CN107543923B - 检测禽白血病病毒a/b/j亚群特异性抗体的试剂盒及其检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及检测禽白血病病毒A/B/J亚群特异性抗体的试剂盒及其检测方法，属于分子生物学领域，该试剂盒包括发光微孔板、封口膜、受体微球Ⅰ、受体微球Ⅱ、供体微球、校准品和分析缓冲液；所述受体微球Ⅰ上标记禽白血病病毒A/B亚群His‑cENV蛋白，受体微球Ⅱ上标记禽白血病病毒J亚群His‑gp85蛋白；供体微球标记兔抗鸡二抗。检测是首先对采集的样本血清进行预处理，然后将受体微球Ⅰ、受体微球Ⅱ、供体微球和样本血清按要求加入到发光微孔板上，在680nm激发光下检测光信号值。该方法实现了对禽白血病病毒A/B/J特异性抗体的检测，不用洗涤，操作简单，检测灵敏，特异性和稳定性较强。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学领域，涉及动物疾病检测，具体地，涉及检测禽白血病病毒A/B/J亚群特异性抗体的试剂盒及其检测方法。
背景技术
禽白血病是指由反转录病毒科甲型反转录病毒属禽C型反转录病毒群引起的以禽类造血组织中某些细胞成分过度增生为主的各种可传染的肿瘤性疾病。以禽淋巴细胞性白血病、成红细胞性白血病和成髓细胞性白血病较为常见，通过垂直传播和水平传播两种方式在世界各国鸡群中广泛流行，引起鸡死亡、消瘦、贫血、生长发育不良，同时引起机体抵抗力下降和免疫抑制，是危害养禽业的主要疾病之一。感染鸡群的禽白血病病毒（ALV）群主要分为A、B、C、D、E、J六个亚群，其中A、B亚群毒株基因序列具有很高的同源性，具有相近的病毒特性。A、B、C、D和J亚群是外源性的，E亚群主要以前病毒的形式存在，是内源性的。A、B亚群在鸡群中较常见的，而C、D亚群较少见，J亚群是一种新的禽白血病病毒亚群。
我国A/B/J亚群禽白血病的发生已相当普遍，临床病例从最初的商品肉鸡群发展到商品蛋鸡、地方种鸡群及其他家禽，并伴随着致瘤性增强及肿瘤多样性的发生。研究显示，我国的A/B/J亚群禽白血病毒呈现高感染率、高发病率，早期感染普遍、发病日龄明显提前，混合感染多发/频发，宿主范围扩展、肿瘤谱扩大，病理变化复杂化等特点，给我国的养禽业造成了巨大的损失。对于此，国外采取严格的切断垂直传播和将未感染的后代隔离饲养的净化措施，从1987年以后国际发达国家的大型种鸡公司就已经宣布将外源性鸡白血病毒净化了。由于净化周期长、成本高，在我国目前还未能有效实施，只能通过早期诊断、及时淘汰感染鸡来净化种群，因此，快速、准确的诊断方法在该病的防治中显得尤为重要。除根据临床症状、病理变化等初步诊断外，禽白血病的确诊一般主要依靠病原学检测，常用的检测方法有病毒分离鉴定、间接免疫荧光试验和ELISA等检测方法，其中，病毒分离鉴定不适合对大量样品进行检测；间接免疫荧光试验的特点是需要荧光显微镜，在操作上具有一定的局限性；ELISA虽然适合大规模样品的检测，但是操作过程繁琐、耗时长，检测结果不时出现假阳性或病毒隐性不能检出的情况，且不能确定病毒亚型。
AlophaScreen(Amplified Luminscent Proximity Homogeneous Assay Screen)技术是一种基于微粒与微粒之间靠近的效应应用于分析物的均相检测方法，而AlophaLISA则是在AlophaScreen技术基础上，与经典ELISA技术有相似之处的均相检测方法，我们称之为均相化学发光技术。 AlophaLISA方法的核心是供体（感光微粒）和受体（发光微粒）这两种直径约为200nm的微粒。在两种微粒表面与生物分子（抗体或抗原蛋白）相偶联，每个微粒表面可覆盖成百上千个生物分子，可捕获待测分子。当微粒受到680nm的激光照射后，供体表面的光敏剂就会将溶液（AlophaLISA反应液）中的氧气转化为单线态氧。单线态氧在溶液中的传播距离约为200nm，如果供体和受体之间的距离小于200nm，单线态氧就能扩散至受体微粒，受体中的光敏化合物就能和单线态氧发生化学反应，其中Eu3+配合物就产生高能级的发光。相反，如果发光微粒和感光微粒之间的距离大于200nm，单体氧无法扩散至发光微粒，就不会有光信号的产生。AlophaLISA均相反应就是基于以上原理，如果包被在两种微粒表面的生物分子存在相互作用是，就拉近了两种微粒之间的距离，产生光信号。通过对光信号的强度检测，来判定实际检测样品中有无待测目标物。虽然基于此原理，AlophaLISA技术在肺癌、肝炎或手足口病等多方面均有所应用，但在禽白血病病毒特异性抗体检测上尚未有涉及，鉴于原理本身并不具有实际操作性，加之检测物之间的差异性，检测体系之间并不能照搬照用，如何在此基础上提高检测效率和检测质量，形成一套行之有效的标准体系，使之能在实践中被广泛应用，仍然是一项非常重要的课题。
发明内容
针对上述问题，本发明提供一种检测禽白血病病毒A/B/J亚群特异性抗体的试剂盒，改试剂盒能够实现对禽白血病病毒A/B/J特异性抗体的同时检测，不用洗涤，操作简单，检测灵敏。
一种检测禽白血病病毒A/B/J亚群特异性抗体的均相化学发光试剂盒，包括发光微孔板、封口膜、受体微球Ⅰ、受体微球Ⅱ、供体微球、校准品和分析缓冲液；
所述受体微球Ⅰ上标记禽白血病病毒A/B亚群His-cENV蛋白，受体微球Ⅱ上标记禽白血病病毒J亚群His-gp85蛋白；所述供体微球标记兔抗鸡二抗；
所述受体微球Ⅰ、受体微球Ⅱ或供体微球的标记过程是通过以下方法实现的：将待标记物置于离心管中，加入磷酸盐缓冲液，离心、洗涤和悬浮，吸干上清后加入MES缓冲液，然后再依次加入经纯化的标记物、氰基硼氢化钠溶液和Tween-20，2-8℃避光旋转反应40～48h后，加入CMO避光37℃搅拌1h终止反应；离心去上清，加HEPES缓冲液重悬，离心去上清，加入保存液，制得偶联标记物的受体微球Ⅰ、受体微球Ⅱ或供体微球；
校准品是由从多份高值血清混合成的阳性标准血清中提取的纯品抗体配制而成；
所述分析缓冲液为50mmol/L、pH7.4的Tris-HCl缓冲液，其中含有质量分数为0.8%的NaCl、质量分数为1%的牛血清白蛋白、质量分数为0.1%的酪蛋白、0.1%的表面活性剂S9、体积分数为0.1%的曲拉通-100、体积分数为0.05%的Proclin-300。
