JP2005517431A - ヒストン修飾マーカーを利用した非侵襲的診断検査 - Google Patents
ヒストン修飾マーカーを利用した非侵襲的診断検査 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2005517431A JP2005517431A JP2003569787A JP2003569787A JP2005517431A JP 2005517431 A JP2005517431 A JP 2005517431A JP 2003569787 A JP2003569787 A JP 2003569787A JP 2003569787 A JP2003569787 A JP 2003569787A JP 2005517431 A JP2005517431 A JP 2005517431A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- dna
- seq
- antibody
- sequence
- nucleosomes
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 108010033040 Histones Proteins 0.000 title claims abstract description 77
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 title description 5
- 108010047956 Nucleosomes Proteins 0.000 claims abstract description 87
- 210000001623 nucleosome Anatomy 0.000 claims abstract description 87
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims abstract description 37
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims abstract description 36
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims abstract description 28
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims abstract description 28
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims abstract description 12
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 77
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 69
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 48
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 claims description 30
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 23
- 108010077544 Chromatin Proteins 0.000 claims description 20
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 20
- 210000003483 chromatin Anatomy 0.000 claims description 20
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims description 19
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 19
- 108010015792 glycyllysine Proteins 0.000 claims description 16
- 238000002493 microarray Methods 0.000 claims description 16
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 claims description 15
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 15
- PAOHIZNRJNIXQY-XQXXSGGOSA-N Gln-Thr-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O PAOHIZNRJNIXQY-XQXXSGGOSA-N 0.000 claims description 14
- 108010062796 arginyllysine Proteins 0.000 claims description 13
- IKAIKUBBJHFNBZ-LURJTMIESA-N Gly-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CN IKAIKUBBJHFNBZ-LURJTMIESA-N 0.000 claims description 12
- 102100039869 Histone H2B type F-S Human genes 0.000 claims description 12
- 101001035372 Homo sapiens Histone H2B type F-S Proteins 0.000 claims description 12
- AEGUWTFAQQWVLC-BQBZGAKWSA-N Ser-Gly-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O AEGUWTFAQQWVLC-BQBZGAKWSA-N 0.000 claims description 12
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 claims description 12
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 12
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 12
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 11
- PURRNJBBXDDWLX-ZDLURKLDSA-N Ser-Thr-Gly Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)NCC(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)N)O PURRNJBBXDDWLX-ZDLURKLDSA-N 0.000 claims description 9
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 claims description 8
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 claims description 7
- BRKHVZNDAOMAHX-BIIVOSGPSA-N Ser-Ala-Pro Chemical compound C[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)N BRKHVZNDAOMAHX-BIIVOSGPSA-N 0.000 claims description 6
- 108010054155 lysyllysine Proteins 0.000 claims description 6
- JAMAWBXXKFGFGX-KZVJFYERSA-N Ala-Arg-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O JAMAWBXXKFGFGX-KZVJFYERSA-N 0.000 claims description 5
- 238000000018 DNA microarray Methods 0.000 claims description 5
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 5
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 4
- HHGYNJRJIINWAK-FXQIFTODSA-N Ala-Ala-Arg Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N HHGYNJRJIINWAK-FXQIFTODSA-N 0.000 claims description 4
- JLXVRFDTDUGQEE-YFKPBYRVSA-N Gly-Arg Chemical compound NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N JLXVRFDTDUGQEE-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 4
- NVGBPTNZLWRQSY-UWVGGRQHSA-N Lys-Lys Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN NVGBPTNZLWRQSY-UWVGGRQHSA-N 0.000 claims description 4
- 241000024188 Andala Species 0.000 claims description 3
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 3
- 210000002751 lymph Anatomy 0.000 claims description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 3
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 claims description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 claims 5
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 abstract description 15
- 238000012216 screening Methods 0.000 abstract description 9
- 208000032170 Congenital Abnormalities Diseases 0.000 abstract description 3
- 206010010356 Congenital anomaly Diseases 0.000 abstract description 2
- 230000007698 birth defect Effects 0.000 abstract description 2
- 238000011191 terminal modification Methods 0.000 abstract 1
- 102000006947 Histones Human genes 0.000 description 21
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 15
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 14
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 14
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 14
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 13
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 12
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 11
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 10
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 10
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 9
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 8
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 7
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 7
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 7
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 7
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 6
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 6
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 description 5
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 5
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 5
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 5
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 5
