JP2005523233A - 細胞障害性免疫応答を誘導する方法およびその方法において有用な組み換えサル・アデノウイルス組成物 - Google Patents

Abstract

選ばれた分子に対するＣＤ８＋Ｔ応答を、組み換えサルアデノウイルスを介してその分子を送達することによって誘導する方法が提供される。また、組み換えサルアデノウイルスを被験者に送達することによってインターフェロン−αおよびインターフェロン−βを誘導する方法が提供される。本発明の方法および組成物は、なかんずく、ヒト免疫不全ウイルスおよびヒトパピローマウイルスによる感染症の予防および治療、およびがん療法のために特によく適合している。

Description

この研究は、米国国立保健研究所からの補助金、Ｐ３０ ＤＫ４７７５７−０８およびＰ０１ ＨＬ５９４０７−０２およびＮＩＡＩＤ補助金ＡＩ ４９７６６−０１によって資金供与された。米国政府は本発明の権利を有する。

ヒト血清型５のアデノウイルス組み換え体は、ウイルス、寄生虫または腫瘍細胞由来の種々の抗原のためのワクチンキャリヤーとして試験されてきた。その結果は、Ｅ１欠失アデノウイルス組み換え体がトランスジーン産物に対する免疫応答を惹起したことから、勇気づけるものであった。ヒト血清型５のアデノウイルス（Ａｄ５）は、ほとんどのヒトに彼らの生活の最初の１年内に感染する遍在性の普通の風邪ウイルスである。本発明は、共通するヒト血清型に対して先在する免疫が、ウイルスの同族の血清型に基づくアデノウイルス組み換え体ワクチンの効力を低下させることを見い出した。若干の場合には、この効力の低下は、ヒトのアデノウイルス組み換え体の比較的高い用量の送達によって克服することができる。しかしながら、これらの比較的高い用量は、他の望ましくない副作用を伴うことがある。

必要とされることは、現在の送達方法に伴う問題を回避する、選ばれた分子に対して免疫応答を誘導するために有用な組成物である。

発明の概要

本発明は、異種の分子に対する細胞障害性免疫応答を、組み換えサルアデノウイルスを介してその分子を宿主に送達することによって優先的に誘導する方法を提供する。本発明は、予期せぬことに、本発明したがって使用される組み換えサルアデノウイルスが、免疫原が同類のヒト５型ウイルスによって送達される場合よりも有意に強力なＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘導する方式で、免疫原を提示することを見い出した。その上、本発明者らは、組み換えチンパンジーアデノウイルスが、ヒトアデノウイルスよりも約５倍高いレベルのインターフェロン−αおよびインターフェロン−βを誘導することを見い出した。

かくして、１つの態様では、本発明は、被験者における異種の分子に対するＣＤ８＋Ｔ細胞応答を、その分子を担持する組み換えサルアデノウイルスを被験者に送達することによって優先的に誘導する方法を提供する。１つの望ましい実施態様では、組み換えサルアデノウイルスは、組み換えチンパンジーアデノウイルス株である。

その他の態様では、本発明は、被験者におけるインターフェロン−αおよび／またはインターフェロン−β応答を、組み換えサルアデノウイルスを被験者に送達することによって誘導する方法を提供する。

なおその他の態様では、本発明は、ヒト免疫不全ウイルスに対するＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘導するために有用な免疫原性組成物を提供する。本組成物は、ヒト免疫不全ウイルス−１の改変されたｇａｇタンパク質をコードしている最適化核酸配列を含有する組み換えサルアデノウイルスおよび生理学的に適合するキャリヤーを含有する。

なおその他の態様では、本発明は、本発明の免疫原性組成物を哺乳動物に投与することによって、哺乳動物においてヒト免疫不全ウイルスに対するＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘導する方法を提供する。

さらなる態様では、本発明は、ヒトパピローマウイルス由来の免疫原性タンパク質をコードしている組み換えサルアデノウイルスを哺乳動物に投与することによって、哺乳動物におけるヒトパピローマウイルスに対するＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘導する方法を提供する。

本発明のなお他の利点が、以下に示す本発明の詳細な記述より容易に明らかにされるであろう。

発明の詳細な記述

ヒトの株５のアデノウイルス組み換え体の免疫原性の、チンパンジーのアデノウイルス株６８のそれとの比較では、両株ともｇａｇの端を切り取られた配列を発現するが、ｃｈｉｍｐアデノウイルスが、より強力であることが示された。類似の結果は、緑色蛍光タンパク質および狂犬病ウイルス糖タンパク質を発現する組み換えチンパンジーアデノウイルスについても観察されている。研究は、トランスジーンが初期サイトメガロウイルスプロモーターによって制御される類似の発現カセットを担持する両Ａｄおよびｃｈｉｍｐ組み換え体を用いて実施されたので、組み換えチンパンジーアデノウイルスのこの高い効力は、より高いトランスジーン発現に関連するとは考えられない。また、両ｃｈｉｍｐおよびＡｄ５ウイルスが同じ細胞レセプターを利用するので、ここで示されたデータは、向性（ｔｒｏｐｉｓｍ）における差異を反映しているとは考えられないことを示している。むしろ、これらの結果は、本発明にしたがって使用された組み換えチンパンジーアデノウイルスが、予期せぬことに、ヒトアデノウイルスとは異なるアジュバント活性（ａｄｊｕｖａｎｔｉｃｉｔｙ）を有することを例証している。この良好なアジュバンシー（ａｄｊｕｖａｎｃｙ）は、ｃｈｉｍｐアデノウイルスによって誘導されるトランスジーンに特異的な免疫応答の大きさおよび動態に対して非常に深い影響を有する。

有利には、この高い効力は、ヒトアデノウイルスの送達システムに要求されるよりも低用量のチンパンジーアデノウイルスの使用を可能にする。その上、本発明者らは、組み換えチンパンジーアデノウイルスが、ヒトアデノウイルスよりも約５倍高いレベルのインターフェロン−αおよびインターフェロン−βを誘導することを見い出した。

さらに、組み換えチンパンジーアデノウイルスは、ヒトアデノウイルス５型ウイルスとほぼ同じ樹状細胞に及ぼす能力を有することが見い出された。サルアデノウイルスの予期せぬ効力と結び付けられるこの能力は、選ばれた抗原に対する細胞障害性免疫応答の誘導において、およびインターフェロン−αおよび／またはインターフェロン−βの増進された誘導が所望される症状の治療において有意な利点を提供する。

Ｉ．組み換えサルアデノウイルス
Ａ．起源
チンパンジーアデノウイルス配列の種々の起源は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション，１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ ２０１１０−２２０９、およびその他の起源から得ることができる。所望されるチンパンジー株Ｐａｎ５［ＡＴＣＣ ＶＲ−５９１］、Ｐａｎ６［ＡＴＣＣ ＶＲ−５９２］およびＰａｎ７［ＡＴＣＣ ＶＲ−５９３］。特に所望されるチンパンジーアデノウイルス株は、チンパンジーアデノウイルス株ＢｅｒｔｈａもしくはＣ１［ＡＴＣＣ受理番号ＶＲ−２０］およびチンパンジーアデノウイルス、株Ｐａｎ９もしくはＣＶ６８［ＡＴＣＣ ＶＲ−５９４］である。便利には、ウイルスＣＶ６８は、この明細書を通して「Ｃ６８」と呼ばれる。ウイルスは、感染したチンパンジーの糞［Ｃ１，Ｒｏｗｅ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，９１：２６０（１９５６）］または腸間膜のリンパ節［Ｃ６８，Ｂａｓｎｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ，Ａｍ．Ｊ．Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ，９４：１６６（１９７１）］から最初に単離された。これらの株の配列、およびアデノウイルス遺伝子Ｅ１ａ，Ｅ１ｂ，Ｅ２ａ，Ｅ２ｂ，Ｅ３，Ｅ４，Ｌ１，Ｌ２，Ｌ３，Ｌ４およびＬ５の位置は、米国特許第６，０８３，７１６号において提供されていて、これは引用によって本明細書に組み入れられている。場合によっては、非チンパンジーのサルアデノウイルス配列が、本発明の組み換えベクターを作成するために使用されてもよい。そのような非チンパンジーアデノウイルスは、ヒヒアデノウイルス株から得られたアデノウイルス［例えば、ＡＴＣＣ ＶＲ−２７５］、リーサスザルから単離されたアデノウイルス株［例えば、ＡＴＣＣ ＶＲ−２０９，ＡＴＣＣ ＶＲ−２７５，ＡＴＣＣ ＶＲ−３５３，ＡＴＣＣ ＶＲ−３５５］、およびアフリカミドリザルから単離されたアデノウイルス株［例えば、ＡＴＣＣ ＶＲ−５４１；ＡＴＣＣ ＶＲ−９４１；ＡＴＣＣ ＶＲ−９４２；ＡＴＣＣ ＶＲ−９４３］を含む。

本明細書に記述される組み換えチンパンジー（または他のサル）アデノウイルスは、１種、１種以上のサルアデノウイルス株由来のアデノウイルス配列を含有してもよい。これらの配列は、天然起源から得られても、組み換え法、合成法、または他の遺伝子工学もしくは化学的方法によって作成されてもよい。

Ｂ．組み換えサルアデノウイルス
本発明において有用な組み換えサルアデノウイルスは、異種の分子を担持する組み換えサルアデノウイルス配列および／またはサルアデノウイルスのキャプシドタンパク質からなるウイルス粒子である。これらのサルアデノウイルス、具体的にはチンパンジーＣ６８およびＣ１配列は、他のサルおよび非サルのアデノウイルスとのハイブリッドベクターの形成、およびシュードタイプの（ｐｓｅｕｄｏｔｙｐｅｄ）組み換えウイルス、すなわちサル起源の異種キャプシドタンパク質中にパックされている、異種分子を担持しているアデノウイルスベクターを有する組み換えウイルスの形成においても有用である。

１．組み換えサルアデノウイルス
最小でも、本発明において有用な組み換えサルアデノウイルスは、シス−要素が異種遺伝子に隣接している、複製およびビリオン包膜に必要なサルアデノウイルスのシス−要素を含有する。すなわち、ベクターは、複製の起点として機能するアデノウイルスのシス−作用の５’逆方向末端反復（ＩＴＲ）、本来の５’パッケージング／エンハンサードメイン（線状Ａｄゲノムのパッケージングに必要な配列およびＥ１プロモーターのためのエンハンサー要素を含有する）、異種分子、および５’ＩＴＲ配列を含有する。参照、例えば、引用によって組み入れられている米国特許第６，２０３，９７５号における「最小」ヒトＡｄベクターの作成のために記述された技術は、組み換えサルアデノウイルスのために容易に適応できる。

場合によっては、本発明において有用な組み換えサルアデノウイルスは、上記の最小サルアデノウイルス配列以上を含有する。これらの他のＡｄベクターは、１種以上の選ばれた遺伝子産物を発現するために、アデノウイルスの機能を破壊する改変を有することを特徴とする。語句「機能的欠失」は、これらの改変を記述するために本明細書では使用される。そのような「機能的欠失」は、典型的には、ウイルスの遺伝子の全部または一部分の欠失という形態をとる。しかしながら、そのような機能的欠失は、また、フレームシフト突然変異の形態をとってもよい。機能的欠失を達成するなお他の適当な操作は、当業者にとっては容易に明らかであろう。

特に望ましい実施態様では、サルアデノウイルスは、アデノウイルスＥ１ａおよびＥ１ｂを発現する機能の不在により複製欠陥的である。これらの組み換えサルアデノウイルスは、また、他の遺伝子における機能的欠失を担持していてもよい。

例えば、アデノウイルス遅発初期遺伝子Ｅ３が、組み換えウイルスの一部を形成するサルアデノウイルス配列から除去されてもよい。Ｅ３の機能は、組み換えアデノウイルス粒子の生産には必須ではない。かくして、本発明において有用な組み換えサルアデノウイルスをパッケージするために、この遺伝子産物の機能を置換することは不必要である。

また、Ｅ４ ＯＲＦ６機能を保持することは望ましいかも知れないが、Ｅ４遺伝子の機能的欠失を有する組み換えサルアデノウイルスが構築されてもよい。本発明のなおその他のベクターは、遅発初期遺伝子Ｅ２ａにおける欠失を含有する。また欠失は、サルアデノウイルスゲノムの後期遺伝子Ｌ１〜Ｌ５のいずれにおいて作成されてもよい。同様に、中期遺伝子ＩＸおよびＩＶａ_２における欠失も、若干の目的のためには有用である。他の欠失が、他の構造または非構造アデノウイルス遺伝子において作成されてもよい。先に議論した欠失は個々に使用されてもよい、すなわち、本発明における使用のためのアデノウイルス配列はＥ１のみの欠失を含有してもよい。あるいはまた、生物学的活性を破壊するのに効果的な全部の遺伝子もしくはその一部の欠失が、いかなる組み合わせにおいて使用されてもよい。例えば、１つの模範的なベクターでは、アデノウイルス配列は、Ｅ１とＥ４遺伝子の、またはＥ１、Ｅ２ａおよびＥ３遺伝子の、またはＥ１とＥ３遺伝子の、またはＥ１、Ｅ２ａおよびＥ４遺伝子の欠失、等々を、Ｅ３の欠失の有無にかかわらず、有してもよい。そのような欠失は、他の突然変異、例えば温度感受性変異と組み合わせて使用されて所望の結果を達成してもよい。

トランスジーンは、サルアデノウイルスのいかなる欠失領域中に挿入されてもよい。あるいはまた、トランスジーンは、所望ならば、現存する遺伝子領域中に挿入されてその領域の機能を破壊してもよい。

組み換えサルアデノウイルスが最小Ａｄ配列のみを含有するか、あるいはＥ１および／またはＥ３領域における機能的欠失のみを有する完全なＡｄゲノムを含有するか否かにかかわらず、組み換えウイルスはサルアデノウイルスのキャプシドを含有する。あるいはまた、他の実施態様では、組み換えシュードタイプのアデノウイルスが、本発明の方法において使用されてもよい。そのようなシュードタイプのアデノウイルスは、異種のサルアデノウイルス配列または非サルアデノウイルス配列を担持している核酸分子がパッケージされたサルアデノウイルスキャプシドタンパク質を利用する。本発明のこれらの組み換えサルアデノウイルスは、当業者には周知である方法を用いて生産することができる。

Ｃ．組み換えウイルス粒子の生産
適当な組み換えサルアデノウイルスを生産する方法は、例えば、米国特許第６，０８３，７１６号に記述されているような、当業者には周知である技術を利用する。被験者（例えば、ヒト、イヌ、ネコまたは他の哺乳動物）への異種分子の送達のための組み換えサルアデノウイルスの構築では、ベクターにおいて用いられるアデノウイルス核酸配列は種々のサル起源から得ることができる。

感染性組み換えウイルス粒子の生産のために必要なサルアデノウイルス配列を欠如するサル（例えば、チンパンジー）アデノウイルス配列を含有するベクターは、ヘルパーウイルスまたはベクターと一緒に使用することができる。ヘルパーウイルスは、サルアデノウイルスのウイルス感染力および増殖のために要求される必須遺伝子産物を提供する。サルアデノウイルス遺伝子の１つのみ、またはより多くの選ばれた欠失が、別の機能的ウイルスベクターにおいて作成される場合、欠失される遺伝子産物は、選ばれたパッケージング細胞においてウイルスを増殖させることによってウイルスベクター生産プロセスにおいて供給することができる。

かくして、これらの機能は、パッケージングのために必要とされる若干またはすべてのアデノウイルスの機能、例えば、ベクターにおいて欠如しているＥ１ａ，Ｅ１ｂ，Ｅ２ａ，Ｅ４ ＯＲＦ６，ＶＡ ＲＮＡのいずれかを提供する永続的に形質転換された細胞系において提供されてもよい。必要ならば、あるいはまた、必要とされるいかなる付加的なアデノウイルス機能が、これらの機能を含有する構築物のトランスフェクションまたは感染によってパッケージング細胞に提供されてもよい。場合によっては、アデノウイルス機能は、異種のサルアデノウイルスキャプシドタンパク質中へのミニ遺伝子を担持しているウイルスベクターのパッケージングを可能にするように選ばれてもよい。サル（例えばＣ６８）キャプシドタンパク質を利用する「シュードタイピング（ｐｓｅｕｄｏｔｙｐｉｎｇ）」の適当な方法は、ヒトアデノウイルスのシュードタイピングに関する当該技術分野において既知である方法に基づいて容易に理解できる。参照、例えば、米国特許第６，２０３，９７５号。

