JP2005531295A - オルトポックスウイルス抗ウイルス薬のスクリーニング方法 - Google Patents
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Abstract
本発明の目的は、病原性ポックスウイルスに起因するヒト疾患の治療または予防用の有効な抗ポックスウイルス薬である。より詳細には、本発明は、コアタンパク質変異(感染性ビリオンの産生および拡大に必要不可欠なステップ)を担うポックスウイルスプロテイナーゼをターゲティングする抗ウイルス薬に関する。
Description
[連邦政府援助]
本発明は、合衆国政府からの支援(NIH助成金番号AI−48486−02)を一部使用して実施した。
本発明は、合衆国政府からの支援(NIH助成金番号AI−48486−02)を一部使用して実施した。
[発明の分野]
本発明の目的は、病原性ポックスウイルスに起因するヒト疾患の治療または予防用の有効な抗ポックスウイルス薬である。より詳細には、本発明は、コアタンパク質変異(感染性ビリオンの産生および拡大に必要不可欠なステップ)を担うポックスウイルスプロテイナーゼをターゲティングする抗ウイルス薬に関する。
本発明の目的は、病原性ポックスウイルスに起因するヒト疾患の治療または予防用の有効な抗ポックスウイルス薬である。より詳細には、本発明は、コアタンパク質変異(感染性ビリオンの産生および拡大に必要不可欠なステップ)を担うポックスウイルスプロテイナーゼをターゲティングする抗ウイルス薬に関する。
[関連分野の説明]
バイオテロリズムの不安は、現代社会に暗影を投じている。微生物を増殖および操作する能力により、感染症および遺伝病の両方と戦うための治療および薬物を開発するための驚異的な数の新規の能力を有する生物医学者を生み出している。不運なことに、これらの同一のテクノロジーは影の側面を有している。精巧な装置をほとんど必要とせずに、微生物学および遺伝操作ツールにより、個人または組織が環境に意図的に散布するための病原性微生物を容易に大量に調製することが可能である。従来の兵器と異なり、病原性微生物は、複製および伝播する能力を有し、兵士と市民を区別せず、一旦放出されると、撤回も制御もできない。
バイオテロリズムの不安は、現代社会に暗影を投じている。微生物を増殖および操作する能力により、感染症および遺伝病の両方と戦うための治療および薬物を開発するための驚異的な数の新規の能力を有する生物医学者を生み出している。不運なことに、これらの同一のテクノロジーは影の側面を有している。精巧な装置をほとんど必要とせずに、微生物学および遺伝操作ツールにより、個人または組織が環境に意図的に散布するための病原性微生物を容易に大量に調製することが可能である。従来の兵器と異なり、病原性微生物は、複製および伝播する能力を有し、兵士と市民を区別せず、一旦放出されると、撤回も制御もできない。
生物戦は、本来は先進工業国の軍隊相互間の対立の間は、その潜在的開発に限られていたが、テロリズムおよびドメスティックバイオレンスの脅威の拡大により、これらの薬剤をこの目的のために同様に使用することができる可能性が高まっている。これに関する最も高い脅威をもたらすと考えられる生物剤は、Bacillus anthracis(炭疽病)、Yersinia pestis(腺ペスト)、Francisella tularensis(野兎病)、Coxiella burnetti(Q熱)、出血性RNAウイルス(例えば、デング熱、マールブルグ病、エボラ熱、およびベネズエラウマ脳炎)、および天然痘である。これらの病原因子のいずれについても意図的な導入は壊滅的であり、一般市民に最も危害を加える可能性のある病原因子は、天然痘または関連する遺伝子操作されたオルトポックスウイルスである。
天然痘は、記録に残っている歴史のなかで最も破壊的な疾患であった。全人類の約1/10が死亡したか、身体障害者になるか、外見が損なわれたと推定されている。20世紀のみで、3億人以上がこの疾患で死亡している。痘瘡ウイルス(天然痘の病原体)は、非常に感染力が強く、最も感染しやすい個体では接触で明らかに疾患を発症する。
天然痘は、通常、感染個体によって拡散されたエアゾール小滴(aerosol droplet)の吸入によって感染する。10〜14日の前駆症状期間の後、高熱および倦怠感によって特徴付けられる明らかな疾患(frank disease)を発症する。2〜3日後、患者の体温は低下し、典型的な膿疱性病変によって特徴付けられる全身性発疹を発症し、これは2〜3週間続き得る。大痘瘡(Variola major)などの天然痘のより感染力の強い形態では、30%もの感染患者が死亡する。治癒した患者は生活に支障をきたす。
この疾患は、バイオテロリズムの病原因子として「理想的」となる以下の多数の特徴を有する。1)このウイルスは容易に増殖し、凍結乾燥することができ、生存を維持するためのコールドチェーンを必要としないこと、2)呼吸器経路によって感染が広がること、3)前駆症状期間が長く、現代の旅行の容易さと組み合わせて感染個体によりこの疾患を広範に蔓延させることができること、4)得られた瘢痕が心理的影響を与え続けること、および5)ウイルスが拡散した後に環境下で非常に安定であり、汚染除去が非常に困難となること。
天然痘が最も重要な関心事であるが、他のオルトポックスウイルス病原体を無視すべきではない。例えば、サル痘ウイルスがヒト集団に最近侵入しており、これまでのところヒト−ヒト感染は制限されているようである。別のより恐ろしいシナリオは、ワクシニアウイルスまたは牛痘ウイルスの実験株(laboratory strain)を遺伝子操作して強力な病原体に変換する毒素を産生させることができるという可能性である。幸運なことに、オルトポックスウイルスは、DNAレベルで非常に関連が強く(例えば、痘瘡とワクシニアで90%)、開発されたいずれの抗ウイルス薬でもこのウイルス群全体の複製を阻害できる可能性がある。
天然痘はもはや自然環境下で存在せず、近い将来破壊する予定の痘瘡ウイルスの実験用ストックが残存していることはほとんど知られていない。動物に蓄積されないヒトに特異的な疾患であり、血清型が1つであり、ジェンナー(Jenner)によって開発された弱毒化ワクチンにより免疫系の細胞性アームおよび体液性アームの両方を有効に刺激して長期的に免疫を得ることができるので、天然痘の根絶は可能であった。天然痘は、米国では1960年代に根絶し、日常的な予防免疫接種は1973年に中断された。
その後の30年間で、免疫学的にナイーブであり、オルトポックスウイルス感染に非常に感受性が高い集団が誕生している。小さいが重要なワクチン接種由来の重篤な合併症リスク(特に、HIVまたは他の病原因子の感染による免疫無防備状態)のために、一般大衆の一斉予防接種は賢明ではない。それにもかかわらず、万一感染性オルトポックスウイルスが集団に取り込まれた場合には、一旦診断されると疾患の蔓延の制限には生ワクチンが有効な武器となる。
曝露前または曝露後2〜3日以内のワクチン接種により、ほとんど完全に防御される。曝露から4〜5日後の遅いワクチン接種では、死から防御することができる。不運なことに、万一感染性病原因子が人口の多い地域に意図的に導入された場合、センチネル事例が診断されるまで、感染患者の巨大な貯蔵庫となる。さらに、利用可能なワクチンストックは比較的制限されている。これらの理由によって、防御手段として、防御免疫を産生して蔓延の抑制に役立てる時間が充分にないウイルスに曝された個体を治療するために有効な抗オルトポックスウイルス薬を利用可能にすることが急務である。
培養細胞におけるオルトポックスウイルス感染阻害に有効な唯一の周知の薬物は、メチサゾンまたはIBT(N−メチリサチンβ−チオセミカルバゾン)である。しかし、この薬物は感染したヒトの治療における価値は限られている。シドフォビルは、効力な抗オルトポックスウイルス阻害剤であることが証明されているが、重篤な副作用を有し、注射によって送達させなければならない。したがって、現在利用可能な安全、有効、且つ経口投与可能な抗オルトポックスウイルス薬は存在しない。
ウイルスタンパク質分解の総括
用語「限定的タンパク質分解」は、基質中のペプチド結合の広範な切断に関連するタンパク質分解と対照的に、ポリペプチド中のペプチド結合が選択的に加水分解された反応を説明するためにLinderstrom−Lang及びOttesenによって最初に導入された。ペプチド結合の切断に必要な酵素をプロテアーゼと命名し、これはペプチダーゼとプロテイナーゼに分類される。ペプチダーゼは、ペプチド鎖のアミノ末端またはカルボキシ末端から1つのアミノ酸を加水分解するエクソペプチダーゼである。対照的に、プロテイナーゼ(タンパク質分解酵素またはエンドペプチダーゼとも呼ばれる)は、基質中の特定のペプチド結合を選択的に認識して切断することができる。
用語「限定的タンパク質分解」は、基質中のペプチド結合の広範な切断に関連するタンパク質分解と対照的に、ポリペプチド中のペプチド結合が選択的に加水分解された反応を説明するためにLinderstrom−Lang及びOttesenによって最初に導入された。ペプチド結合の切断に必要な酵素をプロテアーゼと命名し、これはペプチダーゼとプロテイナーゼに分類される。ペプチダーゼは、ペプチド鎖のアミノ末端またはカルボキシ末端から1つのアミノ酸を加水分解するエクソペプチダーゼである。対照的に、プロテイナーゼ(タンパク質分解酵素またはエンドペプチダーゼとも呼ばれる)は、基質中の特定のペプチド結合を選択的に認識して切断することができる。
プロテイナーゼは、その相対的な三次元の位置がグループ内に保存されたその触媒性アミノ酸残基の同一性および触媒機構に基づいて4つのクラスにさらに分類される。以下の4つのプロテイナーゼ型が存在する。セリンプロテイナーゼ、システイン(チオール)プロテイナーゼ、アスパラギン(酸)プロテイナーゼ、および金属プロテイナーゼ。セリンプロテイナーゼは、アスパラギン酸残基、ヒスチジン残基、およびセリン残基の触媒性三つ組み(triad)を有し、最も一般的で広範囲に及ぶプロテイナーゼ型のようである。システインプロテイナーゼは、システインおよびヒスチジン残基が極めて接近して構成された触媒性二つ組み(diad)を維持しているのに対し、アスパラギン酸プロテイナーゼは2つのアスパラギン酸残基を必要とする。金属プロテイナーゼについては、分析用のために必須ヒスチジンおよびグルタミン酸残基と共に2価のカチオン(通常、Zn2+)が必要である。
プロテイナーゼを、上記の触媒部位および基質結合ポケットを有する最も基本的な形態と見なすことができる。2つの部位は、通常、極めて密接している。一般に、プロテイナーゼは、触媒に関与するアミノ酸が基質結合溝のそれぞれ半分によって寄与される2つの球状ドメインを構成する。ほとんどのセリン、システイン、およびアスパラギン酸プロテイナーゼでは、2つの球状ドメインが同一のポリペプチド内に見出される。しかし、レトロウイルスプロテイナーゼの場合、二量体の複合体を使用して、2つの各触媒中心が結合して溝を形成する。ほとんど全ての基質結合溝が各プロテイナーゼクラスの触媒性アミノ酸に関して類似の三次元構造を達成するにもかかわらず、構造の保存は基質結合ポケットに及んでおらず、所与のプロテイナーゼが他の全てのプロテイナーゼと区別される。この基質結合領域によりプロテイナーゼに特異性が付与される。
特異的ペプチド結合の加水分解には2つの要件を満たさなければならないことが一般的に受け入れられている。第1に、反応性の高いペプチド結合は、一次的および二次的特異性に必要な特異的側鎖を有する隣接アミノ酸残基によって定義される必要がある。一次特異性は、切断しやすい結合の選択をターゲティングする質的特徴を有し、二次的特異性は選択された結合の切断の促進による量的特徴を示す。第2に、切断しやすい結合は、通常、プロテイナーゼに接近可能な可動性領域中の基質表面に隣接して露呈し、切断しやすいペプチドはプロテイナーゼの活性部位ポケットに適合する三次元高次構造中に存在しなければならない。これを、「高次構造特異性」という。
リン酸化、グリコシル化、およびアシル化などの多数の翻訳後修飾型には、酵素活性、タンパク質−タンパク質相互作用、および細胞間局在化などのタンパク質特性の獲得および調節が必要である。同様に、タンパク質活性化または遠位の機能性アミノ酸残基を結合させる三次構造の変化によるアセンブリを調節するために限定的タンパク質分解を使用する場合がある。興味深いことに、加水分解されたペプチド結合の再構築に必要な自由エネルギーは高く、破壊されたペプチド結合の対合の生物学的機構は依然として同定されていない。したがって、タンパク質分解切断によって基質に導入された変化は本質的に不可逆的である。この切断特異性と反応不可逆性との組み合わせにより、食物の消化、シグナルペプチドの切断、シグナル伝達、ペプチドホルモン/成長因子の産生、凝血、補体経路カスケード、病原体の除去、細胞移動、および再生を含む広範な種々の生物学的プロセスの一方向性機構としてタンパク質分解プロセシング反応が共通に利用される。
多数の植物および動物ウイルスについて、感染の成功は1つまたは複数の段階でタンパク質分解プロセシングに依存する。実際に、例外的なウイルスはその複製サイクル中にタンパク質分解プロセシングを必要としない。宿主細胞もしくは感染ウイルスのいずれかまたは両方によって必要なタンパク質分解酵素を得ることができる。宿主細胞によって得られたプロテイナーゼは、一般に、細胞の分泌区画を介して輸送される膜タンパク質またはエンベロープタンパク質のプロセシングに寄与する。ウイルスエンベロープタンパク質がシグナルペプチド(シンドビスウイルスのE1およびE2糖タンパク質など)の切断(アシル化およびグリコシル化に加えて)によって成熟することがこれらの分泌区画内で起こる。それに対して、ウイルスタンパク質のタンパク質分解プロセシングを担うプロテイナーゼは、通常、ウイルス自体によってコードされる。
