JP2005524699A - 血管新生が促進された移植片構成物 - Google Patents

Abstract

病変組織または損傷組織の修復に使用するための腸粘膜下組織移植片構成物を提供する。本移植片構成物は、脊椎動物の腸粘膜下組織、追加の内皮細胞、および該構成物における血管状構造の形成開始を増強する少なくとも一つの予め選択した追加の外因性細胞集団も含む。予め選択した細胞集団は、非角化上皮細胞集団もしくは角化上皮胞集団であってもよいし、あるいは、線維芽細胞、平滑筋細胞、骨格筋細胞、心筋細胞、多能性を有する前駆細胞、周皮細胞、骨形成原細胞または他の適切な細胞タイプからなる群から選択される中胚葉由来の細胞集団であってもよいが、修復対象の組織に基づいて選択されることが好ましい。これらの腸粘膜下組織移植片構成物の血管新生をin vivoで促進する方法およびこれらの移植片構成物の調製方法もまた提供する。

Description

＜本発明の範囲＞
本発明は、血管新生が促進された粘膜下組織由来の組織移植片、および病変組織または損傷組織を修復するためにその組織移植片を使用する方法に関する。特に、本発明は、腸粘膜下組織移植片構成物の修復能を高めるために、内皮細胞および少なくとも一つの予め選択した追加の外因性細胞集団を接種した血管新生が促進された腸組織移植片を目的とする。

本発明は、損傷組織または病変組織の修復に使用するための、内皮細胞および少なくとも一つの予め選択した追加の外因性細胞集団を接種した脊椎動物粘膜下組織由来マトリックスを含む組織移植片構成物を目的とする。本発明に従って使用する腸粘膜下組織由来マトリックスは、高度に保存されたコラーゲン、糖タンパク質、プロテオグリカンおよびグリコサミノグリカンを含むことが好ましい。本発明において使用する腸粘膜下組織マトリックスは、温血脊椎動物の腸粘膜下組織由来である。

本発明に従って調製される腸粘膜下組織移植片構成物は実質的に細胞がないマトリックスであり、これは、in vivoで見出されたマトリックス環境に類似する優れた細胞成長を提供する。この腸粘膜下組織の天然の組成および立体構造は、in vitroにおける細胞の付着および増殖を促進し、また、移植片構成物がin vivoで移植される際の組織再構築を誘導する、細胞成長のためのユニークな基質を提供する。

組織移植片の物質として、腸粘膜下組織は、宿主の体内に移植されると、内因性組織の成長を誘導する（すなわち、腸粘膜下組織は再構築を誘導する）。腸粘膜下組織は、これまでに、血管移植片、膀胱およびヘルニア修復、腱および靭帯の置換および修復、ならびに皮膚移植片において使用され成功している。組織移植片組成物としての腸粘膜下組織の調製および使用については、米国特許第4,902,508号に記載されている。そのように利用すれば、この移植片構成物で置換された組織の成長または再生のためのマトリックスとして役立つだけでなく、内因性組織のそのような成長または再生を促進したり誘導したりすると考えられる。腸粘膜下組織は、内因性組織の再生を誘導するため、移植可能なシート形態、または注入可能な流体形態もしくはゲル形態で使用し得る。

本発明は、追加の内皮細胞および少なくとも一つの予め選択した追加の外因性細胞集団を含む腸粘膜下組織移植片構成物を目的とする。本発明はまた、これらの移植片構成物を用いて、腸粘膜下組織移植片構成物の血管新生をin vivoで促進する方法を目的とする。血管新生が促進された腸粘膜下組織移植片構成物は、この腸組織移植片組成物を宿主へ移植または注入する前に、内皮細胞または内皮細胞前駆体（例えば前駆細胞または幹細胞）および少なくとも一つの予め選択した追加の細胞タイプもしくは指定された細胞タイプを、in vitroで腸粘膜下組織に接種することによって調製する。

一つの実施形態は、病変組織または損傷組織の修復のために使用する腸粘膜下組織移植片構成物を提供する。この組織移植片構成物は、脊椎動物の腸粘膜下組織、追加の内皮細胞および少なくとも一つの予め選択した追加の外因性細胞集団を含む。

別の実施形態において、病変組織または損傷組織の修復に使用するために、血管新生した腸粘膜下組織移植片構成物を提供する。この腸粘膜下組織移植片構成物は、脊椎動物の腸粘膜下組織、追加の内皮細胞および少なくとも一つの予め選択した追加の外因性細胞集団を含み、in vitroで血管または血管様構造を形成させるために、十分な時間、この内皮細胞をこの腸粘膜下組織上で培養したものである。

別の実施形態において、in vivoで腸粘膜下組織移植片構成物の血管新生を促進する方法を提供する。本方法は、移植片構成物を形成させるために、腸粘膜下組織に、内皮細胞集団および少なくとも一つの予め選択した追加の外因性細胞集団をin vitroで接種する工程、および脊椎動物の修復が必要な部位にこの移植片構成物を移植する工程を包含する。

また別の実施形態において、in vivoで腸粘膜下組織移植片構成物の血管新生を促進する方法を提供する。本方法は、腸粘膜下組織に、内皮細胞集団および少なくとも一つの予め選択した追加の外因性細胞集団をin vitroで接種する工程と、血管もしくは血管様構造の形成または成分を誘導するのに十分な時間にわたってこの内皮細胞をin vitroで培養する工程と、脊椎動物の修復が必要な部位にこの移植片構成物を移植する工程を包含する。

これらの方法の実施形態のいずれにおいても、内皮細胞を腸粘膜下組織に接種した後に、予め選択した追加の細胞集団を接種し得、または内皮細胞を腸粘膜下組織に接種する前に、予め選択した追加の細胞集団を接種し得、あるいは内皮細胞と予め選択した追加の細胞集団とを同時にもしくはほぼ同時に接種し得る。

この内皮細胞は、血管または血管様構造の形成を誘導するのに十分な時間にわたって、in vitroにおいて腸粘膜下組織上で培養し得る。あるいは、この内皮細胞は、in vitroで血管または血管様構造を形成しないで内皮細胞を拡大する（すなわち、この内皮細胞が少なくとも1回***させる）のに十分な時間にわたって、腸粘膜下組織上で培養し得る。あるいは、この移植片構成物は、内皮細胞を拡大させないで移植し得る。これらの実施形態のうちのいずれにおいても、予め選択した追加の細胞集団を、移植片構成物を移植する前に拡大させてもよいし、拡大させ（すなわち、少なくとも1回の細胞***周期を経て発達させ）なくてもよい。

また別の実施形態では、病変組織または損傷組織を修復するために使用する腸粘膜下組織移植片構成物を調製する方法を提供する。本方法は、移植構成物を形成するために、腸粘膜下組織に、内皮細胞集団および少なくとも一つの予め選択した追加の外因性細胞集団をin vitroで接種する工程を包含する。本方法はさらに、血管または血管様構造の形成を誘導するのに十分な時間にわたって、in vitroにおいて腸粘膜下組織上で内皮細胞を培養する工程を包含し得る。

