JP2005522405A - 改善された非特異的結合性を有するｅｃｌ標識、その使用方法及びそれを含むキット - Google Patents

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Abstract

非特異的結合を防ぐ官能基（特に、アミド結合を通じて生物学的試薬を結合させるための標準条件によって影響されない負帯電性官能基）を示すビピリジン配位子又はフェナントロリン配位子がこれらの配位子を含む発光性金属錯体として記載される。これらの配位子を含む発光性ルテニウム及びオスミウム錯体の電気化学発光アッセイにおける使用によれば、これらの標識の使用は、非特異的結合を減少させる官能基を示さない類似の標識で標識された試薬を使用して行なったアッセイと比較して、観察される非特異的結合の量を著しく低減できることを示す。

Description

以下の発行済特許が言及される：米国特許番号第５，３１０，６８７号；第５，５９１，５８１号；第５，５９７，９１０号；第５，７０５，４０２号；第５，８４６，４８５号；第６，０６６，４４８号；第６，２１４，５５２号；及び６，２０７，３６９号。これらの参考文献の各々の開示は、参照によって本明細書に組み込まれる。
本発明は標識、好ましくは、アッセイに使用する含金属標識に関する。本発明は、特に、標識された物質の他の材料への非特異的結合（「ＮＳＢ（ｎｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｂｏｎｄｉｎｇ）」）を防ぐ親水性基及び／又は帯電基で置換された配位子を有する金属標識に関する。本発明はまた、これらの標識を使用するアッセイ、好ましく発光アッセイを行なう方法、並びにこれらの標識を含むキット及び組成物に関する。
本願で引用する文書は、本発明が関係する最新の技術水準に関する。これらの参考文献の各開示は、参照によって本明細書に組み込まれる。
電気化学発光（ＥＣＬ：Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）検出は重要な分析技術となっており、一般的な分析や診断手続きに用いられている。電気化学発光は電気的に生成される種と光の放射を利用する。例えば、電気化学発光は、１又は複数の反応物が電気化学的に生成し、１又は複数の化学反応を経て（好ましくは繰り返し）光放射する種を生じるプロセスによって生成する発光を利用するものがある。
実際上、ＥＣＬに基づくアッセイの大半は、電気化学発光化合物の標識としての使用を伴っている。ＥＣＬ標識からの電気化学発光の検出によって、標識された物質の存在又は標識された物質の結合反応への参加を測定する。対象とする分析成分に特異的な標識された結合試薬の使用に基づく分析成分のアッセイは、性質上均一系でも可能であるし（米国特許第５，５９１，５８１号明細書及び国際公開第８７／０６７０６号パンフレットを参照）、磁気粒子（米国特許第５，７０５，４０２号明細書を参照）や電極表面（米国特許第６，０６６，４４８号明細書及び米国特許第６，２０７，３６９号明細書並びに国際公開第９８／１２５３９号パンフレットを参照）などの固相上で起こる結合反応を利用するものでもよい。
ＥＣＬ標識の重要なクラスは、米国特許第５，３１０，６８７号明細書；米国特許第５，５９７，９１０号明細書；及び米国特許第５，５９１，５８１号明細書及び国際公開第８７／０６７０６号パンフレットに記載されているような、１又は複数の多座含窒素複素環配位子（例えばビピリジン、フェナントロリン、ビピラジン、ビピリミジンなど又はそれらの置換された誘導体）を有するルテニウム、オスミウム又はレニウムの有機金属錯体である。これらのタイプの標識（特に、トリス−ビピリジルルテニウム錯体に基づく標識）は、その安定性及びそれらがＥＣＬを生じる効率のために広く使用されている。
商用のＥＣＬの実施では、典型的には、トリプロピルアミンなどのＥＣＬ共反応物の存在下に標識を酸化させることにより、これらの標識からのＥＣＬを生じさせる。ＥＣＬ共反応物も電極で酸化されて強い還元剤（例えば米国特許第５，８４６，４８５号明細書参照）を生じる。還元剤と酸化された標識の非常に活発な反応によって標識は還元され発光励起状態に励起される。光子の放射により、標識はその元の状態に再生されるとともに標識が検出される。
電気化学発光は非常に鋭敏な検出技術である。しかし、検出技術の感度は多くの場合、特定のアッセイにおける感度の決定的な要因ではない。標識された結合試薬と結合相手（例えば分析成分）の間の特異的結合相互作用を利用するアッセイでは、感度は、しばしば、標識された結合試薬が結合相手以外の物質（例えば、粗製試料中の他の成分、他のアッセイ試薬、あるいは固相結合アッセイの場合には固相自体）への非特異的結合（ＮＳＢ）に起因するバックグラウンド信号によって制限される。場合によっては、ＮＳＢにより容器表面やピペット上などで試薬が失なわれて信号の低下がもたらされることもある。ＥＣＬ標識は一般に、他の種類の標識と比べＮＳＢ特性が良好であるが、ある条件の下では、ＮＳＢがアッセイ感度の制限要因となり得る。これは、例えば、ｉ）それ自身が高レベルのＮＳＢを示す結合試薬を標識して用いるＥＣＬアッセイ；ｉｉ）多数の標識で標識された結合試薬を使用するＥＣＬアッセイ及びｉｉｉ）低濃度のＮＳＢブロッカー（ブロッキングタンパク質又は界面活性剤）を使用するか、そのようなブロッカーを用いずに行なうＥＣＬアッセイにおいて起こる。
本発明は少なくとも１つ、好ましくは２つの置換基を有する置換されたビピリジン類及びフェナントロリン類であって、置換基が負帯電基、好ましくはスルフェート基又はスルホネート基を含むものに関する。これらの置換されたビピリジン類及びフェナントロリン類は、金属錯体中の配位子として存在する場合、類似の非置換ビピリジン類及びフェナントロリン類に比べ錯体のＮＳＢを低減させる。さらに、本発明はそのような配位子を含む有機金属錯体、及びそれらの有機金属錯体を含む標識されたアッセイ試薬に関する。
本発明はまた、構造：
ＭＬ1Ｌ2 2
（ここで、
ＭはＯｓ又はＲｕであり；
Ｌ1は、下記Ｌ2と同様であるか、ｉ）生体物質及び／若しくはアッセイにおいて有用なアッセイ試薬又はｉｉ）生体物質及び／若しくはアッセイにおいて有用なアッセイ試薬との反応に参加してそうした共有結合による連結を形成し得る部分と共有結合により連結される少なくとも１つの置換基を有する置換されたビピリジン又はフェナントロリン配位子であり；
Ｌ2は、負帯電基、好ましくはスルフェート基又はスルホネート基を含む置換されたビピリジン又はフェナントロリン配位子であり、前記基は、Ｌ2が非置換ビピリジン又はフェナントロリンである類似の錯体と比べ錯体のＮＳＢを低減するように作用するものである。あるいは、Ｌ2は、中性の親水性基、好ましくは水酸基又はカルボキサミド、又は正帯電基、好ましくはグアニジニウム（ｇｕａｎｉｄｉｎｉｕｍ）基を含む置換されたビピリジン又はフェナントロリン配位子である）を有する発光性金属錯体に関する。
本発明はまた、構造：
ＭＬ1Ｌ2 2
（ここで、
ＭはＯｓ又はＲｕであり；
Ｌ2は、下記からなる群から選択される金属配位子であり

Figure 2005522405
（ここで、
Ｔは、アルキル、アルケニル、アルキニル若しくはフェニル連結基又はそれらの組み合わせを含む連結基であり、場合によっては、１つ又は複数の鎖炭素は複素原子によって置換されていてもよく；
Ｚは、−ＳＯ3 -、−ＳＯ3Ｈ、−ＯＳＯ3 -、−ＯＳＯ3Ｈ、−ＰＯ3 2-、−ＰＯ3Ｈ-、−ＰＯ3Ｈ2、−ＯＰＯ3 2-、−ＯＰＯ3Ｈ-、−ＯＰＯ3Ｈ2、−ＯＰ（Ｒ）Ｏ2 -、−ＯＰ（Ｒ）Ｏ2Ｈ、−[ＮＨＣ（ＮＨ2）2]+、又は、−ＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨ2であり；
Ｒは、アルキル基である）；
Ｌ1は、ｉ）生体物質及び／若しくはアッセイにおいて有用な結合試薬又はｉｉ）生体物質及び／若しくはアッセイにおいて有用な結合試薬との反応に参加してそうした共有結合による連結を形成し得る部分と共有結合により連結される少なくとも１つの置換基を有する置換されたビピリジン又はフェナントロリン配位子であり；Ｌ1は、好ましくは、下記からなる群から選択される金属配位子であり
Figure 2005522405
（ここで、Ｘは、アルキル、アルケニル、アルキニル若しくはフェニル連結基又はそれらの組み合わせを含む連結基であり、場合によっては、１つ又は複数の鎖炭素は複素原子によって置換されていてもよく；
Ｙは、Ｈ又はアルキルであり、
Ｗは、生体分子、結合試薬、酵素基質又は他のアッセイ試薬に連結される官能基であるか、又はＷは、配位子上に存在する場合、配位子を、生体分子、結合試薬、酵素基質又は他のアッセイ試薬に結合（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）させるのに適する官能基である）を有する発光性金属錯体に関する。
本発明はまた、本発明の１つ又は複数の金属錯体、好ましくは発光性金属錯体を連結させた標識された材料に関する。１つの実施形態では、本発明は、構造［Ａ］ｉ［Ｂ］ｊ（ここで、Ａは本発明の発光性金属錯体であり、Ｂは１つ又は複数のＡに共有結合により連結される物質（好ましくは生体物質及び／又はアッセイにおいて有用なアッセイ試薬）であり、ｉは０より大きな整数であり、ｊは０より大きな整数（好ましくは１）である）を有する標識された材料に関する。好ましくは、Ａは上に記載した構造ＭＬ1Ｌ2 2を有する金属錯体であり、ＡとＢは、Ｌ1上の官能基を介して共有結合により連結される。
本発明はまた、発光を生成させるための本発明の発光性金属錯体の使用に関する。錯体は、光ルミネッセンス（ｐｈｏｔｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）強度、時間分解光ルミネッセンス、発光エネルギー移動、発光消光、発光寿命、発光分極、化学発光又は好ましくは電気化学発光の測定に基づくアッセイなどの発光に基づくアッセイで使用できる。本発明はまた、電気化学アッセイ（つまり、錯体の酸化又は還元に伴う電流又は電圧の測定を含むアッセイ）などの非発光性アッセイにおける本発明の錯体の使用を含み、電気化学アッセイには、金属錯体を酸化還元（ｒｅｄｏｘ）標識として用いる電気化学アッセイや金属錯体を分析成分（例えば、ＤＮＡ）の酸化還元測定のために酸化還元反応媒介剤として用いる電気化学アッセイを含む。好ましくは、本発明の金属錯体の使用は、低ＮＳＢ官能基を示さない同様の錯体に比べ錯体の非特異的結合が低いことからアッセイ性能の改善をもたらす。
本発明はまた、ｉ）標識された材料を結合試薬及び場合により固相支持体と接触させるステップ；ｉｉ）結合試薬、標識された材料及び場合により固相支持体を含む結合錯体を形成するステップ；（ｉｉｉ）標識された材料を誘導して信号、好ましくは発光、より好ましくは、ＥＣＬを生じさせるステップ；及びｉｖ）信号を測定することにより発光性金属錯体を測定するステップを含む本発明の標識された材料の測定方法に関する。好ましくは、本発明の金属錯体の使用は、低ＮＳＢ官能基を示さない同様の錯体に比べ錯体の非特異的結合が低いことからアッセイ性能の改善をもたらす。
本発明はまた、ｉ）試料を標識された結合試薬及び場合により固相支持体と接触させるステップ；ｉｉ）結合試薬、分析成分及び場合により固相支持体を含む結合錯体を形成するステップ；ｉｉｉ）標識された結合試薬中の標識を誘導して信号、好ましくは発光、より好ましくはＥＣＬを生じさせるステップ及び；ｉｖ）信号を測定することにより試料中の分析成分を測定するステップを含み、ここで、標識された結合試薬は、分析成分に特異的な結合試薬に共有結合により連結した上記低ＮＳＢ標識の１つ又は複数を含む、試料中の分析成分の測定方法に関する。好ましくは、本発明の標識の使用は、低ＮＳＢ官能基を示さない同様の標識に比べ標識の非特異的結合が低いことからアッセイ性能の改善をもたらす。
本発明はまた、ｉ）試料を標識された分析成分類似体、結合試薬及び場合により固相支持体と接触させるステップ；ｉｉ）標識された分析成分類似体、結合試薬、及び場合により固相支持体を含む結合錯体を形成するステップ；ｉｉｉ）標識された分析成分類似体中の標識を誘導して信号、好ましくは発光、より好ましくはＥＣＬを生じさせるステップ及び；ｉｖ）信号を測定することにより試料中の分析成分を測定するステップを含み、ここで、標識された分析成分類似体は、分析成分類似体に共有結合により連結した上記低ＮＳＢ標識の１つ又は複数を含み、前記標識された分析成分類似体が結合試薬への結合に関し分析成分と競合する、試料中の分析成分の測定方法に関する。好ましくは、本発明の標識の使用は、低ＮＳＢ官能基を示さない同様の標識に比べ錯体の非特異的結合が低いことからアッセイ性能の改善をもたらす。
