JP2005522698A - 高感度の免疫クロマトグラフィーアッセイ法 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2002年4月10日に出願された米国特許出願第10/120,774号の一部継続出願である2002年6月3日に出願された米国特許出願第10/162,138号の優先権を主張する、一部継続出願であり、その全体が参照として本明細書に組み入れられる。
流体試料(特に体液試料)に含まれる細胞および分析物の定量分析を行うことで、医師および患者にとって、診断および治療に関する極めて重要な情報が得られることは少なくない。定量的免疫アッセイ法では、抗原(Ag)抗体(Ab)反応の特異性を利用して、試料中のAgまたはAbの検出および定量を行う。固相免疫アッセイ法では、1種の試薬(例えばAgまたはAb)を固体表面に結合させることで、結合状態の試薬または分析物と、遊離状態の試薬または分析物の分離が容易になる。次に固相に、対象となるAgまたはAbに結合する分析物を含む試料を接触させる。結合の程度を定量することで、試料中の分析物濃度の尺度が得られる。しかし、測定可能なシグナルへと結合事象を変換することは、固相上での粒子の動きの制約条件などの複数の制限の影響を受け、これは、定量的免疫アッセイ法の特異性および応用可能性に影響する。
本発明は、関心対象の分析物および捕捉用試薬を特異的結合対の一部として用いる固相アッセイ法(例えばサンドイッチ免疫アッセイ法または阻害免疫アッセイ法)で、流体試料中の関心対象の分析物の量を測定する方法;ならびにこの方法で用いるキットに関する。
本発明は、アッセイ法、特に定量的免疫クロマトグラフィーアッセイ法で、分析物の量を定量的に測定する方法、およびこのキットに関する。
本発明の「サンドイッチ」アッセイ法では、固相装置を使用する。固相装置は、投入点、試料捕捉ゾーン、および対照捕捉ゾーンを有する膜ストリップを含む。固相装置は任意選択で、対照捕捉ゾーンの後に吸い取りパッドを、また投入点に隣接してもしくは投入点を覆って試料パッドを含んでもよい。膜ストリップは、以下の特徴を有する物質から作製することができる:膜の表面に沿った、また膜の内部を通過する、流体の毛管作用を可能にする十分な空隙率;被覆粒子(例えば上述の分析物結合粒子)または粒子と関心対象の分析物の複合体(例えば上述のように分析物結合粒子に接触)の毛管作用による輸送可能性(すなわち粒子または、粒子と関心対象の分析物の複合体を妨害してはならない);および(3)分析物を含む流体によって湿った状態になること(例えば、水性流体の場合は親水性、有機溶媒の場合は疎水性)。膜の疎水性は、水性流体を使用するために疎水性表面から親水性表面への変換について記載されている米国特許第4,340,482号、または米国特許第4,618,533号などに記載されている過程によって膜を親水性とするように変化させることができる。膜の物質の例には、セルロース、硝酸セルロース、酢酸セルロース、ガラス繊維、ナイロン、高分子電解質イオン交換膜、アクリル共重合体/ナイロン、およびポリエーテルスルホンなどが含まれる。好ましい態様では、膜ストリップは硝酸セルロース(例えばマイラー基材(Mylar backing)を有する硝酸セルロース膜)から作製される。
本発明の「競合」または「阻害」アッセイ法は、「サンドイッチ」アッセイ法と同様に、投入点、試料捕捉ゾーン、および対照捕捉ゾーンを含む、上述の膜ストリップを含む固相装置を用いる。膜ストリップは任意選択で、対照捕捉ゾーンの次にウィッキングパッドを、また投入点の前に試料パッドを含みうる。既に述べたように、「投入点」は、流体試料が投入される膜上の位置である。この態様は上述の試料採取装置も用いる。競合(阻害)アッセイ法用の試料採取装置は、(「サンドイッチ」アッセイ法に関して述べたように、分析物結合剤で被覆される代わりに)関心対象の分析物で、または関心対象の分析物の類似体で被覆される「分析物被覆粒子」の集団を含む。本明細書で用いる分析物の「類似体」は、上述した、分析物-結合剤と結合対を形成するという点で、分析物と類似の結合特性を有する化合物である。分析物、または分析物の類似体は、粒子表面を直接被覆することができるほか、粒子に間接的に結合させることができる。後述するように、「分析物被覆粒子」という表現は、関心対象の分析物、または関心対象の分析物の類似体のいずれかで被覆された粒子を意味しうる。サンドイッチアッセイ法に関して既に記載したように、粒子の集団は、粒子の大きさおよび組成、固相装置の膜の組成、ならびにアッセイ法の感度のレベルに応じて変動する。