これらの実施形態のうちいずれにおいても、少なくとも一つの追加の細胞集団は、非角化の上皮細胞集団もしくは角化上皮細胞集団、または線維芽細胞、平滑筋細胞、骨格筋細胞、心筋細胞、多能性を有する前駆細胞（例えば、幹細胞）、周皮細胞、および骨形成原細胞からなる群から選択される中胚葉由来細胞の集団を含み得る。様々な実施形態において、腸粘膜下組織マトリックスには、内皮細胞およびこれらの付加的な細胞タイプの１種以上を接種し得る。（すなわち、腸粘膜下組織には、内皮細胞とともに、これらの付加的な細胞タイプの１種、２種、３種等を接種し得る。）

＜本発明の詳細な説明＞
本発明は、脊椎動物の腸粘膜下組織もしくは他の粘膜下組織、追加の内皮細胞および少なくとも一つの予め選択した追加の外因性細胞集団を含む粘膜下組織移植片構成物を目的とする。細胞がない腸粘膜下組織に、内皮細胞および予め選択した外因性細胞集団を接種し、病変組織または損傷組織を修復するために使用する。本発明によれば、「損傷組織」とは、損傷し、裂傷し、切断され、または外科的に切除され、あるいは修復を必要とする部位を欠落している（例えば先天的欠損または先天的奇形）組織を意味する。

本発明に従って使用する内皮細胞は、大血管内皮細胞、微小血管内皮細胞、動脈内皮細胞および静脈内皮細胞を含む、任意のタイプの内皮細胞集団由来であり得る。本発明によれば、成熟内皮細胞（例えば、器官または血管から採取されたもの）または内皮細胞前駆細胞（例えば、前駆細胞または幹細胞）のいずれも使用し得る。さらに、この内皮細胞は、幼若動物からでも老齢動物からでも採取し得るが、幼若動物から採取された内皮細胞が好ましい。

一つの実施形態において、予め選択した追加の外因性細胞集団は、非角化上皮細胞集団もしくは角化上皮胞集団であってもよいし、または、線維芽細胞、平滑筋細胞、骨格筋細胞、心筋細胞、多能性を有する前駆細胞、周皮細胞、骨形成原細胞もしくは他の任意の適切な細胞タイプからなる群から選択される中胚葉由来細胞集団であってもよい。

腸粘膜下組織と内皮細胞とを結合させる、予め選択した追加の外因性細胞集団は、修復対象の組織の細胞タイプに基づいて選択し得る。例えば、皮膚が修復されることになっている場合、予め選択した外因性細胞集団は、非角化上皮細胞であってよいし、心臓組織が修復されることになっている場合は、予め選択した外因性細胞集団は心筋細胞であってよい。別の実施形態において、治療される患者から単離された自家細胞をこの腸粘膜下組織に接種する。

一つの実施形態において、腸粘膜下組織と内皮細胞とを結合させる少なくとも一つの予め選択した追加の細胞集団は、平滑筋細胞および／または平滑筋細胞への分化能を有する前駆細胞を含む。都合のよいことに、平滑筋細胞および／または平滑筋前駆細胞は、内皮細胞と共に、移植片構成物中の血管または血管様構造の形成を促進し得る。別の実施形態において、内皮細胞、平滑筋細胞および／または平滑筋細胞前駆細胞と共に、付加的な細胞タイプを添加し得る。

また別の実施形態において、少なくとも一つの予め選択した追加の外因性細胞集団は、多能性を有する前駆細胞集団を含む。腸粘膜下組織は、損傷組織の修復を助ける細胞の中へ、これらの多能性を有する前駆細胞の分化を誘導し得る。都合のよいことに、内皮細胞集団および多能性を有する前駆細胞集団を接種した腸粘膜下組織は、様々な異なるin vivo部位に移植し得、この前駆細胞は、特定の環境に対して適切な細胞タイプへ分化する。例えば、腱または靭帯部位に内皮細胞および多能性を有する前駆細胞を含む組成物を移植すると、この移植片構成物は腱または靭帯へと再構築する。

腸粘膜下組織、内皮細胞、および予め選択した追加の外因性細胞集団を組み合わせることにより、in vitroおよび／またはin vivoにおいて血管新生が驚異的に増強し、腸粘膜下組織のみと内皮細胞以外の治療因子としての細胞タイプとの組み合わせのいずれかの使用と比較して、組織機能のより高い創傷治癒能および優れた回復を有する組織移植片構成物を提供する。

様々な実施形態において、腸粘膜下組織に内皮細胞を接種した後に、腸粘膜下組織マトリックスに予め選択した追加の細胞集団を接種し得るか、または腸粘膜下組織に内皮細胞を接種する前に、腸粘膜下組織に予め選択した追加の細胞集団を接種し得るか、または内皮細胞および予め選択した追加の細胞集団を同時にもしくはほぼ同時に接種し得る（様々な典型的な実施形態については、図１を参照）。

そのような一つの実施形態において、腸粘膜下組織に内皮細胞を接種し得、そして、構成物を病変部位へ移植する前に、血管または血管様構造の形成を誘導するのに十分な時間にわたって、腸粘膜下組織上でこの内皮細胞を培養し得る。腸粘膜下組織に内皮細胞を接種した後において、またin vivoで移植片構成物を移植する直前までの任意の時点において、この腸粘膜下組織に少なくとも一つの予め選択した追加の外因性細胞集団を接種し得る。従って、移植片構成物の移植の前に腸粘膜下組織上で予め選択した細胞を培養するのに許容する時間によって、予め選択した追加の細胞集団は、移植片構成物の病変部位への移植の前に拡大させ（すなわち、少なくとも１回の細胞***周期を経て発達させ）てもよいし、拡大させなくてもよい。

あるいは、腸粘膜下組織に内皮細胞を接種した後に、この腸粘膜下組織に少なくとも一つの予め選択した追加の外因性細胞集団を接種し得、そして、移植片を移植する前に、血管もしくは血管様構造の形成または成分を誘導しないで内皮細胞を拡大させるために、腸粘膜下組織上でその内皮細胞を培養し得る。本実施形態において、移植片構成物の移植の前に腸粘膜下組織上で予め選択した細胞集団を培養するのに許容する時間によって、予め選択した追加の細胞集団は、移植片構成物の病変部位への移植前に拡大させてもよいし、拡大させなくてもよい。

別の実施形態において、腸粘膜下組織に内皮細胞を接種した後に、この腸粘膜下組織に少なくとも一つの予め選択した追加の外因性細胞集団を接種し得、その後直ちに、内皮細胞も予め選択した追加の外因性細胞集団のいずれも拡大させることなく、この腸粘膜下組織を移植し得る。

代替的な実施形態において、腸粘膜下組織に予め選択した追加の外因性細胞集団を接種し得、移植片構成物を移植する前に予め選択した細胞集団を拡大させる（すなわち、この細胞を少なくとも1回***させる）ために、この予め選択した細胞集団をマトリックス上で培養し得る。この実施形態において、腸粘膜下組織に予め選択した外因性細胞集団を接種した後において、また、in vivoで移植片を移植する直前までの任意の時点において、この腸粘膜下組織に内皮細胞を接種し得る。従って、移植片の移植の前に腸粘膜下組織上で内皮細胞を培養するのに許容する時間によって、移植片構成物の病変部位への移植の前にこの内皮細胞を拡大させてもよいし、拡大させなくてもよい。内皮細胞を拡大させる場合、内皮細胞の拡大は、血管または血管様構造の形成を含んでもよいし、含まなくてもよい。