进一步的，所述供体微球为标记兔抗鸡二抗的AlphaScreen®供体微球。
进一步的，所述受体微球Ⅰ为标记His-cENV蛋白的AlphaPlex™ 645微球；受体微球Ⅱ为标记His-gp85的AlphaPlex™ 545微球。
进一步的，所述受体微球Ⅰ、受体微球Ⅱ或供体微球的标记过程是通过以下方法实现的：将20mg/mL的待标记物置于离心管中，向每0.2mL的待标记物中加入0.1mol/L、pH 8.0的磷酸盐缓冲液1mL，离心、洗涤和悬浮反复3～5次，吸干上清加入0.2mL的MES缓冲液，然后加入0.2mg～0.6mg浓度1～3mg/mL经纯化的标记物，再加入8～12uL浓度为400～500mmol/L的氰基硼氢化钠溶液和12.5uL体积分数为1%的Tween-20，2-8℃避光旋转反应40～48h后，加入10uL CMO避光37℃搅拌1h终止反应；离心去上清，加入50mmol/L pH7.4 的HEPES缓冲液0.5mL重悬，离心去上清，加入保存液，制得偶联标记物的受体微球Ⅰ、受体微球Ⅱ或供体微球；
更进一步的，所述保存液为50mmol/L 、pH7.4的Tris-HCl缓冲液，其中包含6.05g/L的Tris、10g/L的海藻糖、10g/L的葡萄糖、30g/L的甘露醇、20g/L的牛血清白蛋白、5g/L的脯氨酸和体积分数为0.1%的Proclin-300。
进一步的，所述校准品是由以下方法制得：将50份经检测的高值血清混合配制成阳性标准血清，10000rpm/min离心30min，再经亲和层析纯化，收集纯品抗体，将纯品抗体用安培瓶分装并冻干形成冻干粉，用分析缓冲液将冻干粉配制成6个校准品浓度：0ng/mL、10ng/mL、40ng/mL、160ng/mL、640ng/mL和2560ng/mL。
进一步地，利用所述的试剂盒检测禽白血病A/B/J亚群特异性抗体的方法，包括以下步骤：
步骤一、临床标本的采集及保存：取不含抗凝剂的真空采血管采集鸡静脉全血标本，37℃放置2h，然后于2～8℃过夜放置，把析出的血清吸出，3000rpm/min离心5min，取上清分装于EP管中并标明采血日期及识别号，制得样本血清；若样本血清当日使用，直接放置于2～8℃冰箱中；若隔日使用，则-20℃冷冻保存；
步骤二、在发光微孔板内将配制好的受体微球Ⅰ、受体微球Ⅱ和供体微球各加入100μL，然后加入样本血清20μL，混合均匀，37℃孵育20min，然后在波长为680nm的光激发下检测不同亚群特异性抗体的信号光值。
进一步的，受体微球Ⅰ的浓度为0.015mg/mL；受体微球Ⅱ的浓度为0.020mg/mL；供体微球的浓度为0.030mg/mL。
有益效果：
本发明利用均相化学发光技术，在受体微球上偶联囊膜蛋白，供体微球上标记兔抗鸡二抗，采用独创的体系将抗原或抗体蛋白偶联到微球上，在蛋白与微球的偶联标记体系中，缓冲液pH、溶液浓度与用量、反应时间及温度等都会对偶联标记过程产生影响，本发明采用不同的缓冲液洗涤微球，增加其表面基团活性，在与标记物反应中，依次加入氰基硼氢化钠溶液和Tween-20，防止微球表面的活性基团氧化，或发生其它化学反应，使活性基团钝化，失去活性，或者活性严重降低；控制偶联时间和反应条件，在提高反应速率的同事，避免发生蛋白自身偶联，提高偶联量。反应完毕后用缓冲液再次洗涤，减少非共价吸附，最大程度提高偶联效率，增加偶联复合物的均一性、灵敏性和特异性，进而决定了微球在特异性抗体检测上的高灵敏度和高效率，再者，保存液中添加的海藻糖、葡萄糖、甘露醇、牛血清白蛋白、脯氨酸和Proclin-300之间协调作用，提高了偶联物质的稳定性和特异性，能准确地快速检测出目标物质，充分发挥出了试剂盒的功效。该试剂盒还能实现对禽白血病病毒A/B/J特异性抗体的同时检测，并能根据检测的信号光来区分这三个亚群的抗体，方便快捷、效率高，而且不用洗涤，操作简单，检测灵敏。同时，开辟了一种检测禽白血病病毒特异性抗体抗体的新途径，形成了一套行之有效的检测体系。
采用该试剂盒进行检测，能检测到稀释256倍的禽白血病A/B亚群阳性血清和稀释512倍的J亚群阳性血清，敏感性较高；对15份禽病阳性血清进行检测，所有样品的检测结果皆为阴性，表明本发明与其他禽病血清无交叉反应，具有良好的特异性，而对禽白血病毒A/B/J亚群阳性血清的检测，发光信号很强，说明具有良好的反应性。另外，采用该试剂盒进行检测，重复性较好，稳定性强，可在2-8℃保存12个月。该试剂盒能够用来对禽白血病毒A/B/J亚群抗体进行定量检测。
附图说明
图1是pUC19-cENV基因重组质粒双酶切鉴定结果电泳图；其中，左侧为使用限制性内切酶EcoRI、XhoI双酶切pUC19-gp85获得的基因片段，右侧为DL10000 Marker；
图2是pUC19-gp85基因重组质粒双酶切鉴定结果电泳图；其中，1为使用限制性内切酶EcoRI、XhoI双酶切pUC19空质粒，2为使用限制性内切酶EcoRI、XhoI双酶切pUC19-gp85获得的基因片段，M为1kb DNA Ladder；
图3是重组表达蛋白cENV纯化前后SDS-PAGE电泳图；其中，图中M为蛋白质Marker，1为诱导菌菌液沉淀，2为上清，3为大量表达蛋白沉淀，4为大量表达蛋白纯化后结果；
图4是重组表达蛋白gp85纯化前后SDS-PAGE电泳图；其中，图中M为蛋白质Marker，1为诱导菌菌液沉淀，2为上清，3为大量表达蛋白沉淀，4为大量表达蛋白纯化后结果；
图5是Western blot法检测cENV重组蛋白结果图；
图6是Western blot法检测gp85重组蛋白结果图。
具体实施方式
以下实施例或试验例用于说明本发明，并不用来限制本发明的保护范围，在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所做的修改或替换，均属于本发明的保护范围。
若未特别指明，实施例或试验例中所用化学试剂均为常规市售试剂，所用技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
