能力試験管に自動的に移される。生存能力試験は、例えばＭＴＴを試験試料に添加することによって実施できる。ＭＴＴはテトラゾリウム塩である。溶解されたＭＴＴは、テトラゾリウムリングを活性ミトコンドリア脱水素酵素によって開裂されて不溶性の紫色のホルマザンに変換する。得られる色の濃度は、その細胞の生存能力と活性に比例する。

すすぎと処理を行った後、残っている微小器官６６を移植器６０に挿入する。

さらに図面を参照すると、図１７Ａと１７Ｅは図１０Ａとともに、本発明の好ましい実施態様の、微小器官６６を移植器６０に挿入するステップを図式的に示す。

図１０Ａで分かるように、複数の移植器６０が一直線に配置され各々微小器官ガイド５４に連結されている。移植器６０は、経皮挿入するため配置されそしてその遠位端縁７４が滅菌キャップ７２で保護された細いハウジング６０を備えている。これらの移植器は、第一装置１０のケーシング２２によって、移植チャンバー７０内に収納されている。

図１７Ａに示す第一ステップで、滅菌キャップ７２を各移植器６０から取り外して移植器６０の遠位端縁７４を露出させる。

図１７Ｂに示す第二ステップで、微小器官６６が保持されている各微小器官ガイド５４を、例えばトング７６で移植器６０中に引き入れて、微小器官ガイド５４の遠位端縁５９を移植器６０から突出させる。微小器官ガイド５４を、位置マーカー６８が移植器６０の遠位端縁７４に見えるまで引張り出す。

図１７Ｃと１７Ｄに示す第二ステップで、第一装置１０内のクランプ７８が微小器官ガイド５４を固締し、一方トング７６を使って微小器官ガイド５４のノッチ６４に対し遠位の部分を破断する。その遠位部分を破断する目的は、微小器官６６を、移植器６０内の微小器官ガイド５４の先端上に置いて、その先端が、一旦部分的に移植器６０からリリースされたドナー組織に対して案内や結合を行わないようにすることである。遠位部分を破断した後、クランプ７８はその微小器官ガイド５４の保持を解除する。

図１７Ｅに見られるように、微小器官６６と微小器官ガイド５４が入っている移植器６０を、矢印７９で示すように回転させて第一装置１０の移植チャンバー７０から外す。

さらに図面を参照すると、図１８Ａと図１８Ｃは、本発明の好ましい実施態様による微小器官６６を身体に移植するステップを図式的に示す。

図１８Ａに示す第一ステップで、移植器６０は、限定されないが例えば身体の筋肉８４と皮膚８２の間に挿入され、次に微小器官ガイド５４を移植器６０内で９０°回転させる。その結果、微小器官６６は筋肉組織８４の上に載る。

図１８Ｂに示す第二ステップで、位置マーカー８０がもはや見えなくなり微小器官６６がその移植位置にあることを示すまで、微小器官ガイド５４を移植器６０中に押し入れる。

図１８Ｃに示す第三ステップで、微小器官ガイド５４を注意深く引き出し次に移植器６０を引き出す。

所望の効果を得るため、複数の移植器６０を使って、被検者に対し一般に同じ領域に複数の微小器官６６を移植して、移植された微小器官６６の予め定められた面積濃度又は予め定められた容積濃度をつくりだす。

第一装置１０は、滅菌された機能性微小器官として、すぐに投与するか又は後に使うため保管する微小器官装置を作製することができることは分かるであろう。本願では、第一装置１０の説明は一実施例として提供している。微小器官を作製し送達する装置の必須の特徴を実現する別の実施態様を予想することができる。

実施例８
微小鉗子
本発明はアンギオポンプなどの微小器官を移送及び送達するのに使う微小鉗子の設計に関する。

図面をさらに参照すると、図２５Ａ〜２５Ｎは微小鉗子１２０の製作段階と作動を図式的に示す。

図２５Ａと２５Ｂで分かるように、組織に対して近位の末端１１２と遠位の末端１１４を有しそして好ましくは直径Ｄ１が約０．３〜５ｍｍのバー１１０の、遠位末端１１４を機械加工して幾分小さい直径Ｄ２にする。さらに、バー１１０にそって機械加工することによって傾斜部分１１６をつくる。

図２５Ｃで分かるように、スリット１２６を近位末端１１２につくってリップ１２２と１２４を間隔ｗ１をあけてつくり鉗子１２０を作製する。

さらに、図２５Ｄで分かるように、リップ１２２と１２４を少し削ってこれらリップの間に幅の広い間隔ｗ２をつくる。

図２５Ｅで分かるように、微小鉗子１２０の遠位末端１１４を、本体１３２とピストン１３４を有するシリンジ１３０に挿入する。なおピストン１３４は、遠位末端１１４に不動に固定するように構成されたキャップ様構造体１３５を含んでいる。

図２５Ｆで分かるように、微小鉗子１２０を利用して組織の試料又は別の試料１４０を把持する。

図２５Ｇで分かるように、ピストン１３４を遠位方向に引っ張ると、シリンジ本体１３２が近位方向の横方向の力を鉗子１２０の傾斜部分１１６に加えて、微小鉗子１２０に標的１４０を把持し把握させる。

微小鉗子１２０は他の形態であってもよいことは分かるであろう。

例えば、図２５Ｈで分かるように、微小鉗子１２０は、鉗子に閉じさせるために使うパートルージョン（ｐｅｒｔｒｕｓｉｏｎ）１１６を備えていてもよい。

あるいは、図２５Ｉで分かるように、隅を丸めたスリット１２６を有する微小鉗子１２０を設計できる。

図２５Ｊで分かるように、微小鉗子１２０の外表面を削ってより鋭くすることができる。

図２５Ｋ〜２５Ｌで分かるように、傾斜を有する微小鉗子１２０を設計することができそして円滑な操作を保証するため相補的な傾斜を有するシリンジ１３０の本体１３２を設計する。

多くの他の設計を同様に利用して微小鉗子１２０を製造できることは分かるであろう。具体的に述べると、微小鉗子１２０は単一のバーから機械加工して製造する必要はない。例えば、第一金属バーを使用して一方のリップをつくり次にそのリップにスリットをつくりそのスリットに板ばねなどの金属帯板を挿入して第二リップをつくることができる。そのスリットは、傾斜部分１１６（図２５Ｂ）に傾斜をつけるため角度をつけてつくる。さらに又はあるいは、ねじを使って金属帯板をバーに取り付けることができる。さらに、コイルばねを、バーと板ばねの間に使うことができる。あるいは、二つのバー又は二つの帯板を角度をつけて溶接して傾斜１１６を与えてもよい。多くの他の設計も同様に可能であることは分かるであろう。

図２５Ｍと２５Ｎは、微小鉗子１２０がシリンジ１３０のハイペレミック針（ｈｙｐｅｒｅｍｉｃｎｅｅｄｌｅ）１４２中に挿入される特別な例を示す。

ピストン１３４が遠位方向に引っ張られると、標的１４０をつかんでいる微小鉗子はハイペレミック針１４２中に引き込まれる。ハイペレミック針１４２はさらに微小器官を移植する作動を行う。