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 5
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 4
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 4
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 4
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 4
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 4
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 4
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 3
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 3
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 3
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 3
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 3
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 3
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 3
- -1 urine Substances 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- BTRULDJUUVGRNE-DCAQKATOSA-N Ala-Pro-Lys Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O BTRULDJUUVGRNE-DCAQKATOSA-N 0.000 description 2
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 101710103773 Histone H2B Proteins 0.000 description 2
- 102100021639 Histone H2B type 1-K Human genes 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- LRQKBLKVPFOOQJ-YFKPBYRVSA-N L-norleucine Chemical compound CCCC[C@H]([NH3+])C([O-])=O LRQKBLKVPFOOQJ-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- 101150118523 LYS4 gene Proteins 0.000 description 2
- FHIAJWBDZVHLAH-YUMQZZPRSA-N Lys-Gly-Ser Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O FHIAJWBDZVHLAH-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 108020004711 Nucleic Acid Probes Proteins 0.000 description 2
- 102000043276 Oncogene Human genes 0.000 description 2
- 229930012538 Paclitaxel Natural products 0.000 description 2
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 2
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 2
- 102000044209 Tumor Suppressor Genes Human genes 0.000 description 2
- 108700025716 Tumor Suppressor Genes Proteins 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 2
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 2
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 2
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 2
- 230000009395 genetic defect Effects 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 2
- 210000005170 neoplastic cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 2
- 239000002853 nucleic acid probe Substances 0.000 description 2
- 229960001592 paclitaxel Drugs 0.000 description 2
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BZQFBWGGLXLEPQ-REOHCLBHSA-N phosphoserine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)COP(O)(O)=O BZQFBWGGLXLEPQ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- 238000003793 prenatal diagnosis Methods 0.000 description 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 238000007634 remodeling Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- RCINICONZNJXQF-MZXODVADSA-N taxol Chemical compound O([C@@H]1[C@@]2(C[C@@H](C(C)=C(C2(C)C)[C@H](C([C@]2(C)[C@@H](O)C[C@H]3OC[C@]3([C@H]21)OC(C)=O)=O)OC(=O)C)OC(=O)[C@H](O)[C@@H](NC(=O)C=1C=CC=CC=1)C=1C=CC=CC=1)O)C(=O)C1=CC=CC=C1 RCINICONZNJXQF-MZXODVADSA-N 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 230000034512 ubiquitination Effects 0.000 description 2
- 238000010798 ubiquitination Methods 0.000 description 2
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940117976 5-hydroxylysine Drugs 0.000 description 1
- 230000005730 ADP ribosylation Effects 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 108010039627 Aprotinin Proteins 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 description 1
- 239000012591 Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Substances 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 108010034791 Heterochromatin Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N Hydroxyproline Chemical compound O[C@H]1CN[C@H](C(O)=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N 0.000 description 1
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 1
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 1
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 125000000998 L-alanino group Chemical group [H]N([*])[C@](C([H])([H])[H])([H])C(=O)O[H] 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 125000000174 L-prolyl group Chemical group [H]N1C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[C@@]1([H])C(*)=O 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 125000000510 L-tryptophano group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C2N([H])C([H])=C(C([H])([H])[C@@]([H])(C(O[H])=O)N([H])[*])C2=C1[H] 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- GDBQQVLCIARPGH-UHFFFAOYSA-N Leupeptin Natural products CC(C)CC(NC(C)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(C=O)CCCN=C(N)N GDBQQVLCIARPGH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007987 MES buffer Substances 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 108091093037 Peptide nucleic acid Proteins 0.000 description 1
- 108010039918 Polylysine Proteins 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 description 1
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 description 1
- RTKIYFITIVXBLE-UHFFFAOYSA-N Trichostatin A Natural products ONC(=O)C=CC(C)=CC(C)C(=O)C1=CC=C(N(C)C)C=C1 RTKIYFITIVXBLE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- MGSKVZWGBWPBTF-UHFFFAOYSA-N aebsf Chemical compound NCCC1=CC=C(S(F)(=O)=O)C=C1 MGSKVZWGBWPBTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 230000029936 alkylation Effects 0.000 description 1
- 238000005804 alkylation reaction Methods 0.000 description 1
- AWUCVROLDVIAJX-UHFFFAOYSA-N alpha-glycerophosphate Natural products OCC(O)COP(O)(O)=O AWUCVROLDVIAJX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 229960004405 aprotinin Drugs 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001483 arginine derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 125000000613 asparagine group Chemical group N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N bis-tris Chemical compound OCCN(CCO)C(CO)(CO)CO OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000008274 breast adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000002487 chromatin immunoprecipitation Methods 0.000 description 1
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- YSMODUONRAFBET-UHFFFAOYSA-N delta-DL-hydroxylysine Natural products NCC(O)CCC(N)C(O)=O YSMODUONRAFBET-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 230000009429 distress Effects 0.000 description 1
- PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N dl-hydroxyproline Natural products OC1C[NH2+]C(C([O-])=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- HKSZLNNOFSGOKW-UHFFFAOYSA-N ent-staurosporine Natural products C12=C3N4C5=CC=CC=C5C3=C3CNC(=O)C3=C2C2=CC=CC=C2N1C1CC(NC)C(OC)C4(C)O1 HKSZLNNOFSGOKW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- YSMODUONRAFBET-UHNVWZDZSA-N erythro-5-hydroxy-L-lysine Chemical compound NC[C@H](O)CC[C@H](N)C(O)=O YSMODUONRAFBET-UHNVWZDZSA-N 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 208000016361 genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 210000004458 heterochromatin Anatomy 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002591 hydroxyproline Drugs 0.000 description 1
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N iniprol Chemical compound C([C@H]1C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@H]2CSSC[C@H]3C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC=4C=CC=CC=4)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC2=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC=CC=2)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H]2N(CCC2)C(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N3)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)CC)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000155 isotopic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- GDBQQVLCIARPGH-ULQDDVLXSA-N leupeptin Chemical compound CC(C)C[C@H](NC(C)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C=O)CCCN=C(N)N GDBQQVLCIARPGH-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- 108010052968 leupeptin Proteins 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000008774 maternal effect Effects 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 238000012775 microarray technology Methods 0.000 description 1
- 238000007479 molecular analysis Methods 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- JPXMTWWFLBLUCD-UHFFFAOYSA-N nitro blue tetrazolium(2+) Chemical compound COC1=CC(C=2C=C(OC)C(=CC=2)[N+]=2N(N=C(N=2)C=2C=CC=CC=2)C=2C=CC(=CC=2)[N+]([O-])=O)=CC=C1[N+]1=NC(C=2C=CC=CC=2)=NN1C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 JPXMTWWFLBLUCD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- QNDVLZJODHBUFM-WFXQOWMNSA-N okadaic acid Chemical compound C([C@H](O1)[C@H](C)/C=C/[C@H]2CC[C@@]3(CC[C@H]4O[C@@H](C([C@@H](O)[C@@H]4O3)=C)[C@@H](O)C[C@H](C)[C@@H]3[C@@H](CC[C@@]4(OCCCC4)O3)C)O2)C(C)=C[C@]21O[C@H](C[C@@](C)(O)C(O)=O)CC[C@H]2O QNDVLZJODHBUFM-WFXQOWMNSA-N 0.000 description 1
- VEFJHAYOIAAXEU-UHFFFAOYSA-N okadaic acid Natural products CC(CC(O)C1OC2CCC3(CCC(O3)C=CC(C)C4CC(=CC5(OC(CC(C)(O)C(=O)O)CCC5O)O4)C)OC2C(O)C1C)C6OC7(CCCCO7)CCC6C VEFJHAYOIAAXEU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 239000000816 peptidomimetic Substances 0.000 description 1
- 125000001151 peptidyl group Chemical group 0.000 description 1
- 239000008177 pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 1
- 150000004713 phosphodiesters Chemical group 0.000 description 1
- 230000000865 phosphorylative effect Effects 0.000 description 1
- 229920000656 polylysine Polymers 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000163 radioactive labelling Methods 0.000 description 1
- 230000021419 recognition of apoptotic cell Effects 0.000 description 1
- 230000007115 recruitment Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000004043 responsiveness Effects 0.000 description 1
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- AWUCVROLDVIAJX-GSVOUGTGSA-N sn-glycerol 3-phosphate Chemical compound OC[C@@H](O)COP(O)(O)=O AWUCVROLDVIAJX-GSVOUGTGSA-N 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- FQENQNTWSFEDLI-UHFFFAOYSA-J sodium diphosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O FQENQNTWSFEDLI-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 1
- 229940048086 sodium pyrophosphate Drugs 0.000 description 1
- 239000011537 solubilization buffer Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- HKSZLNNOFSGOKW-FYTWVXJKSA-N staurosporine Chemical compound C12=C3N4C5=CC=CC=C5C3=C3CNC(=O)C3=C2C2=CC=CC=C2N1[C@H]1C[C@@H](NC)[C@@H](OC)[C@]4(C)O1 HKSZLNNOFSGOKW-FYTWVXJKSA-N 0.000 description 1
- CGPUWJWCVCFERF-UHFFFAOYSA-N staurosporine Natural products C12=C3N4C5=CC=CC=C5C3=C3CNC(=O)C3=C2C2=CC=CC=C2N1C1CC(NC)C(OC)C4(OC)O1 CGPUWJWCVCFERF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 229940124530 sulfonamide Drugs 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 235000019818 tetrasodium diphosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001577 tetrasodium phosphonato phosphate Substances 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- RTKIYFITIVXBLE-QEQCGCAPSA-N trichostatin A Chemical compound ONC(=O)/C=C/C(/C)=C/[C@@H](C)C(=O)C1=CC=C(N(C)C)C=C1 RTKIYFITIVXBLE-QEQCGCAPSA-N 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 231100000588 tumorigenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000000381 tumorigenic effect Effects 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
- 238000009736 wetting Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
- G01N33/6842—Proteomic analysis of subsets of protein mixtures with reduced complexity, e.g. membrane proteins, phosphoproteins, organelle proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6809—Methods for determination or identification of nucleic acids involving differential detection
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/5308—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for analytes not provided for elsewhere, e.g. nucleic acids, uric acid, worms, mites
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6875—Nucleoproteins
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
本発明は、疾病または先天的欠陥の診断指標としての、ヒストンアミノ末端修飾に特異的な抗体の使用に関する。1つの実施態様において、ヌクレオソームが、ヒストン特異的抗体を用いて患者の血液または血清試料から単離され、そして付随するDNAが、診断およびスクリーニング上の目的で、精製され、分析される。
Description
米国政府の権利
本発明は、国立衛生研究所により授与された助成金番号GM40922およびGM53512の下、米国政府の援助で成された。米国政府は本発明に一定の権利を有する。
本発明は、国立衛生研究所により授与された助成金番号GM40922およびGM53512の下、米国政府の援助で成された。米国政府は本発明に一定の権利を有する。
関連出願
本出願は、2002年2月20日に出願された仮特許出願番号60/358,325、および2002年3月19日に出願された仮特許出願番号60/365,459(これらの記載は引用により全体として本明細書に取り込まれる)に基づき、米国特許法第119(e)条の規定による優先権を主張する。
本出願は、2002年2月20日に出願された仮特許出願番号60/358,325、および2002年3月19日に出願された仮特許出願番号60/365,459(これらの記載は引用により全体として本明細書に取り込まれる)に基づき、米国特許法第119(e)条の規定による優先権を主張する。
発明の分野
本発明は、様々な疾病状態を診断するための組成物および方法に関する。より具体的には、該方法は、個体の血液、血漿、または血清から無細胞のヌクレオソームを単離するために、ヒストンタンパク質の翻訳後修飾により作り出される固有のヒストンエピトープに特異的な抗体を用いる。