アデノウイルスの選ばれたＤＮＡ配列、およびトランスジーンおよび他のベクターの、種々の介在プラスミドおよびシャトルベクター中への集合、ならびに組み換えウイルス粒子を生産するためのプラスミドおよびベクターの使用は、慣用の技術を用いてすべて達成される。そのような技術は、テキスト［Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）］に記述されているようなｃＤＮＡの慣用のクローニング技術、アデノウイルスゲノムの重複オリゴヌクレオチド配列の使用、ポリメラーゼ連鎖反応、および所望のヌクレオチド配列を提供するすべての適当な方法を含む。標準のトランスフェクションおよびコ・トランスフェクション技術、例えば、ＣａＰＯ_４沈殿技術が用いられる。使用される他の慣用の方法は、ウイルスゲノムの相同組み換え、寒天重層におけるウイルスのプラーキング、シグナル生成を測定する方法などを含む。

例えば、所望のトランスジーンを含有するシャトルベクターの構築および集合に続いて、シャトルベクターは、パッケージングのための宿主細胞中にイン・ビトロでトランスフェクションされる。宿主細胞は、アデノウイルス機能を失っているいずれかのものを有しているか、またはそれを提供される。相同組み換えがヘルパーとベクター配列の間で起き、ベクターにおいてアデノウイルス−トランスジーン配列が複製され、そしてビリオンキャプシド中にパッケージされるのを可能にして、組み換えアデノウイルス粒子をもたらす。

有利には、本発明者らは、ヒトアデノウイルスＥ１タンパク質が、ＥＩ欠失のサルアデノウイルスをトランス相補（ｔｒａｎｓｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）して、サルアデノウイルス粒子へのそのパッケージングを可能にする。しかしながら、ヒトＡｄ Ｅ１と、欠失したサルＡｄ Ｅ１配列に隣接する配列との間の低度の相同性のために、サルＡｄ Ｅ１が相同的に組み換えられて複製能力のあるサルアデノウイルスを生産するという最小の危険性が存在する。

そうして生産される組み換えサルアデノウイルス粒子は、本発明の方法における使用のために当業者には既知のすべての種々の方法によって単離され、そして精製することができる。

ＩＩ．宿主に送達するための異種分子
Ａ．免疫原
宿主細胞に送達するためのサルアデノウイルスに担持された異種分子は、限定されるものではないが、ポリペプチド、タンパク質、酵素、炭水化物、化学部分、またはオリゴヌクレオチド、ＲＮＡ、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドを含んでもよい核酸分子、を含むいかなる所望の物質であってもよい。１つの望ましい実施態様では、サルアデノウイルスによって運ばれる分子はトランスジーンである。トランスジーンは、アデノウイルス配列にとって異種である核酸配列を含んでなる核酸分子であって、これは、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、酵素、またはその他の興味ある生産物、および宿主細胞においてコードされた生産物の転写および／または翻訳を管理する調節配列をコードし、そして宿主細胞または被験者においてコードされた生産物の発現を可能にする。トランスジーンの組成はサルアデノウイルスの意図される用途に依存する。

例えば、１つのトランスジーンのタイプは、発現に際して検出可能なシグナルを生産するレポーターもしくはマーカー配列を含有する。しかしながら、特に望ましいものは、抗体、もっとも望ましくは細胞媒介の免疫応答が、それに対して誘導される遺伝子産物および他の分子である。

これらの免疫原性遺伝子産物および分子は、限定されるものではないが、ヒトまたは非ヒト脊椎動物に感染するウイルス、細菌、真菌もしくは寄生微生物を含む、広範な病原性微生物、あるいはがん細胞もしくは腫瘍細胞に由来するものであってもよい。免疫原は、タンパク質由来のペプチドもしくはポリペプチドを含んでもよい。ある場合には、１種以上の免疫原が組成物中に含有される。

これらの遺伝子産物および他の分子を含有する所望の免疫原性組成物は、限定されるものではないがウイルス、例えばヒト免疫不全ウイルス、サル免疫不全ウイルス、呼吸シンシチアルウイルス、パラインフルエンザウイルス１−３型、インフルエンザウイルス（例えば、インフルエンザＡおよびインフルエンザＢウイルス）、単純ヘルペスウイルス、ヒトサイトメガロウイルス、肝炎ウイルス（Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎およびＣ型肝炎ウイルス）、ヒトパピローマウイルス、ポリオウイルス、ロータウイルス、カリシウイルス類、はしかウイルス、ムンプスウイルス、風疹ウイルス、アデノウイルス、狂犬病ウイルス、イヌジステンパーウイルス、牛疫ウイルス、コロナウイルス、パルボウイルス、感染性鼻気管炎ウイルス、ネコ白血病ウイルス、ネコ感染性腹膜炎ウイルス、トリ感染性粘液嚢疾患ウイルス、ニューカッスル病、Ｍａｒｅｋ病ウイルス、ブタ呼吸および繁殖症候群ウイルス、ウマ関節炎ウイルスおよび種々の脳炎ウイルス、に起因する疾病の予防および／または治療に対向される組成物を含む。

なお他の免疫原は、限定されるものではないが細菌、例えばヘモフィルス・インフルエンゼ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）（両、類別可能および類別不可能）、ヘモフィルス・ソムナス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｓｏｍｎｕｓ）、モラキセラ・カタラーリス（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトコッカス・アガラクチエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、ストレプトコッカス・フェカリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）、ナイセリア・メニンギチヂス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ），ナイセリア・ゴノローエ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、クラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、クラミジア・ニューモニエ（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、クラミジア・シタチ（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｓｉｔｔａｃｉ）、ボルデテラ・ペルタッシス（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ），サルモネラ・チフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ）、サルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、サルモネラ・コレレスイス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓ）、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、ビブリオ・コレラエ（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）、コリネバクテリウム・ジフテリエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）、ミコバクテリウム・ツベルクロシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ），ミコバクテリウム・アビウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ）−ミコバクテリウム・イントラセルラレ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｒｉｕｍ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）複合体、プロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）、プロテウス・ブルガリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ）、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、クロストリジウム・テタニ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ）、レプトスピラ・インテロガンス（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ）、ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、パスツレラ・マルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、アクチノバチラス・プルロニューモニエ（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）およびマイコプラズマ・ガリセプチカム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ）に起因する疾病の予防および／または治療に対向される。

なお他の望ましい免疫原は、限定されるものではないが、真菌病原菌、例えばアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、ブラストマイセス（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、コクシヂオデス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｄｅｓ）、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）およびヒストプラズマ（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ）に起因する疾病の予防および／または治療に対向される免疫原である。

その上、他の望ましい免疫原は、限定されるものではないが寄生虫、例えばレイシュマニア・マヨール（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｍａｊｏｒ）、アスカリス（Ａｓｃａｒｉｓ）、トリキュリス（Ｔｒｉｃｈｕｒｉｓ）、ジアルヂア（Ｇｉａｒｄｉａ）、シストソマ（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ）、クリプトスポリジウム（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、トリコモナス（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ）、トキソプラズマ・ゴンジイ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ）およびニューモシスチス・カリニイ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｃａｒｉｎｉ）に起因する疾病の予防および／または治療に対向される免疫原である。

さらに、望ましい免疫原は、脊椎動物宿主において治療的または予防的な抗がん効果を誘起することに対向される免疫原、例えば、限定されるものではないが前立腺特異抗原、がん胎児性抗原、ＭＵＣ−１、Ｈｅｒ２、ＣＡ−１２５およびＭＡＧＥ−３を含む、限定されるものではないが、がん抗原または腫瘍に関連する抗原を利用する免疫原を含む。

以下に示される例は、狂犬病（糖タンパク質Ｇ）またはヒト免疫不全ウイルス−１（改変ｇａｇタンパク質）の免疫原性ペプチドが発現される、組み換えサルアデノウイルスベクターを利用する本発明の方法および組成物の利点を具体的に例証している。その他の望ましい実施態様は、ヒトパピローマウイルス由来の免疫原性ペプチドを担持するサルアデノウイルスを利用する。しかしながら、本発明はこれらの免疫原の起源に限定されるものではない。

Ｂ．調節要素
細胞および宿主において所望の遺伝子産物を得るために、転写、翻訳および／または発現を必要とするトランスジーンまたはその他の核酸配列の設計は、コードされた生産物の発現を促進するために、問題のコーディング配列に操作可能に結合される適当な配列を含んでもよい。「操作可能に結合される」配列は、問題の核酸配列を制御するために、問題の核酸配列に隣接している発現制御配列およびイントランスまたは離れて作用する発現制御配列の両方を含む。

発現制御配列は、適当な転写開始、終結、プロモーターおよびエンハンサー配列；有効なＲＮＡプロセッシングシグナル、例えばスプライシングおよびポリアデニル化シグナル；細胞質ｍＲＮＡを安定化する配列；翻訳効率を増進する配列（すなわち、Ｋｏｚａｋ共通配列）；タンパク質の安定性を増進する配列；および所望される場合、タンパク質の分泌を増進する配列を含む。大多数の発現制御配列−在来の、構成的、誘導しうる、そして／または組織に特異的な−は、当該技術分野において既知であり、そして所望される発現の形式に応じて、遺伝子の発現を作動させるために利用できる。真核生物細胞では、発現制御配列は、典型的には、プロモーター、エンハンサー、例えば免疫グロブリン遺伝子、ＳＶ４０、サイトメガロウイルスなど由来のもの、およびスプライスドナーとアクセプター部位を含有してもよいポリアデニル化配列を含む。ポリアデニル化（ポリＡ）配列は、一般に、トランスジーン配列の後、そして３’アデノウイルスＩＴＲ配列の前に挿入される。１つの実施態様では、ウシ成長ホルモンのポリＡが選択される。また、本発明のサルアデノウイルスは、望ましくは、プロモーター／エンハンサー配列とトランスジーンとの間に位置するイントロンを含有してもよい。また、１つの可能なイントロン配列はＳＶ−４０由来であり、そしてＳＶ−４０ Ｔイントロン配列として言及される。ベクターにおいて使用されてもよいその他の要素は、内部リボソームエントリー部位（ＩＲＥＳ）である。ＩＲＥＳ配列は、単一遺伝子転写から１つ以上のポリペプチドを生産するために使用される。ＩＲＥＳ配列は、１つ以上のポリペプチド鎖を含有するタンパク質を生産するために使用できる。これらおよび他の共通するベクター要素の選択は慣例であり、そして多くのそのような配列が利用可能である（参照、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ，およびそこに引用される文献、例えばページ３．１８−３．２６および１６．１７−１６．２７、Ａｕｓｕｂｅ ｅｔ ａｌ．，ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９）。

１つの実施態様では、高レベルの構成的発現が所望される。有用な構成プロモーターの例は、限定されるものではないが、レトロウイルスのラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター（場合によってはＲＳＶエンハンサーを含有する）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（場合によってはＣＭＶエンハンサーを含有する）（参照、例えば、Ｒｏｓｈａｒｔ ｅｔ ａｌ，Ｃｅｌｌ，４１：５２１−５３０（１９８５））、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、β−アクチンプロモーター、ホスホグリセロキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、およびＥＦ１αプロモーター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含む。また外因性の供給化合物によって調節される誘導プロモーターも有用であり、そして亜鉛で誘導しうるヒツジメタロチオニン（ＭＴ）プロモーター、デキサメタソン（Ｄｅｘ）で誘導しうるマウス乳腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、Ｔ７ポリメラーゼプロモーター系（ＷＯ９８／１００８８）；エクジソン昆虫プロモーター（Ｎｏ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３：３３４６−３３５１（１９９６）、テトラサイクリン−抑制系（Ｇｏｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：５５４７−５５５１（１９９２）、テトラサイクリン−誘導系（Ｇｏｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６８：１７６６−１７６９（１９９５）、また参照Ｈａｒｖｅｙ ｅｔ ａｌ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，２：５１２−５１８（１９９８））、ＲＵ４８６−誘導系（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１５：２３９−２４３（１９９７）およびＷａｎｇ ｅｔ ａｌ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，４：４３２−４４１（１９９７））およびラパマイシン−誘導系（Ｍａｇａｒｉ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１００：２８６５−２８７２（１９９７））を含む。本文脈上有用である他の誘導しうるプロモーターの種類は、特定の生理的状態、例えば温度、急性局面（ａｃｕｔｅ ｐｈａｓｅ）、細胞の特定の分化状態によって、あるいは複製中の細胞のみにおいて調節されるプロモーターである。

その他の実施態様では、トランスジーンのための生来の（ｎａｔｉｖｅ）プロモーターが使用できる。生来のプロモーターは、トランスジーンの発現が生来の発現を模倣することが望まれる場合には好適であろう。生来のプロモーターは、トランスジーンの発現が、一時的もしくは発展的に、または組織に特異的な様式で、または特異的な転写刺激に応答して、調節されねばならない場合に使用されてもよい。さらなる実施態様では、他の生来の発現制御要素、例えばエンハンサー要素、ポリアデニル化部位もしくはＫｏｚａｋ共通配列がまた、生来の発現を模倣するために使用されてもよい。

トランスジーンのその他の実施態様は、組織特異的プロモーターに操作可能に連結されたトランスジーンを含む。例えば、骨格筋における発現が望まれる場合は、筋肉において活性のあるプロモーターが使用されるべきである。これらは、骨α−アクチン、ミオシン軽鎖２Ａ、ジストロフィン、骨クレアチンキナーゼをコードしている遺伝子由来のプロモーター、ならびに天然に存在するプロモーターよりも高い活性を有する合成筋肉プロモーター（参照、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１７：２４１−２４５（１９９９））を含む。組織特異的プロモーターの例は、なかんずく、肝臓（アルブミン、Ｍｉｙａｔａｋｅ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｖｉｏｌ．，７１：５１２４−３２（１９９７）；Ｂ型肝炎ウイルスのコアプロモーター、Ｓａｎｄｉｇ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ＴＨｅｒ．，３：１００２−９（１９９６）；α−フェトプロテイン（ＡＨＰ）、Ａｒｂｕｔｈｎｏｔ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ ＴＨｅｒ．，７：１５０３−１４（１９９６））、骨オステオカルシン（Ｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．，２４：１８５−９６（１９９７））；骨シアロプロテイン（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．，１１：６５４−６４（１９９６））、リンパ球（ＣＤ２，Ｈａｎｓａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６１：１０６３−８（１９９８）；免疫グロブリン重鎖；Ｔ細胞受容体α鎖）、ニューロンの、例えばニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）プロモーター（Ａｎｄｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．，１３：５０３−１５（１９９３））、神経フィラメント軽鎖遺伝子（Ｐｉｃｃｉｏｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：５６１１−５（１９９１））、およびニューロン特異的ｖｇｆ遺伝子（Ｐｉｃｃｉｏｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ，１５：３７３−８４（１９９５））について知られている。

もちろん、すべての発現制御配列が、本発明のすべてのトランスジーンを発現するために等しく良好に機能するわけではない。しかしながら、当業者は、本発明の範囲から逸脱することなくこれらの発現制御配列の中から選択することができる。適当なプロモーター／エンハンサー配列は、本明細書によって与えられるガイダンスを用いて当業者によって選択することができる。そのような選択は日常的出来事であり、分子もしくは構築物の限定にはならない。例えば、１種以上の発現制御配列を選択できる者は、問題のコーディング配列に操作可能に連結し、そしてトランスジーン、ミニ遺伝子、および本発明の伝達ウイルス中に挿入することができる。本明細書において教示されるサルアデノウイルスをパッケージする方法、または当該技術分野において教示されるような方法の１つにしたがって、イン・ビトロまたはイン・ビボで適当な細胞が感染される。細胞におけるミニ遺伝子のコピー数はサザンブロットまたは定量的ＰＣＲによって追跡されてもよい。ＲＮＡ発現レベルは、ノザンブロットまたは定量的ＲＴ−ＰＣＲによって追跡されてもよい。発現レベルはウエスタンブロット、免疫組織化学、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、または遺伝子産物の生物活性の試験によって追跡されてもよい。かくして、特定の発現制御配列がトランスジーンによってコードされる特異的な生産物に適しているか否かは、容易にアッセイすることができ、そしてもっとも適当な発現制御配列が選択される。あるいはまた、送達する分子が、例えば炭水化物、ポリペプチド、ペプチドなど、発現を要しない場合は、発現制御配列は、組み換えサルアデノウイルスまたは他の分子の一部を形成する必要はない。