以下に微小鉗子１２０のいくつもの用途を要約して示す。
１．標的１４０は、寸法が３００ミクロンで４ｍｍ×１ｍｍのアンギオポンプのような微小器官であることがあり、その場合微小鉗子１２０がその微小器官を培養培地から直接注射器に通常の方法で挿入できる。場合によって、少量の培養培地を標的とともに微小鉗子１２０によって集めることができる。このことによって微小器官を、設計位置に移植するまで注射器内で生存し続けるようにすることができる。
２．標的１４０が、生体外で受精される哺乳類の卵母細胞である場合があり、その場合微小鉗子１２０が卵母細胞をしっかり保持してその卵母細胞に***を注射するか又は核を導入する。
３．標的１４０は、遺伝子組み換えを行って身体内の予め定められた位置にカテーテル又は外科用針で挿入される幹細胞で構成された集合体（ｃｌｕｍｐ）又は細胞凝集塊（ｃｅｌｌｕｌａｒａｇｇｒｅｇａｔｅ）の場合がある。
４．標的１４０は微小回路などの非生物物体のときがある。

実施例９
微小器官を作製し送達する第二装置
本発明はまた、哺乳類の組織に血管新生を誘発するアンギオポンプなどの微小器官を作製し送達する第二装置１００に関する。

図面をさらに参照すると、図２６は、本発明の好ましい実施態様の微小器官を作製し送達する第二装置１００を図式的に示す。第二装置１００は、ｘ；ｙ；ｚ系を規定しそして図１０Ａ、１１及び１２に示す第一装置１０とともに先に述べたのと実質的に同じ組織スクレーパー２０を備えている。組織スクレーパー２０は、密閉された封入体３０、分層皮膚生検試料（ＳＰＳ）２５をスクレープするように構成されたスクレーピング刃２４、及びＳＰＳ２５を密閉封入体３０に移送するコンベヤベルト２８を備えている。

しかし、組織の生検試料を複数のフラグメント６６（図１４Ｂ）に切断して微小器官をつくる組織切断器４０とその微小器官を移植器に移送する方式は、装置１０（図１０Ｂ）のそれとは異なっている。

第二装置１００では、切断器４０がＳＰＳ２５をコンベヤベルト２８によって配置する基板１０２を備えている。さらに、複数の平行な外科グレードの刃４４が、ＳＰＳ２５を薄いスライスに切断するため±ｙ方向に動くように構成されている。先に述べたのと同様に、微小器官（図１４Ｂに示すフラグメント６６）内に最も深く位置している細胞がその微小器官の最も近くの表面から少なくとも約８０ミクロン離れかつ約３７５ミクロンを超えて離れないことを保証するため、隣接する刃４４の間の距離は、１６０〜７５０ミクロンであり好ましくは３００ミクロンである。

複数の刃４４は、好ましくは、丸窓５０を通ってケーシング２２から突き出ているハンドル４８によって手動で操作する。好ましくは、レバー４８は、ばね荷重にてギロチン様方式で作動し複数の刃４４を単一の集合体として同時にリリースして、刃４４をＳＰＳ２５に同時にかつ完全に接触させて、切断中ＳＰＳ２５が移動したり皺寄りを起こしたり又は折り重なることを回避する。あるいは、レバー４８は電動機で作動させることができる。

さらに図面を参照すると、図２７Ａ〜２７Ｄは、本発明の好ましい実施態様の、複数の刃４４でＳＰＳ２５を切断する工程を有する第二装置１００を示している。

図２７Ａで分かるように、ＳＰＳ２５が基板１０２の上に配置されそして複数の刃４４がＳＰＳ２５の上方に位置している。

図２７Ｂから分かるように、複数の刃４４を降下させて、基板１０２上でこれら刃の間に複数のフラグメント６６を作製する。

図２７Ｃから分かるように、複数の刃４４を手動で引き上げて、フラグメント６６を摩擦力で刃４４とともに引き上げる。専用のレバー１０６で作動する複数の専用プランジャー１０４を使って、フラグメント６６を刃４４の間から基板１０２の上に押し出す。専用プランジャー１０４は一つずつ使用する。

図２７Ｄから分かるように、専用プランジャー１０４の内の一つすなわち専用プランジャー１０４（１）は、専用レバー１０６（１）によって手動でリリースされてフラグメント６６（１）を刃４４の間から基板１０２の上に押し出す。

さらに図面を参照すると、図２８Ａ〜２８Ｃ、２９Ａ〜２９Ｃ及び図２６はともに、上記のように図２７Ｄに示す基板１０２の上に下げたフラグメント６６（１）を装填する工程での微小鉗子１２０の使用を図式的に示す。

図２６で分かるように、装置１００は通孔１０８を有し、その通孔は例えば互いにスライドできる２枚のプレートを使って±ｚ方向にスライドするように構成されている。通孔１０８は、開口を最小限にしてフラグメント６６がほぼ密閉された環境内に保持されるように設置される。

図２８Ａと２９Ａで分かるように、シリンジ１３０に対して好ましくはハイペレミック針１４２（図２５Ｍ〜２５Ｎ）内に配置された微小鉗子１２０は、装置１００の通孔１０８が基板１０２上のフラグメント６６（１）と一直線に並んだときにその通孔１０８を通じて挿入される。

図２８Ｂと２９Ｂから分かるように、微小鉗子１２０がフラグメント６６（１）を把持する。

図２８Ｃと２９Ｃから分かるように、フラグメント６６（１）をハイペレミック針１４２中に引き入れるためにピストン１３４を引き出す。

ハイペレミック針１４２を使って、フラグメント６６（１）を直接移植できる。

分かりやすくするため別個の実施態様で説明されている本発明のいくつもの特徴は、組み合わせて単一の実施態様にして提供することもできることは分かるであろう。逆に簡略化するため単一の実施態様で説明されている本発明の各種特徴は、別個に又は適切なサブコンビネーションで提供することもできる。

本発明を、その具体的実施態様とともに説明してきたが、多くの変形と変更が当業技術者には明らかであることは明白である。したがって、本発明は、本願の特許請求の範囲の精神と広い範囲内に入っているこのような変形と変更をすべて含むものである。

本明細書に記載のすべての刊行物、特許及び特許願は、あたかも、個々の刊行物、特許又は特許願各々が、本願に具体的にかつ個々に参照して示されているように、本願に援用するものである。さらに、本願における任意の文献の引用もしくは確認は、このような文献が本発明に対する従来技術として利用できるという自白とみなすべきではない。