別の実施形態において、腸粘膜下組織に少なくとも一つの予め選択した追加の外因性細胞集団を接種した後に、この腸粘膜下組織に内皮細胞を接種し得、その後直ちに、内皮細胞も予め選択した追加の外因性細胞集団のいずれも拡大させることなく、移植片を移植し得る。

また別の実施形態において、腸粘膜下組織に内皮細胞および予め選択した追加の外因性細胞集団を同時にまたはほぼ同時に接種し得る。本実施形態において、内皮細胞および予め選択した追加の外因性細胞集団を腸粘膜下組織上で培養し、これら２つの細胞集団を拡大させることもできるし、２つの細胞集団を拡大させないで移植片を移植することもできる。内皮細胞を拡大させる場合、内皮細胞の拡大は、血管または血管様構造の形成を含んでもよいし、含まなくてもよい。

腸粘膜下組織は、in vitroにおいて腸粘膜下組織上で培養される細胞の増殖および分化を支える生理的環境を有利に提供する。従って、腸粘膜下組織上に細胞を接種し得、以下に記述するように、当業者に公知の標準的な細胞培養技術を用いて細胞を培養し、移植用組織移植片を作成してそれを必要としている宿主に移植し得る。

腸粘膜下組織が、細胞の成長を支える基質となれる能力は、宿主への移植の前に、内皮細胞集団および／または予め選択した追加の外因性細胞集団を拡大させる機会を提供する。内皮細胞を拡大させる場合、そのような拡大は、移植前に、血管または血管様構造の形成（すなわち、in vitroにおける移植片構成物の潜在的な血管新生）をもたらし得、移植片構成物が移植されると、移植片の創傷治癒能を向上させる。移植片構成物を移植する前に、血管または血管様構造を形成させること、あるいは、移植片構成物を移植する前に内皮細胞を拡大させることにより、移植片を移植したときの創傷治癒能が高められる。それは例えば、腸粘膜下組織シートの管腔から離れた（abluminal）組織層側で増殖する細胞の分化および遊走を促進し、さらにこれらの細胞が粘膜下組織そのものの中での増殖を促進するという作用によるものである。

移植の前に、追加の内皮細胞および予め選択した追加の外因性細胞集団を腸粘膜下組織上で培養する実施形態において、細胞成長を寄与する条件下で、腸粘膜下組織上でこれらの細胞を培養する。培養細胞は、腸粘膜下組織と直接的に接触するかまたは間接的に接触（例えば、液性の伝達）し得る。細胞成長に寄与する条件とは、組織および細胞培養について現在認められている手順の下で、細胞増殖に最適であると考えられる無菌技術、温度（例えば、約37℃）、および栄養供給量などの環境要因である。最適の培養条件は特定の細胞タイプに依存するが、一般に細胞成長の条件は、当技術分野で周知である。

本発明に従った腸粘膜下組織は、移植片物質として様々な形態で使用し得、また、移植片構成物を移植する前に、in vitroにおいて内皮細胞およびその他の細胞タイプを培養するために使用し得る。これらの形態としては、シート型の構造、ゲル形態、（例えば、組織の粉砕または消化による）流動組成物、および当業者に公知の細胞／組織培養液に添加するための抽出物が挙げられる。この腸粘膜下組織またはその成分は、細胞接着のための表面を提供し、かつ／または細胞分化および／または細胞増殖を誘導し得る。この腸粘膜下組織は、組織培養／細胞培養として適用する前に滅菌することが好ましい。しかし、抗生物質が細胞培養液に含まれている場合、滅菌していない組成物を使用し得る。

本発明の一つの実施形態に従って、腸粘膜下組織の植片構成物を提供する（粘膜下組織は筋層から剥離し、少なくとも腸粘膜下組織の粘膜層の管腔部分は、移植片物質として使用されかつ移植片構成物を移植する前にin vitroにおいて内皮細胞および他の細胞タイプを培養するために使用する）。この方法で剥離された腸粘膜下組織は、シート形態、ゲル形態、または消化物や抽出物などの流動組成物として本発明に従って使用し得る。

一つの実施形態において、移植片構成物を移植する前に、細胞培養のために細胞増殖に寄与する条件下で、腸粘膜下組織の層の上に細胞を直接接種する。これらの組織は多孔性であるため、細胞の栄養素がマトリックス全体に拡散し得る。従って、腸粘膜下組織層の管腔面および／または管腔から離れた面に細胞を接種し得、かつそこで培養し得る。腸粘膜下組織の管腔面とは、腸の管腔に面している腸粘膜下組織面で、典型的には、in vivoで内側の粘膜層に隣接している。これに対し、管腔から離れた面とは、腸の管腔から離れている腸粘膜下組織面で、典型的には、in vivoで平滑筋組織と接している。

腸粘膜下組織層のどの側面で細胞が成長するかによって、脊椎動物の腸粘膜下組織の固形層上で培養した細胞は、異なる成長パターンを示し、腸粘膜下組織の成長のための基質と様々な相互作用を示す。本発明の腸粘膜下組織層上で培養された内皮細胞の組織学的な検査により、管腔から離れた面に接種された内皮細胞は、腸粘膜下組織表面に沿って成長／増殖するだけでなく、より容易に粘膜下組織自体へと遊走し、その中で増殖することが明らかにされている。腸粘膜下組織の管腔面は、管腔から離れた側面よりマトリックスの密度が高い。従って、細胞が管腔面を貫通することはほとんどない。腸粘膜下組織の管腔面上に接種された細胞は、マトリックスに付着するが、通常は、マトリックスの表面を貫通しない。

移植片構成物の移植前に培養するために、腸粘膜下組織上に接種された内皮細胞および／または予め選択した追加の外因性細胞集団は、無機物、アミノ酸、糖、ペプチド、タンパク質、もしくはラミニンやフィブロネクチンなどの糖タンパク質を含む栄養素、および／または上皮細胞増殖因子、血管内皮細胞由来増殖因子、血小板由来増殖因子、血小板由来増殖因子様分子、トランスフォーミング成長因子β、線維芽細胞増殖因子、あるいは別の血清増殖因子などの増殖因子の存在下で成長させることができる。一つの実施形態において、in vitroでの細胞増殖を持続させ誘導する能力を高め、さらにin vivoでの再構築を誘導するため、流動形態または粉末形態の腸粘膜下組織を、標準的な細胞培地に補充するために用いることができる。市販の細胞培地体培地（血清含有でも無血清でもよい）の存在下において、腸粘膜下組織上でこの細胞を成長させることができる。