本発明はまた、ｉ）分析成分又は化学的若しくは生物活性を含む試料（又はそうした活性の基質若しくは生成物を含む試料）を本発明の低ＮＳＢ金属錯体に接触させるステップ；ｉｉ）金属錯体を誘導して信号、好ましくは発光、より好ましくはＥＣＬを生じさせるステップ及び；ｉｉｉ）信号を測定することにより化学的又は生物活性を検出又は測定するステップを含む試料中の分析成分又は化学的若しくは生物活性を測定する方法に関する。
本発明はまた、金属錯体又は金属錯体上の配位子を、本発明の低ＮＳＢ標識又は配位子に置き換えることにより、金属錯体を使用する既存のアッセイを改善する方法に関する。
本発明は、さらに、本発明の低ＮＳＢ配位子及び金属錯体を含むキット及び組成物に関する。
本発明は、対象とする分析成分の測定のためにアッセイで使用する改善された標識に関する。本明細書で使用する場合、「測定」という単語及び「測定する」という動詞形は、定量的測定と定性的測定の両者を指す。「測定」は、１又は複数の閾値又は基準に対する量的な比較及び何らかのものの存在及び／又は事象の発生（例えば溶液中での分析成分や標識の存在又は発光の放射）を検出するために行なわれる測定を含むと理解される。本発明の１つの好適実施形態は、ＥＣＬアッセイにおける標識として有用な発光性有機金属化合物錯体に関する。錯体は、１つ又は複数の置換されたフェナントロリン又はビピリジン金属配位子、配位子の非特異的結合を防ぐ置換基を有する金属配位子（そのような配位子を、以下、低ＮＳＢ配位子という）の少なくとも１つを含む。好ましい低ＮＳＢ置換基は負帯電基を含む。負帯電基は、水中で脱プロトンして負帯電状態となり得る中性基又は正帯電基（つまり、０と１４の間のｐＫａを有する）を含むと理解される。適当な負帯電基はカルボキシレート、ホスフェート、ホスホネート、スルフェート及びスルホネート（及びそれらのプロトン化形）を含む。好ましくは、負帯電基は、アミド結合を通じてアミン及びカルボン酸を結合（ｃｏｕｐｌｅ）するために使用される条件下では反応しない。好ましい負帯電基はスルフェート及び最も好ましくはスルホネート基を含む。これらは安定性が高く、ｐＫａが低く、及びアミンとカルボン酸と結合（ｃｏｕｐｌｅ）してアミド結合を形成するのに用いる条件及び試薬に相対的に影響されにくいからである（例えば、金属錯体の１つの配位子上にスルホネートがあっても、これは、別の配位子上のカルボン酸をカルボジイミドを使用してアミン含有試薬と連結させることを妨害しない）。カルボジイミドなどのカルボン酸活性化試薬と反応するが、ホスフェートとホスホネートも有用である。これらの反応が水性条件下で生じる場合、これらの反応の生成物は多くの場合不安定で、結合（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）反応の最終結果に影響しないからである。本発明の別の実施形態では、ビピリジン配位子又はフェナントロリン配位子は、中性の親水性基、好ましくは水酸基若しくはカルボキサミド、又は正帯電基、好ましくはグアニジニウム基で置換される（そのような配位子もアミド結合を形成するために使用する標準条件では影響されないため最も好ましく選択される）。
配位子を含む有機金属錯体は、非置換ビピリジン類又はフェナントロリン類を含む同様の有機金属錯体に比べて相対的に低い非特異的結合を与えるが、標識ベースで同等（２倍以内）又はそれ以上のＥＣＬ信号を与えるように、配位子の設計がなされる。負帯電基は、好ましくは、フェナントロリン環又はビピリジン環に直接には連結されず、アルキル、アルケニル、アルキニル及び／又はフェニル連結基などの連結基を介して結合（ａｔｔａｃｈ）させたものであり、これにより、配位子を含む有機金属錯体のＥＣＬ特性に有害な効果（例えば、酸化還元反応の特性、発光の量子効率、励起状態のエネルギー又は標識安定性への影響による）を及ぼさない。これらの連結基は連結鎖中又は置換基として複素原子を含み得るが、これらの複素原子は好ましくは、ビピリジン環やフェナントロリン環に直接結合するものではない（例えば、アルキル連結鎖中の炭素を酸素で置換して１つ又は複数のアルキルエーテル結合又はオリゴ−エチレングリコール連結基を形成することができる）。好ましい連結基はフェニル及びアルキル基である。短い（１〜５個の炭素）アルキル基は、ＥＣＬに対するその影響が比較的小さく、タンパク質に付着する有機金属標識に組み入れられた場合、タンパク質をアンフォールドしたり変性する能力が相対的に乏しいため、特に好ましい。１個の炭素の連結基は、低ＮＳＢ官能基からビピリジン部分又はフェナントロリン部分を遮るとともに、疎水性表面領域の追加をもたらさず、標識の有効体積を実質的に増加させないので、最も好ましい。
配位子は、ビピリジル配位子に対して好ましくは５位及び５’位、最も好ましくは４位及び４’位で二置換されるか、フェナントロリル配位子に対して好ましくは３位及び８位、最も好ましくは４位及び７位で二置換される。金属錯体では、これらの位置は溶媒が最もアクセスし易く、立体的な込み合いが少ないからである。４位及び４’位で置換されたビピリジン類及び４位及び７位で置換されたフェナントロリン類についての低ＮＳＢ配位子の典型例を下に示す。他の置換パターンは示さないが、同様に定義できる。
Figure 2005522405
（ここで、Ｔは連結基であって、好ましくはアルキル、アルケニル、アルキニル若しくはフェニル連結基又はそれらの組み合わせであり、場合によっては、１つ又は複数の鎖炭素は複素原子によって置換されていてもよく；
Ｚは、−ＳＯ3 -、−ＳＯ3Ｈ、−ＯＳＯ3 -、−ＯＳＯ3Ｈ、−ＰＯ3 2-、−ＰＯ3Ｈ-、−ＰＯ3Ｈ2、−ＯＰＯ3 2-、−ＯＰＯ3Ｈ-、−ＯＰＯ3Ｈ2、−ＯＰ（Ｒ）Ｏ2 -、−ＯＰ（Ｒ）Ｏ2Ｈ、−[ＮＨＣ（ＮＨ2）2]+、又は、−ＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨ2であり；
ｎは、整数、好ましくは１〜５であり、最も好ましくは１であり、
Ｒは、アルキル、好ましくはメチルである）。
本発明は、金属原子、例えば、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｒｕ、Ｒｈ、Ｐｄ、Ａｇ、Ｒｅ、Ｏｓ、Ｉｒ、Ｐｔ、Ｆｅ、Ｔｃ、Ｃｒ、Ｍｏ及びＷにキレートする前記低ＮＳＢ配位子の１つを含む有機金属錯体に関する。このような錯体の重要なクラスは、Ｒｕ及びＯｓの発光性ＥＣＬ活性錯体、好ましくはＲｕ（ＩＩ）又はＯｓ（ＩＩ）酸化状態にあるものである。本発明は式ＭＬ2 3を有する錯体を含み、ここで、Ｌ2は本発明の低ＮＳＢ配位子であり、Ｍは、Ｒｕ及びＯｓ、好ましくはＲｕ（ＩＩ）又はＯｓ（ＩＩ）酸化状態にある。本明細書で使用する場合、ＭＬ2 3やＭＬ1Ｌ2 2などの記法は、錯体が全体として正味の電荷（配位子の帯電状態及び金属の酸化状態によって決定される）を有することを排除せず、錯体が対イオンと結びついて全体としては電荷のない組成物を形成してもよいことが理解される。ＭＬ2 3タイプの錯体は、遊離の未結合（ｕｎｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）ＥＣＬ活性化合物（例えば米国特許第５，６４１，６２３号明細書参照）を使用し、ほとんどの電極表面に対する錯体の吸着を低減すべき用途において特に有用である。
標識としてＥＣＬ活性な錯体を使用する応用例において、特に有用な種類は式ＭＬ1Ｌ2 2を有し、ここでＭはＲｕ又はＯｓ（好ましくはＲｕ（ＩＩ）又はＯｓ（ＩＩ）の酸化状態）であり、Ｌ2は上に記載した低ＮＳＢ配位子であり、Ｌ1は、生体分子、結合試薬、酵素基質又は他のアッセイ試薬に共有結合により連結する（つまり、標識された試薬を形成し、ここで、「標識」は標識された試薬の金属錯体成分を指す）置換されたビピリジン又はフェナントロリンであるか、あるいは、生体分子、結合試薬、酵素基質又は他のアッセイ試薬に共有結合可能で標識された試薬を形成する置換基を有する。そのような配位子は本明細書で使用する場合、連結配位子ともいう。生体物質は、本明細書では、生物学的起源の材料又は合成された類似物を指し、例えば、アミノ酸、ヌクレオシド、ヌクレオチド、タンパク質、ペプチド（及びペプチドミメティクス）、核酸（及び修飾塩基や非天然の結合を有する類似体（例えば、ＰＮＡ））、ホルモン、ビタミン、糖、セカンドメッセンジャー、多糖、ステロイド、脂質、リン脂質、細胞、細胞器官、細胞レベル以下の断片、ウィルス、プリオンなどである。結合試薬は、他の材料との特異的結合相互作用に参加し得る試薬である。結合試薬の例は次のものを含む：酵素、抗体（及びその断片）、レセプター、生物学的レセプターの配位子、金属配位子、核酸、核酸インターカレーター（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｏｒ）、核酸の主溝及び副溝への結合分子、ハプテン、アビジン、ストレプトアビジン、ビオチン、精製タグ（例えば、ＦＬＡＧ、ｍｙｃ、グルタチオンＳ転移酵素、Ｈｉｓタグなど）、精製タグへの結合相手（例えば、特異的抗体、グルタチオン、ニトリロ三酢酸、イミノ二酢酸など）など。酵素基質は、酵素触媒反応において変換される分子を含み、補因子、酵素によって連結されるか開裂される核酸及び酵素によって連結されるか開裂されるペプチドを含む。
配位子上に存在する際、生体物質、結合試薬、酵素基質又は他のアッセイ試薬に配位子を結合（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）させるのに適する官能基の例は、結合化学（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）の技術分野で知られた官能基を含み、例えば、アミン、チオール、ヒドラジド、カルボン酸、活性化されたカルボン酸（例えば、塩化アシル、及びＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルなどの活性なエステル）、水酸基、ハロゲン化アルキル、イソシアナート、イソチオシアナート、塩化スルホニル、活性化されたホスフェート、ホスホネート又はホスホルアミダイト（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅｓ）、アルケン、アルキン、活性なカーバメート及びカーボネート、アルデヒド、ケトン、マレイミド、ジスルフィド、α，β−不飽和カルボニル、及びハロゲン化物、メシル、トシル、トレシルなどの脱離基に結合した炭素などである。試薬への結合標識（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｎｇ ｌａｂｅｌ）のための有用な官能基及び有用な結合技術（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｎｇ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）についてのさらに詳しい情報に関しては、Ｇ．ハーマンソン（Ｇ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ）、Ａ．マリラ（Ａ．Ｍａｌｌｉａ）及びＰ．スミス（Ｐ．Ｓｍｉｔｈ）「固定化された親和性配位子技術（Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｌｉｇａｎｄ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）」（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，１９９２））、及びＧ．ハーマンソン（Ｇ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ）「バイオコンジュゲート技術（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）」（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，１９９６））（これらは参照によって本明細書に組み込まれる）を参照されたい。好ましい官能基はアミン、カルボン酸、活性なエステルであり、好ましくはＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを含む。好ましくは、これらの官能基は、ＥＣＬに対する官能基の影響を限定的にするため、アルキル、アルケニル、アルキニル及び／又はフェニル基を含む連結基鎖を介してビピリジン環又はフェナントロリン環に連結される。これらの連結基は、連結鎖又は置換基中に複素原子を含んでもよいが、これらの複素原子は、好ましくは、ビピリジン環又はフェナントロリン環には直接接合されない（例えば、アルキル連結鎖中の炭素を酸素と置換してアルキルエーテル又はオリゴ（エチレングリコール）連結基を形成してもよい）。配位子は、ビピリジル配位子に対して好ましくは５位及び／又は５’位、最も好ましくは４位及び／又は４’位で置換されるか、フェナントロリル配位子に対して好ましくは３位及び／又は８位、最も好ましくは４位及び／又は７位で置換される。金属錯体では、これらの位置は立体的な込み合いが少ないからである。適当な連結配位子の例を下に示す。ビピリジンに対して４位及び４’位又はフェナントロリンに対して４位及び７位で置換された配位子を示すが、他の置換パターンを有する配位子構造も類推によって明らかである。
