JP2005518779A - ガンを発症する危険性を明らかにするための方法およびキット、ガン治療の有効性および投与量を評価するための方法およびキット、ならびにｄｎａ修復酵素の活性とガンとを相関させるための方法およびキット - Google Patents

Abstract

（ｉ）ガンを発症する被験者の危険性を明らかにするための方法およびキット、（ｉｉ）ガン患者に施されるガン治療の有効性および投与量を評価するための方法およびキット、ならびに（ｉｉｉ）少なくとも１つのＤＮＡ修復酵素の活性と少なくとも１つのガンとの間における相関または非相関の存在を明らかにするための方法およびキットが開示される。

Description

発明の分野および背景
本発明は診断および予後の分野に関する。より詳細には、本発明は、（ｉ）ガンを発症する被験者の危険性を明らかにするための方法およびキット、（ｉｉ）ガン患者に施されるガン治療の有効性および好ましい投与量を評価するための方法およびキット、ならびに（ｉｉｉ）少なくとも１つのＤＮＡ修復酵素の活性と少なくとも１つのガンとの間における相関または非相関の存在を明らかにするための方法およびキットに関する。

身体の各細胞におけるＤＮＡは、内部のＤＮＡ損傷因子（例えば、反応性の酸素化学種）および外部のＤＮＡ損傷因子（例えば、日光、Ｘ線およびγ線、煙）の両方によって引き起こされる損傷を絶えず受けている（Ｆｒｉｅｄｂｅｒｇ他、１９９５）。ほとんどの傷は、ＤＮＡ修復のいくつかの経路の１つによってＤＮＡから除去される（Ｆｒｉｅｄｂｅｒｇ他、１９９５；Ｈａｎａｗａｌｔ、１９９４；Ｍｏｄｒｉｃｈ、１９９４；Ｓａｎｃａｒ、１９９４）。修復されないＤＮＡ傷が複製されたとき、その読み違いのために、修復されないＤＮＡ傷は様々な変異を生じさせる（ＥｃｈｏｌｓおよびＧｏｏｄｍａｎ、１９９１；Ｌｉｖｎｅｈ他、１９９３；Ｓｔｒａｕｓｓ、１９８５）。そのような変異が重要な遺伝子（例えば、ガン遺伝子および腫瘍抑制因子遺伝子）において生じることにより、ガンの発症がもたらされることがある（Ｂｉｓｈｏｐ、１９９５；ＶｏｇｅｌｓｔｅｉｎおよびＫｉｎｚｌｅｒ、１９９３；Ｗｅｉｎｂｅｒｇ、１９８９）。実際、ますます多くのガン傾向の症候群が、ＤＮＡ修復およびゲノム安定性の調節に関与する遺伝子における変異によって引き起こされることが明らかにされているので、ＤＮＡ修復は、近年、ガンの病因における重要な因子として明らかにされてきている。これらには、色素性乾皮症（Ｗｅｅｄａ他、１９９３）、遺伝性非ポリープ性結腸ガン（Ｆｉｓｈｅｒ他、１９９３；Ｌｅａｃｈ他、１９９３；Ｍｏｄｒｉｃｈ、１９９４；Ｐａｒｓｏｎｓ他、１９９３）、毛細血管拡張性運動失調（Ｓａｖｉｔｓｋｙ他、１９９５）、リー・フロイメニ症候群（Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ他、１９９０）、ならびにＢＲＣＡ１遺伝子（Ｇｏｗｅｎ他、１９９８；Ｓｃｕｌｌｙ他、１９９７）およびＢＲＣＡ２遺伝子（Ｃｏｎｎｏｒ他、１９９７；Ｐａｔｅｌ他、１９９８；Ｓｈａｒａｎ他、１９９７）が含まれる。ガン症例の少数を表すこれらの症例では、遺伝子の変異は機能不全を生じさせ、これによりＤＮＡ修復の強い低下をもたらしている。

遺伝性のガンにおけるＤＮＡ修復の役割の考えられる拡大は、散発性ガンにおけるＤＮＡ修復に対する役割であると考えられる。いくつかの研究により、ＤＮＡ修復における個体間の変動性がガン感受性における変化と相関し、修復が低いことは、ガンの危険性がより大きいことに相関することが示唆された（Ａｔｈａｓ他、１９９１；Ｈｅｌｚｌｓｏｕｅｒ他、１９９６；Ｊｙｏｔｈｉｓｈ他、１９９８；Ｐａｒｓｈａｄ他、１９９６；Ｐａｔｅｌ他、１９９７；Ｓａｇｈｅｒ他、１９９８；Ｗｅｉ他、１９９６；Ｗｅｉ他、１９９３；Ｗｅｉ他、１９９４）。

７，８−ジヒドロ−８−オキソグアニン（これはまた８−オキソグアニンまたは８−ヒドロキシグアニンと称され、８−オキソＧと呼ばれる）が２つの主要な経路によってＤＮＡ内に形成される：（ａ）細胞内の代謝、酸化的ストレス、タバコの煙によって、または放射線によって形成される反応性の酸素化学種によるＤＮＡ内のグアニンの修飾（Ａｓａｍｉ他、１９９７；Ｇａｊｅｗｓｋｉ他、１９９０；Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ、１９８５；ＬｅａｎｄｅｒｓｏｎおよびＴａｇｅｓｓｏｎ、１９９２）、（ｂ）細胞内のｄＧＴＰが酸化されることによって形成される８−オキソ−ｄＧＴＰのＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ内への取り込み（ＭａｋｉおよびＳｅｋｉｇｕｃｈｉ、１９９２）。ＤＮＡ内において１回、８−オキソＧは、ｄＡＭＰの誤った挿入とともにＤＮＡポリメラーゼによって複製され、これにより、ＧＣからＴＡへの特徴的なトランスバージョンが引き起こされる（Ｓｈｉｂｕｔａｎｉ他、１９９１；Ｗｏｏｄ他、１９９０）。この修飾されたｄＧＴＰがＤＮＡポリメラーゼによって基質として使用されたとき、修飾されたｄＧＴＰは、多くの場合、テンプレートにおいてＡの反対側に誤って挿入され、これにより、ＡＴからＣＧへのトランスバージョンが引き起こされる（Ｐａｖｌｏｖ他、１９９４）。

ＤＮＡから８−オキソＧを除去するための主要な経路は、ＯＧＧ１遺伝子（ヒトではまたｈＯＧＧ１と称される）の産物である８−オキソグアニンＤＮＡ Ｎ−グリコシラーゼによって開始される塩基除去修復である（Ａｂｕｒａｔａｎｉ他、１９９７；Ａｒａｉ他、１９９７；Ｂｊｏｒａｓ他、１９９７；Ｒａｄｉｃｅｌｌａ他、１９９７；Ｒｏｌｄａｎ−Ａｒｊｏｎａ他、１９９７；Ｒｏｓｅｎｑｕｉｓｔ他、１９９７）。ＯＧＧ１遺伝子が、最近、マウスにおいてノックアウトされたので、その結果、現在では発ガン性に対する作用をこの生物で調べることができるようになっている（Ｋｌｕｎｇｌａｎｄ他、１９９９；Ｍｉｎｏｗａ他、２０００）。チャイニーズハムスター細胞におけるこの大腸菌酵素の発現はγ放射線の変異原性を１／４にした（Ｌａｖａｌ、１９９４）。このことは、８−オキソＧの修復が、γ放射線の変異原活性を無効にすることにおいて重要であることを示している。下記の観測結果により、ＯＧＧ１がガンと関連づけられる：（ｉ）ＯＧＧ１が、染色体３ｐ２５に、すなわち、ヒトの肺ガンおよび腎臓ガンにおいて頻繁に失われる部位にマッピングされた（Ａｒａｉ他、１９９７；Ａｕｄｅｂｅｒｔ他、２０００；Ｉｓｈｉｄａ他、１９９９；Ｌｕ他、１９９７；Ｗｉｋｍａｎ他、２０００）。（ｉｉ）ＯＧＧ１は、２５の肺腫瘍のうちの２つ（Ｃｈｅｖｉｌｌａｒｄ他、１９９８）で、そして９９の腎臓腫瘍のうちの４つ（Ａｕｄｅｂｅｒｔ他、２０００）で変異していることが見出された。（ｉｉｉ）ＯＧＧ１は、白血病細胞株（Ｈｙｎｅ他、２０００）で、そして胃細胞株（Ｓｈｉｎｍｕｒａ他、１９９８）で変異していることが見出された。（ｉｖ）ヒトの肺腫瘍、乳腫瘍および腎臓腫瘍におけるｐ５３変異の分析により、修復されない８−オキソＧによってもたらされる変異タイプである、ＧＣからＴＡへの変異の実質的な存在が明らかにされた（Ｈｏｌｌｓｔｅｉｎ他、１９９６；Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｂｏｕｓｓａｒｄ他、１９９９）。

ガン発症の危険性を低下させる様々な予防的対策（例えば、抗酸化物質の使用、食事、禁煙、ガン発生因子に対する職業的被爆を避けることなど、これらに限定されない）が知られており、そしてさらに、ガンの定期検診、従って、ガンの早期検出が、改善された治癒率をもたらすので、ガンを発症する被験者の危険性を明らかにするための方法およびキットが非常に求められており、そしてそのような方法およびキットを提供することは非常に好都合である。

ガン治療の有効性は遺伝毒性（変異原性）物質に対する細胞の感受性に依存しているので、ガン患者に施されるガン治療の有効性および好ましい投与量を評価するための方法およびキットが非常に求められており、そしてそのような方法およびキットを提供することは非常に好都合である。

また、ガンを発症する被験者の危険性を明らかにすること、そしてガン患者に施されるガン治療の有効性および好ましい投与量を評価することを可能にするように、少なくとも１つのＤＮＡ修復酵素の活性と少なくとも１つのガンとの間における相関または非相関の存在を明らかにするための方法およびキットが非常に求められており、そしてそのような方法およびキットを提供することは非常に好都合である。

発明の概要
本発明の１つの局面により、ガンを発症する被験者の危険性（例えば、オッズ比、相対的危険性）を明らかにする方法であって、被験者の組織におけるＤＮＡ修復／損傷防止酵素の活性レベルを示し得るパラメーターのレベルを測定すること、そしてそのレベルに従って、ガンを発症する被験者の危険性を明らかにすることを含む方法が提供される。

本発明の別の局面により、ガンを発症する被験者の危険性を明らかにする方法であって、（ａ）ガンを発症させる増大した危険性に関連する、喫煙、そして煙またはイオン化放射線に対する職業的被爆などの環境条件に対する暴露の存在または非存在、および（ｂ）被験者の組織におけるＤＮＡ修復／損傷防止酵素の活性レベルを示し得るパラメーターのレベルを明らかにすること、そしてその存在または非存在およびそのレベルに従って、ガンを発症する被験者の危険性を明らかにすることを含む方法が提供される。

本発明のさらに別の局面により、少なくとも１つのＤＮＡ修復／損傷防止酵素の活性と少なくとも１つのガンとの間における相関または非相関の存在を明らかにする方法であって、多数のガン患者および多数の明らかに正常な個体に由来する組織における少なくとも１つのＤＮＡ修復／損傷防止酵素の活性レベルを示し得るパラメーターのレベルを測定すること、そしてそのレベルに従って、少なくとも１つのＤＮＡ修復／損傷防止酵素の活性と少なくとも１つのガンとの間における相関または非相関を明らかにすることを含む方法が提供される。

下記に記載される本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴により、パラメーターは、前記ＤＮＡ修復／損傷防止酵素のタンパク質レベル、前記ＤＮＡ修復／損傷防止酵素をコードするＲＮＡのレベル、および前記ＤＮＡ修復／損傷防止酵素の触媒活性レベルからなる群から選択される。

記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、ガンは、肺ガン、血液ガン、結腸直腸ガン、乳ガン、前立腺ガン、卵巣ガンおよび頭頸部ガンからなる群から選択される。

記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、組織は、血液細胞、切屑細胞および生検物からなる群から選択される。

記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、ＤＮＡ修復／損傷防止酵素は、ＤＮＡ Ｎ−グリコシラーゼ、デオキシリボースリン酸リアーゼおよびＡＰエンドヌクレアーゼからなる群から選択される。

記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、ＤＮＡ Ｎ−グリコシラーゼは、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ、ｈＳＭＵＧ１、ｈＭＢＤ４、ミスマッチ特異的チミン／ウラシルグリコシラーゼ、メチルプリンＤＮＡグリコシラーゼ、ｈＮＴＨ１、アデニン特異的ミスマッチＤＮＡグリコシラーゼ、および８−オキソグアニンＤＮＡグリコシラーゼからなる群から選択される。

記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、危険性は、正常で、明らかに健康な集団（すなわち、参照コントロール群）と比較したとき、危険性増大倍数として表される。

記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、危険性は酵素の比活性ユニット数で表される。

記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、危険性は尺度の大きさとして表される。

記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、ＤＮＡ修復／損傷防止酵素の触媒活性レベルを測定することは、少なくとも１つの傷をその内部に有するＤＮＡ基質を使用して行われる。

記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、少なくとも１つの傷はＤＮＡ基質において所定の部位に存在する。

記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、傷は、ウラシル、５−フルオロウラシル、５−ヒドロキシウラシル、イソジアルル酸、アロキサン、Ｕ／ＴｐＧ：５ｍｅＣｐＧにおけるウラシルまたはチミン、ウラシル（Ｕ：Ｇ）、３，Ｎ^４−エテノシトシン、（ｅＣ：Ｇ）、Ｔ（Ｔ：Ｇ）、３−メチルアデニン、７−メチルアデニン、３−メチルグアニン、７−メチルグアニン、ヒポキサンチン、１，Ｎ６−エテノアデニン、１，Ｎ２−エテノグアニン、チミングリコール、シトシングリコール、ジヒドロウラシル、ホルムアミドピリミジンウレア、Ａ：Ｇ由来のアデニン、Ａ：８−オキソＧ由来のアデニン、Ｃ：Ａ由来のアデニン、２−ヒドロキシアデニン、２，５−アミノ−５−ホルムアミドピリミジン、７，８−ジヒドロ−８−オキソグアニン（これはまた８−オキソグアニンと称される）、および脱塩基部位からなる群から選択される。