一つの実施形態において、腸粘膜下組織および内皮細胞を組み合わせるために、少なくとも一つの予め選択した追加の細胞集団は、内皮細胞とともに移植片構成物の血管または血管様構造の形成を促進するための、平滑筋細胞および／または平滑筋細胞への分化能を有する前駆細胞であってよい。平滑筋細胞をヘパリナーゼで処理すると、増殖細胞に特徴的な表現型の変化を誘導し得ることが知られている。このため、腸粘膜下組織に、内皮細胞および平滑筋細胞集団および／または平滑筋細胞前駆細胞集団を含む少なくとも一つの予め選択した外因性細胞集団を接種する実施形態においては、ヘパリナーゼが細胞培地中に含まれ得る。例えば、フラボバテリウム・ヘパリナム（Flavobaterium heparinum）由来の4単位/mlのヘパリナーゼは、短時間（例えば、6時間）培地に含有させ得るか、または、培地に常に存在させ得る。

また、サブコンフルエントな細胞単層としての基質上に接種された平滑筋細胞には、***能による表現型の変化が起こることが知られている。平滑筋細胞が内皮細胞のコンフルエントな単層で共培養されると、表現型の変化が阻害される。このため、腸粘膜下組織に内皮細胞および平滑筋細胞集団および／または平滑筋細胞前駆細胞集団を含む少なくとも一つの予め選択した外因性細胞集団を接種する実施形態においては、この細胞がサブコンフルエントな細胞単層として腸粘膜下組織に付着するように、追加の内皮細胞を腸粘膜下組織上に接種し得る。別の実施形態において、細胞がサブコンフルエントな細胞単層としての腸粘膜下組織に付着するように、内皮細胞、平滑筋細胞および／または平滑筋前駆細胞を腸粘膜下組織上に接種し得る。

粘膜下組織は、in vivoにおいて多くの微小環境（例えば、腱、靭帯、骨、関節軟骨、動脈、および静脈）中に移植される際、宿主の組織の増殖や適切な組織構造の再構築および再生を誘導する能力をもつことが、これまでにも十分に立証されてきた。内因性組織の形成を誘導するために、シート形態および流動形態における腸粘膜下組織の使用については、米国特許第5,281,422号および同第5,275,826号に記載され特許請求されている（これらの開示は、特に援用することにより本明細書中に組み込むものとする）。従って、本発明の腸粘膜下組織移植片は、修復を必要とする損傷組織の再構築を誘導するためにin vivoで移植される。

一つの実施形態において、腸粘膜下組織、追加の内皮細胞、および予め選択した追加の外因性細胞集団を含有する特許請求されている組成物を、宿主の中への移植するための生体適合性マトリックス中に被包し得る。この被包マトリックスは、栄養素を被包された細胞に拡散させ、さらにこの被包された細胞の産物を、被包された細胞から宿主の細胞へと拡散させるように構成し得る。生細胞を被包するのに適する生体適合性ポリマーは当業者に知られている。例えば、ポリリシン／アルギン酸塩封入法（polylysine/alginate encapsulation process）が、F.LimとA.Sunによって既に記載されている（Science,Vol.210,pp.908-910）。実際に、人工臓器として移植するために、本発明のマトリックス上の細胞を被包すれば、腸粘膜下組織それ自体を有利に使用することができる。

一つの実施形態において、in vivoにおいて腸粘膜下組織移植片構成物の血管新生を促進する方法を提供する。この方法は、腸粘膜下組織に、内皮細胞集団および少なくとも一つの予め選択した追加の外因性細胞集団をin vitroで接種する工程と、脊椎動物の修復の必要な部位にこの移植片構成物を移植する工程とを包含する。この方法の一つの実施形態において、腸粘膜下組織に内皮細胞を接種し、構成物を病変部位に移植する前に、血管または血管様構造の形成を誘導するのに十分な時間にわたって、腸粘膜下組織上でその内皮細胞を培養し得る。移植片構成物に内皮細胞を接種した後において、またin vivoで移植片構成物を移植する直前までの任意の時点において、腸粘膜下組織に少なくとも一つの予め選択した追加の外因性細胞集団を接種し得る。従って、移植片構成物の移植の前に、腸粘膜下組織上で予め選択した細胞集団を培養するのに許容する時間によって、予め選択した追加の細胞集団を、移植片構成物の病変部位への移植の前に拡大させてもよいし、拡大させなくてもよい。

あるいは、腸粘膜下組織に内皮細胞を接種した後に、この腸粘膜下組織に少なくとも一つの予め選択した追加の外因性細胞集団を接種することができ、移植片を移植する前に、血管または血管様構造の形成を誘導しないで腸粘膜下組織上でその内皮細胞を培養して、内皮細胞を拡大させることもできる。本実施形態において、移植片構成物の移植の前に、腸粘膜下組織上で内皮細胞を培養するのに許容する時間によって、移植片構成物の病変部位への移植の前に、予め選択した追加の細胞集団を拡大させてもよいし、拡大させなくてもよい。

別の実施形態において、腸粘膜下組織に内皮細胞を接種した後に、この腸粘膜下組織に少なくとも一つの予め選択した追加の外因性細胞集団を接種し得、その後直ちに、この組織片構成物は内皮細胞も予め選択した追加の外因性細胞集団のいずれも拡大させることなく、移植し得る。

本方法の代替的な実施形態において、腸粘膜下組織に予め選択した追加の外因性細胞集団を接種し得、移植片構成物を移植する前に、予め選択した細胞集団を拡大させるために、腸粘膜下組織上でこの予め選択した細胞集団を培養し得る。この実施形態において、腸粘膜下組織に予め選択した細胞集団を接種した後において、またin vivoで移植片構成物を移植する直前までの任意の時点において、この腸粘膜下組織に内皮細胞を接種し得る。従って、移植片構成物を移植する前に、腸粘膜下組織上で内皮細胞を培養することによってこの細胞を拡大させるのに許容する時間によって、移植片構成物の病変部位への移植の前に、この内皮細胞を拡大させてもよいし、拡大させなくてもよい。この内皮細胞を拡大させる場合、内皮細胞の拡大は、血管または血管様構造の形成を含んでもよいし、含まなくてもよい。

別の実施形態において、腸粘膜下組織に少なくとも一つの予め選択した追加の外因性細胞集団を接種した後に、この腸粘膜下組織に内皮細胞を接種し得、その後直ちに、内皮細胞も予め選択した追加の外因性細胞集団のいずれも拡大させることなく、この移植片構成物を移植し得る。

また別の実施形態において、腸粘膜下組織に内皮細胞と予め選択した追加の外因性細胞集団とを同時にまたはほぼ同時に接種し得る。この実施形態において、内皮細胞と予め選択した追加の外因性細胞集団とを腸粘膜下組織上で培養し、これら２つの細胞集団を拡大させることもできるし、２つの細胞集団を拡大させないで移植片構成物を移植することもできる。この内皮細胞を拡大させる場合、内皮細胞の拡大は、血管または血管様構造の形成を含んでもよいし、含まなくてもよい。

本発明に従って、病変組織または損傷組織の修復に使用するために、血管新生した腸粘膜下組織移植片構成物もまた提供する。この血管新生した移植片構成物は、腸粘膜下組織を含有し、さらに追加の内皮細胞および少なくとも一つの予め選択した追加の外因性細胞集団を含み、ここでこの内皮細胞は、in vitroにおいて血管または血管様構造を形成させるのに十分な時間にわたって、腸粘膜下組織上で培養した。

