JP2005515972A - 痛み止め薬を製造するためのサイムリンのペプチド類縁体（ｔａｐ）の利用 - Google Patents

痛み止め薬を製造するためのサイムリンのペプチド類縁体（ｔａｐ）の利用 Download PDF

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Abstract


【課題】痛み止め薬を製造するためのサイムリンのペプチド類縁体（ＴＡＰ）を提供する。
【解決手段】本発明は、痛みの治療を目指して薬物を製造するための、免疫系に関して不活性であり、亜鉛を含まず、痛み止め活性を有する、サイムリンのペプチド類縁体の利用である。

Description

本発明は、痛み止め薬を製造するためのサイムリンのペプチド類縁体（ＴＡＰ）の利用に関する。
急性の痛み及び慢性の痛みの大半は、炎症反応の結果生じる。痛みを軽減するために推奨されている治療は、最初に炎症反応を軽減することから成ることが多い。
現在のところ、抗炎症薬には、２つの主要な部類：
−非ステロイド系抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ）
−コルチコステロイド類がある。
ＮＳＡＩＤ及びコルチコステロイド類は、有益な治療効果（炎症及び痛みの軽減）に不愉快な副作用を結び付けるという欠点を有する。
実際、ＮＳＡＩＤは潰瘍の形成を誘発し、一方、コルチコステロイド類は免疫抑制作用を有する。
理想的な鎮痛抗炎症薬は、副作用を有さず、生理系にも免疫系にも影響を有さない薬物であろう。
さらに、原因が炎症ではない第２の型の痛みがある。この神経性の痛みはさらに、アヘン剤を含む伝統的な治療に難治性であることを特徴とする。例えば、抗炎症剤、癲癇予防剤、抗うつ剤、交感神経遮断薬の使用又はこれらの併用のような異なった治療が実施されている。
しかしながら、神経性の痛みは極めて変幻自在であり、その結果、治療するのは極めて困難である。
従って、これらの検討は、結局、痛みを治療するのに今日利用できる薬物は数に限りがあり、役に立たないこともあるという結果に終わる。また、この無効性は製品に対して獲得された認容性の結果でもありうる。従って、開業医はその処方箋を修正せざるを得なくなる。これを効き目があるようにするには、彼に利用可能なもう１つの部類の薬物が存在しなければならない。
このことによってこの分野における研究の重要性が説明される。
本発明に係るサイムリンのペプチド類縁体は、自己免疫疾患の治療、Ｔ細胞の刺激及び移植片拒絶の予防のための薬物に関係するということで、特許及び追加特許、ＦＲ７７１５９６３、ＦＲ７８１１８７０及びＥＰ００４１０１９においてすでに記載されている。免疫系に関連したこれらペプチドの特性は亜鉛依存性であることが明らかにされている。事実、ペプチドに含有される亜鉛は、それに四面体構造を与え、それは分子の活性型に相当する。亜鉛の非存在下では、ペプチド類縁体はもはや、いかなる活性も有さない。さらに、その結果、試験管内アッセイで実証されたこれらの特性は生体内試験での免疫系に影響を有さないことが明らかにされている。その上、副次的効果は生じない。これらのペプチドは完全に安全である。
多数の出版物によって、注射した用量に依存してサイムリンは痛覚過敏を誘導する又は軽減することができることが明らかにされている（Safieh-Garabedian et al., Neuroimmunomodulation 6:39-44, 1999）。低用量（ラットにおいてナノグラムの桁；すなわち、０．２〜２０μｇ／ｋｇ）では、サイムリンは痛覚過敏を誘導するが、高用量（ラットにおけるミリグラムの桁；言い換えると５０〜１００μｇ／ｋｇ）では、痛覚過敏を軽減する。従って、免疫系への影響及びこの用量依存性（又は二相性）効果、痛みの誘導又は軽減を考えると、サイムリンの利用は不可能であった。
従って、本発明者は、免疫系に関して不活性である、サイムリンのペプチド類縁体に関心を持った。それらは当初予測した活性を示さなかったが、活性スペクトルを確認し、あらゆる予想に対して、相反する用量依存性効果を示さず、亜鉛依存性なしで鎮痛性の活性だけを有し、最終的に生体内で活性があることが示されることを確認した。
従って、本発明者の知見は、別な方法ですでに安全性が確立されていたこれらのペプチドを用いて、炎症性及び／又は神経性の起源の痛みを治療することを可能にする新しい部類の痛み止め薬を提供することを結果として導いた。
本発明は、痛みを治療することを目指して薬物を製造するための、免疫系に関して不活性であり、且つ鎮痛活性を有する、サイムリンのペプチド類縁体（ＴＡＰ）の利用に関する。
この適用目的での「免疫系に関して不活性であるサイムリンのペプチド類縁体」は、Ｔ細胞特異的な免疫応答に関して不活性である、サイムリンのペプチド類縁体として定義される。特に、これらのペプチドは、例えば、亜鉛のような金属と錯体を形成しない（Dardenne et al., PNAS, 79:5370-5373, 1982）。
本発明に係るペプチドの利用は、有害な二次的影響を誘導することなく、痛みに対して有効であるという利点を有する。
これらのペプチドは別の方法で、古典的な鎮痛剤よりも１０〜１００倍低い用量で効き目がある。例えば、ラットでは、非ステロイド系抗炎症剤の４ｍｇ／ｋｇ及びステロイド系抗炎症剤の２００ｍｇ／ｋｇに対して、利用される用量はラット当たり１μｇの桁（又は５μｇ／ｋｇ）である。５０〜２００ｎｇの桁／ラット；すなわち、０．２５〜１μｇ／ｋｇの低用量においても活性は見い出された。
特に、本発明に従って利用されるペプチドは以下の配列を有する：
Ｘ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ
式中、Ｘは、Ｓｅｒ、Ｌｙｓ−Ｓｅｒ、Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ、Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ、Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ、ＰｙｒｏＧｌｕ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ、並びに１つ又は２つの修飾アミノ酸を含む任意の派生配列を表し、前記可能性のある修飾は以下の種類である。