Figure 2005522405
（ここで、
Ｘは、連結基であって、好ましくはアルキル、アルケニル、アルキニル若しくはフェニル連結基又はそれらの組み合わせであり、場合によっては、１つの鎖炭素は複素原子によって置換されていてもよく；
Ｙは、Ｈ又はアルキル、好ましくは−ＣＨ3であり
Ｗは、結合試薬、生体分子、酵素基質又は他のアッセイ試薬に連結される官能基又は配位子上に存在する場合は生体物質、結合試薬、酵素基質又は他のアッセイ試薬を配位子に結合（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）させるのに適する官能基であり、
ｍは整数、好ましくは１〜５である）。
本発明のいくつかの実施形態において、本発明の標識は別の物質（例えば、生体物質、結合試薬、酵素基質又は他のアッセイ試薬）に共有結合により連結され、又はその物質の測定を可能にする標識として使用される。好ましい実施形態は、構造［Ａ］ｉ［Ｂ］ｊ（ここで、Ａは本発明の発光性金属錯体であり、Ｂは１つ又は複数のＡに共有結合により連結される物質（好ましくは生体物質、結合試薬、酵素基質又は他のアッセイ試薬）であり、ｉは０より大きな整数であり、ｊは０より大きな整数（好ましくは１）である）を有する標識された材料に関する。共有結合による連結は、結合化学（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ｃｈｅｍｉｓｔｙ）の技術分野で知られた種々の共有結合による連結によって備えることができ、例えば、アミド結合、アミン連結、エーテル、チオエーテル、カーバメート、尿素、チオ尿素、シッフ塩基、炭素−炭素結合、エステル、リン酸エステル、スルホンアミドなどである。最も好ましくは、Ａは構造ＭＬ1Ｌ2 2（ここで、ＭはＲｕ又はＯｓ（好ましくはＲｕ（ＩＩ）又はＯｓ（ＩＩ）の酸化状態）であり、Ｌ2は上に記載した本発明の低ＮＳＢ配位子であり、ＡとＢは、上に記載する連結配位子Ｌ1上の官能基によって共有結合により連結される）を有する金属錯体である。本発明の別の実施形態は、構造ＭＬ1Ｌ2 2（ここでＭはＲｕ又はＯｓ（好ましくはＲｕ（ＩＩ）又はＯｓ（ＩＩ）の酸化状態）であり、Ｌ2は本発明の低ＮＳＢ配位子であり、Ｌ1は、別の物質（好ましくは、生体分子、結合試薬、酵素基質又は他のアッセイ試薬）に共有結合により連結される）を有する標識された物質に関する。発明のこの態様による適当なＬ1の例を下に示す。ビピリジンに対して４位及び４’位又はフェナントロリンに対して４位及び７位で置換された配位子を示すが、他の置換パターンを有する配位子構造も類推によって明らかである。
Figure 2005522405
（ここで、
Ｘは、連結基であって、好ましくはアルキル、アルケニル、アルキニル若しくはフェニル連結基又はそれらの組み合わせであり、場合によっては、１つの鎖炭素は複素原子によって置換されていてもよく；
Ｙは、Ｈ又はアルキル、好ましくは−ＣＨ3であり
Ｂは、物質、好ましくは生体分子、結合試薬、酵素基質又は他のアッセイ試薬であり、
Ｗは、Ｂに連結される官能基であり、
ｍは整数、好ましくは１〜５である）。
本発明のさらなる実施形態は、本発明の低ＮＳＢ配位子を含む発光性Ｒｅ（Ｉ）錯体、例えば、Ｒｅ（Ｉ）（ＣＯ）3Ｌ3Ｌ2（ここで、Ｌ2は上に定義される本発明の低ＮＳＢ配位子、好ましくは負帯電基を示するもの、より好ましくはスルフェート基を示するもの、最も好ましくはスルホネート基を示するものであり、Ｌ3はハロゲン化物イオン、ＣＯ、有機イソニトリル、アルキニル基、窒素を含む複素環式化合物、ピリジン又は置換ピリジンなどのＲｅの１価の配位子である。）を含む好ましくは、Ｌ3は生体分子、結合試薬、酵素基質又は他のアッセイ試薬に連結されるＲｅの１価の配位子又は配位子上に存在する場合は生体物質、結合試薬、酵素基質又は他のアッセイ試薬を配位子に結合（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）させるのに適する官能基である（これらの試薬、結合及び官能基はＲｕ及びＯｓの錯体について記載した特性を有する）。Ｌ3は最も好ましくは置換イソニトリル又はピリジンであり、ピリジンは好ましくは３位又は４位で置換されたものである。
本発明の標識及び標識された材料は、金属錯体、好ましくは発光金属錯体を使用する広い種類の知られたアッセイフォーマット（光ルミネッセンス強度、時間分解光ルミネッセンス、発光エネルギー移動、発光消光、発光寿命、発光分極、化学発光又は好ましくは電気化学発光の測定に基づくアッセイ）において有用である。ＥＣＬ分析を行なう方法の例については、米国特許第５，５９１，５８１号明細書；米国特許第５，６４１，６２３号明細書；米国特許第５，６４３，７１３号明細書；米国特許第５，７０５，４０２号明細書；米国特許第６，０６６，４４８号明細書；米国特許第６，１６５，７０８号明細書；米国特許第６，２０７，３６９号明細書；及び米国特許第６，２１４，５５２号明細書及び国際公開第８７／０６７０６号パンフレット及び国際公開第９８／１２５３９号パンフレットを参照されたい。これらの参考文献は、参照によって本明細書に組み込まれる。好ましくは、本発明の発光性金属錯体の使用は、低ＮＳＢ官能基を示さない同様の錯体に比べて錯体の非特異的結合性が低いことから改善されたアッセイ性能をもたらす。好ましくは発光性金属錯体の使用は、所与のアッセイにおいて非特異的信号対特異的信号の比率で２倍以上、より好ましくは５倍以上の改善をもたらす。
いくつかの応用例では、本発明の発光性金属錯体を標識又は結合試薬として使用することで、酵素基質などのアッセイ試薬又は結合試薬のモニタリングが可能となる。我々は、本発明の発光性金属錯体（特に負帯電基を示す錯体）で標識された試薬が、低ＮＳＢ官能基を示さない同様の錯体で標識された試薬に比べて非特異的結合の著しい減少を示すことを見出した。本発明の発光性金属錯体の使用は、ブロッキング試薬の必要条件を著しく小さくし、非特異的結合を減少させ、容器及び流体ラインの表面における試薬の損失を減少させ、標識された結合試薬の相互作用が非特異的であることによる非特異的信号を減少させる。試薬（例えば、抗体及び他のタンパク質）が多数の標識に連結される場合、これらの効果は最も顕著である。我々は、４〜７、７〜１０、１０〜１５、１５〜２０及び２０を超える標識に連結した試薬を調製したが、非特異的結合が観察されたのはわずかであった。試薬当たり標識の数をより大きくすることによって、アッセイ信号は（低ＮＳＢ官能基を示さない発光性金属錯体を使用するアッセイに比べ）、２〜５倍、５〜１０倍増加し、同時に非特異的信号に対する特異的信号の比率は同等に維持されるか著しく改善された。あるいは、同等な特異的信号で与える条件下で、非特異的信号に対する特異的信号の比率が大きく改善される。
多数のアッセイフォーマットでは、分析成分又は活性の測定を、標識された試薬が溶液相と固相支持体部分に分離することに結び付けるために固相支持体を使用する。例としては、材料とその特異的結合相手（このペアの一方は固相支持体上に固定化されているか固定化され得る）の錯体の形成、サンドイッチ錯体（固相支持体上に固定化されているか固定化され得る捕捉試薬を含む）の形成、１つの結合相手に対する２つの競合体の競合（結合相手又は競合体の一方は固相支持体上に固定化されているか固定化され得る）、固相支持体上に固定化されているか固定化され得る試薬からの標識（又は標識された材料）の酵素的又は化学的開裂、又は固相支持体上に固定化されているか固定化され得る試薬への標識（又は標識された材料）の酵素的又は化学的付着が含まれる。分析成分又は活性の量は固相支持体中及び／又は溶液中の標識の量の測定により決定され、測定は典型的には表面選択的な技術、溶液選択的な技術によって、又は２相の分離の後に行なわれる。「固定化され得る」という用語は、本明細書で使用する場合、溶液中での反応に参加し、続いて、検出ステップの間に、又はそのステップに先立って固相上に捕捉され得る試薬を指す。例えば、試薬は、固相上に固定化されている試薬の特異的結合相手を使用して捕捉され得る。あるいは、試薬は捕捉部分に連結され、捕捉部分の特異的結合相手は固相上に固定化されている。有用な捕捉部分−結合相手対の例は、ビオチンストレプトアビジン（又はアビジン）、抗体−ハプテン、レセプター−リガンド、核酸−相補的核酸などを含む。
固相結合アッセイでは、標識された試薬が非特異的に固相上に結合しないことが特に重要である。そうした結合は、非特異的信号をもたらし、アッセイの感度を著しく弱める可能性があるからである。我々は、磁気粒子を固相支持体として用いたＥＣＬアッセイ及び電極を固相支持体として用いたＥＣＬアッセイにおいて、本発明の標識で標識された試薬を試験した。どちらの場合も、低ＮＳＢ官能基を示さない標識を使用したアッセイと比較すると、本発明の標識を使用したアッセイは、より多く標識した試薬（例えば、１試薬当たり４〜７、７〜１０、１０〜１５、１５〜２０及び２０を超える標識）で作用を最適化でき、より高い信号（例えば、２〜５倍、５〜１０倍以上の改善）を与え、非特異的信号に対して高い比率で特異的信号を生じた（例えば、１〜２倍、２〜５倍、又は５倍を超える改善）。本発明の標識は、標識及び標識された試薬が、固相アッセイの支持体として使用される炭素含有電極及び／又はＥＣＬを誘導するための電極に非特異的に結合することを防ぐ点で特に有益であることが分かった。そのような電極は、炭素フィブリル又はその他の炭素粒子を含む電極（例えば、炭素フィブリルや炭素粒子を重合体マトリックス中に分散して含有するプラスチック複合電極）を含む。支持体上に支持された炭素インクの薄層を含む電極上で実行したアッセイにおいても有益な結果が観察された（「発光試験測定用のアッセイプレート、読み取りシステム及び方法（”Ａｓｓａｙ Ｐｌａｔｅｓ，Ｒｅａｄｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ Ｔｅｓｔ Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ”）」と題する本願と同一日付で出願され係属中の出願＿＿＿＿＿に記載。なお、これは参照により本明細書に組み込まれる）。
本発明の別の態様は、アッセイ、好ましくは発光アッセイ、より好ましくは電気化学発光アッセイを行なう際に使用されるキットであって、本発明の配位子及び／又は金属錯体及び以下のもの：（ａ）少なくとも１つの電気化学発光共反応物；（ｂ）１つ又は複数の結合試薬；（ｃ）１つ又は複数のｐＨ緩衝剤；（ｄ）１つ又は複数のブロッキング試薬；（ｅ）１つ又は複数の保存剤；（ｆ）１つ又は複数の安定化剤；（ｇ）１つ又は複数の酵素；（ｈ）１つ又は複数の酵素基質；（ｉ）１つ又は複数の磁気粒子；（ｊ）１つ又は複数のＥＣＬ誘導に適した電極及び（ｋ）１つ又は複数の界面活性剤からなる群から選択される少なくとも１つのアッセイ成分を含むキットに関する。好ましくは、前記アッセイ成分の少なくとも１つは、本発明の配位子又は金属錯体に共有結合により連結される。
好ましくは、キットは、本発明の配位子及び／又は金属錯体及び少なくとも１つのアッセイ成分を１つ以上、好ましくは２つ以上、より好ましくは３つ以上の容器中に含む。
１つの実施形態によれば、キットは、１つ又は複数の容器中に本発明の配位子及び／又は金属錯体並びにアッセイ成分の１つ又は複数を乾燥した形態で含む。
１つの実施形態によれば、本発明の配位子及び／又は金属錯体とアッセイ成分は、別の容器中に入れる。
好ましい１つの実施形態は、本発明による少なくとも１つの標識と少なくとも１つの電気化学発光共反応物を含む電気化学発光アッセイを行なう際に使用するためのキットに関する。