記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、基質は、少なくとも２つのタイプの少なくとも２つの異なる傷を含む。

記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、基質は１つの傷を含む。

記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、基質は、１つのタイプの少なくとも２つの異なる傷を含む。

記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、被験者は、ガンを発症させる増大した危険性と関連する環境条件に曝されることが知られているか、またはそのような環境条件に曝されようとしている。

本発明のさらに別の局面により、被験者における化学療法および／または放射線療法などの変異誘発性の抗ガン処置の効力を予測する方法であって、被験者の組織におけるＤＮＡ修復／損傷防止酵素の活性レベルを示し得る因子のレベルを測定すること、そしてそのレベルに従って、被験者における変異誘発性の抗ガン処置の効力を予測することを含む方法が提供される。

本発明のさらに別の局面により、被験者を処置するための化学療法および／または放射線療法などの変異誘発性の抗ガン処置の投与量を選択する方法であって、被験者の組織におけるＤＮＡ修復／損傷防止酵素の活性レベルを示し得る因子のレベルを測定すること、そしてそのレベルに従って、被験者を処置するための変異誘発性の抗ガン処置の投与量を選択することを含む方法が提供される。

本発明のさらに別の局面により、被験者の組織におけるＤＮＡ修復／損傷防止酵素の活性レベルを測定するためのキットであって、密閉可能な容器に含有されて、少なくとも１つの傷をその内部に有するＤＮＡ基質と、反応緩衝液を含むパッケージとを含むキットが提供される。

下記に記載される本発明の好ましい実施におけるさらなる特徴により、キットは、リンパ球を分離するための試験管をさらに含む。

記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、試験管には、抗凝固剤が予め入れられている。

記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、キットは、遠心分離によってリンパ球を赤血球から分離することにおいて効果的な選択された比重を有する液体をさらに含む。

記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、キットは、赤血球を溶解することにおいて効果的な選択された浸透圧モル濃度を有する溶液をさらに含む。

記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、キットは、タンパク質抽出緩衝液をさらに含む。

記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、キットは、タンパク質測定を行うための試薬をさらに含む。

記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、キットは、当該活性に対するコントロールとして使用される精製されたＤＮＡ修復／損傷防止酵素をさらに含む。

本発明は、ガンを発症する被験者の危険性を明らかにすることにおいて、そしてガン患者に施されるガン治療の有効性および個々の投与量を評価するために有用な方法、キットおよび試薬を提供することによって、現在知られている形態の様々な欠点を解決することに成功している。

図面の簡単な説明
本発明は、本明細書中には、例としてだけであるが、添付された図面を参照して記載される。次に図面を詳細に特に参照することにより、示される特定の事項は、例としてであり、かつ本発明の好ましい実施形態の例示的な議論のためだけであり、そして本発明の原理および概念的局面の最も有用かつ容易に理解される記載であると考えられるものを提供するために示されることに重点が置かれている。これに関連して、本発明の基本的な理解のために必要とされるよりも詳しく本発明の構造的詳細を示すことはなされておらず、しかし、図面とともに理解される説明により、本発明のいくつかの形態がいかにして実際に具体化され得るかが当業者には明らかになる。
図１ａは本発明によるＯＧＧＡ切断アッセイの概略図を示す。アッセイにおいて、３２塩基対の合成ＤＮＡが８−オキソＧの傷（丸により示される）のところで切断され、放射能標識された１７量体が変性後に得られる。星印は、放射能標識されたリン酸基を表す。図１ｂ〜図１ｃは、健康な提供者に由来する末梢血リンパ球から調製されたタンパク質抽出物を用いて標準的な条件のもとで行われた本発明のＯＧＧＡ切断アッセイの経時変化を示す。図１ｂは、尿素−ＰＡＧＥによって分画された反応生成物のリン光画像を示し、図１ｃは画像の定量化を示す。ＧＯ、部位特異的な８−オキソＧを有するＤＮＡ基質；Ｇ、８−オキソＧの代わりにＧを有するコントロール基質。
図２は、ＯＧＧＡ切断アッセイにおけるタンパク質添加測定を示す（図２ａ〜図２ｂ）。アッセイは、健康な提供者に由来する末梢血リンパ球から調製されたタンパク質抽出物の示された量を用いて標準的な条件のもとで行われた。図２ａは、尿素−ＰＡＧＥによって分画された反応生成物のリン光画像を示し、図２ｂは画像の定量化を示す。ＧＯ、部位特異的な８−オキソＧを有するＤＮＡ基質；Ｇ、８−オキソＧの代わりにＧを有するコントロール基質。
図３は、本発明のＯＧＧＡ切断アッセイの特異性の分析を示す（図３ａ〜図３ｂ）。アッセイは、反応混合物が、２ｐｍｏｌの放射能標識された８−オキソＧ含有基質と、示された量の非標識の競合ＤＮＡとを含有したことを除いて、標準的な条件のもとで行われた。図３ａは、尿素−ＰＡＧＥによって分画された反応生成物のリン光画像を示し、図３ｂは画像の定量化を示す。タンパク質抽出物は健康な提供者から得られた。Ｈｘ、ＧおよびＧＯは、放射能標識された基質に類似し、同じ位置にヒポキサンチンまたはグアニンまたは８−オキソＧのいずれかを含有した非標識の競合ＤＮＡを表す。
図４は、健康者（すなわち、コントロール被験者）におけるＯＧＧＡ分布を示す。本発明のＯＧＧＡ切断アッセイが、１２３名の健康な提供者から得られた血液サンプルを用いて行われた。５．５以下のＯＧＧＡが低い（コントロール群の４％未満）と定義され、５．５を越えるＯＧＧＡが正常と定義される。
図５は、男性および女性におけるＯＧＧＡの比較を示す。図４に示された１２３名のＯＧＧＡ分布を男性（Ｎ＝５３）および女性（Ｎ＝７０）について別々にプロットした。
図６は、喫煙者および非喫煙者におけるＯＧＧＡの比較を示す。図４に示された１２３名のＯＧＧＡ分布を喫煙者（Ｎ＝３５）および非喫煙者（Ｎ＝８８）について別々にプロットした。
図７は、２つの年齢群におけるＯＧＧＡの比較を示す。図４に示された１２３名のＯＧＧＡ分布を５０歳未満（Ｎ＝３４）および５０歳以上（Ｎ＝８９）について別々にプロットした。
図８は、明らかな健康者と乳ガン患者または慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）患者とにおけるＯＧＧＡを示す（図８ａ〜図８ｄ）。図８ａ−７０名の健康な女性からなるコントロール群（図５参照）のＯＧＧＡ分布、３１名の乳ガン患者のＯＧＧＡ分布（図８ｂ）。図８ｃ−１２３名の被験者からなるコントロール群におけるＯＧＧＡ分布、１９名のＣＣＬ患者のＯＧＧＡ分布（図８ｄ）。
図９は、明らかな健康者と肺ガン（ＮＳＣＬＣ）患者とにおけるＯＧＧＡを示す（図９ａ〜図９ｂ）。図９ａ−１２３名の健康者（図４参照）からなるコントロール群におけるＯＧＧＡ分布、１０２名の肺ガン（ＮＳＣＬＣ）患者のＯＧＧＡ分布（図９ｂ）。
図１０は、明らかな健康者とリンパ腫患者とにおけるＯＧＧＡを示す（図１０ａ〜図１０ｂ）。図１０ａ−１２３名の健康者（図４参照）からなるコントロール群におけるＯＧＧＡ分布、１８名のリンパ腫患者のＯＧＧＡ分布（図１０ｂ）。
図１１は、明らかな健康者と結腸直腸ガン患者とにおけるＯＧＧＡを示す（図１１ａ〜図１１ｂ）。図１１ａ−１２３名の健康者（図４参照）からなるコントロール群におけるＯＧＧＡ分布、１６名の結腸直腸ガン患者のＯＧＧＡ分布（図１１ｂ）。
図１２は、本発明の教示に従った単分子ユニバーサル基質（図１２ａ）および多分子ユニバーサル基質（図１２ｂ）の概略図である。

本発明は、（ｉ）ガンを発症する被験者の危険性（例えば、オッズ比、相対的危険性）を明らかにするために、（ｉｉ）ガン患者の施されるガン治療の有効性および投与量を評価するために、そして（ｉｉｉ）少なくとも１つのＤＮＡ修復／損傷防止酵素の活性と少なくとも１つのガンとの間における相関または非相関の存在を明らかにするために使用することができる方法およびキットに関する。

本発明による方法およびキットの原理および操作は、図面および付随する説明を参照してより十分に理解することができる。

本発明の少なくとも１つの実施形態を詳細に説明する前に、本発明は、その適用において、下記の説明に示されるか、または実施例によって例示される細部に限定されないことを理解しなければならない。本発明は、他の実施形態が可能であり、または様々な方法で実施することができ、または様々な方法で実施される。また、本明細書中で用いられている表現法および用語法は説明のためであり、従って限定として見なされるべきではないことを理解しなければならない。

本発明を考えているとき、ＤＮＡ修復／損傷防止活性における個体間の変化により、ガンの発症しやすさが調節されるという仮説を設けた。

本発明を実施に移しているとき、臨床的使用に容易に適合させることができる実験系が開発された。その結果、現在では、明らかにされたＤＮＡ修復活性を、ガンの危険性を明らかにする際に使用することができ、そしてガンの防止、早期検出および予後における手段として用いることができるようになっている。ＤＮＡ傷の種類は非常に大きいので、現在、実験の中心は、量が多く、かつ変異誘発性のＤＮＡ傷である８−オキソグアニン（これはまた、７，８−ジヒドロ−８−オキソグアニンまたは８−ヒドロキシグアニンと称され、８−オキソＧと呼ばれる）に向けられていた。しかし、他の変異誘発性のＤＮＡ傷、例えば、下記の表３に列記されるＤＮＡ傷（これらに限定されない）を、好適な適合化を行った後、本発明の方法を実施するために同様に使用することができる。

従って、本発明を実施に移しているとき、ＯＧＧ活性の個体間の変化が数タイプのガンに対する増大した感受性と相関するかどうかが調べられた。修復活性がより低い場合、増大した量のＤＮＡ傷がもたらされることがあり、従って、増大した変異率、そしてガンのより早い発生がもたらされることがある。同様に、修復活性がより低いことにより、ガン細胞は、本来的には遺伝毒性であるガン治療に対する感受性が大きくなっている。異なるタイプのＤＮＡ修復が、異なるタイプのガンにおいては重要であるかもしれないことに留意しなければならない。本発明は、非限定的な様式ではあるが、末梢血リンパ球から得られたタンパク質抽出物に存在する１つ以上のＤＮＡ Ｎ−グリコシラーゼ修復酵素の活性によって特定タイプの変異誘発性の傷（８−オキソＧ）がＤＮＡから除かれることに関して例示される。

本発明は、本明細書中では、肺ガン、リンパ腫および結腸直腸ガンに対する危険因子として、７，８−ジヒドロキシ−８−オキソグアニンに対するＤＮＡ Ｎ−グリコシラーゼのＤＮＡ修復酵素活性（８−オキソグアニンＤＮＡ Ｎ−グリコシラーゼ活性；ＯＧＧ）のレベルを使用することに関して例示される。この酵素活性は、末梢血リンパ球から抽出されたタンパク質抽出物において測定され、本明細書中では、ＯＧＧＡ切断アッセイ、ＯＧＧＡアッセイまたはＯＧＧＡ試験として交換可能に示される。

ＯＧＧＡ試験を使用して、ケース・コントロール研究が３０９名の個体について行われた：１２３名の健康者および合計で１８６名の下記のガン患者：１０２名の肺ガン（ＮＳＣＬＣ）患者、３１名の乳ガン患者、１８名のリンパ腫患者、１９名のＣＬＬ患者および１６名の結腸直腸ガン患者。下記の結果が見出された。

５０歳未満の健康者における平均ＯＧＧＡ（７．６±０．９；Ｎ＝３４）は、５０歳以上の健康者における場合（７．０±１．０；Ｎ＝８９）よりもわずかに大きかった。この違いは統計学的に有意である（Ｐ＝０．０２）。

健康な男性における平均ＯＧＧＡ（７．３±０．９；Ｎ＝５３）は健康な女性（７．１±１．０；Ｎ＝７０）と類似していたが、この違いは統計学的に有意ではなかった（Ｐ＝０．３６）。

喫煙者における平均ＯＧＧＡ（７．３±１．００；Ｎ＝３５）は非喫煙者の平均ＯＧＧＡと類似していた（７．１±１．０；Ｎ＝８８；Ｐ＝０．４６）。このことは、喫煙状態は、ＯＧＧＡに対して無視できるほどの影響を有したことを示している。

肺ガン患者における平均ＯＧＧＡ（６．５±１．５；Ｎ＝１０２）は、Ｐ＝０．０００１で、健康者の場合（７．２±１．０；Ｎ＝１２３）よりも統計学的に小さかった。

強い関連が、カットオフレベル（それぞれ、≦７．３および≦５．６）の定義に依存して、３．９（９５％ＣＩ：１．７〜８．６、Ｐ＝０．０００９）から９．０（９５％ＣＩ：３．２〜２５．０、Ｐ＝０．０００１）までの範囲のオッズ比で、低いＯＧＧＡと肺ガンとの間において見出された。このことは、低いＯＧＧＡ値が肺ガンにおける危険因子であることを示している。

リンパ腫患者における平均ＯＧＧＡ（６．２±１．８；Ｎ＝１８）は、Ｐ＝０．０００１で、健康者の場合（７．２±１．０；Ｎ＝１２３）よりも統計学的に小さかった。

低い修復は、５．５ユニット／μｇタンパク質以下のＯＧＧＡ値と定義されるが、これは健康者の４％未満である。正常な修復は、５．５ユニット／μｇタンパク質を越えるＯＧＧＡとして定義される。年齢について調節した後では、リンパ腫患者は、低いＯＧＧＡ値を有する可能性が、健康なコントロールよりも１５倍大きかった（オッズ比：１５．２；９５％信頼性区間：３．７〜６２．５）。このことは、低いＯＧＧＡ値がリンパ腫における危険因子であるという証拠をもたらしている。