本发明中所用主要试剂、仪器或耗材及其来源如下：
主要试剂：
2-吗啉乙磺酸（MES）、氰化硼氢化钠（NaBH3CN）、羧甲基羟胺半盐（CMO）、4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）和Prolcin-300购自Sigma-Aldrich公司；
Tween-20购自Pierce公司；
AlphaScreen®、AlphaPlex™ 645和AlphaPlex™ 545均购自美国 Perkin Elmer公司；
蛋白预染Marker、Taq聚合酶、限制性内切酶NcoⅠ和XhoⅠ购自Thermo公司；
T4 DNA连接酶、dNTP、DNA Marker、IPTG、pUC19载体购自宝日医生物技术（北京）有限公司；
质粒抽提试剂盒购自OMEGA公司；
His标签抗体为北京全式金生物技术有限公司产品。 主要耗材与仪器：
光激发化学发光仪购自美国 Perkin Elmer公司；
超高速冷冻自平衡离心机 Osterode D-37520购自德国 Thermo fisher 公司；
紫外分光光度计 TU-1900 购自北京普析通用仪器有限责任公司。
试验例1 禽白血病毒A/B/J亚群囊膜蛋白的表达与制备
根据NCBI GenBank中已发表的ALV-A/B/J亚群囊膜蛋白的基因序列，结合国内外对ALV-A/B/J亚群的研究进展，筛选出代表流行毒株的囊膜蛋白抗原表位基因序列，获得重组A/B亚群囊膜蛋白cENV基因序列1244bp，其核苷酸序列SEQ ID NO：1所示；重组J亚群囊膜蛋白gp85基因序列1024bp，其核苷酸序列SEQ ID NO：3所示。为便于后续试验，通过PCR扩增，使A/B亚群囊膜蛋白cENV基因序列和J亚群囊膜蛋白gp85基因序列的5，端均含NcoI酶切位点，3，端均含XhoI酶切位点。将得到的cENV基因序列和gp85基因序列分别连接至pUC19载体上。测序，验证正确后，将pET32a(+)和上述连接了目的基因的pUC-19克隆载体分别用限制性内切酶NcoⅠ和XhoⅠ在37℃水浴条件下进行双酶切60min，用1%琼脂糖凝胶电泳后，pET32a(+)双酶切后胶回收大片段，pUC-19克隆载体双酶切后回收目的基因片段。双酶切的结果如图1和图2所示 。将回收获得的大片段和目标基因片段于22℃过夜连接，其中与cENV目标基因片段的连接体系为：pET32a(+)载体1uL，cENV基因片段1.5uL，ddH2O 20uL，T4DNA连接酶1.5uL，10×Green Buffer 3uL，总体积共27uL，获得连接产物pET32a-cENV重组质粒；与gp85目标基因片段的连接体系为：pET32a(+)载体1uL，gp85基因片段1.5uL，ddH2O 20uL，T4DNA连接酶1.5uL，10×Green Buffer 3uL，总体积共27uL，获得连接产物pET32a- gp85重组质粒。
将连接产物pET32a-cENV重组质粒和pET32a-gp85重组质粒按照常规方法分别转入0.1%CaCl2制备的感受态细菌BL21中，涂布于含有氨苄青霉素的LB固体培养基中，37℃过夜培养，次日挑取单菌落，摇菌，提取质粒进行双酶切鉴定后送去测序，确认其中具有如SEQID NO：1和 SEQ ID NO：3所示的序列，可见获得的重组cENV基因和gp85基因已经分别成功克隆入pET32a-cENV重组质粒和pET32a- gp85重组质粒中。
将含有重组质粒的阳性大肠杆菌BL21菌接种于含氨苄青霉素（Amp）抗性的固体培养基中，37℃过夜培养后，取3～4个单菌落接种于含Amp的LB液体培养基中，37℃震荡（250rpm/min）培养至OD600=0.8，加入IPTG（异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷）至终浓度为1mmol/L，37℃继续培养4小时，得带HIS标签的融合蛋白His—cENV和His—gp85，同时培养未诱导的重组质粒转化BL21菌作为阴性对照。所述A/B亚群His-cENV蛋白的氨基酸序列SEQID NO:02所示，J亚群His-gp85蛋白的氨基酸序列SEQ ID NO: 4所示。表达的蛋白经SDS-PAGE和Western-blot鉴定，结果如图3和图4所示。
收集培养的工程菌菌液，6000rpm/min离心10min，弃上清，沉淀用PBS重悬获得重悬液，然后重悬液中加入GuNTA-0 Buffer和PMSF在低温下用超声破碎仪超声破碎BL21细菌，120W，工作2s，间歇3s，超声100个循环；然后将超声破碎菌液转入50ml离心管中，配平，4℃，12000r/min离心10分钟，取上清，-20℃保存；用Ni-NTA纯化树脂对裂解菌体进行亲和层析，样品加到层析柱中，流速12ml/h收集穿透部分。层析用5倍NTA体积的GuNTA-60 Buffer洗脱，流速12ml/h，收集洗脱液。用0.5mol/LNaCl和20mmol/L Tris-HCl溶液24小时透析洗脱液，纯化后的禽白血病cENV蛋白和gp85蛋白进行SDA-PAGE和Western-blot检测目的蛋白纯度高达97%。得到的蛋白经过Bradford法测定蛋白含量，2ml离心管分装，-80℃保存备用。
重组蛋白的纯化步骤如下：
将上述离心获得的沉淀用9倍体积的洗涤液
重悬沉淀，静置5min后，8000rpm，4℃，15min，弃上清。用9倍体积的洗涤液
重悬沉淀，静置5min后，8000rpm，4℃，15min，弃上清，保留沉淀。用9倍体积的洗涤液
重悬沉淀，静置5min后，8000rpm，4℃，15min，弃上清，保留沉淀。按照100mL菌液加4-10mL溶解液，4℃过夜。8000rpm，4℃，15min。取上清，即为纯化蛋白。
包涵体纯化所述试剂配制方法：
1、细菌重悬液（250mL）：PBS（NaCl 2g，KCl 0.05g，Na2HPO4 0.36g，KH2PO4 0.06g），1mmol/L EDTA；
2、溶液
（500mL）：500mmol/L Tris-HCl（PH=6.0），50mmol/L NaCl，50mmol/LEDTA；
3、溶液