本発明の方法は、分析物結合粒子が固相装置の膜内に埋込まれたアッセイ法と比較して、感度が増強されたアッセイ法を提供する。例えばサンドイッチアッセイ法では、関心対象の分析物のアッセイ法の対象となる流体試料を、膜への投入前に分析物結合粒子と混合するので、関心対象の分析物が、膜内で生じる捕捉反応の前に分析物結合粒子と結合するまでに長い時間を要する。また、関心対象の分析物と分析物結合粒子の相互作用は流体相中で起こるので、粒子の移動度が大きいために、固相装置の膜のマトリックスにおける関心対象の分析物と分析物結合粒子間の同じ相互作用と比較して、効率的な結合が生じる可能性がある。またサンドイッチアッセイ法と競合アッセイ法の両方に関して、粒子が、固相装置に埋込まれるよりも流体採取装置に多く含まれうる。つまり数が多くなると、反応の感度がさらに高まる。また、分析物結合粒子(または分析物被覆粒子)は、緩衝された混合流体試料の固相膜への投入前に、緩衝された混合流体試料中に分散しているので、粒子は捕捉ゾーンを、流体先端の頂点でクイックウエーブというより、連続的に流体の毛管作用で通過する。結果として、低濃度の粒子は捕捉ゾーンを長い時間をかけて流れる。したがって、粒子が「捕捉」されうる時間は事実上長くなる一方で、捕捉ゾーンを通過する粒子の量は事実上減少するので、粒子が流体先端の頂点を通過する場合に生じる他のものによる一部の粒子の捕捉のブロッキングが避けられる。
本発明は、本明細書に記載された方法に使用されるキットも含む。キットの成分は以下を含む:特異的結合対の第1および/または第2の成分、緩衝液および/または緩衝液容器、流体採取手段、1台もしくは複数の固相装置(任意選択で投入パッドおよび/またはウィッキングパッドを含む)、少なくとも1台の試料採取装置、1種類もしくは複数の緩衝液容器、標準曲線作製用の対照試料および/または他の標準曲線情報、分析物結合粒子、分析物被覆粒子、および/または対照粒子、捕捉用試薬、抗体、関心対象の分析物の評価対象となる試料の採取を補助するツール(例えばスワブ)、処理装置(例えばバイオハザード用の廃棄用バッグ)、および/または試料採取装置に関する他の情報または指示書(例えばロット情報や有効期限など)。例えば一つの態様では、キットは、分析物結合粒子を内部に有する少なくとも1台の試料採取装置を含む。好ましい態様では、キットは、蒸発乾燥された、真空乾燥された、または凍結乾燥された分析物結合粒子を内部に有する少なくとも1個のピペットチップを含む。別の態様では、キットは、本明細書に記載された、少なくとも1台の固相装置、および少なくとも1台の試料採取装置を含む。別の好ましい態様では、キットは少なくとも1本のピペット;蒸発乾燥された、真空乾燥された、または凍結乾燥された分析物結合粒子を内部に有する少なくとも1個もしくは複数のピペットチップ;ならびに少なくとも1台の固相装置を含む。この態様は任意選択で、ピペットチップ中の分析物結合粒子に関する標準曲線、ロット情報、および/または有効期限に関する情報を含んでもよい。さらに別の好ましい態様では、キットは少なくとも1台の試料採取装置;乾燥状態の分析物結合粒子を内部に有する少なくとも1個のピペットチップ;少なくとも1台の固相装置、ならびに少なくとも1個の緩衝液容器を含む。この好ましい態様は任意選択で、緩衝液容器内に緩衝液;および固体試料の採取用のツール(例えばスワブ)を含む場合もある。
材料および方法