ＩＩＩ．送達のためのウイルスの製剤化
組み換えサルアデノウイルスは、好ましくは生理学的に適合しうるキャリヤー中に懸濁されて、ヒトもしくは非ヒト哺乳動物患者に対して投与される。適当なキャリヤーは、伝達ウイルスが向けられる適応の観点において当業者によって容易に選ぶことができる。例えば、１つの適当なキャリヤーは、種々のバッファー溶液を用いて製剤化されてもよい生理食塩水（例えばリン酸バッファー生理食塩水）を含む。他の典型的なキャリヤーは、滅菌生理食塩水、ラクトース、スクロース、リン酸カルシウム、ゼラチン、デキストラン、寒天、ペクチン、ピーナッツ油、ゴマ油および水を含む。キャリヤーの選択は本発明の限定にはならない。

場合によっては、本発明の組成物は、組み換えサルアデノウイルスおよびキャリヤーに加えて、他の慣用の製薬学的成分、例えば保存剤、化学安定化剤、またはワクチン用途のためのアジュバントを含有してもよい。適当な典型的保存剤は、クロロブタノール、ソルビン酸カリウム、ソルビン酸、二酸化硫黄、没食子酸プロピル、パラベン、エチルバニリン、グリセリン、フェノールおよびパラクロロフェノールを含む。適当な化学安定化剤は、ゼラチンおよびアルブミンを含む。適当な典型的アジュバントは、なかんずく、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）、３−Ｏ−デシル化モノホスホリル脂質Ａ（Ｒｉｂｉ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．；Ｈａｍｉｌｔｏｎ，ＭＴ）、鉱油および水、水酸化アルミニウム、アンフィゲン（Ａｍｐｈｉｇｅｎ）、アビルジン（Ａｖｉｒｄｉｎｅ）、Ｌ１２１／スクワレン、ムラミルペプチド、およびサポニン、例えばＱｕｉｌ Ａを含む。

ＩＶ．治療および／または予防のための組み換えウイルスの送達
組み換え、複製欠陥アデノウイルスは、「製薬学的に有効な量」、すなわち、所望の細胞をトランスフェクションし、そして選ばれた遺伝子の十分な発現レベルを提供して、治療的またはワクチン接種的免疫応答、例えば若干の測定可能な予防的免疫レベルを提供するために、投与経路において有効である組み換えアデノウイルス量において投与される。

慣用の、そして製薬学的に許容しうる投与経路は、限定されるものではないが、鼻内、筋肉内、気管内、皮下、皮内、肛門、経口および他の粘膜および非経口投与経路を含む。ここで使用されるように、粘膜投与経路は、限定されるものではないが、吸入、経口、膣、および肛門経路を含む、粘膜組織に送達する投与経路を含む。投与経路は、所望ならば組み合わされてもよく、または免疫原もしくは疾患に応じて調節されてもよい。例えば、狂犬病の予防では、皮下、気管内、鼻内および経口経路が好適である。投与経路は、主として、治療される疾病の性質に依存する。

組み換え複製欠陥Ａｄウイルスの用量もしくは有効量は、主として、症状、選ばれた遺伝子、動物の年齢、体重および健康のような因子に依存し、したがって動物の中で変えてもよい。

ウイルスベクターの用量は、主として、治療されている症状、患者の年齢、体重および健康のような因子に依存し、したがって哺乳動物（ヒトを含む）患者の中で変えてもよい。有利には、本発明の組み換えサル（例えばチンパンジー）アデノウイルスの予期せぬ能力は、所望の免疫原性効果を誘導する（例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞の予定レベルの誘導）のに有効な量を提供するために、組み換えチンパンジーアデノウイルスの有意に低い量の使用を可能にする。例えば、組み換えサルアデノウイルスの有効用量は、チンパンジーアデノウイルスの１０^４ｐｆｕ〜１０^６ｐｆｕによって提供することができる。しかしながら、より高い用量も、例えば、選ばれた送達経路に応じて容易に選択することができる。例えば、ウイルスベクターは、約１ｘ１０^４プラーク形成単位（ｐｆｕ）〜約１ｘ１０^１３ｐｆｕウイルス／ｍｌ、そして８０ｋｇの成人体重に基づいて、約１ｘ１０^９〜約１ｘ１０^１１ｐｆｕ／ｍｌウイルスの範囲の濃度を含有するキャリヤー溶液の、約１００μｌ〜約１００ｍｌ、より好ましくは約１ｍｌ〜約１０ｍｌにわたる量において送達されてもよい。好適な用量は、２ｘ１０^１０ｐｆｕ／ｍｌにおける約５０ｍｌ生理食塩水であると評価される。好適な用量は、上記濃度において約１ｍｌ〜約１０ｍｌキャリヤー（例えば生理食塩水）である。選ばれた遺伝子の治療レベル、または免疫のレベルは、必要ならば追加免疫のための必要性を決定するためにモニターすることができる。血清において、ＣＤ８＋Ｔ細胞応答、または場合によっては抗体タイターの調査の後、場合によっては追加免疫化が所望されてもよい。場合によっては、組み換えサルアデノウイルスが、初回免疫−追加免疫（ｐｒｉｍｅ−ｂｏｏｓｔ）療法を用いて送達されてもよい。種々のそのような療法は、当該技術分野において記述されており、容易に選択することができる。１つの特定の望ましい方法は、引用によって組み入れられている、２０００年３月２日公表のＷＯ００／１１１４０に記述されている。

１つの望ましい実施態様では、本発明は、改変されたｇａｇタンパク質を含有する組み換えサルアデノウイルスを送達することによって、被験者においてヒト免疫不全ウイルスに対するＣＤ８＋Ｔ細胞応答を優先的に誘導する方法を提供する。下記の実施例において具体的に説明される改変ｇａｇタンパク質は、例えば、米国特許第５，９７２，５９６号に記述されているように最適化された。コーディングおよびタンパク質配列は、本明細書では配列番号：６および配列番号：７において再現されている。参照、また、Ｇ．Ｍｅｙｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｅｄｓ．Ｈｕｍａｎ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ ＡＩＤＳ．Ａ．ｃｏｍｐｉｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ａｎｄ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ（Ｌｏｓ Ａｌａｍｏｓ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｌｏｓ Ａｌａｍｏｓ，ＮＭ １９９１）。しかしながら、ｇａｇタンパク質、または本明細書に記述されるすべての他の選ばれた免疫原もしくは抗原の発現を改良するためのいかなる種々の方法も、当業者には既知であり、そして利用することができる、例えば、ＨＩＶ−１ｇａｇコドン配列のヒト化、ＨＩＶ−１ｇａｇスプライス部位の除去、ＨＩＶ−１ｇａｇコドン配列の上流へのさらなるリーダー配列の挿入、ＨＩＶ−１ｇａｇコドン配列の上流へのＫｏｚａｋ配列の挿入。最適化法の選択は、本発明の限定にはならない。あるいはまた、本発明の方法は、ＨＩＶエンベロープタンパク質またはＨＩＶ ｐｏｌを担持している組み換えサルアデノウイルスを被験者に送達するために使用されてもよい。１つの望ましいＨＩＶエンベロープタンパク質はＨＩＶ糖タンパク質１２０であり、これの配列はＧｅｎＢａｎｋから入手できる。しかしながら、他の適当なエンベロープタンパク質も利用することができる。ＨＩＶ−１ｐｏｌの配列は既知であり、種々の改変ｐｏｌ配列も知られている。参照、例えば、米国特許第５，９７２，５９６号およびＲ．Ｓｃｈｅｉｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｏｌ．，７１（７）：４８９２−４９０３（Ｊｕｌｙ １９９７）。

その他の望ましい実施態様では、本発明は、腫瘍に関連するタンパク質を含有する組み換えサルアデノウイルスを被験者に送達することによって、選ばれた悪性疾患に特異的な腫瘍関連タンパク質に対するＣＤ８＋Ｔ細胞応答を優先的に誘導する方法を提供する。そのようなタンパク質は細胞のがん遺伝子、例えば変異ｒａｓまたはｐ５３を含む。

その他の実施態様では、本発明は、腫瘍関連タンパク質を含有する組み換えサルアデノウイルスを被験者に送達することによって、選ばれた悪性疾患に特異的な腫瘍関連タンパク質に対するＣＤ８＋Ｔ細胞応答を優先的に誘導する方法を提供する。

なおその他の望ましい実施態様は、ヒトパピローマウイルスによる感染の予防のため、および関連する症状の治療と予防のために、そのウイルス由来のタンパク質を含有する組み換えサルアデノウイルスを送達することを伴う。例えば、このタンパク質は、Ｅ６、Ｅ７および／またはＬ１からなる群より選ばれてもよい（Ｓｅｅｄｏｒｆ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｏｌ．，１４５：１８１−１８５（１９８５））。症状がシンシチアルウイルス感染症である場合、タンパク質は糖（Ｇ）タンパク質および融合（Ｆ）タンパク質からなる群より選ばれ、これらの配列はＧｅｎｂａｎｋから入手できる。

次の実施例は、本発明を具体的に説明するために提供され、そしてその範囲を限定するものではない。当業者は、特定の試薬および条件が以下の実施例において概説されるけれども、本発明の精神および範囲によって包含されることを意味する改変が作成できることを理解できる。

チンパンジーアデノウイルスＣ６８に基づくＥ１欠失ベクターの創造
Ｃ６８の複製欠陥バージョンが遺伝子伝達における使用のために単離された。Ｅ１発現細胞系における相同組み換えによって、欠失したＥ１を有する組み換え体を創造するという古典的な戦略が遂行された。第１の段階は、ｍ．ｕ．０〜１．３を含有するプラスミドの創造と、それに続くＣＭＶプロモーター由来の増強された緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）および９−１６．７ｍ．ｕ．にわたるＣ６８配列を発現するミニ遺伝子の付加であった。この線状プラスミドは、ＳｓｐＩで消化したＣ６８プラスミド（ＳｓｐＩは相同組み換えのために３．６ｍ．ｕ．において切断して４６４４ｂｐを残す）とともにＥ１発現細胞系中にコ・トランスフェクションされた。実験は、先ず、これがトランス相補性のために十分であろうという希望をもってヒトＡｄ５由来のＥ１を含有する２９３細胞を用いて実施された。事実、所望の組み換え体を表すプラークが生成した。得られるベクターはＣ６８−ＣＭＶ−ＧＦＰと呼ばれた。

組み換え体を生成する戦略は、組み換え体の効率的かつ急速な単離を可能にするように改変された。第１に、最初のシャトルベクター中のアルカリホスファターゼＤＮＡが、ｌａｃＺからの原核生物プロモーターによって作動される原核生物ＧＦＰ遺伝子により置換された。これは、シャトルベクター中に所望の真核生物ＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩ転写ユニットを組み入れることを試みる場合に、細菌の形質転換株の有効なスクリーニングを可能にする。得られる形質転換株は、ＧＦＰの発現に関してスクリーニングすることができる；白色コロニーは組み換え体であるが、一方緑色コロニーは残留する親のプラスミドである。

緑色−白色選択は、ヒトＡｄ５組み換え体の単離のためにコ・トランスフェクションの生成物をスクリーニングするために使用された（Ａ．Ｒ．Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａ．，５：１１４８−１１５２（１９９８））；これがＣ６８系に適用された。最初のシャトルベクターは、９から２６ＭＵに伸長した３’配列を含むように修正された。このベクターは、ＸｂａＩにより制限された元のＣ６８−ＣＭＶ−ＧＦＰ単離物からのウイルスＤＮＡとともにコ・トランスフェクションされたが、ＸｂａＩはＭＵ１６．５で切断して相同組み換えのための９．５ｋｂのオーバーラップの余地を残す。得られるプラークが、所望の組み換え体を表す非蛍光単離物について位相差蛍光顕微鏡下でスクリーニングされた。これは、構造またはトランスジーン発現に基づく標準法に比較してスクリーニングを非常に単純にした。

Ａ．シャトルプラスミド
組み換えＣ６８ウイルスの創造のためのプラスミドシャトルベクターを構築するために、プラスミドｐＳＰ７２（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）が、ＢｇｌＩＩによる消化と、それに続くＫｌｅｎｏｗ酵素（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）による末端の平滑化（ｆｉｌｌｉｎｇ−ｉｎ）、そして合成１２ｂｐＰａｃＩリンカー（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）の連結により改変されてｐＳＰ７２−Ｐａｃを生成した。Ｃ６８ゲノムのマップユニット（ｍ．ｕ．もしくはＭＵ）０−１．３にわたる４５６ｂｐＰａｃＩ／ＳｎａＢ Ｉフラグメントが、Ｃ６８ゲノムのＢａｍＨＩ Ｅフラグメントを含有するｐＮＥＢ−ＢａｍＥプラスミドから単離され、そしてＰａｃＩとＥｃｏＲＶ処理されたｐＳＰ７２−Ｐａｃ中にクローン化されて、ｐＳＰ−Ｃ６８−ＭＵ ０−１．３を生成した。ＳＶ４０ポリＡシグナルを有するｌａｃＺを作動するサイトメガロウイルス初期プロモーターからなるミニ遺伝子カセットは、４．５ｋｂＥｃｏＲＩ／ＳａｌＩフラグメントとしてｐＣＭＶβ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）から分離され、そして同じセットの酵素により制限切断されたｐＳＰ−Ｃ６８−ＭＵ ０−１．３に連結されてｐＳＰ−Ｃ６８−ＭＵ ０−１．３−ＣＭＶＬａｃＺを得た。

Ｃ６８の９−１６．７ＭＵ領域の単離における最初の段階では、両ｐＧＥＭ−３Ｚ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＭＩ）とｐＢＳ−Ｃ６８−ＢａｍＦが、ＢａｍＨＩとＳｐｈＩ酵素により二重に消化された。次いで、ｐＢＳ−Ｃ６８−ＢａｍＦからの２９３ｂｐフラグメントがｐＧＥＭ−３Ｚ骨格に連結されてｐＧＥＭ−Ｃ６８−ＭＵ９−９．８を生成した。Ｃ６８ ＭＵ９−１６．７を含む２．４ｋｂフラグメントは、ｐＢＳ−Ｃ６８ ＢａｍＨＢクローンから、ＸｂａＩ消化、平滑化反応、続くＢａｍＨＩ処理後に得られ、そしてＢａｍＨＩ／ＳｍａＩ二重消化されたｐＧＥＭ−Ｃ６８−ＭＵ９−９．８中にクローン化されてｐＧＥＭ−Ｃ６８−ＭＵ９−１６．７を得た。Ｃ６８ ９−１６．７ｍ．ｕ．領域は、ｐＧＥＭ−Ｃ６８−ＭＵ９−１６．７から、ＥｃｏＲＩによる消化、Ｋｌｅｎｏｗ酵素（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）による末端の平滑化（ｆｉｌｌｉｎｇ−ｉｎ）、合成１２ｂｐＨｉｎｄＩＩＩＩリンカー（ＮＥＢ）の連結、次いでＨｉｎｄＩＩＩによる消化によって単離された。Ｃ６８ ＭＵ ９−１６．７にわたるこの２．７ｋｂフラグメントは、ｐＳＰ−Ｃ６８−ＭＵ ０−１．３−ＣＭＶｌａｃＺのＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローン化されて、最終シャトルプラスミドｐＣ６８−ＣＭＶ−ＬａｃＺを生成した。さらに、８２０ｂｐアルカリホスファターゼ（ＡＰ）ｃＤＮＡフラグメントが、ｐＡｄＣＭＶＡＬＰ（Ｋ．Ｊ．Ｆｉｓｈｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７０：５２０−５３２（１９９６））から単離され、そしてｐＣ６８−ＣＭＶ−ＬａｃＺのＮｏｔＩ部位においてｌａｃＺと交換されて、ｐＣ６８−ＣＭＶ−ＡＰを得た。