データにより、ＯＧＧＡが、１６名のうち２名（１２％）の結腸直腸ガン患者で低かったことが示される（５／１２３と比較して、すなわち、健康者における４．１％）。このことは、低いＯＧＧＡが結腸直腸ガンにおける危険因子であることを示している。

ＯＧＧＡの分布は、乳ガン患者では正常であった。このことは、ＯＧＧＡがこのタイプのガンにおける危険因子でないことを示している。

ＯＧＧＡ試験、そして他のＤＮＡ修復活性に対する類似する試験を、ガンの防止、早期診断および予後のための個体のスクリーニングのために使用できることが理解される。これらの使用は下記にさらに詳しく記載される。

下記には、いくつかの例が示される：
（ｉ）肺ガンを防止するために、ＯＧＧＡが低い喫煙者についてスクリーニングすること。
８５％の肺ガン患者は喫煙者であるが、喫煙者の大多数は、喫煙の発ガン作用に対してうまく対処しており、肺ガンが発生しない。ヘビースモーカーの間でさえ、約９０％はこの疾患が発症しない（Ｍａｔｔｓｏｎ他、１９８７；Ｍｉｎｎａ他、２００２）。本明細書中に示される結果により、喫煙と低いＯＧＧＡとの組合せは肺ガン感受性の劇的な増大を生じさせるという事実が明瞭になっている。例えば、３０歳の喫煙者の推定される危険性は、ＯＧＧＡ値が３．０である場合、基準（ＯＧＧＡ値が７．０である３０歳の非喫煙者）よりも２２１倍大きい。比較のために、３０歳の非喫煙者の推定される危険性は、ＯＧＧＡ値が３．０である場合、基準よりも１２倍大きいにすぎない。この発見に対する最も簡単な説明は、末梢血リンパ球におけるＯＧＧＡが低い喫煙者は、その肺においてもまたＯＧＧＡがより低いということである。まず第一に、低い修復を有する場合、喫煙は、ＤＮＡ損傷のさらなる過剰な負荷をもたらし、従って、大きいガン危険性をもたらす。これは、ガンを発症させる危険性が遺伝的要因（ＤＮＡ修復のレベル）と外部要因（喫煙）との組合せである古典的な一例である。そのような個体は、説得して禁煙させることができる。そのようなスクリーニングは、肺ガンに対する予防的手段として効果的であり、究極的には肺ガンの発生率の低下をもたらす。
（ｉｉ）職業的有害要因を回避すること。
相当数の人々が、放射線または煙を取り扱うところで作業している。これらには、病院における放射線医学部門、核産業、原子炉、核兵器を取り扱う軍事部門などが含まれる。これらの人々は、自身の安全のために、義務的な試験として、ＯＧＧＡについて検査することができる。イオン化放射線および煙はそれぞれ８−オキソＧを生じさせるので、ＯＧＧＡが低い個体は、そのようなところではガンを発症する可能性が増大していると考えられる。そのような個体は、別の作業環境を探すことが勧められる。
（ｉｉｉ）ガン治療に対する予後マーカーとしてＯＧＧＡ値を使用すること。
ガン治療は化学薬品および放射線に大きく頼っている。これらの作因は、ほとんどの場合、大量のＤＮＡ損傷を与え、これにより、迅速に***しているガン細胞の選択的な殺傷を生じさせることによって作用する。そのような治療的作因に関する問題は、ガンでない細胞にも損傷を与え、またはガンでない細胞をも殺すということである。ガン患者におけるＯＧＧＡのレベルを知ることは、特定の治療的処置の予後を推定するためのマーカーとして使用することができる。
（ｉｖ）リンパ腫または結腸直腸ガンに対する感受性についてスクリーニングすること。
ＯＧＧＡを、リンパ腫または結腸直腸ガンに対する感受性について個体をスクリーニングするために使用することができる。
（ｖ）ガンの早期検出。
ＯＧＧＡが低い個体（例えば、禁煙しない、ＯＧＧＡが低い喫煙者）に、肺ガンの早期検出を可能にするために、定期的な追跡観察を受けるように勧めることができる。

従って、本発明の１つの局面により、ガンを発症する被験者の危険性を明らかにする方法が提供される。本発明のこの局面による方法は、ＤＮＡ修復／損傷防止酵素の活性レベルを示し得る因子のレベルを測定し、そしてそのレベルに従って、ガンを発症する被験者の危険性を明らかにすることによって行われる。

本明細書中を通して使用される用語「示し得る」は、相関することを包含する。

本発明の別の局面により、ガンを発症する被験者の危険性を明らかにする方法が提供される。本発明のこの局面による方法は、ガンを発症させる増大した危険性に関連する、喫煙、そして煙またはイオン化放射線に対する職業的被爆などの環境的条件に対する暴露の存在または非存在を明らかにし、そしてＤＮＡ修復／損傷防止酵素の活性レベルを示し得る因子のレベルを測定し、そしてその存在または非存在およびそのレベルに従って、ガンを発症する被験者の危険性を明らかにすることによって行われる。

いくつかの方法はどれも、被験者の組織におけるＤＮＡ修復／損傷防止酵素の活性レベルを示し得る因子のレベルを測定する際に本発明に従って利用することができる。

１つの実施形態により、ＤＮＡ修復／損傷防止酵素の活性レベルを示し得る、ＤＮＡ修復／損傷防止酵素のタンパク質レベルが測定される。いくつかの選択可能な定量アッセイを、タンパク質レベルを測定するために用いることができる。それらはそれぞれが、タンパク質とそれに対して特異的な抗体との間における特異的な相互作用に基づいている。下記の表１には、種々のＤＮＡ修復／損傷防止酵素を認識する知られている抗体が示される。

^（１）Ｓｌｕｐｐｈａｎｇ，Ｇ．、Ｅｆｔｅｄａｌ，Ｉ．、Ｋａｖｉｌ，Ｂ．、Ｂｈａｒａｔｉ，Ｓ．、Ｈｅｌｌｅ，Ｎ．Ｍ．、Ｈａｕｇ，Ｔ．、Ｌｅｖｉｎｅ，Ｄ．Ｗ．、Ｋｒｏｋａｎ，Ｈ．Ｅ．（１９９５）、ＵＮＧ遺伝子に由来する組換えヒトウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼの性質、およびＵＮＧは主要なウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼをコードするという証拠、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３４、１２８〜１３８。
^（２）Ｍｏｎｄｅｎ，Ｙ．、Ａｒａｉ，Ｔ．、Ａｓａｎｏ，Ｍ．、Ｏｈｔｓｕｋａ，Ｅ．、Ａｂｕｒａｔａｎｉ，Ｈ．、Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ，Ｓ．（１９９９）、ヒトＭＭＨ（ＯＧＧ１）タイプ１ａタンパク質はヒト細胞における８−ヒドロキシグアニン傷を修復するための主要な酵素である、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．、２５８、６０５〜６１０。
^（３）Ｐａｒｋｅｒ，Ａ．、Ｇｕ，Ｙ．およびＬｕ，Ａ．−Ｌ．（２０００）、ウシ肝臓ミトコンドリアから得られた大腸菌ＭｕｔＹミスマッチ修復タンパク質の哺乳動物ホモログの精製および特徴づけ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．、２８、３２０６〜３２１５。
^（４）Ｋａｎｇ，Ｄ．、Ｎｉｓｈｉｄａ，Ｊ．、Ｉｙａｍａ，Ａ．、Ｎａｋａｂｅｐｐｕ，Ｙ．、Ｆｕｒｕｉｃｈｉ，Ｍ．、Ｆｕｊｉｗａｒａ，Ｔ．、Ｓｅｋｉｇｕｃｈｉ，Ｍ．およびＴａｋｅｓｈｉｇｅ，Ｋ．（１９９５）、ヒト細胞における８−オキソ−ｄＧＴＰａｓｅの細胞内局在性、特にミトコンドリアにおけるこの酵素の役割について、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７０、１４６５９〜１４６６５。
^（５）Ｌａｄｎｅｒ，Ｒ．Ｄ．およびＣａｒａｄｏｎｎａ，Ｓ．Ｊ．（１９９７）、ヒトｄＵＴＰアーゼ遺伝子は核およびミトコンドリアの両方のイソ型をコードする、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７２、１９０７２〜１９０８０。
^（６）Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ，Ｄ．Ｋ．、Ｒａｗｓｏｎ，Ｔ．Ｙ．、Ｓｈｏｗａｌｔｅｒ，Ｓ．Ｄ．およびＷｉｌｓｏｎ，Ｓ．Ｈ．（１９９５）、ホルボールエステルはチャイニーズハムスター卵巣細胞におけるＤＮＡアルキル化剤によるＤＮＡポリメラーゼβのアップレギュレーションを妨げる、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７０、１６４０２〜１６４０８。
^（７）Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ，Ｄ．Ｋ．、Ｈｕｓａｉｎ，Ｉ．、Ａｒｔｅａｇａ，Ｃ．Ｌ．およびＷｉｌｓｏｎ，Ｓ．Ｈ．（１９９９）、選択されたヒト腫瘍細胞株におけるＤＮＡポリメラーゼβの発現の違い、Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ、２０、１０４９〜１０５４。

何らかの特定のタンパク質を認識する抗体を、免疫系の細胞が、目的とするタンパク質の少なくとも１つのエピトープに、好ましくは多数のそのエピトープにインビボまたはインビトロで曝される、この分野で広く知られている様々な方法を使用して容易に誘発させることができる。そのような抗体はポリクローナルまたはモノクローナルであり得る。商業的な抗体開発サービスを世界中で利用することができる。例には、Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）、ＴＮＢ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．（Ｓｔ Ｊｏｈｎ’ｓ、Ｎｅｗｆｏｕｎｄｌａｎｄ、カナダ）、およびＧｅｎｅｍｅｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｉｎｃ．（Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）が含まれる。

そのような抗体は、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、タンパク質チップアッセイおよび抗体チップアッセイ（これらに限定されない）を含む、様々な広く知られている抗体型検出アッセイにおいて使用することができる。

ウエスタンブロットでは、総タンパク質調製物が、ゲルにより、典型的にはポリアクリルアミドゲルにより、典型的には変性条件下、そして場合により還元条件下で電気泳動される。次いで、タンパク質はメンブランに転写され、その後、ミルクタンパク質などの非特異的なタンパク質によってブロッキングされる。次いで、目的とするタンパク質に対して特異的な抗体をブロットと相互作用させる。抗体は、目的とするタンパク質に定量的に結合する。抗体と目的タンパク質との間における結合を、抗体を直接標識することによって、または好ましくは、最初の抗体を認識することができる標識された二次抗体を使用することによって、そのいずれでもモニターすることができる。

ＥＬＩＳＡでは、目的とするタンパク質と結合することができる抗体が、定量的検出のために役立つ比色測定反応を触媒することができる酵素に結合される。

タンパク質チップアッセイでは、タンパク質のマトリックスが形成されるように、目的とするタンパク質、典型的には、多数の異なる目的とするタンパク質が、利用可能な位置で固体担体に結合させられる。抗体、または特定のタンパク質に対して特異的で、識別可能な標識によってそれぞれが標識されているいくつかの抗体を、生物学的サンプルに由来するタンパク質の存在下で担体と相互作用させる。抗体によって認識され、かつ生物学的サンプルに存在するタンパク質は、固体担体に結合しているその対応体と競合し、その結果、担体上のそれぞれの利用可能な位置に対する抗体の結合レベルを、結合に対するそのような競合によって測定することができるようになる。

抗体チップアッセイでは、異なるタンパク質とそれぞれが結合することができる抗体のマトリックスが形成されるように、抗体が、利用可能な位置で固体担体に結合させられる。生物学的サンプルに由来するタンパク質が標識され、そして標識されたタンパク質を固体担体と相互作用させる。サンプルにおけるタンパク質のレベルを示し得る、固体担体に対する結合レベルが測定される。

これらのアッセイは広く知られており、この分野の文献に詳しく記載されている。さらなる詳細を、例えば、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、第Ｉ巻〜第ＩＩＩ巻、Ｃｏｌｉｇａｎ Ｊ．Ｅ．編（１９９４）；Ｓｔｉｔｅｓ他（編）、「Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（第８版）、Ａｐｐｌｅｔｏｎ＆Ｌａｎｇｅ、Ｎｏｒｗａｌｋ、ＣＴ（１９９４）；ＭｉｓｈｅｌｌおよびＳｈｉｉｇｉ（編）、「Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８０）に見出すことができる。様々な利用可能な免疫アッセイが特許および科学文献に詳細に記載されている：例えば、米国特許第３７９１９３２号、同第３８３９１５３号、同第３８５０７５２号、同第３８５０５７８号、同第３８５３９８７号、同第３８６７５１７号、同第３８７９２６２号、同第３９０１６５４号、同第３９３５０７４号、同第３９８４５３３号、同第３９９６３４５号、同第４０３４０７４号、同第４０９８８７６号、同第４８７９２１９号、同第５０１１７７１号および同第５２８１５２１号；「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ」、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ（１９８６）；「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」、第１巻〜第３１７巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ｍａｒｓｈａｋ他、「Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｏｕｒｓｅ Ｍａｎｕａｌ」、ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ（１９９６）を参照のこと。

本発明の別の実施形態により、ＤＮＡ修復／損傷防止酵素の活性レベルを同様に示し得る、ＤＮＡ修復／損傷防止酵素をコードするＲＮＡ（ｍＲＮＡなど）のレベルが測定される。いくつかの選択可能な定量アッセイを、ＲＮＡレベルを測定するために用いることができる。それらはそれぞれが、相補的な核酸同士の間における特異的な相互作用に基づいている。下記の表２には、ＤＮＡ修復／損傷防止酵素をコードするヒト遺伝子が示される：

ヒトゲノムのコード配列の大部分（ほぼすべて）がクローン化され、配列決定されているので、ＤＮＡ修復／損傷防止酵素の未だ報告されていないヒト遺伝子を、今日では、インシリコ検索を使用して容易に単離することができる。本明細書中下記に示される参考文献の一覧においてさらに記載されるように、遺伝子単離の従来の方法もまた利用することができる。