別の実施形態において、in vivoにおける腸粘膜下組織移植片構成物の血管新生を促進する方法を提供する。この方法は、腸粘膜下組織に、内皮細胞集団および少なくとも一つの予め選択した追加の外因性細胞集団をin vitroで接種する工程と、in vitroにおいて血管または血管様構造の形成を誘導するのに十分な時間にわたって、内皮細胞と付加的な細胞集団とを該腸粘膜下組織上で培養する工程と、脊椎動物の修復の必要な部位に移植片構成物を移植する工程を包含する。

本発明の腸粘膜下組織は、移植の前に、初めは小さな細胞集団（in vitroで拡大し得る）を接種し得る。都合のよいことに、in vitroにおいて内皮細胞を腸粘膜下組織上で培養すると、この内皮細胞を接種することによって、in vitroでこの移植片の血管新生を誘導し得る。この腸粘膜下組織はさらに、血管新生を促進するために、平滑筋細胞もしくは平滑筋細胞前駆細胞、または線維芽細胞などの別の細胞タイプを接種し得る。

この実施形態において、腸粘膜下組織に内皮細胞を接種し、構成物を病変部位に移植する前に、血管または血管様構造の形成を誘導するのに十分な時間にわたって、その内皮細胞を腸粘膜下組織上で培養し得る。腸粘膜下組織に内皮細胞を接種した後において、またin vivoで移植片構成物を移植する直前までの任意の時点において、この腸粘膜下組織に少なくとも一つの予め選択した追加の外因性細胞集団を接種し得る。従って、移植片構成物を移植する前に、腸粘膜下組織上で予め選択した細胞集団を培養するのに許容する時間によって、移植片構成物の病変部位への移植の前に、予め選択した追加の細胞集団を拡大させてもよいし、拡大させなくてもよい。

代替的な実施形態において、腸粘膜下組織に予め選択した追加の外因性細胞集団を接種し得、移植片構成物を移植する前に、この予め選択した細胞集団をマトリックス上で培養して、予め選択した細胞集団を拡大させ得る。この実施形態において、腸粘膜下組織に予め選択した細胞集団を接種した後に、この腸粘膜下組織に内皮細胞を接種する。この実施形態において、移植片構成物を病変部位に移植する前に、血管または血管様構造を形成するために内皮細胞を拡大するのに十分な時間にわたって、内皮細胞を腸粘膜下組織上で培養する。

別の実施形態において、腸粘膜下組織に内皮細胞と予め選択した追加の外因性細胞集団とを同時にまたはほぼ同時に接種し得る。この実施形態において、移植片構成物を移植する前に、予め選択した追加の外因性細胞集団と内皮細胞とを腸粘膜下組織上で培養し、これら２つの細胞集団を拡大させる。

病変組織または損傷組織を修復するのに使用する腸粘膜下組織移植片構成物を調製する方法もまた提供する。この方法は、移植片構成物を形成するために、腸粘膜下組織に、内皮細胞集団および少なくとも一つの予め選択した追加の外因性細胞集団をin vitroで接種する工程を包含する。この方法はさらに、移植片構成物を病変部位に移植する前に、血管または血管様構造の形成を誘導するのに十分な時間にわたって、内皮細胞を腸粘膜下組織上で培養する工程を包含し得る。

本発明に従って使用するために、腸粘膜下組織の調製については、例えば、米国特許第4,902,508号に記載されている。要約すると、腸粘膜下組織は脊椎動物の腸から調製し、ブタ、ヒツジ、またはウシから採取するのが好ましいが、それ以外の種からでも可能である。この点で、腸粘膜下組織は典型的には異種（すなわち、異なる種に由来する）ものであるが、同種異系（すなわち、同じ種の異なる種類に由来する）あるいは自家（すなわち、同じ動物または個体に由来する）のものであってもよい。

本発明で使用される、腸粘膜下組織を調製する一つの方法では、縦方向に拭き取ることで組織を剥離し、平滑筋組織を含む外側層および最も内側の層（すなわち、少なくとも粘膜の管腔部分）を除去する。従って、粘膜下組織は、筋層および少なくとも粘膜の管腔部分から剥離される。粘膜下組織を生理食塩水ですすぎ、必要に応じて滅菌する。これにより、水和状態または脱水状態で保存し得る。凍結乾燥または風乾した粘膜下組織は、再水和し、生物活性を欠失しないで本発明に従って使用し得る。開始物質としての天然の粘膜下組織は、比較的細胞を持たないコラーゲンマトリックスである。また、上記の通り調製された好ましいコラーゲン腸粘膜下組織は、無傷細胞のないコラーゲンマトリックスである（すなわち、粘膜下組織のコラーゲン腸粘膜下組織は細胞がない）。

粘膜下組織の多層シートを形成するために、粘膜下組織の複数の層を互いにオーバーラップさせることができる。個々の層は、縫合およびコラーゲン結合ペースト剤（collagen binder paste）などの生体適合性接着剤の使用を含む、当業者に公知の標準的な技術を用いて、互いに対して固定し得る。あるいは、脱水条件下で、オーバーラップした領域を圧縮することにより各層を融合してもよい。必要に応じて、米国特許第5,711,969号に記載されているように、加熱してもよい（この開示は、特別に本明細書中に組み込むものとする）。

脊椎動物の腸粘膜下組織は、グルタルアルデヒドによるなめし処理、酸性ｐＨにおけるホルムアルデヒドによるなめし処理、エチレンオキシド処理、プロピレンオキシド処理、ガスプラズマ滅菌、γ線照射、電子ビームおよび過酢酸滅菌を含む従来の滅菌技術を用いて殺菌し得る。好ましい滅菌技術は、粘膜下組織を、過酢酸、１〜４ミリラドのγ線照射（より好ましくは1〜2.5ミリラドのγ線照射）、またはガスプラズマ滅菌に曝露させることであるが、なかでも過酢酸滅菌が最も好ましい滅菌法である。代表的に、腸粘膜下組織には、２つ以上の滅菌過程が供される。腸粘膜下組織は、例えば化学処理によって滅菌した後、電子ビーム滅菌法またはγ線照射滅菌法を用いて再度殺菌することができる。代表的に、移植片への細胞の添加は、移植片の滅菌後に行う。米国特許第6,206,931号に記載されているような滅菌技術を使用してもよい（本明細書中に援用することにより組み込むものとする）。本発明の移植片構成物を移植する前に、in vitroにおいて内皮細胞および予め選択した細胞集団を培養するために、滅菌した腸粘膜下組織を使用し得る。