移植された微小器官（矢印で示す）のまわりの新しい血管形成を示す写真である。移植された微小器官に発現された各種の血管新生因子の相対レベルを示すグラフである。調製後、各種の期間、身体外で培養された微小器官から抽出されたＲＮＡの血管新生因子特異的ＰＴ−ＰＣＲ産物である。 β−アクチンＲＴ−ＰＣＲ産物（対照）のインテンシティーに対して正規化した、図３に示すＲＴ−ＰＣＲ産物のデンシトメトリーで得た半定量データを示すグラフである。微小器官を移植されたか又は擬似移植された（対照）総腸骨結紮ラットの歩行パターンを示すヒストグラムである。動物を歩行挙動について採点する前に身体運動を行わせたことを除いて図５の実験グループと同じグループを示すヒストグラムである。微小器官を移植されたか又は擬似移植された総腸骨動脈結紮マウスの歩行パターンを示すヒストグラムである。同系マウスの皮下領域中に移植してから６ヶ月後のマウス脾臓由来の微小器官（ＭＣ矢印で示す）を示す画像である。同系ラット由来の肺臓微小器官を移植されたラットの角膜を示す画像である。本発明の好ましい実施態様による、微小器官を作製し送達する装置を図式的に示す。本発明の好ましい実施態様による、微小器官を作製し送達する装置を図式的に示す。本発明の好ましい実施態様による組織スクレーパーを図式的に示す。本発明の好ましい実施態様による前記組織スクレーパーを図式的に示す。本発明の好ましい実施態様による組織切断器を図式的に示す。本発明の好ましい実施態様による前記組織切断器を図式的に示す。本発明の好ましい実施態様による前記組織切断器を図式的に示す。本発明の好ましい実施態様による前記組織切断器を図式的に示す。本発明の好ましい実施態様による、切断が完了したときの組織切断器を図式的に示す。本発明の好ましい実施態様による、微小器官の湿潤を保持するため培地を適用するステップを図式的に示す。本発明の好ましい実施態様による、微小器官を移植器に挿入するステップを図式的に示す。本発明の好ましい実施態様による、微小器官を移植器に挿入するステップを図式的に示す。本発明の好ましい実施態様による、微小器官を移植器に挿入するステップを図式的に示す。本発明の好ましい実施態様による、微小器官を移植器に挿入するステップを図式的に示す。本発明の好ましい実施態様による、微小器官を移植器に挿入するステップを図式的に示す。本発明の好ましい実施態様による、微小器官を身体内に移植するステップを図式的に示す。本発明の好ましい実施態様による、微小器官を身体内に移植するステップを図式的に示す。本発明の好ましい実施態様による、微小器官を身体内に移植するステップを図式的に示す。移植された皮膚の微小器官（ＳＭＯ）における移植後１日目の血管新生を示す（矢印は新しく形成された血管を示す）。移植された皮膚の微小器官（ＳＭＯ）における移植後３日目の血管新生を示す（矢印は新しく形成された血管を示す）。移植された皮膚の微小器官（ＳＭＯ）における移植後７日目の血管新生を示す（矢印は新しく形成された血管を示す）。移植されたＳＭＯ中の局所血流（図２０Ａ）を肺のＭＯによって誘発された血流（図２０Ｂ）と比較して示す。血流の強さを測定するため蛍光ビーズを使った。移植されたＳＭＯ中の局所血流（図２０Ａ）を肺のＭＯによって誘発された血流（図２０Ｂ）と比較して示す。血流の強さを測定するため蛍光ビーズを使った。若いマウス由来のＳＭＯと老マウス由来のＳＭＯを若いマウスに移植して１ヶ月後の、これらＳＭＯにおける血管の形成を示す。若いマウス由来のＳＭＯと老マウス由来のＳＭＯを若いマウスに移植して１ヶ月後の、これらＳＭＯにおける血管の形成を示す。若いマウス由来のＳＭＯと老マウス由来のＳＭＯを若いマウスに移植して２週間後の、これらＳＭＯ内の血流を示す。若いマウス由来のＳＭＯと老マウス由来のＳＭＯを若いマウスに移植して２週間後の、これらＳＭＯ内の血流を示す。ＳＭＯを移植されていない筋肉組織における血管の形成を示す蛍光顕微鏡で撮った写真である。ＳＭＯを移植された筋肉組織における血管の形成を示す蛍光顕微鏡で撮った写真である。ＳＭＯを移植された筋肉組織における血管の形成を示す蛍光顕微鏡で撮った写真である。ＳＭＯを移植された筋肉組織における血管の形成を示す蛍光顕微鏡で撮った写真である。ＳＭＯを移植された筋肉組織における血管の形成を示す蛍光顕微鏡で撮った写真である。ＳＭＯを移植された筋肉組織における血管の形成を示す蛍光顕微鏡で撮った写真である。ＳＭＯを移植されていない筋肉組織における血管の形成を示す蛍光顕微鏡で撮った写真である。被検ウサギに移植して７日後にレスキュー（ｒｅｓｃｕｅ）された単一ＳＭＯ中の血管の形成を示す。本発明による微小鉗子の製作段階と作動を示す。本発明による微小鉗子の製作段階と作動を示す。本発明による微小鉗子の製作段階と作動を示す。本発明による微小鉗子の製作段階と作動を示す。本発明による微小鉗子の製作段階と作動を示す。本発明による微小鉗子の製作段階と作動を示す。本発明による微小鉗子の製作段階と作動を示す。本発明による微小鉗子の製作段階と作動を示す。本発明による微小鉗子の製作段階と作動を示す。本発明による微小鉗子の製作段階と作動を示す。本発明による微小鉗子の製作段階と作動を示す。本発明による微小鉗子の製作段階と作動を示す。本発明による微小鉗子の製作段階と作動を示す。本発明による微小鉗子の製作段階と作動を示す。本発明の好ましい実施態様による微小器官を作製し送達する第二装置を図式的に示す。本発明の好ましい実施態様による複数の刃で切断する段階を有する第二装置を図式的に示す。本発明の好ましい実施態様による複数の刃で切断する段階を有する第二装置を図式的に示す。本発明の好ましい実施態様による複数の刃で切断する段階を有する第二装置を図式的に示す。本発明の好ましい実施態様による複数の刃で切断する段階を有する第二装置を図式的に示す。本発明の方法と装置に関連する本発明の微小鉗子の使用を図式的に示す。本発明の方法と装置に関連する本発明の微小鉗子の使用を図式的に示す。本発明の方法と装置に関連する本発明の微小鉗子の使用を図式的に示す。本発明の方法と装置に関連する本発明の微小鉗子の使用を図式的に示す。本発明の方法と装置に関連する本発明の微小鉗子の使用を図式的に示す。本発明の方法と装置に関連する本発明の微小鉗子の使用を図式的に示す。