１つの好ましい実施形態によれば、キットは、本発明の標識を含み、さらに次のもの：抗体、抗体の断片、タンパク質、酵素、酵素基質、阻害剤、補因子、抗原、ハプテン、リポタンパク質、リポサッカライド、細胞、細胞以下の成分、細胞レセプター、ウィルス、核酸、抗原、脂質、糖タンパク質、炭水化物、ペプチド、アミノ酸、ホルモン、タンパク質結合配位子、薬剤又はこれらの組み合わせから選択される少なくとも１の生物学的試薬（ｂｉｏｒｅａｇｅｎｔ）をさらに含む。
本発明の別の様相は、アッセイ実行物質に付着する本発明の金属配位子又は金属錯体を含む組成物に関する。
本発明の１つの実施形態は、試料中に存在する対象とする分析成分を検出するための組成物であって、
（ｉ）官能基を含む本発明の金属錯体及び
（ｉｉ）対象とする分析成分に結合し得るか対象とする分析成分に結合している前記官能基に連結するアッセイ実行物質
を含む組成物に関する。
好ましくは、組成物はさらに、
（ｉ）添加された対象とする分析成分又は添加された前記分析成分の類似体；
（ｉｉ）前記分析成分の結合相手又は前記類似体の結合相手；及び
（ｉｉｉ）（ｉ）又は（ｉｉ）と結合し得る反応成分
からなる群から選択される少なくとも１つの物質を含む。
さらに別の本発明の実施形態は、試料中に存在する対象とする分析成分を検出するための組成物であって、以下のものを含む。
（ａ）本発明の金属錯体及び
（ｂ）前記錯体に連結するアッセイ実行物質であって、前記アッセイ実行物質は以下のもの：
（ｉ）添加された対象とする分析成分又は添加された前記分析成分の類似体；
（ｉｉ）前記分析成分の結合相手又は前記検体の類似体の結合相手；及び
（ｉｉｉ）（ｉ）又は（ｉｉ）と結合し得る反応成分
からなる群から選択される少なくとも１つの物質を含む。
本発明のさらに別の実施形態は、アッセイ実行物質に結合する本発明の金属配位子又は金属錯体及び
（ａ）電解質；
（ｂ）対象とする分析成分又は対象とする分析成分の類似体；
（ｃ）対象とする分析成分又はその類似体の結合相手；
（ｄ）（ｂ）又は（ｃ）と反応し得る反応成分；及び
（ｅ）ＥＣＬ共反応物
からなる群から選択される少なくとも１つの他の成分を含み、但し、任意の試薬組成物中に含まれる２つの成分は保存中に互いに反応せず、意図するアッセイにおいてそれらの機能を害することがない、アッセイにおいて試薬として用いるための組成物に関する。
実施例
ＥＣＬ装置
ここに示すＥＣＬの例は、様々なＥＣＬ装置により行なった。いくつかの方法では、米国特許第５，９３５，７７９号明細書；米国特許第６，１３３，０４３号明細書；及び米国特許第６，２００，５３１号明細書に記載されるように、結合アッセイの固相支持体として磁気粒子を使用した。このようなＥＣＬ測定は、プラチナ電極上に磁気粒子を収集し、電極に電気エネルギーを印加し、放射される発光を測定することを含む。別の例では、重合体マトリックス中に分散させた炭素フィブリルを含む複合電極を、（米国特許第６，２０７，３６９号明細書及び国際公開公報第９８／１２５３９号パンフレットに記載されているようにして）結合アッセイの固相支持体及びＥＣＬ誘導用の電極の両方として使用した。上に挙げた参考文献のＥＣＬ方法及び装置の記載は、参照によって本明細書に組み込まれる。電極、装置、光検出器、検出器利得などの差のために、異なる実施例で報告したＥＣＬ信号は、直接には比較すべきではない。
配位子１の合成

Figure 2005522405
２５０ｍＬの７：３水／メタノール混合物中４，４’−ビス−ブロモメチルビピリジン（フレーザーら（Ｆｒａｓｅｒ ｅｔ ａｌ．）、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，１９９７，６２，９３１４−９３１７）１．７ｇを含む懸濁液に亜硫酸ナトリウム（１．３ｇ）を添加した。混合物を６０分間還流し、冷却し、次いで、ロータリーエバポレータによってそのもとの体積の約５０％まで濃縮した。残った水溶液を酢酸エチルの２×２０ｍＬで洗浄した。水相をロータリーエバポレータによって濃縮乾燥した。残った固形物をさらに高い真空下で乾燥させた。固形物から沸騰させた１％水／メタノール３×１００ｍＬ部分に生成物を抽出した（固形物を各部分中５分間撹拌し、ろ過により上清を回収）。ろ液を合わせ、ロータリーエバポレータによって濃縮し粗製固形生成物を生じた。生成物を水／イソプロパノールからの再結晶によって精製し、１：４水／イソプロパノール、イソプロパノール及びエーテルで洗浄したところ純粋な白色固体を生じた。典型的な収率は約５０％であるが、再結晶上清から生成物を回収することにより改善され得る。
錯体２の合成
Figure 2005522405
合成の第一段階として、アンダーソンら（Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．）（Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｓ）１９７９，７４−７５）の手順に修正を加え、配位子４−（４−メチル−２，２−ビピリジン−４’−イル）−酪酸のＲｕＣｌ3との錯体の調製を行なった。ＲｕＣｌ3水和物（０．９４ｇ）を１ＮＨＣｌ４ｍＬ及び水８ｍＬと混合し、激しく混合して溶解させた。生じた溶液を混合しつつ、配位子４−（４−メチル−２，２−ビピリジン−４’−イル）−酪酸１．０２ｇ（国際公開公報第８７／０６７０６号パンフレット）を添加した。混合物を３６時間、激しく混合したところ、この間に、配位子−ＲｕＣｌ3錯体が溶液から沈殿した。生成物懸濁液を冷却し、生成物をろ過によって回収し、１ＮＨＣｌ、水及びエーテルで洗浄し、真空下に乾燥させた。典型的な収率は約６０％であった。
生じた錯体（０．４７ｇ）を、エチレングリコール７５ｍＬ中０．７８ｇのスルホネート含有ビピリジン配位子１と混合した。溶液を還流し、生成物の形成がいつ完了したか（２．５時間未満）を決定するために４５５ｎｍでの可視吸収によってモニターした。溶媒をロータリーエバポレータ（浴温度＜１００℃を使用）によって除去し、残渣を１ＮＮａＯＨ１５ｍＬに溶解させ、錯体の形成中に生じたかもしれないすべてのエステルを加水分解するために暗所で２時間インキュベートした。溶液を１０ｍＭギ酸７５０ｍＬで希釈し、ＱＡＥ−セファデックスＡ−２５の１００ｍＬカラム（予め５００ｍＭＮａＣｌ及び１０ｍＭギ酸で平衡させ、次いで、豊富な量の１０ｍＭギ酸で洗浄した）上にロードした。１０ｍＭギ酸中０−２５０ｍＭのＮａＣｌ勾配を使用して生成物を溶出した。生成物画分はロータリーエバポレータによって濃縮した。固形生成物を冷メタノール（必要ならば少量の水を添加）５×１０ｍＬに抽出し、抽出液を濃縮し、抽出操作をもう１度繰り返して、塩の大半を除去した。次いで、生成物を、溶離剤として５：９５：０．１アセトニトリル／水／トリフルオロ酢酸を使用して、逆相シリカで精製した。逆相精製した生成物を、水約２ｍＬに溶解させ、１ＮＮａＯＨでｐＨ６〜８に調節した。生じた溶液をセファデックスＧ−１５の１００ｍＬカラムに適用し、水で溶出した。生成物画分を凍結乾燥したところ、純粋なオレンジ色の固体として生成物が生じた。典型的な収率は５０％であった。３回のクロマトグラフィーステップは、酢酸アンモニウムなどの揮発性塩勾配使用によるＱＡＥ−セファデックスＡ−２５上での１回の精製と置き換えてもよい。
錯体３の合成
Figure 2005522405
下記の操作によって錯体２をＮＨＳエステルとして活性化した。錯体２（２２ｍｇ）を１ｍＬの４０ｍＭＨＣｌに溶解させた。混合しながらＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）５．８ｍｇを添加し、続けてＮ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（ＥＤＣ）３９ｍｇを添加した。反応を室温で３０分間インキュベートし、直ちにセファデックスＧ−１５（予め水中で４℃に平衡）の３０ｍＬカラムを通し水で溶出した。生成物画分を直ちに凍らせ凍結乾燥したところ純粋なオレンジ色の固体として生成物が得られた。
配位子７の合成
Figure 2005522405
化合物４から２つの別個のアルキル化ステップで中間体５を調製した。不活性雰囲気下、乾燥ＴＨＦ６０ｍＬに４，４−ジメチル−２，２−ビピリジン１．３８ｇを含む溶液を調製し、０℃に冷却した。撹拌しながら、リチウムジイソプロピルアミン（ＬＤＡ、シクロヘキサン中１．５Ｍ溶液）５．２５ｍＬを滴下し、０℃で３０分間インキュベートした。２−（３−ブロモプロピルオキシ）テトラヒドロ−２Ｈピラン１．４ｍＬを加えて、０℃でさらに３時間インキュベートした。反応を飽和ＮＨ4Ｃｌでクエンチし、減圧下にＴＨＦを除去して濃縮した。残った水溶液を塩化メチレンで抽出した。有機画分をＭｇＳＯ4で乾燥し、濃縮し、溶離剤として４％メタノール／塩化メチレンを使用してシリカクロマトグラフィーによって精製し、９５％の収率でモノアルキル化生成物とした。モノアルキル化した生成物（１．９２５ｇ）を乾燥ＴＨＦに溶解し、最初のアルキル化のために使用した条件下に、ＬＤＡ４ｍＬ及び２−（３−ブロモプロピルオキシ）テトラヒドロ−２Ｈピラン１．０５ｍＬと反応させた。飽和ＮＨ4Ｃｌでクエンチして反応を完了し、炭酸カリウムでｐＨ約８に調整し、生成物を塩化メチレン中に抽出し、ＭｇＳＯ4で乾燥し、溶離剤として１０％酢酸エチル／ヘキサンを使用して塩基性アルミナ（活性Ｉ）を用いたクロマトグラフィーによって精製した。透析した（ｄｉａｌｙｌａｔｅｄ）中間体５の出発原料４からの全収率は７３％であった。
酸性条件下に中間体５を脱プロトンしてジオール６を得た。中間体５（１．２７７ｇ）を１７ｍＬの１ＮＨＣｌ／メタノール（１：１）に溶解させた。溶液を室温で一夜インキュベートした。濃縮水酸化アンモニウムを用いて溶液のｐＨを約９に調節し、生成物を塩化メチレン中に抽出し、ＭｇＳＯ4で乾燥し、溶離剤として３％メタノール／塩化メチレンを使用して、塩基性アルミナを用いたクロマトグラフィーによって精製した。８４％の収率でジオール６を回収した。
ジホスホン酸エステル７の調製は、ジオール６をメチルジクロロホスパイト（ｍｅｔｈｙｌｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｏｓｐｉｔｅ）と反応させることにより達成した。ピリジン約８ｍＬにジオール６（６０ｍｇ）を溶解させた。約１ｍＬの溶液を残してほとんどのピリジンを留去した。残りの溶液を、０．５ｍＬ塩化メチレン中メチルジクロロホスファイト（ｍｅｔｈｙｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｏｓｐｈｉｔｅ）１０６ｍｇを含む冷（０℃）溶液に撹拌しながら滴下した。反応を０℃で４５分間進行させた。２Ｍ炭酸カリウム２ｍＬを添加することによって反応をクエンチした。溶液をロータリーエバポレータにより濃縮乾燥した。水を添加し、蒸発を数回行なってピリジンをすべて除去した。生成物は、０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含む水の中でアセトニトリル勾配を使用して、Ｃ１８逆相カラム上のＨＰＬＣクロマトグラフィーによって精製した。
錯体８の合成
Figure 2005522405
配位子１から錯体２を調製するのに使用したのと類似の操作により、配位子７、配位子４−（４−メチル−２，２−ビピリジン−４’−イル）−酪酸及びＲｕＣｌ3から錯体８を調製した。３０％アセトニトリル／水＋０．１％ＴＦＡを溶離剤として使用した逆相シリカを用いたクロマトグラフィー、酢酸トリエチルアンモニウム勾配（ｐＨ５．５）を溶離剤として使用するＱＡＥ−セファデックスＡ２５を用いたイオン交換クロマトグラフィー、及び、水＋０．１％ＴＦＡ中アセトニトリル勾配を溶離剤として使用した逆相シリカカラムを用いて脱塩することにより精製を行い、ＴＦＡ塩を得た。
配位子９の合成
Figure 2005522405
メタノール２００ｍＬ中、４，４’−ジカルボキシ−２，２’−ビピリジンジメチルエステル１．０２ｇ含む懸濁液を加熱沸騰させ、ジメチルエステルを可能な限り溶解させた。溶液を室温まで放冷した後、溶液中にアンモニアガスを吹き込んだ。ＴＬＣが出発原料の消失を示すまで反応を進行させた。不溶な生成物９をろ過によって回収した。
錯体１０の合成
Figure 2005522405