（250mL）：溶液
，1mol/L尿素；
4、溶液
（250mL）：溶液
，2mol/L尿素；
5、包涵体溶解液（250mL）：溶液
，8mol/L尿素。
使用上述纯化得到的His-cENA蛋白和His-gp85蛋白分别包被ELISA板，使用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测该蛋白的生物学活性。以His 标签抗体以及IDEXX检测试剂盒检测禽白血病毒A/B/J抗体为阳性的鸡血清为阳性对照，健康SFP鸡血清为阴性对照，HRP标记羊抗鼠IgG、羊抗鸡IgG酶标二抗按照说明书使用。结果显示阳性对照与与阴性对照的OD值比值大2.1，说明该蛋白具有良好的生物学活性和抗原性。
其中，ELISA具体步骤如下：
1、包被：取纯化过重组蛋白，以0.05MpH9.6的碳酸盐缓冲液稀释至最佳浓度，包被反应板，100ul/孔，4℃过夜；
2、洗涤：甩去酶标板中的包被液，用PBST（PBS, 0.05% Tween-20）加满各孔，室温静置3min，弃去PBST，洗涤3次，3min/次，拍干；
3、封闭：各孔加入封闭液（2%BSA），200ul/孔，置4℃过夜，封闭后，拍干；
4、加样：将待检测血清按梯度稀释后加入包被板，100ul/孔，同时设立阴阳性血清对照。置37℃培养箱孵育1h，洗涤3次，3min/次，拍干；
5、用PBST将HRP标记羊抗鼠IgG、羊抗鸡IgG酶标二抗按1:2000稀释，100ul/孔，置37℃培养箱孵育1h，洗涤3次，3min/次，拍干； 6、显色：使用TMB单组份显色液（TIANGEN公司产品）按100ul/孔加入包被板，37℃条件下避光显色15min加终止液(2M H2SO4)终止显色；7、用酶联免疫检测仪测其在波长450nm检测各个孔的OD值，阴性对照OD450值为N，阳性对照OD450值为P。若P/N>2.1判为阳性。
试验例2 受体微球和供体微球的制备
取AlphaPlex™ 645受体微球（20mg/mL）0.2mL置于1.5mL EP离心管中，加入0.1mol/L pH 8.0的磷酸盐缓冲液1mL，离心洗涤悬浮3次，每次离心力16000g/min离心15分钟，吸干上清加入0.2mL MES缓冲液，然后加入0.3mg～0.6mg浓度1～3mg/mL已纯化高活性的重组蛋白禽白血病病毒A/B亚群His-cENV，再加入8～12uL浓度为400～500mmol/L的氰基硼氢化钠溶液和12.5uL 1%Tween-20，避光2-8℃旋转反应40～48h后，加入10uL CMO避光37℃搅拌反应1h终止反应。将标记好的受体微球4℃、13000g/min离心30min，用移液器移除上清液，加入50mmol/L、pH7.4的HEPES缓冲液0.5mL重悬，震荡悬浮管底部受体微球；重复上述步骤离心2次，加入50mmol/L、 pH7.4的保存液待用。
取AlphaPlex™ 545受体微球（20mg/mL）0.2mL置于1.5mL EP离心管中，加入0.1mol/L、pH 8.0的磷酸盐缓冲液1mL，离心洗涤悬浮3次，每次离心力16000g/min离心15分钟，吸干上清加入0.2mL MES缓冲液，然后加入0.2mg～0.5mg浓度1～2mg/mL已纯化高活性的重组蛋白禽白血病病毒J亚群His-gp85蛋白，再加入8～12uL浓度为浓度为400～500mmol/L的氰基硼氢化钠溶液和12.5uL 1% Tween-20，避光2-8℃旋转反应40～48h后，加入10uL CMO避光37℃搅拌反应1h终止反应。将标记好的受体微球4℃、13000g/min离心30min，用移液器移除上清液，加入50mmol/L 、pH7.4的HEPES缓冲液0.5mL重悬，震荡悬浮管底部受体微球；重复上述步骤离心2次，加入0.2mL 50mmol/L、pH7.4的保存液待用。
取醛基化AlphaScreen®供体微球（20mg/mL）0.2mL置于1.5mL EP离心管中，加入0.02mol/L pH7.6的磷酸盐缓冲液1mL，离心洗涤悬浮3次，每次离心力16000g/min离心15分钟，吸干上清加入0.2mL MES缓冲液，然后加入0.4mg～0.6mg浓度1～2mg/mL已纯化高活性的兔抗鸡二抗，再加入8～12uL浓度为浓度为400～500mmol/L的氰基硼氢化钠溶液和12.5uL 1%Tween-20，避光2-8℃旋转反应40～48h后，加入10uL CMO避光37℃搅拌反应1h终止反应。将标记好的受体微球4℃、13000g/min离心30min，以移液器移除上清液，加入50mmol/L、pH7.4 的HEPES缓冲液0.5mL重悬，震荡悬浮管底部受体微球；重复上述步骤离心2次，加入50mmol/L、pH7.4的保存液待用。
所述HEPES缓冲液的制备：称取HEPES 5.96g和牛血清白蛋白（BSA）5g，加水800mL溶解，加5mL吐温-20，加水定容至1L。
所述保存液为50m mol/L 、pH7.4的Tris-HCl缓冲液：称取Tris 6.05g，加水800mL溶解，调pH至7.4；加海藻糖10g，葡萄糖10g，甘露醇30g，BSA 20g，脯氨酸5g，Proclin-3001mL，溶解后加水定容至1L。
所述0.1mol/L、pH 8.0的磷酸盐缓冲液的制备：称取Na2HPO4·12H2O 33.9g和NaH2PO4 0.731g，加水800mL溶解，加0.5mL吐温-20，加水定容至1L。
所述0.02mol/L、pH7.6的磷酸盐缓冲液的制备：称取Na2HPO4·12H2O 5.8g、NaH2PO40.496g和NaCl 8g，加水800mL溶解，加0.5mL吐温-20，加水定容至1L。
所述MES缓冲液的制备：称取MES 21.3g，加800mL蒸馏水溶解，用10mol/L NaOH调pH值至6.0，定容至1L。
试验例3 禽白血病A/B/J亚群特异性抗体的均相化学发光检测试剂盒的组配