Ｂ．組み換えウイルスの構築
Ｅ１を欠失した組み換えＣ６８−ＣＭＶＥＧＦＰベクターを創造するために、ｐＣ６８−ＣＭＶ−ＥＧＦＰシャトルプラスミドが、先ず、強化緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）遺伝子を用いて、ｐＣ６８−ＣＭＶ−ＬａｃＺにおいてｌａｃＺトランスジーンを置換することによって構築された。置換クローニング工程は次のように実施された。付加するＮｏｔＩ制限部位が、ＢａｍＨＩ消化、平滑化反応、そして８ｂｐ合成ＮｏｔＩリンカー（ＮＥＢ）の連結によって、ｐＥＧＦＰ−１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）中のＥＧＦＰコーディング配列の５’末端中に導入された。両構築物のＮｏｔＩ制限後、ＥＧＦＰ配列が改変ｐＥＧＦＰ−１から単離され、そしてｐＣ６８−ＣＭＶ−ｌａｃＺ中のｌａｃＺを置換するために使用された。ｐＣ６８−ＣＭＶＥＧＦＰ構築物（３μｇ）が、既に記述されているように（Ｇ．Ｇａｏ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７０：８９３４−８９４３（１９９６））、相同組み換えのために２９３細胞中にＳｓｐＩ消化されたＣ６８ゲノムＤＮＡ（１μｇ）とともにコ・トランスフェクションされた。蛍光顕微鏡によって可視化される緑色プラークが２回のプラーク精製、拡大およびＣｓＣｌ勾配沈降（Ｇ．Ｇａｏ，ｅｔ ａｌ，前出）による精製において単離された。

組み換えＣ６８ベクターの構築のために緑色／白色選択工程（Ａ．Ｒ．Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ＴＨｅｒａ．，５：１１４８−１１５２（１９９８））を適用する試みにおいて、９−３６ＭＵにわたる７．２ｋｂフラグメントが、ＡｇｅＩおよびＢｓｉｗＩ制限エンドヌクレアーゼによる処理によってｐＢＳＣ６８−ＢａｍＢプラスミドから単離され、そしてｐＣ６８−ＣＭＶ−ＡＰシャトルプラスミドのＡｓｐ７１８とＡｇｅＩ部位にクローン化されて、ｐＣ６８ＣＭＶ−ＡＰ−ＭＵ３６と呼ばれる新しいプラスミドが得られた。さらなる改変は、Ｅｃｏ４７ＩＩＩとＮｒｕＩ消化によってｐＣ６８ＣＭＶ−ＡＰ−ＭＵ３６から２６−３６ｍ．ｕ．を除去するために実施された。ｐＣ６８ＣＭＶ−ＡＰ−ＭＵ２６と呼ばれる新しいシャトルプラスミドは、相同組み換えのためのより短い領域（すなわち、１６．７−２６ＭＵ）をミニ遺伝子に対して３’に有する。組み換えＣ６８ベクターを作成するためには、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）が問題の遺伝子と置換される。得られるｐＣ６８ＣＭＶ−Ｎｕｇｅｎｅ−ＭＵ２６構築物は、ＸｂａＩ（１６．５ＭＵ）制限されたＣ６８−ＣＭＶＧＦＰウイルスＤＮＡとともに２９３細胞中にコ・トランスフェクションされ、続いて上部寒天重層が実施された。組み換えウイルスプラーク（白色）が、ｐＣ６８ＣＭＶ−Ｎｕｇｅｎｅ構築物とＣ６８ウイルス骨格との間で共有される１６．７−２６ＭＵの領域における相同組み換えをとおして生成される；白色プラークを形成する組み換え体は、無切断の（ｕｎｃｕｔ）Ｃ６８−ＣＭＶＧＦＰウイルスの緑色プラークと選別される。

また、緑色／白色選択メカニズムは、ｐＣ６８シャトルプラスミド中への問題の遺伝子のクローニングの工程にも導入された。両ｐＣ６８ＣＭＶ−ＡＰ−ＭＵ３６およびｐＣ６８ＣＭＶ−ＡＰ−ＭＵ２６におけるＡＰ遺伝子は、ｐＧＦＰＭＵ３１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）から単離されるｌａｃＺプロモーターによって作動される原核生物ＧＦＰ遺伝子のカセットと置換された。かくして、細菌の形質転換株の白色コロニーは組み換えプラスミドを含有することができる。細菌コロニーに対するこの緑色／白色選択工程は、多数のミニプレップしたＤＮＡを生成および特徴決定する必要性を回避し、その結果さらに、組み換えＣ６８ベクターの創造における効率を増進した。

サルアデノウイルスワクチン構築物で感染されたＴＫ ⁻ 細胞における抗原の発現（Ｇａｇ分泌）
ＨＩＶ−１クレードＢのｇａｇ遺伝子の端を切り取った形態のヌクレオチド配列改変バージョンを担持する、チンパンジー株６８（Ａｄｃｈｉｍｐ６８）およびヒト株５（Ａｄｈｕ５）のアデノウイルス組み換え体が、前記のように構築された（実施例１およびＺ．Ｑ．Ｘｉａｎｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌ．２１９，２００（１９９６））。ｇａｇを含有するＨＩＶ−１の構造タンパク質の転写物は、遺伝的不安定要素（ｇｅｎｅｔｉｃ ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｅｌｅｍｅｎｔｓ）を含有するが、これは、核外移行と細胞質における有効な発現のためにｒｅｖタンパク質の存在を必要とする（Ｓ．Ｓｃｈｗａｒｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６，７１７６（１９９２）；Ｓ．Ｓｃｈｗａｒｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６，１５０−１５９（１９９２）；Ｇ．Ｎａｓｉｏｕｌａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８，２９８６（１９９４））。アデノウイルスは、核の転写に依存し、したがってＨＩＶ−１タンパク質の発現のためにｒｅｖを必要とする。Ｒｅｖ依存性を回避するために、遺伝的不安定要素が部位特異的突然変異によって除去されたｇａｇのコドン改変された配列（Ｒ．Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１，４８９２（１９９７）；Ｓ．Ｓｃｈｗａｒｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６，７１７６（１９９２）；Ｓ．Ｓｃｈｗａｒｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６，１５０（１９９２））が、アデノウイルスのベクター中に挿入された。導入された遺伝子は端を切り取られたｐ３７ｇａｇタンパク質（ｐ１７およびｐ２４領域）をコードしている。端を切り取られたｇａｇタンパク質は、ウイルス粒子を形成せず、そしてトランスフェクションされたヒト細胞の上澄液中に部分的に分泌される（Ｒ．Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１，４８９２（１９９７））。変異したｇａｇ構築物はワクチン接種実験において使用され、そしてマウスおよび霊長類において細胞性および体液性免疫応答の生成をもたらす（Ｊ．Ｔ．Ｑｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３，９１４５（１９９９））。

Ａｄｃｈｉｍｐ６８およびＡｄｈｕ５組み換え体は、ヒト株５のアデノウイルスのＥ１によりトランスフェクションされた２９３細胞において生成も増殖もされる。本発明者らは、この異種のＥ１が、Ｅ１欠失Ａｄｃｈｉｍｐ６８ウイルス組み換え体を相補させるのに適しており、よって、複製能力のある野生型ウイルスへの組み換えと復帰の危険を低下させることを見い出した。

ＴＫ⁻培養上澄液中のｇａｇタンパク質の存在は、ｇａｇに対するマウスモノクローナル抗体を用いるウエスタンブロッティングによって分析された。ＴＫ⁻細胞（１ｘ１０^６）が、Ａｄｈｕ５ｇａｇ３７もしくはＡｄｃｈｉｍｐ６８ｇａｇ３７ウイルスにより４８時間感染された（１細胞当たり１０ｐｆｕ）。さらなるＴＫ⁻細胞が、狂犬病ウイルスの糖タンパク質を発現するＡｄｈｕ５もしくはＡｄｃｈｉｍｐ６８構築物により感染された。培養上澄液中のタンパク質は、１２％変性ポリアクリルアミドゲル上で分離され、そしてエレクトロブロッティングによってＰＶＤＦメンブランに転移された。ブロットはＨＩＶ−１ｐ２４に対するモノクローナル抗体１８３−Ｈ１２−５Ｃを用いて染色された（Ｂ．Ｃｈｅｌｓｅｂｒｏ，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：６５４７（１９９２））。

このｇａｇの改変配列を担持する２種のアデノウイルス組み換えクローン（Ａｄｈｕ５ｇａｇ３７、Ａｄｃｈｉｍｐ６８ｇａｇ３７）は、ウエスタンブロット分析によって示されるように、匹敵するレベルにおけるトランスジーン産物を発現した。ＨＩＶ−１のｇａｇに対するモノクローナル抗体に結合した予期したサイズ（３７ｋＤａ）のタンパク質が、両方のアデノウイルスｇａｇ組み換え体の１０プラーク形成単位（ｐｆｕ）により感染されたＴＫ⁻細胞の上澄液中に検出された。狂犬病ウイルスの糖タンパク質を発現するＡｄｈｕ５もしくはＡｄｃｈｉｍｐ６８組み換え体（Ａｄｈｕ５ｒａｂ．ｇｐおよびＡｄｃｈｉｍｐ６８．ｇｐ）により感染された対照細胞は、このタンパク質を生産することができなかった。

サルアデノウイルスによる、哺乳動物におけるｇａｇに対するＣＤ８ ^＋ Ｔ細胞応答の誘導
以下に示す実験は、Ａｄｈｕ５ｇａｇ３７もしくはＡｄｃｈｉｍｐ６８ｇａｇ３７組み換え体のいずれかを筋肉内（ｉ．ｍ．）注射されたマウスの脾細胞が、サイトカイン、すなわちインターフェロン（ＩＦＮ）−γ遊離によって、ならびに標的細胞の溶解によって、ｇａｇタンパク質の免疫優性エピトープ（Ｂ．Ｄｏｅ ａｎｄ Ｃ．Ｍ．Ｗａｌｋｅｒ，ＡＩＤＳ １０，７９３（１９９６））に応答することを例証している。

Ａ．サイトカイン遊離アッセイ
Ｂａｌｂ／ｃマウス３頭の群が、Ａｄｃｈｉｍｐ６８ｇａｇ３７ウイルスの２ｘ１０^５、２ｘ１０^６もしくは２ｘ１０^７ｐｆｕ、Ａｄｈｕ５Ｌ１ウイルス（Ｈ．Ｃ．Ｊ．Ｅｒｔｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６３：２８８５（１９８９））の２ｘ１０^６ｐｆｕ、Ａｄｈｕ５ｇａｇ３７ウイルスの２ｘ１０^６ｐｆｕまたはＶＶｇａｇウイルスの２ｘ１０^７ｐｆｕによりｉ．ｍ．で免疫化された。脾細胞が、１０日後にｇａｇに対するＣＤ８^＋Ｔ細胞応答について試験された。サイトカイン（ＩＦＮ−γ）産生をアッセイするために、脾細胞（１ｘ１０^６／サンプル）が、９６穴丸底ミクロタイタープレートにおいて２％胎児ウシ血清（ＦＢＳ）および１０^−６Ｍ２−メルカプトエタノールを補足したＤｕｌｂｅｃｃｏｓ改変Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ）中で、Ｈ−２^ｄハプロタイプの免疫優性ＣＤ８^＋Ｔ細胞エピトープを担持するＡＭＱＭＬＫＥＴＩペプチド（配列番号：１）３μｇ／ｍｌおよびＢｒｅｆｅｌｄｉｎＡ（ＧｏｌｇｉＰｌｕｇ，ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）１μｇ／ｍｌとともに、３７℃で５時間培養された。細胞はＰＢＳで洗浄され、そしてマウスＣＤ８に対するＦＩＴＣ標識した抗体とともに４℃で３０分間インキュベートされた。細胞は洗浄され、そして４℃で２０分間、１Ｘ Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）中で透過性を高められた。細胞はＰｅｒｍ／Ｗａｓｈ（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）で３回洗浄され、そしてマウスＩＦＮ−γに対してＰＥ標識した抗体とともに４℃で３０分間同じバッファー中でインキュベートされた。洗浄後、細胞は２色のフローサイトメトリーによって検査され、そしてデータがＷｉｎｍＤｉソフトウエアによって解析された。右隅の数字は、ＩＦＮ−γについてポジティブに染色された全ＣＤ８^＋Ｔ細胞におけるＣＤ８^＋細胞のパーセントを示す。

１回の免疫化７〜１０日後に、全脾臓ＣＤ８^＋Ｔ細胞集団のかなり大きな割合が、ｇａｇペプチドに応答してＩＦＮ−γを産生した。さらなるイン・ビトロの拡大なしにアッセイされた一次脾細胞が、ｇａｇペプチドにより前処理されたＨ−２適合の標的細胞を溶解した。ｇａｇ特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞の活性は、Ａｄｃｈｉｍｐ６８構築物による免疫化のほうが優れており、これは全脾臓のＣＤ８^＋細胞集団の〜１６−１９％というｇａｇに対するＣＤ８^＋Ｔ細胞頻度を達成した。ウイルスの２ｘ１０^５ｐｆｕという低用量が、ほぼ１０％の頻度をなお惹起したＡｄｃｈｉｍｐ６８ｇａｇ３７ウイルスについて示されたように、応答は用量依存性であった。Ａｄｈｕ５ｇａｇ３７組み換え体は２ｘ１０^６ｐｆｕにおいて〜９％の最適頻度を誘導した。これらの頻度は、このワクチンの用量の増大においても有意には増進されなかった（データ未掲載）。全長ｇａｇを発現するワクシニアウイルス組み換え体（ＶＶｇａｇ、Ｓ．Ｃｈａｃａｒａｂａｒｔｉ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．５，３４０３（１９８５）ではｖＤＫ１と命名された）は、細胞内サイトカイン染色によって一層低い頻度のＣＤ８^＋Ｔ細胞を刺激した。

Ｂ．標的細胞の溶解
Ａにおいて記述されたようなアデノウイルス組み換え体の１回用量、または最初にｉ．ｍ．によって、続いて２週間後に腹腔内注射によって与えられたＶＶｇａｇ組み換え体の２用量を用いて１０日前に免疫化されたマウスからの脾細胞が、ｇａｇに対するペプチド（黒塗の四角）または狂犬病ウイルス核タンパク質の配列（Ｈ．Ｃ．Ｊ．Ｅｒｔｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６３：２８８５（１９８９））から線状化された対照ペプチド３１Ｄ（Ｘ）のいずれかを用いて室温で１６−２４時間処理された１ｘ１０^４Ｐ８１５細胞において、種々のエフェクター対標的細胞比で５時間の^５１Ｃｒ遊離アッセイで試験された。ＶＶｇａｇワクチンによる２回の免疫化は、検出しうるＴ細胞に媒介されるｇａｇ特異的一次細胞溶解を誘導するのに必要であった。

Ｃ．ｇａｇに対するＣＤ８ ^＋ Ｔ細胞の動態
Ｂａｌｂ／ｃマウス４頭の群が、Ａｄｈｕ５ｇａｇ３７もしくはＡｄｃｈｉｍｐ６８ｇａｇ３７ウイルスにより免疫化された。脾細胞が６−１２日後に回収され、前記のようにＩＦＮ−γ産生および標的細胞溶解について試験された。２種のアデノウイルス組み換え体によって惹起されるｇａｇに対するＣＤ８^＋Ｔ細胞応答の動態は異なっていた。Ａｄｈｕ５ｇａｇ３７ウイルスによって示されるｇａｇに対する応答は、Ａｄｃｈｉｍｐ６８ｇａｇ３７組み換え体に対するＣＤ８^＋Ｔ細胞応答よりも２−４日早くピークに達した。

サルアデノウイルスワクチンに及ぼすヒトアデノウイルスへの前曝露の効果
アデノウイルスの普通のヒト株５に対する前曝露の劇的効果を研究するために、マウスが、無関係の抗原（ヒトパピローマウイルスＬ１）を発現するＡｄｈｕ５組み換え体の１回用量で免疫化された。２週間後マウスは、Ａｄｈｕ５ｇａｇ３７もしくはＡｄｃｈｉｍｐ６８ｇａｇ３７ワクチンのいずれかによりワクチン接種された。