配位子９（３００ｍｇ）をＤＭＦ中ＲｕＣｌ3水和物１６２ｍｇと混合し、一夜還流した。不溶なＲｕＬ2Ｃｌ2中間体をろ過によって回収しアセトンと水で洗浄した。中間体の一部（４９．８ｍｇ）を、約１００〜１５０ｍＬの１：１メタノール／水中、配位子４−（４−メチル−２，２−ビピリジン−４’−イル）酪酸２１．８ｍｇと混合し、一夜還流した。生じた溶液をデカンテーションして不溶な不純物を除去し、ロータリーエバポレータによって濃縮した。ＮａＣｌを飽和させたメタノールを溶離剤として使用して、シリカクロマトグラフィーによって精製を行なった。ロータリーエバポレータにより溶媒を除去した後、生成物を濃ヘキサフルオロリン酸アンモニウムに溶解した。溶液をＣ１８シリカカラムに適用した。水を使用して過剰な塩を洗い流した。次いで、アセトニトリルを使用して溶出し純粋な生成物１０（ＰＦ6塩として）を得た。
配位子１１の合成
Figure 2005522405
４，４’−ビス−ヒドロキシメチル−２，２’−ビピリジン（４，４’−ビス−カルボキシ−２，２−ビピリジンジメチルエステルを還流エタノール中、水素化ホウ素ナトリウム還元して調製した）と三酸化硫黄ピリジン錯体（ＳＯ3−ｐｙｒ）との反応によって配位子１１を調製した。ＳＯ3−ｐｙｒ（１０７ｍｇ）を０．７５ｍＬのＤＭＦ中３５．３ｍｇの４，４’−ビス−ヒドロキシメチル−２，２’−ビピリジンに添加した。１．５時間後に、生成物をクロロホルムで沈殿させ、水中に再溶解した。水溶液をクロロホルムで洗浄し、ＮａＯＨ溶液で中和し、凍結乾燥して粉状にした。Ｃ１８カラム及び０．１％ＴＦＡを含む水中でアセトニトリル勾配を使用して生成物を逆相ＨＰＬＣによって精製した。
錯体１２の合成
Figure 2005522405
ＲｕＣｌ3水和物（１１．７ｍｇ）を、４：１メタノール／水７５ｍＬ中、３７．６ｍｇの配位子１１と混合した。混合物を４時間還流した。配位子４−（４−メチル−２，２−ビピリジン−４’−イル）−酪酸（１０．３ｍｇ）を添加し、混合物を一夜還流した。溶液をろ過し、ろ液をロータリーエバポレータによって濃縮した。水中アセトニトリルの勾配を使用した逆相クロマトグラフィー、及び溶離剤としてアセトニトリル中メタノールを使用したシリカゲルクロマトグラフィーによって生成物を精製した。
錯体１３の合成

Figure 2005522405
配位子４，４’−ビス−ヒドロキシメチル−２，２’−ビピリジン（５８．７ｍｇ）を１：１メタノール／水５０ｍＬ中でＲｕＣｌ3（実施例２参照）と配位子４−（４−メチル−２，２−ビピリジン−４’−イル）−酪酸との錯体５８．１ｍｇと混合した。溶液を一夜還流した。次いで、溶液を真空下にろ過し濃縮した。生成物を５％アセトニトリル／水に溶解し、Ｃ１８シリカのカラムにロードし、６６％アセトニトリル／水で溶出した。生成物をヘキサフルオロリン酸アンモニウムを含む５％アセトニトリル／水中で再溶解し、Ｃ１８シリカ上にロードし、４０％アセトニトリル／水で溶出し、収率４５％で純粋な錯体を得た。
錯体１４の合成
Figure 2005522405
ＲｕＣｌ3水和物をＤＭＦ中２当量の４，７−ジフェニルフェナントロリンと混同し、一夜還流し、ビス−ジフェニルフェナントロリンルテニウム二塩化物中間体を黒い固形沈殿として得た。沈殿をろ過によって回収し、乾燥し、１：１ジオキサン／水中１当量の４−（４−メチル−２，２−ビピリジン−４’−イル）−酪酸と混合し、一夜還流した。０．１％ＴＦＡを含む水中でアセトニトリル勾配を使用して、Ｃ１８シリカを用いた逆相ＨＰＬＣによって生成物を精製した。
錯体１５の合成
Figure 2005522405
上に述べた錯体２の調製と類似の操作を用いて、４，７−ジフェニル−１，１０−フェナントロリンジスルホン酸（ナトリウム塩）及び［４−（４−メチル−２，２−ビピリジン−４’−イル）−酪酸］ＲｕＣｌ3から錯体１５を調製した。但し、その精製は、０．１％ＴＦＡを含む水中でアセトニトリル勾配を使用して、Ｃ１８シリカを用いた１回の逆相ＨＰＬＣによって行なった。
配位子１６の合成
Figure 2005522405
配位子４，４’−ビス−ヒドロキシメチル−２，２’−ビピリジン（１０８ｍｇ）を１：１ＴＨＦ／トルエン２０ｍＬ中のＮ，Ｎ’−ビス−ブチルオキシカルボニル−グアニジン５２０ｍｇ及びトリフェニルホスフィン３９３ｍｇと混合し、０℃に冷却した。ジイソプロピルアゾジカルボイレート（Ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌ ａｚｏｄｉｃａｒｂｏｙｌａｔｅ）（３００ｕＬ）を３０分かけて添加した。混合物を０℃３時間及び室温で３時間撹拌した。水５ｍＬで反応をクエンチし、溶媒を真空下に除去した。メタノールとアセトニトリルの１：１混合物で粉砕して白色固体を得た。生成物はそれ以上の精製なしで使用した。生成物の構造は、保護されていない窒素を介してビピリジンに連結しグアニジンとして示される。連結は保護された窒素のうちの１つを介して生じていてもよい。
錯体１７の合成
Figure 2005522405
配位子１６（２８．８ｍｇ）を１：１ＴＦＡ／ＣＨ2Ｃｌ2０．８ｍＬ中で脱保護した。減圧下で溶媒を除去し、脱保護した配位子をさら精製することなく使用した。脱保護した配位子を、エタノール１．０ｍＬ中、錯体［４−（４−メチル−２，２−ビピリジン−４’−イル）−酪酸］Ｒｕ（ＩＩ）（ＤＭＳＯ）2Ｃｌ2（４．８ｍｇの４−（４−メチル−２，２−ビピリジン−４−イル）−酪酸とメタノール０．６ｍＬ中Ｒｕ（ＤＭＳＯ）4Ｃｌ2１０．２ｍｇとの室温での一夜の反応によって調製）と混合し、反応混合物を４時間還流した。生成物を水中でＴＦＡ勾配を使用するＳＰセファデックスＣ２５上のイオン交換、及び０．１％ＴＦＡを含むアセトニトリル／水混合物を溶離剤として使用する逆相シリカ上の逆相クロマトグラフィーによって精製した。
錯体１８の合成

Figure 2005522405
３ＮＨＣＬ４０ｍＬ中（ＮＨ4）2ＯｓＣｌ2１ｇ及び４，７−ビフェニル−１，１０−フェナントロリンジスルホン酸（ナトリウム塩）を混合して混合物を調製した。混合物を８０℃で２時間加熱した。溶液を冷却し、ｐＨが約９に達するまで炭酸カリウム水溶液を添加した。溶液を減圧下で濃縮乾燥した。ＤＭＦ２０ｍＬ中の４，７−ジフェニル−１，１０のフェナントロリンジスルホン酸（ナトリウム塩）をさらに１当量添加した。溶液を８時間還流した。冷却後、次亜硫酸ナトリウム２００ｍｇを少量の水に溶かして添加した。溶液を真空下に約１０ｍＬまで濃縮した後、アセトンの添加によってビス−ジフェニルフェナントロリンオスミウム二塩化物中間体を沈殿させた。アセトンの添加によってメタノールからの生成物を沈殿させることにより物質をもう一度精製した。
ビス−ジフェニルフェナントロリンオスミウム二塩化物中間体の一部（２６６ｍｇ）を１：１ジオキサン／水中４−（４−メチル−２，２−ビピリジン−４’−イル）−酪酸６０ｍｇと混合し、１８時間還流した。溶液を減圧下で濃縮乾燥し、残渣を水１０ｍＬ中に再溶解した。ヘキサフルオロリン酸アンモニウム２００ｍｇ添加後、溶液を再び濃縮乾燥し、残渣をアセトニトリル１０ｍＬ部分で洗浄した。溶離剤としてメタノールを使用して逆相シリカを用いて生成物を精製した。
ＮＨＳエステルの合成
［４−（４−メチル−２，２−ビピリジン−４’−イル）−酪酸］Ｒｕ（ＩＩ）［ｂｐｙ］2（錯体１９）のＮＨＳエステルを、精製形（ＮＨＳ ＴＡＧ（ＩＧＥＮインターナショナル））で得るか、又は下記の方法のうちの１つによって対応するカルボン酸（錯体２０）から粗製物の形で調製した。ＮＨＳエステルを含む錯体３を、実施例３により精製形とするか、又は下記の方法のうちの１つによって錯体２から粗製物の形で調製した。非プロトン性条件下又は水中でＮＨＳエステルを粗製物の形で調製することもできる。典型的には、可能な場合、非プロトン性条件を使用した。典型的な非プロトン性溶媒には不溶な水可溶性錯体は水性条件下で調製した。
非プロトン性条件：錯体を含むカルボン酸を塩化メチレンに溶解させ、これに少過剰なＮＨＳとＥＤＣを添加した。塩化メチレンに可溶でないいくつかの錯体はアセトニトリル若しくはＤＭＦ又はこれらの溶媒と塩化メチレンとの混合物中で反応させた。反応を完了（ＨＰＬＣ又はＴＬＣによって決定）させた後、溶媒を真空下に除去し、粗製物をＤＭＦ又はＤＭＳＯに再溶解し、標識反応に使用するためのストック液とした。
水性条件：錯体を含む２０ｍＭカルボン酸水溶液に以下の順に添加した。ｉ）１００ｍＭモルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）緩衝剤、ｐＨ６．０、５０ｍＭ ＮＨＳ及び２００ｍＭ ＥＤＣ ＨＣｌ。反応を１５〜３０分インキュベートした。ＮＨＳエステル生成物はそのまま使用することができるが、いくつかの実験では、過剰のＥＤＣを下記方法のうちの１つによってＮＨＳエステルの調製直後に除去した。ｉ）溶離剤として水を使用したセファデックスＧ−１５上でのサイズ排除クロマトグラフィーにより生成物を精製するか、ｉｉ）生成物をナトリウム形のＳＰ−セファデックスＣ２５の短カラムに通し、水で溶離するか、又はｉｉｉ）生成物を逆相クロマトグラフィー媒体にロードし水／アセトニトリルで溶離する。これらの水性条件のうちの１つの下で作られたＮＨＳエステルを（実施例１７に記載するように）調製／精製直後に使用した。
抗体のＮＨＳエステルによる標識化
抗体を２ｍｇ／ｍＬ以上の濃度で、ＰＢＳ−１緩衝剤（１５０ｍＭリン酸カリウム、１５０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．８）に溶解させた。ＮＨＳエステル（実施例１６に記載するように調製した）で官能化したＥＣＬ標識を、水、ＤＭＦ又はＤＭＳＯ（有機溶媒の最終濃度は＜２０％に維持されるべきである）に添加し、室温で少なくとも２時間反応を続けた。標識されたタンパク質をセファデックスＧ−２５（正帯電又は中性の錯体）又はセファデックスＧ−５０（負帯電錯体）上のサイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。カップリング反応の効率は標識ごとに異なるので、種々の標識とタンパク質のモル比を一般に試みた。精製した生成物中の１つのタンパク質当たり標識の平均数は、比色タンパク質アッセイ（ＢＣＡアッセイ又はクマシーブルーアッセイ（ピアースケミカルズ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）））を使用することにより決定してタンパク質濃度を決定し、また、可視吸収（典型的には、ルテニウムに基づく標識についての４５５ｎｍ）を決定し、標識の濃度を決定した。
錯体２０、８及び１０で標識された抗体を使用する炭素電極上のサンドイッチイムノアッセイの比較。
エチレン−ｃｏ−酢酸ビニル（ＥＶＡ）中に分散させたカーボンナノチューブ（フィブリル）を含むプラスチック複合電極をアンモニア／窒素プラズマで処理し、表面のフィブリルを露出させるとともにアミン基を導入した。ＳＭＣＣ（ピアス・ケミカル）で表面を処理し、次いで、表面をストレプトアビジン（トロート（Ｔｒａｕｔ）試薬で標識してチオール基を導入）と反応させることにより、固定化されたストレプトアビジン層を導入した。
ストレプトアビジンをコーティングした電極の３／１６”ディスクを固相支持体として使用し、また、抗体、抗体希釈剤及び較正剤希釈剤（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ製Ｅｌｅｃｓｙｓ ＡＦＰから）を使用して、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）についてサンドイッチイムノアッセイを行なった。Ｒｏｃｈｅのキットは、ビオチンで標識された捕捉抗体及び錯体２０で標識された検出抗体を使用する。本発明の標識と比較するために、キットの標識された検出抗体を、同じ抗体であるが標識の量を実施例１７に記載したように変えた標識２０、８及び１０で置き替えた。ストレプトアビジンをコーティングした電極を、捕捉抗体、標識された検出抗体のうちの１つ、及び１８６４ナノグラム／ｍＬのＡＦＰでスパイクされた較正用希釈剤（ウシ血清アルブミン及びウシ免疫グロブリンＧを含む人工血清置換材料）を含む試料と接触させた。スパイクされていない較正用希釈剤を使用してネガティブコントロールも行なった。アッセイ混合物を電極上でインキュベートして、サンドイッチ錯体を生じさせ、しかる後、ディスクをホスフェート緩衝剤で洗浄し、ＥＣＬセルへ移した。トリプロピルアミン（ＯＲＩＧＥＮアッセイ緩衝剤、ＩＧＥＮ）を含む溶液に複合電極を接触させ、複合電極の電位を約２．３Ｖまで走査することによりＥＣＬを測定した。