ＰｙｒｏＧｌｕ：Ｄ−ＰｙｒｏＧｌｕ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ
Ｇｌｎ：Ｚ−Ｇｌｎ、Ｄ−Ｇｌｎ、Ｐｒｏ、Ｃｙｓ（Ｓ−ＣＯＮＨ２）、Ｍｅｔ（Ｏ）、
Ｇｌｕ、Ｇｌｕ（γ−ｃｙａｎｏ）、Ｇｌｕ（γＣＳ−ＮＨ２）、Ｄ−Ｇｌｕ、
Ａｓｎ、ＮｏｒＶａｌ
Ａｌａ：Ｄ−Ａｌａ、Ｚ−Ａｌａ、Ａｃ−Ａｌａ
Ｌｙｓ：Ａｒｇ、Ｄ−Ｌｙｓ、Ｎ−γ−Ｚ−Ｌｙｓ、Ｌｙｓ（Ｎ６アセチル）、Ｏｒｎ、
Ｈａｒ、２−アミノ−ヘキサノイル、２，６−ジアミノヘキシノイル、２，６−
ジアミノヘキセノイル、Ｈｅｐ、Ｄ−Ｌｙｓ（Ｎ６アセチル）
Ｓｅｒ：Ａｌａ、（Ｎ−メチル）Ｓｅｒ、Ｄ−Ｓｅｒ、Ｔｈｒ
Ｇｌｙ：Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｄ−Ａｌａ、Ｄ−Ｌｅｕ
Ａｓｎ：シアノＡｌａ、チオ−Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、β−Ａｌａ−ＮＨ２、
Ｄ−Ａｓｎ、Ａｓｎ−ＮＨ２。
「サイムリン類縁体」の外延（reference）は、サイムリン、以下の配列：ＰｙｒｏＧｌｕ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｓｎを有するペプチドを明瞭に除外する。
特に、本発明は、以下のペプチドの利用の保護を想定する：
（１）ＰｙｒｏＧｌｕ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ
（２）ＰｙｒｏＧｌｕ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ
（３）ＰｙｒｏＧｌｕ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ
（４）ＰｙｒｏＧｌｕ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−β−Ａｌａ−ＮＨ２
（５）ＰｙｒｏＧｌｕ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｄ−Ａｓｎ
（６）ＰｙｒｏＧｌｕ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−ＮＨ２
（７）ＰｙｒｏＧｌｕ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ
（８）ＰｙｒｏＧｌｕ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｎｖａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ
（９）ＰｙｒｏＧｌｕ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｓｐ
（１０）Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ
（１１）Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ
（１２）Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ
（１３）Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−β−Ａｌａ−ＮＨ２
（１４）Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｄ−Ａｓｎ
（１５）Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−ＮＨ２
（１６）Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ
（１７）Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｎｖａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ
（１８）Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｓｐ
（１９）Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ
（２０）Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ
（２１）Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ
（２２）Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−β−Ａｌａ−ＮＨ２
（２３）Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｄ−Ａｓｎ
（２４）Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−ＮＨ２
（２５）Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ
（２６）Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｎｖａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ
（２７）Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｓｐ
（２８）Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ
（２９）Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ
（３０）Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ
（３１）Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−β−Ａｌａ−ＮＨ２
（３２）Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｄ−Ａｓｎ
（３３）Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−ＮＨ２
（３４）Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ
（３５）Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｎｖａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ
（３６）Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｓｐ
（３７）Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ
（３８）Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ
（３９）Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ
（４０）Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−β−Ａｌａ−ＮＨ２
（４１）Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｄ−Ａｓｎ
（４２）Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−ＮＨ２
（４３）Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ
（４４）Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｎｖａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ
（４５）Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｓｐ
さらに具体的には、本発明は、以下のペプチド：
（１９）Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ
（１）ＰｙｒｏＧｌｕ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ
（１０）Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ
（２８）Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ
（３７）Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｓｐの利用の保護を想定する。
エンドトキシンの足底内注射（局所）又は腹腔内注射（全身性）のいずれかによって誘導したラットにおける炎症及び痛覚過敏の２つのモデルにおいてこれらのペプチドを検討した。これらのペプチドを用いた予備処置によって機械的な痛覚過敏及び熱による痛覚過敏の双方が用量依存性になくなる。さらに、エンドトキシンの足底内注射によるＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＴＮＦα及びＮＧＦの過剰産生は、予備処置によって有意に軽減される。腹腔内注射の場合、敗血症性ショック（痛み、発熱、眠気及び食欲不振）に匹敵する状態の効果を有するが、予備処置は痛覚過敏を予防し、体を正常温度に保つ。
最終的に、これらのペプチドはそのほかの抗炎症剤と同一又はさらに優れた鎮痛効果を有するが、用いた用量すべてについて生理的及び行動的なパラメータにおいていかなる明瞭な変化も誘導しない。
従って、これらのペプチドは鎮痛特性及び／又は抗炎症特性を有する。
これらのペプチドの鎮痛特性は、神経性の痛み（又は神経障害性の痛み）にまで広がる。数種のモデルを用いて異なった病因の神経性の痛み：単神経障害、身体型又は臓器型の別の痛みモデルの２つの動物モデルが調べられている。これらのモデルによって機械的な異痛、及び時には、熱による異痛の有意な軽減を確認することが可能になる。神経障害性の徴候が阻害される一方で、刺激性物質（カプサイシン）の注射により誘導される痛みに関連する行動が軽減される。あらゆる場合において、これらのペプチドは、神経障害性の痛みの場合に利用されるそのほかの治療により誘導されるものより大きい又は同等である阻害効果を有する。
それらの特性を考慮すると、偏頭痛、坐骨神経痛、神経障害及び炎症性起源の急性又は慢性の痛みの治療にこれらのペプチドの利用はさらに特に推奨される。
最適な有効性のために、投与される好ましい用量は０．０１〜１ｍｇ／ｋｇの間であり、前記投与投薬は、非経口、経皮又は経鼻を含む様々な経路によって行われる。
以下にそれぞれ表す図面を参照しつつ、以下の実施例に照らして、本発明のそのほかの特徴及び利点がさらに良く理解されるであろう。
実施例１．本発明に係るペプチドの鎮痛特性及び抗炎症特性
１．材料及び方法
体重２００〜２５０ｇの成熟した雄のスプラーグ・ドーリー（Sprague-Dewley）ラットを用いて実験を行った。最適の照明及び温度（１２時間の明暗サイクル；２２±３℃）条件下にて動物を飼育した。餌及び水は自由に与えた。実験はすべて、意識がある状態で動物に行う痛み実験に関する倫理的指示に準拠して行い（Zimmermann M., 1983, Ethical guidelines for investigations of experimental pain in conscious animals ［意識のある動物における実験的痛みの研究に関する倫理的指針］、Pain, 16:109-110）、動物の世話に関する施設の審議会に承認された。