脊椎動物の腸粘膜下組織はまた、粉砕および／または酵素による消化により生物活性を欠失しないで流動化し得ることが知られている。米国特許第6,264,992 B1号を参照されたい（この開示は、特に援用することにより本明細書中に組み込むものとする）。より詳細には、腸粘膜下組織成分全体またはその大部分を可溶化するのに十分な時間にわたって、天然の腸粘膜下組織または流動化された腸粘膜下組織の組成物は、酵素で処理し得る。好ましくは、腸粘膜下組織成分の懸濁液または均質な溶液を得るために、腸粘膜下組織の構造成分を加水分解する酵素で粘膜下組織を消化する。腸粘膜下組織は、プロテアーゼ（例えば、コラゲナーゼ、またはトリプシンもしくはペプシン）、グリコサミノグリカナーゼ（glycosaminoglycanase）またはプロテアーゼとグリコサミノグリカナーゼとの組み合わせで酵素的に処理し得る。必要に応じて、他の適切な酵素を単独で、あるいはプロテアーゼとグリコサミノグリカナーゼとを組み合わせて使用し得る。組織消化物は、部分的に可溶化された粘膜下組織の均質な溶液を得るために、必要に応じて濾過し得る。

腸粘膜下組織成分の濃度および水和化の程度をコントロールすることにより、流動化された腸粘膜下組織の粘性を操作し得る。粘性は、25℃で、約2〜約300,000cpsの範囲に調節し得る。消化した物質を透析した後、腸粘膜下組織消化溶液のｐＨを約5.0〜約9.0に調節することにより、より高い粘性を有する配合物（例えば、ゲル剤）を腸粘膜下組織消化溶液から調製し得る。

腸粘膜下組織抽出物の調製については、1998年6月18日に国際公開第98/25964号パンフレットとして公開された国際特許出願第PCT/US97/22721号の明細書（本明細書中に援用することにより組み込むものとする）および実施例３に記載されている。流動形態およびゲル形態の腸粘膜下組織、ならびに腸粘膜下組織抽出物に、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）β、ＴＧＦ−β関連タンパク質、線維芽細胞増殖因子を含む増殖因子などの生理活性物質を保持してもよい。

本発明はまた、腸粘膜下組織の粉末形態での使用を考慮する。一つの実施形態において、腸粘膜下組織を液体窒素下で微粉砕し、粒径0.1〜1mm²の範囲の粒子を形成することによって、粉末形態の腸粘膜下組織を調製し得る。次いで、この粒子状組成物を一晩凍結乾燥し滅菌して、固形状の実質的に無水の粒子状組成物を形成する。あるいは、粉末形態の腸粘膜下組織は、粉砕された腸粘膜下組織の懸濁液または溶液を乾燥させることにより、流動化した腸粘膜下組織から形成し得る。

＜実施例１＞
＝＝＝流動化させた腸粘膜下組織の調製＝＝＝
すでに米国特許第4,902,508号および同第4,956,178号に記載され、また上述した通り、新たに安楽死させたブタ（Delphi Indiana）から小腸粘膜下組織を採取し調製した。液体窒素下で腸粘膜下組織を粉末化し、使用するまで−80℃で保存した。この粉末状組織5gを100mlの0.1％ペプシン含有0.5M酢酸溶液に加え、4℃で72時間消化することにより、部分消化を行った。部分消化の後、懸濁液を4℃で20分間遠心（12,000rpm）し、不溶性のペレットを捨てた。上清を、4℃で、0.01M酢酸を数回取り換えながら透析し（MWCO 3500）た。腸粘膜下組織水解物にクロロホルム（900mlの0.01M酢酸に対し5mlのクロロホルム）を加えることにより、この溶液を滅菌した。無菌の0.01M酢酸をさらに2度取り換えて、腸粘膜下組織の透析を続け、クロロホルムを除去した。その後、透析バッグの内容物を、無菌的な容器に無菌的に移した。得られた流動性の組成物を4℃で保存した。流動化腸粘膜下組織組成物は、細胞および増殖因子等の他の成分と組み合わせて、本発明の移植片構成物において使用する。

＜実施例２＞
＝＝＝腸粘膜下組織のゲル形態の組成物の調製＝＝＝
ゲル形態の腸粘膜下組織を調製するために、8mlの流動化粘膜下組織を、1.2mlの10×PBSバッファー（5mg/Lフェノールレッドを含む10×リン酸緩衝生理食塩水）（0.04N HCl（約1.6ml）を加え、ｐＨを6.6〜7.4に調節し、次いで、ｐＨが＞８にシフトするまで0.05N NaOH（約1.2ml）を加えた）と混合した。最終量は水で12mlに調節した。脊椎動物の宿主に移植するため、得られた混合物は、細胞や増殖因子等の移植片構成物の他の成分と組み合わせる。

＜実施例３＞
＝＝＝腸粘膜下組織抽出物の調製＝＝＝
これらの研究に使用した抽出バッファーには、4Mグアニジンおよび2M尿素が含まれていた（それぞれ、50mM Tris-HCl、ｐＨ7.4で調製）。腸粘膜下組織粉末を、フッ化フェニルメチルスルフォニル（PMSF）、Ｎ−エチルマレイミド、およびベンザミジン（プロテアーゼ阻害剤）を含む（それぞれ1mM）抽出バッファー（25%w/v）に懸濁し、4℃で24時間激しく撹拌した。次いで、抽出混合液を4℃、で30分間遠心（12,000×g）し、上清を回収した。抽出バッファーで不溶性の物質を簡単に洗浄し、遠心し、洗浄液を元の上清と併せた。この上清を、30倍量の脱イオン水（72時間にわたり9回取替え）でSpectrapor（MWCO 3,500、スペクトラム・メディカル・インダストリーズ(Spectrum Medical Industries)、ロサンゼルス、カリフォルニア州）のチューブで十分に透析した。いかなる不溶性の物質も除去するために、透析物を12,000×gで遠心し、移植片構成物の他の成分と組み合わせるためにこの上清を直ちに使用するか、または凍結乾燥して保存した。

＜実施例４＞
＝＝＝腸粘膜下組織の滅菌＝＝＝
細胞培養技術は絶対無菌条件下で実施しなければならないので、培養系に抗生物質が含まれていない場合、移植片構成物の移植の前に、腸粘膜下組織を無菌的な方法で調製して細胞培養基質として使用できるようにしなければならない。腸粘膜下組織の生物親和特性に対する滅菌効果を評価するため、数多くの滅菌法について調べた。組織の機械的強度および生物親和特性を著しく弱めない滅菌技術が好ましい。腸粘膜下組織に対して以下の滅菌法を評価した：過酢酸滅菌、1.0（または1.0未満）〜2.5ミリラドのγ線照射、1.0ミリラドのγ線照射、Exspor（アルサイド社、ノーフォーク、コネチカット州）滅菌、電子ビーム、ホルムアルデヒド、およびこれらの滅菌法の様々な組み合わせ。コバルト60γチャンバーを使用し、水和した腸粘膜下組織にγ線照射を行った。Exsporによる滅菌は、滅菌剤量（ml）：腸粘膜下組織（g）＝10：1の割合で、製造業者の指示書に従って実施した。