配列番号１〜８は一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドの配列である。

【配列表】

Claims

第一哺乳類の組織に血管新生を誘発する方法であって、少なくとも一つの微小器官を、第一哺乳類の組織中に移植するステップを含んでなり、前記少なくとも一つの微小器官が複数種の血管新生因子を産生して血管新生を誘発する方法。
前記少なくとも一つの微小器官が、第二哺乳類の器官組織由来の器官である請求項１に記載の方法。
第一哺乳類と第二哺乳類が単一個体の哺乳類である請求項２に記載の方法。
前記器官が、肺臓、肝臓、腎臓、筋肉、脾臓、皮膚及び心臓からなる群から選択される請求項２に記載の方法。
前記少なくとも一つの微小器官が二種以上の細胞型を含んでいる請求項１に記載の方法。
第一哺乳類がヒトである請求項１に記載の方法。
前記少なくとも一つの微小器官が、第一哺乳類の組織内に移植される前に、少なくとも４時間、身体外で培養される請求項１に記載の方法。
前記少なくとも一つの微小器官が、第一哺乳類の組織中に移植されたとき生存力を保持するように調製される請求項１に記載の方法。
前記少なくとも一つの微小器官の寸法が、前記少なくとも一つの微小器官内に最も深く位置している細胞の前記少なくとも一つの微小器官の最も近い表面からの距離が少なくとも約８０〜１００ミクロンでかつ約２２５〜３７５ミクロンまでであるような寸法である請求項８に記載の方法。
前記複数の血管新生因子の各々が、前記少なくとも一つの微小器官内で独特の発現パターンをもっている請求項１に記載の方法。
前記少なくとも一つの微小器官の細胞の少なくとも一部分が、血管新生を制御するために選択された少なくとも一種の外因性ポリヌクレオチド配列を含有している請求項１に記載の方法。
前記少なくとも一種の外因性ポリヌクレオチド配列が、前記少なくとも一つの微小器官の前記細胞の前記少なくとも一部分のゲノムに組み込まれている請求項１１に記載の方法。
前記少なくとも一種の外因性ポリヌクレオチド配列が、前記複数種の血管新生因子のうちの少なくとも一種の血管新生因子の発現を制御するように設計されている請求項１２に記載の方法。
前記少なくとも一種の外因性ポリヌクレオチド配列が、エンハンサー又はサプレッサーの配列を含有している請求項１３に記載の方法。
前記少なくとも一種の外因性ポリヌクレオチド配列の発現産物が、前記複数種の血管新生因子のうちの少なくとも一種の血管新生因子の発現を制御することができる請求項１１に記載の方法。
前記少なくとも一種の外因性ポリヌクレオチド配列が、少なくとも一種の組み換え血管新生因子をコードしている請求項１１に記載の方法。
第一哺乳類の組織に血管新生を誘発する方法であって：
（ａ）可溶性分子を少なくとも一つの微小器官から抽出し、次いで
（ｂ）上記ステップ（ａ）で抽出された前記可溶性分子の少なくとも一つの予め定められた投与量を、第一哺乳類の組織に投与する、
ステップを含んでなる方法。
前記可溶性分子を、前記ステップ（ｂ）の前に、医薬として許容できる担体と混合する請求項１７に記載の方法。
前記少なくとも一つの微小器官が、第二哺乳類の器官組織由来の器官である請求項１７に記載の方法。
前記少なくとも一つの微小器官を、前記可溶性分子を抽出する前に、少なくとも４時間培養する請求項１７に記載の方法。
前記少なくとも一つの微小器官の寸法が、前記少なくとも一つの微小器官内に最も深く位置している細胞の前記少なくとも一つの微小器官の最も近い表面からの距離が少なくとも約８０〜１００ミクロンでかつ約２２５〜３７５ミクロンまでであるような寸法である請求項１７に記載の方法。
有効成分として、少なくとも一つの微小器官からの可溶性分子の抽出物を含有し及び医薬として許容できる担体を含有する医薬組成物。
複数種の細胞を含有する微小器官であって、その複数種の前記細胞の少なくとも一部分が少なくとも一種の外因性ポリヌクレオチド配列を含有し、その少なくとも一種の外因性ポリヌクレオチド配列が、前記細胞内で発現される少なくとも一種の血管新生因子の発現を制御することができる微小器官。
微小器官が第二哺乳類の器官組織由来の器官である請求項２３に記載の微小器官。
第一哺乳類と前記第二哺乳類が単一個体の哺乳類である請求項２４に記載の微小器官。
前記器官が、肺臓、肝臓、他の腸管由来の器官、腎臓、脾臓及び心臓からなる群から選択される請求項２３に記載の微小器官。
前記少なくとも一つの微小器官が二種以上の細胞型を含有している請求項２３に記載の微小器官。
微小器官の寸法が、微小器官内に最も深く位置している細胞の微小器官の最も近い表面からの距離が少なくとも約８０〜１００ミクロンでかつ約２２５〜３７５ミクロンまでであるような寸法である請求項２３に記載の微小器官。
前記少なくとも一種の外因性ポリヌクレオチド配列が、前記複数種の前記細胞の前記少なくとも一部分のゲノム中に組み込まれている請求項２３に記載の微小器官。
前記少なくとも一種の外因性ポリヌクレオチド配列が、エンハンサー又はサプレッサーの配列を含有している請求項２３に記載の微小器官。
前記少なくとも一種の外因性ポリヌクレオチド配列の発現産物が、前記少なくとも一種の血管新生因子の発現を制御することができる請求項２３に記載の微小器官。
第一哺乳類の組織に血管新生を誘発する方法であって：
（ａ）少なくとも一つの微小器官を増殖培地内で培養してならし培地を生成させ、
（ｂ）前記ならし培地を、少なくとも一つの予め定められた培養期間の後に収集し、次いで、
（ｃ）ステップ（ｂ）で収集した前記ならし培地の少なくとも一つの予め定められた投与量を、第一哺乳類の組織中に投与して、その組織に血管新生を誘発する、
ステップを含んでなる方法。
前記少なくとも一つの微小器官が、第二哺乳類の器官組織由来の器官である請求項３２に記載の方法。
前記少なくとも一つの微小器官を、前記ならし培地を収集する前に、少なくとも４時間培養する請求項３２に記載の方法。
前記少なくとも一つの微小器官の寸法が、前記少なくとも一つの微小器官内に最も深く位置している細胞の前記少なくとも一つの微小器官の最も近い表面からの距離が少なくとも約８０〜１００ミクロンでかつ約２２５〜３７５ミクロンまでであるような寸法である請求項３２に記載の方法。
前記増殖培地が最小必須培地である請求項３２に記載の方法。
組織の生検試料から微小器官を生成させ次いでその微小器官を被検者に投与する装置であって：
（ａ）組織の生検試料を複数の微小器官に切断する切断チャンバー、及び
（ｂ）その複数の微小器官を被検者に投与する移植機構であって、前記切断チャンバーに連結されて作動する移植機構、
を含んでなる装置。
前記切断チャンバーが試薬の導入及び取り出しを行う入口／出口を備えている請求項３７に記載の装置。
前記切断チャンバーがその中に組織の生検試料を導入する入口を備えている請求項３７に記載の装置。