より具体的には、マウスはＡｄｈｕ５Ｌ１ワクチン１０^８ｐｆｕにより免疫化された。２週間後、Ａｄｈｕ５−免疫ならびに未免疫マウスが、Ａｄｈｕ５ｇａｇ３７もしくはＡｄｃｈｉｍｐ６８ｇａｇ３７組み換え体の２ｘ１０^６もしくは２ｘ１０^７ｐｆｕを注射された（１群当たり４−５頭）。Ａｄｈｕ５Ｌ１−免疫または未免疫のマウスのさらなる群が、Ａｄｈｕ５ｇａｇ３７もしくはＡｄｃｈｉｍｐ６８ｇａｇ３７ウイルスの２ｘ１０^６ｐｆｕにより免疫化された。９日後、マウスは、全長ｇａｇを発現するワクシニアウイルス組み換え体１０^６ｐｆｕを腹腔内に注射された。マウスはワクシニアウイルス注射後５日目に屠殺された。

Ａｄｈｕ５ウイルスで前免疫されたマウスは、Ａｄｈｕ５ｇａｇ３７ワクチンによるワクチン接種後にｇａｇに対して応答することができなかった。それらは、対照マウスにおいて見られた頻度と類似のＣＤ８^＋ｇａｇ特異的Ｔ細胞の頻度を示し、対応して、それらの脾細胞は標的細胞を発現するｇａｇを溶解することができなかった。これに対して、Ａｄｃｈｉｍｐ６８ｇａｇ３７構築物でワクチン接種されたＡｄｈｕ５−免疫マウスにおいては、ｇａｇへのＣＤ８^＋Ｔ細胞応答はわずかに低下されただけであった。ｇａｇに対するＣＤ８^＋Ｔ細胞の頻度は〜３０％だけ低下され、そして脾細胞の細胞溶解活性は、異なるエフェクター対標的細胞比を較べて〜５０％低下された。

かくして、両アデノウイルス組み換え体は、ｇａｇに対するＣＤ８^＋Ｔ細胞の頻度を誘導して、従来のワクチン、例えば裸のＤＮＡまたはポックスウイルス組み換え体（Ｓ．Ｓｃｈｗａｒｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６，１５０−１５９（１９９２））によって誘起される頻度を上回る。また。頻度は、慢性的に感染した個人において一般に見られる頻度（Ｄ．Ｈ．Ｂａｒｏｕｃｈ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７，４１９２（２０００）；Ｔ．Ｕ．Ｖｏｇｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４，４９６８（２０００）；Ｐ．Ａ．Ｇｏｅｐｆｅｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４，１０２４９（２０００）；Ｃ．Ｒ．Ｒｉｎａｌｄｏ Ｊｒ．ｅｔ ａｌ．ＡＩＤＳ Ｒｅｓ．＆ Ｈｕｍ．Ｒｅｔｒ．，１４：１４２３（１９９８））よりも高かった。これらの結果は、アデノウイルス組み換え体ワクチンの能力を強調している。

抗原に対するＣＤ８ ^＋ Ｔ細胞の初回免疫および追加免疫の効果
Ａｄｈｕ５ｇａｇ３７もしくはＡｄｃｈｉｍｐ６８ｇａｇ３７ウイルス２ｘ１０^７ｐｆｕで免疫された未免疫またはＡｄｈｕ５−免疫マウスの細胞からの一次脾細胞が、Ａｄｈｕ５ｇａｇ３７もしくはＡｄｃｈｉｍｐ６８ｇａｇ３７ウイルス２ｘ１０^６ｐｆｕでワクチン接種され、次いでＶＶｇａｇウイルス１０^６ｐｆｕで追加免疫された未免疫またはＡｄｈｕ５−免疫マウスからの脾細胞と比較された。脾細胞は５日後にＣＤ８および細胞内ＩＦＮ−γについて分析された。これらのアッセイは、５時間の^５１Ｃｒ遊離アッセイにおいて、ｇａｇペプチドまたは対照ペプチド３１Ｄを用いて処理されたＰ８１５細胞の溶解についてさらなるイン・ビトロ培養がなかった以外は、本質的に前記のように実施された。 異種のワクチン構築物、ＶＶｇａｇ組み換え体による初回もしくは追加免疫は、Ａｄｈｕ５組み換え体ワクチンによって提示されるｇａｇに対するＣＤ８^＋Ｔ細胞応答を回復することができなかった。Ａｄｈｕ５ｇａｇ３７およびＶＶｇａｇを用いて追加免疫されたＡｄｈｕ５ワクチン接種動物は、ｇａｇに対する応答でＩＦＮ−γを産生する脾臓ＣＤ８^＋Ｔ細胞の７．１％の多さを示したけれども、これらのＣＤ８^＋Ｔ細胞は、全体的にｇａｇを提示する標的細胞に対する細胞溶解活性を欠いていた。これらの結果は、ワクチンキャリヤーの抗原に対する前曝露が、アデノウイルス組み換え体のトランスジーン産物に対するＣＤ８^＋Ｔ細胞応答において定量的のみならずまた定性的な影響を有することを示している。Ａｄｃｈｉｍｐ６８ｇａｇ３７によりワクチン接種されたＡｄｈｕ５免疫マウスにおけるｇａｇに対するＣＤ８^＋Ｔ細胞応答は、未免疫マウスにおいて見られたものと類似のＶＶｇａｇ免疫化に及ぼすブースター効果を示した。

ｇａｇに対するＣＤ８^＋Ｔ細胞の頻度ならびに一次標的細胞の溶解は、異種のワクチンキャリヤー、例えばＶＶｇａｇ組み換え体による初回免疫（未掲載）または追加免疫によってさらに増進することはできなかった。アデノウイルス組み換え体によるｉ．ｍ．初回免疫、それに続く９日後のＶＶｇａｇによるｉ．ｐ．ブースター免疫化の後、初回免疫後５日に分析されたＣＤ８^＋ｇａｇ特異的Ｔ細胞は、全脾臓ＣＤ８^＋細胞集団の〜４０％を含有した。

Ａｄｈｕ５に対して先在する免疫はＡｄｈｕ５ｇａｇ３７ワクチンの有効性を極度に低下したが、Ａｄｃｈｉｍｐ６８ｇａｇ３７ウイルスに対するＣＤ８^＋Ｔ細胞応答をわずかしか損なわなかった。Ａｄｈｕ５ウイルスに対して免疫されたマウスが、狂犬病ウイルスに対するＡｄｈｕ５ワクチンによるワクチン接種に対して、低下したＢ細胞応答を発生したことは、既に報告された。ワクチンの用量を増加するか、または狂犬病ウイルスの同じ抗原を発現するＤＮＡワクチンを使用することは、Ａｄｈｕ５ウイルスに対する前曝露の減弱効果を容易に回避することができた（Ｚ．Ｑ．Ｘｉａｎｆ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２，６７１６（１９９９））。

これに対して、Ａｄｈｕ５組み換え体ワクチンによって提示されたｇａｇに対するＣＤ８^＋Ｔ細胞応答は、Ａｄｈｕ５免疫マウスにおいては失われ、そしてｇａｇに対する異種ワクチンによるさらなる免疫化によっても部分的に回復できるだけであった。このことは、Ｂ細胞の刺激に較べて、ＣＤ８^＋Ｔ細胞の誘導が、ウイルス中和抗体を循環することによる干渉に対してより感受性であることを示しているであろう。

狂犬病糖タンパク質を含有する組み換えアデノウイルスの生産
ヒト血清型２，４，５，７，１２およびチンパンジー血清型６８のアデノウイルスが、ヒト２９３細胞において増殖され、そして滴定された。狂犬病ウイルスのＥＲＡ血清型の糖タンパク質またはヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）−１６のＬ１タンパク質を発現するヒト血清型５に基づく組み換えアデノウイルスは、既に記述されている（Ｚ．Ｑ．Ｚｉａｎｇ，ｅｔ ａｌ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２１９：２２０−２２７（１９９６）；Ｄ．Ｗ．Ｋｏｗａｌｃｙｋ，ｅｔ ａｌ，（２０００）Ｖａｃｃｉｎｅ ｒｅｇｉｍｅｎ ｆｏｒ ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ｏｆ ｓｅｘｕａｌｌｙ ｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｄ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ １６．Ｖａｃｃｉｎｅ）。チンパンジー血清型６８のアデノウイルスに基づく発現系は実施例１において記述されているように開発された。

アデノウイルスはＥ１（ヒト血清型５由来）−トランスフェクション２９３細胞において増殖された（Ｆ．Ｌ．Ｇｒａｈａｍ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．３６：５９−７４（１９７７））。ウイルスは細胞の凍結融解によって収穫された。若干の実験では、ウイルスはＣｓＣｌ勾配精製によって精製された。他の実験では、３回の凍結融解をとおして壊死された感染細胞の澄明上澄液が使用された。ウイルスは２９３細胞において滴定されてプラーク形成単位（ｐｆｕ）を決定した。

狂犬病ウイルス糖タンパク質を発現するチンパンジー６８血清型のアデノウイルス組み換え体は、この実施例において詳述されるようにアデノウイルスヒト血清型５のＥ１をトランスフェクションした２９３細胞において生成された。ウイルスクローンは、最初に、狂犬病ウイルス糖タンパク質のコンホメーション依存性エピトープに対するモノクローナル抗体５０９−６を用いる間接的な免疫蛍光法によってスクリーニングされた。安定なアデノウイルスサブクローンの選択によって、感染ＴＫ⁻細胞におけるＡｄ．ｃｈｉｍｐ６８ｒａｂ．ｇｐウイルスによる全長の狂犬病ウイルス糖タンパク質の発現は、次の実施例において記述されるように免疫沈降によって確認された。

アデノウイルス組み換え体によるトランスジーン産物の発現
この実施例は、Ａｄｈｕ５ウイルスがＡｄｃｈｉｍｐ６８構築物に較べて顕著に高いレベルのＴＫ⁻細胞における狂犬病ウイルス糖タンパク質発現を達成したことを示す。このトランスジーンについての転写レベルはタンパク質発現に並行したが、このことは、差異が翻訳後の修飾における差異には無関係であったことを示す。ＴＫ⁻細胞はＣＡＲポジティブであり、したがってウイルス血清型による形質導入の割合は匹敵するにちがいない。

これらの実験における使用のために、哺乳類細胞、すなわち仔ハムスター腎臓（ＢＨＫ）−２１細胞、Ｅ１−トランスフェクション２９３細胞およびＴＫ⁻細胞が、グルタミン、ピルビン酸Ｎａ、非必須アミノ酸、ＨＥＰＥＳバッファー、抗生物質および１０％胎児ウシ血清（ＦＢＳ）を補足されたＤｕｌｂｅｃｃｏの改変Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ）において増殖された。

Ａ．免疫沈降
ＴＫ⁻細胞（１サンプル当たり１０^６）が、狂犬病ウイルス糖タンパク質を発現するアデノウイルス組み換え体または無関係のウイルス抗原を発現する対照構築物のいずれかの１細胞当たり５ｐｆｕにより感染された。４８時間後、細胞は無菌リン酸バッファー生理食塩水（ＰＢＳ）により２回洗浄され、次いで、^３５Ｓ−標識システインおよびメチオニン（Ｐｒｏｍｉｘ，ＮＥＮ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）２０μｌの添加前に、血清不含の培地において９０分間インキュベートされた。４時間のインキュベーション後、細胞はＰＢＳで洗浄され、次いでＲＩＰＡバッファーを含有するプロテアーゼ阻害剤１ｍｌを用いて２０分間処理された。細胞および細胞砕片がウエルから除去され、短時間回転され、そして１２，０００ｒｐｍで２分間遠心された。上澄液は、狂犬病ウイルス糖タンパク質に対する５０９−６モノクローナル抗体を含有する１５μｌ／ｍｌ腹水液とともに４℃で９０分間インキュベートされた。タンパク質ＳｅｐｈａｒｏｓｅＧがサンプル当たり７５μｌで添加され、そして弱い撹拌下で３０分間４℃でインキュベートされた。サンプルは遠心によって沈殿され、そしてＲＩＰＡバッファーによって４回洗浄された。ペレットが充填用バッファー８０μｌ中に再懸濁され、４分間沸騰された。次いで、サンプル（２０μｌ）が、分子量標準に較べて１２％ＳＤＳ−ポリアクリルアミド（ＰＡＧＥ）ゲル上で分離された。ゲルが濾紙上で乾燥され、これがＫｏｄａｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｆｉｌｍ（Ｘ−Ｏｍａｔ Ｂｌｕｅ ＸＢ−１）に４８時間露光された。

Ａｄｃｈｉｍｐ６８ｒａｂ．ｇｐ組み換え体は、５０９−６抗体に結合した予期したサイズのタンパク質を発現した。Ａｄｈｕ５ｒａｂ．ｇｐウイルスで感染されたＴＫ⁻細胞の沈降物は、無関係のトランスジーン産物を発現するアデノウイルス組み換え体による感染細胞からの溶解物には不在であった同一サイズのバンドを示した。狂犬病ウイルス糖タンパク質の発現は、Ａｄｈｕ５ｒａｂ．ｇｐ構築物による感染細胞において一層顕著であった。トランスジーン産物の発現における差異は、翻訳前の出来事、例えばウイルス取り込みにおける差異、転写割合または転写物の安定性を反映しているであろう。あるいはまた、別個の側鎖修飾のような翻訳または翻訳後の差異が、血清学的に検出可能なタンパク質における定量的差異をもたらすのかもしれない。

これらの２つの可能性をさらに識別するために、総ＲＮＡが、いずれかのアデノウイルス組み換え体により感染されたＴＫ⁻細胞から単離された。狂犬病ウイルス糖タンパク質およびハウスキーピング遺伝子に対する逆転写ｍＲＮＡが、Ｂ項で記述されるように実施されたリアルタイムＰＣＲによって増幅された。

Ｂ．リアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）
ＴＫ⁻細胞の集密モノレアーが、いずれかのアデノウイルス組み換え体１０ｐｆｕにより２並列のサンプルにおいて感染された。細胞が２４時間後に単離され、そしてＲＮＡが製造者の指示にしたがってＴＲＩ試薬（Ｍｏｌ．Ｒｅｓ．Ｃｅｎｔｅｒ，Ｃｉｎｃｉｎａｔｉ，ＯＨ）を用いて抽出された。ＲＮＡがＲＮアーゼ不含のＤＮアーゼにより処理され、フェノール抽出によって精製され、そしてサンプル当たりＲＮＡ５０ｎｇに調整された。ＲＮＡは逆転写され、そして狂犬病ウイルス糖タンパク質のためのプライマー（配列番号：２：５’ＡＡ ＧＣＡ ＴＴＴ ＣＣＧ ＣＣＣ ＡＡＣ ＡＣ；配列番号：３：３’ＧＧＴ ＴＡＧ ＴＧＧ ＡＧＣ ＡＧＴ ＡＧＧ ＴＡＧ Ａ）およびハウスキーピング遺伝子グルタルアルデヒド−３−リン酸デヒドロキナーゼ（ＧＡＰＤＨ）のためのプライマー（配列番号：４：５’ＧＧＴ ＧＡＡ ＧＧＴ ＣＧＧ ＴＧＴ ＧＡＡ ＣＧＧ ＡＴＴ Ｔ；配列番号：５：３’ＡＡＴ ＧＣＣ ＡＡＡ ＧＴＴ ＧＴＣ ＡＴＧ ＧＡＴ ＧＡＣ Ｃ）を用いて、Ｌｉｇｈｔ Ｃｙｃｌｅｒ−ＲＮＡ増幅キットＳＹＢＲグリーン（Ｒｏｃｈｅ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ；Ｚ．Ｈｅ，ｅｔ ａｌ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２７０：１４６−１６１７（２０００））により増幅された。

表１のデータは結果を提供する。データは２並列の測定値±ＳＤについての平均値を示す。

このデータによって示されるように、ハウスキーピング遺伝子のそれらに調節されたトランスジーン転写物は、血清学的に検出可能なタンパク質のそれに匹敵する定量的差異を示した。

この実施例において提供されなかったデータでは、緑色蛍光タンパク質およびヒト免疫不全ウイルス−１のコドン改変され端を切り取られたｇａｇタンパク質を発現する２つの他のＡｄｃｈｉｍｐ６８組み換え体が、ＴＫ⁻細胞において同等のタンパク質発現レベルを示した同じトランスジーン産物を発現するＡｄｈｕ５組み換え体に比較された。このことから、Ａｄｃｈｉｍｐ６８ウイルスによる狂犬病ウイルス糖タンパク質の低下した発現は、ウイルスの取り込みにおいてだけでなく、また両構築物が同じ制御要素によって調節される転写の割合においても差異を反映しないことが結論付けられた。