禽白血病A/B/J亚群特异性抗体的均相化学发光检测试剂盒，包括发光微孔板、封口膜、受体微球、供体微球、校准品和分析缓冲液；所述受体微球包括偶联禽白血病病毒A/B亚群His-cENV蛋白的AlphaPlex™ 645受体微球和偶联禽白血病病毒J亚群His-gp85蛋白的AlphaPlex™ 545受体微球；所述供体微球为标记兔抗鸡二抗的AlphaScreen®供体微球；所述为分析缓冲液为50mmol/L、 pH7.4的Tris-HCl缓冲液，其中含有质量分数为0.8%的NaCl、质量分数为1%的牛血清白蛋白、质量分数为0.1%的酪蛋白、0.1%表面活性剂S9、体积分数为0.1%的曲拉通-100、体积分数为0.05%的Proclin-300；所述发光微孔板为96孔发光微孔板（美国 Perkin Elmer公司）；所述封口膜采用TopSeal-A 封口膜（美国 PerkinElmer公司）。
所述校准品是由以下方法制得：将50份经检测的高值血清混合配制成阳性标准血清，10000rpm/min离心30min，再经亲和层析纯化，收集纯品抗体，将纯品抗体用安培瓶分装并冻干形成冻干粉，用分析缓冲液将冻干粉配制成6个校准品浓度：0ng/mL、10ng/mL、40ng/mL、160ng/mL、640ng/mL和2560ng/mL。
组配完毕，试剂盒于-20℃保存备用。
试验例4 本发明所述均相化学发光检测试剂盒检测禽白血病A/B/J亚群特异性抗体的条件优化
（1）受体微球和供体微球最佳稀释比例
采用棋盘滴定法，禽白血病病毒A/B亚群His-cENV的AlphaPlex™ 645受体微球和禽白血病病毒J亚群His-gp85的AlphaPlex™ 545 受体微球分别都设0.005 mg/mL、0.010mg/mL、0.015 mg/mL、0.020 mg/mL、0.025mg/mL、0.030 mg/mL共6个浓度，标记兔抗鸡二抗的AlphaScreen®供体微球设0.010 mg/mL、0.020mg/mL、0.030mg/mL、0.040mg/mL共4个浓度，测定结果以信号/空白比(Signal/Background，S/B)及四参数曲线拟合来确定最佳稀释比例。最终确定标记蛋白禽白血病病毒A/B亚群His-cENV的AlphaPlex™ 645受体微球最佳浓度为0.015mg/ml，标记蛋白禽白血病病毒J亚群His-gp85的AlphaPlex™ 545 受体微球最佳浓度为0.020mg/ml，标记兔抗鸡二抗的AlphaScreen®供体微球最佳浓度为0.030mg/ml。
（2）反应温度和时间
将反应时间设定为10min、20min、30min、40min、50min、60min，反应温度设置25℃和37℃，根据S/B值，选择S/B值最高时间又最短的温度和时间，在发光微孔板内将配制好的受体微球和供体微球各加入100μL，然后加入样本血清20μL，混合均匀，按提前设置的温度和时间去反应，然后在光激发化学发光仪读取信号值。结果选择37℃孵育20min，为最佳温度和孵育时间。
（3）最适分析缓冲液的选择
选取以下4种缓冲液：HEPES缓冲液、PBS缓冲液、MES缓冲液、Tris缓冲液，以S/B作为优化标准。最终选择S/B值最高的分析缓冲液为50mmol/L、 pH7.4的Tris-HCl缓冲液，其中含有质量分数为0.8%的NaCl、质量分数为1%的牛血清白蛋白、质量分数为0.1%的酪蛋白、0.1%S9、体积分数为0.1%的曲拉通-100、体积分数为0.05%的Proclin-300
试验例5 本发明所述试剂盒检测禽白血病A/B/J亚群特异性抗体的方法
本发明所述试剂盒检测禽白血病A/B/J亚群特异性抗体的方法，包括以下步骤：
步骤一、临床标本的采集及保存：取不含抗凝剂的真空采血管采集鸡静脉全血标本，37℃放置2h，然后于2～8℃过夜放置，把析出的血清吸出，3000rpm/min离心5min，取上清分装于EP管中并标明采血日期及识别号，制得样本血清；若样本血清当日使用，直接放置于2～8℃冰箱中；若隔日使用，则-20℃冷冻保存。
步骤二、在发光微孔板内将配制好的受体微球和供体微球各加入100μL，然后加入样本血清20μL，混合均匀，37℃孵育20min，然后在光激发化学发光仪读取发光值。
步骤三、按照步骤一和步骤二所述均相化学发光试剂盒检测的操作流程，将配制好六种浓度的校准品进行测定，所得结果四参数拟合回归计算，得回归方程及校准品剂量反应曲线。根据步骤二测定的样本血清的发光值和反应曲线，计算样本血清中特异性抗体的剂量值。
试验例6 本发明所述试剂盒检测禽白血病病毒A/B/J亚群特异性抗体的方法的主要指标
（1）敏感性
将3份分别为禽白血病A亚群、B亚群和J亚群的强阳血清标本作梯度稀释1:8、1:16、1:32、1:64、1:128、1:256、1:512、1:1024，用本发明所述检测方法进行检测，结果如下表1所示。选取阳性标本血清30份，用病毒分离实验、本发明所述检测方法和国外进口试剂盒（IDEXX）同时测定，结果可知，三种检测方法检测30份已知阳性血清样本的结果相比符合率为100%。
表1：试剂盒敏感性检测
由上表1可以看出，本发明所述检测方法能检测到稀释256倍的禽白血病A亚群和B亚群强阳性血清，可检测到的A亚群的特异性抗体的最低剂量值为22ng/mL，可检测到的B亚群的特异性抗体的最低剂量值为26ng/mL；本发明所述检测方法能检测到稀释512倍的禽白血病J亚群强阳血清，可检测到的J亚群的特异性抗体的最低剂量值为12ng/mL。
（2）特异性
购买荷兰GD公司15份禽病特异性标准阳性血清样品：禽传染性法氏囊病（IBD），禽传染性支气管炎（IBV，Beaudette株），新城疫(NDV)，禽脑脊髓炎（AE），禽贫血因子（CAV），传染性喉气管炎（ILT），滑液支原体（MS），禽流感(AIV，0126株），呼肠孤病毒（REO），禽传染性支气管炎（IBV，Mass株），禽腺病毒（FAV，Phelp株），水禽/鸡痘病毒（FPV），禽减蛋病毒（EDS-76），败血支原体（MG）和副粘病毒（APMV）。另外还购买了3份禽白血病A亚群、B亚群和J亚群标准阳性血清样本
将上述15种禽病特异性标准阳性血清和ALV-A/B/J亚群标准阳性血清都进行1:8稀释，用本发明所述均相化学发光试剂盒定量检测抗体的方法进行检测， 特异性检测数据如下表2所示。
表2：试剂盒特异性检测