ウイルスポリペプチドのタンパク質分解は、複製サイクル中に反応する機能に依存して、「形式的(formative)」または「形態形成的(morphogenic)」タンパク質分解として分類されている。形式的タンパク質分解は、ウイルスポリタンパク質の構造および非構造タンパク質産物のプロセシングをいう。多数のウイルス形式的切断プロテアーゼが同定されており、これらは、ピコマウイルス(picomavirus)、ファルビウイルス、アルファウイルス、レトロウイルス、およびコロナウイルスなどの動物ウイルスによってコードされる。形式的タンパク質分解によって、巨大タンパク質前駆体からいくつかのウイルスタンパク質を発現させるための1つのRNAテンプレートを使用するためのレトロウイルスおよび+鎖RNAウイルスなどのウイルスの機構が得られる。形態形成的タンパク質分解は、ビリオン成熟中のプレビリオンで構築されたウイルス構造タンパク質の切断をいう。ビリオン構築と同時に形態形成的切断が起こり、これはしばしばピコマウイルス、アルファウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、およびT4バクテリオファージなどの、DNAウイルスおよびRNAウイルスの両者の感染力の獲得に関し必要とされる。形態形成的タンパク質分解についてあまり知られていないにもかかわらず、レトロウイルス粒子の構築における正確なゲノムRNA二量体形成の促進、バクテリオファージT4 DNAの一方向性パッケージング、可動性形態での感染性ポリオウイルスビリオンの完成、および感染開始時のアデノウイルス粒子の適切な分解の促進を含むこのプロセスについてのいくつかの異なる機能が提供されている。
使用したタンパク質分解成熟反応型に関係なく、感染性の子孫ビリオンの有効な産生を確実にするためにウイルスプロテイナーゼの活性が適切に調節されることが不可欠である。一般に、生物系内で、酵素および基質の異なる区画化、特異的阻害剤および/またはアクチベーターの存在、ならびに酵素原のタンパク質分解活性化を含むいくつかの方法でプロテイナーゼが調節される。ウイルスは類似のストラテジーを取り入れている。例えば、レトロウイルスでは、細胞内でのタンパク質の活性部位のその基質との相互作用を一定期間防止するgag−polポリタンパク質の一部の置換によって構造タンパク質の形態形成的切断を誘発するための酸性細胞外環境が提案されている。アデノウイルスの場合、複製の後期段階でpVI構造タンパク質から産生されたDNAおよびジスルフィド結合ペプチドは、ウイルスプロテイナーゼの活性化およびその後のウイルス成熟が必要であるようである。最後に、ヌクレオキャプシドの構築後に自己タンパク質分解を受けて不活性になるシンドビスウイルスのコアタンパク質によってウイルスプロテイナーゼ活性の調節についてのおそらくほとんどの的確な例が得られる。タンパク質分解事象と併せた触媒ポケットへのタンパク質のカルボキシ末端領域の位置付けによってプロテイナーゼ活性が不活化される。
ウイルス遺伝子産物のVV複製サイクルおよび翻訳後修飾
生物系における遺伝子発現の調節手段としての限定的タンパク質分解の重要性、ならびに単純なウイルス系でさえもこの調節機構を見かけ上使用する方法の範囲および多様性を考えると、ワクシニアウイルスなどの複合ウイルス(complex virus)がどのようにしてこのプロセスを複製サイクルに組み込むかを考慮することは興味深い。ワクシニアウイルス(VV)は、ポックスウイルス科(その固有の形態学および細胞質複製部位によって区別されるDNAウイルスファミリー)の原型である。
生物系における遺伝子発現の調節手段としての限定的タンパク質分解の重要性、ならびに単純なウイルス系でさえもこの調節機構を見かけ上使用する方法の範囲および多様性を考えると、ワクシニアウイルスなどの複合ウイルス(complex virus)がどのようにしてこのプロセスを複製サイクルに組み込むかを考慮することは興味深い。ワクシニアウイルス(VV)は、ポックスウイルス科(その固有の形態学および細胞質複製部位によって区別されるDNAウイルスファミリー)の原型である。
191kbpのVV DNAゲノムは、少なくとも263個の遺伝子産物をコードし、その発現は、ウイルスの宿主細胞への侵入を開始し、感染性粒子を形成するための複雑な高分子構造の構築で終了するウイルス複製サイクル中に一過性様式で調節される。多数の他のウイルスと異なり、VVは複数のビリオン形態を産生し、その全てが感染性を示すようである。ポックスウイルスのアセンブリおよび分化についての分子の詳細は未完成で議論の余地があるが、最も広範に認められた事象のシナリオを以下に示す。ウイルスDNA複製後(または同時)、子孫DNA分子の集団、ビリオン酵素、および構造タンパク質が結合してプレビリオン粒子を形成する。中間区画(小胞体とゴルジ体との間)を介した出芽によってこれらの粒子が2つの膜を獲得して、感染性の細胞内成熟ウイルス(IMV)となる。次いで、IMVの一部がトランスゴルジネットワーク由来の2つのさらなる膜に包まれて細胞内エンベロープウイルス(IEV)を形成する。細胞表面への移動後、最も外側のIEV膜が原形質膜と融合して、細胞外エンベロープウイルス(EV)となる。EVは、細胞に結合したままであるか(細胞結合エンベロープウイルス、CEV)、または細胞外エンベロープウイルス(EEV)として外部媒質に放出し得る。牛痘ウイルス(CPV)などのいくつかのポックスウイルスは、依然として別のビリオン形態を産生する。CPV感染細胞では、主に1つの160kDaウイルスタンパク質から構成される巨大な封入体が産生される。これらのA型内で封入体は閉塞(および感染性)ウイルスである。
ウイルス構築および形態形成プロセス中に使用される多数のウイルスコードタンパク質、非常に多数のVVビリオン形態、および多数の異なる細胞内部位を考慮して、VVは、これらの複雑なプロセスを調節するために多数の細胞タンパク質修飾およびターゲティング経路を使用すると予想される。実際、一連のウイルス複製中に、VVタンパク質はアシル化、リン酸化、グリコシル化、ADP−リボシル化、およびタンパク質分解プロセシングを含む多数の翻訳後修飾によって成熟することが証明されている。どの役割がVV複製中にタンパク質分解反応を制限するかについての詳細は本発明者が1990年に研究を開始した時点で得られなかったが、文献で得られた情報により、形式的および形態形成的切断経路の両方を利用することが示唆された。例えば、VV成長因子(VGF)および血球凝集素(HA)タンパク質の両方が小胞体を介したその通過および原形質膜への輸送中に形式的タンパク質分解を介してシグナルペプチドを除去するようであった。同様に、成熟VVビリオンコア内で見出された3つの主要な構造タンパク質(4a、4b、および25K)は、感染後期に高分子量の前駆体から産生され、形態形成的切断の候補となることが公知であった。この10年間に本発明者らの研究所で取り組んできた実験は後者の問題(すなわち、主要なVVコアが成熟するプロセシング反応の性質)であった。
VVタンパク質分解−1990年以前に公知の事項
VV感染後期に発現する遺伝子(すなわち、ウイルスDNA合成の開始後に発現する遺伝子)には、子孫ビリオンの構築に必要なほとんどの構造タンパク質が含まれる。HolowczakおよびJoklikは、VV感染細胞中に存在する放射性標識タンパク質の見かけ上の分子量と精製ビリオンで見出される分子量との比較による相違を留意した場合、いくつかのVV構造タンパク質をタンパク質分解プロセシングに供することができることが最初に指摘された。その後、VV感染細胞のパルス標識を使用して、巨大前駆体タンパク質からより小さいポリペプチドまで追跡し、より大きなサイズのタンパク質が同時に消滅することを証明した。この変換を、前駆体合成に明らかな効果を示さないリファンピシンによって特異的に阻害することができる。前駆体タンパク質をP4aと命名し、タンパク質分解プロセシング産物を4aと命名した。
VV感染後期に発現する遺伝子(すなわち、ウイルスDNA合成の開始後に発現する遺伝子)には、子孫ビリオンの構築に必要なほとんどの構造タンパク質が含まれる。HolowczakおよびJoklikは、VV感染細胞中に存在する放射性標識タンパク質の見かけ上の分子量と精製ビリオンで見出される分子量との比較による相違を留意した場合、いくつかのVV構造タンパク質をタンパク質分解プロセシングに供することができることが最初に指摘された。その後、VV感染細胞のパルス標識を使用して、巨大前駆体タンパク質からより小さいポリペプチドまで追跡し、より大きなサイズのタンパク質が同時に消滅することを証明した。この変換を、前駆体合成に明らかな効果を示さないリファンピシンによって特異的に阻害することができる。前駆体タンパク質をP4aと命名し、タンパク質分解プロセシング産物を4aと命名した。
さらなるパルスチェイス実験により、P4aに加えて、いくつかの他のVV構造ポリペプチドが、VV複製サイクルの後期段階で見かけ上切断されることが明らかとなった。ビリオンタンパク質のSarovおよびJoklik命名法を使用して言及されるこれらのタンパク質分解プロセシングタンパク質は、4a、4b、VP8(本発明者らの研究では25Kと呼ぶ)、9、および10を含んでいた。これは、実際、タンパク質分解を受けるVV後期タンパク質数の過小評価を示し得る。VVコアタンパク質4a、4b、VP8(25K)は、VV粒子中で最も豊富なタンパク質であり、ビリオン質量の約33%を占める。
トリプシンペプチドマッピングおよび免疫試薬を使用して、P4a、P4b、およびP25K前駆体とそのプロセシング産物4a、4b、および25Kとの間の関係を確立した。これらの遺伝子をコードする3つの遺伝子座の位置をマッピングし、そのオープンリーディングフレームのヌクレオチド配列を決定した。VVのコペンハーゲン株の全ゲノム配列を取りまとめて、P4a、P4b、およびP25K前駆体をコードする遺伝子を、それぞれA10L、A3L、およびL4Rと命名した。VV構造タンパク質のタンパク質分解プロセシングは、感染性子孫ビリオンの形成に不可欠なようである。この結論は、全タンパク質合成に影響を与えずに見かけ上タンパク質分解(および粒子成熟)に影響を与える種々の異なる薬物処置(例えば、リファンピシンおよびα−アマニチン)またはゲノムの条件致死変異が存在するという所見に起因する。
本発明の目的は、病原性ポックスウイルスに起因するヒト疾患の治療または予防用の有効な抗ポックスウイルス薬である。本発明者らの抗ウイルス薬開発の目的は、コアタンパク質変異(感染性ビリオンの産生および拡大に必要不可欠なステップ)を担うポックスウイルスプロテイナーゼである。
本発明者らは、コアタンパク質成熟の触媒を担うウイルス遺伝子産物を同定し、抗ウイルス標的と確証するためにこれを遺伝子アプローチで使用した。発現ベクターテクノロジーを使用して、大量のコアタンパク質プロテイナーゼを発現および精製する。精製プロテイナーゼは、潜在的阻害剤の同定に対する以下の二方面の(two−pronged)アプローチのための出発材料として使用することができる。1)合理的薬物デザインと組み合わせた構造−機能分析、および2)潜在的プロテアーゼ阻害剤の制限されたライブラリーに対する高処理スクリーニングの使用に適切なインビトロ切断アッセイの開発。いずれかのアプローチによって同定されたリード化合物は、組織培養細胞において種々のオルトポックスウイルスの複製を阻害する。これらの化合物は、環境への病原性ポックスウイルスの意図的導入に対する迅速な応答防御の提供に有用な抗ウイルス薬である。
特に、本発明の目的は、強力且つ特異的で、費用効果的様式で産生または合成することができ、経口送達することができ、その作用様式が十分に理解されている抗オルトポックスウイルス薬の開発である。この理由のために、本発明者らは、薬物開発の標的としてオルトポックスウイルスコアタンパク質プロテイナーゼ(vCPP)を選択した。本発明者らは、vCCPとしてI7LおよびG1L遺伝子によってコードされるシステインプロテイナーゼを同定した。オルトポックスウイルス複製サイクルにおけるこれらの酵素の役割は、比較的十分に理解されており、これらは固有の基質認識部位を有するようであり、これらの酵素の要件は全てのオルトポックスウイルスで保存されている。
本発明は、病原性オルトポックスウイルス(天然痘など)の成長を阻害することができる化合物ならびにヒト宿主における疾患関連病理学を発見および開発する手段を提供する。
有効な抗ウイルス薬の開発には、その破壊がウイルスに致命的であり、且つ宿主には比較的良性である特異的相互作用または活性の同定が必要である。オルトポックスウイルスなどのウイルスがその複製中に多数の宿主細胞酵素および代謝経路を使用する偏性(obligate)細胞内寄生虫であるので、この作業はしばしば非常に困難であり、この事実は主に首尾の良い抗ウイルス薬の相対的な少なさの原因である。アシクロビルなどの有効であることが証明された薬物は、典型的には、ヌクレオチド代謝または生合成酵素に指向する。核酸生合成に関与する多数のオルトポックスウイルスコード酵素は、その哺乳動物の対応物と相同性が非常に高いので(例えば、ワクシニアウイルスチミジンキナーゼはヒト酵素と90%を越えて同一)、不可能ではないにしても、これらのウイルス酵素を特異的に遮断する化合物を同定することは困難であることが以前に証明されている。
ほとんどのウイルスは、抗ウイルス薬開発の新規の標的クラスが見込まれる、その発生サイクルの重要なステップとしてウイルスコードプロテイナーゼによって触媒されるタンパク質分解を使用する。最近、ヒト宿主の疾患の予防に非常に有効であることが証明されたHIV、C型肝炎ウイルス、およびインフルエンザ酵素を特異的にターゲティングするプロテイナーゼ阻害剤が開発された。したがって、オルトポックスウイルスコアタンパク質のタンパク質分解変異が感染性子孫の産生に絶対的に必要であることに留意することは特に興味深い。この10年間での本発明者らの研究所での研究により、コアタンパク質前駆体の直接エンド型タンパク質切断に必要な固有のcisシグナルが同定され、コアタンパク質成熟の状況要件が確立され、この不可欠な反応を行うプロテイナーゼがウイルスによってコードされることが強く示唆された。本発明は、この魅力的な標的およびこの問題について取り組んだ本発明者らの多数の経験を活用して、ウイルスコアタンパク質プロテイナーゼ(vCPP)の特異的な力学的阻害に基づいてオルトポックスウイルス複製を阻害する有効な抗ウイルス薬を開発する。
特に、本発明は、以下を提供する。
1.オルトポックスウイルスコアタンパク質成熟を担うvCCP。
2.不可欠な遺伝子産物としてvCPPを確証するための条件致死遺伝子アプローチの使用。
3.大量のvCPPの産生および精製が可能な哺乳動物および/または原核生物発現ベクターテクノロジーの使用。
4.精製vCPPの構造−機能および生化学分析。
5.vCPP酵素活性を測定するためのインビトロ切断アッセイおよび潜在的なプロテイナーゼ阻害剤のサブライブラリーに対する機構ベースの高処理スクリーニング手順におけるアッセイの使用。
6.vCPP活性の遮断による組織培養細胞における種々のオルトポックスウイルスの複製を阻害するリード化合物の証明。
1.オルトポックスウイルスコアタンパク質成熟を担うvCCP。
2.不可欠な遺伝子産物としてvCPPを確証するための条件致死遺伝子アプローチの使用。
3.大量のvCPPの産生および精製が可能な哺乳動物および/または原核生物発現ベクターテクノロジーの使用。
4.精製vCPPの構造−機能および生化学分析。