前記切断チャンバーに連結されて作動し前記複数の微小器官のうち少なくとも一つの犠牲微小器官の生存能力を試験する生存能力試験チャンバーをさらに備えている請求項３７に記載の装置。
前記移植機構が、多チャネルインプランター及び前記複数の微小器官を前記切断チャンバーから前記多チャンネルインプランターの方に前進させそしてさらに複数の微小器官を被験者に投与する対応する前進素子を備えている請求項３７に記載の装置。
前記切断チャンバー及び前記移植機構に連結されて作動し前記微小器官を前記投与を行う前に処理する処理チャンバーをさらに備えている請求項３７に記載の装置。
前記処理チャンバーが処理試薬を導入し取り出すための入口／出口を備えている請求項４２に記載の装置。
前記切断チャンバーが、組織の生検試料が一旦前記複数の微小器官すなわち前記の各微小器官に切断されたならば前記複数の微小器官の微小器官内に最も深く位置している細胞が前記微小器官の最も近くの表面から少なくとも約８０〜１００ミクロン離れかつ２２５〜３７５ミクロンを超えて離れないように、設計されかつ構築される請求項３７に記載の装置。
前記切断チャンバーが組織の生検試料を前記複数の微小器官に切断する移動可能な複数の刃を有する切断機構を備えている請求項３７に記載の装置。
前記刃が、組織の生検試料が一旦前記複数の微小器官すなわち前記の各微小器官に切断されたならば前記複数の微小器官の微小器官内に最も深く位置している細胞が前記微小器官の最も近くの表面から少なくとも約８０〜１００ミクロン離れかつ２２５〜３７５ミクロンを超えて離れないように、互いに配置されている請求項４５に記載の装置。
前記移植機構がシリンジ作動される微小鉗子を含み、前記微小鉗子が前記シリンジのハイペレミック針内に挿入されており、前記ハイペレミック針が被験者への微小器官の投与のために作動する請求項３７に記載の装置。
前記シリンジ作動される微小鉗子が前記装置からの微小器官の除去及び前記ハイペレミック針中への挿入のためにさらに作動する請求項４７に記載の装置。
組織の生検試料から微小器官を作製する装置であって：
（ａ）組織の生検試料を複数の微小器官に切断するための切断チャンバー、及び
（ｂ）前記切断チャンバーに連結されて作動し、前記複数の微小器官のうちの少なくとも一つの犠牲微小器官の生存能力を試験するための生存能力試験チャンバー、
を備えている装置。
前記切断チャンバーが試薬の導入及び取出しを行う入口／出口を持っている請求項４９に記載の装置。
前記切断チャンバーが組織の生検試料をその中に導入する入口を備えている請求項４９に記載の装置。
前記切断チャンバーが、組織の生検試料が一旦前記複数の微小器官すなわち前記の各微小器官に切断されたならば前記複数の微小器官の微小器官内に最も深く位置している細胞が前記微小器官の最も近くの表面から少なくとも約８０〜１００ミクロン離れかつ２２５〜３７５ミクロンを超えて離れないように、設計されかつ構築される請求項４９に記載の装置。
前記切断チャンバーが組織の生検試料を前記複数の微小器官に切断する移動可能な複数の刃を有する切断機構を備えている請求項４９に記載の装置。
前記刃が、組織の生検試料が一旦前記複数の微小器官すなわち前記の各微小器官に切断されたならば前記複数の微小器官の微小器官内に最も深く位置している細胞が前記微小器官の最も近くの表面から少なくとも約８０〜１００ミクロン離れかつ２２５〜３７５ミクロンを超えて離れないように、互いに配置されている請求項５３に記載の装置。
前記複数の刃が各々平行移動できる傾斜した切断刃先を持っている請求項５３に記載の装置。
前記複数の刃が各々回転可能な円板刃である請求項５３に記載の装置。
組織の生検試料から微小器官を作製する装置であって：
（ａ）組織の生検試料を複数の微小器官に切断するための切断チャンバー、
（ｂ）前記切断チャンバーに連結されて作動し前記微小器官を処理するための処理チャンバー、及び
（ｃ）前記微小器官を前記切断チャンバーから前記処理チャンバーへ前進させる前進機構、
を備えている装置。
前記処理チャンバーが処理試薬の導入及び取出しを行うための入口／出口を備えている請求項５７に記載の装置。
前記切断チャンバーが試薬の導入及び取出しを行う入口／出口を持っている請求項５７に記載の装置。
前記切断チャンバーが生検試料をその中に導入する入口を備えている請求項５７に記載の装置。
前記切断チャンバーが、組織の生検試料が一旦前記複数の微小器官すなわち前記の各微小器官に切断されたならば前記複数の微小器官の微小器官内に最も深く位置している細胞が前記微小器官の最も近くの表面から少なくとも約８０〜１００ミクロン離れかつ２２５〜３７５ミクロンを超えて離れないように、設計されかつ構築される請求項５７に記載の装置。
前記切断チャンバーが組織の生検試料を前記複数の微小器官に切断する移動可能な複数の刃を有する切断機構を備えている請求項５７に記載の装置。
前記刃が、組織の生検試料が一旦前記複数の微小器官すなわち前記の各微小器官に切断されたならば前記複数の微小器官の微小器官内に最も深く位置している細胞が前記微小器官の最も近くの表面から少なくとも約８０〜１００ミクロン離れかつ２２５〜３７５ミクロンを超えて離れないように、互いに配置されている請求項６２に記載の装置。
前記複数の刃が各々平行移動できる傾斜した切断刃先を持っている請求項６２に記載の装置。
前記複数の刃が各々回転可能な円板刃である請求項６２に記載の装置。
組織の生検試料から微小器官を作製し次いでその微小器官を被検者に投与する方法であって：
（ａ）組織の生検試料を複数の微小器官に切断する切断チャンバー、及び
（ｂ）前記切断チャンバーに連結されて作動する、複数の微小器官を被験者に投与する移植機構、
を有する装置を提供し、
組織の生検試料を前記切断チャンバー内に入れてその組織の生検試料を複数の微小器官に切断し、次いで
前記移植機構を使って前記複数の微小器官を被検者に投与する、
ステップを含んでいる方法。
微小器官がアンギオポンプとして働く請求項６６に記載の方法。
前記切断チャンバーが試薬の導入及び取出しを行う入口／出口を有し、前記方法は前記微小器官を前記切断チャンバー内で洗浄した後、前記移植機構を使って複数の微小器官を被検者に投与するステップをさらに含んでいる請求項６６に記載の方法。
前記切断チャンバーがその中に組織の生検試料を導入する入口を有し、前記方法はその組織生検試料を前記入り口を通じて前記切断チャンバー内に入れるステップを含んでいる請求項６６に記載の方法。
前記装置が前記切断チャンバーに連結されて作動して前記複数の微小器官のうちの少なくとも一つの犠牲微小器官の生存能力を検査する生存能力試験チャンバーをさらに備え、前記方法は前記複数の微小器官のうちの前記少なくとも一つの犠牲微小器官の前記生存能力を試験した後、前記移植機構を使って複数の微小器官を被検者に投与するステップをさらに含んでいる請求項６６に記載の方法。