有上表2可知，本发明所述试剂盒的检测方法检测的15份禽病特异性标准血清样品，所有样品的检测结果皆为阴性，表明本发明与其他禽病血清无交叉反应，具有良好的特异性。检测禽白血病毒A/B/J亚群标准阳性血清，发光信号很强，说明具有良好的反应性，能够用来对禽白血病毒A/B/J亚群抗体进行定量检测。
（3）精密度
取用禽白血病A亚群强阳血清标本1份、B亚群强阳血清标本1份和J亚群强阳血清标本1份。两个实验员（A和B）将这三个血清样本每人重复20次实验，计算所测结果变异系数（CV），结果表明：A实验员20次测得结果CV平均百分比为6.28%；B实验员20次测得结果CV平均百分比为7.44%，CV百分比均小于10%，说明重复性好，结果稳定可靠。
（4）稳定性
将本发明制备的标记禽白血病病毒A/B亚群His-cENV的AlphaPlex™ 645受体微球、标记禽白血病病毒J亚群His-gp85的AlphaPlex™ 545 受体微球、标记兔抗鸡二抗的AlphaScreen®供体微球，和分析缓冲液置于2-8℃保存0、3、6、9、12个月，然后用本发明建立的均相化学发光法对本实验室保存的质控品（PC，IBD，IBV，NDV，REO，AIV，SPF）进行检测，观察该均相化学发光法的敏感性和特异性变化趋势，评估该方法的稳定性，结果如下表3所示。
表3：试剂盒稳定性检测
有上表3可知，本发明所述试剂盒所用到的主要试剂在2-8℃保存12个月，其敏感性、特异性结果均几乎没有发生变化，说明该试剂盒在12个月内有很强的稳定性。
SEQUENCE LISTING
<110> 黑龙江省动物疫病预防与控制中心、洛阳现代生物技术研究院有限公司
<120> 检测禽白血病病毒A/B/J亚群特异性抗体的试剂盒及其检测方法
<130> 1
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1148
<212> DNA
<213> 禽白血病病毒
<400> 1
ccatgggtac acccttgctg ccaacgagag ttaattatat tctcattatt ggtgtcctgg 60
tcttgtgtga ggttacgggg gtgagagctg atgttcactt actcgagcag ccaggtggca 120
gcacggattt ctgcctctct acacagggcg gcagcacctc cccttttcag acatgtttga 180
taggtatccc gtcccctatt ggcggtagca aggggtacgt ctctggtaat tgcaccgcct 240
tgggtggcag ctatcggaag gtttcatgct tgttgttaaa gctgaatgtt tccctgttgg 300
acgagccagg tggcagcgaa ctacaactgt taggttccca gtctctccct ggaggcagct 360
acggtagtcc ggcgggcgtt tacggcggca gccaagttac acacatcctc ttgactgacg 420
gtggcagccc gtttacagta gtgacagcag gtggcagcgg aagtgaatat tgcggtgcat 480
atggctacgg aggcagcgtc agtggatgtt gcggggaatc aatcacgatt ctcccaccag 540
gggcgtgggt cgacggtggt agcaaaccaa aggcgctacc acccggaatt ttcctcattt 600
gtggggatgg cggaagcccc agtcgtccgg tagggggccc ctgctattta ggaaaactta 660
ccatgttagg cggcagcata ctcgccaatt cgggcggtag ccataaacga agcgtcacac 720
acctggatga tacaggcggc agctcagatg aagtaacgct ttggggtgga ggcagcgcaa 780
gaatctttgc atctatctta gctccggggg tagcagctgc gcaagcctta agaggtggca 840
gcagactagc ctgttggtcc gttaaacagg ctggcggtag caccacatca ctcctcgggg 900
acttattgga tgatgtcacg agtattcgac acgcggtcct gcagaaccga ggtggcagca 960
ttgacttctt gcttctggct cacggccatg gctgtgagga cattgctgga atgtgttgtt 1020
tcaatctcag tggcggcagc gaatgggccg ttcatttgct aaaaggacta cttttggggc 1080
tggtagttat cttgctgcta gtagtatgcc tgccttgctt tttgcaattc gtatctagta 1140
gcctcgag 1148
<210> 2
<211> 382
<212> PRT
<213> 大肠杆菌BL21
<400> 2
Met Gly Thr Pro Leu Leu Pro Thr Arg Val Asn Tyr Ile Leu Ile Ile
1 5 10 15
Gly Val Leu Val Leu Cys Glu Val Thr Gly Val Arg Ala Asp Val His
20 25 30
Leu Leu Glu Gln Pro Gly Gly Ser Thr Asp Phe Cys Leu Ser Thr Gln
35 40 45
Gly Gly Ser Thr Ser Pro Phe Gln Thr Cys Leu Ile Gly Ile Pro Ser
50 55 60
Pro Ile Gly Gly Ser Lys Gly Tyr Val Ser Gly Asn Cys Thr Ala Leu
65 70 75 80
Gly Gly Ser Tyr Arg Lys Val Ser Cys Leu Leu Leu Lys Leu Asn Val