実験を以下のように設定した。固相装置(「試験カートリッジ」)を準備するために、事前にマイラー基材(Mylar backing)に事前に貼付したニトロセルロース膜を用いた。特異的抗体(試料捕捉用試薬)を膜の試料捕捉ゾーンに投入し、内部対照抗体(対照捕捉用試薬)を膜の対照捕捉ゾーンに投入した。抗体を投入した後に、膜上のタンパク質結合部位を、ポリビニルアルコール(PVA)で処理してブロックし、次に膜を洗浄して乾燥させた。次にこの膜を、投入抗体のラインに対して垂直となるように5 mm幅のストリップに切断した。次にストリップを、試験カートリッジ(固相装置)内に、以下の2枚のパッドとともに組み立てた:a)血液細胞(全血を使用する場合)を分けるフィルターとして機能する近位端における投入パッド、またはガラスファイバーのパッド(炭疽菌試験用の試料ホールド用パッドとして作用する);およびb)膜内を、試料を添加する近位端から遠位端へ移動する流体を吸い上げる吸収パッドとして作用する、ガラスファイバーの遠位端における(抗体のラインを超える)ウィッキングパッド。
上記の方法でアッセイ法を行い、ピペットチップ中の乾燥ラテックスを用いてラテックス粒子を緩衝液(希釈物)中に滴定することで得られた結果を、ラテックス粒子で膜ストリップを(ラテックス投入部位「LAS」で)被覆することで得られた結果と比較し、試料の流体が毛管作用によってLASを介して移動してから、試料捕捉ゾーンおよび対照捕捉ゾーンを介して移動可能とすることで得た。試料は、ベースライン(0)および0.5 ng/mlのTnIにおけるウマ血清標準および血液M5とした。緩衝液(希釈物)は、0、0.5×、1×、2×、4×、または8×のラテックス粒子を含むTnI希釈物(200 mM GHCl+10%ヤギ血清)であった。結果を表1に示す。
標準曲線における1×ラテックス希釈物とLASストリップの比較
実施例1に記載された方法でアッセイ法を行い、ピペットチップ中の乾燥ラテックスを用いて緩衝液(希釈物)中へのラテックス粒子の滴定で得られた結果を、上述のようにラテックス粒子で膜ストリップ(ラテックス投入部位「LAS」)を被覆することで得られた結果と比較した。試料は、ウマ血清標準および0、0.1、0.2、0.5、1、および3 ng/mlを添加した血液M35とした。緩衝液(希釈物)は、180 mM GHCl+10%ヤギ血清を有し、1×ラテックス粒子を含むまたは含まないTnI希釈物とした。結果を表2に示す。
ラテックス希釈物の滴定と対照LASストリップ
実施例1に記載された方法でアッセイ法を行い、ピペットチップ中の乾燥ラテックスを用いてラテックス粒子の緩衝液(希釈物)中への滴定によって得られた結果を、ラテックス粒子で膜ストリップを(ラテックス投入部位「LAS」で)上述のように被覆して得られた結果と比較した。試料は0および2000 ng/mlの炭疽菌(Bacillus anthracis)の胞子とした。緩衝液(希釈物)は、1×、3×、または6×のラテックス粒子を含むまたは含まないTnI希釈物とした。結果を表3に示す。
Claims (38)
- 以下の段階を含む、流体試料中の関心対象の分析物の量を定量的に測定する方法であって、流体試料中の関心対象の分析物の量が、補正後の分析物結合粒子の量に正比例する方法:
a)投入点、試料捕捉ゾーン、および対照捕捉ゾーンを含む膜ストリップを含む固相装置を提供する段階であって、試料捕捉ゾーンが接触領域と対照捕捉ゾーンの間に位置する段階;
b)分析物結合粒子の集団を含む試料採取装置を提供する段階であって、分析物結合粒子が分析物結合剤で被覆される段階;
c)i)流体試料を試料採取装置に導入し、混合流体試料を作製し、続いて緩衝液を混合流体試料に導入する段階;ii)緩衝液を試料採取装置に導入し、続いて流体試料を導入する段階;またはiii)固体を緩衝液中に導入し続いて流体試料を試料採取装置に導入することによって流体試料を形成する段階のいずれかであって、これにより、接触状態の分析物結合粒子を含む、緩衝された混合流体試料を作製する段階;
d)緩衝された混合流体試料を、膜ストリップの投入点に投入する段階;
e)流体が毛管作用によって、接触状態の分析物結合粒子をストリップを介して試料捕捉ゾーンに向けておよび通過して輸送でき(ここで試料捕捉用試薬は試料捕捉ゾーンに固定されている)、かつ、接触状態の分析物結合粒子が試料捕捉用試薬と結合できる条件下で、膜ストリップを維持する段階;