行動的処置
ベースラインを確立するために、注射に先立って連続して３日間にわたって熱による痛み試験及び機械的痛み試験を行った。
機械的な侵害受容性（nociceptive）の閾値は、機械的な足圧迫試験（ＰＰ）で決定したが、熱による侵害受容性の閾値は、ホットプレート（ＨＰ）、熱湯への足の浸漬（ＰＩ）及び尾払い試験（tail flick）を用いて決定した。
２回の連続した加圧の間が５分間隔で、左右の後足に交互に０．２０ｇ／ｃｍ２の一定の圧力を与えることによりＰＰ試験を行う。動物が、激しい屈曲反射を特徴とする典型的な反応を呈すると加圧を停止する。
ＨＰ試験では、動物を個別にホットプレート（５２．５±０．３℃）に載せる。痛みの閾値は、動物をホットプレートに載せた瞬間から動物が足をなめる又はジャンプするという事実により示される痛みの最初の兆候まで経過する潜伏期間によって測定される。
ＰＩ試験では、４８℃の蒸留水で後足を交互に濡らし、足を引っ込めるという最初の兆候まで経過する潜伏時間を記録する。
ＴＦ試験では、各動物の尾を５０．５℃の蒸留水に浸漬する。動物が尾を引っ込めることによってわかる潜伏時間を記録する。結果は５分間隔で行われる連続３回の試行に基づく。
薬剤の投与
２つの動物モデル：一方は局所の炎症；他方は全身性の炎症、を用いて、炎症性の痛覚過敏を実施した。
いわゆる局所モデルでは、一方の後足にエンドトキシン（Salmonella typhasa、リポ多糖類、シグマ）の溶液（５０μ１の９％生理的な生理食塩水溶液中で１．２５μｇ）を足底内注射することによりラットに投与し、それによって、注射を受けた足に限定された、熱による痛覚過敏及び機械的な痛覚過敏の双方を誘導する。
第２のモデルでは、ラットはエンドトキシン（１００μ１の生理的な生理食塩水溶液中で２５μｇ）の腹腔内注射を受ける。
次いで種々の治療が可能である：
プロトコール１（ａ）：異なったラット群（各群でｎ＝５）を以下の様式にてペプチド類縁体（ＴＡＰ）Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ（カナダのクアンタムバイオテクノロジー社［Quantum Biotechnologies, Inc.,］により合成された）で治療した：
−このペプチドの一回の腹腔内注射（５０μ１の生理的な生理食塩水溶液中で２５μｇ）を与えるか、又は
−エンドトキシン（ＥＴ）（足底内注射による５０μ１の生理的な生理食塩水溶液中で１．２５μｇ）の注射に３０分先立って、腹腔内注射による異なった用量のこのペプチド（５０μｌの塩化ナトリウム中１．５及び２５μｇ）で予備治療する、のいずれか。
プロトコール１（ｂ）：ペプチド類縁体の有効性をステロイド剤、ＮＳＡＩＤ、並びにＩＬ−１β及びプロスタグランジンにより誘導される痛覚過敏への拮抗性が知られているペプチドの有効性と比較して見られるそのほかの実験。
ＴＡＰの注射に３０分先立って、１００μ１の生理的な生理食塩水溶液中でのＬｙｓ−Ｄ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ（１０ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射により一群のラットを予備治療した。このトリペプチドはＩＬ−１βのみで誘導される痛覚過敏の拮抗性で知られている。
第２の群では、ＴＡＰの注射に３０分先立って、ラットは、１００μ１の生理的な生理食塩水溶液中でのＬｙｓ−Ｄ−Ｐｒｏ−Ｖａｌトリペプチド（１０ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射を受けた。Ｌｙｓ−Ｄ−Ｐｒｏ−Ｖａｌは、ＩＬ−１β及びＰＥＧ２によって誘導される痛覚過敏の拮抗剤である。
これらのトリペプチドで利用される用量はサフィ−ガラベディアン（Safieh-Garabedian B., Kanaan S.A., Haddad J.J., Abou Jaoude P., Jabbur S.J., Saade N.E., 1997, エンドトキシンが誘導する局所の炎症性痛覚過敏におけるインターロイキン−１β、神経生長因子及びプロスタグランジンＥ２の関与、Brit. J. Pharmacol., 121:1619-1626）の論文に記載されているものである。
第３の群及び第４の群は、デキサメタゾン及びインドメタシンで治療した。
ＥＴ注射の直前及び注射の３時間後、２００μｇ／ｋｇの濃度にて、９％塩化ナトリウム溶液中に溶解したリン酸デキサメタゾンを注射した。
生理食塩水緩衝溶液（ｐＨ７．４）に乳糖インドメタシンを溶解することによりインドメタシンを調製し、ＥＴ注射の直前及び注射の３時間後、４ｍｇ／ｋｇの濃度にて注射した。
前述の実験の試験はすべて、ＥＴ注射の９時間後に行った。これは、このモデルにおける痛覚過敏のピークと一致する。生理食塩水溶液（足底内に５０〜１００μｌ）の注射は痛みの閾値に有意な変化を示さなかった。
プロトコール２（ａ）：一方のラット群には、ＥＴ（５０μｇ）の腹腔内注射を与えたが、他方の群は、ＥＴ注射に３０分先立って、サイムリンのタンパク質類縁体（ＴＡＰ）（２５μｇ、腹腔内注射）で予備治療した。
次いで、ＥＴ注射の後１時間、３時間及び６時間でＴＦ試験及びＰＰ試験を行った。
プロトコール２（ｂ）：異なったラット群（各群、ｎ＝５）を以下の様式で治療した。
−５０μｇのＥＴを１回の腹腔内注射で与えたか、又は
−エンドトキシン注射に３０分先立って、ＴＡＰペプチド（２５μｇ、腹腔内注射）で予備治療したかのいずれか。
１時間、３時間及び６時間の時点で直腸温を測定した。
対照群には、ＴＡＰペプチド（１００μ１の生理食塩水溶液中で２５μｇ）の腹腔内注射を与えた。
サイトカイン及び神経成長因子（ＮＧＦ）