図１は、非特異的信号（つまり分析成分がない状態での信号）及び特異的信号（分析成分存在下での信号と、分析成分がない状態での信号の間の差）を示す。図は、標識８（負帯電ホスホン酸エステル基を示す）及び１０（中性の親水性カルボキサミド基を示す）が従来のＥＣＬ標識２０とほぼ同等の特異的信号を与え、特異的信号は、１つのタンパク質当たりの標識の数につれてほぼ直線的に増加したことを示す。しかし、標識は、非特異的結合の量では顕著な予期しない違いを示した。標識２０の非特異的信号は、１つのタンパク質当たり標識の数につれて指数関数的に増加したのである。対照的に、中性の親水性カルボキサミド基を示す標識１０はより低いＮＳＢを示し、負帯電を示す標識８が示すＮＳＢは、１つのタンパク質当たりの標識数が多い場合でも無視できる程度であった。アッセイ信号（Ｓ）及びバックグラウンドに対するアッセイ信号（Ｓ／Ｂ）は標識８を使用することにより改善できる。（従来の標識と比較して）ＮＳＢ信号を増加させずに、１つの抗体当たり標識の数を増加させることができるためである。標識８を用いて測定したピークＳ／Ｂは、標識２０を用いて測定したものと比べ２倍より大きかった。タンパク質に対して最適な比率の標識（Ｓ／Ｂによって決定した）を使用すると、標識８を用いて測定した信号は標識２０を用いて測定したものより８倍大きかった。
錯体２０、２、１５、１２、１７及び１５で標識された抗体を使用する炭素電極上のサンドイッチイムノアッセイの比較
アッセイを行なうのに先立ち酸素プラズマ処理したフィブリル−ＥＶＡ複合電極に捕捉抗体を直接吸着し、較正材（０及び２２００ｎｇ／ｍＬ）をヒト血清中で調製した点を除いて、実施例１８に記載するのと同様にＡＦＰアッセイを行なった。図２は、錯体２０、２及び１５で標識した抗体からの特異的信号は、錯体１５を含むバソフェナントロリンで高度に標識した抗体を除いてほぼ類似していることを示す。我々の仮説では、標識付けの比率が高い場合、大きな平面状の芳香族の構造は、抗体の結合を立体的にブロックするかこれを変性させてその活性に影響すると考えられる。また、実施例１８において観察されるように、負帯電性配位子を有する錯体で標識した抗体からの非特異的信号は、１つの抗体当たり標識の高い場合でも低いが、従来の標識２０からの非特異的信号は、１つの抗体当たり標識の数が増すにつれて指数関数的に増大することを図２は示す。標識２を使用して得られた最適化されたＳ／Ｂは、標識２０で得られた最適化されたＳ／Ｂの５倍を超える。タンパク質に対する標識の最適の比率（Ｓ／Ｂによって決定した）を使用した場合、標識２によって測定した信号は、標識２０によって測定したそれより３倍以上大きかった。同様のアッセイ（データは示していない）において、スルフェート基を示す錯体（錯体１２）で標識された抗体は、錯体２で標識されたものと同様の挙動を示した。錯体１５のＯｓ類似体で標識された抗体では、一般に、同様の低い非特異的結合が示されたが、特異的信号はＲｕ錯体のほぼ３０〜５０％の傾向を示した。錯体１５の非スルホン化型（つまり錯体１４）で標識された抗体は、一般に、タンパク質に対する標識の比率が低い場合でもバックグラウンドが高く信号は低くなった。我々の仮説では、高度に疎水性の錯体が抗体機能を妨害したと考えられる。同様のアッセイでは、正帯電性の高い錯体１７は非常に高い非特異的信号を与えた（１つの抗体当たり５〜６個の標識では、非特異的信号が、錯体２で標識された抗体からの非特異的信号の１００倍以上であった）。この結果は、負帯電性錯体の優れた振る舞いが単に親水性の帯電基を有していることによるのではなく、帯電の符号が重要であることを示す。我々の仮説では、アッセイが、正帯電性の高い表面近くで実行される場合、錯体１７にはいくつかの選択される利用場面があり得ると考えられる（正帯電はこうした状態でＮＳＢを防ぐためには有益であろう）。配位子１６を有する錯体１７及びその他の錯体もまた、電極に発光標識を吸着させる必要がある利用場面で（例えば、発光に基づくセンサーでは、ＥＣＬに基づくＨＰＬＣ検出器やＥＣＬ標識を電極上又は膜（ナフィオン膜などの電極に堆積させる膜）中に吸着させて用いるＥＣＬディスプレイにおいて）使用できるであろう。
錯体２０及び２で標識された抗体を使用する磁気粒子上のサンドイッチイムノアッセイの比較。
標準の検出抗体を同じ抗体だが様々な量の錯体２０又は２で標識した抗体に置き替えた点を除いてＥｌｅｃｓｙｓ ＡＦＰアッセイ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）試薬を使用してＡＦＰアッセイを行なった。ブロッキングタンパク質を含む緩衝剤を用いた溶液に既知濃度のＡＦＰ（０又は１０００ｎｇ／ｍＬ）を含む試料（０．００７ｍＬ）を、ビオチン標識された捕捉抗体（０．００４５ｍｇ／ｍＬ）０．０３５ｍＬ及び検出抗体（０．０１２ｍｇ／ｍＬ）０．０３５ｍＬと混合した。反応混合物を室温で１５分間インキュベートし、しかる後、ストレプトアビジンコーティングを施した磁気粒子（０．７２ｍｇ／ｍＬ）０．０３５ｍＬ、及びトリプロピルアミン（ＯＲＩＧＥＮアッセイ緩衝剤（ＩＧＥＮインターナショナル））の緩衝剤を用いた溶液０．１３９ｍＬを添加した。反応混合物をさらに１５分間インキュベートし、しかる後、ＯＲＩＧＥＮ Ｍ−８装置（ＩＧＥＮインターナショナル）及びＥＣＬ検出を使用して懸濁液を分析した。図３は、標識２が与える特異的信号は、標識２０よりわずかに少ないが、非特異的信号は特に高度に標識された抗体では非常に少ないことを示す。標識２を使用して得られた最適化されたＳ／Ｂは、標識２０で得られた、最適化されたＳ／Ｂの２倍以上であった。
錯体２０、８及び１０で標識された抗体を用いた炭素複合電極上でのＥＣＬに基づくサンドイッチイムノアッセイの比較結果を示すグラフであり、図は、１つの抗体当たり標識の数の関数として非特異的信号と特異的信号を示す。 錯体２０、２、１５、１２、１７及び１５で標識された抗体を用いた炭素複合電極上でのＥＣＬに基づくサンドイッチイムノアッセイの比較結果を示すグラフであり、図は、１つの抗体当たり標識の数の関数として非特異的信号と特異的信号を示す。 錯体２０及び２で標識された抗体を用いて磁気粒子上で行なったＥＣＬに基づくサンドイッチイムノアッセイの比較結果を示すグラフであり、図は、１つの抗体当たり標識の数の関数として非特異的信号と特異的信号を示す。

Claims (91)

  1. 下記からなる群から選択される配位子。
    Figure 2005522405
    （ここで、
    Ｔは、アルキル連結基であり、場合によっては、１つ又は複数の鎖炭素は複素原子によって置換されていてもよく；
    Ｚは、−ＳＯ3 -、−ＳＯ3Ｈ、−ＯＳＯ3 -、−ＯＳＯ3Ｈ、−ＰＯ3 2-、−ＰＯ3Ｈ-、−ＰＯ3Ｈ2、−ＯＰＯ3 2-、−ＯＰＯ3Ｈ-、−ＯＰＯ3Ｈ2、−ＯＰ（Ｒ）Ｏ2 -、−ＯＰ（Ｒ）Ｏ2Ｈ、−[ＮＨＣ（ＮＨ2）2]+、又は、−ＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨ2であり；
    Ｒは、アルキル基である）
  2. Ｔが−（ＣＨ2）ｎ−であり、ｎが１と５の間の整数である請求項１に記載の配位子。
  3. Ｚが−ＳＯ3 -又は−ＳＯ3Ｈである請求項１又は２に記載の配位子。
  4. Ｚが−ＯＳＯ3 -又は−ＯＳＯ3Ｈである請求項１又は２に記載の配位子。
  5. Ｚが、−ＰＯ3Ｈ-、−ＰＯ3Ｈ2、−ＯＰＯ3 2-、−ＯＰＯ3Ｈ-、ＯＰＯ3Ｈ2、−ＯＰ（Ｍｅ）Ｏ2 -又は−ＯＰ（Ｍｅ）Ｏ2Ｈである請求項１又は２に記載の配位子。
  6. Ｚが、−［ＮＨＣ（ＮＨ2）2］+又はＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨ2である請求項１又は２に記載の配位子。
  7. 請求項１、２、３、４、５又は６に記載の配位子及び配位子の環窒素に結合している金属原子を含む発光性金属錯体。
  8. 下記からなる群から選択される配位子：
    Figure 2005522405
    （ここで、
    Ｔは、アルキル連結基であり、場合によっては、１つ又は複数の鎖炭素は複素原子によって置換されていてもよく；
    Ｚは、−ＳＯ3 -、−ＳＯ3Ｈ、−ＯＳＯ3 -、−ＯＳＯ3Ｈ、−ＰＯ3 2-、−ＰＯ3Ｈ-、−ＰＯ3Ｈ2、−ＯＰＯ3 2-、−ＯＰＯ3Ｈ-、−ＯＰＯ3Ｈ2、−ＯＰ（Ｒ）Ｏ2 -、−ＯＰ（Ｒ）Ｏ2Ｈ、−[ＮＨＣ（ＮＨ2）2]+、又は、−ＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨ2であり；
    Ｒは、アルキル基である）を含む発光性金属錯体を使用し、
    前記金属錯体が前記配位子の環窒素に結合する金属原子を含む、発光に基づくアッセイの遂行方法。
  9. 前記アッセイにおいて前記金属錯体が、Ｚ＝Ｈである類似の錯体よりも低減された非特異的結合を示す請求項８に記載の方法。
  10. 構造：
    Ｍ（Ｌ1）3
    （ここで、
    ＭはＯｓ又はＲｕであり；
    Ｌ1は、下記からなる群から選択される配位子：
    Figure 2005522405
    （ここで、
    Ｔは、アルキル連結基であり、場合によっては、１つ又は複数の鎖炭素は複素原子によって置換されていてもよく；
    Ｚは、−ＳＯ3 -、−ＳＯ3Ｈ、−ＯＳＯ3 -、−ＯＳＯ3Ｈ、−ＰＯ3 2-、−ＰＯ3Ｈ-、−ＰＯ3Ｈ2、−ＯＰＯ3 2-、−ＯＰＯ3Ｈ-、−ＯＰＯ3Ｈ2、−ＯＰ（Ｒ）Ｏ2 -、−ＯＰ（Ｒ）Ｏ2Ｈ、−[ＮＨＣ（ＮＨ2）2]+、又は、−ＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨ2であり；
    Ｒは、アルキル基である））を有する発光性金属錯体。
  11. 構造：
    Ｍ（Ｌ1）3
    （ここで、
    ＭはＯｓ又はＲｕであり；
    Ｌ1は、下記からなる群から選択される配位子：
    Figure 2005522405
    （ここで、
    Ｔは、アルキル連結基であり、場合によっては、１つ又は複数の鎖炭素は複素原子によって置換されていてもよく；
    Ｚは、−ＳＯ3 -、−ＳＯ3Ｈ、−ＯＳＯ3 -、−ＯＳＯ3Ｈ、−ＰＯ3 2-、−ＰＯ3Ｈ-、−ＰＯ3Ｈ2、−ＯＰＯ3 2-、−ＯＰＯ3Ｈ-、−ＯＰＯ3Ｈ2、−ＯＰ（Ｒ）Ｏ2 -、−ＯＰ（Ｒ）Ｏ2Ｈ、−[ＮＨＣ（ＮＨ2）2]+、又は、−ＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨ2であり；
    Ｒは、アルキル基である））を有する発光性金属錯体を使用する、発光に基づくアッセイの遂行方法。
  12. 前記アッセイにおいて前記金属錯体が、Ｚ＝Ｈである類似の錯体よりも低減された非特異的結合を示す請求項１１に記載の方法。
  13. 構造：
    ＭＬ1Ｌ2 2
    （ここで、
    ＭはＯｓ又はＲｕであり；
    Ｌ1は、生体物質、結合試薬、酵素基質又は他のアッセイ試薬と反応して共有結合による連結を形成し得る少なくとも１つの置換基を有する置換されたビピリジン又はフェナントロリン配位子であり；
    Ｌ2は、下記からなる群から選択される金属配位子：
    Figure 2005522405
    （ここで、
    Ｔは、アルキル、アルケニル、アルキニル若しくはフェニル連結基又はそれらの組み合わせを含む連結基であり、場合によっては、１つ又は複数の鎖炭素は複素原子によって置換されていてもよく；
    Ｚは、−ＳＯ3 -、−ＳＯ3Ｈ、−ＯＳＯ3 -、−ＯＳＯ3Ｈ、−ＰＯ3 2-、−ＰＯ3Ｈ-、−ＰＯ3Ｈ2、−ＯＰＯ3 2-、−ＯＰＯ3Ｈ-、−ＯＰＯ3Ｈ2、−ＯＰ（Ｒ）Ｏ2 -、−ＯＰ（Ｒ）Ｏ2Ｈ、−[ＮＨＣ（ＮＨ2）2]+、又は、−ＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨ2であり；
    Ｒは、アルキル基である））を有する発光性金属錯体。
  14. Ｌ1が、下記からなる群から選択される請求項１３に記載の発光性金属錯体：
    Figure 2005522405
    （ここで、
    Ｘは、アルキル、アルケニル、アルキニル若しくはフェニル連結基又はそれらの組み合わせを含む連結基であり、場合によっては、１つ又は複数の鎖炭素は複素原子によって置換されていてもよく；
    Ｙは、Ｈ又はアルキルであり、
    Ｗは、生体物質、結合試薬、酵素基質又は他のアッセイ試薬と反応して共有結合による連結を形成し得る置換基である））。
  15. Ｚが−ＳＯ3 -又は−ＳＯ3Ｈである請求項１３又は１４に記載の発光性金属錯体。
  16. Ｚが−ＯＳＯ3 -又は−ＯＳＯ3Ｈである請求項１３又は１４に記載の発光性金属錯体。
  17. Ｚが、−ＰＯ3Ｈ-、−ＰＯ3Ｈ2、−ＯＰＯ3 2-、−ＯＰＯ3Ｈ-、ＯＰＯ3Ｈ2、−ＯＰ（Ｍｅ）Ｏ2 -又は−ＯＰ（Ｍｅ）Ｏ2Ｈである請求項１３又は１４に記載の発光性金属錯体。