5.vCPP酵素活性を測定するためのインビトロ切断アッセイおよび潜在的なプロテイナーゼ阻害剤のサブライブラリーに対する機構ベースの高処理スクリーニング手順におけるアッセイの使用。
6.vCPP活性の遮断による組織培養細胞における種々のオルトポックスウイルスの複製を阻害するリード化合物の証明。
本発明は、vCPPに対する阻害プロフィールで非常に特異的であり、非常に強力であるので、非常に低濃度しか必要とせず、全身毒性を示すことなく優れた生物学的利用能を提供する化学的特徴を有する抗ポックスウイルス化合物の同定手段を提供する。このような化合物はまた、合成が容易且つ経済的であり、例外的な処方上の問題もなく、長期保存に対して安定である。
vCPPの発現および精製
単一特異性ポリクローナル抗血清の産生により、細胞内合成およびvCPPタンパク質の運命に従い、精製およびアッセイの開発を補助することが可能となる。
単一特異性ポリクローナル抗血清の産生により、細胞内合成およびvCPPタンパク質の運命に従い、精製およびアッセイの開発を補助することが可能となる。
インタクトなタンパク質内の複数のエピトープを認識する広範な反応性を有する抗血清を誘導するための免疫原の供給源として使用するために発現ベクター中で全vCPP ORF(オリゴヒスチジンタグを含むか含まない)を発現することができる。原核生物発現ベクターを使用することができるが、vCPPはプロテイナーゼであるので、細菌細胞におけるこの活性の発現は致死的であり、目的のクローンの単離を阻害し得る。この問題が生じる場合、2つの代替法を使用することができる。第1に、誘導しないで発現を最小にし、発現細胞が死滅する前に誘導初期にvCPPを精製するために、外来インサートの発現を非常にストリンジェントな調節下におく発現ベクターを使用することが可能である。第2に、vCPPタンパク質の不活性形態をクローン化および発現することができる。
HXXEHモチーフ内の残基の変異は、G1L酵素活性を阻害することが知られている。類似の変異を、I7Lの潜在的な触媒二つ組み(diad)に導入することができる。vCPPタンパク質の小部分のみを含むインフレーム融合タンパク質を産生するための原核生物発現ベクターの使用またはこれらの領域に対応する合成ペプチドの合成(必要に応じて、ペプチドのキャリアタンパク質への結合)のいずれかによってサブドメイン特異的抗血清を作製することもできる。これらのアプローチの両方を使用して、VVコアタンパク質のいくつかに対する領域特異的抗血清が首尾よく得られた。G1LおよびI7L ORFのコンピュータ分析により、タンパク質全体に存在する潜在的な免疫原性エピトープが存在し、これらの多くがタンパク質表面に存在すると予想されることが示唆される。インビボ実験で使用されることに加えて、サブドメイン特異的抗血清は、vCPPタンパク質の触媒および結合ドメインの探索に有用であるはずである。
vCPPの構造を探索するためにさらなる免疫試薬が必要である場合、モノクローナル抗体の産生における免疫原として精製vCPPタンパク質を使用することができる。いかなる場合でも、由来する全ての血清の免疫反応性をマッピングし、vCPPタンパク質短縮の遺伝子操作されたネスト化組の使用またはBIAコア技術によって確認することができる。
生化学的特徴づけおよびアッセイの開発で使用するために酵素を過剰発現させるために、真核細胞および原核細胞の両方でvCPPタンパク質を過剰発現させ、精製し、特徴付けることができる。vCPPタンパク質の1つの供給源は、VV感染哺乳動物細胞に由来する。哺乳動物細胞での発現は、細胞酵素またはウイルス酵素のいずれかによって触媒される任意の潜在的な翻訳後修飾が起こるという利点を有する。プロセシングを遮断するためにリファンピシンの存在下で行った野生型VV感染から十分な量のvCPPタンパク質を単離することが可能であるにもかかわらず、近年のVVベクターテクノロジーの進歩により、vCPPタンパク質を容易に過剰発現させることが可能である。
vCPPを発現するORFを、T7プロモーターおよびEMC翻訳エンハンサーのプラスミドベクター下流に挿入することができる。次いで、このプラスミドを、VV(MVA株):T7組換え体で重感染させたレシピエント哺乳動物細胞にトランスフェクトすることができる。これらの条件下で、プラスミドから高レベルのvCPPタンパク質発現を駆動するT7 RNAポリメラーゼ遺伝子のゲノムコピーが発現される。しかし、VVのMVA株は哺乳動物細胞中でその複製サイクルを完了することができないので、VVコアタンパク質の状況的(contextual)プロセシングが中止され、vCPPタンパク質が蓄積される。あるいは、市販のバキュロウイルス発現ベクターを使用することができる。これらはグリコシル化されていないにもかかわらず(vCPPの場合起こりそうにない)、昆虫細胞中で産生された哺乳動物タンパク質は、通常機能的である。
原核細胞中でvCPPタンパク質を過剰発現させるために、SPEX系を使用することができる。これは、タンパク質を産生および輸送するための種々のStreptococcus属またはLactococcus属などの非病原性GRAS(一般的に安全)グラム陽性細菌を使用するタンパク質発現ベクターである。この系は、米国特許第5,821,088号(その内容は本明細書中に参考することによって組み込まれる)に記載されている。SPEX系は、全てのグラム陽性細菌が細胞表面上でのタンパク質の輸送および固定に使用する保存経路を活用する。異種タンパク質は、グラム陽性宿主の細胞表面上に発現するように指示されるか、融合パートナーとしてMタンパク質(化膿連鎖球菌の繊維状表面タンパク質)の一部の使用によって培養培地に分泌される。
Mタンパク質由来のシグナル配列およびプロペプチド配列を、グラム陽性宿主細胞の細胞膜を介して移送するために目的の遺伝子産物に融合し、所望のタンパク質を培養培地に直接分泌させる。vCPPの原核生物産生に十分に適合するベクター系のいくつかの利点には、以下が含まれる。1)組換えベクタークローニング操作は標準的な大腸菌法を使用すること、2)SPEX発現株への組換えベクターの1ステップ選択導入、3)GRAS発現ベクター株(酵素のGLP組の産生により影響を受けやすいはずである)、4)LPSなどの有毒な細胞内産物を放出しないこと、5)可溶性形態でタンパク質産物を産生し、活性な高次構造(ペリプラズム中に不溶性封入体を形成する大腸菌中に産生された多数のタンパク質と異なる)を推測することができること、6)発現したタンパク質産物の明らかなサイズ制限がないこと(150kDa以上)、7)ウシ産物を欠く(BSE汚染の可能性がない)簡単な実験培地での産生コストの低さ、8)高収率(至適化することなく1リットルの細菌培地あたり3〜5mgのタンパク質)、および9)グラム陽性細菌が高密度発酵に影響を受けるので、製造用にスケールアップすることができること。この系を使用して、本発明者らは、すでに多数の抗原的に信頼のおける酵素活性外来タンパク質を発現している。
哺乳動物および細菌供給源の両方由来のvCPPタンパク質を、伝統的および/または免疫親和性のクロマトグラフィ手順の組み合わせを使用して精製することができる。迅速に作業し、冷所で作業し、酵素活性の維持が促進される可能性のある条件下(例えば、グリセロールの添加および/またはタンパク質濃度を高く保つこと)でクロマトグラフィの画分を保存することが推奨される。vCPPの精製能力をさらに高めるために、そのN末端またはC末端に融合した短いオリゴヒスチジン領域を含むvCPPタンパク質が発現されるように真核生物および原核生物発現ベクターを再操作することができる。次いで、hisタグ化G1Lおよび/またはI7Lタンパク質を、当分野で公知の方法を使用した金属アフィニティクロマトグラフィーによって直接精製することができる。
vCPPタンパク質のいずれかの末端への6〜10個のヒスチジン残基の添加ではその酵素活性に影響を与えない。化膿連鎖球菌のソルターゼ(sortase)またはspeBプロテイナーゼのN末端へのヒスチジン−タグの添加により、タンパク質のその天然の基質上で触媒する能力に影響を与える証拠はないことが以前に証明されている。同様に、科学者は、SpeB、ソルターゼ、およびDegPプロテイナーゼについての精製プロトコールを首尾よく開発している。
vCPP切断アッセイ
ビリオン構築の状況下でインビボのみでVVコアタンパク質前駆体のタンパク質分解が起こるという事実にもかかわらず、本発明者らは、合理的薬物デザインおよび/またはHTSと共に使用するための切断アッセイを確立した。このアッセイは、形態形成的切断反応にも関与する種々の他のウイルスプロテイナーゼのためのインビトロ切断アッセイを開発する本発明者らの能力に基づく。vCPPプロテイナーゼの精製は進行中であり、適切な基質を同定し、有用な形式をデザインし、AG(X)モチーフの特異的エンド型タンパク質分解切断を好む条件を開発する。SpeB、ソルターゼ、およびDegP酵素の特異的切断アッセイは既に確立されており、類似のアプローチを本発明で使用する。以下は、その後の薬物開発における複雑性および潜在的利用可能性のために示した3つの異なるアッセイ型を概説する。
ビリオン構築の状況下でインビボのみでVVコアタンパク質前駆体のタンパク質分解が起こるという事実にもかかわらず、本発明者らは、合理的薬物デザインおよび/またはHTSと共に使用するための切断アッセイを確立した。このアッセイは、形態形成的切断反応にも関与する種々の他のウイルスプロテイナーゼのためのインビトロ切断アッセイを開発する本発明者らの能力に基づく。vCPPプロテイナーゼの精製は進行中であり、適切な基質を同定し、有用な形式をデザインし、AG(X)モチーフの特異的エンド型タンパク質分解切断を好む条件を開発する。SpeB、ソルターゼ、およびDegP酵素の特異的切断アッセイは既に確立されており、類似のアプローチを本発明で使用する。以下は、その後の薬物開発における複雑性および潜在的利用可能性のために示した3つの異なるアッセイ型を概説する。
a)ELISA。任意選択的にP4b切断部位由来の周辺アミノ酸をさらに含むAG(X)モチーフを含むペプチドを得る。ペプチドを標識する。標識は、アミノ末端などのペプチドの一方の末端に連結したIAEDANまたはジダンシル−L−システイン(Molecular Probes、OR)などの蛍光タグであり得る。ペプチドを活性化マイクロタイタープレートに用いて、インキュベートし(例えば、一晩)、その後ブロッキング溶液でプレートの反応表面をコートする。プレートにvCPPを添加し、切断範囲を、例えば、TECANマイクロ蛍光光度計(microfluorimeter)を使用してモニタリングする蛍光の放出によって経時的にモニタリングした。あるいは、一次抗体として切断部位特異的抗血清と共に標準的なELISA形式を使用した免疫学的読出しを使用することができる。
b)FPA(蛍光近接アッセイ(Fluorescence proximity assay))。このアッセイは、ペプチドのNH2末端およびCOOH末端にコンジュゲートしたプローブの蛍光消光対に基づく。切断前などに蛍光基にきわめて近接して消光基が存在する場合、蛍光エネルギーは消光基に吸収されて比較的低いまたはベースラインのシグナルを発する。プロテアーゼによるペプチドの切断後、消光基を、蛍光基の間近から「移動させ」、プローブの蛍光はベースラインを超えて上昇する。これは非常に感度の高いアッセイであり、HTSについて至適な形式(いわゆる「混合して測定する(mix−and−measure)」)である。
一方の末端にコンジュゲートしたダブシルスクシンイミジルエステル(ダブシル)基および他方の末端にコンジュゲートしたEDANS基(5−(2−アミノエチル)アミノ)ナフタレン−1−スルホン酸)を有する定義されたAG(X)切断部位を含むペプチドを得る。1つの可能な実施形態では、ダブシル基はNH2末端にコンジュゲートし、EDANS基はCOOH末端にコンジュゲートする。ダブシルは蛍光性を示さないが、EDANSのピーク発光スペクトルに重複する強い吸収を示す。このペプチドを黒色プレートのウェルに滴定し、vCPPプロテアーゼを添加する。蛍光の増加は、ペプチドの切断を示す。
c)HTRF。AG(X)切断部位および共鳴エネルギー移動に必要な試薬で標識するためにいずれかの末端に修飾基を含むようにFPAアッセイに記載のペプチドに類似のペプチドを合成する。ペプチドのアミノ末端をビオチン化し、カルボキシル末端はポリヒスチジンタグを有する。HTRFアッセイは、励起ユーロプリンクリプタート(Euクリプタート)基から修飾アロフィコシアニン(XL665)への蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)に依存する。市販のストレプトアビジンを使用してアミノ末端を修飾し、市販のEuクリプタート結合抗His6抗体(Packard Bioscience Co.,Maeriden,CA)を使用してペプチドのカルボキシ末端を修飾することができる。この試薬を337nmで励起した場合、近接によってEuクリプタートはXL665にエネルギーを移動する。次いで、XL665はエネルギーを失い、665nmで発光する。ペプチドの切断後、励起EuクリプタートからXL665への共鳴エネルギー移動は起こらず、得られた665nmでの発光シグナルは減少する。
vCPP阻害剤の合理的薬物デザイン
当業者は、アッセイ形式が好ましいものは全て容易に使用することができ、反応を至適化するために反応条件(プロテアーゼ:基質比、イオン強度、温度、疎水性など)を変化させることができる。予想された部位で切断されたかどうかを、切断産物の極小配列(microsequence)分析、変異切断部位を含むペプチド基質の使用、およびvCPPが属するプロテイナーゼの予想されるクラスに特異的なプロテイナーゼ阻害剤の封入によって確証することができる。同様に、上記で作製した抗血清をこれらのアッセイと組み合わせて使用して、酵素の相互活性表面および活性部位をマッピングすることができる。
当業者は、アッセイ形式が好ましいものは全て容易に使用することができ、反応を至適化するために反応条件(プロテアーゼ:基質比、イオン強度、温度、疎水性など)を変化させることができる。予想された部位で切断されたかどうかを、切断産物の極小配列(microsequence)分析、変異切断部位を含むペプチド基質の使用、およびvCPPが属するプロテイナーゼの予想されるクラスに特異的なプロテイナーゼ阻害剤の封入によって確証することができる。同様に、上記で作製した抗血清をこれらのアッセイと組み合わせて使用して、酵素の相互活性表面および活性部位をマッピングすることができる。