f)試料中の流体が毛管作用によって、接触状態の分析物結合粒子をストリップを介して対照捕捉ゾーンに向けておよび通過して輸送でき(ここで対照捕捉用試薬は対照捕捉ゾーンに固定されている)、かつ、接触状態の分析物結合粒子が対照捕捉用試薬と結合できる条件下で、膜ストリップをさらに維持する段階;
g)試料中の流体が毛管作用によって、試料捕捉用試薬にも対照捕捉用試薬にも結合していない任意の接触状態の分析物結合粒子を対照捕捉ゾーンを超えて輸送できる条件下で、膜ストリップをさらに維持する段階;
h)試料捕捉ゾーンにおける接触状態の分析物結合粒子の量、および対照捕捉ゾーンにおける接触状態の分析物結合粒子の量を決定する段階;ならびに
i)試料捕捉ゾーンにおける分析物結合粒子の量、および対照捕捉ゾーンにおける分析物結合粒子の量から、補正後の分析物結合粒子の量を決定する段階。 - 補正後の分析物結合粒子の量を、対照捕捉ゾーンにおける分析物結合粒子の量に対する、試料捕捉ゾーンにおける分析物結合粒子の量の比として決定する、請求項1記載の方法。
- 補正後の分析物結合粒子の量を、対照捕捉ゾーンにおける分析物結合粒子の量と試料捕捉ゾーンにおける分析物結合粒子の量の合計に対する、試料捕捉ゾーンにおける分析物結合粒子の量の比として決定する、請求項1記載の方法。
- 分析物および分析物結合剤が結合対の成分である、請求項1記載の方法。
- 分析物結合剤が、抗体、抗体断片、ハプテン、薬剤接合体、および受容体からなる群より選択される、請求項1記載の方法。
- 分析物結合剤が抗体である、請求項5記載の方法。
- 試料捕捉用試薬が、分析物結合粒子上の抗体と同じエピトープに対する抗体、および分析物結合粒子上の抗体と異なるエピトープに対する抗体からなる群より選択される抗体である、請求項6記載の方法。
- 段階(g)で、試料中の流体が毛管作用によって、試料捕捉用試薬にも対照捕捉用試薬にも結合していない任意の接触状態の分析物結合粒子を対照捕捉ゾーンを超えてウィッキングパッド中に輸送する、請求項1記載の方法。
- 分析物結合粒子の集団を蒸発乾燥させる、真空乾燥させる、または凍結乾燥させる、請求項1記載の方法。
- 以下の段階を含む、流体試料中の関心対象の分析物の量を定量的に測定する方法であって、流体試料中の関心対象の分析物の量が、補正後の分析物被覆粒子の量に反比例する方法:
a)投入点、試料捕捉ゾーン、および対照捕捉ゾーンを含む膜ストリップを含む固相装置を提供する段階であって、試料捕捉ゾーンが接触領域と対照捕捉ゾーンの間に位置する段階;
b)分析物被覆粒子の集団を含む試料採取装置を提供する段階であって、分析物被覆粒子が分析物または分析物の類似体で被覆される段階;
c)i)流体試料を試料採取装置に導入し、混合流体試料を作製し、続いて緩衝液を混合流体試料に導入する段階;ii)緩衝液を試料採取装置に導入し、続いて流体試料を導入する段階;またはiii)固体を緩衝液中に導入し続いて流体試料を試料採取装置に導入することによって流体試料を形成する段階のいずれかであって、これにより、分析物被覆粒子を含む、緩衝された混合流体試料を作製する段階;
d)緩衝された混合流体試料を、膜ストリップの投入点に投入する段階;
e)流体が毛管作用によって、分析物被覆粒子をストリップを介して試料捕捉ゾーンに向けておよび通過して輸送でき(ここで試料捕捉用試薬は試料捕捉ゾーンに固定されている)、かつ、分析物被覆粒子が試料捕捉用試薬と結合できる条件下で、膜ストリップを維持する段階;
f)試料中の流体が毛管作用によって、分析物被覆粒子をストリップを介して対照捕捉ゾーンに向けておよび通過して輸送でき(ここで対照捕捉用試薬は対照捕捉ゾーンに固定されている)、かつ、分析物被覆粒子が対照捕捉用試薬と結合できる条件下で、膜ストリップをさらに維持する段階;
g)試料中の流体が毛管作用によって、試料捕捉用試薬にも対照捕捉用試薬にも結合していない任意の分析物被覆粒子を対照捕捉ゾーンを超えて輸送できる条件下で、膜ストリップをさらに維持する段階;
h)試料捕捉ゾーンにおける分析物被覆粒子の量、および対照捕捉ゾーンにおける分析物被覆粒子の量を決定する段階;ならびに