様々な細胞タイプ（例えば、IMR−90、FR、HT−29、RPEC）を、滅菌した腸粘膜下組織に接種し、それらの成長特性を1、3、7および14日目に解析した。全細胞タイプについて得られた結果によれば、γ線照射または過酢酸処理により滅菌された腸粘膜下組織由来の成長基質は、細胞の付着と成長をある程度まで支えたことが明らかにされた。しかし、過酢酸滅菌腸粘膜下組織由来基質に接種された細胞は、付着率および生存率の増加を示し、かつ増殖率および分化率も高くなった。好ましい滅菌法としては、過酢酸処理に続いてγ線照射または電子ビームにより最終滅菌する方法が挙げられる。

＜実施例５＞
＝＝＝過酢酸処理した腸粘膜下組織の滅菌＝＝＝
腸粘膜下組織を10：1（過酢酸溶液ml：腸粘膜下組織g）以上の割合で、室温で2時間、過酢酸／エタノール溶液に浸漬する。過酢酸／エタノール溶液は4％エタノール、0.1％ （v：v）過酢酸、および残りの水を含む。0.1％過酢酸成分は、表１の定義のような市販の35％過酢酸原液の稀釈液である。腸粘膜下組織を、過酢酸溶液中に浸漬している間、ローテーター上で振とうすることが好ましい。２時間後、過酢酸溶液は流出させ、同等量の乳酸リンゲル液またはリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で置換し、15分間浸漬する（その間振とうする）。腸粘膜下組織を、乳酸リンゲル液ルまたはPBSでさらに４回洗浄した後、さらに15分間滅菌水ですすぐ。

表１：35％過酢酸溶液の化学組成（重量％）
過酢酸 35.5
過酸化水素 6.8
酢酸 39.3
硫酸 1.0
水 17.4
過酸化アセチル 0.0
安定剤 500PPM
代表的な活性酸素分析（重量％）
過酸としての活性酸素 7.47
Ｈ₂Ｏ₂としての活性酸素 2.40
全活性酸素 10.67

＜実施例６＞
＝＝＝内皮細胞の成長＝＝＝
米国特許第4,902,508号に記載の通り、新たに安楽死させたブタから小腸粘膜下組織を採取し調製する。様々な方法（γ線照射、過酢酸等）により滅菌した後、細胞成長のための平坦な表面（50mm²）を作るために、組織をポリプロピレンフレーム内に固定する。培地栄養素が、腸粘膜下組織の両方の表面へ届くように、このフレームを組織培養培地に浸す。内皮細胞および平滑筋細胞を腸粘膜下組織に接種し、（3×10⁴細胞／腸粘膜下組織片）、次いで、37℃、5％C0₂の95％エアインキュベーターに入れる。様々な時間培養した後、細胞を接種した腸粘膜下組織を、10％中性緩衝ホルマリンで固定し、パラフィンに包埋して切片（6μm）を作成する。細胞増殖の特性を明らかにするため、様々な組織学染色および免疫組織化学的染色を実施する。これらの方法を用いて、血管または血管様構造を観察する。

本発明の移植片構成物の代替的な調製を示すフローチャートである。

Claims (49)