三次元構造の決定アプローチとしてタンパク質の構造分析を行うこともできる。精製酵素をCD(円偏光二色性)、二次元NMR(核磁気共鳴)、または結晶化/X線回折などの分析手順に供することによって、vCPPに関する大量の構造情報を迅速に得ることができる。この情報を、触媒残基の同定およびvCPPが属するプロテイナーゼクラスの知識と組み合わせて、構造をモデリングすることができる。このような情報を使用して、当業者は、一定の化学的特性を有する所与のクラスのプロテイナーゼに結合する可能性のある化学物質のサブセットを同定することができる。この化学的サブセットを出発点として使用して本発明者らの切断アッセイにおける有望な阻害剤を試験することができる。陽性と記録されたものは全てその後の相互作用化学のための出発点として使用することができる。
vCPP HTS
製薬産業での有用な化学物質の同定のための最も強力且つ有用な技術の1つは、自動化高処理スクリーニングである。利用可能なほとんどの薬物および現在開発中の多数の薬物は、この様式で発見されている。不運なことに、無作為な天然化合物またはコンビナトリアルケミストリーのいずれかに対する無作為なHTSは、時間がかかり、高価で、非常に骨が折れる。
製薬産業での有用な化学物質の同定のための最も強力且つ有用な技術の1つは、自動化高処理スクリーニングである。利用可能なほとんどの薬物および現在開発中の多数の薬物は、この様式で発見されている。不運なことに、無作為な天然化合物またはコンビナトリアルケミストリーのいずれかに対する無作為なHTSは、時間がかかり、高価で、非常に骨が折れる。
当業者は、FPAまたはHTRFなど、混合して測定するアプローチなどの上記のアッセイ形式の1つを使用して潜在的なプロテイナーゼ阻害剤として選択された化学ライブラリーサブセットを手動で容易にスクリーニングすることができる。HTSの有用性の1つは同定された任意の潜在的な阻害剤の有用性であり、有効濃度範囲を容易に確立し、他のプロテイナーゼに対する特異性を試験し、複製様式で試験する。
vCPP阻害剤活性についてのインビボスクリーニング
合理的薬物デザインまたはHTSによって同定されたリード化合物を、以下の様式でインビボ効率について試験することができる。
合理的薬物デザインまたはHTSによって同定されたリード化合物を、以下の様式でインビボ効率について試験することができる。
a)リード化合物濃度の増加は、いくつかの異なる種(L−929(マウス)、RK−13(ウサギ)、RL−1(ラット)、HeLa(ヒト)、およびBSC40(サル))由来の非感染組織培養細胞で認められる。細胞を、生体色素であるTrypan Blueの排除によって形態の変化、成長率、DNA合成、および生存度について観察した。
b)リード化合物濃度の増加は、VVに感染したBSC40細胞で認められる。感染細胞を上記のように、感染ウイルスの産生、ウイルスタンパク質合成、ウイルスDNA合成、ビリオン構築の状態、およびコアタンパク質切断について分析する。阻害剤がvCPPを特異的にターゲティングする場合、不稔感染(abortive)後期表現型が認められる。
c)抗ウイルス薬として潜在性を有するvCPP阻害剤について、これは種々のオルトポックスウイルスに有効なはずである。したがって、種々のVV株(WR、IHD、コペンハーゲン)、ウサギ痘ウイルス、およびウシ痘ウイルスに対するvCPP阻害剤を試験する。さらに、トリ痘ウイルス、orf、欠肢症、および昆虫痘ウイルスなどの非オルトポックスウイルスに対する任意の有望な阻害剤を試験して阻害範囲を決定する。
[実施例]
実験系として、当分野で利用可能な情報が豊富であり、実験室で成長および操作することができることが証明されており、バイオセーフティプロフィールが受け入れられており、痘瘡ウイルスの機能および配列が高レベルで保存されているので、本発明はワクシニアウイルス(VV)を使用する。
実験系として、当分野で利用可能な情報が豊富であり、実験室で成長および操作することができることが証明されており、バイオセーフティプロフィールが受け入れられており、痘瘡ウイルスの機能および配列が高レベルで保存されているので、本発明はワクシニアウイルス(VV)を使用する。
ワクシニアウイルスのI7Lのオープンリーディングフレームは、これらのプロテアーゼの特徴である保存された触媒三つ組み(His241、Asp248、Cys328)を含む423アミノ酸のシステインプロテアーゼをコードする。これは、活性部位中のオキシアニオンホールの形成を補助すると予想されるシステイン残基のすぐ上流に不変グルタミン(Q)残基も含む。I7Lタンパク質は、ワクシニアウイルスのためのコアタンパク質プロテアーゼであると考えられる。
コアタンパク質プロテアーゼの可能な基質は、全てタンパク質分解プロセシングが行われたP4a、P4b、P25K、P21K、およびP17K(2)である。これらの前駆体中の切断部位のアラインメントにより、保存AG*X切断モチーフが明らかとなる。下記の実験のために、試験基質としてP25Kを選択した。P25Kは、2つの推定切断部位(アミノ酸17〜19のAGSおよびアミノ酸31〜33のAGA)を含む。I7Lがコアタンパク質プロテアーゼであるかどうかを決定するために、ワクシニアウイルスの一過性発現研究についてC末端の6×ヒスチジンタグに融合したI7LおよびC末端FLAGタグに融合したP25Kをプラスミドにクローン化した。両方のプラスミドを、ワクシニアウイルスを用いてBSC40細胞にトランスフェクトした。FLAG特異的M2抗体を使用したウェスタンブロット分析は、I7LおよびP25Kが同時発現し、P25K基質が切断されて25kDaのバンドが産生されることを示した(図1のレーン5および図2のレーン5)。
切断部位をさらに特徴付けるために、P25Kのオープンリーディングフレームに対して2つの変異を行って、部位特異的変異誘発による2つの切断部位でアミノ酸を変化させた。第1の変異は、アミノ酸17〜19をAGSからIDIに変化させた。第2の変異は、アミノ酸31〜33をAGAからRDPに変化させた。変異タンパク質をプロセシングする能力を、VV感染細胞の一過性発現によって分析した。FLAG特異的M2抗体を使用した免疫ブロットによって証明されるように、IDI変異プラスミドはI7Lと同時発現し、依然として切断が認められ(図2、レーン6)、I7LがAGA部位で切断されることを示す。しかし、RDP変異体の部分的切断が存在し(図2、レーン7)、これはI7LがAGS部位で同様に切断することができることを意味し得る。これらの結果から、P25KはAGS部位およびAGA部位の2ステップタンパク質分解切断プロセシングを受けることが可能である。本明細書中に記載の結果は、I7LがAGS部位およびAGA部位でP25Kを切断し、前駆体タンパク質を28kDaタンパク質から25kDaタンパク質にプロセシングすることができることを示す。
本発明者らは、4a、4b、および25Kを含む多数のVVコアタンパク質がビリオンの構築および成熟と密接に関連する共通の形態形成的切断経路を介してプロセシングされるようであることを証明した。ウイルス遺伝子発現の後期の前駆体としてこれらの基質が合成される。前駆体形態は、タンパク質がウイルス工場(virus factory)にターゲティングされて構築ビリオンに結合するために不可欠である。成熟ビリオンの状況下のみで前駆体の切断が起こる。全ての前駆体タンパク質は、新規のAG(X)モチーフで切断されるようである。このモチーフは、任意の他のウイルス系で利用されるモチーフと異なり、いかなる公知のプロテイナーゼによっても認識されない。VV後期タンパク質としてこれらの切断を担う酵素が同定され、この酵素はI7Lコードシステインプロテイナーゼのようである。
P4bおよびP25K切断部位の同定−AGAモチーフ
ウイルスDNA合成開始後のVV感染細胞のパルス標識ならびにSDS:ポリアクリルアミドゲル電気泳動およびオートラジオグラフィによる抽出物の分析により、見かけの分子量を有する3つの主要な放射性標識タンパク質種(95kDa(P4a)、65kDa(P4b)、および28kDa(P25K))が認められる。過剰な非標識アミノ酸を含む培地の添加および感染細胞のインキュベーションの継続により、これら3つのタンパク質は、3つの主要なビリオンコアタンパク質と同時移動する62KDa(4a)、60KDa(4b)、および25KDa(25K)種に追跡される。興味深いことに、多数のタンパク質分解反応と異なり、前駆体合成時間と切断産物の出現との間に認められる約30〜45分の遅延に伴って、変換プロセスは急速ではない。さらに、VVコアタンパク質前駆体のタンパク質分解は、追跡時のシクロヘキシミドの添加によって産物形成が阻害されるので、新たにタンパク質合成が開始される必要があるようである。これら両方の所見はビリオン構築(時間および継続的タンパク質合成が必要なプロセス)の状況で切断するという仮説と一致する。これは、VVコアタンパク質のタンパク質分解の「状況的プロセシング」仮説の提案の最初の基本であった。
ウイルスDNA合成開始後のVV感染細胞のパルス標識ならびにSDS:ポリアクリルアミドゲル電気泳動およびオートラジオグラフィによる抽出物の分析により、見かけの分子量を有する3つの主要な放射性標識タンパク質種(95kDa(P4a)、65kDa(P4b)、および28kDa(P25K))が認められる。過剰な非標識アミノ酸を含む培地の添加および感染細胞のインキュベーションの継続により、これら3つのタンパク質は、3つの主要なビリオンコアタンパク質と同時移動する62KDa(4a)、60KDa(4b)、および25KDa(25K)種に追跡される。興味深いことに、多数のタンパク質分解反応と異なり、前駆体合成時間と切断産物の出現との間に認められる約30〜45分の遅延に伴って、変換プロセスは急速ではない。さらに、VVコアタンパク質前駆体のタンパク質分解は、追跡時のシクロヘキシミドの添加によって産物形成が阻害されるので、新たにタンパク質合成が開始される必要があるようである。これら両方の所見はビリオン構築(時間および継続的タンパク質合成が必要なプロセス)の状況で切断するという仮説と一致する。これは、VVコアタンパク質のタンパク質分解の「状況的プロセシング」仮説の提案の最初の基本であった。
VVコアタンパク質前駆体が切断される部位を決定するために、成熟4a、4b、および25Kタンパク質を、単離および精製し、N末端極小配列分析に供した。次いで、由来する配列をP4a、P4b、およびP25KのORFの推定アミノ酸配列と比較した。25Kおよび4bタンパク質のアミノ末端は、それぞれP25Kの残基33およびP4bの残基62と同定された(図4)。P25KまたはP4bのN末端由来の32および61アミノ酸の喪失による予想される分子量の減少は、タンパク質分解プロセシング後のゲルで認められた移動度の変化と十分に対応していた。いずれの小ペプチドも単離されなかったので、エンド型タンパク質分解切断、エクソ型タンパク質分解消化、または2つのプロセスの組み合わせを介してP4bおよびP25K前駆体のプロセシングが進行したかどうかを決定できなかった。
成熟4bおよび25Kタンパク質の由来するN末端の周囲に存在するP4bおよびP25K前駆体内の推定アミノ酸配列の比較により、同一モチーフの存在が明らかとなった。保存されたAla−Gly−Ala(AGA)トリペプチド内に両方の切断産物のN末端が見出され、推定切断部位は切断し易いGly−Ala結合で生じる。切断部位決定要因としてのAGAモチーフの重要性は、2つの証拠によって示唆された。第1に、推定P4bおよびP25K切断部位の上流または下流に保存された他の明らかな配列エレメントは存在しなかった。
第2に、トリ痘ウイルス(FPV)の4bおよび25Kコアタンパク質ホモログがそれぞれVVタンパク質(50)との相同性が52%であり同一性が33%でしかないにもかかわらず、FPV前駆体は、VVコアタンパク質前駆体と正確に同一の位置にAGAモチーフを含んでいた(図5)。興味深いことに、4aタンパク質を類似の分析に供したにもかかわらず、極小配列データは得られず、そのN末端が遮断されたことが示唆される。
P4a成熟経路
P4a前駆体の推定アミノ酸配列は、P4bおよびP25Kのプロセシングで使用される保存されたAGAトリペプチドモチーフを含まない。このことにより、P4aタンパク質が異なる経路によってプロセシングされるか、P4aがP4bおよびP25Kと同一の経路によってプロセシングされるが、あまり有効に切断されなかった部位で行われたという可能性が高まった。
P4a前駆体の推定アミノ酸配列は、P4bおよびP25Kのプロセシングで使用される保存されたAGAトリペプチドモチーフを含まない。このことにより、P4aタンパク質が異なる経路によってプロセシングされるか、P4aがP4bおよびP25Kと同一の経路によってプロセシングされるが、あまり有効に切断されなかった部位で行われたという可能性が高まった。
P4a前駆体の切断がインビボでのP4bおよびP25K前駆体の切断よりも遅い速度で進行するようであるという所見から、この仮説が支持された(51)。このことを考慮して、配列AGXについて891アミノ酸のP4a前駆体の推定アミノ酸配列を検索し、3つのシグナル(AGN(残基94〜96)、AGS(残基613〜615)、およびAGT(残基696〜698))が見出された。P4a前駆体内の3つ全ての部位で切断される場合、4aについておよそ正確なサイズの内部タンパク質が放出される。
VVコアタンパク質4aは、3つの内部AGX部位でのタンパク質分解によってP4aから切断されるという仮説を試験するために、P4a前駆体の部分領域に特異的な免疫試薬を作製し、種々のペプチドマッピングおよびタンパク質配列決定手順と併せて使用した。得られた結果により、P4a前駆体は2つの位置(残基613〜615のAGS部位および残基697と698との間のAGT部位)で切断されることが証明された。巨大N末端4aタンパク質(残基1〜614)およびC末端23kDaタンパク質(残基698〜891)は共に主要なビリオンコア構成要素となる。放出されると予想される内部小ペプチド(残基615〜697)の位置および運命は未知である。しかし、部位特異的変異誘発を使用して、AGS部位またはAGT部位のいずれかが遺伝的に不活化された変異P4aタンパク質を産生した。一過性発現手順を使用して、インビボで4a−9Kまたは9K−23Kキメラの存在を証明することが可能であるので、内部9KDa配列は遺伝的に不安定ではないことが示唆される。さらに、AGS部位およびAGT部位での切断由来の末端産物を単離および微小配列決定する能力により、1つのエンド型タンパク質分解切断事象を介してプロセシングされることも強く示唆された。P4a前駆体の内部AGS部位およびAGT部位が切断されるにもかかわらず、2つの独立した一連のペプチドマッピングデータにより、残基94〜96のAGN部位がプロセシングされないことが明確に証明された。したがって、これらの結果により、3つ全ての主要なコアタンパク質前駆体のプロセシングが対等に関連し、ウイルス構築中に同一のウイルスプロテイナーゼによって触媒され、エンド型タンパク質分解が内部AGXモチーフ(XはA、S、またはTであるがNではない)で起こるようであることが示唆される。