i)試料捕捉ゾーンにおける分析物被覆粒子の量、および対照捕捉ゾーンにおける分析物被覆粒子の量から、補正後の分析物被覆粒子の量を決定する段階。 - 補正後の分析物被覆粒子の量を、対照捕捉ゾーンにおける分析物被覆粒子の量に対する、試料捕捉ゾーンにおける分析物被覆粒子の量の比として決定する、請求項10記載の方法。
- 補正後の分析物被覆粒子の量を、対照捕捉ゾーンにおける分析物被覆粒子の量と試料捕捉ゾーンにおける分析物被覆粒子の量の合計に対する、試料捕捉ゾーンにおける分析物被覆粒子の量の比として決定する、請求項10記載の方法。
- 分析物および試料捕捉用試薬が結合対の成分である、請求項10記載の方法。
- 試料捕捉用試薬が、抗体、抗体断片、ハプテン、薬剤接合体、および受容体からなる群より選択される、請求項10記載の方法。
- 試料捕捉用試薬が抗体である、請求項14記載の方法。
- 段階(g)で、試料中の流体が毛管作用によって、試料捕捉用試薬にも対照捕捉用試薬にも結合していない任意の分析物被覆粒子を対照捕捉ゾーンを超えてウィッキングパッド中に輸送する、請求項10記載の方法。
- 分析物被覆粒子の集団を蒸発乾燥させる、真空乾燥させる、または凍結乾燥させる、請求項10記載の方法。
- 膜ストリップが、硝酸セルロースまたはガラスファイバーから作られる、請求項1または10記載の方法。
- 粒子がラテックスビーズである、請求項1または10記載の方法。
- 粒子が標識されている、請求項1または10記載の方法。
- 標識が、比色分子、蛍光分子、リン光分子、発光分子、化学発光分子、および酵素結合分子からなる群より選択される、請求項20記載の方法。
- 結合対の成分の1つが、胞子、タンパク質、ホルモン、酵素、糖タンパク質、ペプチド、低分子、多糖、レクチン、抗体、抗体断片、核酸、薬剤、薬剤接合体、毒素、ウイルス、ウイルス粒子、細菌、細胞壁の一部、ハプテン、および受容体からなる群より選択される、請求項4または13記載の方法。
- 対照捕捉用試薬が抗免疫グロブリン抗体である、請求項6または15記載の方法。
- 流体試料が、全血、血漿、血清、尿、脳脊髄液、唾液、***、硝子体、および滑液からなる群より選択される、請求項1または10記載の方法。
- 流体試料が懸濁状態の固体を含む、請求項1または10記載の方法。
- 固体が、粒子試料、粉末試料、土壌試料、および胞子からなる群より選択される、請求項25記載の方法。
- 胞子が、炭疽菌またはバチルス・グロビギーの胞子を含む、請求項16記載の方法。
- 流体試料が、水、地下水、汚水、および廃水からなる群より選択される、請求項1または10記載の方法。
- 関心対象の分析物が、ミオグロビン、リシン、C反応性タンパク質、b-ナトリウム利尿ペプチド、CK-MB、トロポニンI、およびPSAからなる群より選択される、請求項1または10記載の方法。
- 関心対象の分析物が、野兎病菌、クラウストリジア、またはその産生毒素、および、痘瘡ウイルスまたは他のポックスウイルスからなる群より選択される、請求項1または10記載の方法。
- 段階(d)で、混合流体試料を、投入パッドを介して投入点に投入する、請求項1または10記載の方法。
- 試料採取装置が、ピペットおよびピペットチップからなる群より選択される、請求項1または10記載の方法。
- 以下を含むキット:
投入点、試料捕捉ゾーン、および対照捕捉ゾーンを含む膜ストリップを含む、固相装置であって、試料捕捉ゾーンが接触領域と対照捕捉ゾーンの間に位置する固相装置;ならびに
分析物結合粒子の集団を含む、試料採取装置。 - 試料採取装置が、ピペットおよびピペットチップからなる群より選択される、請求項33記載のキット。
- 分析物結合粒子の集団を蒸発乾燥させる、凍結乾燥させる、または真空乾燥させる、請求項33記載のキット。
- ピペットチップ中の分析物結合粒子に関する検量線、ロット情報、および/または有効期限についての情報を追加的に含む、請求項35記載のキット。
- 緩衝液、および1個または複数の緩衝液容器を追加的に含む、請求項33記載のキット。
- 試料採取ツールを追加的に含む、請求項33記載のキット。
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