85 90 95
Ser Leu Leu Asp Glu Pro Gly Gly Ser Glu Leu Gln Leu Leu Gly Ser
100 105 110
Gln Ser Leu Pro Gly Gly Ser Tyr Gly Ser Pro Ala Gly Val Tyr Gly
115 120 125
Gly Ser Gln Val Thr His Ile Leu Leu Thr Asp Gly Gly Ser Pro Phe
130 135 140
Thr Val Val Thr Ala Gly Gly Ser Gly Ser Glu Tyr Cys Gly Ala Tyr
145 150 155 160
Gly Tyr Gly Gly Ser Val Ser Gly Cys Cys Gly Glu Ser Ile Thr Ile
165 170 175
Leu Pro Pro Gly Ala Trp Val Asp Gly Gly Ser Lys Pro Lys Ala Leu
180 185 190
Pro Pro Gly Ile Phe Leu Ile Cys Gly Asp Gly Gly Ser Pro Ser Arg
195 200 205
Pro Val Gly Gly Pro Cys Tyr Leu Gly Lys Leu Thr Met Leu Gly Gly
210 215 220
Ser Ile Leu Ala Asn Ser Gly Gly Ser His Lys Arg Ser Val Thr His
225 230 235 240
Leu Asp Asp Thr Gly Gly Ser Ser Asp Glu Val Gln Leu Trp Gly Gly
245 250 255
Gly Ser Ala Arg Ile Phe Ala Ser Ile Leu Ala Pro Gly Val Ala Ala
260 265 270
Ala Gln Ala Leu Arg Gly Gly Ser Arg Leu Ala Cys Trp Ser Val Lys
275 280 285
Gln Ala Gly Gly Ser Thr Thr Ser Leu Leu Gly Asp Leu Leu Asp Asp
290 295 300
Val Thr Ser Ile Arg His Ala Val Leu Gln Asn Arg Gly Gly Ser Ile
305 310 315 320
Asp Phe Leu Leu Leu Ala His Gly His Gly Cys Glu Asp Ile Ala Gly
325 330 335
Met Cys Cys Phe Asn Leu Ser Gly Gly Ser Glu Trp Ala Val His Leu
340 345 350
Leu Lys Gly Leu Leu Leu Gly Leu Val Val Ile Leu Leu Leu Val Val
355 360 365
Cys Leu Pro Cys Phe Leu Gln Phe Val Ser Ser Ser Leu Glu
370 375 380
<210> 3
<211> 1087
<212> DNA
<213> 禽白血病病毒
<400> 3
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370 375 380
Claims (5)
1.一种检测禽白血病病毒A/B/J亚群特异性抗体的均相化学发光试剂盒，其特征在于：包括发光微孔板、封口膜、受体微球Ⅰ、受体微球Ⅱ、供体微球、校准品和分析缓冲液；
所述受体微球Ⅰ上标记禽白血病病毒A/B亚群His-cENV蛋白，受体微球Ⅱ上标记禽白血病病毒J亚群His-gp85蛋白；所述供体微球标记兔抗鸡二抗；
所述受体微球Ⅰ、受体微球Ⅱ或供体微球的标记过程是通过以下方法实现的：将待标记物置于离心管中，加入磷酸盐缓冲液，离心、洗涤和悬浮，吸干上清后加入MES缓冲液，然后再依次加入经纯化的标记物、氰基硼氢化钠溶液和Tween-20，2-8℃避光旋转反应40～48h后，加入CMO避光37℃搅拌1h终止反应；离心去上清，加HEPES缓冲液重悬，离心去上清，加入保存液，制得偶联标记物的受体微球Ⅰ、受体微球Ⅱ或供体微球；
所述保存液为50mmol/L 、pH7.4的Tris-HCl缓冲液，其中包含6.05g/L的Tris、10g/L的海藻糖、10g/L的葡萄糖、30g/L的甘露醇、20g/L的牛血清白蛋白、5g/L的脯氨酸和体积分数为0.1%的Proclin-300；
校准品是由从多份高值血清混合成的阳性标准血清中提取的纯品抗体配制而成；
所述分析缓冲液为50mmol/L、pH7.4的Tris-HCl缓冲液，其中含有质量分数为0.8%的NaCl、质量分数为1%的牛血清白蛋白、质量分数为0.1%的酪蛋白、0.1%的表面活性剂S9、体积分数为0.1%的曲拉通-100、体积分数为0.05%的Proclin-300。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述供体微球为标记兔抗鸡二抗的AlphaScreen®供体微球。
3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述受体微球Ⅰ为标记His-cENV蛋白的AlphaPlex™ 645微球；受体微球Ⅱ为标记His-gp85的AlphaPlex™ 545微球。
4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述受体微球Ⅰ、受体微球Ⅱ或供体微球的标记过程是通过以下方法实现的：将20mg/mL的待标记物置于离心管中，向每0.2mL的待标记物中加入0.1mol/L、pH 8.0的磷酸盐缓冲液1mL，离心、洗涤和悬浮反复3～5次，吸干上清加入0.2mL的MES缓冲液，然后加入0.2mg～0.6mg浓度1～3mg/mL经纯化的标记物，再加入8～12uL浓度为400～500mmol/L的氰基硼氢化钠溶液和12.5uL体积分数为1%的Tween-20，2-8℃避光旋转反应40～48h后，加入10uL CMO避光37℃搅拌1h终止反应；离心去上清，加入50mmol/L pH7.4 的HEPES缓冲液0.5mL重悬，离心去上清，加入保存液，制得偶联标记物的受体微球Ⅰ、受体微球Ⅱ或供体微球。