AG(X)切断モチーフ
タンパク質プロセシングされることが公知の3つ全てのVVコアタンパク質を、AGXモチーフで切断する。したがって、全VVゲノムの状況下で何回AGXトリペプチドがVVタンパク質内に存在すると予想されるかを求めることおよびモチーフが切断部位として使用される頻度を決定することは興味深かった。VV(コペンハーゲン)ゲノム(49)の完全なヌクレオチド配列を使用して、各ORFの推定アミノ酸配列を決定し、1つのデータベースにコンパイルした。AGXトリペプチドについてのこのデータベースの検索により、198個の主要なORFで82回出現することが明らかとなり、これはAGXが無作為に出現する場合に予想される204部位よりも本質的に低い頻度である。これら82個の部位のうち、18個は能動的に切断されることが以前に示されている部位(すなわち、P25KおよびP4bのAGAならびにP4aのAGTおよびAGS)に類似していた。
タンパク質プロセシングされることが公知の3つ全てのVVコアタンパク質を、AGXモチーフで切断する。したがって、全VVゲノムの状況下で何回AGXトリペプチドがVVタンパク質内に存在すると予想されるかを求めることおよびモチーフが切断部位として使用される頻度を決定することは興味深かった。VV(コペンハーゲン)ゲノム(49)の完全なヌクレオチド配列を使用して、各ORFの推定アミノ酸配列を決定し、1つのデータベースにコンパイルした。AGXトリペプチドについてのこのデータベースの検索により、198個の主要なORFで82回出現することが明らかとなり、これはAGXが無作為に出現する場合に予想される204部位よりも本質的に低い頻度である。これら82個の部位のうち、18個は能動的に切断されることが以前に示されている部位(すなわち、P25KおよびP4bのAGAならびにP4aのAGTおよびAGS)に類似していた。
これらのAGXモチーフのいくつかまたは全てがVV複製中の切断部位として役立つかどうかを検討するために、本発明者らは、テストケースとしてAGAトリペプチドに焦点をあてた。AGAモチーフは、7回出現する。AGAモチーフを含むタンパク質を以下に示す。P4bおよびP25Kコアタンパク質前駆体(共に切断されている)、未知の機能のA12LおよびA17L遺伝子産物、EEV粒子周囲の外膜中で見出されるF13L ORFによってコードされるパルミチル化P37タンパク質、E9L ORFによってコードされるVV DNAポリメラーゼ(DNAP)、ならびにKIL遺伝子によってコードされる宿主域(HR)タンパク質。これらのタンパク質が一連のVV複製中にプロセシングされるかどうかを決定するために、各遺伝子産物についての単一特異性抗血清を産生するか入手し(P.TraktmanのαDNAPおよびR.WittekのαP37K)、パルスチェイス放射性標識および免疫沈降手順と併せて使用した。
得られた結果は、DNAP、P37K、およびHRタンパク質がタンパク質分解プロセシングを受けないことを明確に示した。対照的に、A17LおよびA12L ORFの遺伝子産物を23KDaおよび24KDaの前駆体として合成し、21KDaおよび17KDaの産物にプロセシングされた。プロセシング反応はリファンピシンによって阻害され、ビリオン粒子に結合したプロセシング産物が見出され、これにより、A17LおよびA12L遺伝子産物がP4bおよびP25K前駆体と同一の経路によって成熟することが示唆された。これらの結果により、VVにおける形態形成的切断を支配するいくつかの規則が提案された(図7)。
プロセシングするために、前駆体タンパク質は、1)AGA(またはAGX)モチーフを含み、2)感染後期に発現し(DNAPは初期タンパク質であり、HRは最初期タンパク質である)、および3)ビリオンコアに組み込まれる運命でなければならない(P37は後期タンパク質であるが、コアでなく膜中に存在する)。これらのストリンジェンシーを使用しても、AGX出現数+複合体VVビリオン中で見出された多数のタンパク質と仮定すると、これにより、ビリオン構築中に40〜50個ものウイルスタンパク質を形態学的切断に供することができることが示唆される。
形態形成的タンパク質分解を支配するこれらの規則が提案されていることにより、A12L遺伝子産物のプロセシングを再試験した。この遺伝子産物は後期に発現する。これは見かけ上のコアタンパク質である。これは1つではなく3つのAGXモチーフを含む。切断することが公知の23KDaのA12L前駆体のN末端付近のAGAトリペプチドに加えて、タンパク質のC末端に向かう2つのAGKモチーフが存在する。一方または両方のAGK部位が認識されるかどうかを決定するために、VV感染細胞の経時的パルスチェイス放射性標識を実施し、その後ポリクローナルα12L血清を使用した免疫沈降を行った。大変驚いたことに、本発明者らは、23KDaのA12L前駆体が15、10.6、および8KDaの種を含む多数の産物に分解されることを発見した。産物の極小配列分析により、1つ、2つ、または3つ全てのAGXモチーフでの切断によって3つの産物が得られることが証明された。興味深いことに、長期間の追跡期間を使用した場合でさえも、前駆体を完全にプロセシングされた8KDaの産物に追跡することができる。むしろ、3つ全ての産物は、[10.6KDa]>[15KDa]>[8KDa]の順で安定なようであった。さらに、3つ全てのA12L由来の産物をビリオン中に見出すことができ、これにより、異なる生物学的機能を有し得ることが示唆される。したがって、これらの結果により、インビボで切断されたAGXモチーフの新規の変異型AGKが同定され、3ステップの成熟経路に供されるVVコアタンパク質の第1の例が得られた。
VVコアタンパク質プロセシングは形態形成的切断経路である
VVコアタンパク質のタンパク質分解がウイルスの生活環における形式的または形態形成的機能を使用するかどうかを試験するアプローチとして、放射性標識された未熟および成熟VV粒子を分離および精製するショ糖対数勾配分画法を開発した。感染細胞を回収した感染後の時間に依存して、異なる沈殿速度を示す酸沈殿数の4つの異なるピークを検出することができる。パルスチェイス手順を使用して、ピークは、経時的により遅い沈殿物質がより早い沈殿物質を追跡する前駆体−産物関係を有することを示し得る。ピークをA、B、C、およびV粒子と呼び、Aは勾配の上部付近で見出される初期前駆体形態であり、Vは最も速く沈殿した産物である。プレビリオンが成熟するにつれて、これらは勾配中でより速く移動し、DNアーゼ1での処理に耐性を示すようになる。A粒子のコアタンパク質組成は、主に非切断前駆体であり、成熟コアタンパク質4a、4b、25K、および23Kは微量しか含まれない。しかし、粒子の沈降速度が増加するにつれて、タンパク質分解成熟が進行し、C粒子がほぼ排他的に成熟コアタンパク質から構成されていた。まとめると、これらの結果は、いくつかの個別且つ分離可能なVVプレビリオン形態が存在すること、VVコアタンパク質前駆体が切断前にプレビリオンに結合すること、およびコアタンパク質の成熟が非感染性プレビリオンから感染性ウイルス粒子への変換に同等に関連することを示す。これは、VVコアタンパク質前駆体成熟が形態形成的機能を果たすという仮説を強力に支持する。
VVコアタンパク質のタンパク質分解がウイルスの生活環における形式的または形態形成的機能を使用するかどうかを試験するアプローチとして、放射性標識された未熟および成熟VV粒子を分離および精製するショ糖対数勾配分画法を開発した。感染細胞を回収した感染後の時間に依存して、異なる沈殿速度を示す酸沈殿数の4つの異なるピークを検出することができる。パルスチェイス手順を使用して、ピークは、経時的により遅い沈殿物質がより早い沈殿物質を追跡する前駆体−産物関係を有することを示し得る。ピークをA、B、C、およびV粒子と呼び、Aは勾配の上部付近で見出される初期前駆体形態であり、Vは最も速く沈殿した産物である。プレビリオンが成熟するにつれて、これらは勾配中でより速く移動し、DNアーゼ1での処理に耐性を示すようになる。A粒子のコアタンパク質組成は、主に非切断前駆体であり、成熟コアタンパク質4a、4b、25K、および23Kは微量しか含まれない。しかし、粒子の沈降速度が増加するにつれて、タンパク質分解成熟が進行し、C粒子がほぼ排他的に成熟コアタンパク質から構成されていた。まとめると、これらの結果は、いくつかの個別且つ分離可能なVVプレビリオン形態が存在すること、VVコアタンパク質前駆体が切断前にプレビリオンに結合すること、およびコアタンパク質の成熟が非感染性プレビリオンから感染性ウイルス粒子への変換に同等に関連することを示す。これは、VVコアタンパク質前駆体成熟が形態形成的機能を果たすという仮説を強力に支持する。
感染時のVVコアタンパク質の細胞内およびウイルス内局在化をモニタリングするためにデザインした別の実験組では、各コアタンパク質前駆体および/またはその切断された産物を認識する単一特異性ポリクローナル抗血清集団を産生した。VV感染細胞の間接的免疫蛍光分析におけるこれらの血清の使用により、VVコアタンパク質前駆体は感染細胞の細胞質全体に分布していないことが証明された。むしろ、コアタンパク質前駆体は、ほとんど排他的に子孫ビリオンが構築される「ビロソームまたはウイルス工場」に局在していた。感染後期に、各ウイルス粒子と考えられる点状染色もまた細胞質全体で明らかであった。免疫電子顕微鏡法によってこの仮定を確認した。IEM研究もまた、VVコアタンパク質前駆体が未熟なVVビリオンと結合することおよびビリオンが成熟サイクルを進行するにつれて新規に進行したコアタンパク質が凝縮コア(condensing core)に結合したままであることを証明した。
上記で報告した実験の結果は、VVコアタンパク質の前駆体形態がビロソームおよび構築プレビリオンへの適切な局在化に必要であることを示す。これにより、VV感染細胞中に存在する全てのタンパク質がパッケージングされるわけではないので、コアタンパク質前駆体のどのような特徴がこの挙動を担うのかという問題が生じる。この問題は、コアタンパク質構造全体、これらが相互作用するタンパク質パートナー、またはこの性質を提供する特異的ターゲティングシグナルの存在であることを提案することができる。
少なくともP4bおよびP25Kの場合、潜在的なターゲティングシグナルの1つの候補は、ウイルス構築中にタンパク質分解によって除去されるN末端リーダーペプチドである。この仮説を試験するために、リーダーをコードする配列(31個のN末端アミノ酸)が欠失した変異P25K遺伝子を構築した。一過性発現を介したVV感染細胞の状況下で(Δ31)P25Kタンパク質が発現された。成熟25Kコアタンパク質と機能的に等価であるべきこのタンパク質は、ビリオンにパッケージングされなかった。
コアタンパク質前駆体のリーダー全体がこの表現型を得ることが必要であるかどうかを決定するために、P4bタンパク質の61アミノ酸リーダーにおける欠失を構築させた。15、30、または44アミノ酸の欠失はP4bプロセシングに影響を与えず、不可欠な情報は切断部位に近接していることを示した。AGA部位を再構築する様式での25Kタンパク質へのウイルスチミジンキナーゼ(TK)(可溶性初期タンパク質)のN末端30アミノ酸の融合によって、これがこの性質を与えるリーダーの配列または構造であるという証拠が得られた。このTK:25K融合タンパク質は、パッケージングもプロセシングもされていなかった。
興味深いことに、2つの交換変異体(swap mutant)として機能的に相互交換可能なようであるコアタンパク質のリーダーを、P4bリーダー:25KおよびP25Kリーダー:4bキメラの作製によって作製した。両方の場合では、タンパク質をパッケージングおよびプロセシングすることができる。この結果は、融合タンパク質が確実に構造上の特徴を破壊するので、コアタンパク質前駆体の四次構造全体が主な局在化決定要因であることに反論する。まとめると、これらのデータにより、VVコアタンパク質のアミノ末端ペプチドはいくらかの範囲で相互交換可能であり、AGA部位に極めて近接した残基は最も直接的に正確な細胞内およびウイルス内局在化に寄与するようであることが示唆される。
P25K切断を担うシスシグナルの特徴づけ
ウイルスプロテイナーゼ文献の前例に基づいて、本発明者らは、VVコアタンパク質のタンパク質分解プロセシングを研究するためのアッセイ系の開発に対して多数の異なるアプローチを試みた。これらには、以下が含まれる。(i)切断欠損温度感受性VV変異体を感染させた細胞から単離したVVコアタンパク質前駆体と野生型VV感染または非感染細胞由来の抽出物とを混合したインビトロ切断アッセイ、(ii)可溶化VVビリオンとインビボまたはインビトロで作製したVVコアタンパク質前駆体との混合、(iii)ウサギ網状赤血球ライセート中の細胞および/またはウイルスmRNAの混合物でのコアタンパク質前駆体mRNAの同時翻訳、および(iv)推定VVコアタンパク質切断部位を含む種々のレポーター遺伝子構築物を発現するためのハブリッドT7/VV系(52)を使用した一過性発現アッセイ。
ウイルスプロテイナーゼ文献の前例に基づいて、本発明者らは、VVコアタンパク質のタンパク質分解プロセシングを研究するためのアッセイ系の開発に対して多数の異なるアプローチを試みた。これらには、以下が含まれる。(i)切断欠損温度感受性VV変異体を感染させた細胞から単離したVVコアタンパク質前駆体と野生型VV感染または非感染細胞由来の抽出物とを混合したインビトロ切断アッセイ、(ii)可溶化VVビリオンとインビボまたはインビトロで作製したVVコアタンパク質前駆体との混合、(iii)ウサギ網状赤血球ライセート中の細胞および/またはウイルスmRNAの混合物でのコアタンパク質前駆体mRNAの同時翻訳、および(iv)推定VVコアタンパク質切断部位を含む種々のレポーター遺伝子構築物を発現するためのハブリッドT7/VV系(52)を使用した一過性発現アッセイ。
例外なく、いかなるこれらの系を使用しても試験基質の切断は認められなかった。これにより、部分的に、VVコアタンパク質のタンパク質分解成熟が状況的(contextual)であり、ビリオン構築に直接関連するという本発明者らの仮説が導かれた。この仮説の予想は、AGXモチーフで切断されるべきVVタンパク質について、感染後期に合成され、構築ビリオンにパッケージングされ、VVコアと結合しなければならないことである。合成速度、細胞内ターゲティング、またはVVコアタンパク質前駆体の構造についての任意の混乱により、プロセシングが撤回されると予想され得る。