狂犬病ウイルス抗原を用いるマウスの免疫化
Ａｄｃｈｉｍｐ６８ｒａｂ．ｇｐウイルスに対する狂犬病ウイルス特異的抗体応答が、マウスの近交系および非近交系株において、Ａｄｈｕ５ｒａｂ．ｇｐウイルスのそれと比較された。マウスは、ｓ．ｃ．またはｉ．ｎ．のいずれかで与えられる組み換え体の連続希釈液を注射された。血清が１４日後に採取され、そしてＥＬＩＳＡおよびウイルス中和アッセイによって狂犬病ウイルス糖タンパク質に対する抗体について試験された。関連のないトランスジーン、すなわちＨＩＶ−１のｇａｇ（前記実施例に記述）を発現するアデノウイルス組み換え体が対照として使用された。これらの組み換え体は、いずれかのアッセイによって検出しうる狂犬病ウイルスへの抗体応答を誘導することができなかった。この研究のより詳細な記述および結果が以下に記される。

メスの６−８週齢Ｃ３Ｈ／ＨｅおよびＣ５７Ｂ１／６マウスはＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ Ｍａｉｎｅより購入された。非近交系ＩＣＲマウスはＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）より購入された。

マウスは、生理食塩水１００μｌにおいて皮下（ｓ．ｃ．）に、または５０μｌにおいて鼻内（ｉ．ｎ．）に与えられるアデノウイルスまたはアデノウイルス組み換え体の種々の用量を注射された。マウスは、１０平均致死用量（ＬＤ_５０）において脳内（ｉ．ｃ．）に与えられるＣＶＳ−１１株の狂犬病ウイルスによりチャレンジされた。Ｅｖｅｌｙｎ Ｒｏｋｉｔｎｉｋｉ−Ａｂｅｌｓｅｔｈ（ＥＲＡ）およびＣｈａｌｌｅｎｇｅ Ｖｉｒｕｓ Ｓｔａｎｄａｒｄ（ＣＶＳ）−１１株の狂犬病ウイルスは、ＢＨＫ−２１細胞において増殖された。ＥＲＡウイルスはスクロース勾配で精製され、ベータプロピオノラクトンによる処理によって不活性化され、そしてタンパク質濃度０．１ｍｇ／ｍｌに調整された。ＣＶＳ−１１ウイルスはＢＨＫ−２１細胞において、そして成熟したＩＣＲマウスによって滴定された（Ｚ．Ｑ．Ｘｉａｎｇ，Ｚ．Ｑ．＆ Ｈ．Ｃ．Ｅｒｔｌ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈ．４７：１０３−１６（１９９４））。チャレンジでは、マウスは、少なくとも２１日間２４−４８時間毎にチェックされた。マウスが終末狂犬病ウイルス脳炎の指示である完全な後脚麻痺を生じた場合には、マウスは安楽死された。

血清学的アッセイは、酵素結合イムノアドソルバントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、抗体のアイソタイププロフィルおよびウイルス中和アッセイを含む。

Ａ．ＥＬＩＳＡ
マウスは、免疫後種々の時間隔で眼窩後穿刺によって採血された。血清を調製し、そして不活性化狂犬病ウイルス０．１μｇ／ウエルで覆われたプレートにおいて狂犬病ウイルスに対する抗体について試験された。血清は、ヒト血清型５またはチンパンジー血清型６８のＧＦＰに対する精製Ｅ１欠失アデノウイルス組み換え体０．１μｇ／ウエルでコーティングされたプレートにおいてアデノウイルスに対する抗体について試験された。ＥＬＩＳＡは基本的には前述のように実施された（Ｚ．Ｑ．Ｘｉａｎｇ，ｅｔ ａｌ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２１９，２２０−２２７（１９９６））。プレートは一夜コーティングされた。次いで、それらが、３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するＰＢＳにより２４時間ブロックされた。洗浄後、ＰＢＳ−３％ＢＳＡ中に希釈された血清が６０分間添加された。洗浄後、アルカリホスファターゼ共役ヤギ抗マウスＩｇ（Ｃａｐｐｅｌ）の１：１００希釈液が氷上で１時間添加された。洗浄後、基質が室温で２０−３０分間添加された。最適濃度が４０５ｎｍにおいて読まれた。

Ｂ．抗体のアイソタイプ
狂犬病ウイルスに対する抗体のアイソタイプが、若干の小さい前記の改変（Ｘｉａｎｇ，Ｖｉｒｏｌ，１９９６、前出）を有するＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｓｕｂｉｓｏｔｙｐｉｎｇ（ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ）キットを用いて不活性化ＥＲＡウイルスでコーティングされたプレートにおいてＥＬＩＳＡによって決定された。

また、抗体のアイソタイププロフィルは、ｓ．ｃ．免疫化では異なっていたが、２種のアデノウイルスワクチンのｉ．ｎ．適用では類似していた。両組み換え体は、いずれの接種経路による送達でも、狂犬病ウイルスの抗原に対するＩｇＧ２ａ抗体を惹起した。

ｉ．ｎ．免疫化における両組み換え体およびｓ．ｃ．投与におけるＡｄｈｕ５ｒａｂ．ｇｐワクチンは、ｓ．ｃ．投与されたＡｄｃｈｉｍｐ６８ｒａｂ．ｇｐ構築物に対する応答を欠いた、Ｔｈ２ｈｅｌｐの指標である顕著なＩｇＧ１応答を誘導した。

Ｃ．中和抗体
血清はＣＶＳ−１１株の狂犬病ウイルスに対する中和抗体について試験されたが、この株は抗原としてＥＲＡ株に密接に関連している（Ｚ．Ｑ．Ｘｉａｎｇ，ｅｔ ａｌ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２１４，３９８−４０４（１９９６））。ＷＨＯ参考血清が比較のために使用された。タイターは国際単位として表された。

ｓ．ｃ．投与されたＡｄｃｈｉｍｐ６８ｒａｂ．ｇｐウイルスは、Ａｄｈｕ５ｒａｂ．ｇｐ構築物に較べてトランスジーン産物に対する弱い効力のＢ細胞応答を誘導した。試験された全時点において観察された抗体応答の大きさの差は、マウス株により異なり、近交系Ｃ３Ｈ／Ｈｅマウスほど非近交系ＩＣＲにおいて明瞭ではなかった。これに対して、ｉ．ｎ．免疫化された両ワクチンは、ＥＬＩＳＡおよびウイルス中和アッセイにより決定されたように匹敵する抗体のタイターを誘導した。

Ａｄｈｕ５ｒａｂ．ｇｐの注射における比較的均衡したＴｈ１／Ｔｈ２応答と較べて、ｓ．ｃ．免疫化におけるＡｄｃｈｉｍｐ６８ｒａｂ．ｇｐ組み換え体に対する明瞭なＴｈ１応答は、アジュバント活性における差異を主張する。気道への適用では、Ａｄｈｕ５ウイルスおよび多分Ａｄｃｈｉｍｐ６８ウイルスの両組み換え体の自然の感染経路が、大きさおよびそれらのアイソタイププロフィルにおいて匹敵するトランスジーン産物に対する抗体タイターを誘導した。このことは、向性および／またはアジュバント活性において仮定された差異が、組織依存的、すなわち皮下に較べて気道において欠如しているか、またはあまり明瞭ではないことを示唆する。

組み換えチンパンジーアデノウイルスによる細胞障害性Ｔ細胞の優先的誘導
狂犬病ウイルスに対するワクチンで誘導される防御はウイルス中和抗体と相関している（ＶＮＡｓ，Ｆ．Ｌ．Ｇｒａｈａｍ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．３６，５９−７４（１９７７））。かくして、狂犬病タンパク質による研究は、この免疫系の武器の刺激に焦点を絞った。すべての実験を通じて、マウスは、Ａｄｃｈｉｍｐ６８ｒａｂ．ｇｐウイルスおよび、並行して、前述のヒト血清型５に基づくＡｄｒａｂ．ｇｐウイルスにより免疫化された。この適用において、この組み換え体はＡｄｈｕ５ｒａｂ．ｇｐウイルスを指す。

両アデノウイルス組み換え体は狂犬病ウイルスによるチャレンジに対して防御を誘導した。ｓ．ｃ．投与されたいずれかのアデノウイルス組み換え体５ｘ１０^６ｐｆｕで免疫化されたＣ３Ｈ／Ｈｅマウスは、ＣＶＳ株の狂犬病ウイルスの１０平均致死用量（ＬＤ_５０）で３週間後にチャレンジされた場合には発病しなかった。この狂犬病ウイルス株は、抗原としてＥＲＡ株に密接に関連しているが、齧歯類では一層毒性が強い。５ｘ１０^５ｐｆｕという比較的低いワクチン用量において、Ａｄｈｕ５ｒａｂ．ｇｐウイルスは完全な防御をなお与えるが、一方、低いパーセントのＡｄｃｈｉｍｐ６８ｒａｂ．ｇｐで免疫化されたマウスは感染に屈服した。ワクチン用量のさらなる減少は、Ａｄｃｈｉｍｐ６８ｒａｂ．ｇｐワクチンの効力の喪失をもたらした。ｉ．ｎ．免疫化では、５ｘ１０^５ｐｆｕで投与された場合、両ワクチンは完全な防御を提供した。より低い５ｘ１０^４ｐｆｕの用量では、Ａｄｈｕ５ｒａｂ．ｇｐワクチンでワクチン接種されたマウスの５０％が進行性の疾病を発生したが、一方Ａｄｃｈｉｍｐ６８ｒａｂ．ｇｐ組み換え体のこの用量で免疫化されたマウスは防御された。無関係の抗原を発現するいずれかの血清型のアデノウイルス組み換え体によるか、または狂犬病ウイルス糖タンパク質に対するアデノウイルス組み換え体のいずれかの５ｘ１０^３ｐｆｕにより免疫化された全マウスは、致命的な狂犬病脳炎を発症した。

狂犬病ウイルスに対する抗体応答に及ぼすヒトアデノウイルスの種々の血清型への先在する免疫の影響
ヒトアデノウイルスの普通の血清型（例えば、ヒト血清型２，４，５，７および１２）のいずれかに対する前曝露がＡｄｃｈｉｍｐ６８ｒａｂ．ｇｐワクチンに対する抗体応答を抑制するか否かを試験するために、Ｃ３Ｈ／Ｈｅマウスの群が、ヒト血清型２，４，５，７もしくは１２またはチンパンジー血清型６８（後者の血清型はＥ１を欠失されていた）の複製能力のあるアデノウイルス４ｘ１０^８ｐｆｕにより免疫化された。２週間後、マウスはいずれかＡｄｈｕ５ｒａｂ．ｇｐまたはＡｄｈｕ５ｒａｂ．ｇｐウイルスによりｓ．ｃ．にワクチン接種された。Ａｄｈｕ５ｒａｂ．ｇｐ組み換え体はマウス当たり２ｘ１０^５ｐｆｕの用量で使用され、ｓ．ｃ．投与の場合、そのような低用量ではＣ３Ｈ／Ｈｅマウスにおいて限界の抗体応答しか誘導しないＡｄｃｈｉｍｐ６８ｒａｂ．ｇｐ組み換え体は、マウス当たり２ｘ１０^７ｐｆｕで注射された。血清が２週間後に採取され、そしてＥＬＩＳＡによって狂犬病ウイルス糖タンパク質に対する抗体について試験された。Ａｄｈｕ５ｒａｂ．ｇｐに対する狂犬病ウイルス特異的応答は、Ａｄｃｈｉｍｐ６８ウイルスに対して惹起された応答よりも未免疫マウスにおいてはやや勝っていた。Ａｄｈｕ５ｒａｂ．ｇｐウイルスに対する応答は、Ａｄｈｕ５前免疫マウスにおいては完全に抑制された。また、ヒト血清型４，２，７および１２のアデノウイルスに対するマウスの前免疫では、若干の低下が見られた。Ａｄｃｈｉｍｐ６８ウイルスに対して前曝露されたマウスでは、応答は影響されなかった。Ａｄｃｈｉｍｐ６８ｒａｂ．ｇｐウイルスに対する応答は、同類のウイルスに対して前免疫であったマウスでは強く抑制された。ヒト血清型２のアデノウイルスに以前に遭遇したマウスは、Ａｄｃｈｉｍｐ６８ウイルスによって提示される狂犬病ウイルス抗原に対して抗体応答のやや低下を示した。ヒトアデノウイルスの他の血清型のいずれかを接種されたマウスは、ワクチン接種前に未免疫であったマウスにおけるタイターに較べて量において同等かまたは増加されたＡｄｃｈｉｍｐ６８ｒａｂ．ｇｐウイルスにおける狂犬病への抗体タイターを生じた。特に、Ａｄｈｕ５ウイルスに対するマウスの前免疫は、Ａｄｃｈｉｍｐ６８ｒａｂ．ｇｐ構築物によるワクチン接種においてより高い抗体タイターを生じたが、これは、トランスジーン産物に対するＢ細胞応答を促進した交差反応性Ｔヘルパー細胞の存在を反映しているのであろう。

等しいワクチン用量において、Ａｄｃｈｉｍｐ６８ｒａｂ．ｇｐワクチンが、Ａｄｈｕ５ウイルスに対するマウスの前免疫においてＡｄｈｕ５ｒａｂ．ｇｐウイルスに比較して、より優れた抗体タイターを誘導するか否かをさらに決定するために、ワクチン滴定実験が実施された。Ｃ３Ｈ／Ｈｅマウスの群が、ＨＰＶ−１６のＬ１抗原に対するＥ１欠失アデノウイルス組み換え体４ｘ１０^８ｐｆｕによりｓ．ｃ．で免疫化された。２週間後、マウスは、種々の用量でｓ．ｃ．投与されるＡｄｈｕ５ｒａｂ．ｇｐまたはＡｄｈｕ５ｒａｂ．ｇｐウイルスのいずれかによりワクチン接種された。マウスは２週間後に採血され、狂犬病ウイルスに対する血清抗体タイターが、ＥＬＩＳＡ（未掲載）およびウイルス中和アッセイによって決定された。いずれのアッセイも、Ａｄｈｕ５免疫マウスではＡｄｃｈｉｍｐ６８ｒａｂ．ｇｐ構築物に対する抗体応答について有意な低下を示さなかった。同類のウイルスに対するマウス前免疫においてＡｄｈｕ５構築物によって示された狂犬病ウイルスに対する抗体タイターの大きい低下は、ワクチン用量に依存した。より低用量のワクチンに対する抗体応答は、より高用量に対する応答よりも一層影響された。ＶＮＡタイターはＥＬＩＳＡタイターよりも実質的に多く低下された。もっとも高いワクチン用量に対するＶＮＡのタイターは、Ａｄｈｕ５ウイルスに対するマウスの前免疫において半減されたが、一方、２つのより低いワクチン用量では、タイターは２０倍以上低下された。試験されたいかなる用量でも、Ａｄｃｈｉｍｐ６８ｒａｂ．ｇｐ組み換え体は、Ａｄｈｕ５ｒａｂ．ｇｐワクチンの同用量によって達成されるタイターに較べて、Ａｄｈｕ５前免疫マウスでは狂犬病に対するより高いＶＮＡタイターを誘導した。Ａｄｈｕ５ワクチンの効力に及ぼすＡｄｈｕ５に対する先在免疫の有害な効果は、防御実験においてさらに例証された。Ａｄｈｕ５ｒａｂ．ｇｐもしくはＡｄｃｈｉｍｐ６８ｒａｂ．ｇｐウイルスの２ｘ１０^５ｐｆｕにより免疫化された未免疫マウスは、ＣＶＳ−１１ウイルスによるチャレンジに対して完全に防御された。Ａｄｈｕ５ｒａｂ．ｇｐワクチンのこの用量により免疫化されたＡｄｈｕ５前免疫マウスの多数（６５％）は狂犬病ウイルスの感染に屈服したが、同用量のＡｄｃｈｉｍｐ６８ｒａｂ．ｇｐウイルスによりワクチン接種されたものは防御されたままだった。Ａｄｈｕ５ｒａｂ．ｇｐウイルスの用量をマウス当たり２ｘ１０^６ｐｆｕへの増大は、ワクチンの効力を回復した。