遺伝子の配列に基づいて、ノーザンブロット、定量的なＲＮＡ ＰＣＲ（これはまた定量的ＲＴ−ＰＣＲとして知られている）、ＲＮＡドットブロット、および核酸チップアッセイを、生物学的サンプルにおける特定のＲＮＡ（ｍＲＮＡなど）のレベルを測定するために容易に開発することができ、そして使用することができる。これらのアッセイに関するさらなる詳細を、例えば、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他（１９８９）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、第Ｉ巻〜第ＩＩＩ巻、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．編（１９９４）；Ａｕｓｕｂｅｌ他、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ（１９８９）；Ｐｅｒｂａｌ、「Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ」、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）；Ｗａｔｓｏｎ他、「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ」、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｏｏｋｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｂｉｒｒｅｎ他（編）、「Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｓｅｒｉｅｓ」、第１巻〜第４巻、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９８）；「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」、Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．編（１９８４）；「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」、Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．およびＨｉｇｇｉｎｓ，Ｓ．Ｊ．編（１９８５）；「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ」、Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．およびＨｉｇｇｉｎｓ，Ｓ．Ｊ．編（１９８４）；「ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ（１９９０）に見出すことができる。

別の実施形態において、そして下記に詳しくさらに記載され、かつ下記の実施例の節によって例示されるように、測定される因子は、ＤＮＡ修復／損傷防止酵素の触媒活性そのものである。

本発明は、ガンを発症する被験者の危険性を明らかにすることにおいて有用である。この場合、それにより、任意のタイプのガンが、本発明の方法を実施することによって危険性決定に付される。すべてのガンがＤＮＡの変異から生じること、そして原発性腫瘍から転移性腫瘍への特定のガンの進行は、ガン細胞が発達して、よりガン性になり（例えば、より迅速に増殖し、増殖制御を免れ、自己シグナル伝達挙動を獲得し、血管形成の誘導などを行い）、そしてより転移性になるにつれて変異を蓄積するガン細胞のクローン選択を反映していることが広く知られている。このプロセスは、種々のガンの成長および発達に関与する特定の遺伝子に依存して、様々な変化を受けやすい。従って、インビボでの異なるＤＮＡ修復／損傷防止活性が、異なるガンの形成を防止するために必要であることが予想される。また、煙および放射線などの遺伝毒性因子に対する身体組織の暴露レベルは異なる。遺伝毒性因子のタイプが異なると、異なるタイプのＤＮＡ傷が生じるので、再度ではあるが、インビボでの異なるＤＮＡ修復／損傷防止活性が、異なるガンの形成を防止するために必要であることが予想される。

低いＯＧＧＡが、試験されたガンのすべてではないが、いくつかと関連することが見出されたので、本発明を実施に移しているときに得られた結果は上記と一致している。しかしながら、本明細書中に記載されるＯＧＧＡアッセイと類似するアッセイを、他のガンを１つ以上のＤＮＡ傷（そのいくつかが下記の表３に示される）と相関させるために容易に開発することができる。

実際、すべての知られているガンを、その存在と、あるタイプの低いＤＮＡ修復／損傷防止活性の存在との間における相関または非相関を見出すことによって評価することができる。正の相関が確認されると、予測可能な危険性決定アッセイを容易に実施することができる。

従って、本発明の１つの局面により、少なくとも１つのＤＮＡ修復／損傷防止酵素の活性と少なくとも１つのガンとの間における相関または非相関の存在を明らかにする方法が提供される。本発明のこの局面による方法は、多数のガン患者および多数の明らかに正常な固体に由来する組織における少なくとも１つのＤＮＡ修復／損傷防止酵素の活性レベルを測定し、そしてそのレベルに従って、少なくとも１つのＤＮＡ修復／損傷防止酵素の活性と少なくとも１つのガンとの間における相関または非相関を明らかにすることによって行われる。本発明のこの局面は、一部のガンについては相関が見出されるが、他のガンについては非相関が見出された多数のガンについて、１つの傷をその内部に有する好適な基質を使用して、１つのＤＮＡ修復酵素活性（８−オキソグアニンＤＮＡグリコシラーゼ）に関して本明細書中に例示される。

従って、本明細書中に記載される、ガンを発症する被験者の危険性を明らかにする方法は、肺ガン（例えば、小細胞肺ガンおよび非小細胞肺ガン）、血液ガン（例えば、リンパ腫および白血病、これには、例えば、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病などが含まれる）、結腸直腸ガン、乳ガン、前立腺ガン、卵巣ガン、悪性メラノーマ、胃ガン、膵臓ガン、泌尿器ガン、子宮ガン、骨ガン、肝臓ガン、甲状腺ガン、脳ガン、頭頸部ガン（例えば、唾液腺ガンおよび咽頭ガンを含む）（これらに限定されない）を含む様々なガンについて実施することができる。

ＤＮＡ修復／損傷防止活性は、知られている方法によって受診者から集めることができる種々の身体組織または細胞の抽出物において測定することができる。血液細胞、切屑細胞（例えば、口内または皮膚の切屑物）および生検物が、そのような組織は診断のために被験者から日常的に取られているので、良好な例である。

数タイプのＤＮＡ修復／損傷防止活性を本発明に従ってアッセイすることができ、例えば、ＤＮＡ Ｎ−グリコシラーゼ、ヌクレオチドプール除去活性（ｄＮＴＰａｓｅ活性、例えば、８−オキソｄＧＴＰａｓｅ）、ＡＰエンドヌクレアーゼ、および（ＤＮＡポリメラーゼβの）デオキシリボースリン酸リアーゼをアッセイすることができる。

ＤＮＡ Ｎ−グリコシラーゼの活性を測定するためのアッセイが、本明細書中では、８−オキソグアニンＤＮＡグリコシラーゼに関して記載され、例示される。これに関して、１つ以上の傷を含むＤＮＡ基質に対するＤＮＡ Ｎ−グリコシラーゼの切断活性をモニターすることが便利である。

８−オキソｄＧＴＰａｓｅの活性をモニターするためのアッセイは、例えば、Ｍｏ他［Ｍｏ，Ｊ．−Ｙ．、Ｍａｋｉ，Ｈ．およびＳｅｋｉｇｕｃｈｉ，Ｍ．（１９９２）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９、１１０２１〜１１０２５］によって記載される通りである。例えば、８−オキソｄＧＴＰａｓｅ活性を、α−^３２Ｐ標識された８−オキソｄＧＴＰの８−オキソｄＧＭＰへの加水分解を測定することによってアッセイすることができる。反応混合物（１２．５μｌ）には、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、４ｍＭのＭｇＣｌ_２、４０ｍＭのＮａＣｌ、２０μＭのα−^３２Ｐ標識された８−オキソｄＧＴＰ、８０μｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン、８ｍＭのジチオスレイトール、１０％のグリセロール、およびタンパク質抽出物が含有される。反応が３０℃で２０分間行われる。その後、反応混合物からの一部（２μｌ）がＰＥＩ−セルロースＴＬＣプレートにスポットされ、混合物が、１時間、１ＭのＬｉＣｌを含有する溶液で分画される。ＴＬＣプレート上のスポットが、その後、リン光画像化によって可視化され、定量される。８−オキソｄＧＴＰの調製はＭｏ他（同書）に記載される。

ＡＰエンドヌクレアーゼの活性をモニターするためのアッセイは、例えば、Ｗｉｌｓｏｎ ＩＩＩ他［Ｗｉｌｓｏｎ ＩＩＩ，Ｄ．Ｍ．、Ｔａｋｅｓｈｉｔａ，Ｍ．、Ｇｒｏｌｌｍａｎ，Ａ．Ｐ．、Ｄｅｍｐｌｅ，Ｂ．（１９９５）、ＤＮＡにおける脱塩基部位アナログにおけるヒトアプリンエンドヌクレアーゼ（Ａｐｅ）の切断活性、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７０、１６００２〜１６００７］によって記載される通りである。反応混合物（１０μｌ）には、５０ｍＭのＨｅｐｅｓ−ＫＯＨ（ｐＨ７．５）、５０ｍＭのＫＣｌ、１００μｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン、１０ｍＭのＭｇＣｌ_２、０．０５％のトリトンＸ−１００、２ｐｍｏｌのＤＮＡ基質、およびタンパク質抽出物が含有される。反応が３７℃で５分間〜３０分間行われ、その後、反応生成物が尿素−ＰＡＧＥによって分画され、無傷なＤＮＡ鎖と切断されたＤＮＡ鎖とが分離される。活性が、基質の切断度から求められる。基質の調製は同じ参考文献（Ｗｉｌｓｏｎ ＩＩＩ他、同書）に記載される。

デオキシリボースリン酸リアーゼ（ｄＲＰａｓｅ）の活性をモニターするためのアッセイは、例えば、Ｐｒａｓａｄ他［Ｐｒａｓａｄ，Ｒ．、Ｂｅａｒｄ，Ｗ．Ａ．、Ｓｔｒａｕｓｓ，Ｐ．Ｒ．およびＷｉｌｓｏｎ，Ｓ．Ｈ．（１９９８）、ヒトＤＮＡポリメラーゼβのデオキシリボースリン酸リアーゼ：基質特異性および触媒機構、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７３、１５２６３〜１５２７０］によって記載される通りである。デオキシリボースリン酸リアーゼ（ｄＲＰａｓｅ）の活性は、部位特異的に５’が切断された脱塩基部位を含有する、^３２Ｐで３’末端標識された二重鎖オリゴヌクレオチドからのデオキシリボースリン酸の除去を追うことによってアッセイすることができる。反応混合物（１０μｌ）には、５０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）、２ｍＭのジチオスレイトール、５ｍＭのＭｇＣｌ_２、２０ｎＭの、部位特異的な脱塩基部位を有する^３２Ｐ標識された二重鎖オリゴヌクレオチド（ＡＰエンドヌクレアーゼで５’が事前に切断されたもの）、およびタンパク質抽出物が含有される。反応が３７℃で１５分間行われる。反応を停止させた後、ＮａＢＨ_４を３４０ｍＭの最終濃度に添加し、０℃で３０分間インキュベーションすることによって、生成物が安定化される。その後、ＤＮＡがエタノール沈殿され、尿素−ＰＡＧＥによって分画される。ｄＲＰａｓｅの活性が、短い方の反応生成物の生成度から求められる。ＤＮＡ基質の調製は同じ参考文献（Ｐｒａｓａｄ他、同書）に記載される。

下記の表３には、ＤＮＡ修復酵素、ＤＮＡ修復酵素をコードする遺伝子、およびＤＮＡ修復酵素が認識するＤＮＡ傷の例が示される。

酵素１〜８はＤＮＡグリコシラーゼである；
酵素９および１０は、損傷したｄＮＴＰまたは非天然ｄＮＴＰを加水分解し、それによりＤＮＡ合成時におけるＤＮＡへのそれらの取り込みを防止する；
哺乳動物のＤＮＡ修復遺伝子および活性に関するさらなる詳細を、Ｋｒｏｋａｎ他（２０００）、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ、４７６：７３〜７７；Ｗｏｏｄ他（２００１）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９１：１２８４〜１２８９（これらはともに参考として本明細書中に組み込まれる）に見出すことができる。

本発明による危険性は多数の方法のいずれかで表すことができる。１つの例では、危険性は、正常で、明らかに健康な集団（すなわち、参照コントロール群）と比較したとき、ガンを発症することにおける危険性増大倍数として表される。別の例では、危険性は酵素の比活性ユニット数で表される。別の例では、線型的または対数的な危険性の尺度が、「危険性増大倍数」または「活性ユニット数」のいずれかについて作製され、そして危険性は尺度の大きさで表される。

記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、ＤＮＡ修復／損傷防止酵素の活性レベルを測定することは、少なくとも１つの傷をその内部に有するＤＮＡ基質を使用して行われる。

図１２ａ〜図１２ｂによって概略的に例示されるように、単分子ユニバーサル基質（ＭＭＳ、図１２ａ）または多分子ユニバーサル基質（ＰＭＳ、図１２ｂ）もまた作製し、使用することができ、そしてこれらにより、本発明の方法およびキットが実施される。そのようなユニバーサル基質は、２つ以上のＤＮＡ修復／損傷防止酵素の活性を同時に測定するために、本発明に従って使用される。従って、本発明のユニバーサル基質は、少なくとも２つの異なるＤＮＡ修復酵素によって特異的に認識される少なくとも２つの異なるＤＮＡ傷を含む（４つの傷が、図１２ａ〜図１２ｂに示され、Ｌ１〜Ｌ４によって識別される）。ユニバーサル基質に沿って異なるＤＮＡ傷の位置を慎重に選択することを、異なるＤＮＡ修復酵素の活性を示し得る識別可能な反応生成物（例えば、サイズ識別可能な反応生成物）（図１２ａにおけるＰ１〜Ｐ１０、図１２ｂにおけるＰ１１〜Ｐ１４）の生成を確実にするために使用することができる。正確性を確保するために、傷は、試験される活性に対して特徴的であるように選択される。その長さ方向に沿って標識を好ましくは含むユニバーサル基質の長さは、特に単分子基質については、相互の反応生成物が、分析される反応生成物のすべて（図１２ａにおけるＰ１〜Ｐ１０）よりも実質的に長くなるよう選択される。末端標識することを、この問題を完全に避けるために、多分子基質の場合において使用することができる。従って、本発明による基質の長さは、限定されることなく、１０塩基対〜数百基対の範囲にすることができる。

従って、本発明の基質は、少なくとも１つのタイプの少なくとも１つの傷、または少なくとも２つのタイプの少なくとも１つの傷（ユニバーサル基質）を有することができ、この場合、傷は、好ましくは、ＤＮＡ基質において所定の位置に配置される。傷は任意のタイプであり得るが、これには、ウラシル、５−フルオロウラシル、５−ヒドロキシウラシル、イソジアルル酸、アロキサン、Ｕ／ＴｐＧ：５ｍｅＣｐＧにおけるウラシルまたはチミン、ウラシル（Ｕ：Ｇ）、３，Ｎ^４−エテノシトシン、（ｅＣ：Ｇ）、Ｔ（Ｔ：Ｇ）、３−メチルアデニン、７−メチルアデニン、３−メチルグアニン、７−メチルグアニン、ヒポキサンチン、１，Ｎ６−エテノアデニン、１，Ｎ２−エテノグアニン、チミングリコール、シトシングリコール、ジヒドロウラシル、ホルムアミドピリミジンウレア、Ａ：Ｇ由来のアデニン、Ａ：８−オキソＧ由来のアデニン、Ｃ：Ａ由来のアデニン、２−ヒドロキシアデニン、２，５−アミノ−５−ホルムアミドピリミジン、７，８−ジヒドロ−８−オキソグアニン、および脱塩基部位が含まれるが、これらに限定されない。