本発明は、様々な疾病状態を診断するための組成物および方法に関する。より具体的には、該方法は、個体の血液、血漿、または血清から無細胞のヌクレオソームを単離するために、ヒストンタンパク質の翻訳後修飾により作り出される固有のヒストンエピトープに特異的な抗体を用いる。
発明の背景
真核生物において、DNAは、繰り返し染色質サブユニットであるヌクレオソームを形成するために、ヒストンタンパク質と複合体を形成する。DNAのこのパッケージングは、転写または複製の様なDNAを鋳型とするプロセスのため、DNAへアクセスしようとしているタンパク質に対して厳しい制限を設けている。ヒストンアミノ末端の翻訳後修飾は、真核生物の細胞ゲノムの染色質構造の決定、ならびに細胞遺伝子の発現の制御において、重要な働きをすることが急速に明らかになりつつある。
真核生物において、DNAは、繰り返し染色質サブユニットであるヌクレオソームを形成するために、ヒストンタンパク質と複合体を形成する。DNAのこのパッケージングは、転写または複製の様なDNAを鋳型とするプロセスのため、DNAへアクセスしようとしているタンパク質に対して厳しい制限を設けている。ヒストンアミノ末端の翻訳後修飾は、真核生物の細胞ゲノムの染色質構造の決定、ならびに細胞遺伝子の発現の制御において、重要な働きをすることが急速に明らかになりつつある。
ヒストンのアミノ末端「テール」ドメインで生じるアセチル化、リン酸化、メチル化、ユビキチン化、およびADPリボシル化を含む、多くのヒストンの共有結合性修飾が報告された。該修飾型の多様性、および該修飾を受ける残基の顕著な特異性は、複雑な序列および組合せられた機能が不明確なままであることを示す。ヒストンアミノ末端で生じると知られている共有結合性修飾のうち、アセチル化がおそらく最も研究されており、かつ理解されている。最近の研究により、染色質中のプロモーターを標的とするための動員に応答して、ヒストンのリジン残基をそれぞれ特異的にアセチル化、または脱アセチル化する、既に特徴付けられた活性化補助因子および抑制補助因子が同定された(Berger (1999) Curr. Opin. Genet. Dev. 11,336-341参照)。該研究は、染色質リモデリングがヌクレオソームの鋳型からの転写の制御において基礎的な働きをするという、説得力のある証拠を提供する。
特異的な翻訳後修飾を生じるヒストンを特異的に認識する抗体の使用により、本発明者は「ヒストンコード」を解明しつつある。特に、ヒストンタンパク質、およびそれに関係する共有結合性修飾が、染色質構造を変えることができる機序(これにより、転写の「オン・オフ」状態における遺伝的相違、あるいは特定された高次構造を定義することにより、染色体の安定的な伝播を導く)に関与するという証拠が明らかになりつつある。従って、該特異的な修飾が、結合するDNAの転写状態を示すマーカーとして働き得る。
ヌクレオソームは、健常個体(Stroun et al., Annals of the New York Academy of Sciences 906: 161-168 (2000))、ならびに罹患個体の血清で検出され得ると最近報告された。さらに、血清ヌクレオソーム濃度は、良性および悪性疾病に罹患している患者で相当高いと報告された(Holdenrieder et al., Int J Cancer, 95 (2): 114-120 (Mar 20,2001))。腫瘍発生患者でのヌクレオソームの高濃度は、増殖中の腫瘍で自然発生的に生じるアポトーシス由来であると推測される。従って、患者血中のヌクレオソームの上昇した濃度の存在が、増加した細胞死と関係する疾病の診断的特徴(disgnostic)となり得る(Holdenrieder et al., Anticancer Res, 19 (4A): 2721-2724 (1999))。
本発明に先立ち、発明者は、検出されたヌクレオソームを含むヒストンの種類を特徴付けることなく、個体の血中に存在するヌクレオソームの総数を単純にモニターした。血中を循環しているヌクレオソームは、固有に修飾されたヒストン(ここで、固有のヒストンエピトープおよび/または結合するDNAが、特定の疾病状態と相関し得る)を含有すると予測される。従って、本発明の1つの態様は、修飾されたヒストンタンパク質と特異的に結合する抗体の使用による無細胞のモノまたはオリゴヌクレオソームの同定に関する。該修飾されたヒストンの同定は、疾病および先天的欠陥の診断マーカーとなり得る。
発明の要約
本発明は、個体の体液中に存在するヌクレオソーム(ここで、ヌクレオソームは1以上の修飾されたヒストンを含む)を検出する、非侵襲的診断方法に関する。より具体的には、抗体がヒストンのアミノ末端の特異的翻訳後修飾に対して作成され、そして該抗体を用いて、事前に選択された修飾されたヒストンを含有する無細胞ヌクレオソームが検出される。異なる種類の修飾されたヒストンの総数および/または割合の変化が、診断目的上用いられ得る。さらに、特定の核酸配列と結合する種類の修飾されたヒストンが、疾病状態の診断に用いられ得る。
本発明は、個体の体液中に存在するヌクレオソーム(ここで、ヌクレオソームは1以上の修飾されたヒストンを含む)を検出する、非侵襲的診断方法に関する。より具体的には、抗体がヒストンのアミノ末端の特異的翻訳後修飾に対して作成され、そして該抗体を用いて、事前に選択された修飾されたヒストンを含有する無細胞ヌクレオソームが検出される。異なる種類の修飾されたヒストンの総数および/または割合の変化が、診断目的上用いられ得る。さらに、特定の核酸配列と結合する種類の修飾されたヒストンが、疾病状態の診断に用いられ得る。
図面の簡単な説明
図1は、ヒトヒストンタンパク質H2A、H2B、H3、およびH4のアミノ末端で見出される翻訳後修飾を表す図である。
図1は、ヒトヒストンタンパク質H2A、H2B、H3、およびH4のアミノ末端で見出される翻訳後修飾を表す図である。
発明の詳細な説明
定義
本発明の明細書および請求項において、次の用語は、以下で説明する定義にのっとり用いられる。
本明細書で用いられる用語「核酸」は、RNA、ならびに1本鎖および2本鎖DNAおよびcDNAを包含する。さらに、用語「核酸」、「DNA」、「RNA」、および同類の用語は、核酸類似体、すなわちリン酸ジエステルバックボーン以外を有する類似体も含む。例えば、当該技術分野で知られており、かつバックボーンにリン酸ジエステル結合の代わりにペプチド結合を有する、いわゆる「ペプチド核酸」が本発明の範囲内であると意図されている。
定義
本発明の明細書および請求項において、次の用語は、以下で説明する定義にのっとり用いられる。
本明細書で用いられる用語「核酸」は、RNA、ならびに1本鎖および2本鎖DNAおよびcDNAを包含する。さらに、用語「核酸」、「DNA」、「RNA」、および同類の用語は、核酸類似体、すなわちリン酸ジエステルバックボーン以外を有する類似体も含む。例えば、当該技術分野で知られており、かつバックボーンにリン酸ジエステル結合の代わりにペプチド結合を有する、いわゆる「ペプチド核酸」が本発明の範囲内であると意図されている。
本明細書で用いられる用語「相補的」または「相補性」は、塩基対規則により関連するポリヌクレオチド(すなわち、ヌクレオチド配列)に関して用いられる。例えば、配列「A−G−T」は、配列「T−C−A」に相補的である。
本明細書で用いられる用語「ハイブリダイゼーション」は、相補的核酸の対形成に関して用いられる。ハイブリダイゼーション、およびハイブリダイゼーションの強さ(すなわち、核酸間の結合の強さ)は、核酸間の相補性の程度、関与条件のストリンジェンシー、形成された結合の長さ、および核酸中のG:C比の様な因子により影響される。
用語「ペプチド」は、3個のアミノ酸(ここで、アミノ酸は、天然に存在するかまたは合成(非天然に存在する)アミノ酸である)配列を包含する。ペプチド模倣物は、次の修飾のうち1つ以上を有するペプチドを含む:
1.1個以上のペプチジル−−C(O)NR−−結合(ボンド)が、−−CH2−カルバメート結合(−−CH2OC(O)NR−−)、ホスホン酸塩結合、−CH2−スルホンアミド(−CH2−−S(O)2NR−−)結合、尿素(−−NHC(O)NH−−)結合、−−CH2−第2アミン結合の様な非ペプチジル結合により、またはアルキル化ペプチジル結合(−−C(O)NR−−)(ここで、RはCl−C4アルキルである)で置き換えられた、ペプチド;
2.N末端が、−−NRR1基、−−NRC(O)R基、−−NRC(O)OR基、−−NRS(O)2R基、−−NHC(O)NHR基(ここで、RおよびR1は水素であるか、またはCl−C4アルキルである(ただし、RおよびR1は共に水素ではない)に誘導体化されている、ペプチド;
3.C末端が、−−C(O)R2(ここで、R2は、C1−C4アルコキシからなる群から選択される)、および−−NR3R4(ここで、R3およびR4は、水素およびC1−C4アルキルからなる群から独立して選択される)に誘導体化されている、ペプチド。
1.1個以上のペプチジル−−C(O)NR−−結合(ボンド)が、−−CH2−カルバメート結合(−−CH2OC(O)NR−−)、ホスホン酸塩結合、−CH2−スルホンアミド(−CH2−−S(O)2NR−−)結合、尿素(−−NHC(O)NH−−)結合、−−CH2−第2アミン結合の様な非ペプチジル結合により、またはアルキル化ペプチジル結合(−−C(O)NR−−)(ここで、RはCl−C4アルキルである)で置き換えられた、ペプチド;
2.N末端が、−−NRR1基、−−NRC(O)R基、−−NRC(O)OR基、−−NRS(O)2R基、−−NHC(O)NHR基(ここで、RおよびR1は水素であるか、またはCl−C4アルキルである(ただし、RおよびR1は共に水素ではない)に誘導体化されている、ペプチド;
3.C末端が、−−C(O)R2(ここで、R2は、C1−C4アルコキシからなる群から選択される)、および−−NR3R4(ここで、R3およびR4は、水素およびC1−C4アルキルからなる群から独立して選択される)に誘導体化されている、ペプチド。
ペプチド中の天然に存在するアミノ酸残基は、次の通り、IUPAC−IUB生化学命名法連合(Biochemical Nomenclature Commission)により推奨された方法で省略される:フェニルアラニンは、PheまたはFであり;ロイシンは、LeuまたはLであり;イソロイシンは、IleまたはIであり;メチオニンは、MetまたはMであり;ノルロイシンは、Nleであり;バリンは、ValまたはVであり;セリンは、SerまたはSであり;プロリンは、ProまたはPであり;トレオニンは、ThrまたはTであり;アラニンは、AlaまたはAであり;チロシンは、TyrまたはYであり;ヒスチジンは、HisまたはHであり;グルタミンは、GlnまたはQであり;アスパラギンは、AsnまたはNであり;リシンは、LysまたはKであり;アスパラギン酸は、AspまたはDであり;グルタミン酸は、GluまたはEであり;システインは、CysまたはCであり;トリプトファンは、TrpまたはWであり;アルギニンは、ArgまたはRであり;グリシンは、GlyまたはGであり、そしてXは任意のアミノ酸である。他の天然に存在するアミノ酸は、例えば、4−ヒドロキシプロリン、5−ヒドロキシリジン等を含む。
本明細書で用いられる用語「保存的アミノ酸置換」は、次の5つの群のうち1つとの交換として、本明細書で定義される:
I.小さい、脂肪族、非極性、またはわずかに極性の残基:
Ala、Ser、Thr、Pro、Gly;
II.極性、負に荷電した残基、およびそのアミド:
Asp、Asn、Glu、Gln;
III.極性、正に荷電した残基:
His、Arg、Lys;
IV.大きい、脂肪族、非極性の残基:
Met、Leu、Ile、Val、Cys;
V.大きい、芳香族性残基:
Phe、Tyr、Trp。
I.小さい、脂肪族、非極性、またはわずかに極性の残基:
Ala、Ser、Thr、Pro、Gly;
II.極性、負に荷電した残基、およびそのアミド:
Asp、Asn、Glu、Gln;
III.極性、正に荷電した残基:
His、Arg、Lys;
IV.大きい、脂肪族、非極性の残基:
Met、Leu、Ile、Val、Cys;
V.大きい、芳香族性残基:
Phe、Tyr、Trp。
本明細書で用いられる用語「精製された」および類似の用語は、天然環境中の分子または化合物と一般的に関係する他の要素が実質的にない(少なくとも60%ない、好ましくは75%ない、そして最も好ましくは90%ない)形態の分子または化合物の単離に関する。
用語「疾病状態」は、先天的欠陥、癌の様な病的状態、および環境因子および病原菌(細菌、ウイルス等)に対する応答性を含む、生きている動物または植物の正常状態の障害と関係するいずれかの状態を包含することが意図されている。
「治療薬剤」、「医薬剤」、または「薬剤」は、患者の疾患、苦痛、疾病、または傷害の処置(予防、診断、緩和、または治癒を含む)において用いられる任意の治療、または予防薬剤を意味している。
本明細書で用いられる用語「処置すること」は、特異的な疾患または状態と関係する症状を緩和すること、および/または該症状を予防または除去することを含む。例えば、癌を処置することは、癌細胞の成長および/または***を予防すること、または遅延させること、ならびに癌細胞を殺すことを含む。
本明細書で用いられる用語「医薬的に許容される担体」は、リン酸緩衝食塩水溶液、および油/水または水/油乳濁液の様な水および乳濁液、および様々な種類の湿潤剤の様な、任意の標準的な医薬担体を包含する。
本明細書で用いられる用語「抗体」は、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体、またはFab、F(ab’)2、およびFvフラグメントの様なその結合フラグメントを意味している。
本明細書で用いられる用語「非経腸」は、皮下、静脈内、または筋肉内投与を含む。
本明細書で用いられる用語「非経腸」は、皮下、静脈内、または筋肉内投与を含む。
本明細書で用いられる用語「修飾されたヒストン」は、H2A、H2B、H3、およびH4からなる群から選択されるヒストンタンパク質(ここで、アミノ末端の少なくとも30個以上のアミノ酸残基のうち1個以上が、アセチル化、メチル化、リン酸化、またはユビキチン化により翻訳後修飾されている)を意味している。
本明細書で用いられる用語「修飾されたアミノ酸」は、アミノ酸と共有結合した1個以上の修飾基を含むアミノ酸残基を含む。例えば、それぞれの修飾されたリジン残基は、モノ−、ジ−、またはトリ−メチル化されるためのキャパシティーを有し、そして一般的にメチル化リジンについては、該可能性の3つ全てを包含することが意図されている。
本明細書で用いられる用語「活性な遺伝子配列」は、転写活性に適任である遺伝子を意味している。
本明細書で用いられる用語「不活性な遺伝子配列」は、転写活性に適任でない遺伝子を意味している。
本明細書で用いられる用語「不活性な遺伝子配列」は、転写活性に適任でない遺伝子を意味している。
発明