これらの実験には組織の試料採取が必要である。エンドトキシン注射の後、１時間（ＴＮＦαの測定のために）及び４時間（ＩＬ−１β、ＩＬ−６及びＮＧＦの測定のために）のいずれかで麻酔（ペンチオバルビタールナトリウム、５０ｍｇ／ｋｇ）によって動物を殺し、後足の皮膚を採取した。
ＩＬ−１β、ＴＮＦα、ＩＬ−６及びＮＧＦの評価を続行する目的で、これらの組織試料を重量測定し、急速凍結して−７０℃に保存する。
実験のもう１つのシリーズでは、異なったラット群：ＥＴ注射の３０分前にＴＡＰで予備治療した一方の群及びＴＡＰのみを注射した他方の群を用いて、上述のように組織を採取する。
０．４ＭのＮａＣｌ、０．０５％のツイーン２０（登録商標）、０．５％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、０．１ｍＭのフェニルメチルスルホニルフッ化物、０．１ｍＭの塩化ベンゼトニウム、１０ｍＭのＥＤＴＡ及び２０ＫＩ／ｍＬのアプロチニンを含有するリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ、ｐＨ＝７．４）中で組織をホモジネートする。
次いで、１，２００ｇで６０分４℃にて混合物を遠心する。ＥＬＩＺＡアッセイを用いて上清中に含有されるサイトカイン及びＮＧＦを測定した。
以下の製造元の推奨される指示書による免疫キット（プロメガ）の助けを借りてＮＧＦを測定する。
ＩＬ−１β、ＴＮＦα及びＩＬ−６の測定は、サフィ−ガラベディアン（Safieh-Garabedian B., Dardenne M., Kanaan S.A., Atweh S.F., Jabbur S.J., Saade N.E., 2000。サイムリンが誘導した痛覚過敏におけるサイトカイン及びプロスタグランジンの役割、Neuropharmacology 39:1653-1661）により記載されたプロトコールに従って行った。
データの統計学的解析及び処理
異なった侵害受容性試験に関しての痛みの閾値の値を動物の各群について規定した。調べた各薬剤について得られたデータを、注射する前に確立した対照、又は２種類の対照：１回のＥＴ注射が与えられた動物の一方のシリーズ及び９％塩化ナトリウム溶液の１回注射を受けた動物のもう一方のシリーズのいずれかと比較した。
サイトカイン及びＮＧＦのレベルの評価については、ＥＴのみ、薬剤のみ又はＥＴに加えて薬剤を注射した動物を用いて得られた値を、９％塩化ナトリウム溶液を注射した対照動物の群を用いて得られた値と比較した。
ＡＮＯＶＡそれに続くボンフェロニの検定を用いて、標準偏差の有意性を立証した。
２．結果
ＥＴの足底内注射により誘導した炎症性痛覚過敏におけるＴＡＰペプチドの効果
ラットの後足へのＥＴ（５０μｌの生理食塩水溶液中に１．２５μｇ）の足底内注射は、機械的な痛覚過敏に関するＰＰ試験（対照の生理食塩水溶液での２．０６±０．０６に比べて０．８７±０．０９、Ｐ＜０．００１）によれば、及び熱による痛覚過敏に関するＰＩ試験（対照の生理食塩水溶液での１．９７±０．０５に比べて１．２５±０．０４、Ｐ＜０．００１）、ＨＰ（対照の生理食塩水溶液での９．２４±０．１６に比べて６．０±０．１８、Ｐ＜０．００１）及びＴＦ（対照の生理食塩水溶液での３．１９±０．０８に比べて２．４０±０．０６、Ｐ＜０．００１）によれば、９時間（痛覚過敏のピーク）で測定された侵害受容性の閾値の有意な軽減を誘導した。ＴＡＰペプチド（１．５及び２５μｇ）を用いた治療は、ＥＴの注射によって誘導された痛覚過敏を用量依存性の様式で軽減した（図１）。ＴＡＰの２５μｇ用量では、種々の応答を引き出す潜伏時間は、ＰＰ試験、ＰＩ試験、ＨＰ試験及びＴＦ試験についてそれぞれ、２．０５±０．０７秒、１．９４±０．００５秒、９．１２±０．７秒及び３．２２秒±０．０９秒（ベースライン又は生理食塩水溶液を用いて得られた値に比べてすべての値についてｐ＞０．０５）であった。ＴＡＰのみ（５０μｌの生理食塩水溶液中に２５μｇ）の腹腔内注射は、異なった痛み試験における潜伏時間に有意な変化を生じなかった。
ＴＡＰペプチドの有効性のそのほかの薬物及び類縁体との比較
ＥＴ（１．２５μｇ）の足底内注射により誘導した痛覚過敏に対するＴＡＰの効果を、ステロイド剤、ＮＳＡＩＤ並びにＬｙｓ−Ｄ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ及びＬｙｓ−Ｄ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒペプチドを用いて得られた効果と比較すると、得られた結果は、ＴＡＰは、Ｌｙｓ−Ｄ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ及びＬｙｓ−Ｄ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒペプチドよりもはるかに有効な鎮痛剤であることを実証している（図２）。ＴＡＰは、インドメタシン及びデキサメタゾンに似た効果を有するが、はるかに低い濃度である（図２）。
サイトカインにおけるＴＡＰの効果
ラットの後足へのエンドトキシンの注射は、生理食塩水溶液を注射したラット又は何の物質も与えられなかった同一ラットの足と比較して、炎症誘発性サイトカイン及びＮＧＦの濃度の有意な上昇（ｐ＜０．００１）を誘導した。ＥＴ注射後１時間でのＴＮＦαの濃度は、対照生理食塩水溶液の注射後の１００．０±８．００ｐｇ／足に比べて、３４５．０±６１．０ｐｇ／足だった。ＥＴ注射後３時間でのＩＬ−１βの濃度は、対照生理食塩水溶液の注射後の４００．０±４５．０ｐｇ／足に比べて、２，８５０．６±２５５．４ｐｇ／足だった；ＩＬ−６の濃度は、対照生理食塩水溶液についての２５０．０±５０．０ｐｇ／足に比べて２，８３１．０±２８５．０ｐｇ／足であり、ＮＧＦの濃度は、対照生理食塩水溶液についての９．１１±１．６ｎｇ／足に比べて２３．０±１．７３であった。
ＴＡＰによる事前治療は、ＴＮＦα濃度の上昇を無効にし、ＩＬ−１βの濃度（２８５０．６±２５５．４から１６８６．０±２６６．０ｐｇ／足に、ｐ＜０．０１）、ＩＬ−６（２８３１±２８５から１１５８±１９７．０ｐｇ／足に、ｐ＜０．００１）及びＮＧＦ（２３．０±１．７３から１６．７３±２．７０ｐｇ／足に、ｐ＜０．００１）を有意に低下させた（図３Ａ、３Ｂ、３Ｃ及び３Ｄ）。図３に示すように、対照動物におけるＴＡＰ（２５ｇ）の注射は、サイトカイン又はＮＧＦの濃度に有意な変化を誘導しなかった。