この仮説の試験には、インビボでのVVコアタンパク質前駆体のタンパク質分解成熟を媒介するシスおよびトランス因子を試験するアッセイの開発が必要であった。この目的を達成するために、いくつかの困難を克服しなければならない。第1に、VVコアタンパク質前駆体をコードする遺伝子は、ウイルス複製に不可欠と考えられた。条件致死変異はこれらの遺伝子座で利用不可能であり、これらは遺伝子座は当分野で公知の遺伝子挿入技術による直接不活化に感受性を示す遺伝子座ではない。第2に、VVコアタンパク質は比較的不溶性であり、インビトロでの研究が困難である。第3に、本発明者らの初期の実験に基づいて、成熟ビリオン粒子の状況下でのみ切断するようである。第4に、VVコアタンパク質前駆体は感染後期で高度に発現され、外因的に付加されたコアタンパク質前駆体の検出が困難となる。
これらの難問を克服するために、オクタペプチドエピトープ(FLAG(55))でのC末端でのP25K VVコアタンパク質前駆体のタグ化によるVVコアタンパク質タンパク質分解成熟を追跡するためのトランスプロセシングアッセイを開発した。3つの主要なコアタンパク質前駆体遺伝子で最も小さいので遺伝子操作が容易であることおよびL4R遺伝子産物(P25Kタンパク質)は比較的可溶性が高く生化学分析に影響を受けやすいので、これらの研究の標的としてL4R遺伝子を選択した。
VVで同時感染された細胞における一過性発現アッセイの使用により、P25K:FLAG融合遺伝子産物のタンパク質分解を、FLAGエピトープまたは25Kタンパク質に特異的な抗血清を使用した免疫ブロッティングおよび免疫沈降手順によってモニタリングすることができる。インビボで、P25:FLAG前駆体をより小さな産物に切断し、パルスチェイス標識手順によって、前駆体−産物の関係を確立した。P25K:FLAG前駆体のインビボでの切断がリファンピシンによって阻害され、これは反応が真のVVコアタンパク質前駆体と同一の経路を使用することを意味する。さらに、ビリオン構築が切断と同時に起こるという仮説と一致して、P25K:FLAG産物が成熟ビリオンと結合して見出された。これらの実験中に、P25Kリーダーの残基17〜19の間に存在するAGS部位でプロセシングが起こる潜在的な切断媒介物(P25K)が同定された(図9)。
P25K:FLAG前駆体内の一次AGA(31位〜33位)部位または中間体AGS(17位〜19位)部位のいずれかまたは両方のトリペプチドIDIとの部位特異的変異誘発置換により、変異部位の切断が遮断され、これは、両部位を使用してインビボで独立して認識されること、および真のタンパク質分解が起こることを示す。P25K:FLAG前駆体プロセシング速度は、真のP25K前駆体の速度の約半分であった。この所見は、免疫蛍光を使用してP25K:FLAGタンパク質がビロソームにあまり有効にターゲティングされないということを証明することによって部分的に説明された。VVコアタンパク質プロセシングはビリオン構築中に起こるようであるので、ビロソームに結合したP25K:FLAGタンパク質のみがプロセシング経路に侵入するようである。
ターゲティングの欠損は、P25K:FLAG前駆体の構造の変化またはビロソーム内自体で複製するゲノム遺伝子と対照的に融合遺伝子がプラスミドから発現することに起因し得る。任意の場合では、これらの結果は、トランスプロセシングアッセイの利点を確立するための生化学的および遺伝的証拠を提供し、AGXモチーフが切断部位選択において直接的役割を果たすことの直接的証拠を提供する。
IDI変異体の切断の失敗によってP25KプロセシングにおけるAGXモチーフの中心的な重要性が示唆されるにもかかわらず、切断部位選択のさらなる決定要因が存在しなければならない。AGXモチーフを含むタンパク質の全てがタンパク質分解的に切断されるわけではない。同一の前駆体中の他の2つの下流AGX部位が存在するという事実にもかかわらず、このような例の1つは、切断されないP4aのAGN部位である。同様に、上記で考察したように、VV DNAポリメラーゼ、パルミチル化37Kエンベロープタンパク質、およびHRタンパク質は全て切断されないAGAモチーフを有する。したがって、AGXモチーフは、不可欠であるが、特異的切断部位の定義には不十分なようである。前駆体内のさらなる基質決定要因は、切断部位選択に寄与しなければならない。これらのいくつかの他の決定要因を同定するアプローチとして、本発明者らは、部位特異的変異誘発手順と併せて上記のトランスプロセシングアッセイを使用した。詳細には、テンプレートとしてP25K:FLAG遺伝子を使用して、置換、挿入、および欠失変異を、AGA部位中およびその周囲に導入した。各個々の変異体の表現型を、一過性発現および免疫ブロッティング手順によって分析した。
全体で、50個を超える異なるP25K:FLAG変異体を構築した。変異体の遺伝子型を、配列決定および試験したこれらの表現型によって確認した。アミノおよびカルボキシ近接残基での位置をそれぞれP1、P2などおよびP1’、P2’などとして示すSchecter and Berger(56)の命名法を使用して、得られた結果を以下にまとめる。P1’位の残基占有は、切断を遮断するプロリン置換のみに非常に寛容であった。対照的に、P1(セリンまたはアラニン)およびP2(システイン、セリン、またはアスパラギン)の許容占有は非常に制限される。P1/P2二重変異体の分析によりこの結論が支持され、さらなる組み合わせストリンジェンシーレベルが示唆された。AGAモチーフに非常に近接した(アミノまたはカルボキシ末端)配列の挿入または欠失により切断が完全に取り消され、さらなる構造エレメントの存在が示唆される。これらの領域中の保存されたプロリンまたは塩基性残基の変異は切断に影響を与えないのに対して、P4部位中の疎水性残基の存在が必要なようである。
vCPPの候補−G1LおよびI7L
a)G1L−上記のように、インビトロでのVVコアタンパク質タンパク質分解を再構成するための多数の異なるアプローチが試みられ、これらの全てがこの反応の状況的要件によって不成功に終わった。したがって、VVコアタンパク質前駆体の切断を担うプロテイナーゼを同定するために、インビボマッピング手順を実施することが必要である。この目的を達成するために、転写調節トランスプロセシングアッセイを開発した。
a)G1L−上記のように、インビトロでのVVコアタンパク質タンパク質分解を再構成するための多数の異なるアプローチが試みられ、これらの全てがこの反応の状況的要件によって不成功に終わった。したがって、VVコアタンパク質前駆体の切断を担うプロテイナーゼを同定するために、インビボマッピング手順を実施することが必要である。この目的を達成するために、転写調節トランスプロセシングアッセイを開発した。
VV遺伝子の転写を、カスケード機構の制御によって厳格に調節する。初期mRNAの合成および修飾に必要な全ての酵素を、感染性ビリオンにパッケージングする。細胞への侵入後、初期遺伝子発現によりウイルスDNA複製が開始され、中期および後期のウイルス遺伝子が連続して発現する。通常のウイルス感染時には、後期転写因子遺伝子(A1L、A2L、およびG8R)ならびに後期遺伝子自体の発現のためのテンプレートとして新規に複製された裸のウイルスDNAが役立つことが示された。そのDNA複製がAraCによって遮断された感染細胞中の外因的に供給された後期プロモーター由来の転写を、後期転写因子遺伝子のプラスミドコピーの同時トランスフェクションによってレスキューすることができる。これにより、レポーター遺伝子としてP25K:FLAG ORFのプラスミドコピーを使用した転写調節トランスプロセシングアッセイの開発の基礎が得られた。
ウイルスゲノム由来の後期遺伝子発現を遮断するために、AraCn存在下で細胞にVVを感染させた。AraC処置VV感染細胞への全長VV DNAのトランスフェクションによってVVコアタンパク質前駆体が発現および切断され、両方のプロセス(合成およびプロセシング)がこれらの条件下で起こり、プロテイナーゼがVV後期遺伝子の産物である可能性があることを示す。基質発現およびタンパク質分解を分離するために、AraCで処理したVV感染細胞を、以下のプラスミドコピーで同時にトランスフェクトした。(i)後期遺伝子転写因子A1L、A2L、およびG8R、(ii)試験基質、(iii)プロテイナーゼの潜在的供給源。試験基質として、P25K:FLAG融合遺伝子を使用した。プロテイナーゼの初期供給源は、VVゲノムの6組の重複コスミドクローンであった。個別に、コスミド3および21は前駆体のN末端リーダー内の17位〜19位で見出されたAGS部位でのP25K:FLAGタンパク質のプロセシングをレスキューすることができた。これら2つのコスミドがHindIIIGタンパク質中で重複するにつれて、VV HindIII Gフラグメントのクローン化コピーを試験し、基質の切断を支持することも見出された(図10)。
以前に、本発明者らは、プロテイナーゼ活性が示唆されるモチーフの存在についてのVV(コペンハーゲン)のゲノム配列中の全ORFの推定アミノ酸配列を検索するためにコンピュータ分析を使用していた。本発明者らが得た「ヒット」のみが、HXXEH配列モチーフを含み、サーモリシンなどの金属プロテイナーゼ中に存在する活性部位コンセンサス配列の直接的逆位であるG1L ORFの範囲内であった。モチーフが後進的であり、且つウイルスコード金属プロテイナーゼの既知の例が存在しないにもかかわらず、本発明者らは、G1L ORFをクローン化し、インビトロで発現させ、VVコアタンパク質前駆体を切断する能力について試験したが、成功しなかった。
インスリン分解酵素に代表される金属プロテイナーゼのサブクラスは、逆位HXXEHモチーフを含む(図11)。さらに、本発明者らは、VVコアタンパク質プロセシング反応の状況的性質を認識していた。したがって、本発明者らは、一旦、VV HindIIIGフラグメントがコアタンパク質プロテイナーゼ遺伝子を含むようであると確認すると、本発明者らは転写調節トランスプロセシングアッセイでクローン化G1L遺伝子を試験し、これらが信頼できるプロテイナーゼをコードすることを発見した。分子遺伝子学的実験により、P25K:FLAG前駆体がAGSモチーフ内で切断され、G1L ORFのHXXEHモチーフ内の保存残基には酵素活性が必要であることが確認された。これらの結果により、VV G1Lタンパク質が金属プロテイナーゼであり、VVコアタンパク質の形態学的タンパク質分解に関与するという結論が強く支持される。
b)I7L−vCPPとしてG1Lタンパク質に関するいくつかの証拠が存在するにもかかわらず、本発明者らは、最近、第2の候補プロテイナーゼ(I7Lのオープンリーディングフレームの遺伝子産物)を同定した。酵母におけるユビキチン様プロテイナーゼに対する相同性に基づいてこのタンパク質を同定した。これはシステインプロテイナーゼであることが予想され、2つの潜在的な活性部位が明らかである。G1Lのように、I7Lはオルトポックスウイルス間で高度に保存されている。I7Lは、感染後期で発現する47KDaのタンパク質をコードすると予想される。単一特異性α−I7L抗血清の使用により、タンパク質はウイルス工場、未熟ウイルス粒子、およびIMVに結合し、コア中に排他的に存在することが証明された。
I7L遺伝子の条件致死変異体を単離した。非許容温度で、コアタンパク質前駆体P4a、P4b、およびP25Kは合成されるがプロセシングされない。さらに、未成熟ウイルス粒子形成と感染性IMV粒子への変換との間はウイルス構築が停止する。非許容温度では、感染性子孫は産生されない。これらの全特徴は、vCPPで予想された特徴であるので、I7L遺伝子産物の重要性がさらに証明される。
上記で考察するように、利用可能な証拠に基づいて、VVによってコードされる263個の遺伝子産物のうち、本発明者らのvCPPの2つの主要な候補は、G1LおよびI7L遺伝子によってコードされるタンパク質である。配列情報に基づいて、G1Lは逆位HXXEHモチーフを有する金属プロテイナーゼであると予想され、I7Lはシステインプロテイナーゼであると予想される。これらの推定プロテイナーゼのいずれがvCPPであり得るかどうかを決定するための最初のアプローチとして、クラス特異的プロテイナーゼ阻害剤集団を試験して組織培養細胞中でのVV複製阻害能力を決定することが目的であった。
そのためには、種々の濃度のプロテイナーゼ阻害剤の存在下でBSC40組織培養細胞にVVを感染させた。形態学的外観およびチミジン組み込みによって判断して、組織培養細胞に与える影響が最小の薬物濃度を使用するように努力した。試験した阻害剤には以下が含まれていた。1,10−フェナントロリン、金属プロテイナーゼ阻害剤およびその非キレート化異性体、1,7−フェナントロリン、ヨードアセトアミド、システイン阻害剤、およびペプスタチンA(アスパラギン酸プロテイナーゼ阻害剤)。不運なことに、本発明者らは、宿主細胞に対して毒性が高くないいかなるセリンプロテイナーゼ阻害剤も同定することができず、哺乳動物細胞中のこのプロテイナーゼ型の普遍性を考慮するとおそらく驚くべき結果ではない。興味深いことに、10μMのヨードアセトアミドまたは1μMの1,10−フェナントロリンによってVV複製は完全に遮断されたが、1,7−フェナントロリンまたはペプスタチンAでは効果がなかった。これらの結果は、ウイルス複製サイクルで不可欠な役割を果たす金属プロテイナーゼおよびシステインプロテイナーゼと一致した。したがって、G1LおよびI7Lは共にvCPPの実行可能な候補として残される。
G1Lタンパク質および/またはI7Lタンパク質がvCPPであるかどうかを決定するために、以下の2つの相補的アプローチを使用した。(1)プロテイナーゼ阻害剤の存在下でのVV複製の表現型分析、および(2)遺伝子特異的条件致死変異体の構築。
表現型分析は、ヨードアセトアミドおよび1,10−フェナントロリンが共にVV複製の強力な阻害剤であるという所見を活用し(図12)、これにより、ウイルス生活環中のシステインプロテイナーゼおよび金属プロテイナーゼそれぞれの不可欠な要件が示唆される。この反応の阻害は、ウイルス初期転写およびタンパク質合成が正常に進行し、ウイルスDNA合成および中期遺伝子発現が起こり、ウイルス後期タンパク質(コアタンパク質前駆体を含む)が作製され、その後未成熟ウイルス粒子が構築される一方で、切断しない場合は成熟感染性子孫が形成されない表現型によって明らかである。したがって、10μのMヨードアセトアミドまたは1μMの1,10−フェナントロリンの存在下で細胞あたり10プラーク形成単位の多重度にてVVで感染されたBSC40細胞の単層を、以下のいくつかの分析型に供する。