ヌクレオソームが患者の血中で検出され得ること、および血液ヌクレオソーム濃度レベルの上昇が癌の診断的特徴となることが、最近報告された。しかしながら、この先行研究はヌクレオソーム集団の総数を単純にモニターし、ヒストンの中身に基づき、互いに異なるヌクレオソームの部分集団を説明していない。本発明者は、ヒストンの特定の翻訳後修飾が、染色質構造を変化させ得る機序に寄与することを発見した。そして、該染色質リモデリングは、ヌクレオソームの鋳型からの転写の制御において基礎的な働きをすると信じられている。さらに、本発明者は、ヌクレオソームがアポトーシスの過程を通じて、翻訳後修飾を維持することを最初に証明した。具体的には、実施例1に記載のアポトーシスを経験した乳腺癌細胞由来のヌクレオソームは、そのメチル化、リン酸化、またはアセチル化修飾を維持し、そして該修飾が、該修飾に対して生じた特異的抗体を用いて検出され得る。
ヌクレオソームが患者の血中で検出され得ること、および血液ヌクレオソーム濃度レベルの上昇が癌の診断的特徴となることが、最近報告された。しかしながら、この先行研究はヌクレオソーム集団の総数を単純にモニターし、ヒストンの中身に基づき、互いに異なるヌクレオソームの部分集団を説明していない。本発明者は、ヒストンの特定の翻訳後修飾が、染色質構造を変化させ得る機序に寄与することを発見した。そして、該染色質リモデリングは、ヌクレオソームの鋳型からの転写の制御において基礎的な働きをすると信じられている。さらに、本発明者は、ヌクレオソームがアポトーシスの過程を通じて、翻訳後修飾を維持することを最初に証明した。具体的には、実施例1に記載のアポトーシスを経験した乳腺癌細胞由来のヌクレオソームは、そのメチル化、リン酸化、またはアセチル化修飾を維持し、そして該修飾が、該修飾に対して生じた特異的抗体を用いて検出され得る。
本発明は改良された疾病の診断検査に関し、これは、無細胞の修飾されたヌクレオソーム集団の上昇、または変更された染色質構造の存在について、温血動物の血液をスクリーニングすることを含む。より具体的には、本発明は、ヒストンペプチドのアミノまたはカルボキシ末端の翻訳後修飾と特異的に結合する抗体の使用に関する。検出されたヌクレオソーム上の固有のヒストンの存在は、染色質構造、および修飾されたヒストンタンパク質と結合する核酸配列の転写活性に関する情報を提供する。
従って、本発明は、哺乳類、より好ましくはヒトの血液(および、他の体液)からヌクレオソームを単離するために、コアヒストンタンパク質のフレキシブルなN末端およびC末端テール上の翻訳後修飾により形成された固有のエピトープに対して特異的な抗体を用いる、改良された診断スクリーニングに関する。本発明で用いる固有のエピトープとして働くヒストンアミノ酸残基の適当な翻訳後修飾が、図1に記載されている。個体血中の特異的なヒストン修飾を1個以上検出することは、特定の疾病状態の診断的特徴となる。
本発明の1つの実施態様をに従って、活性な遺伝子配列(真性染色質)、または不活性な遺伝子配列(異質染色質)と結合する固有のヒストンマーカーに対する抗体を用いて、疾病状態を示す不適当な遺伝子発現を検出可能である。例えば、個体の血中または他の体液中に存在するヌクレオソーム集団のスクリーニングは、腫瘍抑制遺伝子の不活性化、あるいは癌遺伝子の活性化を明らかにする。
個体中の該活性化または不活性化遺伝子配列の検出方法は、個体から体液試料を得る段階、および修飾されたヒストンに特異的な抗体を用いて、該試料からヌクレオソームを単離する段階を含む。該ヌクレオソームは、尿、血液、リンパ液、血漿、または血清を含む1以上の患者体液から回収可能である。従って、疾病状態を診断するための最小限に侵襲性のスクリーニングを提供する。1つの実施態様において、該ヌクレオソームは、個体の血液、血漿、または血清から回収される。体液中に存在するヌクレオソームの安定性を増強するために、該試料は好ましくは10mM EDTAで処理され、そして−20℃で保存される。修飾されたヒストンを標的とする抗体との免疫沈降の前処理(precursor)として、血液、血漿、または血清中のヌクレオソームは、ポリ−リジンまたはストレプトアビジンでコートされた固体支持体への集積により、まず濃縮され得る。後者の方法は、ストレプトアビジンでの捕獲に先立ち、ヒストンを優先的にビオチン化するために、血中に存在するビオチン化トランスフェラーゼ活性を利用する(Hymes & Wolf, J. Nutr. 129, 485S-489S, 1999)。
本発明で用いられる抗修飾ヒストン抗体は、ヒストンテールの翻訳後修飾により形成される既知のヒストンエピトープを標的とする抗体のいずれからも選択され得る。本発明で用いられる抗体のエピトープとして使用され得る、ヒストンテールのいくつかの翻訳後修飾のリストが、図1で提供される。該抗体をそれぞれ用いて、対応する修飾されたヒストンを含有する患者血中に存在するヌクレオソームを単離できる。血中の修飾されたヒストンの同定は、特定の疾病または疾患を示し得る。個体中の該抗体により検出された無細胞のヌクレオソーム数の有意な増加(野生型レベルと比べて)、および/または別のヒストン修飾と比べて、1以上の特定のヒストン修飾の割合の変化は、特定の疾病状態を示し得る。
1つの実施態様において、活性な遺伝子配列と結合すると知られている修飾されたヒストンと結合するか、あるいは不活性な遺伝子配列と結合する修飾されたヒストンと結合する抗体が、選択される。遺伝子活性化と関係するものとして同定されたヒストンエピトープは、次のものを含む:
Ala Arg Thr Lys(M) Gln Thr Ala Arg(配列番号:1)、
Ser Gly Arg(M) Gly Lys(配列番号:2)、
Ser Gly Arg Gly Lys(A)(配列番号:3)、
Ser Gly Arg(M) Gly Lys(A)(配列番号:4)、および
Ser(P) Gly Arg(M) Gly Lys(A)(配列番号:5)、
ここで、「Ser(P)」、「Arg(M)」、および「Lys(A)」は、それぞれ、修飾されたアミノ酸であるリン酸化セリン、メチル化アルギニン、およびアセチル化リジンを表す。1つの実施態様において、抗体は、配列番号:1を含むペプチド配列(ここで、リジン残基はジメチル化されている)に特異的である。遺伝子不活性化と関係するものとして同定されたヒストンエピトープは、次のものを含む:
Gln Thr Ala Arg Lys(M) Ser Thr Gly Val(配列番号:6)、
Gln Thr Ala Arg Lys(M) Ser Thr Gly Gly(配列番号:8)、
Ala Ala Arg Lys(M) Ser Ala Pro(配列番号:9)。
Ala Arg Thr Lys(M) Gln Thr Ala Arg(配列番号:1)、
Ser Gly Arg(M) Gly Lys(配列番号:2)、
Ser Gly Arg Gly Lys(A)(配列番号:3)、
Ser Gly Arg(M) Gly Lys(A)(配列番号:4)、および
Ser(P) Gly Arg(M) Gly Lys(A)(配列番号:5)、
ここで、「Ser(P)」、「Arg(M)」、および「Lys(A)」は、それぞれ、修飾されたアミノ酸であるリン酸化セリン、メチル化アルギニン、およびアセチル化リジンを表す。1つの実施態様において、抗体は、配列番号:1を含むペプチド配列(ここで、リジン残基はジメチル化されている)に特異的である。遺伝子不活性化と関係するものとして同定されたヒストンエピトープは、次のものを含む:
Gln Thr Ala Arg Lys(M) Ser Thr Gly Val(配列番号:6)、
Gln Thr Ala Arg Lys(M) Ser Thr Gly Gly(配列番号:8)、
Ala Ala Arg Lys(M) Ser Ala Pro(配列番号:9)。
1つの実施態様において、抗体は、配列番号:8を含むペプチド配列(リジン残基がジメチル化されている)に特異的である。該抗体を用いて、疾病状態を示す如何なる異常遺伝子発現も検出できる。
または、ヌクレオソームと結合する核酸配列(ヒストン修飾の1つの特異的な抗体を用いた免疫沈降により、血液から単離される)は、疾病状態または疾病の可能性の診断を補助するための標準的な技術(すなわち、潜在ウイルスの同定、または他の遺伝子前提条件)を用いて分析され得る。
本発明の1つの実施態様に従って、個体の体液由来のヌクレオソームが、本発明の修飾されたヒストンに特異的な抗体のうち1以上を用いた免疫沈降により単離される。または、本発明の修飾されたヒストンに特異的な抗体は、試料から無細胞のヌクレオソームを単離する方法を提供するための不溶性支持体に結合され得る。該支持体は、粒子または固体形であり、プレート、試験管、ビーズ、球、フィルター、または膜を含み得るが、これらに限られない。不溶性支持体に抗体を固定する方法は、当該技術分野の技術者に既知である。1つの実施態様において、本発明の抗体は、アフィニティークロマトグラフィーで用いるのに適当な不溶性支持体に固定される。標的とする抗原との抗体の特異的な結合を可能とするのに適した条件下で、試料が修飾されたヒストンに特異的な抗体と接触させられた後、修飾されたヒストンを含むヌクレオソームが、当該技術分野の技術者に知られた標準的技術を用いて単離され得る。
ヌクレオソームが試料から単離されると、ヌクレオソームと結合したDNAが、PCRまたは他の増幅技術により、標準的な技術(回収されたDNAを必要に応じて増幅することを含む)を用いて回収され得る。1つの実施態様に従って、免疫沈降されたヌクレオソームと結合したDNAが精製され、そして該DNAによりコード化される遺伝子が同定される。体液試料からヌクレオソームをまず単離するために用いられた特異的な抗体に依存して、該方法は、個体中の活性または不活性な遺伝子のいずれかを同定することが可能となる。
単離されたヌクレオソームと結合したDNAによりコード化される遺伝子を同定するために用いられる段階は、当該技術分野の技術者に既知の分析的方法のいずれかを含む。1つの実施態様に従って、該遺伝子配列は、精製されたDNAを直接マイクロシークエンスすることにより同定される。または、1つの実施態様において、精製されたDNAは、PCR技術または他の増幅技術を用いてまず増幅され、その後配列分析の様なDNA分析がさらになされる。
1つの実施態様において、単離されたヌクレオソームと結合したDNAによりコード化される遺伝子は、相補的配列のハイブリダイゼーションに適した条件下で、既知の核酸配列と精製されたDNAを接触させることにより同定され得る(ここで、その相補鎖への精製DNAのハイブリダイゼーションが当該遺伝子を同定するものである)。例えば、既知のDNA配列または精製されたDNAのいずれかが標識プローブとして働き、そして非標識配列が固体表面に固定される、サザンブロット分析が行われ得る。
核酸プローブは、当該技術分野で既知の標準的技術(本発明は、特定の検出システムまたは標識のいずれかに制限されることを意図していない)を用いて検出可能なマーカーで標識され得る。例えば、核酸プローブは、フルオロフォア、放射性同位元素、またはビオチンまたはジコキシゲニンの様な非同位体標識物質で標識され得る。
1つの実施態様に従って、重要な種々の遺伝子を表す既知の核酸配列が、固体表面に固定化される。好ましくは、該配列はマイクロアレイ(既知の配列それぞれが固体表面上の位置を決められている)の形で固定化される。該方法において、相補鎖と精製されたヌクレオソームDNA配列のハイブリダイゼーションにより固体表面の特定の領域で形成されたシグナルによって、該配列によりコード化される遺伝子を同定する。1つの実施態様において、精製されたヌクレオソームDNAが標識され(そして、1つの実施態様においては、DNAが増幅され、続いて標識される)、続いて、相補的配列とのハイブリダイゼーションに適した条件下で、既知の配列のマイクロアレイと接触させられる。事前に決めた時間をおいた後、未結合および非特異的結合物質が該マイクロアレイから洗い出され、そして該アレイが検出可能なシグナルについてスクリーニングされる。
本発明は、アポトーシスを介した細胞死の増加により特徴付けられる疾病状態(例えば、癌)を診断するためのアポトーシスマーカーを利用する方法も包含する。個体中の新生物細胞の存在は、該新生物細胞のアポトーシスの結果として血中のヌクレオソームレベルを上昇させることが示された。従って、本発明者は、ヌクレオソームの分析をアポトーシス細胞から放出されたものに限ることにより、診断スクリーニングの感度を上昇させることを意図している。ひとつのヒストンエピトープが、アポトーシスマーカーとして働くことが同定された(国際特許出願番号PCT/US02/24405を参照。この記載は本明細書に取り込まれる)。該エピトープに対する抗体が、様々な人工的な刺激で刺激されて、アポトーシス細胞死経路に入った細胞を同定する。該抗体は、ヒストンH2Bのアミノ末端ペプチドSer Ala Pro Ala Pro Lys Lys Gly Ser(P) Lys Lys(配列番号:7)(ここで、「Ser(P)」はリン酸化セリンを表す)に対するものである。該抗体を用いて、アポトーシス細胞から放出されたヌクレオソームを選択的に単離できる。
従って、本発明の1つの態様において、該「アポトーシス抗体」を用いて、アポトーシス/増幅された細胞死と関係する疾病の診断指標として、患者の体液中に存在するヌクレオソームを検出できる。H2Bのアミノ末端から14番目の位置にあるセリンアミノ酸(Ser14)は、アポトーシス過程をこれから経験するかまたは既に始まった細胞において、生体内で選択的にリン酸化されるので、該抗体は、疾病を有するかまたは生じるリスクのある個体のアポトーシス細胞から放出された、血中に存在するヌクレオソームを検出するために高感度となる。それゆえ、該抗体は、個体の疾病状態を検出するための特に有効な診断的特徴となる。該診断方法は、血液、血漿、または血清試料を得る段階、該試料を、ペプチドSer Ala Pro Ala Pro Lys Lys Gly Ser(P) Lys Lys(配列番号:7)の様なSer14の位置でリン酸化されるヒストンH2Bアミノ末端ペプチドに特異的な抗体を含む組成物と接触させる段階、およびアポトーシス細胞から放出されたヌクレオソームを回収するために該抗体と結合したヌクレオソームを免疫沈降する段階を含む。アポトーシスマーカーの抗体で免疫沈降されたヌクレオソームの閾値が、アポトーシス/増幅された細胞死と関係する疾病状態を予測する。