  18. Ｚが、−［ＮＨＣ（ＮＨ2）2］+又は−ＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨ2である請求項１３又は１４に記載の発光性金属錯体。
  19. ＭがＯｓである請求項１３、１４、１５、１６、１７又は１８に記載の発光性金属錯体。
  20. Ｗが活性化されたカルボキシル基である請求項１４に記載の発光性金属錯体。
  21. Ｗがカルボン酸基、アミン基又は水酸基である請求項１４に記載の発光性金属錯体。
  22. 構造：
    ＭＬ1Ｌ2 2
    （ここで、
    ＭはＯｓ又はＲｕであり；
    Ｌ1は、下記からなる群：
    Figure 2005522405
    （ここで、Ｘは、アルキル連結基であり、場合によっては、１つ又は複数の鎖炭素は複素原子によって置換されていてもよく；
    Ｙは、Ｈ又はアルキルであり、
    Ｗは、生体物質、結合試薬、酵素基質又は他のアッセイ試薬と反応して共有結合による連結を形成し得る官能基である）から選択され；
    Ｌ2は、下記からなる群：
    Figure 2005522405
    （ここで、
    Ｔは、アルキル連結基であり、場合によっては、１つ又は複数の鎖炭素は複素原子によって置換されていてもよく；
    Ｚは、−ＳＯ3 -又は−ＳＯ3Ｈである）から選択される金属配位子である）を有する発光性金属錯体。
  23. ＭがＲｕである請求項２２に記載の発光性金属錯体。
  24. Ｔが−（ＣＨ2）ｎ−であり、Ｘが−（ＣＨ2）ｍ−であり、ｎとｍは各々１と５の間の整数である請求項２２又は２３に記載の発光性金属錯体。
  25. Ｌ2は４位及び７位で置換されたフェナントロリン配位子であるか、又は、Ｌ2は４位及び４’位で置換されたビピリジン配位子である請求項２２、２３又は２４に記載の発光性金属錯体。
  26. Ｗが活性化されたカルボキシル基である請求項２２、２３、２４又は２５に記載の発光性金属錯体。
  27. Ｗがカルボン酸基、アミノ基又はチオール基である請求項２２、２３、２４又は２５に記載の発光性金属錯体。
  28. Ｗが
    Figure 2005522405
    である請求項２２、２３、２４又は２５に記載の発光性金属錯体。
  29. 構造：
    Figure 2005522405
    （ここで、Ｗは、生体物質、結合試薬、酵素基質又は他のアッセイ試薬と反応して共有結合による連結を形成し得る官能基である）を有する発光性金属錯体。
  30. Ｗが活性化されたカルボキシル基である請求項２９に記載の発光性金属錯体。
  31. Ｗがカルボキシル基、アミノ基又は水酸基である請求項２９に記載の発光性金属錯体。
  32. Ｗが

    Figure 2005522405
    である請求項２９の発光性金属錯体。
  33. 構造：
    ＭＬ1Ｌ2 2
    （ここで、
    ＭはＯｓ又はＲｕであり；
    Ｌ1は、生体物質、結合試薬、酵素基質又は他のアッセイ試薬に共有結合により連結される少なくとも１つの置換基を有する置換されたビピリジン又はフェナントロリン配位子であり；
    Ｌ2は、下記からなる群：
    Figure 2005522405
    （ここで、
    Ｔは、アルキル、アルケニル、アルキニル若しくはフェニル連結基又はそれらの組み合わせを含む連結基であり、場合によっては、１つ又は複数の鎖炭素は複素原子によって置換されていてもよく；
    Ｚは、−ＳＯ3 -、−ＳＯ3Ｈ、−ＯＳＯ3 -、−ＯＳＯ3Ｈ、−ＰＯ3 2-、−ＰＯ3Ｈ-、−ＰＯ3Ｈ2、−ＯＰＯ3 2-、−ＯＰＯ3Ｈ-、−ＯＰＯ3Ｈ2、−ＯＰ（Ｒ）Ｏ2 -、−ＯＰ（Ｒ）Ｏ2Ｈ、−[ＮＨＣ（ＮＨ2）2]+、又は、−ＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨ2であり；
    Ｒは、アルキル基である）から選択される金属配位子である）を有する発光性金属錯体を含む標識された材料。
  34. Ｌ1が、下記からなる群：
    Figure 2005522405
    （ここで、
    Ｘは、アルキル、アルケニル、アルキニル若しくはフェニル連結基又はそれらの組み合わせを含む連結基であり、場合によっては、１つ又は複数の鎖炭素は複素原子によって置換されていてもよく；
    Ｙは、Ｈ又はアルキルであり、
    Ｂは、生体物質、結合試薬、酵素基質又は他のアッセイ試薬であり；
    ＷはＢに連結される官能基である）から選択される請求項３３に記載の標識された材料。
  35. Ｚが−ＳＯ3 -又は−ＳＯ3Ｈである請求項３３又は３４に記載の標識された材料。
  36. Ｚが−ＯＳＯ3 -又は−ＯＳＯ3Ｈである請求項３３又は３４に記載の標識された材料。
  37. Ｚが、−ＰＯ3Ｈ-、−ＰＯ3Ｈ2、−ＯＰＯ3 2-、−ＯＰＯ3Ｈ-、ＯＰＯ3Ｈ2、−ＯＰ（Ｍｅ）Ｏ2 -又は−ＯＰ（Ｍｅ）Ｏ2Ｈである請求項３３又は３４に記載の標識された材料。
  38. Ｚが、−［ＮＨＣ（ＮＨ2）2］+又は−ＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨ2である請求項３３又は３４に記載の標識された材料。
  39. ＭがＯｓである請求項３３、３４、３５、３６、３７又は３８に記載の標識された材料。
  40. 錯体が、ＺがＨである類似の錯体よりも低減された非特異的結合を示す請求項３３、３４、３５、３６、３７、３８又は３９に記載の標識された材料。
  41. 前記生体物質、結合試薬、酵素基質又は他のアッセイ試薬が、アミノ酸、ヌクレオシド、ヌクレオチド、タンパク質、ペプチド、ペプチドミメティクス、核酸及びペプチド核酸からなる群から選択される請求項３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９又は４０に記載の標識された材料。
  42. 前記生体物質、結合試薬、酵素基質又は他のアッセイ試薬が、５種以上の前記発光性金属錯体に連結される請求項３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０又は４１に記載の標識された材料。
  43. 前記生体物質、結合試薬、酵素基質又は他のアッセイ試薬が、１０種以上の前記発光性金属錯体に連結される請求項３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０又は４１に記載の標識された材料。
  44. 構造：
    ＭＬ1Ｌ2 2
    （ここで、
    ＭはＯｓ又はＲｕであり；
    Ｌ1は、生体物質、結合試薬、酵素基質又は他のアッセイ試薬に共有結合により連結される少なくとも１つの置換基を有する置換されたビピリジン又はフェナントロリン配位子であり；
    Ｌ2は、下記からなる群：
    Figure 2005522405
    （ここで、
    Ｔは、アルキル、アルケニル、アルキニル若しくはフェニル連結基又はそれらの組み合わせを含む連結基であり、場合によっては、１つ又は複数の鎖炭素は複素原子によって置換されていてもよく；
    Ｚは、−ＳＯ3 -、−ＳＯ3Ｈ、−ＯＳＯ3 -、−ＯＳＯ3Ｈ、−ＰＯ3 2-、−ＰＯ3Ｈ-、−ＰＯ3Ｈ2、−ＯＰＯ3 2-、−ＯＰＯ3Ｈ-、−ＯＰＯ3Ｈ2、−ＯＰ（Ｒ）Ｏ2 -、−ＯＰ（Ｒ）Ｏ2Ｈ、−[ＮＨＣ（ＮＨ2）2]+、又は、−ＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨ2であり；
    Ｒは、アルキル基である）から選択される金属配位子である）を有する発光性金属錯体を含む標識された材料を使用する、発光に基づくアッセイの遂行方法。
  45. 前記アッセイにおいて、前記標識された材料が、Ｚ＝Ｈである類似の錯体よりも低減された非特異的結合を示す請求項４４に記載の方法。
  46. 構造：
    ＭＬ1Ｌ2 2
    （ここで、
    ＭはＯｓ又はＲｕであり；
    Ｌ1は、下記からなる群：
    Figure 2005522405
    （ここで、
    Ｘは、アルキル連結基であり、場合によっては、１つ又は複数の鎖炭素は複素原子によって置換されていてもよく；
    Ｙは、Ｈ又はアルキルであり、
    Ｗは、生体物質、結合試薬、酵素基質又は他のアッセイ試薬に連結される官能基である）から選択され；
    Ｌ2は、下記からなる群：
    Figure 2005522405
    （ここで、
    Ｔは、アルキル連結基であり、場合によっては、１つ又は複数の鎖炭素は複素原子によって置換されていてもよく；
    Ｚは−ＳＯ3 -又は−ＳＯ3Ｈである）から選択される金属配位子である）を有する発光性金属錯体を含む標識された材料。
  47. ＭがＲｕである請求項４６に記載に記載の標識された材料。
  48. Ｔが−（ＣＨ2）ｎ−であり、Ｘが−（ＣＨ2）ｍ−であり、ｎとｍは各々１と５の間の整数である請求項４６又は４７に記載の標識された材料。
  49. Ｌ2は４位及び７位で置換されたフェナントロリン配位子であるか、又は、Ｌ2は４位及び４’位で置換されたビピリジン配位子である請求項４６、４７又は４８に記載の標識された材料。
  50. 錯体が、ＺがＨである類似の錯体よりも低減された非特異的結合を示す請求項４６、４７、４８又は４９に記載の標識された材料。
  51. 前記生体物質、結合試薬、酵素基質又は他のアッセイ試薬が、アミノ酸、ヌクレオシド、ヌクレオチド、タンパク質、ペプチド、ペプチドミメティクス、核酸及びペプチド核酸からなる群から選択される請求項４６、４７、４８、４９又は５０に記載の標識された材料。
  52. 前記生体物質、結合試薬、酵素基質又は他のアッセイ試薬が、５種以上の前記発光性金属錯体に連結される請求項４６、４７、４８、４９、５０又は５１に記載の標識された材料。
  53. 前記生体物質、結合試薬、酵素基質又は他のアッセイ試薬が、１０種以上の前記発光性金属錯体に連結される請求項４６、４７、４８、４９、５０又は５１に記載の標識された材料。
  54. 構造：
    ＭＬ1Ｌ2 2
    （ここで、
    ＭはＯｓ又はＲｕであり；
    Ｌ1は、下記からなる群：
    Figure 2005522405
    （ここで、
    Ｘは、アルキル連結基であり、場合によっては、１つ又は複数の鎖炭素は複素原子によって置換されていてもよく；
    Ｙは、Ｈ又はアルキルであり、
    Ｗは、生体物質、結合試薬、酵素基質又は他のアッセイ試薬に連結される官能基である）から選択され；
    Ｌ2は、下記からなる群：
    Figure 2005522405
    （ここで、
    Ｔは、アルキル連結基であり、場合によっては、１つ又は複数の鎖炭素は複素原子によって置換されていてもよく；
    Ｚは−ＳＯ3 -又は−ＳＯ3Ｈである）から選択される金属配位子）を有する発光性金属錯体を含む標識された材料を使用する、発光に基づくアッセイの遂行方法。
  55. 前記アッセイにおいて、前記標識された材料が、Ｚ＝Ｈである類似の標識された材料よりも低減された非特異的結合を示す請求項５４に記載の方法。
  56. 構造：
    Figure 2005522405
    （ここで、Ｗは、生体物質、結合試薬、酵素基質又は他のアッセイ試薬に連結される官能基である）を有する発光性金属錯体を含む標識された材料。
  57. （ｉ）Ｗが−Ｃ（Ｏ）−であり、（ｉｉ）前記生体物質、結合試薬、酵素基質又は他のアッセイ試薬が、アミノ酸、ヌクレオシド、ヌクレオチド、タンパク質、ペプチド、ペプチドミメティクス、核酸及びペプチド核酸からなる群から選択され、（ｉｉｉ）前記生体物質、結合試薬、酵素基質又は他のアッセイ試薬が、アミド結合によってＷに連結される請求項５６に記載の標識された材料。
  58. 前記生体物質、結合試薬、酵素基質又は他のアッセイ試薬が、５種以上の前記発光性金属錯体に連結される請求項５６又は５７に記載の標識された材料。
  59. 前記生体物質、結合試薬、酵素基質又は他のアッセイ試薬が、１０種以上の前記発光性金属錯体に連結される請求項５６又は５７に記載の標識された材料。
  60. 構造：

    Figure 2005522405
    （ここで、Ｗは、生体物質、結合試薬、酵素基質又は他のアッセイ試薬に連結される官能基である）を有する発光性金属錯体を含む標識された材料を使用する、発光に基づくアッセイの遂行方法。
  61. 前記アッセイにおいて、前記標識された材料が、Ｚ＝Ｈである類似の標識された材料よりも低減された非特異的結合を示す請求項６０に記載の方法。