a)感染から0、2、4、6、8、および10時間後の35S−メチオナインでのパルス標識。表示時間での感染(+/−薬物処理)およびコントロール細胞抽出物を調製し、抗コアタンパク質抗血清のカクテル(4a、4b、25K)を使用したSDS:PAGEおよび/または免疫ブロッティングによって分析した。タンパク質発現パターン分析により、初期タンパク質が発現されるかどうか、後期タンパク質が発現されるかどうか(および推測により、ウイルスDNAが合成されるか)が明らかとなる。
b)感染後1時間間隔での10分間の3H−チミジンでのパルス標識によってDNA合成を直接測定する。コントロール状況では、ウイルスDNA合成は約1.5時間で開始され、3〜4時間ピークとなり、その後減少する。曲線の誘導期、ピーク期、または停止期からの逸脱は、コアタンパク質成熟前段階での阻害剤活性を示す。
c)パルスチェイス標識を使用して、コアタンパク質プロセシングを直接調査する。感染細胞(+/−薬物)に、感染から4時間間隔で35S−メチオニンで30分間標識する。標識培地を除去し、100倍の冷メチオンを含む培地と交換し、標識後1、2、3、および4時間インキュベートし、回収する。表示時間の細胞抽出物を調製し、抗コアタンパク質抗血清のカクテル(4a、4b、25K)を使用したSDS:PAGEおよび/または免疫ブロッティングによって分析する。コアタンパク質の発現パターン分析は、vCPP活性の有無を直接示す。
d)感染性子孫産生を、プラークアッセイによってモニタリングする。両阻害剤はウイルス成長を防止する。
上記分析の結果がvCPP阻害と一致するので、感染8時間後での透過型電子顕微鏡法のための感染細胞(+/−薬物)を調製する。これらを薄く切り、染色し、TEMで視覚化し、撮影する。図13に示すように、コアタンパク質成熟の非存在下で、ウイルスコアがほとんどまたは全く濃縮されていない未成熟粒子が蓄積される。
これらの実験結果により、vCPPの候補としてG1LおよびI7Lが確認されるが、これらはプロテイナーゼとしていずれかの遺伝子産物を直接同定しない。これはその標的が明らかにvCPPではない種々の薬物または変異が上記と類似の様式でその表現型を示すためである。例えば、それぞれN2LおよびD13遺伝子産物を阻害するα−アマニチンおよびリファンピシンはともに不稔性後期表現型を有する。これは、コアタンパク質タンパク質分解の状況的要件に起因するようである。未成熟ビリオンの正確な構築を阻害するものは全てコアタンパク質成熟を阻害するようである。
G1Lタンパク質またはI7Lタンパク質がvCPPであるかどうかに取り組むためのより直接的なアプローチとして、条件致死変異技術を使用することができる。G1LまたはI7L遺伝子を含むVV DNA(WR株)の領域をそれぞれ含み、ウイルスゲノム(500bp超)への相同組換えを触媒するための天然のプロモーターおよび十分な隣接領域で完成させた組換えDNAプラスミドを構築する。これらのプラスミドはまた、独立したVV転写エレメント(7.5Kプロモーター)の調節下でキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(gpt)を有する第2の遺伝子カセットを含む。PCR媒介挿入変異誘発手順を使用して、lacオペレーター(lacO)を、G1LおよびI7L遺伝子のプロモーター/転写開始部位とオープンリーディングフレームとの間に挿入する。
これらの二重組換えプラスミドの構造の信頼性を、連結領域の制限酵素分析、PCR増幅、およびDNA配列決定によって確認する。次いで、組換えプラスミドを、vLacI(構成性にlacリプレッサーを発現する組換えVV株)で前に感染させたBSC40細胞にトランスフェクトする。ミコフェノール酸(MPA、de novoプリン生合成を遮断する)、ヒポキサンチン(サルベージ経路を駆動する)、およびイソプロピルチオガラクトピラノシド(IPTG、標的遺伝子の発現を誘導する)を使用して、組換えウイルスを選択する。ウイルスストックをこれらの条件下で数回継代し、MPAの非存在下であるがIPTGの存在下でさらに数回継代する。これらの条件下で、最初の組換えは単一交差(single crossover)であるが、MPA選択の非存在下ではgptカセット自体が除外され、lacO/標的遺伝子(G1LまたはI7L)が二重逆数交差として安定に組み込まれ、天然の遺伝子と置換される。これらの条件下で、G1Lおよび/またはI7Lの発現は、lacオペロンの調節下にある。次いで、目的遺伝子の発現を、成長培地中のIPTGの有無によって調節することができる。
このアプローチは、F18R、D13L、G8R、L4R、およびA5Lを含む多数の後期遺伝子の機能の解明に以前に首尾よく使用されている。本発明者の研究所は、ビリオン構築および形態形成時のL1R(後期VVミリスチルタンパク質)の機能の研究にこの方法を使用した。ほとんどの場合、表示した感染後期間後のIPTGの添加によって表現型と逆行させることができる。重要なことには、コードされた遺伝子の機能を、IPTGの存在下での標的遺伝子のクローン化コピーでのウイルス複製のマーカーレスキューによって最後に証明することができる。
これらのアプローチにより、vCPPの候補としてG1LおよびI7Lを同定した。しかし、他の不可欠なVVプロテイナーゼの同定は利点や重要性がないわけではないことを留意すべきである。予想することができる他のウイルス系を使用した結果に基づいて、ほとんどのウイルスの変異誘発能を考慮すると、vCPPに対する特異的プロテイナーゼ阻害剤の広範な配置(deployment)により、最終的に薬物耐性変異体が出現する。したがって、必要に応じて、ウイルス生活環の異なる点に関与する異なるクラスのプロテイナーゼ標的の添加により、その後に第2のレベルの標的が得られる。
抗ウイルス標的としてのvCPPの確証
上記で同定されたVV遺伝子がvCPP活性を直接担うことの確認および適切な抗ウイルス標的としてのこの遺伝子産物の確証を2つの段階で進行させる。条件致死変異体の表現型分析によって暫定的な確証を行う。vCPPとしてのG1LまたはI7Lタンパク質の最終的な確証には、各遺伝子産物の発現および精製ならびにインビトロでの推定酵素活性を証明するための適切な切断アッセイの開発が必要である(以下を参照のこと)。
上記で同定されたVV遺伝子がvCPP活性を直接担うことの確認および適切な抗ウイルス標的としてのこの遺伝子産物の確証を2つの段階で進行させる。条件致死変異体の表現型分析によって暫定的な確証を行う。vCPPとしてのG1LまたはI7Lタンパク質の最終的な確証には、各遺伝子産物の発現および精製ならびにインビトロでの推定酵素活性を証明するための適切な切断アッセイの開発が必要である(以下を参照のこと)。
抗ウイルス薬開発のための標的としてG1LおよびI7L遺伝子の表現型の確証には、以下の実験が含まれる。
a)タンパク質発現および細胞内局在化の速度。本発明で作製した単一特異性抗血清を使用して、VV感染細胞の抽出物を、感染後の種々の時間で分析して、G1Lおよび/またはI7Lタンパク質が発現するかを決定する。同様に、パルスチェイスプロトコールを使用して、タンパク質が安定か不安定化を決定する。免疫蛍光および免疫電子顕微鏡法によって細胞内局在化を決定する。vCPPは、VVコアタンパク質前駆体で同時局在化されるウイルス後期タンパク質であり、未成熟ビリオン中で見出される。酵素を発現および精製するためのその後の作業時にvCPPの位置および相対的安定性についての情報は有益である。
b)vlacO/G1LおよびvlacO/I7Lの複製欠損。IPTGの存在下および非存在下でBSC40細胞にvlacO/G1LおよびvlacO/I7L組換え体を感染させる。感染細胞を、上記のように、感染性ウイルスの産生、ウイルスタンパク質合成、ウイルスDNA合成、ビリオン構築の状態、およびコアタンパク質切断について分析する。vCPPをコードする遺伝子により、IPTGの非存在下での不稔(abortive)後期表現型が得られる。欠損表現型を感染後の種々の時間で逆行させることができるかどうかを、IPTGの添加によって評価することができる。ウイルス構築およびコアタンパク質成熟に対するリファンピシン媒介阻害の可逆性に基づいて、これによりインビボvCPP分析の同期化手段が得られる。
b)vlacO/G1LおよびvlacO/I7L組換え体のマーカーレスキュー。G1LまたはI7L遺伝子産物が認められた表現型を担うことを直接照明するために、野生型遺伝子を使用してウイルス組換えをレスキューする能力を試験する。IPTGの非存在下で、BSC40細胞に、vlacO/G1LおよびvlacO/I7Lを感染させ、コントロールプラスミドまたは天然のプロモーターに隣接するG1LまたはI7L遺伝子を含むプラスミドのいずれかでトランスフェクトする。次いで、トランスフェクトした細胞の抽出物を、IPRGの存在下での感染性プラークアッセイによって成熟ビリオンについてアッセイする。
まとめると、これらの実験の結果により、G1LおよびI7L遺伝子産物がvCPPの予測する特性を有し、いずれかの活性の非存在により予測される不稔後期表現型が得られることが明らかである。
ワクシニアウイルスI7Lコアタンパク質プロテイナーゼの特徴づけ
酵母におけるユビキチン様プロテイナーゼに対する相同性による推定プロテイナーゼとしてI7Lのオープンリーディングフレームの遺伝子産物を最初に同定した、ワクシニアウイルスコアタンパク質の切断を担うプロテイナーゼの1つであることが示された。コアタンパク質切断の配列および特徴について比較的多数の情報が存在するにもかかわらず、これらの反応を行う酵素についてはほとんど知られていない。本実験の目的は、I7Lが各コアタンパク質を切断することができることおよび前駆体タンパク質中のI7LまたはAla−Gly−Xaa部位のいずれかの推定触媒三つ組みの変異誘発によりこの活性が消滅することを示すことである。
酵母におけるユビキチン様プロテイナーゼに対する相同性による推定プロテイナーゼとしてI7Lのオープンリーディングフレームの遺伝子産物を最初に同定した、ワクシニアウイルスコアタンパク質の切断を担うプロテイナーゼの1つであることが示された。コアタンパク質切断の配列および特徴について比較的多数の情報が存在するにもかかわらず、これらの反応を行う酵素についてはほとんど知られていない。本実験の目的は、I7Lが各コアタンパク質を切断することができることおよび前駆体タンパク質中のI7LまたはAla−Gly−Xaa部位のいずれかの推定触媒三つ組みの変異誘発によりこの活性が消滅することを示すことである。
材料と方法
細胞およびウイルス−5%ウシ胎児血清(FCS)、2mMグルタミン、および15g/ml硫酸ゲンタマイシンを含むイーグルス最小基本培地中でBSC40細胞を成長させた。精製されたts16ワクシニアウイルスを、上記のように調製した。1.5%寒天および50g/mlアンピシリンを含むLuria−BertaniブロスまたはLuria−Bertani培地中で大腸菌株を成長させた。
細胞およびウイルス−5%ウシ胎児血清(FCS)、2mMグルタミン、および15g/ml硫酸ゲンタマイシンを含むイーグルス最小基本培地中でBSC40細胞を成長させた。精製されたts16ワクシニアウイルスを、上記のように調製した。1.5%寒天および50g/mlアンピシリンを含むLuria−BertaniブロスまたはLuria−Bertani培地中で大腸菌株を成長させた。
プラスミドおよび部位特異的変異誘発−使用した全てのプラスミド、オリゴ、および株の説明については、表1を参照のこと。ワクシニアウイルスP4aおよびP4b遺伝子を、プライマーCB40、CB41、CB42、およびCB43をそれぞれ使用したウェスタン逆株ゲノムDNAから増幅し、NcoIおよびNheIならびにPstIおよびHindIIIフランキングを含むpRB21にクローン化して、pP4aおよびpP4bを得た。製造者の説明書に従ってQuikChange(登録商標)部位特異的変異誘発キット(Stratagene,Cedar Creek,TX)を使用し、IDI残基に対してAGS(アミノ酸番号613〜615)およびAGT(アミノ酸番号696〜698)部位を変異するためにプライマーCB46、CB47、CB48、およびCB49を使用し、テンプレートとしてpP4aを使用してP4a遺伝子の部位特異的変異誘発を行った。IDIに対してAGA(アミノ酸番号60〜62)を変異させるためにプライマーCB44およびCB45を使用し、テンプレートとしてpP4bを使用する、P4b遺伝子の部位特異的変異誘発のために同一の方法を使用した。プライマーCB62〜CB73ならびに残基W(アミノ酸番号242)、D(アミノ酸番号248)、D(アミノ酸番号258)、Q(アミノ酸番号322)、C(アミノ酸番号328)、およびG(アミノ酸番号329)をそれぞれAに変異するためのテンプレートとしてプラスミドpI7Lを使用した同一のキットを使用して、I7L遺伝子の部位特異的変異誘発を行った。
同時発現実験−6ウェルプレート中のBSC40細胞のコンフルエントな単層に、細胞あたり5プラーク形成単位の感染多重度でts16VVを感染させ、製造者の説明書にしたがってDMRIE−C(Invitrogen,Carlsbad,CA)を使用して10μgのプラスミドDNAでトランスフェクトした。細胞を、細胞を吸い出すためのピペッティングの上下による吸い上げによって感染24時間後に表面から回収した。粗抽出物を、15000prmで10分間遠心分離し、上清を吸引して破棄し、ペレットを80μlの1×PBS中に再懸濁した。これを3回凍結融解し、2500rpmで3分遠心分離して細胞破片を沈殿させた。上清画分を、ウェスタンブロットによって分析した。
ウェスタンブロット分析−上記で得られた10μlのホールセル抽出物をSDS−ポリアクリルアミドゲルゲル上で泳動し、PVDF(Pall,AnnArbor,MI)メンブレンに移した。メンブレンを、1000倍希釈の抗FLAG抗血清(Stratagene,Cedar Creek,TX)とインキュベートし、その後2000倍希釈のヤギ抗マウスAP抗体(Bio−Rad,Hercules,CA)とインキュベートした。製造者の説明書に従ってAP発色系(Bio−Rad,Hercules,CA)を使用してタンパク質を検出した。
ts16レスキュー実験−100mmプレート中のBSC40細胞のコンフルエントな単層に、感染多重度3でts16を感染させ、pI7L、pH241A、pW242A、pD248A、pD258A、pQ322A、pC328A、pG329A、またはpI7L−Tのいずれかでトランスフェクトした。コントロールについては、細胞にts16のみを感染させ、細胞にウェスタンリザーブワクシニアウイルスを感染させた。40℃で24時間インキュベートした。細胞を回収し、遠心分離し、ペレットを1mLのPBSに再懸濁し、3回凍結融解し、滴定してウイルス複製のレスキューを決定した。