傷は、オリゴデオキシヌクレオチドの合成において使用される４つの通常のホスホルアミダイト構成成分と、ＤＮＡ内に導入されたとき、ＤＮＡ修復酵素によって認識され得る傷をその中に導入するさらなる少なくとも１つの修飾されたホスホルアミダイト構成成分とを連続して使用する固相ＤＮＡ合成を使用して、ＤＮＡ分子において特定の規定された位置（部位）に導入することができる。別の方法では、ＤＮＡ分子が、１つ以上のタイプの１つ以上の傷をその内部に生じさせる変異誘発剤（例えば、酸化剤またはＵＶ放射線）に曝される。この方法を使用したときでさえ、特定の傷がＤＮＡ内に形成される程度は、多くの場合、ＤＮＡ配列に依存するので、傷がランダムに分布していない生成物（本発明の基質）をもたらすプレ基質を選択することができる。

他の代わりの方法もまた存在する。例えば、プラスミドＤＮＡを酸化剤で酸化することができる。これにより、数個の傷がプラスミドＤＮＡ内に形成される。次に、このプラスミドＤＮＡを使用して、傷の存在位置を正確に知ることなく、このＤＮＡに対して作用する修復酵素をアッセイすることができる。酵素はＤＮＡ内に切れ目をもたらし、これにより、プラスミドはスーパーコイル状の閉じた形態から切れ目のある（開環）形態に変換される。これらの２つは、ゲル電気泳動または勾配遠心分離によって容易に識別することができる。別の例では、ＤＮＡ片が、傷のある構成成分の存在下で酵素的に合成される。化学的な脱アミノ化などの他の代わりの方法もまた知られている。

従って、本発明の基質は、少なくとも２つのタイプの少なくとも２つの異なる傷、または１つの傷、または１つのタイプの少なくとも２つの異なる傷を含むことができる。

本発明によるガン危険性決定試験は、ガンを発症させる増大した危険性と関連する環境条件（例えば、喫煙、そして煙、イオン化照射線および他の発ガン因子に対する職業的被爆など）に曝されることが知られているか、またはそのような環状条件に曝されようとしている被験者について特に好都合である。

本明細書中上記で議論されたように、ガン治療の有効性は、正常な細胞よりも、ガン細胞に対して大きい影響を及ぼすその遺伝毒性作用のためである。従って、本発明の別の局面により、被験者における化学療法および／または放射線療法などの変異誘発性の抗ガン処置の効力を予測する方法が提供される。本発明のこの局面による方法は、被験者の組織におけるＤＮＡ修復酵素の活性レベルを測定し、そしてそのレベルに従って、被験者における変異誘発性の抗ガン処置の効力を予測することによって行われる。

抗ガン治療の投与量はまた、本発明の教示を考慮して個々に最適化することができる。従って、本発明のさらに別の局面により、被験者を処置するための化学療法および／または放射線療法などの変異誘発性の抗ガン処置の投与量を選択する方法が提供される。本発明のこの局面による方法は、被験者の組織におけるＤＮＡ修復／損傷防止酵素の活性レベルを測定し、そしてそのレベルに従って、被験者を処置するための変異誘発性の抗ガン処置の投与量を選択することによって行われる。この場合、組織は、好ましくは、ガンそのものに由来する生検物である。

本発明のさらなる局面により、被験者の組織におけるＤＮＡ修復／損傷防止酵素の活性レベルを測定するためのキットが提供される。その最小限の形態において、キットは、密閉可能な容器に含有されて、少なくとも１つの傷をその内部に有するＤＮＡ基質と、ＤＮＡ修復活性を維持するために好適な選択された反応緩衝液とを含むパッケージを含む。好ましくは、キットはまた、リンパ球を分離するための試験管を含む。好ましくは、試験管には、ヘパリン（これに限定されない）などの抗凝固剤が予め入れられている。さらに好ましくは、キットはさらに、遠心分離によってリンパ球を赤血球から分離することにおいて効果的な選択された比重を有する液体を含み、例えば、フィコールがリンパ球単離試験管に含有される。好都合には、キットは、赤血球を溶解することにおいて効果的な選択された浸透圧モル濃度を有する溶液を含む。本発明の好ましい実施形態において、タンパク質抽出緩衝液もまたキットに含まれる。好ましくは、キットはさらに、タンパク質測定を行うための試薬を含み、例えば、ＰｉｅｒｃｅによるＢＣＡキットに含まれる試薬を含む。さらに好ましくは、キットは、当該活性に対するコントロールとして使用される精製されたＤＮＡ修復酵素を含む。

本発明のさらなる目的および利点および新規な特徴は、限定的であることを意図しない下記の実施例を検討したとき、当業者に明らかになる。さらに、本明細書中上記に説明され、そして下記の請求項の節に記載される本発明の様々な実施形態および局面のそれぞれは、実験的裏づけが下記の実施例に見出される。

実施例
次に、下記の実施例が参照される。下記の実施例は、上記の説明と一緒に、本発明を非限定的な様式で例示する。

材料および実験方法
ＤＮＡ基質：ＤＮＡ基質を、それぞれが３２塩基の長さである２つの相補的な合成オリゴヌクレオチドをアニーリングすることによって調製した。オリゴヌクレオチドはワイツマン科学研究所（Ｗｅｉｚｍａｎｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ）の生物学サービス部の合成部門によって合成された。８−オキソＧを含有するオリゴヌクレオチドは配列５’−ＣＣＧＧＴＧＣＡＴＧＡＣＡＣＴＧＴＯＡＣＣＴＡＴＣＣＴＣＡＧＣＧ−３’（配列番号１）（Ｏ＝８−オキソＧ）を有した。８−オキソＧホスホルアミダイト構成成分をＧｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈから購入した。オリゴヌクレオチドを、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを使用して^３２Ｐで標識し、そしてオリゴヌクレオチド５’−ＣＧＣＴＧＡＧＧＡＴＡＧＧＴＣＡＣＡＧＴＧＴＣＡＴＧＣＡＣＣＧＧ−３’（配列番号２）にアニーリングした。放射能標識された二重鎖を非変性１０％ゲルでのＰＡＧＥによって精製した。その濃度をＰｉｃｏＧｒｅｅｎ ｄｓＤＮＡ定量アッセイ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）によって測定した。

血液サンプル：多数の血液サンプルをＳｈｅｂａ医療センターにおける血液バンクから得た。１０ｍｌの末梢血サンプルを健康な提供者またはガン患者から得た。それらは、ｔｈｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｈｅｌｓｉｎｋｉ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅから許可を得た後に集められた。

末梢リンパ球の単離：血液サンプルは、集められた１８時間後〜２４時間後に処理された。全血の各サンプルに由来する１００μｌ部分を、Ｃｏｂａｓ Ｍｉｃｒｏｓ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍ）血球数計測装置を使用して分析した。１０ｍｌのＰＢＳ（ダルベッコのリン酸塩緩衝化生理的食塩水、Ｓｉｇｍａ）を残りの血液部分に加え、そして末梢血リンパ球を、ＵＮＩ−ＳＥＰチューブ（ＮＯＶＡｍｅｄ、Ｊｅｒｕｓａｌｅｍ、イスラエル）におけるポリスクロース−ナトリウムメトリゾアート培地での希釈全血の密度勾配遠心分離によって単離した。遠心分離を、１，０００ｘｇで、２０℃で３０分間行った。

遠心分離後、リンパ球のバンドを取り出し、ＰＢＳ緩衝液で洗浄した。赤血球の除去を、５ｍｌの１５５ｍＭ ＮＨ_４Ｃｌ；０．０１Ｍ ＫＨＣＯ_３；０．１ｍＭ ＥＤＴＡにおける室温で４分間の溶解によって行った。リンパ球をＰＢＳで洗浄し、１ｍｌのＰＢＳに懸濁した。この懸濁物における白血球の数を、Ｃｏｂａｓ Ｍｉｃｒｏｓ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍ）血球数計測装置を使用して測定した。

１〜４ｘ１０^６個の細胞を含有するサンプルを、室温で４分間の５，０００ｒｐｍにおける遠心分離によって沈殿させた。細胞ペレットを、その後、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ７．１）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５ｍＭ ＤＴＴ、０．５ｍＭスペルミジン、０．５ｍＭスペルミンおよびプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ）において２０，０００細胞／μｌの濃度に再懸濁した。細胞を氷上で３０分間インキュベーションし、その後、液体窒素で凍結した。凍結されたリンパ球は−８０℃で保存された。

タンパク質抽出物の調製：凍結されたリンパ球を３０℃で解凍し、その後、そのタンパク質含有物を、２２０ｍＭ ＫＣｌを用いて氷上で３０分間抽出した。細胞破片を、４℃で１５分間の１３，２００ｒｐｍにおける遠心分離によって除いた。グリセロールをタンパク質抽出物に１０％の最終濃度に加え、抽出物を液体窒素で凍結した。タンパク質濃度を、ウシγ−グロブリンを標準品として使用して、ＢＣＡアッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ）によって測定した。

ＯＧＧ活性の標準的な分析：反応混合物（２０μｌ）には、５０ｍＭのＴｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ７．１）、１ｍＭのＥＤＴＡ、１１５ｍＭのＫＣｌ、２０μｇのウシγ−グロブリン、２ｐｍｏｌのポリｄＡ・ポリｄＴ、０．５ｐｍｏｌの基質、および８μｇ〜１２μｇのタンパク質抽出物が含有された。反応を３７℃で３０分間行い、その後、１５ｍＭのＥＤＴＡ／０．２％のＳＤＳを加えることによって停止させた。タンパク質を、プロテイナーゼＫ（２０μｇ）と３７℃で１時間インキュベーションすることによって分解し、その後、８０ｍＭのＮａＯＨを用いて３７℃で３０分間処理した。変性させたＤＮＡ生成物を、８９ｍＭのＴｒｉｓ・ホウ酸塩／２．５ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）に８Ｍの尿素を含有する１５％ポリアクリルアミドゲルでの電気泳動を１，５００Ｖにおいて４５℃〜５０℃で２時間行うことによって分析した。放射能標識されたＤＮＡ生成物の分布を、Ｆｕｊｉ ＢＡＳ２５００リン光画像化装置を使用して可視化し、定量した。１ユニットのＯＧＧ活性は、本明細書中では、本明細書中に記載される標準的な反応条件のもとで１ｆｍｏｌのＤＮＡ基質を３７℃において１時間で切断することとして定義される。下記には、ＯＧＧＡが、比活性として、すなわち、活性ユニット数／１μｇ・総タンパク質抽出物として示される。

統計学的分析：３元ＡＮＯＶＡを、固定された影響としての性別、年齢（５０歳以上、５０歳未満）および喫煙状態に関して平均ＯＧＧＡ値を比較するために、健康者に対して用いた。

スチューデントｔ検定を、連続変数として分析された平均ＯＧＧＡ値を、腺ガン患者と扁平上皮ガン患者との間で比較するために使用した。

症例者とコントロール者との間における平均年齢の差から生じるＯＧＧＡ平均値に対する考えられる影響をうち消すために、ＯＧＧＡ平均値を、共変量としての年齢（連続変数として処理される）を用いてＡＮＣＯＶＡを使用して比較した。有意な交互作用が年齢と健康状態との間に見出されなかったので、この分析は可能であった。

関連を、フィッシャーの直説法を使用して計算し、そしてオッズ比（ＯＲ）を２ｘ２表から計算した。調整されたＯＲおよびＣＩ値を、肺ガンについては年齢および性別および喫煙状態に対する調整とともに、そしてリンパ腫については年齢のみに対する調整とともに、ロジスティック回帰モデルを近似することによって計算した。ＯＧＧＡ値を、連続変数として、あるいはコントロール群の４％（５．５でのＯＧＧＡカットオフ）または５％（５．６でのＯＧＧＡカットオフ）または１０％（５．９でのＯＧＧＡカットオフ）または１５％（６．２でのＯＧＧＡカットオフ）または２５％（６．４でのＯＧＧＡカットオフ）または５０％（７．３でのＯＧＧＡカットオフ）に対応する値における二分化変数として分析した。年齢を連続変数として分析し、これに対して、性別および喫煙状態を二分変数として分析した。

オッズ比（ＯＲ）を、ＯＧＧＡ値が連続変数として分析されるロジスティック回帰モデルから得られるｂ_ｉ推定値（ｂ_ＯＧＧＡ＝−０．６２４；ｂ_年齢＝０．１；ｂ_喫煙者＝２．９）を使用して下記の式（Ｋｌｅｉｎｂａｕｍ、１９９４）によって計算した：

例えば、Ｘ_０（基準）が、７．０のＯＧＧＡ値を有する３０歳の非喫煙者を表すために使用され、そしてＸ_ｉが、試験された被験者群を表すために使用された。従って、現在のモデルに対する式は下記の式になる：

式中、ＯＧＧＡ_ｉおよび年齢_ｉは個体ｉのＯＧＧＡ値および年齢であり、Ｓ_ｉは、喫煙者または非喫煙者に対して、それぞれ、１または０のいずれかである。
すべての統計学的分析は、ＳＡＳソフトウエア（バージョン６．１２；ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｉｎｃ．、Ｃａｒｙ、ＮＣ）を使用して行われた。