1つの実施態様に従って、患者から単離された無細胞のヌクレオソームと結合したDNAを分析することにより、患者の腫瘍関連遺伝子を検出する方法が提供される。該実施態様に従って、無細胞のヌクレオソームが、ヒストンタンパク質と特異的に結合する1以上の抗体を用いて、体液から単離される。該ヌクレオソームは免疫沈降され、結合DNAが精製され、精製されたDNA配列によりコード化される遺伝子を同定するための分子分析技術の対象とされる。1つの実施態様において、免疫沈降されたヌクレオソームから回収されたDNAは、PCRを介して必要に応じて増幅され、続いて該DNAが、相補的な核酸配列のハイブリダイゼーション(ここで、核酸2本鎖の形成により検出可能なシグナルが生じる)に適した条件下で、核酸マイクロアレイと接触させられる。該方法において、無細胞のヌクレオソームと結合したDNAによりコード化される遺伝子が、同定され得る。無細胞のヌクレオソームと結合したDNAによりコード化される特定の遺伝子を同定することは、処置に起因する好ましい効果ならびに副作用についてモニターすることを含む、治療上の処置をモニターするのに特に有用である。さらに、ヒストンのアミノおよびカルボキシテールの翻訳後修飾により作成される、ある種のヒストンエピトープを標的とする抗体を選択することにより、無細胞のヌクレオソームのある種のサブセットが免疫沈降され、そして結合DNAが分析される。
1つの実施態様に従って、腫瘍関連遺伝子を検出すること、または成人女性中の胎児DNAを同定する方法が提供される。該方法は、対象の胎児または腫瘍遺伝子と結合した固有に修飾されたヒストンタンパク質を利用して、胎児のDNAか、または原発腫瘍のDNAを単離する段階を含む。例えば、国際特許出願番号PCT/US01/26283で既に記載された抗体は、リジン9でアセチル化されたヒストンと結合するDNAを特異的に沈殿させる。母親のDNAと比べて、胎児中の対象の遺伝子と結合したヒストンの異なるアセチル化が、胎児DNAの単離および同定を可能とする。具体的には、ヌクレオソームを生じる胎児DNAが選択的に沈殿され、そして該DNAがPCRまたは別の増幅技術により回収される。免疫沈降されたヌクレオソームから回収されたDNAのシークエンスは、胎児遺伝子、または腫瘍細胞と関係する核酸配列中の変異の存在または不存在の同定を可能とする。従って、該技術は、胎児の遺伝子欠陥のスクリーニング、ならびに早期癌のスクリーニングのための重要な非侵襲的技術となり得る。
本発明の1つの重要な態様において、該方法を用いて、胎児が特定の遺伝子欠陥のヘテロ接合体、あるいはホモ接合体であるかを決定できる。それゆえ、1つの態様において、本発明は、母親がその病気のキャリアーであるときでさえ適切であるという利点を有する、遺伝子疾病および形質の非侵襲的出生前診断を可能とする。さらに、該出生前診断は、家族調査を必要とせずに行われ得る。
1つの実施態様において、本発明の抗体が標識される。本発明が特定の検出システムまたは標識に限られることは意図されていない。抗体は、フルオロフォア、放射性同位元素、またはビオチンまたはジコキシゲニンの様な非放射性標識試薬で標識される;ビオチンを含有する抗体は、蛍光色素の様な任意の検出可能な標識と結合した「検出試薬」(例えば、アビジン)を用いて検出される。1つの実施態様において、本発明のヒストン特異的抗体は、2次抗体(ここで、2次抗体は標識され、かつ1次(ヒストン特異的)抗体に特異的である)の使用により検出される。または、該ヒストン特異的抗体は、放射性同位元素、またはFITCまたはローダミンの様なフルオロフォアで直接標識され;かかる場合、2次検出試薬は、標識プローブの検出に必要とされない。続いて、血中の修飾されたヒストンの存在が、関連標識抗体の使用により検出され得る。
1つの実施態様に従って、疾病状態と関連する染色質変化を検出する方法が提供される。該方法は、ヌクレオソームの第1および第2のプールをそれぞれ作り出すために、健常個体および罹病個体から採取された生物学的試料から、無細胞のヌクレオソームを単離する段階を含む。典型的には、該生物学的試料は、血液試料またはその派生物(例えば、血清または血漿)を含むが、リンパ液、尿、唾液の様な、細胞外DNAを含有する他の体液も用いられ得る。1つの好ましい実施態様において、ヌクレオソームは、1以上のヒストン特異的抗体の使用により、生物学的試料から回収される。1つの実施態様において、ヒストン特異的抗体は、図1で示されるヒストンのアミノおよびカルボキシテールの翻訳後修飾の1つにより、作られるエピトープと結合する抗体である。1つの実施態様において、ヒストン特異的抗体は、
Ala Arg Thr Lys(M) Gln Thr Ala Arg(配列番号:1)、
Ser Gly Arg(M) Gly Lys(配列番号:2)、
Ser Gly Arg Gly Lys(A)(配列番号:3)、
Ser Gly Arg(M) Gly Lys(A)(配列番号:4)、
Ser(P) Gly Arg(M) Gly Lys(A)(配列番号:5)、
Gln Thr Ala Arg Lys(M) Ser Thr Gly Val(配列番号:6)、
Gln Thr Ala Arg Lys(M) Ser Thr Gly Gly(配列番号:8)、および
Ala Ala Arg Lys(M) Ser Ala Pro(配列番号:9)、
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むペプチドと結合する抗体である。
Ala Arg Thr Lys(M) Gln Thr Ala Arg(配列番号:1)、
Ser Gly Arg(M) Gly Lys(配列番号:2)、
Ser Gly Arg Gly Lys(A)(配列番号:3)、
Ser Gly Arg(M) Gly Lys(A)(配列番号:4)、
Ser(P) Gly Arg(M) Gly Lys(A)(配列番号:5)、
Gln Thr Ala Arg Lys(M) Ser Thr Gly Val(配列番号:6)、
Gln Thr Ala Arg Lys(M) Ser Thr Gly Gly(配列番号:8)、および
Ala Ala Arg Lys(M) Ser Ala Pro(配列番号:9)、
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むペプチドと結合する抗体である。
1つの実施態様において、該ヒストン特異的抗体は、ペプチドAla Arg Thr Lys(M) Gln Thr Ala Arg(配列番号:1)、またはGln Thr Ala Arg Lys(M) Ser Thr Gly Gly(配列番号:8)と結合する抗体である。
生物学的試料からヌクレオソームを単離後、該単離されたヌクレオソームと結合したDNAが、精製されたDNAの第1および第2のプール(健常個体から回収されたDNAのセット、および特定の疾病状態に罹患している個体から回収されたDNAのセット)を作成するために、ヌクレオソームの第1および第2のプールから精製される。続いて、該精製されたDNAが、DNAシークエンス、核酸ハイブリダイゼーション分析(サザンブロット分析を含む)、PCR増幅、または別のスクリーニング法の様な標準的分子技術を用いて分析され、精製されたDNA配列の2つのプール間の違いが同定される。核酸配列の2つのプールのうち1つにだけ存在する核酸配列が、疾病状態と関係する可能性のある発現/抑制遺伝子(ヌクレオソームを単離するために用いられた抗体に依存する)を表す。
1つの実施態様に従って、健常および非健常個体の無細胞ヌクレオソームから回収されたDNAの2つのプールは、相補的配列間のハイブリダイゼーションを可能とする条件下で、同一セットのDNAマイクロアレイとそれぞれ別々に接触させられる。該マイクロアレイは、特定の疾病と関係するDNAのサブセットを含有するか、あるいは1以上の特定の細胞種類および発生ステージで発現する配列の全セットを含有する。該既知配列は、固体表面、またはマイクロアレイを形成するための「チップ」上に固定化され得る。該マイクロアレイは、当該技術分野の技術者に知られた技術を用いて用意され得る。該マイクロアレイは、精製されたDNAのプール由来のヌクレオソーム中の配列とマイクロアレイの核酸配列とのハイブリダイゼーションが、検出可能なシグナルを発生するように設計される。
1つの実施態様において、精製されたヌクレオソームDNAの2つのプール(すなわち、健常および非健常供給源由来)が標識され、マイクロアレイと接触させられる。そして1つの実施態様においては、該DNA配列がPCRにより増幅され、標識され、そして該配列がマイクロアレイと接触させられる。続いて、未結合および非特異的結合物質を除去するための該アレイの洗浄により、マイクロアレイ上に存在する既知の配列と特異的に結合する標識配列の検出が可能となり、従って、標識配列の同一性(identity)が明らかとなる。さらに、精製DNAの第2のプールと、精製DNAの第1のプールで得られたハイブリダイゼーションパターンの比較により、疾病状態と潜在的に関係する染色質変化が明らかとなる。
ある種の遺伝子が特定の疾病状態と関係するとして同定されると、続いて該遺伝子配列が本方法論を用いる診断検査のための基礎を形成し得る。1つの実施態様に従い、病変をスクリーニング/検出する方法は、修飾されたヒストンに特異的な抗体の使用により、個体から無細胞のヌクレオソームを単離する段階、および単離されたヌクレオソームと結合した核酸配列の同一性を決定する段階を含む。該配列の同一性は、配列分析によるか、または既知の配列とのハイブリダイゼーションにより決定され得る。事前に選択された特定の核酸配列の同定が、疾病状態の診断的特徴となる。例えば、癌と関係すると既に明らかな癌遺伝子または遺伝子変異の存在は、事前に選択される特定の配列を決定する。
染色質免疫沈降DNAを現在のゲノムマイクロアレイ技術と組み合わせることにより(チップ上)、「ヒストンコード」と関連する配列と結合する固有の修飾されたヒストンと関連するヒト(または他の)ゲノムの任意の位置を調べることが可能である。例えば、メチル(K4)H3抗体(配列番号:1の配列に特異的)を用いて免疫沈降されたDNAが、固体表面または「チップ」上に固定化され、従って、転写に適する与えられた細胞の全核酸配列を表す。同様に、メチル(K9)H3抗体(配列番号:6の配列に特異的)を用いて免疫沈降されたDNAが、固体表面または「チップ」に固定化され、従って、転写に適さない与えられた細胞の全核酸配列を表す。個体の血液からヌクレオソームを収集すること、結合したDNAを回収すること、該DNAを標識すること、続いて標識されたDNAを、固定化されたDNAマイクロアレイとハイブリダイゼーションさせることで、遺伝子の異常発現を明らかにする。相違は、定性的ならびに定量的に測定され得る。該情報を知ることは、様々なヒト癌において、鍵となる腫瘍抑制遺伝子または癌遺伝子のタンパク質のオン/オフ状態を決定する際に非常に有益である。
1つの実施態様において、染色質の免疫沈降を用いて、マイクロアレイの使用により、広範囲のゲノムでの活性な遺伝子の位置を決定する。例えば、1つの好ましい実施態様において、免疫沈降された染色質の2つのプール(すなわち、疾病および健常組織由来の免疫沈降された染色質)を含む方法は、当該技術分野の技術者に知られた標準的技術を用いる遺伝子チップ、DNAマイクロアレイ、またはプロテオミクスチップの使用を含む。例えば、WO01/16860、WO01/16860、WO01/05935、WO00/79326、WO00/73504、WO00/71746、およびWO00/53811(これらの記載は、本明細書に特に取り込まれる)で記載されるシステムのいずれかが、本発明での使用に適している。好ましくは、チップの特定の位置での免疫沈降された染色質の相互作用が明らかとなり、該チップは、免疫沈降された染色質と結合したDNA配列の単離が可能となるように、既知のDNA配列の様な既知化合物の所定アレイを含有する。
様々な修飾がヒストンコードと関連するので、該技術の鍵は、それらに特異的な抗体を使用することである。ヒトおよび他のゲノムに対してのこの適用は、エピゲノムの基礎となる。本発明は、それぞれのオン/オフ抗体として、Lys4/Lys9メチルH3抗体の使用を詳述したが、この概念は、「ヒストンコード」に対して形成される抗体の全てに対してより一般的に適用される。例えば、Lys9メチル対Ser10ホスホH3抗体は、分化対増殖を制御する「メチル/ホスホ」スイッチもある。本発明は、H3リジン27および36、およびH4リジン20を含むH3およびH4ヒストンのアミノ末端の別のメチル化領域に対する抗体も包含する。該抗体を生成するために用いられるペプチドは、次に挙げられる:
H3リジン27:AARK(M)SAPVCG(配列番号:10)
H3リジン36:SGGVK(M)KPHKCG(配列番号:11)
H4リジン20:RHRK(M)ILRDCG(配列番号:12)
(ここで、K(M)はメチル化されたリジン残基を表し、下線を引いたGCは、該抗体の生成のため、H3配列に加えられたアミノ酸を意味している)。
H3リジン27:AARK(M)SAPVCG(配列番号:10)
H3リジン36:SGGVK(M)KPHKCG(配列番号:11)
H4リジン20:RHRK(M)ILRDCG(配列番号:12)
(ここで、K(M)はメチル化されたリジン残基を表し、下線を引いたGCは、該抗体の生成のため、H3配列に加えられたアミノ酸を意味している)。
実施例1
アポトーシス細胞由来のオリゴヌクレオソームの検出
MDA−MB−468ヒト乳腺癌細胞を、10%ウシ胎児血清を添加したLeibovitz培地中に1.75×106細胞/25cm2で播種した。対数増殖中である48時間後に、3つのフラスコの細胞を、0.1〜0.3M タキソールまたはDMSO(ビークル、最終濃度0.002%)で、37℃にて8または18時間刺激した。
アポトーシス細胞由来のオリゴヌクレオソームの検出
MDA−MB−468ヒト乳腺癌細胞を、10%ウシ胎児血清を添加したLeibovitz培地中に1.75×106細胞/25cm2で播種した。対数増殖中である48時間後に、3つのフラスコの細胞を、0.1〜0.3M タキソールまたはDMSO(ビークル、最終濃度0.002%)で、37℃にて8または18時間刺激した。
続いて細胞を、ダルベッコリン酸緩衝食塩水2×10mlでそっと洗浄し、続いて最小容量(200L/25cm2)の可溶化バッファー:
50mM Tris−HCl、pH7.4、
150mM NaCl、
1% トリトン−X100、
2.5mM ピロリン酸ナトリウム、
10mM グリセロリン酸塩、
中で、室温にて30分間可溶化した。
50mM Tris−HCl、pH7.4、
150mM NaCl、
1% トリトン−X100、
2.5mM ピロリン酸ナトリウム、
10mM グリセロリン酸塩、
中で、室温にて30分間可溶化した。
これに、最終濃度:
10mM EDTA、
200ng/ml トリコスタチンA、
2M スタウロスポリン、
1M オカダ酸、
0.5M シベルメトリン、
500M AEBSF(PMSFに代わる安定なもの)、
1g/ml アプロチニン、
1M E−64、
1M ロイペプチン、
となる様に設計された阻害剤カクテルを添加して、直ちに使用した。
10mM EDTA、
200ng/ml トリコスタチンA、
2M スタウロスポリン、
1M オカダ酸、