結果
I7Lのコアタンパク質プロセシング活性−I7Lが各コアタンパク質の切断を担うかどうかを決定するために、非許容温度で細胞にts16を感染させ、プラスミドから得た基質および酵素で同時トランスフェクトするインビボトランスプロセシングアッセイを使用した。基質タンパク質およびI7Lプロテアーゼの両方は、合成初期−後期プロモーターを有するプラスミドから構成性に発現される。ウェスタンブロットによる検出のためにC末端上にFLAGエピトープを有する各コアタンパク質プラスミドをデザインした。図16は、前に決定した切断部位をその上に有するA10L、A3L、およびL4Rのオープンリーディングフレームの産物である3つの主要なコアタンパク質P4a、P4b、およびP25のマップである。これらの切断部位は全てAGXモチーフにマッピングされる。P4aは、分子量が97kDaの最も巨大な前駆体タンパク質であり、タンパク質のC末端領域にAGSおよびAGT切断部位の両方を含む。P4bはN末端AGA部位を有する67kDaのポリタンパク質であり、P25Kはタンパク質のN末端領域にAGSおよびAGA切断部位の両方を有する28kDaのポリタンパク質である。
I7Lのコアタンパク質プロセシング活性−I7Lが各コアタンパク質の切断を担うかどうかを決定するために、非許容温度で細胞にts16を感染させ、プラスミドから得た基質および酵素で同時トランスフェクトするインビボトランスプロセシングアッセイを使用した。基質タンパク質およびI7Lプロテアーゼの両方は、合成初期−後期プロモーターを有するプラスミドから構成性に発現される。ウェスタンブロットによる検出のためにC末端上にFLAGエピトープを有する各コアタンパク質プラスミドをデザインした。図16は、前に決定した切断部位をその上に有するA10L、A3L、およびL4Rのオープンリーディングフレームの産物である3つの主要なコアタンパク質P4a、P4b、およびP25のマップである。これらの切断部位は全てAGXモチーフにマッピングされる。P4aは、分子量が97kDaの最も巨大な前駆体タンパク質であり、タンパク質のC末端領域にAGSおよびAGT切断部位の両方を含む。P4bはN末端AGA部位を有する67kDaのポリタンパク質であり、P25Kはタンパク質のN末端領域にAGSおよびAGA切断部位の両方を有する28kDaのポリタンパク質である。
I7LによるP25Kの切断は以前に証明されているが、本明細書中では、本発明者らは、他のコアタンパク質前駆体の切断を指示することができることを証明する。図17は、I7LがP4bをその前駆体形態から成熟プロセシング形態に切断するが(レーン3)、I7Lのヒスチジン残基(推定触媒三つ組みのメンバー)がアラニンに変異する場合、この切断はもはや認められない(レーン4)ことを示す。単独で発現したP4bおよびP4bIDIを示すレーン2および5はコントロールである。レーン1は、交差反応性を示さない非感染細胞を示す。P4bのAGA部位がIDI残基に変異される場合、I7Lによる切断は認められない(レーン6)。レーン7は、変異P4bおよび変異I7Lでは切断産物が認められないことを示す最後のコントロールであり、ウイルスまたは細胞中の他のプロテアーゼでは切断反応が生じないことを示す。
図18に示すように、P4aポリタンパク質を使用してこの実験を繰り返した。P4aが単独で発現する場合(レーン3)、97kDaの成熟サイズで泳動されるが、I7LがP4aでトランスフェクトされた場合、2つの切断産物が認められ(レーン4)、AGSおよびAGT部位の両方で切断されたことを示す。I7Lの変異によってこの切断は消滅する(レーン5)。P4aのAGS部位がIDIに変異してI7Lで同時トランスフェクトされた場合、AGT部位のみでの切断を示す21kDa付近に1つだけバンドが認められる(レーン10)。IDI部位で切断が遮断されるがAGS部位で依然として小さな範囲の切断が認められる30kDa付近の僅かなバンドが認められ、AGT部位がIDIに変異した場合(レーン7)に類似の結果が得られ、これは、I7Lの触媒活性が切断ならびに真の切断部位の存在に必要であることを示す。
I7Lの特徴づけ−図19は、Kyte−Doolittleプログラムを使用したI7Lタンパク質の推定疎水性プロットを示す。推定触媒三つ組み残基の位置および不活性なI7Lに移入した変異を示す。プロリンをロイシンに変化させたts16変異の位置も示す。疎水性プロフィールの下に、バーで示したVV I7L由来の相違の位置と共に痘瘡ウイルス、ラクダ痘ウイルス、およびサル痘ウイルス酵素を示し、これらの酵素がVV I7Lと高度に類似することを示す。タンパク質のN末端ドメインがタンパク質分解プロセシングに必要であるかどうかを決定するために、全長I7Lと比較して示したサイズの短縮I7Lを作製した。いくつかの高度に保存されたアミノ酸を有するVVI7Lと、ASFVプロテアーゼと、アデノウイルスプロテアーゼと、サッカロマイセス・セレヴィシエプロテアーゼとの間に保存された触媒コアドメインが存在する。保存アミノ酸を指す矢印ともに図19の下にこれを示す。
これらの保存アミノ酸のうちどのアミノ酸がI7Lの触媒活性に必要であるかを決定するために、目的の残基をアラニンに変異させるためにそれぞれに対して部位特異的変異誘発を行った。各コアタンパク質前駆体に対する変異タンパク質の活性を試験するために一過性発現アッセイを行った。酵素発現を試験するための抗I7L血清および前駆体タンパク質のプロセシングをチェックするためのFLAGモノクローナル抗血清を使用してウェスタンブロットを行った。各変異I7L酵素は、等しく十分に発現した。図20は、全長I7Lは各前駆体タンパク質を切断することができるが、H(番号241)、W(番号242)、D(番号248)、Q(番号322)、C(番号328)、またはG(番号329)をアラニンに変異した場合、この切断が失われることを示す。変異I7Lのみは、D番号258をアラニンに変異した場合に依然として切断することができ、これが触媒三つ組みのメンバーではないことを示す。pD258Aでの同時トランスフェクションは、このタンパク質が依然としてP25KおよびP4bを切断することができるが、P4aの切断は示さないことを示した。
マーカーレスキュー−I7Lがts16ウイルスの成長およびタンパク質分解プロセシング活性をレスキューすることができることを証明するために、ウイルスを単独、トランスフェクトされた全長I7Lの存在下、およびトランスフェクトされた変異I7Lの存在下で成長させ、非許容温度でI7Lを短縮し、レスキューを決定するために滴定した。図21に示すように、全長I7Lは、ts16n成長をレスキューすることができ、I7Lは、実際、ts16で変異した遺伝子産物であることを示す。変異I7L酵素および短縮酵素のほとんどは、ts16の成長をレスキューすることができず、酵素のN末端部分が必要であることを示す。両アスパラギン酸変異が再生されたが、野生型ウイルスよりも範囲が狭かった。
考察
考察
I7Lのオープンリーディングフレームの遺伝子産物としてVVコアタンパク質前駆体の切断を担うタンパク質の同一性を同定した。この実施例では、本発明者らは、このタンパク質の性質をさらに特徴付けた。エピトープタグ化基質およびプラスミド産生酵素を使用したインビボトランスプロセシングアッセイを使用した本明細書中で報告したデータは、I7Lは切断反応を駆動し、ウイルスコアタンパク質プロテイナーゼであることをさらに確認することができることを示した。変異分析は、この反応が起こるためにI7Lの触媒活性が必要であり、真の切断部位が基質中に存在しなければならないことを示した。これは、I7LがP4bおよびP25Kの真のAGA部位ならびにP4a内のAGSおよびAGT部位で切断することができるという点で全体的な効果なようであるにもかかわらず、P4aおよびP4bの切断はP25Kの切断よりも有効性が低いようである。
ヒスチジン、システイン、およびアスパラギン酸残基の変異によりタンパク質分解活性が消滅するので、I7Lタンパク質はシステインプロテアーゼとして特徴付けられる。さらに、触媒コアドメイン中の他の高度に保存される残基(W(番号242)、Q(番号322)、C(番号328)、G(番号329))は全てタンパク質分解に必要である。タンパク質分解に不可欠であることが見出されない唯一の残基は、D(番号258)であった。
変異中にウイルスによって使用されるタンパク質分解成熟の型に無関係に、感染性子孫ビリオンの有効な産生を確実にするためにウイルスプロテイナーゼ活性を調節することが重要である。一般に、生態系内で、酵素および基質の異なる区画化、特異的阻害剤および/またはアクチベーターの存在、ならびに酵素原のタンパク質分解活性化を含むいくつかの方法でプロテイナーゼの調節が行われる。ウイルスは、類似のストラテジーを取り入れていた。例えば、レトロウイルスでは、酸性細胞外環境により、細胞内でのプロテイナーゼの活性部位の相互作用を防止するgag−polポリタンパク質の一部のその基質との置換によって構造タンパク質の形態形成的切断が誘発されることが提案されている。アデノウイルスの場合、後期複製段階でのpVI構造タンパク質およびウイルスDNAから産生されたジスルフィド結合ペプチドはウイルスプロテイナーゼの活性化およびその後のウイルス成熟に必要であるようである。
本発明を、種々の特定の材料、手順、および実施例を参照して本明細書中に記載および例示しているが、本発明は、この目的のために選択された特定の材料、材料の組み合わせ、および手順に制限されないことが理解される。このような詳細の多数の変形形態を示唆することができ、当業者に認識される。
Claims (25)
- AG(X)モチーフを含むペプチドを準備するステップと、
前記ペプチドをマイクロタイタープレートに用いるステップと、
前記マイクロタイタープレートを一定時間インキュベートするステップと、
ブロッキング溶液を用いて前記プレートの反応表面をコートするステップと、
前記プレートにvCCPを添加するステップと、
切断範囲を経時的にモニタリングするステップと、
別の物質の存在下で前記ステップを繰り返すステップと、
前記物質の存在下での切断範囲と前記物質の非存在下での切断範囲とを比較するステップとを含み、切断の減少は、前記物質がvCPP切断の阻害剤であることを示す、インビトロでのvCCP切断アッセイ。 - 前記ペプチドが、P4b切断部位由来の周辺アミノ酸をさらに含む請求項1に記載のアッセイ。
- 前記ペプチドが標識されている請求項1に記載のアッセイ。
- 前記標識が蛍光標識である請求項3に記載のアッセイ。
- 前記蛍光標識が、IAEDANSまたはDidansyl−L−システインである請求項4に記載のアッセイ。
- 前記標識が、前記ペプチドのアミノ末端に付着している請求項3に記載のアッセイ。
- 前記マイクロタイタープレートが、予め活性化されている請求項1に記載のアッセイ。
- 前記マイクロタイタープレートを一晩インキュベートする請求項1に記載のアッセイ。
- 前記vCPPがI7LまたはG1Lである請求項1に記載のアッセイ。
- 前記切断範囲を蛍光の放出によって測定する請求項1に記載のアッセイ。
- マイクロ蛍光光度計(microfluorimeter)を使用して、前記蛍光の放出をモニタリングする請求項10に記載のアッセイ。
- 標準的なELISA形式を使用して、前記切断範囲を測定する請求項1に記載のアッセイ。
- 前記一次抗体は、切断部位特異的な抗血清である請求項13に記載のアッセイ。
- AG(X)モチーフを含むペプチドを準備するステップと、
プローブの蛍光消光対を準備するステップと、
黒色プレートのウェルに前記ペプチドを滴定するステップと、
前記プレートにvCCPプロテアーゼを添加するステップと、
切断範囲を経時的にモニタリングするステップと、
別の物質の存在下で前記ステップを繰り返すステップと、
前記物質の存在下での切断範囲と前記物質の非存在下での切断範囲とを比較するステップとを含み、切断の減少は、前記物質がvCPP切断の阻害剤であることを示す、インビトロでのvCCP切断アッセイ。 - 前記ペプチドが、P4b切断部位由来の周辺アミノ酸をさらに含む、請求項14に記載のアッセイ。
- 蛍光基に極めて接近して消光基を使用して蛍光エネルギーを消光基によって吸収し、比較的低いシグナル又はベースラインのシグナルが得られるように、前記プローブをペプチドのNH2末端およびCOOH末端にコンジュゲートする、請求項14に記載のアッセイ。
- 前記消光プローブがダブシルスクシンイミジルエステル(ダブシル)基であり、前記蛍光プローブがEDANS基、(5−(2−アミノエチル)アミノ)ナフタレン−1−スルホン酸)である、請求項16に記載のアッセイ。
- 前記消光プローブをペプチドのNH2末端にコンジュゲートし、前記蛍光プローブをペプチドのCOOH末端にコンジュゲートする、請求項16に記載のアッセイ。
- 前記vCCPがI7LまたはG1Lである、請求項14に記載のアッセイ。
- プロテアーゼによる前記ペプチドの切断により、蛍光基の極めて近くの周辺から消光基が除去されてプローブの蛍光が増大する、請求項14に記載のアッセイ。
- AG(X)モチーフを含むペプチドを準備するステップであって、
ここで、前記ペプチドの一方の末端がビオチン化され、他方の末端がポリヒスチジンタグを有し、
ここで、前記ビオチン化末端がストレプトアビジンで修飾され、
前記ポリヒスチジンタグを有する末端がユーロプリンクリプタート結合抗His6抗体で修飾されている、
修飾アロフィコシアニン(XL665)を添加するステップと、
前記標識ペプチドを337nmで励起し、Eu−クリプタートがXL665にエネルギー移動して、665nmの光を放出し、ベースライン発光を測定するステップと、
vCCPプロテアーゼを添加するステップと、
切断範囲を経時的にモニタリングするステップと、
別の物質の存在下で前記ステップを繰り返すステップと、
前記物質の存在下での切断範囲と前記物質の非存在下での切断範囲とを比較するステップとを含み、切断の減少は、前記物質がvCPP切断の阻害剤であることを示す、インビトロでのvCCP切断アッセイ。 - 前記ペプチドがP4b切断部位由来の周辺アミノ酸をさらに含む請求項21に記載のアッセイ。
- 前記ペプチドのアミノ末端がビオチン化され、前記カルボキシ末端がポリヒスチジンタグを有する請求項21に記載のアッセイ。
- 前記vCCPがI7LまたはG1Lである請求項21に記載のアッセイ。
- 前記ペプチドの切断により励起Eu−クリプタートからXL665への共鳴エネルギー移動が阻害されて、665nmの発光シグナルが減少する請求項21に記載のアッセイ。
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