Ａｄｃｈｉｍｐ６８組み換え体によって発現されたトランスジーン産物に対する抗体応答は、ヒト血清型５の対応する組み換え体に対する応答を抑制する普通のヒトアデノウイルス血清型に対する先在免疫によって影響されなかった。複製能力のあるウイルスによる前免疫では、Ａｄｈｕ５ｒａｂ．ｇｐワクチンに対する免疫応答は、Ａｄｈｕ５前免疫マウスにおいて失われ、そしてアデノウイルスの他のヒト血清型、例えば２および４に対するマウスの前免疫において低下した。Ａｄｃｈｉｍｐ６８組み換え体に対する応答は、同類のウイルスに対するマウスの前免疫では、予期されたように抑制された。このことは、Ａｄｃｈｉｍｐ６８ウイルスがヒトの集団では循環せず、そして普通のヒト血清型は、Ａｄｃｈｉｍｐ６８ウイルスによる中和エピトープを共有しないので臨床的な懸念にはならない。

複製能のあるウイルスにより以前に感染されたマウスにおけるほど衝撃は重大ではなかったけれども、複製欠陥Ａｄｈｕ５ウイルスに対する前曝露は、また、Ａｄｈｕ５組み換え体によって提示される狂犬病ウイルス糖タンパク質への抗体応答を低下した。複製欠陥Ａｄｈｕ５ウイルスに対する前免疫マウスからの血清は、Ａｄｈｕ５ｒａｂ．ｇｐワクチンによる免疫化において狂犬病ウイルスに対して、低下しているが容易に検出しうる抗体を生じた。Ａｄｈｕ５ｒａｂ．ｇｐ構築物の用量の増大は、先在免疫の衝撃を部分的に回避することができた。狂犬病ウイルスに対するワクチンに誘導される防御はＶＮＡを要求するが、これは、特に低用量において使用される場合、Ａｄｈｕ５ワクチンによって前免疫マウスにおいて有効であるように誘導されなかった。Ａｄｈｕ５前免疫マウスでは、Ａｄｃｈｉｍｐ６８ｒａｂ．ｇｐ構築物に対するＶＮＡ応答は、かくして、Ａｄｈｕ５ワクチンの応答について試験された全用量において、ｓ．ｃ．免疫化においてこのワクチンのやや低い能力を補償する以上に一層優れていた。

かくして、Ａｄｃｈｉｍｐ６８組み換え体は、ヒトにおける使用のためにワクチンキャリヤーとして魅力的な代替物を提供する。ここに示されるように、それらは、非侵入投与経路、例えば上気道を通して２ｘ１０^５ｐｆｕという低用量において適用された場合でさえ有効である。ｉ．ｎ．適用による粘膜免疫化は、注射されるワクチンによる標的とされる中枢免疫系とは相互に連絡するけれども、それとは異なる普通の粘膜免疫系の応答の有利な誘導という利点を付加した。

チンパンジーＣ６８ウイルスの保存および複製
次の実施例１１〜１５はチンパンジーＣ６８のさらなる特徴を提供する。この情報が新規な組み換えチンパンジーアデノウイルス構築物の構築において容易に使用できることは当業者によって理解できる。

Ｃ６８ウイルス保存株はＡＴＣＣ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から得られ、そして１０％胎児ウシ血清（ＦＣＳ；ＳｉｇｍａまたはＨｙｃｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）および１％ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ）を補足したＤＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）において培養される２９３細胞（ＡＴＣＣ）において増殖された。２９３細胞の感染は、最初の２４時間２％ＦＣＳを補足したＤＭＥＭにおいて実施され、この後ＦＣＳが添加されて最終濃度を１０％にした。感染細胞は、１００％の細胞がウイルスに誘導された細胞変性効果（ＣＰＥ）を示した時に収穫され、回収され、そして遠心によって濃縮された。細胞ペレットは１０ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）中に再懸濁され、３回の凍結と融解によって溶解された。ウイルス調製物は、２回の塩化セシウム密度勾配液における超遠心段階後に得られ、そしてウイルスの保存液は、１０ｍＭＴｒｉｓ／１００ｍＭＮａＣｌ／５０％グリセロール中１ｘ１０^１２粒子／ｍｌに希釈され、−７０℃において保存された。

ウイルスゲノムＤＮＡのクローニングおよび配列決定
ゲノムＤＮＡは、標準的方法にしたがって精製ウイルス調製物から単離され、製造者の推奨にしたがって１６種の制限酵素のパネルにより消化された。指摘される以外は、全制限および修飾酵素は、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮから得られた。ゲノムＤＮＡはＢａｍＨＩ、ＰｓｔＩ、ＳａｌＩ、ＨｉｎｄＩＩＩもしくはＸｂａＩにより消化され、そしてフラグメントがプラスミド中にサブクローン化された（Ｋ．Ｌ．Ｂｅｒｋｎｅｒ ａｎｄ Ｐ．Ａ．Ｓｈａｒｐ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１１：６００３−２０（１９８３））。除タンパク後に、合成１０ｂｐＰａｃＩリンカー（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）が、ＰａｃＩおよびＢａｍＨＩ、またはＰｓｔＩにより二重消化された。

Ｃ６８から生成されたＰｓｔＩ、ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩクローンは図１、パートＣ，ＤおよびＥにそれぞれ図示される。塗られたボックスによって指示されるフラグメントはクローン化されなかったが、全ゲノムの配列は重複するクローンおよびウイルスＤＮＡを直接に（白いボックス）配列決定することにより決定された。クローン化フラグメントは表２に記述される。

チンパンジーアデノウイルス、Ｃ６８はＡＴＣＣから得られ、そしてヒト２９３細胞において増殖された。ウイルスゲノムＤＮＡは確立した操作（Ａ．Ｒ．Ｄａｖｉｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，５：１１４８−１１５２（１９９８））を用いて精製ビリオンから単離され、そして制限酵素のパネルを用いて消化された；データは従来の研究と一致した（データ未掲載）（Ｇ．Ｒ．Ｋｉｔｃｈｉｎｇｍａｎ，Ｇｅｎｅ，２０：２０５−２１０（１９８２）；Ｑ，Ｌｉ ａｎｄ Ｇ．Ｗａｄｅｌｌ，Ａｒｃｈ Ｖｉｒｏｌ．１０１：６５−７７（１９９８）；Ｒ．Ｗｉｇａｎｄ，ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ，３０：１−９（１９８９））。Ｃ６８の全ゲノムにわたる制限フラグメントがプラスミド中にサブクローン化された。Ｃ６８ゲノムの図面は、図１Ａに示され、そしてプラスミドベクター中にクローン化されたＰｓｔＩ、ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩフラグメントは、図１Ｂ、１Ｃおよび１Ｄにそれぞれ白いボックスによって示される。クローン化フラグメント、フラグメントサイズおよびゲノムの位置がまた表２に列挙される。両プラスミドクローンおよびゲノムＤＮＡが配列決定のための鋳型として使用された。ゲノムは両方向に進むプライマーによって配列決定され、そして各塩基は約４反応の平均に含まれた。

Ｃ６８ゲノムは長さ３６５２１ｂｐである［参照、米国特許第６，０８３，７１６号］。ＧｅｎＢａｎｋ配列との予備比較は、ウイルスゲノムの全長に沿って他のヒトおよび動物アデノウイルスとの種々の程度の類似性を示した。従来記述されたアデノウイルスのゲノムユニットのすべてに相同性を有する領域、初期領域１−４および主要後期遺伝子が、Ｃ６８ゲノムにおいて見い出された（図１Ａ）。Ｃ６８と、完全に配列決定されたヒトアデノウイルス、Ａｄ２（ＮＣ００１４０５），Ａｄ５（ＮＣ００１４０５），Ａｄ１２（ＮＣ００１４６０），Ａｄ１７（ＮＣ００２０６７）およびＡｄ４０（ＮＣ０１４６４）との間のＤＮＡ相同性が、クローンを配列するために使用された。オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が決定され、そしてゲノムが他のヒトアデノウイルスに対する相同性に基づいて同定された。主要アデノウイルス初期および後期遺伝子のすべてがＣ６８において存在している。逆方向末端反復（ＩＴＲ＝ｓ）は長さ１３０ｂｐである。

Ｃ６８配列の解析
種々の種からの分離株を含む、ＧｅｎＢａｎｋより入手できるマストアデノウイルス属の各メンバーの完全ヌクレオチド配列がＣ６８に対する同一性についてスクリーニングされた。Ａｄ４ミニゲノムが、次のＧｅｎＢａｎｋ配列：左側ＩＴＲ（Ｊ０１９６４）；Ｅ１Ａ領域（Ｍ１４９１８）；ＤＮＡｐｏｌおよびｐＴＰ（Ｘ７４５０８，７４６７２）；ＶＡ ＲＮＡ−Ｉ，ＩＩ（Ｕ１０６８２）；５２，５５Ｋ（Ｕ５２５３５）；ｐＶＩＩ（Ｕ７０９２１）；ヘキソン（Ｘ８４６４６）；エンドプロテアーゼ（Ｍ１６６９２）；ＤＮＡ結合タンパク質（Ｍ１２４０７）；ファイバー（Ｘ７６５４７）；右側ＩＴＲ（Ｊ０１９６５）から組み立てられた。Ａｄ７混成ゲノムは、次の配列データ：Ｍｕ３−２１（Ｘ０３０００）；ＶＡ ＲＮＡ−Ｉ，ＩＩ，ｐＴＰ ＆ ５２，５５Ｋ（Ｕ５２５７４）；ペントン（ＡＤ００１６７５）；ｐＶＩ，ヘキソンおよびエンドプロテアーゼ（ＡＦ０６５０６５）；ＤＮＡ結合タンパク質（Ｋ０２５３０）；Ｅ３およびファイバー領域（ＡＦ１０４３８４）；右側ＩＴＲ（Ｖ０００３７）から創造された。

アミノ酸配列のアライメントは、Ｊａｌｖｉｅｗ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／〜ｍｉｃｈｅｌｅ／ｊａｖｉｅｗ／）により編集されたＣｌｕｓｔａｌ Ｘを用いて生成され、そしてＢｏｘｓｈａｄｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｈ．ｅｍｂｎｅｔ．ｏｒｇ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／ＢＯＸ ｆｏｒｍ．ｈｔｍｌ）を用いて解析された。公に利用できる全ヒトアデノウイルス血清型由来のヘキソンタンパク質配列が最初に、Ｃ６８に対してもっとも高い相同性を示すセットを同定するためにアライメントされた。

Ｃ６８ゲノム中のすべての意味のある読み枠のヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列が、既知のＤＮＡおよびタンパク質配列と比較された。Ｃ６８のヌクレオチド配列は、Ａｄ２，４，５，７，１２，１７および４０の配列と比較される。従来の制限解析（Ｋｉｔｃｈｉｎｇｍａｎ，前出；Ｌｉ ａｎｄ Ｗａｄｅｌｌ，前出）との一致において、Ｃ６８はヒトＡｄ４（サブグループＥ）にもっとも類似している。

Ｃ６８のＥ１Ａ領域は、ｎｔ４８０におけるＴＡＴＡボックスから１５２１におけるポリＡ付加部位まで伸びている。共通スプライスドナーおよびアクセプター部位は、ヒトＡｄの対応部分の類似位置に存在し、そして２８．２Ｋおよび２４．８Ｋタンパク質はサイズではヒトＡｄタンパク質に類似している。Ｃ６８の最小Ｅ１Ａタンパク質のＯＲＦは、他のアデノウイルスのためのほぼ６０アミノ酸に対する１０１残基をコードすると推定される。他のアデノウイルスが、しばしばＴＧＡ終止コドンを有するＣ６８の残基６０にはＴＴＡコドンが存在する。Ｃ６８ Ｅ１Ａ １００Ｒタンパク質の最初の６０残基は、Ａｄ４同族体とは８５％の同一性を有する。

Ｃ６８ゲノムは、４つのＥ１Ｂタンパク質、２０．５Ｋ，５４．７Ｋ，１０．１Ｋおよび１８．５ＫならびにｐＩＸについての遺伝子をコードしている。全５種のＣ６８にコードされるタンパク質は、他のＡｄＥ１ＢおよびｐＩＸタンパク質に対してサイズでは類似している。Ｅ１Ｂ ２１Ｋタンパク質のＡｄ４同族体は１４２アミノ酸のみを有し、ここでは、Ｃ６８は１８６残基を有し、そして他のヒトアデノウイルスは１６３−１７８残基を有する。Ｃ６８およびＡｄ４タンパク質は、最初の１３４ａａにわたって９５％の同一性を共有し、次いで類似末端およびＡｄ４タンパク質は、１４２アミノ酸において終結する。

Ｃ６８ゲノムは、Ｅ２Ａ ５５Ｋ ＤＮＡ結合タンパク質およびＩｖａ２成熟タンパク質の同族体、ならびにＥ２Ｂ末端タンパク質およびＤＮＡポリメラーゼをコードしている。すべてのＥ２領域タンパク質は、それらのヒトＡｄ対応部分に対してサイズでは類似しており、そしてＥ２Ｂタンパク質は特に良好に保存されている。Ｃ６８ Ｅ２Ｂ １２３．６Ｋ ＤＮＡポリメラーゼは１１２４残基であると推定され、一方、他のヒトアデノウイルスがより小さいポリメラーゼを有するけれどもＡｄ４は１１９３を有すると推定される。Ａｄ４ポリメラーゼの残基１−７１は、いずれか他のＡｄポリメラーゼに対する類似性を有さず、そしてこのタンパク質が内部のＡＴＧコドンにおいて実際に開始することは可能である。アミノ酸７２−１１９３からは、Ａｄ４およびＣ６８ポリメラーゼは９６％のアミノ酸同一性を有する。

今までに配列決定されたヒトアデノウイルスのＥ３領域は、かなりの配列およびコーディング容量の可変性を示す。Ａｄ４０は５個のＥ３領域遺伝子を有し、Ａｄ１２は６個を有し、Ｃ６８およびＡｄ５は７個を有し、Ａｄ３８は８個を有し、そしてＡｄ３ならびにＡｄ７（サブグループＢヒトアデノウイルス）は９個の推定Ｅ３領域遺伝子を有する。Ａｄ４ Ｅ３領域はまだ配列決定されていない。Ａｄ３５のＥ３領域に較べて、全７個のＥ３遺伝子同族体はＣ６８ゲノムにおいて同定された（Ｃ．Ｆ．Ｂａｓｌｅｒ ａｎｄ Ｍ．Ｓ．Ｈｏｒｗｉｔｚ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２１５：１６５−１７７（１９９６））。

Ｃ６８ Ｅ４領域は６個のＯＲＦを有し、そして各々はヒトＡｄ５，１２および４０ Ｅ４領域におけるタンパク質に相同である。Ｃ６８、Ａｄ１２およびＡｄ４０のＯＲＦ同族体は約１３０残基であるので、Ｅ４の命名法は混乱しつつあり、一方Ａｄ５では、比較的大きいＯＲＦ２タンパク質のアミノおよびカルボキシ末端に対して、それぞれ相同性を有する６４および６７残基のタンパク質をコードしている２つのＯＲＦが存在する。Ｅ４領域の第５ＯＲＦがヒトＡｄ５の広く研究されたＯＲＦ６タンパク質に対して相同であるので、ＯＲＦ５は、本発明者らの命名では省略された。

Ｃ６８ゲノムの主要な後期プロモーターおよびトリパータイトリーダー配列の位置が同定された。１５の主要後期タンパク質をコードする可能性を有するＯＲＦが配置された。Ｃ６８後期タンパク質のすべては、それらのヒトＡｄ対応部分にサイズでは類似している。チンパンジーおよびヒトＡｄの後期タンパク質間のアミノ酸同一性パーセントは、かなり変化する。Ｃ６８ファイバータンパク質は、Ａｄ４タンパク質と９０％のアミノ酸同一性を有するが、他のヒトＡｄファイバータンパク質に対してははるかに低い類似性を有すると推定される。ファイバーノブ（ｋｎｏｂ）におけるＣＡＲ結合部位はＣ６８において存在している。