0.5M シベルメトリン、
500M AEBSF(PMSFに代わる安定なもの)、
1g/ml アプロチニン、
1M E−64、
1M ロイペプチン、
となる様に設計された阻害剤カクテルを添加して、直ちに使用した。
続いて、洗剤に不溶性(非分画)の染色質、未変性の核および細胞をペレットとするために、細胞溶解物を4℃にて325gで10分間遠心した。必要に応じて生成されたモノおよびオリゴヌクレオソームの濃縮物を含有する上清を回収し、等分して−80℃で保存した。続いて、試料を、ELISA(Roche diagnosticのキット:カタログ番号1774425)でヌクレオソームの中身について、およびリン酸化、アセチル化、またはメチル化ヒストンに特異的な抗体シリーズを用いるウエスタンブロット(Upstate)により、タンパク質レベルでの「マークした」ヌクレオソームの存在について分析した。
ELISAは、ビークルと比べて、8時間タキソールで処理した細胞上清中で約40〜45倍濃縮したヌクレオソームを示す。最大添加量(16L/ウェル)の細胞溶解物含有ヌクレオソームを、MESバッファーシステム(Novex)を用いたNuPAGE12%Bis−Trisゲル(還元)での電気泳動により、分離した。ニトロセルロース膜に移した後、4℃で一晩、メチル化ヒストンH3(lys−4)、リン酸化ヒストンH3(ser−10)、およびアセチル化ヒストンH3(lys−14)に特異的なポリクローナルウサギ抗体で、ブロットにプローブ結合させた。続いて、5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリル−1−リン酸塩/ニトロブルーテトラゾリウム色素生産性基質(Invitrogen)と結合した、アルカリホスファターゼ結合抗ウサギヤギ抗体を用いて、タンパク質を目に見えるようにした。ヌクレオソームがアポトーシス過程を通じて、リン酸化、アセチル化、およびメチル化ヒストン成分を維持していることを示す陽性結果を、「マークしたヒストン特異的」抗体の両方で得た。
Claims (26)
- 個体中の活性な遺伝子配列を検出する方法であって、
該個体由来の体液試料を用意すること;
該試料を、活性な遺伝子配列と結合する修飾されたヒストンと結合する抗体と接触させること;
該抗体と結合したヌクレオソームを単離すること;
該ヌクレオソームと結合したDNAを精製すること;および
該個体中の活性な遺伝子配列を検出するために、精製DNAによりコード化される遺伝子を同定すること、
の段階を含む、方法。 - 抗体が、
Ala Arg Thr Lys(M) Gln Thr Ala Arg(配列番号:1)、
Ser Gly Arg(M) Gly Lys(配列番号:2)、
Ser Gly Arg Gly Lys(A)(配列番号:3)、
Ser Gly Arg(M) Gly Lys(A)(配列番号:4)、および
Ser(P) Gly Arg(M) Gly Lys(A)(配列番号:5)、
からなる群から選択されるペプチドと特異的に結合する、請求項1に記載の方法。 - 遺伝子を同定する段階が精製DNAをシークエンスすることを含む、請求項1に記載の方法。
- 精製DNAが該シークエンス段階の前に増幅される、請求項3に記載の方法。
- 遺伝子を同定する段階が、相補鎖のハイブリダイゼーションに適した条件下で、該精製DNAを既知の核酸配列と接触させることを含む(ここで、その相補体への精製DNAのハイブリダイゼーションが当該遺伝子を同定するものである)、請求項1に記載の方法。
- 精製DNAが、それを既知のDNA配列と接触させる前に標識される、請求項5に記載の方法。
- 既知のDNA配列が固体表面に固定化される、請求項5に記載の方法。
- 体液が、尿、血液、リンパ液、血漿、または血清からなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
- 体液が血液、血漿、または血清である、請求項7に記載の方法。
- 個体中の不活性な遺伝子配列を検出する方法であって、
該個体由来の体液試料を用意すること;
該試料を、不活性な遺伝子配列と結合する修飾されたヒストンと結合する抗体と接触させること;
該抗体と結合したヌクレオソームを単離すること;
該ヌクレオソームと結合したDNAを精製すること;および
該個体中の不活性な遺伝子配列を検出するために、精製DNAによりコード化される遺伝子を同定すること、
の段階を含む、方法。 - 抗体が、
Gln Thr Ala Arg Lys(M) Ser Thr Gly Val(配列番号:6)、
Gln Thr Ala Arg Lys(M) Ser Thr Gly Gly(配列番号:8)、および
Ala Ala Arg Lys(M) Ser Ala Pro(配列番号:9)、
からなる群から選択されるペプチドと特異的に結合する、請求項10に記載の方法。 - 遺伝子を同定する段階が、精製DNAをシークエンスすることを含む、請求項10に記載の方法。
- 精製DNAが、該シークエンス段階の前に増幅される、請求項12に記載の方法。
- 遺伝子を同定する段階が、相補的配列のハイブリダイゼーションに適した条件下で、該精製DNAを既知の核酸と接触させることを含む(ここで、その相補体への精製DNAのハイブリダイゼーションが遺伝子を同定するものである)、請求項10に記載の方法。
- 精製DNAが、それを既知のDNA配列と接触させる前に標識される、請求項14に記載の方法。
- 既知のDNA配列が固体表面に固定化される、請求項15に記載の方法。
- 既知のDNA配列が固定化されたDNAマイクロアレイを含み、該固定化DNAとその相補体との結合が検出可能なシグナルを発生させる、請求項16に記載の方法。
- 体液が血液または血清である、請求項10に記載の方法。
- 個体のアポトーシス細胞から放出されるヌクレオソームを単離する方法であって、
血液または血清試料を用意すること;
該試料を、アミノ酸配列Ser Ala Pro Ala Pro Lys Lys Gly Ser(P) Lys Lys(配列番号:7)を含むペプチドと特異的に結合する抗体を含む組成物と接触させること;
アポトーシス細胞から放出されたヌクレオソームを回収するために、該抗体と結合したヌクレオソームを単離すること、
の段階を含む、方法。 - 疾病状態と関係する染色質の変化を検出する方法であって、
ヒストンタンパク質に特異的な抗体の使用により、健常個体および罹病個体から採取された試料から、ヌクレオソームの第1および第2のプールをそれぞれ作成するために、無細胞のヌクレオソームを単離すること;
精製DNAの第1および第2のプールを作成するために、該単離されたヌクレオソームの第1および第2のプールと結合したDNAを精製すること;
相補配列間のハイブリダイゼーションを可能とする条件下で、DNAの第1および第2のプールを同一セットのDNAマイクロアレイと接触させること(ここで、精製されたプールのDNA中の配列と、マイクロアレイの核酸配列とのハイブリダイゼーションが、検出可能なシグナルを発生させるものである);
疾病状態と関係する染色質の変化を検出するために、精製DNAの第1のプールで得られるハイブリダイゼーションパターンを、精製DNAの第2のプールに対して比較すること;
の段階からなる、方法。 - ヒストン特異的抗体が、
Ala Arg Thr Lys(M) Gln Thr Ala Arg(配列番号:1)、
Ser Gly Arg(M) Gly Lys(配列番号:2)、
Ser Gly Arg Gly Lys(A)(配列番号:3)、
Ser Gly Arg(M) Gly Lys(A)(配列番号:4)、
Ser(P) Gly Arg(M) Gly Lys(A)(配列番号:5)、
Gln Thr Ala Arg Lys(M) Ser Thr Gly Val(配列番号:6)、
Gln Thr Ala Arg Lys(M) Ser Thr Gly Gly(配列番号:8)、および
Ala Ala Arg Lys(M) Ser Ala Pro(配列番号:9)、
からなる群から選択されるペプチドと特異的に結合する、請求項20に記載の方法。 - 該精製DNAが、それをマイクロアレイと接触する段階の前に増幅される、請求項20に記載の方法。
- 該精製DNAが、それをマイクロアレイと接触させる段階の前に標識される、請求項20に記載の方法。
- 疾病状態を検出する方法であって、
修飾されたヒストンに特異的な抗体の使用により、個体から無細胞のヌクレオソームを単離すること;および
単離されたヌクレオソームと結合した核酸配列の同一性を決定すること(ここで、特定の核酸配列の同定が、疾病状態の診断的特徴となるものである);
の段階を含む、方法。 - 抗体が、アミノ酸配列Ser Ala Pro Ala Pro Lys Lys Gly Ser(P) Lys Lys(配列番号:7)を含むペプチドと特異的に結合する、請求項24に記載の方法。
- 該核酸配列が核酸をシークエンスすることにより同定される、請求項24に記載の方法。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US35832502P | 2002-02-20 | 2002-02-20 | |
US36545902P | 2002-03-19 | 2002-03-19 | |
PCT/US2003/004661 WO2003070894A2 (en) | 2002-02-20 | 2003-02-19 | A non-invasive diagnostic test utilizing histone modification markers |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2005517431A true JP2005517431A (ja) | 2005-06-16 |
Family
ID=27760487
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2003569787A Pending JP2005517431A (ja) | 2002-02-20 | 2003-02-19 | ヒストン修飾マーカーを利用した非侵襲的診断検査 |
Country Status (6)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20050069931A1 (ja) |
EP (1) | EP1483415A4 (ja) |
JP (1) | JP2005517431A (ja) |
AU (1) | AU2003216291A1 (ja) |
CA (1) | CA2476835A1 (ja) |
WO (1) | WO2003070894A2 (ja) |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2009536336A (ja) * | 2006-05-09 | 2009-10-08 | ザ ユニバーシティ オブ バーミンガム | ヒストン |
JP2010539906A (ja) * | 2007-09-21 | 2010-12-24 | バイオセプト インコーポレイティッド | 胎児の細胞および核酸の同定および単離 |
KR20140078638A (ko) * | 2011-09-01 | 2014-06-25 | 싱가폴 볼리션 피티이 리미티드 | 히스톤 변이체를 함유하는 뉴클레오솜의 검출 방법 |
JPWO2018181274A1 (ja) * | 2017-03-27 | 2019-11-07 | 積水メディカル株式会社 | 抗体を用いた標的核酸濃縮及び回収法 |
Families Citing this family (30)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB0319376D0 (en) | 2003-08-18 | 2003-09-17 | Chroma Therapeutics Ltd | Histone modification detection |
WO2005040814A1 (en) * | 2003-10-14 | 2005-05-06 | Cancer Research Technology Limited | Methods and means of cancer detection by histone modification |
GB0413732D0 (en) * | 2004-06-13 | 2004-07-21 | Chroma Therapeutics Ltd | Histone modification |
US7655431B2 (en) * | 2004-12-09 | 2010-02-02 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Compositions and methods based upon the kinase haspin |
DE602006018458D1 (de) * | 2005-04-29 | 2011-01-05 | Univ California | Antikörper gegen histonmodifikationen für die klinische krebsdiagnose und -prognose |
US8119572B2 (en) * | 2005-10-24 | 2012-02-21 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Methods for determining protein binding specificity using peptide libraries |
WO2007121276A2 (en) * | 2006-04-12 | 2007-10-25 | Biocept, Inc. | Enrichment of circulating fetal dna |
WO2008027548A2 (en) * | 2006-09-01 | 2008-03-06 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Microarray-based global chromatin structure mapping |
US20100240054A1 (en) * | 2008-09-22 | 2010-09-23 | Biocept, Inc. | Identification and isolation of fetal cells and nucleic acid |
US20130224880A1 (en) | 2011-05-27 | 2013-08-29 | Ptm Biolabs, Inc. | Reagents and methods for detecting protein crotonylation |