実験結果
ＯＧＧ活性（ＯＧＧＡ）ＤＮＡ修復試験：塩基除去修復（ＢＥＲ）はＤＮＡ Ｎ−グリコシラーゼによって開始され、このとき、ＤＮＡ Ｎ−グリコシラーゼにより、損傷した塩基または異常な塩基がＤＮＡから放出され、脱塩基部位が生じる。後者は、その後、ＡＰエンドヌクレアーゼ（ＡＰＥ／ＨＡＰ１）活性および／またはグリコシラーゼのリアーゼ活性ならびにＤＮＡポリメラーゼβのデオキシリボースリン酸リアーゼ（ｄＲＰａｓｅ）活性によって修復される。生じたギャップは、１ヌクレオチド〜３ヌクレオチドのパッチを形成し、その後、連結するＤＮＡポリメラーゼβによって埋められる（Ｄｉａｎｏｖ他、１９９２；Ｓｉｎｇｈａｌ他、１９９５）。ＰＣＮＡおよびＦＥＮ−１フラップエンドヌクレアーゼをも必要とするＢＥＲの長いパッチ経路が同定された（Ｆｏｒｔｉｎｉ他、１９９８；Ｋｉｍ他、１９９８）。８−オキソＧが細胞抽出物においてヌクレオチド除去修復によってもまた修復され得ることが報告された（Ｒｅａｒｄｏｎ他、１９９７）。しかしながら、この発見のインビボでの意味は明らかにされていない（Ｒｕｎｇｅｒ他、１９９５）。さらに、８−オキソＧの修復が転写に共役していること、そしてそのような修復には、ＸＰＧ、ＴＦＩＩＨおよびＣＳＢのタンパク質（Ｌｅ Ｐａｇｅ他、２０００）が要求され、またＢＲＣＡ１およびＢＲＣＡ２のタンパク質（Ｌｅ Ｐａｇｅ他、２０００）が要求されることが報告された。

本発明を実施に移しているとき、ＯＧＧ活性に対するアッセイ（ＯＧＧＡ試験）が、部位特異的な８−オキソＧを有する、^３２Ｐで末端標識された合成オリゴヌクレオチド（３２塩基対の長さ）を基質として使用して開発された。ＯＧＧ活性源は、１０ｍｌの血液サンプルからのフィコール分画化によって得られるヒト末梢血リンパ球（ＰＢＬ）から調製されたタンパク質抽出物であった。タンパク質抽出物は、凍結解凍、続く塩抽出によってリンパ球から調製された。抽出物におけるＯＧＧ活性による８−オキソＧのオリゴヌクレオチドからの除去により、脱塩基部位が生じるが、この脱塩基部位は、この酵素のＡＰリアーゼ活性によって、または抽出物に存在するＡＰエンドヌクレアーゼによって、そのいずれかで迅速に除去された。脱塩基部位を切断するアルカリ処理が、ＯＧＧ活性のみが試験において測定されるように、脱塩基部位の完全な切断を確実にするために抽出物とのインキュベーションの後に行われた。尿素−ＰＡＧＥ、続くリン光画像化による分析が、短い方の放射能標識されたＤＮＡフラグメント（１７ヌクレオチドの長さ、図１ａ）の形成によって示される切断の程度を定量するために使用された。ＯＧＧ活性レベル（ＯＧＧＡ値）は、比活性として、すなわち、１μｇのタンパク質抽出物あたりのＯＧＧ活性のユニット数として測定される。１ユニットのＯＧＧ活性レベルにより、１ｆｍｏｌのＤＮＡ基質が、標準的な反応条件のもとで、３７℃において１時間で切断される。

図１ｂ〜図１ｃおよび図２ａ〜図２ｂには、リンパ球抽出物におけるＯＧＧ活性の経時変化およびタンパク質添加測定がそれぞれ示される。活性は、ＤＮＡ基質における８−オキソＧの存在に依存していた。ＤＮＡ基質が８−オキソＧの代わりにＧを含有したとき、活性は観測されなかった。この観測された活性は主としてＯＧＧ１酵素のためであるが、ＯＧＧ１酵素は、ヒト細胞から調製された抽出物におけるＯＧＧ活性のほとんどを担うことが示された（Ｍｏｎｄｅｎ他、１９９９）。ＯＧＧ２（別のＯＧＧ酵素）の存在が報告された。しかし、その活性は、全細胞抽出物においてＯＧＧ１よりもはるかに低かった（Ｈａｒｚａ他、１９９８）。ＯＧＧに加えて、ＡＰＮＧ（アルキルプリンＤＮＡ Ｎ−グリコシラーゼ）（これはまたＡａｇ（アルキルアデニンＤＮＡグリコシラーゼ）またはＭＰＧ（Ｎ−メチルプリングリコシラーゼ）と称される）が、８−オキソＧに対して作用することが報告された（Ｂｅｓｓｈｏ他、１９９３）が、この発見は、Ｈａｎｇ他（１９９７）において疑問とされた。インビボにおいて、このタンパク質は、少なくともマウスでは、８−オキソＧをＤＮＡから除去する際には大きな役割を有していない（Ｅｎｇｅｌｗａｒｄ他、１９９７；Ｈａｎｇ他、１９９７）。ＭＰＧがリンパ球抽出物によるＤＮＡからの８−オキソＧの除去に関与しているかどうかを明らかにするために、競合実験が、部位特異的なヒポキサンチンを含有する非標識の二重鎖オリゴヌクレオチド（ＯＧＧ１に対してではなく、ＭＰＧに対する基質）を用いて行われた（Ｅｎｇｅｌｗａｒｄ他、１９９７；Ｈａｎｇ他、１９９７を参照のこと）。図３において認めることができるように、この二重鎖オリゴヌクレオチドは、抽出物による８−オキソＧ含有ＤＮＡの切断を阻害しなかった。このことは、ＡＰＮＧがこの切断反応には関与しないことを示唆している。８−オキソＧの代わりにＧを含有する非標識の二重鎖オリゴヌクレオチドの過剰量を用いたコントロール実験は阻害を示さず、これに対して、８−オキソＧ−ＤＮＡを含有する二重鎖オリゴヌクレオチドは、予想されたように、阻害を生じさせた（図３ａ〜図３ｂ）。これらの競合実験は、８−オキソＧに対するＯＧＧＡ試験の特異性を示すものである。

再現性実験は、このアッセイが正確で、非常に再現的であり、変動係数が？１０％であることを示した。再現性実験の一例が表４に示される。

健康な提供者（提供者番号５４）から得られた１２個の血液サンプル（それぞれが１０ｍｌ）をＯＧＧＡのために処理し、アッセイした。１ユニットのＯＧＧ活性により、１ｆｍｏｌのＧＯ含有基質が、標準的な反応条件のもと、３７℃において６０分間で切断される。

健康な提供者（提供者番号５０）から得られた６個の血液サンプル（それぞれが１０ｍｌ）を、タンパク質抽出物を調製するために処理した。表には、異なる３日でこれらのアッセイに関して行われた３回の独立したアッセイの結果が示される。

健康者（コントロール被験者）におけるＯＧＧＡ値。ＯＧＧＡ試験を、１２３名の健康者から得られた血液サンプルについて行った。分布が図４に示される。平均ＯＧＧＡ値は７．２±１．０ユニット／μｇタンパク質であった（これはまた、７．２±１．０のＯＧＧＡ値とも呼ばれる；表５）。

^＊ＳＤ、標準偏差
^＊＊Ｐ値は３元ＡＮＯＶＡの結果である。

ＯＧＧＡの範囲は３．６〜１０．１ユニット／μｇタンパク質であった。これはＯＧＧ活性の２．８倍の範囲を表す。これはかなり狭い活性分布であり、以前の報告（Ａｓａｍｉ他、１９９６）よりも著しく狭い。

性別、年齢（５０歳未満、５０歳以上）および喫煙状態に関する３元ＡＮＯＶＡにより、平均ＯＧＧＡ値において、男性（５３名；７．３±１．０ユニット／μｇタンパク質）と女性（７０名；７．１±１．０ユニット／μｇタンパク質）との間には有意差がないこと（Ｐ＝０．３６、図５；表５）、または喫煙者（Ｎ＝３５；７．３±１．０ユニット／μｇタンパク質）と非喫煙者（Ｎ＝８８；７．１±１．０ユニット／μｇタンパク質）との間には有意差がないこと（Ｐ＝０．４６）が明らかにされた。このことは、喫煙は末梢血リンパ球におけるＯＧＧＡ値に影響しないことを示している（図６；表５）。この結果は、８−オキソＧ修復活性が喫煙者では１．６倍増大していることを報告したＡｓａｍｉ他（１９９６）によって得られた結果とは異なる。対照的に、２つの年齢群の間には、平均ＯＧＧＡ値の小さい（６．６％）が、統計学的に有意な低下が認められた。５０歳未満の個体は７．６±０．９（Ｎ＝３４）の平均ＯＧＧＡ値を有したが、これに対して、５０歳以上の個体は７．０±１．０（Ｎ＝８９）の平均ＯＧＧＡ値を有した（Ｐ＝０．０２；図７；表５）。まとめると、これらの結果は、年齢、喫煙状態および性別に関してＯＧＧＡ値はほとんど変動がないことを示している。

ＯＧＧＡは、乳ガン患者では低下せず、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）では変化する。：ＯＧＧＡ試験を、３１名の乳ガン患者および１９名のＣＬＬ患者から得られた血液サンプルについて行った。表６において認めることができるように、平均ＯＧＧＡ値は、乳ガン患者では７．３±１．４ユニット／μｇタンパク質であり、これはコントロールの女性被験者のＯＧＧＡ値と類似していた（７．１±１．０；Ｐ＝０．２９；表５および表６）。また、ＯＧＧＡ値の分布も類似していた（図８ａ〜図８ｄ）。これらの結果は、ＯＧＧＡが乳ガンにおける危険因子でないことを示している。ＣＬＬ患者の平均ＯＧＧＡ値は７．９±１．５であり、コントロール被験者よりも大きかった（７．２±１．０；Ｐ＝０．０００７；表６）。しかし、ＣＣＬ患者の間におけるＯＧＧＡ値の分布はコントロール群と類似していた（図８ｃ〜図８ｄ）。

^＊ＳＤ、標準偏差
^＊＊ＯＧＧＡ平均値を、共変量としての年齢（連続変数として処理される）を用いてＡＮＣＯＶＡを使用して比較した。乳ガン患者の場合、コントロール群は女性被験者から構成された。

ＯＧＧＡは肺ガンにおける危険因子である。ＯＧＧＡ試験を、手術可能な非小細胞肺ガン（ＮＳＣＬＣ）に罹患しているが、血液サンプルが採取されるときに化学療法または放射線療法のいずれをも受けていない１０２名の患者から得られた血液サンプルを用いて行った。図９ａ〜図９ｂおよび表６において認めることができるように、平均ＯＧＧＡ値は６．０±１．５ユニット／μｇタンパク質であり、これはコントロール者の平均値よりも有意に低かった（７．２±１．０；Ｐ＝０．０００１）。腺ガンまたは扁平上皮ガンに関して症例者を別々に分析することにより、ＮＳＣＬＣのこれらの主要なサブタイプにおける類似するＯＧＧＡレベルが明らかにされた（腺ガン：６．１±１．５、Ｎ＝３７；扁平上皮ガン：５．８±１．６、Ｎ＝３５；Ｐ＝０．４４）（それ以外の３０症例は他のサブタイプまたは非分類ＮＳＣＬＣのいずれかであった）。コントロール者および症例者におけるＯＧＧＡの分布を比較することにより、これらの２つの群の間における差が強調される。図９ａ〜図９ｂにおいて明瞭に認めることができるように、コントロール者と比較して、症例者では、ＯＧＧＡ値の低い方への変化が認められる。例えば、コントロール者の４％のみが？５．５のＯＧＧＡ値を有し、これに対して、症例者の３８％がこの範囲にＯＧＧＡ値を有する。このことは、値がコントロール者の平均ＯＧＧＡ値の１／２〜１／３であることを示している。コントロール群の平均年齢（５７±１４）は、症例者群とは有意に異なっている（６８±１０；Ｐ＜０．０００１）。従って、年齢について調整されたロジスティック回帰を使用して、関連を分析し、そして共分散分析を使用して、年齢調整された平均ＯＧＧＡ値を比較した。

ＯＧＧＡのレベルと肺ガンの存在との間における関連を分析するために、ロジスティック回帰を使用した。この場合、二値従属変数が肺ガンの存在／非存在であり、年齢が連続変数として用いられ、そして性別、喫煙状態およびＯＧＧＡが二分変数として用いられた。後者は、コントロール群の５％（５．６でのＯＧＧＡカットオフ）または１０％（５．９でのＯＧＧＡカットオフ）または１５％（６．２でのＯＧＧＡカットオフ）または２５％（６．４でのＯＧＧＡカットオフ）または５０％（７．３でのＯＧＧＡカットオフ）に対応する値において二分化された。表７において認めることができるように、喫煙は肺ガンと強く関連しており、これは、この疾患における主要な危険因子としてのその確立された役割と一致している。例えば、ＯＧＧＡが、（コントロール者の１０％に対応する）？５．９で二分化されたモデルでは、喫煙者に対するオッズ比（ＯＲ）は２０．８であった（９５％ＣＩ：７．８〜５５．４、Ｐ＝０．０００１）。ＯＧＧＡカットオフが、（コントロール者の５０％に対応する）？７．３として定義されたモデルでは、喫煙者に対するＯＲは２３．０であった（９５％ＣＩ：８．９〜５９．２、Ｐ＝０．０００１）。性別は、これらのモデルのいずれにおいても著しい影響を有しておらず、これに対して、年齢の増大は、肺ガンの存在と関連した。年齢に対するＯＲは、すべてのモデルにおいて相対的に小さかった（１．１ ９５％ＣＩ：１．１〜１．２、Ｐ＝０．０００１）が、統計学的には有意であることには留意すること。年齢を連続変数として分析したところ、１年間の変化について、比較的小さいＯＲが得られる。従って、その最終的な影響は、年齢の特定の変化に適用されたときには、はるかにより大きいと考えられる（下記の表８を参照のこと）。

表７から認めることができるように、明瞭な関連が、ＯＧＧＡのレベルと肺ガンの存在との間に見出された。さらに、用量依存的な影響が認められ、より大きいＯＲが、ＯＧＧＡがより小さい場合に得られる。例えば、３．９、５．２、７．０および９．０のＯＲ値が、それぞれ、７．３、６．４、５．９および５．６のカットオフＯＧＧＡ値について得られた（表７）。これらの大きいＯＲ値は、低いＯＧＧＡと肺ガンとの間における強い関連を示している。そのうえ、ＯＧＧＡの低下に伴うＯＲの増大は関連の有意性をさらに強めている。さらに、ＯＲ値が大きいことにより、コントロール群における偏った選択の可能性が否定される。