前記移植機構が、多チャネルインプランター及び前記複数の微小器官を前記切断チャンバーから前記多チャンネルインプランターに前進させそしてさらに複数の微小器官を被検者に投与する対応する前進素子を備え、前記方法は前記前進素子を使って複数の微小器官を被検者に投与するステップを含んでいる請求項６６に記載の方法。
前記装置が、前記切断チャンバーに連結されて作動する処理チャンバー、及び前記投与を行う前に前記微小器官を処理する前記投与機構を備え、前記方法が前記投与を行う前に前記微小器官を処理するステップをさらに含んでいる請求項６６に記載の方法。
前記投与を行う前に前記微小器官を処理する前記ステップが、洗浄、形質転換、培養及びそれらの組合わせからなる群から選択される少なくとも一つの処理を含んでいる請求項７２に記載の方法。
前記投与を行う前に前記微小器官を処理する前記ステップが、少なくとも１時間培養するステップを含んでいる請求項７２に記載の方法。
前記投与を行う前に前記微小器官を処理する前記ステップが、前記微小器官の細胞の少なくとも一部に、血管新生を調節するため選択された少なくとも一つの外因性ポリヌクレオチド配列を導入することによって形質転換するステップを含んでいる請求項７２に記載の方法。
前記少なくとも一つの外因性ポリヌクレオチド配列が、前記微小器官の前記細胞の前記少なくとも一部のゲノムに組み込まれる請求項７５に記載の方法。
前記少なくとも一つの外因性ポリヌクレオチド配列が、前記複数の血管新生因子のうちの少なくとも一つの血管新生因子の発現を調節するように設計されている請求項７６に記載の方法。
前記少なくとも一つの外因性ポリヌクレオチド配列が、エンハンサー又はサプレッサーの配列を含んでいる請求項７７に記載の方法。
前記少なくとも一つの外因性ポリヌクレオチド配列の発現産物が、前記複数の血管新生因子のうちの少なくとも一つの血管新生因子の発現を調節することができる請求項７５に記載の方法。
前記少なくとも一つの外因性ポリヌクレオチド配列が、少なくとも一つの組み換え血管新生因子をコードしている請求項７５に記載の方法。
前記処理チャンバーが処理試薬の導入及び取出しを行う入口／出口を備え、前記方法は少なくとも一つの処理試薬を前記入口／出口を通じて前記処理チャンバーに導入するステップを含んでいる請求項７２に記載の方法。
前記切断チャンバーが、一旦組織の生検試料が前記複数の微小器官すなわち前記各微小器官に切断されたならば、前記複数の微小器官のうちの微小器官内に最も深く位置している細胞が前記微小器官の最も近くの表面から少なくとも約８０〜１００ミクロン離れかつ２２５〜３７５ミクロンを超えて離れないように設計されかつ構築され、前記方法は、前記切断チャンバーを使用して、前記複数の微小器官のうちの微小器官内に最も深く位置している細胞が前記微小器官の最も近くの表面から少なくとも約８０〜１００ミクロン離れかつ２２５〜３７５ミクロンを超えて離れないように、組織の生検試料を、前記複数の微小器官すなわち前記の各微小器官に切断するステップをさらに含んでいる請求項６６に記載の方法。
前記切断チャンバーが、組織の生検試料を前記複数の微小器官に切断するための移動可能な複数の刃を有する切断機構を有し、前記方法は前記複数の刃を使って組織の生検試料を前記複数の微小器官に切断するステップを含んでいる請求項６６に記載の方法。
前記刃が、一旦組織の生検試料が前記複数の微小器官すなわち前記各微小器官に切断されたならば、前記複数の微小器官のうちの微小器官内に最も深く位置している細胞が前記微小器官の最も近くの表面から少なくとも約８０〜１００ミクロン離れかつ２２５〜３７５ミクロンを超えて離れないように互いに対して配置され、前記方法は、前記複数の刃を使用して、前記複数の微小器官のうちの微小器官内に最も深く位置している細胞が前記微小器官の最も近くの表面から少なくとも約８０〜１００ミクロン離れかつ２２５〜３７５ミクロンを超えて離れないように、組織の生検試料を、前記複数の微小器官すなわち前記の各微小器官に切断するステップを含んでいる請求項８３に記載の方法。
前記複数の刃が各々平行移動可能な傾斜刃先を有し、前記方法は、前記傾斜刃先を組織の生検試料に対して平行移動させて、組織の生検試料を前記複数の微小器官に切断するステップを含んでいる請求項８３に記載の方法。
前記複数の刃が各々回転可能な円板刃であり、前記方法は前記回転可能な円板刃を組織の生検試料に対して回転させてその組織の生検試料を前記複数の微小器官に切断するステップを含んでいる請求項８３に記載の方法。
前記組織の生検試料が、肺臓、肝臓、腎臓、筋肉、脾臓、皮膚、心臓、リンパ節及び骨髄からなる群から選択される組織又は器官由来の試料である請求項６６に記載の方法。
組織の生検試料のドナーと被検者が同じ個体である請求項６６に記載の方法。
組織の生検試料のドナーと被検者が異なる個体である請求項６６に記載の方法。
組織の生検試料のドナーがヒトである請求項６６に記載の方法。
組織の生検試料のドナーがヒト以外の哺乳類である請求項６６に記載の方法。
前記被検者がヒト以外の哺乳類である請求項６６に記載の方法。
前記被検者がヒトである請求項６６に記載の方法。
複数の微小器官を被検者に投与する前記ステップが経粘膜又は非経口の投与経路で行われる請求項６６に記載の方法。
前記経粘膜又は非経口の投与経路が、筋肉内、皮下、骨髄内、くも膜下、直接心室内、静脈内、腹腔内、鼻腔内及び眼内の投与経路からなる群から選択される請求項９４に記載の方法。
微小器官を作製し送達する装置であって：
組織の生検試料を複数のフラグメントに切断して複数の微小器官を作製する組織切断器、及び
前記組織切断器に取外し可能に連結される少なくとも一つの移植器であって、前記組織切断器に取り付けられたときに、前記複数の微小器官のうちの一つの微小器官を受け取り、そして前記組織切断器から連結を解除された後、前記微小器官を被検者に移植する移植器、
を備えた装置。
組織の生検試料を得るための組織スクレーパーをさらに備えた請求項９６に記載の装置。
前記組織スクレーパーが前記組織の生検試料を予め定められた幅に調製するように構成されている請求項９７に記載の装置。
前記組織スクレーパーが前記組織の生検試料を予め定められた長さに調製するように構成されている請求項９７に記載の装置。
前記組織スクレーパーが前記組織の生検試料を予め定められた厚さに調製するように構成されている請求項９７に記載の装置。
前記組織スクレーパーが取替え可能な刃を有している請求項９７に記載の装置。
前記装置が、基板、ランプ及びケーシング内に密封されている請求項９６に記載の装置。
前記装置が制御システムを含んでいる請求項９６に記載の装置。