ウイルス中和抗体アッセイ
Ｃ６８とヒトアデノウイルスの型特異的抗原の間で交差反応性があるか否かを決定するためにいくつかの研究が実施された。血清の中和抗体は次のように試験された。正常なヒト被験者（Ｎ＝５０）、アカゲザル（Ｎ＝５２）およびチンパンジー（Ｎ＝２０）からの血清のパネルが、指標細胞系として２９３細胞を用いるベクターに基づくＡｄ５およびＣ６８に対する中和抗体について評価された。個々のヒト、アカゲザルまたはチンパンジーから収集された血清が５６℃で３０分間不活性化された。各サンプルの連続希釈液（１０％ＦＣＳを含有するＤＭＥＭの１００μｌ中１：１０，１：２０，１：４０，１：８０，１：１６０，１：３２０）が、等量のＨ５．０１０ＣＭＶＥＧＦＰ（１０００ＰＦＵ／ウエル）またはＣ６８ＣＭＶＥＧＦＰウイルスに添加され、そして４℃で２時間インキュベートされた。混合液１００および５０μｌが９６穴平底プレート中の２ｘ１０ ２９３細胞上に移された。対照ウエルは等量のウイルス（血清無添加）で感染された。サンプルは、５％ＣＯ_２中３７℃で４８時間インキュベートされ、そして蛍光顕微鏡下で検査された。感染した対照に較べて緑色蛍光フォーカスの＞５０％の低下を示したサンプル希釈液が中和抗体についてポジティブとスコアされた。

予期されたように、正常なヒト被験者の約３５％が、アカゲザルおよびチンパンジーの血清において観察されるよりも一層多い、Ａｄ５に対する中和抗体、頻度を例証した。Ｃ６８に対する中和抗体は、チンパンジーの８０％、そして正常なヒト被験者またはアカゲザルのわずか２％において観察された。非標的種における中和抗体のタイターは一般に低かった。

Ｃ６８のヒトアデノウイルスベクターとの交差反応性をさらに評価するために、マウスは、Ａｄ２，４，５，７および１２、ならびにＣ６８の２ｘ１０^７プラーク形成単位（ｐｆｕ）により免疫化された。血清は２週間後に採取され、そしていずれかＡｄ５もしくはＣ６８ベクターを中和した抗体について試験された。Ａｄ５ベクターに対する中和抗体は、Ａｄ５により免疫化された動物においてのみ検出された。重要なことは、Ｃ６８ベクターに対する中和抗体を有する動物のみが、Ｃ６８ベクターにより免疫化された動物であった；Ａｄ４を含む、試験されたヒト血清型のどれも、イン・ビトロでＣ６８を中和するマウスにおける抗体を生成しなかった。

ヒトの試行におけるＣ６８ベクターの利用について重要なことは、ヒト集団における中和抗体の不在である。本研究者らの研究では、５０人のヒト被験者のスクリーニングは、チンパンジーの＞５０％において中和抗体を示した同じアッセイを用いて、何らの有意な中和抗体も検出することができなかった（＞１：１０）。さらにまた、Ａｄ４を含む、複数のヒトＡｄ血清型により免疫化されたマウスの血清は、Ｃ６８による感染を中和しなかった。

その他の研究では、１０〜２０頭のＩＣＲマウスの群が、皮下（ｓ．ｃ．）、鼻内（ｉ．ｎ．）もしくは経口的（ｐｅｒ ｏｓ）に投与されるＡｄｈｕ５ｒａｂ．ｇｐまたはＡｄＣ６８ｒａｂ．ｇｐワクチンの種々の用量によりワクチン接種された。マウスは２１日後に採血され、そして国際単位として表されるウイルス中和抗体（ＶＮＡ）タイターが決定された。マウスは、ワクチン接種４週後に、中枢神経系中に直接適用されるＣＶＳ−２４ウイルスの１０平均致死用量によりチャレンジされた。

これらのデータは、ＡｄＣ６８構築物が、予期せぬことに、鼻内の低用量においてヒト５型よりも良好な防御抗体応答を誘導することを例証している

ヘキソンタンパク質の構造解析
Ｃ６８とヒト血清型との間の中和抗体の不在は、型特異的エピトープを保持すると推定されるヘキソンの領域における構造上の差異を一層注意して評価させた。従来の研究は、これらのエピトープが、Ｃｒａｗｆｏｒｄ−Ｍｉｋｓｚａ ａｎｄ Ｓｃｈｎｕｒｒ（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ，７０：１８３６−１８４４（１９９６））によって決定されたヘキソンの７個の超可変領域内に位置することを示唆していた。Ｃ６８と数種のヒトアデノウイルス間のヘキソンタンパク質のアミノ酸配列の比較が図２において示される。事実、Ｃ６８は、これらの超可変配列のかなりの領域において実質的に類似していない。Ｃ６８のヘキソンの三次元構造のより詳細なモデリングが、独特な配列をマッピングするために実施された。Ｃ６８およびＡｄ４からのヘキソン構造のモデルが、Ａｄ２およびＡｄ５に関するヘキソンのＸ線結晶構造に基づいて生成された。

Ａｄ５ヘキソンのＸ線結晶構造（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ ｂａｎｋ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ ＩＲＵＸ）（Ｊ．Ｊ．Ｒｕｘ ａｎｄ Ｒ．Ｍ．Ｂｕｒｎｅｔｔ，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１：１８−３０（２０００））、およびＡｄ２に関するそれ（Ｆ．Ｋ．Ａｔｈａｐｐｉｌｌｙ，ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２４２：４３０−４５５（１９９４））が、さらに精査されて、現在のヘキソンモデルが得られた（Ｒｕｘ ａｎｄ Ｂｕｒｎｅｔｔ，どこか他に公表される）。同類のＣ６８とＡｄ４ヘキソンのモデルは、Ｓｗｉｓｓ−ＰｄｂＶｉｅｗｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｏｄｅｌｉｎｇ ｅｎｖｉｒｏｍｅｎｔ（Ｎ．Ｇｕｅｚ ａｎｄ Ｍ．Ｃ．Ｐｅｉｔｓｃｈ，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，１８：２７１４−２７２３（１９９７））を用いて最初に作成された。その自動操作が使用されて、Ｃ６８およびＡｄ４ヘキソンアミノ酸配列がＡｄ２およびＡｄ５ヘキソン結晶構造のそれに対してアライメントされた。配列のアライメントは、既知の分子構造上にモデル配列の筋道をガイドするために使用された。既知の構造において見られなかった残基の側鎖位置が側鎖プロトマーのライブラリーから選ばれた。これらの最初の分子モデルが、次に、マニュアルで調整されて、露出された可変領域にギャップを移動し、そして側鎖のパッキングを最適化することによって自動アライメントが改善された。Ａｄ２およびＡｄ５鋳型構造において観察されなかった外部のループセグメントの位置は、既知のループ構造のライブラリーから選ばれるか、またはマニュアルで適合されるかのいずれかであった。各モデルのコンホメーションは、分子メカニクスプログラムＣＨＡＲＭＭ（Ｂ．Ｒ．Ｂｒｏｏｋｓ，ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｃｈｅｍ．，４：１８７−２１７（１９８３））を用いるエネルギー最小化によってさらに精査された。次いで、これらのＣ６８およびＡｄ４ヘキソンモデルの構造がアライメントされ、そして新しい配列のアライメントが算出された。２つの構造的にアライメントされたヘキソン配列間の差異は、相同性モデルの画像を着色するために使用された。Ｓｗｉｓｓ−ＰｄｂＶｉｅｗｅｒプログラム内で作成された図式画像はエクスポートされ、Ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｃｅ ｏｆ Ｖｉｓｉｏｎ Ｒａｙ Ｔｒａｃｅｒプログラム（ＰＯＶ−Ｒａｙ２０００，Ｖｅｒｓｉｏｎ３．１ｇ）によって表された。

全体のＣ６８配列はＡｄ４ヘキソンの配列に非常に類似しているが、２つの配列間の差異は、主として、ＤＥ１およびＦＧ１ループ内に絞られ、そしてこれらは、すべて７つの超可変領域を含有する。それは、各々異なるサブユニット由来のＤＥ１、ＦＧ１およびＦＧ２であり、これらは三量体分子の頂点におけるタワー（ｔｏｗｅｒ）ドメインの形成に緊密に係わっている。ヘキソンタワーは、ビリオンの外部表面の大部分を形成し、そして抗体付着の部位である。ヘキソンの側面および基部はキャプシド内に一緒にパックされるので、これらの領域は抗体結合から遮蔽され、それらの配列は保存されている。これに対して、Ｃ６８およびＡｄ４の配列は、ヘキソンタワーにおいては全く異なっている。このことは、これらのウイルスのいずれかに対して惹起された抗体が交差反応しないことを直接に説明している。

この明細書において引用されるすべての出版物、および配列リストは、引用によって本明細書に組み入れられている。本発明は、特に好適な実施態様に関して記述されたが、本発明の精神から逸脱することなく改変が作成できることは理解されるであろう。そのような改変は、付随する特許請求の範囲内にはいることが意図される。

図１は、チンパンジーアデノウイルスＣ６８ゲノムの遺伝子構成を総括している。図１Ａでは、Ｃ６８チンパンジーアデノウイルスのゲノムが上部にボックスによって略図として表されている。逆方向末端反復は黒く塗られており、そして初期領域はグレーに塗られている。ボックス上の矢印頭部は初期遺伝子の発現方向を示す。ボックス下の線は１００マップユニットへのゲノムの分割を表す。線の下の矢印は５個の後期遺伝子領域および各領域にコードされているタンパク質を表す。ボックスまたは矢印下の数字は、各領域の始点（プロモーターまたは開始コドン）および終点（規定のポリＡシグナル）を示している。＊はＥ２Ａ後期プロモーターを表す。図１Ｂは、ＰｓｔＩクローンを図示し；図１Ｃは、ＢａｍＨＩクローンを図示している。図１Ｄは、ＨｉｎｄＩＩＩクローンを図示している。パート１Ｂ−１Ｄでは、白い領域は、フラグメントが表１に挙げられるようなプラスミド中にクローン化されたことを示し、一方、塗られた領域は、制限フラグメントがクローン化されなかったことを示している。各部分では、Ａが最大フラグメントであるとしたアルファベット順のフラグメント名、およびフラグメントサイズがボックスの上に列挙され、そしてフラグメント終点がボックス下に列挙された。 図２は、ヘキソンタンパク質の複数配列の整列を提供している。高度に類似するヒトアデノウイルスヘキソンの推定アミノ酸配列がＣＬＵＳＴＡＬ Ｘを用いてチンパンジーアデノウイルスと比較された。血清型およびサブグループは、左の余白に示され、その次に残基数が示される。数字は翻訳の開始点に対するアミノ酸位置を指す。アミノ酸は、Ｃ６８に関して、重要な配列の類似性（グレー）および同一性（黒）に色づけされた。ループドメインＤＥ１およびＦＧ１内の７つの超可変領域が下部にそって標識され、そして次に示す整列：ＨＶＲ１，１３７−１８８；ＨＶＲ２，１９４−２０４；ＨＶＲ３，２２２−２２９；ＨＶＲ４，２５８−２７１；ＨＶＲ５，２７８−２９４；ＨＶＲ６，３１６−３２７；およびＨＶＲ７，４３３−４６５におけるＡｄ２配列に対応する。示される配列のＧｅｎＢａｎｋ受理番号は、次のとおりである：ＡＡＤ０３６５７（Ａｄ４），Ｓ３７２１６（Ａｄ１６），Ｓ３９２９８（Ａｄ３），ＡＡＤ０３６６３（Ａｄ７），およびＮＰ０４０５２５（Ａｄ２）。

【配列表】

Claims (21)

1. 被験者において免疫原に対するＴ細胞応答を誘導するための薬物の製造における組み換えアデノウイルスの使用であって、
   該組み換えサルアデノウイルスが、皮下に送達された場合に免疫原に対するＣＤ８＋Ｔ細胞応答を優先的に誘導するすることを特徴とし、そして
   さらに、該組み換えアデノウイルスが、被験者において免疫原の発現を管理する調節配列の制御下に免疫原をコードしている核酸分子を含有することを特徴とする、使用。
2. 被験者において免疫原に対する抗体応答を誘導するための薬物の製造における組み換えアデノウイルスの使用であって、
   該組み換えサルアデノウイルスが、粘膜に送達された場合に低用量の免疫原に対する抗体応答を優先的に誘導するすることを特徴とし、そして
   さらに、該組み換えアデノウイルスが、被験者において免疫原の発現を管理する調節配列の制御下に免疫原をコードしている核酸分子を含有することを特徴とする、使用。
3. 被験者において免疫原に対するＣＤ８＋Ｔ細胞応答を優先的に誘導する方法であって、被験者において免疫原の発現を管理する調節配列の発現制御の制御下に免疫原をコードしている核酸分子を含有する組み換えサルアデノウイルスを被験者に送達する段階を含んでなる方法。
4. 該組み換えサルアデノウイルスが皮下に送達される、請求項３記載の方法。
5. 該組み換えサルアデノウイルスが低用量において送達される、請求項３または請求項４記載の方法。
6. 該組み換えサルアデノウイルスが、１０^４ｐｆｕ〜１０^６ｐｆｕである有効量において送達される、請求項３〜５のいずれかに記載の方法。
7. 該組み換えサルアデノウイルスが組み換えＣ６８チンパンジーアデノウイルスである、請求項３〜６のいずれかに記載の方法。
8. 免疫原が、ヒト免疫不全ウイルス−１、ヒトパピローマウイルスおよび狂犬病ウイルスからなる群より選ばれる病原性ウイルス由来のペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質からなる群より選ばれる、請求項３〜７のいずれかに記載の方法。
9. （ａ）ヒト免疫不全ウイルス−１の改変されたｇａｇタンパク質をコードしている最適化核酸配列を含有する組み換えサルアデノウイルス、および（ｂ）生理学的に適合するキャリヤーを含んでなる、ヒト免疫不全ウイルスに対する細胞障害性免疫応答を誘導するために有用な免疫原性組成物。
10. 請求項９の組成物を哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物においてヒト免疫不全ウイルスに対するＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘導する方法。
11. 哺乳動物においてヒト免疫不全ウイルスに対するＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘導するための薬物の製造における、請求項９記載の免疫原性組成物の使用。
12. ヒトパピローマウイルス由来の免疫原性タンパク質をコードしている組み換えサルアデノウイルスを哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物においてヒトパピローマウイルスに対するＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘導する方法。
13. 哺乳動物においてヒトパピローマウイルスに対するＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘導するための薬物の製造における、ヒトパピローマウイルス由来の免疫原性タンパク質をコードしている組み換えサルアデノウイルスの使用。
14. 哺乳動物において狂犬病ウイルスに対する中和抗体応答を誘導するための薬物の製造における、狂犬病ウイルス由来の免疫原性タンパク質をコードしている組み換えサルアデノウイルスの使用。
15. ヒト免疫不全ウイルス−１（ＨＩＶ−１）の抗原を含有する組み換えサル複製欠陥アデノウイルスを含んでなる、ヒト免疫不全ウイルスのためのワクチン。
16. 抗原が、ＨＩＶ−１のエンベロープ、ｐｏｌ、またはｇａｇ領域からなる群の中より選ばれる、請求項１５記載のワクチン。
17. 抗原が、遺伝子不安定要素（ｇｅｎｅｔｉｃ ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｅｌｅｍｅｎｔｓ）が除去された生来の（ｎａｔｉｖｅ）抗原を含む、請求項１６記載のワクチン。
18. 抗原が、配列番号：６の配列を含有するＨＩＶ−１ ｇａｇ ｃＤＮＡである、請求項１６記載のワクチン。
19. アデノウイルス組み換え体が、チンパンジー株６８由来の、チンパンジー由来のＥ１欠失アデノウイルスである、請求項１５記載のワクチン。
20. 狂犬病抗原の発現を管理する調節配列の制御下に狂犬病抗原をコードしている核酸配列を含有する組み換えサル複製欠陥アデノウイルスを含んでなる、狂犬病のためのワクチン。
21. 請求項１５のワクチンを哺乳動物に投与することを含む、ヒト免疫不全ウイルスに対してＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘導し、そして哺乳動物を保護するための方法。

Images