GB201115099D0 (en) * | 2011-09-01 | 2011-10-19 | Belgian Volition Sa | Method for detecting nucleosomes |
CN103183725B (zh) * | 2011-12-27 | 2016-06-08 | 杭州景杰生物科技有限公司 | 一种蛋白质赖氨酸巴豆酰化修饰的检测及亲和试剂开发的方法 |
US9605313B2 (en) * | 2012-03-02 | 2017-03-28 | Sequenom, Inc. | Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations |
GB201303576D0 (en) * | 2013-02-28 | 2013-04-10 | Singapore Volition Pte Ltd | Method for predicting therapy efficacy using nucleosome structure biomarkers |
EP3597774A1 (en) | 2013-03-13 | 2020-01-22 | Sequenom, Inc. | Primers for dna methylation analysis |
EP3004383B1 (en) | 2013-05-24 | 2019-04-24 | Sequenom, Inc. | Methods for non-invasive assessment of genetic variations using area-under-curve (auc) analysis |
WO2015134523A1 (en) * | 2014-03-03 | 2015-09-11 | The Board Of Trustees Of The University Of Illinois | Chromatin immunocapture devices and methods of use |
EP3117011B1 (en) | 2014-03-13 | 2020-05-06 | Sequenom, Inc. | Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations |
US20160034640A1 (en) | 2014-07-30 | 2016-02-04 | Sequenom, Inc. | Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations |
EP3075743A1 (en) * | 2015-03-30 | 2016-10-05 | Universität Stuttgart | Isolation of nucleosomes having multiple-modified histone protein octamers |
EP3491560A1 (en) | 2016-07-27 | 2019-06-05 | Sequenom, Inc. | Genetic copy number alteration classifications |
CA3049961A1 (en) | 2016-12-09 | 2018-06-14 | The Broad Institute, Inc. | Crispr effector system based diagnostics |
CA3207879A1 (en) | 2017-01-24 | 2018-08-02 | Sequenom, Inc. | Methods and processes for assessment of genetic variations |
WO2018170340A1 (en) | 2017-03-15 | 2018-09-20 | The Broad Institute, Inc. | Crispr effector system based diagnostics for virus detection |
US11174515B2 (en) | 2017-03-15 | 2021-11-16 | The Broad Institute, Inc. | CRISPR effector system based diagnostics |
BR112020015093A2 (pt) | 2018-01-29 | 2020-12-08 | The Broad Institute, Inc. | Diagnóstico baseado no sistema de efetor crispr |
EP3765638A2 (en) | 2018-03-13 | 2021-01-20 | Yissum Research Development Company of the Hebrew University of Jerusalem Ltd. | Diagnostic use of cell free dna chromatin immunoprecipitation |
WO2020186223A1 (en) | 2019-03-14 | 2020-09-17 | The Broad Institute, Inc. | Sherlock assays for tick-borne diseases |
WO2023131939A1 (en) | 2022-01-05 | 2023-07-13 | Yeda Research And Development Co. Ltd. | Methods and kits for analyzing nucleosomes and plasma proteins |
WO2024133222A1 (en) * | 2022-12-19 | 2024-06-27 | Belgian Volition Srl | Assessment of biological samples for nucleic acid analysis |
Family Cites Families (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AU2934299A (en) * | 1998-03-18 | 1999-10-11 | Roche Diagnostics Gmbh | Detection of apoptotic products |
AU4676500A (en) * | 1999-04-28 | 2000-11-10 | Northwestern University | Localization of major peptide autoepitopes for nucleosome specific t cells of systemic lupus erythematosus |
WO2002018418A1 (en) * | 2000-08-25 | 2002-03-07 | University Of Virginia Patent Foundation | Antibodies specific for methylated lysines in histones |
JP2005508302A (ja) * | 2001-07-03 | 2005-03-31 | ユニバーシティ オブ バージニア パテント ファウンデーション | アルギニン3でのヒストンh4のメチル化 |
CA2456010A1 (en) * | 2001-08-03 | 2003-02-20 | University Of Virginia Patent Foundation | Phosphorylated histone h2b as an apoptosis marker |
-
2003
- 2003-02-19 WO PCT/US2003/004661 patent/WO2003070894A2/en active Application Filing
- 2003-02-19 AU AU2003216291A patent/AU2003216291A1/en not_active Abandoned
- 2003-02-19 JP JP2003569787A patent/JP2005517431A/ja active Pending
- 2003-02-19 EP EP03742781A patent/EP1483415A4/en not_active Withdrawn
- 2003-02-19 CA CA002476835A patent/CA2476835A1/en not_active Abandoned
-
2004
- 2004-08-19 US US10/922,806 patent/US20050069931A1/en not_active Abandoned
Cited By (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2009536336A (ja) * | 2006-05-09 | 2009-10-08 | ザ ユニバーシティ オブ バーミンガム | ヒストン |
JP2010539906A (ja) * | 2007-09-21 | 2010-12-24 | バイオセプト インコーポレイティッド | 胎児の細胞および核酸の同定および単離 |
KR20140078638A (ko) * | 2011-09-01 | 2014-06-25 | 싱가폴 볼리션 피티이 리미티드 | 히스톤 변이체를 함유하는 뉴클레오솜의 검출 방법 |
JP2014529405A (ja) * | 2011-09-01 | 2014-11-13 | シンガポールボリション ピーティーイーリミテッド | ヒストン変種含有ヌクレオソーム検出法 |
JP2017215338A (ja) * | 2011-09-01 | 2017-12-07 | ベルジアン ボリション エスピーアールエル | ヒストン変種含有ヌクレオソーム検出法 |
KR102130855B1 (ko) * | 2011-09-01 | 2020-07-09 | 벨지언 볼리션 에스피알엘 | 히스톤 변이체를 함유하는 뉴클레오솜의 검출 방법 |
JPWO2018181274A1 (ja) * | 2017-03-27 | 2019-11-07 | 積水メディカル株式会社 | 抗体を用いた標的核酸濃縮及び回収法 |
US11155805B2 (en) | 2017-03-27 | 2021-10-26 | Sekisui Medical Co., Ltd. | Target nucleic acid concentration and recovery method using antibody |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CA2476835A1 (en) | 2003-08-28 |
AU2003216291A1 (en) | 2003-09-09 |
EP1483415A2 (en) | 2004-12-08 |
EP1483415A4 (en) | 2006-02-01 |
WO2003070894A2 (en) | 2003-08-28 |
US20050069931A1 (en) | 2005-03-31 |
WO2003070894A3 (en) | 2004-02-26 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP2005517431A (ja) | ヒストン修飾マーカーを利用した非侵襲的診断検査 | |
EP1668368B1 (en) | Detection of histone modification in cell-free nucleosomes | |
US9045801B2 (en) | Biomarkers for non-hodgkin lymphomas and uses thereof | |
JP5476559B2 (ja) | リン酸化酵素の新規基質ポリペプチド | |
JP2003518920A (ja) | 新規なヒト遺伝子および遺伝子発現産物 | |
EP3027654A1 (en) | Pik3c2g fusions | |
US20080241852A1 (en) | Compositions, kits, and methods for identification, assessment, prevention, and therapy of endometriosis | |
JP2011092195A (ja) | 卵巣癌の同定、評価、予防および治療のための核酸分子およびタンパク質 | |
JP2010246558A (ja) | 乳癌の同定、評価、予防、および治療のための組成物、キットおよび方法 | |
CN114901832A (zh) | 分离循环核小体的方法 | |
JP6387001B2 (ja) | Cdk阻害剤と関連するバイオマーカー | |
JP2005508302A (ja) | アルギニン3でのヒストンh4のメチル化 | |
DE60325541D1 (de) | Verfahren/Präparat zur Erkennung von Pankreaskrebs | |
CA2070995A1 (en) | Diagnostic probe for detecting human stomach cancer | |
US7741052B2 (en) | Method of assessing the risk of atherosclerosis | |
US6962776B2 (en) | Methods and materials for evaluating cardiovascular conditions | |
KR102085663B1 (ko) | Wrb 유전자의 메틸화 수준을 이용한 소혈관폐색증의 예측 또는 진단을 위한 정보제공방법 및 이를 위한 조성물 | |
JP2013039111A (ja) | スプライシングバリアント | |
WO2011158863A1 (ja) | タンパク質キナーゼの新規基質ペプチド | |
US20130288275A1 (en) | Compositions and methods for detecting acetylated sumo proteins | |
AU2002322372A1 (en) | Methylation of histone H4 at arginine 3 | |
KR20140081659A (ko) | Sox2 검출용 폴리펩티드 및 이의 용도 | |
WO2007037532A1 (ja) | Srms遺伝子の治療的又は診断的用途 | |
KR20120132455A (ko) | bcl?2 단백질 표적 펩타이드 및 이의 이용 |