前記装置が、組織の生検試料を前記装置の一領域から別の領域に移送する少なくとも一つの自動走行機構を含んでいる請求項９６に記載の装置。
前記装置が組織の生検試料をすすぐための洗浄装置を備えている請求項９６に記載の装置。
前記洗浄装置が培地を組織の生検試料に加えるようにさらに作動する請求項１０５に記載の装置。
前記装置が組織処理チャンバーとしてさらに作動する請求項９６に記載の装置。
前記装置がその中の温度を制御する装置を含んでいる請求項９６に記載の装置。
前記組織切断器が、微小器官のうちのいずれか一つの中に最も深く位置している細胞が最も近い表面から少なくとも約８０〜１００ミクロン離れかつ約２２５〜３７５ミクロンを超えて離れないように、組織の生検試料を前記複数のフラグメントに切断して前記微小器官を作製するように設計された複数の平行な外科グレードの刃を備えている請求項９６に記載の装置。
前記組織切断器が、組織の生検試料に対し角度をつけて配置されている複数の平行な外科グレードの刃を備えている請求項９６に記載の装置。
前記組織切断器が、回転可能な円板刃として配置されている複数の平行な外科グレードの刃を備えている請求項９６に記載の装置。
前記装置が前記複数の微小器官のうちの少なくとも一つの微小器官の生存能力を試験するための生存能力試験チャンバーを備えている請求項９６に記載の装置。
前記組織切断器が、組織の生検試料を切断し、前記微小器官を作製し、次に前記微小器官の各々を、複数の微小器官ガイドのうちの単一の微小器官ガイド上に単一の操作で配置するように作動する請求項９６に記載の装置。
前記少なくとも一つの移植器が、経皮挿入用でかつ前記複数の微小器官ガイドのうちの一つを受け入れるように作動する細いハウジングを含んでいる請求項１１３に記載の装置。
前記少なくとも一つの移植器が、前記複数の微小器官ガイドのうちの一つを受け入れるように作動する複数の移植器を含んでいる請求項１１３に記載の装置。
前記複数の微小器官ガイドが各々、そのガイドに配置された前記微小器官を移植するため位置決めするときに示す位置マーカーを含んでいる請求項１１３に記載の装置。
前記複数の微小器官ガイドが各々、そのガイドの遠位部分を破断して、そのガイドに配置された前記微小器官に先端を形成させるノッチを含んでいる請求項１１３に記載の装置。
前記複数の微小器官ガイドが各々、そのガイドに配置されている前記微小器官が移植されるときに示す位置マーカーを含んでいる請求項１１３に記載の装置。
前記装置が使い捨て装置である請求項９６に記載の装置。
微小器官を作製し送達する方法であって：
組織の生検試料をスクレープし、
その組織の生検試料を複数のフラグメントに切断して複数の微小器官を作製し、次いで
前記複数の微小器官のうちの少なくとも一つを移植する、
ステップを含んでなる方法。
前記微小器官がアンギオポンプとして働く請求項１２０に記載の方法。
前記組織の生検試料を処置した後に移植するステップをさらに含んでいる請求項１２０に記載の方法。
前記処置が、洗浄、形質転換、培養及びこれらの組合わせからなる群から選択される請求項１２２に記載の方法。
前記切断ステップが、第一の複数の組織フラグメントに切断して第一の複数の微小器官を作製するステップをさらに含み、そして
前記移植するステップが、第二の複数のフラグメントを移植するステップをさらに含み、前記第二の複数は前記第一の複数より少なくとも１小さい方法において、
前記方法が、生存能力試験のために前記第一の複数の組織フラグメントうちの少なくとも一つを使う
ステップをさらに含んでいる請求項１２０に記載の方法。
前記切断ステップが、前記微小器官のいずれか一つの中に最も深く位置している細胞が、最も近い表面から少なくとも約８０ミクロン離れかつ約３７５ミクロンを超えて離れないように、組織の生検試料を前記複数のフラグメントに切断して前記微小器官を作製するステップを含んでいる請求項１２０に記載の方法。
前記移植ステップが、複数の微小器官を前記被検者の予め選択された領域に、微小器官の予め定められた領域濃度で移植するステップをさらに含んでいる請求項１２０に記載の方法。
前記移植ステップが、複数の微小器官を被検者の予め選択された容積に、微小器官の予め定められた容積濃度で移植するステップをさらに含んでいる請求項１２０に記載の方法。
微小器官を作製し送達する方法であって：
組織の生検試料を得るため使用する組織スクレーパー、
その組織の生検試料を複数のフラグメントに切断して複数の微小器官を作製するために使用する組織切断器、及び
前記組織切断器に取外し可能に連結された少なくとも一つの移植器であって、前記組織切断器に連結されているときに前記複数の微小器官のうちの一つの微小器官を受け取り、そして前記組織切断器から外された後、前記微小器官を被検者に移植するために使う移植器、
を備えた、微小器官を作製し送達する装置を利用し、
その組織の生検試料を前記組織スクレーパーでスクレープし、
その組織の生検試料を、前記組織切断器で前記複数のフラグメントに切断して前記複数の微小器官を作製し、
前記複数の微小器官のうちの前記一つの微小器官を前記少なくとも一つの移植器に取り付け、
前記少なくとも一つの移植器を取り外し、次いで
前記微小器官を、前記少なくとも一つの移植器で移植する、
ステップを含む方法。
前記微小器官がアンギオポンプとして働く請求項１２８に記載の方法。
前記装置が、基板、ランプ及びケーシング内に密封されている請求項１２８に記載の方法。
前記装置が、組織の生検試料を前記装置の一領域から別の領域に移送する少なくとも一つの自動走行機構を含んでいる請求項１２８に記載の方法。
前記組織スクレーパーが前記組織を予め定められた幅にスクレープするように構成されている請求項１２８に記載の方法。
前記組織スクレーパーが前記組織を予め定められた長さにスクレープするように構成されている請求項１２８に記載の方法。
前記組織スクレーパーが前記組織を予め定められた厚さにスクレープするように構成されている請求項１２８に記載の方法。
前記組織スクレーパーが取替え可能な刃を有している請求項１２８に記載の方法。
前記装置が組織の生検試料をすすぐための洗浄装置を備えている請求項１２８に記載の方法。
前記洗浄装置が培地を組織の生検試料に加えるようにさらに作動する請求項１２８に記載の方法。
前記組織の生検試料を処置した後に移植するステップをさらに含んでいる請求項１２８に記載の方法。
前記処置が、洗浄、形質転換、培養及びこれらの組合わせからなる群から選択される請求項１３８に記載の方法。
前記装置がその中の温度を制御する手段を含んでいる請求項１２８に記載の方法。
前記組織切断器が、微小器官のうちのいずれか一つの中に最も深く位置している細胞が最も近い表面から少なくとも約８０〜１００ミクロン離れかつ約２２５〜３７５ミクロンを超えて離れないように、組織の生検試料を前記複数のフラグメントに切断して前記微小器官を作製するように設計された複数の平行な外科グレードの刃を備えている請求項１２８に記載の方法。