ＥＴにより誘導される全身性の炎症性痛覚過敏におけるＴＡＰの効果
ＥＴ（５０μｇ、ｉ．ｐ．）の注射は、ＰＰ試験（対照についての２．０３±０．０４秒に比べた１．１３±０．０６、ｐ＜０．００１）によれば、及びＴＦ試験（対照についての３．０８±０．０４秒に比べた２．２７±０．０６、ｐ＜０．００１）によれば、１時間での侵害受容性の閾値の有意な低下を誘発した。痛覚過敏は、注射後６〜９時間、観察可能で残っていた（図４Ａ及び４Ｂ）。ＥＴの全身性投与の３０分前でのＴＡＰ（２５μｇ）の腹腔内注射による事前治療は、ＥＴにより生じる機械的痛覚過敏（図４Ａ）及び熱による痛覚過敏（図４Ｂ）を消失させた。
エンドトキシンは既知の発熱物質であり、その注射は１時間で体温における有意な上昇を誘導した（対照についての３７．６５±０．１６℃に比べた３８．４３±０．０２８℃）。その後、温度は６時間で有意に上昇したままだった（図４Ｃ）。腹腔内注射（２５μｇ）におけるＴＡＰによる事前治療は、ＥＴにより誘導される体温上昇過程を無効にし、値は対照のそれと有意な差異はなかった（図４Ｃ）。
実施例２：神経性病因の痛みに対する本発明に係るペプチド（ＴＡＰ）の鎮痛特性
１．材料及び方法
これらの試行には成熟した雄のスプラーグ・ドーリー系ラット（２５０〜３００ｇ）を用いた。実験期間にわたって、ラットは標準条件下（１ケージ当たり４〜５匹、１２時間の昼夜サイクル、２２．２℃）に置き、水及び餌は自由に与えた。必要な外科的処置は、クロルプロマジン（８ｍｇ／ｋｇ、腹腔内注射）及びアトロピン（０．０５ｍｇ／ｋｇ、同上）を用いた予備麻酔の後、ケタミン（ケタラール（登録商標）、４０〜５０ｍｇ／ｋｇ、同上）を用いた深麻酔下で行った。
この検討は、神経性病因の痛みの誘導のための２つの実験プロトコールに基づいていた。第１のプロトコールは単神経障害の２つの動物モデルを利用した。第２のプロトコールは、侵害受容性のシグナル伝達に関係しているとみなされている求心性線維群を活性化することが知られている物質である、カプサイシンの注射に基づいた。
ａ）プロトコールＩ：単神経障害の動物モデル
単神経障害の誘導：
ＣＣＩ（慢性緊縮傷害、慢性の神経緊縮、Bennet G.J. & Xie Y.K., 1988, ヒトで見られるものに似た痛み感覚の障害を生じるラットにおける末梢性の単神経障害、Pain, 33:87-107）に従って、又はＳＮＩ（予備の神経の傷害、衰弱させた足の予備の神経、Decosterd I. & Woolf C.J., 2000, 予備の神経の傷害：持続する末梢性の神経障害の痛みの動物モデル、Pain, 87:149-158）に従って、異なったラット群（各群ｎ＝６のラット）において単神経障害を誘導した。後部腰部を切開した後、膝窩を覆う皮膚及び脂肪層を切開することにより坐骨神経を暴露した。ＣＣＩモデルについては、坐骨三叉形成の近位側に４つのゆるい結紮（クロムメッキした金属の腸線縫合糸、４．０）を配置した。ＳＮＩモデルについては、外側膝窩の坐骨神経及び内側膝窩の坐骨神経を単離し、きつく結紮し、区分したが、足の側面を刺激する腓腹神経はそのままにした。
行動試験：
１つのケージの個別の区画にラットを入れたが、ケージの床は金属格子からなっており、足蹠軟部組織及びワイヤ付きの足の側面にアクセスすることができた。
機械的な異痛については、後足の足底表面（ＳＮＩモデルについては側面表面及びＣＣＩについては中央の足底表面）をフォン・フレイのワイヤ（ＶＦＦ４．３１及び５．０７、米国ストールティング社）に接触させたが、それらはそれぞれ、２．０４１ｇ及び１１．７４９ｇ（１８．５ｍＮ及び１０６．７ｍＮ）の力に相当した。これらのワイヤの屈曲力は、正常動物における侵害受容性の引込め反射を誘発するには不十分であることが分かっていた。１０回の試行により誘導された足引込めの数を、単神経障害の誘導に先立って（ベースライン）及び誘導後に各ラットについて各後足で明らかにした。正常なラットでは、小さい内径のワイヤ（ＶＦＦ４．３１）及びさらに大きい内径（ＶＦＦ５．０７）はそれぞれ、１０回の試行当たり、平均１．３±０．２及び２．７±０．３回の反応を誘導した。
神経障害の誘導後、２つの単繊維は１０回の試行当たり５回を超える反応を生じた。
寒冷異痛の評価には、チョウイ（Choi et al., 1994, 神経障害性の痛みのラットモデルにおける進行中の痛み及び寒冷異痛の行動的兆候、Pain, 59:369-376）らによって記載された方法を用いた。それは、数滴（およそ５０μｌ）のアセトン溶液を足に塗布し、引込め反応の持続時間を測定することから成る。０．５秒及び２０秒がそれぞれ、最小閾値及び最大閾値について任意に選択した値である。
足底表面に向けられた放射熱の侵害受容性の熱線に反応した足の引込め（ＲＰ）の持続時間（Ｄ）は正常ラットで明らかにされている。単神経障害を誘導した後ＤＲＰが増加するということは、痛覚過敏の徴候であるとみなされた。各ラットは最小限、５分毎にセッション当たり２つのＲＰ試験を受けた。
神経障害の徴候は、神経障害を誘導した後７〜１０日で最大であった。神経障害のピークに相当するこの期間にＴＡＰ注射の効果を試した。
ｂ）プロトコールＩＩ：侵害受容性の求心性神経の化学的刺激
このプロトコールは確立されたカプサイシンの特性に基づき、カプサイシンは、神経性の炎症を生じることが知られ、侵害受容性の情報を伝達することで知られている求心性神経線維の特異的な群（「カプサイシン感受性一次求心性神経」又はＣＳＰＡと呼ばれる）を選択的に刺激する（概説には、Szolcsanyi J., 1996, 神経性の炎症：軸索反射説の再評価、Geppetti P. & Holzer P. 編、神経性の炎症、３３４２ページ、［ボーカラトーン，ＣＲＣプレス］を参照のこと）。
我々のグループは、それぞれ可逆性の身体型及び臓器型の痛みを誘発するために、２つの方法：低い量のカプサイシンの足底内注射（ｉ．ｐｌ．）及び腹腔内注射（ｉ．ｐ．）を適用した。