  62. ｉ）分析成分、化学活性、生物活性、生物活性の生成物又は化学活性の生成物を含む試料を発光性金属錯体に接触させるステップ；ｉｉ）金属錯体を誘導し発光を放射させるステップ；ｉｉｉ）化学活性又は生物活性を検出するか測定するために発光を測定するステップを含む、試料中の分析成分、化学活性又は生物活性の測定方法であって；前記発光性金属錯体が、
    下記からなる群：
    Figure 2005522405
    （ここで、
    Ｔは、アルキル連結基であり、場合によっては、１つ又は複数の鎖炭素は複素原子によって置換されていてもよく；
    Ｚは、−ＳＯ3 -、−ＳＯ3Ｈ、−ＯＳＯ3 -、−ＯＳＯ3Ｈ、−ＰＯ3 2-、−ＰＯ3Ｈ-、−ＰＯ3Ｈ2、−ＯＰＯ3 2-、−ＯＰＯ3Ｈ-、−ＯＰＯ3Ｈ2、−ＯＰ（Ｒ）Ｏ2 -、−ＯＰ（Ｒ）Ｏ2Ｈ、−[ＮＨＣ（ＮＨ2）2]+、又は、−ＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨ2であり；
    Ｒがアルキルである）から選択される配位子を含む測定方法。
  63. 前記アッセイにおいて、前記標識された材料が、非特異的結合低減官能基を示さない類似の配位子を有する標識された材料と比較して、低減された非特異的結合を示す請求項６２に記載の方法。
  64. 前記発光が電気化学発光である請求項６２又は６３に記載の方法。
  65. ｉ）標識された材料を結合試薬及び場合により固相支持体と接触させるステップ；ｉｉ）結合試薬、標識された材料及び場合により固相支持体を含む結合錯体を形成するステップ；ｉｉｉ）標識された材料を誘導して発光を放射させるステップ；及びｉｖ）放射された発光を測定することにより標識された材料を測定するステップを含む、標識された材料の測定方法において、標識された材料が、
    下記からなる群：
    Figure 2005522405
    （ここで、
    Ｔは、アルキル連結基であり、場合によっては、１つ又は複数の鎖炭素は複素原子によって置換されていてもよく；
    Ｚは、−ＳＯ3 -、−ＳＯ3Ｈ、−ＯＳＯ3 -、−ＯＳＯ3Ｈ、−ＰＯ3 2-、−ＰＯ3Ｈ-、−ＰＯ3Ｈ2、−ＯＰＯ3 2-、−ＯＰＯ3Ｈ-、−ＯＰＯ3Ｈ2、−ＯＰ（Ｒ）Ｏ2 -、−ＯＰ（Ｒ）Ｏ2Ｈ、−[ＮＨＣ（ＮＨ2）2]+、又は、−ＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨ2であり；
    Ｒがアルキルである）から選択される配位子を含む発光性金属錯体により標識される測定方法。
  66. 前記標識された材料を前記固相と接触させ、前記固相上に前記結合錯体を形成する請求項６５に記載の方法。
  67. 前記アッセイにおいて、前記標識された材料が、非特異的結合低減官能基を示さない類似の配位子を有する類似の標識された材料と比較して、低減された非特異的結合を示す請求項６５又は６６に記載の方法。
  68. 前記発光が電気化学発光である請求項６５、６６又は６７に記載の方法。
  69. ｉ）試料を標識された結合試薬及び場合により固相支持体と接触させるステップ；ｉｉ）結合試薬、分析成分及び場合により固相支持体を含む結合錯体を形成するステップ；ｉｉｉ）標識された結合試薬中の標識を誘導して発光、好ましくはＥＣＬを放射させるステップ及び；ｉｖ）放射された発光を測定することにより試料中の分析成分を測定するステップを含む、試料中の分析成分の測定方法において、前記標識された結合試薬が、
    下記からなる群：
    Figure 2005522405
    （ここで、
    Ｔは、アルキル連結基であり、場合によっては、１つ又は複数の鎖炭素は複素原子によって置換されていてもよく；
    Ｚは、−ＳＯ3 -、−ＳＯ3Ｈ、−ＯＳＯ3 -、−ＯＳＯ3Ｈ、−ＰＯ3 2-、−ＰＯ3Ｈ-、−ＰＯ3Ｈ2、−ＯＰＯ3 2-、−ＯＰＯ3Ｈ-、−ＯＰＯ3Ｈ2、−ＯＰ（Ｒ）Ｏ2 -、−ＯＰ（Ｒ）Ｏ2Ｈ、−[ＮＨＣ（ＮＨ2）2]+、又は、−ＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨ2であり；
    Ｒがアルキルである）から選択される配位子を含む発光性金属錯体により標識される測定方法。
  70. 前記結合錯体が前記固相上で形成される請求項６９に記載の方法。
  71. 前記標識された結合試薬が前記固相に接触され、前記結合錯体が前記固相上で形成される請求項６９に記載の方法。
  72. 前記アッセイにおいて、前記標識された結合試薬が、非特異的結合低減官能基を示す標識を有しない標識された類似の結合試薬と比較して、低減された非特異的結合を示す請求項６９、７０又は７１に記載の方法。
  73. 前記発光が電気化学発光である請求項６９、７０、７１又は７２に記載の方法。
  74. 前記アッセイがサンドイッチアッセイである請求項６９、７０、７１、７２又は７３に記載の方法。
  75. 前記アッセイが競合的アッセイである請求項６９、７０、７１、７２又は７３に記載の方法。
  76. ｉ）試料を標識された分析成分類似体、結合試薬及び場合により固相支持体と接触させるステップ；ｉｉ）標識された分析成分類似体、結合試薬、及び場合により固相支持体を含む結合錯体を形成するステップ；ｉｉｉ）標識された分析成分類似体中の標識を誘導して発光、好ましくはＥＣＬを放射させるステップ及び；ｉｖ）放射された発光を測定することにより試料中の分析成分を測定するステップを含む、試料中の分析成分の測定方法において、前記標識された分析成分類似体が、
    下記からなる群：
    Figure 2005522405
    （ここで、
    Ｔは、アルキル連結基であり、場合によっては、１つ又は複数の鎖炭素は複素原子によって置換されていてもよく；
    Ｚは、−ＳＯ3 -、−ＳＯ3Ｈ、−ＯＳＯ3 -、−ＯＳＯ3Ｈ、−ＰＯ3 2-、−ＰＯ3Ｈ-、−ＰＯ3Ｈ2、−ＯＰＯ3 2-、−ＯＰＯ3Ｈ-、−ＯＰＯ3Ｈ2、−ＯＰ（Ｒ）Ｏ2 -、−ＯＰ（Ｒ）Ｏ2Ｈ、−[ＮＨＣ（ＮＨ2）2]+、又は、−ＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨ2であり；
    Ｒがアルキルである）から選択される配位子を含む発光性金属錯体により標識される測定方法。
  77. 前記標識された分析成分類似体が前記固相に接触され、前記結合錯体が前記固相上で形成される請求項７６に記載の方法。
  78. 前記アッセイにおいて、前記標識された分析成分類似体が、非特異的結合低減官能基を示さない類似の試薬と比較して、低減された非特異的結合を示す請求項７６又は７７に記載の方法。
  79. 前記発光が電気化学発光である請求項７６、７７又は７８に記載の方法。
  80. ビピリジン、フェナントロリン、置換されたビピリジン又は置換されたフェナントロリン配位子を含む発光性金属錯体を使用する発光アッセイを改善する方法であって、前記配位子を下記からなる群：
    Figure 2005522405
    （ここで、
    Ｔは、アルキル連結基であり、場合によっては、１つ又は複数の鎖炭素は複素原子によって置換されていてもよく；
    Ｚは、−ＳＯ3 -、−ＳＯ3Ｈ、−ＯＳＯ3 -、−ＯＳＯ3Ｈ、−ＰＯ3 2-、−ＰＯ3Ｈ-、−ＰＯ3Ｈ2、−ＯＰＯ3 2-、−ＯＰＯ3Ｈ-、−ＯＰＯ3Ｈ2、−ＯＰ（Ｒ）Ｏ2 -、−ＯＰ（Ｒ）Ｏ2Ｈ、−[ＮＨＣ（ＮＨ2）2]+、又は、−ＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨ2であり；
    Ｒがアルキルである）から選択される配位子で置き換えるステップを含む方法。
  81. 前記置き換えが、バックグラウンドに対するアッセイ信号を２倍以上改善する請求項８０に記載の方法。
  82. 構造：
    ＭＬ1Ｌ2 2
    （ここで、
    ＭはＯｓ又はＲｕであり；
    Ｌ1は、アッセイ実行物質に共有結合により連結する少なくとも１つの置換基を有する置換されたビピリジン又はフェナントロリン配位子であり、
    Ｌ2は、下記からなる群：
    Figure 2005522405
    （ここで、
    Ｔは、アルキル、アルケニル、アルキニル若しくはフェニル連結基又はそれらの組み合わせを含む連結基であり、場合によっては、１つ又は複数の鎖炭素は複素原子によって置換されていてもよく；
    Ｚは、−ＳＯ3 -、−ＳＯ3Ｈ、−ＯＳＯ3 -、−ＯＳＯ3Ｈ、−ＰＯ3 2-、−ＰＯ3Ｈ-、−ＰＯ3Ｈ2、−ＯＰＯ3 2-、−ＯＰＯ3Ｈ-、−ＯＰＯ3Ｈ2、−ＯＰ（Ｒ）Ｏ2 -、−ＯＰ（Ｒ）Ｏ2Ｈ、−[ＮＨＣ（ＮＨ2）2]+、又は、−ＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨ2であり；
    Ｒは、アルキル基である）から選択される金属配位子である）を有する発光性金属錯体を含む標識された材料；及び
    以下のものからなる群から選択される少なくとも１つのアッセイ成分：
    （ａ）電気化学発光共反応物；
    （ｂ）１つ又は複数の結合試薬；
    （ｃ）１つ又は複数のｐＨ緩衝剤
    を１つ又は複数の容器に含むキット。
  83. 以下のものからなる群から選択される１つ又は複数の追加のアッセイ成分：
    （ａ）１つ又は複数のブロッキング試薬；
    （ｂ）１つ又は複数の保存剤；
    （ｃ）１つ又は複数の安定化剤；
    （ｄ）１つ又は複数の酵素；及び
    （ｅ）１つ又は複数の界面活性剤
    をさらに含む請求項８２に記載のキット。
  84. 構造：
    ＭＬ1Ｌ2 2
    （ここで、
    ＭはＯｓ又はＲｕであり；
    Ｌ1は、アッセイ実行物質に共有結合により連結する少なくとも１つの置換基を有する置換されたビピリジン又はフェナントロリン配位子であり、
    Ｌ2は、下記からなる群：
    Figure 2005522405
    （ここで、
    Ｔは、アルキル、アルケニル、アルキニル若しくはフェニル連結基又はそれらの組み合わせを含む連結基であり、場合によっては、１つ又は複数の鎖炭素は複素原子によって置換されていてもよく；
    Ｚは、−ＳＯ3 -、−ＳＯ3Ｈ、−ＯＳＯ3 -、−ＯＳＯ3Ｈ、−ＰＯ3 2-、−ＰＯ3Ｈ-、−ＰＯ3Ｈ2、−ＯＰＯ3 2-、−ＯＰＯ3Ｈ-、−ＯＰＯ3Ｈ2、−ＯＰ（Ｒ）Ｏ2 -、−ＯＰ（Ｒ）Ｏ2Ｈ、−[ＮＨＣ（ＮＨ2）2]+、又は、−ＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨ2であり；
    Ｒは、アルキル基である）から選択される金属配位子である）を有する発光性金属錯体を含む標識された材料。
  85. 前記アッセイ実行物質が以下のものからなる群：
    （ａ）対象とする添加された分析成分又は添加された前記分析成分類似体；
    （ｂ）前記分析成分の結合相手又は前記分析成分類似体の結合相手；及び
    （ｃ）（ｉ）又は（ｉｉ）に結合し得る反応成分
    から選択される請求項８４に記載の標識された材料。
  86. 請求項８４に記載の標識された材料と以下のものからなる群：
    （ａ）電解質；
    （ｂ）対象とする分析成分、又は対象とする分析成分類似体；
    （ｃ）対象とする分析成分の結合相手又はその類似体；
    （ｄ）（ｂ）又は（ｃ）と反応し得る反応成分；及び
    （ｅ）ＥＣＬ共反応物
    から選択される少なくとも１つの追加のアッセイ成分（但し、任意の試薬組成物中に含まれる２つの成分は保存中に互いに反応せず、意図するアッセイにおいてそれらの機能を害することがない）を含むアッセイ中の試薬として使用される組成物。
  87. 請求項８４に記載の標識された材料を含み、前記アッセイ実行物質は対象とする分析成分に結合し得るか対象とする分析成分に結合している、試料中に存在する対象とする分析成分を検出するための組成物。
  88. 以下のものからなる群：
    （ｉ）対象とする添加された分析成分又は添加された前記分析成分類似体；
    （ｉｉ）前記分析成分の結合相手又は前記分析成分類似体の結合相手；及び
    （ｉｉｉ）（ｉ）又は（ｉｉ）に結合し得る反応成分
    から選択される少なくとも１つの追加の物質を含む請求項８７に記載の組成物。
  89. ｎが１である請求項２に記載の配位子。
  90. ｎが１である請求項２４に記載の発光性金属錯体。
  91. ｎが１である請求項４８に記載の標識された材料。
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