前記組織切断器が、組織の生検試料に対し角度をつけて配置されている複数の平行な外科グレードの刃を備えている請求項１２８に記載の方法。
前記組織切断器が、回転可能な円板刃として配置されている複数の平行な外科グレードの刃を備えている請求項１２８に記載の方法。
前記装置が前記複数の微小器官のうちの少なくとも一つの微小器官の生存能力を試験するための生存能力試験チャンバーを備えている請求項１２８に記載の方法。
前記切断のステップが、前記微小器官の各々を複数の微小器官ガイドのうちの単一の微小器官ガイド上に配置するステップをさらに含んでいる請求項１２８に記載の方法。
前記少なくとも一つの移植器が、経皮挿入用でかつ前記複数の微小器官ガイドのうちの一つを受け入れるように作動する細いハウジングを含んでいる請求項１４５に記載の方法。
前記少なくとも一つの移植器が、前記複数の微小器官ガイドのうちの一つを受け入れるように作動する複数の移植器を含んでいる請求項１４５に記載の方法。
前記複数の微小器官ガイドが各々、そのガイドに配置された前記微小器官を移植するため位置決めするときに示す位置マーカーを含んでいる請求項１４５に記載の方法。
前記複数の微小器官ガイドが各々、そのガイドの遠位部分を破断して、そのガイドに配置された前記微小器官に先端を形成させるノッチを含んでいる請求項１４５に記載の方法。
前記複数の微小器官ガイドが各々、そのガイドに配置されている前記微小器官が移植されるときに示す位置マーカーを含んでいる請求項１４５に記載の方法。
前記方法が、前記装置を一度の使用後に捨てることをさらに含む請求項１２８に記載の方法。
前記組織の生検試料が、肺臓、肝臓、腎臓、筋肉、脾臓、皮膚、心臓、リンパ節及び骨髄からなる群から選択される組織又は器官由来の試料である請求項１２８に記載の方法。
組織の生検試料のドナーと被検者が同じ個体である請求項１２８に記載の方法。
組織の生検試料のドナーと被検者が異なる個体である請求項１２８に記載の方法。
組織の生検試料のドナーがヒトである請求項１２８に記載の方法。
組織の生検試料のドナーがヒト以外の哺乳類である請求項１２８に記載の方法。
前記被検者がヒト以外の哺乳類である請求項１２８に記載の方法。
前記被検者がヒトである請求項１２８に記載の方法。
前記装置が制御システムを含んでいる請求項１２８に記載の方法。
前記切断ステップが、第一の複数の組織フラグメントに切断して第一の複数の微小器官を作製するステップをさらに含み、そして
前記移植するステップが、第二の複数の微小器官を移植するステップをさらに含み、前記第二の複数が、前記第一の複数に等しい複数、前記第一の複数より１小さい複数及び前記第一の複数より２小さい複数からなる群から選択される請求項１２８に記載の方法。
前記切断ステップが、第一の複数の組織フラグメントに切断して第一の複数の微小器官を作製するステップをさらに含み、そして
前記移植するステップが、第二の複数のフラグメントを移植するステップをさらに含み、前記第二の複数は前記第一の複数より１小さく、そして
前記方法が、生存能力試験のために端縁フラグメントを使う
ステップをさらに含んでいる請求項１２８に記載の方法。
前記切断ステップが、第一の複数の組織フラグメントに切断して第一の複数の微小器官を作製するステップをさらに含み、そして
前記移植するステップは、第二の複数の組織フラグメントを移植するステップをさらに含み、その第二の複数が前記第一の複数より２小さく、
前記方法が、第一端縁フラグメントを生存能力試験のために使用し、そして
第二端縁フラグメントを廃棄する、
ステップをさらに含んでいる請求項１２８に記載の方法。
前記切断ステップが、前記微小器官のいずれか一つの中に最も深く位置している細胞が、最も近い表面から少なくとも約８０ミクロン離れかつ約３７５ミクロンを超えて離れないように、組織の生検試料を前記複数のフラグメントに切断して前記微小器官を作製するステップを含んでいる請求項１２８に記載の方法。
前記切断ステップが、前記微小器官のいずれか一つの中に最も深く位置している細胞が、最も近い表面から少なくとも約１００ミクロン離れかつ約２２５ミクロンを超えて離れないように、組織の生検試料を前記複数のフラグメントに切断して前記微小器官を作製するステップを含んでいる請求項１２８に記載の方法。
前記移植ステップが、複数の微小器官を前記被検者の予め選択された領域に、微小器官の予め定められた領域濃度で移植するステップをさらに含んでいる請求項１２８に記載の方法。
前記移植ステップが、複数の微小器官を被検者の予め選択された容積に、微小器官の予め定められた容積濃度で移植するステップをさらに含んでいる請求項１２８に記載の方法。
前記組織の生検試料は分層厚さの組織生検試料である請求項１２８に記載の方法。
全断面直径が０．３〜５ｍｍであり、かつ標的に対する近位末端及び遠位末端を有する細長い体を含む微小鉗子であって、前記細長い体が以下のもの：
前記近位末端にある二つのリップであって、それらの間に間隙を規定するリップ；及び
近位方向の横方向の力が直径の増大に適用されたときに前記二つのリップを互いに対して押しつけるように構成された、前記細長い体に沿った全断面直径における直径の増大
を含む微小鉗子。
前記直径の増大が前記リップの少なくとも一つに沿った折り畳みである請求項１６８に記載の微小鉗子。
前記直径の増大が前記リップの少なくとも一つに沿った傾斜である請求項１６８に記載の微小鉗子。
シリンジと共に作動するように構成された請求項１６８に記載の微小鉗子であって、前記シリンジの中に前記細長い体が挿入されることができ、前記シリンジは前記直径の増大より小さい内部直径を有し、前記シリンジは前記細長い体の前記遠位末端に固定的に取り付けられたピストンをさらに有し、かくして前記ピストンが前記シリンジ中に引かれると近位方向の横方向の力が前記シリンジによって前記直径の増大に適用され、前記リップに前記標的を把持し把握させる微小鉗子。
ハイペレミック針をさらに含む請求項１７１に記載の微小鉗子であって、前記ハイペレミック針の中に前記細長い体が挿入されることができ、前記ハイペレミック針は前記直径の増大より小さい内部直径を有し、前記シリンジによって操作される前記ハイペレミック針は近位方向の前記横方向の力を前記直径の増大に適用して、前記リップに前記標的を把持し把握させるように作動する微小鉗子。
カテーテルと共に作動するように構成された請求項１６８に記載の微小鉗子であって、前記カテーテル中に前記細長い体が挿入されることができ、前記カテーテルは前記直径の増大より小さい内部直径を有し、前記カテーテルは近位方向の前記横方向の力を前記直径の増大に適用して、前記リップに前記標的を把持し把握させる微小鉗子。