カプサイシンの足底内注射
カプサイシン（１０％ツイーン２０のオリーブ油５０μｌに１０μｇ）の注射によって痛覚過敏を生じたが、そのピークは注射後３〜６時間であり、２４時間経つと消失した。後足の背部に０．２ｋｇ／ｃｍ２の一定の圧力をかけることから成る足圧迫試験（ＰＰ）を用いて機械的な痛覚過敏を評価した。圧力の適用と侵害受容性の足引込め（retraction）すなわち足屈曲反応との間で経過した時間を機械的な侵害受容の潜伏時間（又は閾値）とみなした。ホットプレート（ＨＰ）試験及び足浸漬（ＰＩ）試験を用いて熱による痛覚過敏を評価した。
実施例１のようにＨＰ試験及びＰＩ試験を行ったが、ホットプレートの温度は５２．５±０．３℃であり、熱湯容器は４８±０．３℃であった。
２つの連続した試験の間の５分の間隔を守って、２つの後足で交互にＰＰ試験及びＰＩ試験を行った。
ラットが環境に順応するように注射より１週間先立ってラットを実験室に送り、処置の前に各試験についてベースライン値を得るために、２日又は３日にわたってラットで試験を行った（詳細は、Kanaan S.A. et al., 1996, ラット及びマウスにおけるエンドトキシンで誘導された局所の炎症及び痛覚過敏：炎症性の痛みのための新しいモデル、Pain, 66:373-379）。
カプサイシンの腹腔内注射
この試験は、１０％ツイーン２０のオリーブ油溶液１００μｌに２０μｇのカプサイシンを若干のラットに注射すること（ｉ．ｐ．）及びこれらの注射により誘導される行動を観察することから成る。ギースラー（Giesler G.J. et al., 1976, 中脳水道周囲灰白質の電気刺激による臓器痛の阻害、Pain, 2:43-48）らによって記載された方法に従って、４レベルの行動段階を考案した。
以下のようにレベルを定義した：０＝正常な行動；１＝腹部筋肉の軽い収縮；２＝一方の側面の収縮及び臀部垂下の脱臼；３＝腹部筋肉の有意な収縮及び２本の後足の伸展。
動物の行動を評価するために、最適な観察用に４５°に傾けた鏡の上に置いた透明なケージに各ラットを入れた。
ポリグラフを用いて１人の観察者が正常行動及び侵害受容性行動を書き留め、ポリグラフの記録を評価するために、もう１人の観察者が３０分間にわたって各レベルに相当する時間を数えた。２人の観察者はいずれも投与された注射も予想される効果も知らなかった。
注射された薬物
使用したＴＡＰペプチドは実施例１で使用されたのと同一である。
カプサイシン（８−メチル−Ｎ，バニリル−ノナンアミド、シグマ＃Ｍ１０２２）は、１０％ツイーン２０のオリーブ油溶液に溶解し、適当な濃度にてｉ．ｐ．又はｉ．ｐｌ．で投与した。
データの解析
神経障害に罹っているラットにおいて行った実験の間、単神経障害の誘導に先立って確立したベースライン条件を参照して、動物の各群において、異痛及び痛感過敏を評価した。例えば、各ＶＦＦによって誘導した足の引込めの回数の平均を各群の全ラットについて計算し、注射後異なった時間にＴＡＰで治療した後、この平均値の変動を割り出した。規定における異痛及び熱に関する痛覚過敏について同じ方法を続けた。
カプサイシンのｉ．ｐ．注射を含む実験をしている間に、カプサイシンの注射に先立って（ベースライン条件）及び注射後の様々な時間間隔（３、６、９及び２４時間）でラットの各群について、各痛み試験（ＰＰ、ＨＰ又はＰＩ）を用いて行った測定値の平均値を算出した。カプサイシンの３０分前にＴＡＰを注射し（ｉ．ｐ．）、カプサイシンの注射後、同一の時間間隔で様々な痛み試験の潜伏時間を測定した。
カプサイシンのｉ．ｐ．注射については、カプサイシンのみ又はＴＡＰ後にカプサイシンを与えられた動物について、各行動レベルに相当する全時間を測定した。治療後の神経障害の徴候又は痛み試験の変動は、ＡＮＯＶＡ次いでその後ボンフェロニの検定によって評価した。治療の有無における痛みスコアの変動は、５％の有意性レベル（ｐ＜０．０５）を仮定してスチューデントの両側検定によって評価した。
２．結果
神経障害の徴候におけるＴＡＰ注射の効果
ＣＣＩ又はＳＮＩによって誘導される神経障害の対象とされた２群のラット（群当たり６匹のラット）におけるＴＡＰ（１００μｌ中５μｇ、ｉ．ｐ．）の注射は、神経障害の徴候すべてにおいて有意な減衰を生じた（図５及び６）。この効果は、注射後２時間にて機械的な異痛で最大だった。注射後７５分の寒冷異痛、ＣＣＩモデルにおける痛み刺激に対する過剰反応及びＳＮＩモデルにおける神経障害の徴候のすべてで最大であった。しかしながら、ＳＮＩモデルでは、ＴＡＰによって寒冷異痛はほどほどに軽減されたにすぎなかった。注射後３〜４時間にＴＡＰの効果の可逆性が認められた。
２つのモデルに続くことによってラットのほかの群において１μｇ及び２５μｇのＴＡＰの用量効果を評価した。図７は、５μｇ／ラットの用量を用いて神経障害の徴候の減衰が最大であったことを示す。
連続５日間にわたるＴＡＰ（１００μｌ中１μｇ）による毎日の治療によって、異痛の徴候の進行性の軽減並びに各注射の効果の増強作用を生じる。この増強作用の最も明らかな証拠は、ＴＡＰの単回注射によってわずかしか変化しなかった寒冷異痛の阻害が増加したことである（参考、図１１）。
神経障害の徴候におけるＴＡＰによる治療の効果を、そのほかの２つのラット群（ｎ＝６）におけるメロキシカン（５ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）又はモルヒネ（４ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）のいずれかを注射して観察されるものと比較した。ＴＡＰによる治療は、そのほかの２つの薬剤で観察されるよりも、触覚異痛及び熱による痛覚過敏の大きな軽減を誘導し、これははるかに低い用量である。図１０はこの比較を表す。ＳＮＩで誘導される神経障害の対象とされた異なるラット群（ｎ＝６）に注射によって各薬剤を投与する。測定はすべて、各薬剤の活性のピーク時（注射後４５〜６０分）に行った。治療に先立って神経障害の対象とされたラットにおいて行われた測定に相当する対照。