ロジスティック回帰モデルは連続変数としての年齢に基づいており、そして二分変数は、喫煙状態（喫煙者、非喫煙者）、性別（女性、男性）およびＤＮＡ修復活性値（示されたように、様々なカットオフ値に関して、低いまたは正常）であった。モデルの適合度は、Ｒ^２によって記載されるが、５８％〜６１％の範囲内である。
^＊９５％ＣＩ、９５％の信頼性区間。
^†カットオフ値はＯＧＧＡの二分変数について定義される。かっこ内の数字は、カットオフ値以下のＯＧＧＡ値を有するコントロール被験者の対応する百分率を示す。

ケース・コントロール研究では、調べられた変数が、危険因子であるのではなく、疾患の結果であるという可能性が存在する。今回の場合、肺腫瘍が末梢血リンパ球（ＰＢＬ）におけるＯＧＧＡの低下を生じさせているという可能性が検討された。ＯＧＧＡ値は、例えば、腫瘍が血流中に分泌する様々な因子によって影響を受け得る。ＮＳＣＬＣの主要な処置は、腫瘍を手術によって除去することである。このことは、ＰＢＬのＯＧＧＡと肺ガンとの関連に対する原因モデルと結果モデルとを区別するための方法を提供する。肺から除去されると、腫瘍がリンパ球におけるＯＧＧＡに対して有する影響は、（腫瘍がそのような影響を有する場合には）時間とともに弱くなるはずである。ＯＧＧＡと、（手術の４ヶ月前から手術後の１年間にわたる範囲の）手術および血液サンプル採取の間の経過期間との間には相関が見出されなかった。このことは、サンプルが手術前または手術後に採取されたかどうかは、ＰＢＬにおけるＯＧＧＡのレベルに対して全く影響を有しなかったことを示している。症例被験者の現在の群において、ほとんど（６７／１０２）のサンプルが手術前に採取された。これらの結果は、低下したＯＧＧＡが実際には肺ガンにおける危険因子であることを明瞭に示している。

この知見に対する最も簡単な生物学的説明は下記の通りである。ＰＢＬにおける低いＯＧＧＡは肺における低いＯＧＧＡを反映している。ＰＢＬにおけるＤＮＡ修復活性と肺細胞との間の相関（Ａｕｃｋｌｅｙ他、２００１）、またはＰＢＬにおけるＤＮＡ修復活性と胃粘膜との間の相関（Ｋｙｒｔｏｐｏｕｌｏｓ他、１９９０）が以前に報告されていた。ＤＮＡ修復能がより低いことは、酸化的ＤＮＡ損傷の低下した修復能をもたらし、その結果、８−オキソグアニンが蓄積し、変異速度の増大をもたらし、これにより、より大きいガン危険性がもたらされる。喫煙者では、肺におけるＤＮＡ損傷が過度に存在し、従って、より大きい危険性が予想される。ＯＧＧＡ値と喫煙状態との間には何ら交互作用は見出されなかった。これは、これらの２つはそれぞれが肺ガンに対する独立した危険因子であることを示唆している。このことは、低いＯＧＧＡが非喫煙者においてもまた危険因子であることを意味している。酸化的ＤＮＡ損傷は、外部の因子に曝されない場合でさえ生じる一般的な細胞内損傷である（Ｌｉｎｄａｈｌ、１９９３）ので、これは驚くべきことではない。

前に議論されたように、ＯＧＧＡは、乳ガン患者では低下しない。このことは、８−オキソＧの修復が、肺ガンの場合およびいくつかのさらなるガンでは障害となっているが、他のガン（例えば、乳ガン）では障害となっていないことを示唆している。これは、特定のＤＮＡ修復遺伝子における遺伝性の欠陥により特定タイプのガンに罹りやすくなっているという知見と一致している。例えば、ヌクレオチド除去修復における欠陥が皮膚ガンを生じさせることが示されたが（Ｗｅｅｄａ他、１９９３）、これに対して、ミスマッチ修復における欠陥により、遺伝性の非ポリープ性結腸ガンが生じる（Ｍｏｄｒｉｃｈ、１９９４）。本発明者らが理解するところでは、本明細書中に示された結果は、特定の塩基除去修復酵素の低下した活性がガンと関連することを最初に明らかにするものである。

本研究の結果の有用な適用は、特定のＯＧＧＡ値、年齢および喫煙状態に関連する肺ガンの危険性の推定値をもたらす定量的モデルであると考えられる。肺ガンなどの、頻繁に生じない疾患について、そして症例者およびコントロール者が合理的に集団を代表していることを仮定すると、オッズ比は、推定された相対的危険性として使用することができる（Ｇｏｒｄｉｓ、１９９６）。従って、モデルが、連続変数としての年齢およびＯＧＧＡと、二分変数としての喫煙状態（喫煙者または非喫煙者）とを用いて、ロジスティック回帰を使用して組み立てられた。これは肺ガンに対するＯＲ値をもたらし、この値は危険性の推定値として理解された。ＯＲ値は、（特定の年齢、ＯＧＧＡ値および喫煙状態を有する）それぞれの特定の群のオッズを、７．０の正常なＯＧＧＡ値を有する３０歳の非喫煙者（基準群；１．０のＯＲ）のオッズで除することによって計算された。特定の年齢、ＯＧＧＡ値および喫煙状態に対するＯＲ値が表８に示される。例えば、表８によれば、４．０の低いＯＧＧＡ値を有する３０歳の喫煙者に対する推定される危険性は、基準よりも１１８倍大きい。４０歳の年齢では、推定される危険性は、基準よりも３２１倍に増大する。この高い推定される危険性は、主として、喫煙と低いＯＧＧＡとが一緒になった結果である。最初に低い修復活性を有する場合、喫煙は、さらに過度のＤＮＡ損傷を生じさせ、従って、大きいガン危険性をもたらす。このモデルは、喫煙と低いＯＧＧＡとの組合せが肺ガンに対する感受性の劇的な増大を生じさせるという事実を明らかにすることにおいて役に立つ。例えば、４．０のＯＧＧＡ値を有する４０歳の非喫煙者は、基準よりも１８倍大きい推定される危険性を有しており、同じ年齢およびＯＧＧＡを有する喫煙者の、基準よりも３２１倍大きい推定される危険性とは対照的である（表８）。

ＯＧＧＡ試験を使用して、低下したＤＮＡ修復能について喫煙者をスクリーニングすることができる。これらの個体は、その個人の低下した、ＤＮＡ損傷の修復能に基づいて、説得して禁煙させることができる。喫煙は肺ガンについて大きい相対的な推定される危険性に対する主要な寄与因子（表７および表８）であるので、禁煙は、肺ガンを防止する可能性を著しく改善することが期待される。個人の感受性に基づく、個人に向けられた禁煙のそのような方法は、肺ガンを防止するための成功する費用効果的な方法をもたらすことができ、そしてさらなるＤＮＡ修復アッセイを含むように拡張することができる。

^＊表はケース・コントロール研究のロジスティック回帰分析に基づいており、従って、数字は危険性の推定される値を表すだけである。オッズ比は、７．０のＯＧＧＡ値を有する３０歳の非喫煙者のオッズ比に対して計算される。

本明細書中に示されるデータは、低いＯＧＧＡが、非喫煙者の間においてもまた肺ガンについて危険因子であることを示している（表７および表８）。低いＯＧＧＡを有する非喫煙者は、自身を守るために何をすることができるか。１つの可能性は、二次的な喫煙またはイオン化放射線などの外部の酸化的ＤＮＡ損傷源に曝されないように気を付けることである。後者には、病院における放射線医学部門、核産業および原子炉が含まれる。しかし、酸化的ＤＮＡ損傷は体内の因子によってもまた生じる；従って、食事による抗酸化物質は保護効果を有すると考えられる。大規模な集団研究により、抗酸化物質は、ガンに対して保護効果がないことが見出された（Ｃｏｌｌｉｎｓ、１９９９；ＬｉｐｐｍａｎおよびＳｐｉｔｚ、２００１に総説される）。しかし、これらの食品添加物は、酸化的ＤＮＡ損傷を修復する能力が低い個体によって摂取されたときには保護効果を有すると考えられる。

低いＯＧＧ活性はリンパ腫における危険因子である。：１８名のリンパ腫患者の分析により、ＯＧＧ ＤＮＡ修復値の低い方への明瞭な変化が示された（図１０ａ〜図１０ｂ；表６）。平均ＯＧＧＡ値は６．２±１．８ユニット／μｈタンパク質であり、これは健康者の場合よりも有意に低かった（Ｐ＝０．０００１）。ロジスティック回帰を使用して健康者およびリンパ腫患者において正常な修復および低い修復を分析することにより、１５．２（９５％ＣＩ、３．７〜６２．５）の調整されたオッズ比が得られた。このことは、年齢について調整を行った後では、リンパ腫患者は、低いＯＧＧＡを有しやすいことが、健康なコントロールよりも１５倍大きかったことを意味している。このことは、低いＯＧＧＡがリンパ腫における危険因子であることを示している。

^＊ＣＩ、９５％信頼性区間
^＊＊年齢について調整された後

ＯＧＧ活性は結腸直腸ガン患者では低下しているようである。分析を１６名の結腸直腸ガン患者に関して行った（図１１ａ〜図１１ｂ）。２名の患者は低いＯＧＧを示した（１２％）。このデータは、低いＯＧＧが結腸直腸ガン患者における危険因子であることを示している。

明確化のために別々の実施形態に関連して記載されている本発明のいくつかの特徴はまた、１つの実施形態において組み合わせて提供され得ることが理解される。逆に、簡潔化のために１つの実施形態に関連して記載されている本発明の様々な特徴はまた、別々に、または任意の好適な部分組合せで提供され得る。

本発明がその具体的な実施形態とともに記載されているが、多くの代替および改変および変化が当業者には明らかであることはいうまでもないことである。従って、本発明は、添付された請求項の精神および広い範囲に含まれるすべてのそのような代替および改変および変化を包含するものとする。本明細書中で言及されているすべての刊行物および特許および特許出願は、本出願では、個々の刊行物または特許または特許出願のそれぞれが、参考として本明細書中に組み込まれることが具体的かつ個々に示されていたかのようにそれと同じ程度に、参考として本明細書中にその全体が組み込まれる。さらに、本明細書中におけるいずれかの参照事項の引用または同一化は、そのような参照事項が本発明に対する先行技術として利用できるという許可として解釈してはならない。

図１ａは本発明によるＯＧＧＡ切断アッセイの概略図を示す。図１ｂ〜図１ｃは、健康な提供者に由来する末梢血リンパ球から調製されたタンパク質抽出物を用いて標準的な条件のもとで行われた本発明のＯＧＧＡ切断アッセイの経時変化を示す。図１ｂは、尿素−ＰＡＧＥによって分画された反応生成物のリン光画像を示し、図１ｃは画像の定量化を示す。 ＯＧＧＡ切断アッセイにおけるタンパク質添加測定を示す（図２ａ〜図２ｂ）。図２ａは、尿素−ＰＡＧＥによって分画された反応生成物のリン光画像を示し、図２ｂは画像の定量化を示す。 本発明のＯＧＧＡ切断アッセイの特異性の分析を示す（図３ａ〜図３ｂ）。図３ａは、尿素−ＰＡＧＥによって分画された反応生成物のリン光画像を示し、図３ｂは画像の定量化を示す。 健康者（すなわち、コントロール被験者）におけるＯＧＧＡ分布を示す。 男性および女性におけるＯＧＧＡの比較を示す。 喫煙者および非喫煙者におけるＯＧＧＡの比較を示す。 ２つの年齢群におけるＯＧＧＡの比較を示す。 明らかな健康者と乳ガン患者または慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）患者とにおけるＯＧＧＡを示す（図８ａ〜図８ｂ）。図８ａ−７０名の健康な女性からなるコントロール群（図５参照）のＯＧＧＡ分布、３１名の乳ガン患者のＯＧＧＡ分布（図８ｂ）。 明らかな健康者と乳ガン患者または慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）患者とにおけるＯＧＧＡを示す（図８ｃ〜図８ｄ）。図８ｃ−１２３名の被験者からなるコントロール群におけるＯＧＧＡ分布、１９名のＣＣＬ患者のＯＧＧＡ分布（図８ｄ）。 明らかな健康者と肺ガン（ＮＳＣＬＣ）患者とにおけるＯＧＧＡを示す（図９ａ〜図９ｂ）。図９ａ−１２３名の健康者（図４参照）からなるコントロール群におけるＯＧＧＡ分布、１０２名の肺ガン（ＮＳＣＬＣ）患者のＯＧＧＡ分布（図９ｂ）。 明らかな健康者とリンパ腫患者とにおけるＯＧＧＡを示す（図１０ａ〜図１０ｂ）。図１０ａ−１２３名の健康者（図４参照）からなるコントロール群におけるＯＧＧＡ分布、１８名のリンパ腫患者のＯＧＧＡ分布（図１０ｂ）。 明らかな健康者と結腸直腸ガン患者とにおけるＯＧＧＡを示す（図１１ａ〜図１１ｂ）。図１１ａ−１２３名の健康者（図４参照）からなるコントロール群におけるＯＧＧＡ分布、１６名の結腸直腸ガン患者のＯＧＧＡ分布（図１１ｂ）。 本発明の教示に従った単分子ユニバーサル基質（図１２ａ）および多分子ユニバーサル基質（図１２ｂ）の概略図である。

【配列表】

Claims (66)