5.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述校准品是由以下方法制得：将50份经检测的高值血清混合配制成阳性标准血清，10000rpm离心30min，再经亲和层析纯化，收集纯品抗体，将纯品抗体用安培瓶分装并冻干形成冻干粉，用分析缓冲液将冻干粉配制成6个校准品浓度：0ng/mL、10ng/mL、40ng/mL、160ng/mL、640ng/mL和2560ng/mL。
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| CN110261599B (zh) * | 2019-05-16 | 2022-02-08 | 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心） | 一种检测a、b亚群禽白血病病毒抗体的elisa试剂盒及其应用 |
| CN112114131A (zh) * | 2019-06-21 | 2020-12-22 | 博阳生物科技（上海）有限公司 | 一种均相化学发光检测方法及其应用 |
| CN110981969B (zh) * | 2019-12-24 | 2021-12-07 | 长江大学 | 一种alv-k的elisa试剂盒及其检测方法 |
Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1646913A (zh) * | 2002-04-10 | 2005-07-27 | 反应生物医学公司 | 敏感性免疫色原图像测试 |
| CN103472235A (zh) * | 2013-08-26 | 2013-12-25 | 河北省科学院生物研究所 | 一种长效蛋白质溶液稳定剂 |
| CN103837675A (zh) * | 2014-03-07 | 2014-06-04 | 常艳敏 | 多组分同时定量分析的均相发光免疫分析方法及其所使用的试剂盒 |
| CN102735833B (zh) * | 2012-07-09 | 2015-01-21 | 沃克(天津)生物科技有限公司 | 甲状腺过氧化物酶抗体均相发光免疫分析试剂盒及其检测方法 |
| CN104548087A (zh) * | 2014-12-26 | 2015-04-29 | 山东农业大学 | 一种抗a/b亚群禽白血病病毒感染的表位疫苗及其制备方法和应用 |
| CN106442982A (zh) * | 2016-08-31 | 2017-02-22 | 扬州大学 | 一种禽白血病病毒j亚群特异抗原多肽及其应用 |
| CN106932583A (zh) * | 2015-12-29 | 2017-07-07 | 北京大成生物工程有限公司 | 人表皮生长因子受体Her-2/neu定量检测试剂盒及其制备方法与应用 |
-
2017
- 2017-08-23 CN CN201710730963.0A patent/CN107543923B/zh active Active
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1646913A (zh) * | 2002-04-10 | 2005-07-27 | 反应生物医学公司 | 敏感性免疫色原图像测试 |
| CN102735833B (zh) * | 2012-07-09 | 2015-01-21 | 沃克(天津)生物科技有限公司 | 甲状腺过氧化物酶抗体均相发光免疫分析试剂盒及其检测方法 |
| CN103472235A (zh) * | 2013-08-26 | 2013-12-25 | 河北省科学院生物研究所 | 一种长效蛋白质溶液稳定剂 |
| CN103837675A (zh) * | 2014-03-07 | 2014-06-04 | 常艳敏 | 多组分同时定量分析的均相发光免疫分析方法及其所使用的试剂盒 |
| CN104548087A (zh) * | 2014-12-26 | 2015-04-29 | 山东农业大学 | 一种抗a/b亚群禽白血病病毒感染的表位疫苗及其制备方法和应用 |
| CN106932583A (zh) * | 2015-12-29 | 2017-07-07 | 北京大成生物工程有限公司 | 人表皮生长因子受体Her-2/neu定量检测试剂盒及其制备方法与应用 |
| CN106442982A (zh) * | 2016-08-31 | 2017-02-22 | 扬州大学 | 一种禽白血病病毒j亚群特异抗原多肽及其应用 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| AB亚群禽白血病病毒gp85蛋白的克隆表达及其单克隆抗体的制备;吴艳，等;《中国畜牧兽医学会禽病学分会第十五次学术研讨会论文集》;20101001;第115页左栏第2行-右栏第18行 * |
| J亚群禽白血病病毒gp85基因的原核表达及间接ELISA方法建立;刘丽娜，等;《中国预防兽医学报》;20140131;第36卷(第1期);摘要，第39页左栏-第41页左栏 * |
| 检测J亚群禽白血病病毒抗体的间接ELISA方法建立和针对gp85蛋白的单克隆抗体研制;朱陈娟;《中国优秀硕士学位论文全文数据库 农业科技辑》;20130615(第6期);摘要，第5-25页 * |
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| Publication number | Publication date |
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