1. 病変組織または損傷組織の修復に使用するための腸粘膜下組織移植片構成物であって、
   脊椎動物の腸粘膜下組織、追加の内皮細胞および少なくとも一つの予め選択した追加の外因性細胞集団を含む組織移植片構成物。
2. 前記少なくとも一つの追加の細胞集団が、角化上皮細胞、非角化上皮細胞、および中胚葉由来細胞からなる群から選択される細胞集団を含む、請求項１に記載の移植片構成物。
3. 前記少なくとも一つの追加の細胞集団が、平滑筋細胞の集団を含む、請求項１に記載の移植片構成物。
4. 前記少なくとも一つの追加の細胞集団が、平滑筋細胞前駆細胞の集団を含む、請求項１に記載の移植片構成物。
5. 前記腸粘膜下組織が、筋層、および少なくとも該腸組織の粘膜層の管腔部分から剥離されることを特徴とする、請求項１に記載の移植片構成物。
6. さらにヘパリナーゼを含むことを特徴とする、請求項１に記載の移植片構成物。
7. 血管内皮細胞由来増殖因子、血小板由来増殖因子、血小板由来増殖因子様分子、トランスフォーミング成長因子β、および血清増殖因子からなる群から選択される増殖因子をさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載の移植片構成物。
8. 前記腸粘膜下組織に前記内皮細胞を接種した後に、該腸粘膜下組織に前記予め選択した追加の細胞集団を接種すること特徴とする、請求項１の移植片構成物。
9. 前記腸粘膜下組織に前記予め選択した追加の細胞集団を接種した後に、該腸粘膜下組織に前記内皮細胞を接種すること特徴とする、請求項１の移植片構成物。
10. 前記腸粘膜下組織に、前記内皮細胞と前記予め選択した追加の細胞集団とを同時にまたはほぼ同時に接種することを特徴とする、請求項１に記載の移植片構成物。
11. 腸粘膜下組織移植片構成物の血管新生をin vivoで促進する方法であって、
    該腸粘膜下組織移植片構成物に、内皮細胞集団および少なくとも一つの予め選択した追加の外因性細胞集団をin vitroで接種する工程と、
    脊椎動物の修復が必要な部位に該移植片構成物を移植する工程と、
    を包含する方法。
12. 前記少なくとも一つの追加の細胞集団が、角化上皮細胞、非角化上皮細胞、および中胚葉由来細胞からなる群から選択される細胞集団を含むことを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
13. 前記少なくとも一つの追加の細胞集団が、平滑筋細胞集団を含むことを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
14. 前記少なくとも一つの追加の細胞集団が、平滑筋細胞前駆細胞集団を含むことを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
15. 前記腸粘膜下組織が、該腸組織の筋層および少なくとも粘膜層の管腔部分から剥離されることを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
16. 前記移植片構成物が、さらにヘパリナーゼを含むことを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
17. 前記移植片構成物が、血管内皮細胞由来増殖因子、血小板由来増殖因子、血小板由来増殖因子様分子、トランスフォーミング成長因子β、および血清増殖因子からなる群から選択される増殖因子をさらに含むことを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
18. 前記移植片構成物を前記脊椎動物に移植する前に、in vitroで血管または血管状構造を形成させるのに十分な時間にわたって前記腸粘膜下組織上で前記内皮細胞を培養する工程をさらに含むことを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
19. 前記腸粘膜下組織に前記内皮細胞を接種した後に、該腸粘膜下組織に前記予め選択した追加の細胞集団を接種することを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
20. 前記腸粘膜下組織に前記予め選択した追加の細胞集団を接種した後に、該腸粘膜下組織に前記内皮細胞を接種することを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
21. 前記腸粘膜下組織に、前記内皮細胞と前記予め選択した追加の細胞集団とを同時にまたはほぼ同時に接種することを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
22. 前記腸粘膜下組織に前記内皮細胞を接種した後に、該腸粘膜下組織に前記予め選択した追加の細胞集団を接種することを特徴とする、請求項１８に記載の方法。
23. 前記腸粘膜下組織に前記予め選択した追加の細胞集団を接種した後に、該腸粘膜下組織に前記内皮細胞を接種することを特徴とする、請求項１８に記載の方法。
24. 前記腸粘膜下組織に、前記内皮細胞と前記予め選択した追加の細胞集団とを同時に接種することを特徴とする請求項１８に記載の方法。
25. 前記移植片構成物を移植する前に、前記内皮細胞も前記予め選択した追加の細胞集団も拡大（expand）させないことを特徴とする、請求項１９、２０または２１のいずれか１項に記載の方法。
26. in vitroで血管も血管様構造も形成しないで、前記内皮細胞を拡大させる（expand）のに十分な時間にわたって、前記腸粘膜下組織上で該内皮細胞を培養する工程と、
    前記移植片構成物を前記脊椎動物に移植する前に、前記予め選択した追加の細胞集団を拡大させるのに十分な時間にわたって、該予め選択した追加の細胞集団を該腸粘膜下組織該上で培養する工程と、
    をさらに包含する、請求項１９、２０または２１のいずれか１項に記載の方法。
27. in vitroで血管も血管様構造も形成しないで、前記内皮細胞を拡大させる（expand）のに十分な時間にわたって、前記腸粘膜下組織で該内皮細胞を培養する工程をさらに包含する、請求項１９、２０または２１のいずれか１項に記載の方法。
28. 前記移植片構成物を移植する前に、前記予め選択した追加の細胞集団を拡大（expand）させないことを特徴とする、請求項２７に記載の方法。
29. 前記移植片構成物を移植する前に、前記予め選択した細胞集団を拡大させる（expand）のに十分な時間にわたって、前記腸粘膜下組織上で該予め選択した追加の細胞集団を培養する工程をさらに包含する、請求項１９、２０または２１のいずれか１項に記載の方法。
30. 前記移植片構成物を移植する前に、前記内皮細胞を拡大（expand）させないことを特徴とする、請求項２９に記載の方法。
31. 前記移植片構成物を移植する前に、前記予め選択した追加の細胞集団を拡大させる（expand）ことを特徴とする、請求項２２、２３または２４のいずれか１項に記載の方法。
32. 前記移植片構成物を移植する前に、前記予め選択した追加の細胞集団を拡大（expand）させないことを特徴とする、請求項２２、２３または２４のいずれか１項に記載の方法。
33. 病変組織または損傷組織の修復に使用するための腸粘膜下組織移植片構成物を調製する方法であって、該方法は、該腸粘膜下組織に、内皮細胞集団および少なくとも一つの予め選択した追加の外因性細胞集団をin vitroで接種する工程を包含する方法。
34. 前記移植片構成物を脊椎動物に移植する前に、in vitroで血管または血管様構造を形成させるのに十分な時間にわたって、前記内皮細胞を前記腸粘膜下組織上で培養する工程をさらに包含する、請求項３３に記載の方法。
35. 腸粘膜下組織移植片構成物の血管新生をin vivoで促進する方法であって、
    該腸粘膜下組織に、内皮細胞集団および少なくとも一つの予め選択した追加の外因性細胞集団をin vitroで接種する工程と、
    血管または血管様構造の形成を誘導するのに十分な時間にわたって、該内皮細胞を該腸粘膜下組織上でin vitroで培養する工程と、
    脊椎動物の修復が必要な部位に前記移植片構成物を移植する工程と、
    を包含する方法。
36. 前記少なくとも一つの追加の細胞集団が、角化上皮細胞、非角化上皮細胞、および中胚葉由来細胞からなる群から選択される細胞集団を含むことを特徴とする、請求項３５に記載の方法。
37. 前記少なくとも一つの追加の細胞集団が、平滑筋細胞集団を含むことを特徴とする、請求項３５に記載の方法。
38. 前記少なくとも一つの追加の細胞集団が、平滑筋細胞前駆細胞の集団を含むことを特徴とする、請求３５に記載の方法。
39. 前記腸粘膜下組織に前記内皮細胞を接種した後に、該腸粘膜下組織に前記予め選択した追加の細胞集団を接種することを特徴とする、請求項３５に記載の方法。
40. 前記腸粘膜下組織に前記予め選択した追加の細胞集団を接種した後に、該腸粘膜下組織に前記内皮細胞を接種することを特徴とする、請求項３５に記載の方法。
41. 前記腸粘膜下組織に、前記内皮細胞と前記予め選択した追加の細胞集団とを同時に接種することを特徴とする、請求項３５に記載の方法。
42. 病変組織または損傷組織の修復に使用するための血管新生した腸粘膜下組織移植片構成物であって、
    脊椎動物の腸粘膜下組織、追加の内皮細胞および少なくとも一つの予め選択した追加の外因性細胞集団を含み、
    in vitroで血管または血管様構造を形成させるのに十分な時間にわたって、該内皮細胞を該腸粘膜下組織上で培養したことを特徴とする、組織移植片構成物。
43. 病変組織または損傷組織の修復に使用するための血管様構造を有する腸粘膜下組織移植片構成物であって、
    脊椎動物の腸粘膜下組織、追加の内皮細胞、および少なくとも一つの予め選択した追加の外因性細胞集団を含み、
    該付加的な細胞集団が、該移植片構成物における該血管様構造の形成の開始を増強することを特徴とする、移植片構成物。
44. 病変組織または損傷組織の修復に使用するための血管様構造を有する腸粘膜下組織移植片構成物の調製方法であって、
    該腸粘膜下組織に、内皮細胞集団および少なくとも一つの予め選択した追加の外因性細胞集団をin vitroで接種する工程で、
    該付加的な細胞集団が、該移植片構成物における該血管様構造の形成の開始を増強することを特徴とする調製方法。
45. 病変組織または損傷組織の修復に使用するための組織移植片構成物であって、粘膜下組織、追加の内皮細胞、および少なくとも一つの予め選択した追加の外因性細胞集団を含み、該粘膜下組織が、筋層、および少なくとも該組織粘膜層の管腔部分から剥離されることを特徴とする、組織移植片構成物。
46. 病変組織または損傷組織の修復に使用するための、組織移植片構成物の調製方法であって、
    粘膜下組織に、内皮細胞集団および少なくとも一つの予め選択した追加の外因性細胞集団をin vitroで接種する工程を包含し、
    該粘膜下組織が、筋層、および少なくとも該組織粘膜層の管腔部分から剥離されることを特徴とする方法。
47. 病変組織または損傷組織の修復に使用するための、血管様構造を有する組織移植片構成物であって、
    粘膜下組織、追加の内皮細胞、および少なくとも一つの予め選択した追加の外因性細胞集団を含み、
    該付加的な細胞集団が該移植片構成物における該血管様構造の形成の開始を増強することを特徴とする、移植片構成物。
48. 病変組織または損傷組織の修復に使用するための、血管様構造を有する組織移植片構成物の調製方法であって、
    粘膜下組織に、内皮細胞集団および少なくとも一つの予め選択した追加の外因性細胞集団をin vitroで接種する工程を包含し、
    該付加的な細胞集団が該移植片構成物における該血管様構造の形成の開始を増強することを特徴とする、移植片構成物。
49. 患者の病変組織または損傷組織を治療する方法であって、該病変組織もしくは損傷組織を請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、４２、４３、４５、または４７のいずれか１項に記載の組織移植片構成物で修復する工程を包含する方法。
    
    

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