1. ガンを発症する被験者の危険性を明らかにする方法であって、被験者の組織におけるＤＮＡ修復／損傷防止酵素の活性レベルを示し得るパラメーターのレベルを測定すること、そして前記レベルに従って、ガンを発症する被験者の危険性を明らかにすることを含む方法。
2. 前記パラメーターは、
   前記ＤＮＡ修復／損傷防止酵素のタンパク質レベル、
   前記ＤＮＡ修復／損傷防止酵素をコードするＲＮＡのレベル、および
   前記ＤＮＡ修復／損傷防止酵素の触媒活性レベル
   からなる群から選択される請求項１の方法。
3. 前記ガンは、肺ガン、血液ガン、結腸直腸ガン、乳ガン、前立腺ガン、卵巣ガンおよび頭頸部ガンからなる群から選択される請求項１の方法。
4. 前記組織は、血液細胞、切屑細胞および生検物からなる群から選択される請求項１の方法。
5. 前記ＤＮＡ修復／損傷防止酵素は、ＤＮＡ Ｎ−グリコシラーゼ、デオキシリボースリン酸リアーゼおよびＡＰエンドヌクレアーゼからなる群から選択される請求項１の方法。
6. 前記ＤＮＡ Ｎ−グリコシラーゼは、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ、ｈＳＭＵＧ１、ｈＭＢＤ４、ミスマッチ特異的チミン／ウラシルグリコシラーゼ、メチルプリンＤＮＡグリコシラーゼ、ｈＮＴＨ１、アデニン特異的ミスマッチＤＮＡグリコシラーゼ、および８−オキソグアニンＤＮＡグリコシラーゼからなる群から選択される請求項１の方法。
7. 危険性は、正常で、明らかに健康な集団（すなわち、参照コントロール群）と比較したとき、危険性増大倍数として表される請求項１の方法。
8. 危険性は酵素の比活性ユニット数で表される請求項１の方法。
9. 危険性は尺度の大きさとして表される請求項１の方法。
10. ＤＮＡ修復酵素の触媒活性レベルを測定することは、少なくとも１つの傷をその内部に有するＤＮＡ基質を使用して行われる請求項２の方法。
11. 前記少なくとも１つの傷は前記ＤＮＡ基質において所定の部位に存在する請求項１０の方法。
12. 前記基質は、少なくとも２つのタイプの少なくとも２つの異なる傷を含む請求項１０の方法。
13. 前記基質は１つの傷を含む請求項１０の方法。
14. 前記基質は、１つのタイプの少なくとも２つの異なる傷を含む請求項１０の方法。
15. 前記傷は、ウラシル、５−フルオロウラシル、５−ヒドロキシウラシル、イソジアルル酸、アロキサン、Ｕ／ＴｐＧ：５ｍｅＣｐＧにおけるウラシルまたはチミン、ウラシル（Ｕ：Ｇ）、３，Ｎ^４−エテノシトシン、（ｅＣ：Ｇ）、Ｔ（Ｔ：Ｇ）、３−メチルアデニン、７−メチルアデニン、３−メチルグアニン、７−メチルグアニン、ヒポキサンチン、１，Ｎ６−エテノアデニン、１，Ｎ２−エテノグアニン、チミングリコール、シトシングリコール、ジヒドロウラシル、ホルムアミドピリミジンウレア、Ａ：Ｇ由来のアデニン、Ａ：８−オキソＧ由来のアデニン、Ｃ：Ａ由来のアデニン、２−ヒドロキシアデニン、２，５−アミノ−５−ホルムアミドピリミジン、７，８−ジヒドロ−８−オキソグアニン、および脱塩基部位からなる群から選択される請求項１０の方法。
16. 前記ＤＮＡ修復／損傷防止酵素の前記タンパク質レベルは、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、タンパク質チップアッセイおよび抗体チップアッセイからなる群から選択されるアッセイにより測定される請求項２の方法。
17. 前記ＤＮＡ修復／損傷防止酵素をコードする前記ＲＮＡの前記レベルは、ノーザンブロット、定量的なＲＮＡ ＰＣＲ、ＲＮＡドットブロット、および核酸チップアッセイからなる群から選択されるアッセイにより測定される請求項２の方法。
18. 被験者は、ガンを発症させる増大した危険性と関連する環境条件に曝されることが知られているか、またはそのような環境条件に曝されようとしている請求項１の方法。
19. ガンを発症する被験者の危険性を明らかにする方法であって、
    （ａ）ガンを発症させる増大した危険性に関連する環境条件に対する暴露の存在または非存在、および
    （ｂ）被験者の組織におけるＤＮＡ修復／損傷防止酵素の活性レベルを示し得るパラメーターのレベルを明らかにすること、そして
    前記存在または非存在および前記レベルに従って、ガンを発症する被験者の危険性を明らかにすることを含む方法。
20. 前記パラメーターは、
    前記ＤＮＡ修復／損傷防止酵素のタンパク質レベル、
    前記ＤＮＡ修復／損傷防止酵素をコードするＲＮＡのレベル、および
    前記ＤＮＡ修復／損傷防止酵素の触媒活性レベル
    からなる群から選択される請求項１９の方法。
21. 前記ガンは、肺ガン、血液ガン、結腸直腸ガン、乳ガン、前立腺ガン、卵巣ガンおよび頭頸部ガンからなる群から選択される請求項１９の方法。
22. 前記組織は、血液細胞、切屑細胞および生検物からなる群から選択される請求項１９の方法。
23. 前記ＤＮＡ修復／損傷防止酵素は、ＤＮＡ Ｎ−グリコシラーゼ、デオキシリボースリン酸リアーゼおよびＡＰエンドヌクレアーゼからなる群から選択される請求項１９の方法。
24. 前記ＤＮＡ Ｎ−グリコシラーゼは、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ、ｈＳＭＵＧ１、ｈＭＢＤ４、ミスマッチ特異的チミン／ウラシルグリコシラーゼ、メチルプリンＤＮＡグリコシラーゼ、ｈＮＴＨ１、アデニン特異的ミスマッチＤＮＡグリコシラーゼ、および８−オキソグアニンＤＮＡグリコシラーゼからなる群から選択される請求項１９の方法。
25. 危険性は、正常で、明らかに健康な集団（すなわち、参照コントロール群）と比較したとき、危険性増大倍数として表される請求項１９の方法。
26. 危険性は酵素の比活性ユニット数で表される請求項１９の方法。
27. 危険性は尺度の大きさとして表される請求項１９の方法。
28. ＤＮＡ修復酵素の触媒活性レベルを測定することは、少なくとも１つの傷をその内部に有するＤＮＡ基質を使用して行われる請求項２０の方法。
29. 前記少なくとも１つの傷は前記ＤＮＡ基質において所定の部位に存在する請求項２８の方法。
30. 前記傷は、ウラシル、５−フルオロウラシル、５−ヒドロキシウラシル、イソジアルル酸、アロキサン、Ｕ／ＴｐＧ：５ｍｅＣｐＧにおけるウラシルまたはチミン、ウラシル（Ｕ：Ｇ）、３，Ｎ^４−エテノシトシン、（ｅＣ：Ｇ）、Ｔ（Ｔ：Ｇ）、３−メチルアデニン、７−メチルアデニン、３−メチルグアニン、７−メチルグアニン、ヒポキサンチン、１，Ｎ６−エテノアデニン、１，Ｎ２−エテノグアニン、チミングリコール、シトシングリコール、ジヒドロウラシル、ホルムアミドピリミジンウレア、Ａ：Ｇ由来のアデニン、Ａ：８−オキソＧ由来のアデニン、Ｃ：Ａ由来のアデニン、２−ヒドロキシアデニン、２，５−アミノ−５−ホルムアミドピリミジン、７，８−ジヒドロ−８−オキソグアニン、および脱塩基部位からなる群から選択される請求項２８の方法。
31. 前記基質は、少なくとも２つのタイプの少なくとも２つの異なる傷を含む請求項２８の方法。
32. 前記基質は１つの傷を含む請求項２８の方法。
33. 前記基質は、１つのタイプの少なくとも２つの異なる傷を含む請求項２８の方法。
34. 前記ＤＮＡ修復／損傷防止酵素の前記タンパク質レベルは、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、タンパク質チップアッセイおよび抗体チップアッセイからなる群から選択されるアッセイにより測定される請求項２０の方法。
35. 前記ＤＮＡ修復／損傷防止酵素をコードする前記ＲＮＡの前記レベルは、ノーザンブロット、定量的なＲＮＡ ＰＣＲ、ＲＮＡドットブロット、および核酸チップアッセイからなる群から選択されるアッセイにより測定される請求項２０の方法。
36. 前記環境条件は、喫煙、そして煙またはイオン化放射線に対する職業的被爆からなる群から選択される請求項１９の方法。
37. 被験者における変異誘発性の抗ガン処置の効力を予測する方法であって、被験者の組織におけるＤＮＡ修復／損傷防止酵素の活性レベルを示し得るパラメーターのレベルを測定すること、そして前記レベルに従って、被験者における変異誘発性の抗ガン処置の効力を予測することを含む方法。
38. 前記パラメーターは、
    前記ＤＮＡ修復／損傷防止酵素のタンパク質レベル、
    前記ＤＮＡ修復／損傷防止酵素をコードするＲＮＡのレベル、および
    前記ＤＮＡ修復／損傷防止酵素の触媒活性レベル
    からなる群から選択される請求項３７の方法。
39. 前記変異誘発性の抗ガン処置は、化学療法および放射線療法からなる群から選択される請求項３７の方法。
40. 被験者を処置するための変異誘発性の抗ガン処置の投与量を選択する方法であって、被験者の組織におけるＤＮＡ修復／損傷防止酵素の活性レベルを示し得るパラメーターのレベルを測定すること、そして前記レベルに従って、被験者を処置するための変異誘発性の抗ガン処置の投与量を選択することを含む方法。
41. 前記変異誘発性の抗ガン処置は、化学療法および放射線療法からなる群から選択される請求項４０の方法。
42. 被験者の組織におけるＤＮＡ修復酵素の活性レベルを測定するためのキットであって、密閉可能な容器に含有されて、少なくとも１つの傷をその内部に有するＤＮＡ基質と、反応緩衝液を含むパッケージとを含むキット。
43. リンパ球を分離するための試験管をさらに含む請求項４２のキット。
44. 前記試験管には、抗凝固剤が予め入れられている請求項４３のキット。
45. 遠心分離によってリンパ球を赤血球から分離することにおいて効果的な選択された比重を有する液体をさらに含む請求項４２のキット。
46. 赤血球を溶解することにおいて効果的な選択された浸透圧モル濃度を有する溶液をさらに含む請求項４２のキット。
47. タンパク質抽出緩衝液をさらに含む請求項４２のキット。
48. タンパク質測定を行うための試薬をさらに含む請求項４２のキット。
49. 精製されたＤＮＡ修復酵素をさらに含む請求項４２のキット。
50. 前記基質は、少なくとも２つのタイプの少なくとも２つの異なる傷を含む請求項４２のキット。
51. 前記基質は１つの傷を含む請求項４２のキット。
52. 前記基質は、１つのタイプの少なくとも２つの異なる傷を含む請求項４２のキット。
53. 少なくとも２つのタイプの少なくとも２つの異なる傷を含む、一重又は二重鎖の形態の単離されたＤＮＡ分子。
54. 多数のタイプの多数の傷を含む、一重又は二重鎖の形態の単離されたＤＮＡ分子。
55. 少なくとも１つのＤＮＡ修復／損傷防止酵素の活性と少なくとも１つのガンとの間における相関または非相関の存在を明らかにする方法であって、多数のガン患者および多数の明らかに正常な個体に由来する組織における少なくとも１つのＤＮＡ修復／損傷防止酵素の活性レベルを示し得るパラメーターのレベルを測定すること、そして前記レベルに従って、前記少なくとも１つのＤＮＡ修復／損傷防止酵素の前記活性と前記少なくとも１つのガンとの間における前記相関または前記非相関を明らかにすることを含む方法。
56. 前記ガンは、肺ガン、血液ガン、結腸直腸ガン、乳ガン、前立腺ガン、卵巣ガンおよび頭頸部ガンからなる群から選択される請求項５５の方法。
57. 前記組織は、血液細胞、切屑細胞および生検物からなる群から選択される請求項５５の方法。
58. 前記ＤＮＡ修復／損傷防止酵素は、ＤＮＡ Ｎ−グリコシラーゼ、デオキシリボースリン酸リアーゼおよびＡＰエンドヌクレアーゼからなる群から選択される請求項５５の方法。
59. 前記ＤＮＡ Ｎ−グリコシラーゼは、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ、ｈＳＭＵＧ１、ｈＭＢＤ４、ミスマッチ特異的チミン／ウラシルグリコシラーゼ、メチルプリンＤＮＡグリコシラーゼ、ｈＮＴＨ１、アデニン特異的ミスマッチＤＮＡグリコシラーゼ、および８−オキソグアニンＤＮＡグリコシラーゼからなる群から選択される請求項５５の方法。
60. 相関または非相関はＰ値で表される請求項５５の方法。
61. ＤＮＡ修復酵素の活性レベルを測定することは、少なくとも１つの傷をその内部に有するＤＮＡ基質を使用して行われる請求項５５の方法。
62. 前記少なくとも１つの傷は前記ＤＮＡ基質において所定の部位に存在する請求項６１の方法。
63. 前記基質は、少なくとも２つのタイプの少なくとも２つの異なる傷を含む請求項６１の方法。
64. 前記基質は１つの傷を含む請求項６１の方法。
65. 前記基質は、１つのタイプの少なくとも２つの異なる傷を含む請求項６１の方法。
66. 前記傷は、ウラシル、５−フルオロウラシル、５−ヒドロキシウラシル、イソジアルル酸、アロキサン、Ｕ／ＴｐＧ：５ｍｅＣｐＧにおけるウラシルまたはチミン、ウラシル（Ｕ：Ｇ）、３，Ｎ^４−エテノシトシン、（ｅＣ：Ｇ）、Ｔ（Ｔ：Ｇ）、３−メチルアデニン、７−メチルアデニン、３−メチルグアニン、７−メチルグアニン、ヒポキサンチン、１，Ｎ６−エテノアデニン、１，Ｎ２−エテノグアニン、チミングリコール、シトシングリコール、ジヒドロウラシル、ホルムアミドピリミジンウレア、Ａ：Ｇ由来のアデニン、Ａ：８−オキソＧ由来のアデニン、Ｃ：Ａ由来のアデニン、２−ヒドロキシアデニン、２，５−アミノ−５−ホルムアミドピリミジン、７，８−ジヒドロ−８−オキソグアニン、および脱塩基部位からなる群から選択される請求項６１の方法。

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