カプサイシンのｉ．ｐｌ．注射により誘導された痛覚過敏におけるＴＡＰによる治療の効果
カプサイシン（５０μｌ中１０μｇ）の足底内注射は、様々な痛み試験の時に観察される潜伏時間の有意な低減（痛覚過敏）を生じた。この低減は注射後３時間経ってから６時間までで最大であり２４時間で消失した（Saade N.E., Massaad C.A., Ochoa-Chaar C.I., Atweh S.F., Safieh-Garabedian B., Jabbur S.J., 2000, カプサイシンの足底内注射により誘導される痛覚過敏への神経ペプチド及びヒスタミンの寄与の可能性、J. Neurosci. Abst. suppl. 11, Vol. 12:123）。異なったラット群（各群でｎ＝５のラット）に、カプサイシン又はＴＡＰ（ｉ．ｐ．）次いで３０分後１．５又は２５μｇ／ラットにてカプサイシンのいずれかを注射した。ＴＡＰによる事前治療は、カプサイシンによって誘導された痛覚過敏の用量依存性の減衰を生じた（図８）。用量が高ければ高いほど、ＴＡＰの注射はカプサイシンにより誘導された痛覚過敏の完全な予防に関与した。２５μｇ用量のＴＡＰの注射は、様々な痛み試験の時に観察された潜伏時間の有意な加減を生じなかった（図８、対照）。
カプサイシンにより誘導される臓器痛におけるＴＡＰ注射の効果
カプサイシン（１００μｌ中２０μｇ）のｉ．ｐ．注射を受けたラット（ｎ＝６）は、３６分の合計観察時間にわたって、０．２±０．３分にわたるレベル０、２．５１±０．４５分にわたるレベル１、２１．５±０．８分にわたるレベル２及び１１．８４±０．４３分にわたるレベル３に相当する反応を有した（図９）。
もう１つのラット群（ｎ＝６）では、カプサイシン（２０μｇ、ｉ．ｐ．）の注射に先立ったＴＡＰ（ラット当たり２００μｌ中５０μｇ）の注射によって以下のスコアを生じた：レベル０に相当する０．８２±０．１８分、レベル１に相当する１２．８９±２．５分、レベル２に相当する１５．６２±０．９分及びレベル３に相当する６．６７±０．０９分。従って、ＴＡＰによる事前治療は、カプサイシンにより誘導された侵害受容性スコアの左へのシフトを生じた（図９）。
実施例３：注射用溶液製造のためのＴＡＰの利用
−ＴＡＰ：０．０５ｍｇ
−無菌の、発熱物質の入っていない蒸留水：１．０ｍｌ
ろ過による滅菌、アンプル、ビン又は複数回投与用ビンへの充填。
投与の可能性のある経路は、腹腔内、皮下、大脳内、筋肉内及び皮内への注射である。
エンドトキシンの注射により誘導された痛覚過敏の用量依存性の軽減を表す。 ステロイド剤、非ステロイド性抗炎症剤及び鎮痛性トリペプチドと比較した本発明に係るペプチドの抗痛覚過敏効果の比較検討を表す。 炎症誘発性サイトカイン及びＮＧＦの濃度の低下による、本発明に係るペプチドでの予備治療の抗炎症効果を表す。 敗血症性ショックのシミュレーションであるエンドトキシンの全身性注射により誘導された痛み（Ａ及びＢ）及び発熱（Ｃ）に対する予備治療の効果を表す。 本発明に係るペプチドで予備治療した、ＣＣＩ（坐骨神経の慢性圧迫）単神経障害を持つラットにおける異痛（害にならない刺激により誘導される異常な痛み）及び痛感過敏（中程度の強さの侵害受容性刺激に対する過剰反応）の阻害を表す。 本発明に係るペプチドで予備治療した、ＳＮＩ（力を奪った足の予備神経の痛み）単神経障害を持つラットにおける異痛及び痛感過敏の阻害を表す。 前述の２つの型の神経障害を有するラットにおける本発明に係るペプチドの用量検討を表す。 カプサイシンの注射により誘導した痛覚過敏（身体型の神経性の痛み）を有するラットにおける本発明に係るペプチドの用量検討を表す。 カプサイシンの腹腔内注射により誘導された臓器痛（臓器型の痙攣性の痛み）の本発明に係るペプチドによる減衰を表す。 神経障害に対する異なった薬剤の比較を表す。 ＴＡＰを用いた毎日の治療の効果を表す。

Claims (8)

  1. 痛みの治療を目指して薬物を製造するための、免疫系に関して不活性であり、痛み止め活性を有する、サイムリンのペプチド類縁体の利用。
  2. 前記ペプチドが以下の配列：
    Ｘ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｓｎを有し、
    式中、Ｘは、Ｓｅｒ、Ｌｙｓ−Ｓｅｒ、Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ、Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ、Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ、ＰｙｒｏＧｌｕ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ、並びに１つ又は２つの修飾アミノ酸を含む任意の派生配列を表し、前記可能性のある修飾が以下の種類：
    ＰｙｒｏＧｌｕ：Ｄ−ＰｙｒｏＧｌｕ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ
    Ｇｌｎ：Ｚ−Ｇｌｎ、Ｄ−Ｇｌｎ、Ｐｒｏ、Ｃｙｓ（Ｓ−ＣＯＮＨ２）、Ｍｅｔ（Ｏ）、
    Ｇｌｕ、Ｇｌｕ（γ−シアノ）、Ｇｌｕ（γＣＳ−ＮＨ２）、Ｄ−Ｇｌｕ、
    Ａｓｎ、ＮｏｒＶａｌ
    Ａｌａ：Ｄ−Ａｌａ、Ｚ−Ａｌａ、Ａｃ−Ａｌａ
    Ｌｙｓ：Ａｒｇ、Ｄ−Ｌｙｓ、Ｎ−γ−Ｚ−Ｌｙｓ、Ｌｙｓ（Ｎ６アセチル）、Ｏｒｎ、
    Ｈａｒ、２−アミノ−ヘキサノイル、２，６−ジアミノヘキシノイル、２，６−
    ジアミノヘキセノイル、Ｈｅｐ、Ｄ−Ｌｙｓ（Ｎ６アセチル）
    Ｓｅｒ：Ａｌａ、（Ｎ−メチル）Ｓｅｒ、Ｄ−Ｓｅｒ、Ｔｈｒ
    Ｇｌｙ：Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｄ−Ａｌａ、Ｄ−Ｌｅｕ
    Ａｓｎ：シアノＡｌａ、チオ−Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、β−Ａｌａ−ＮＨ２、
    Ｄ−Ａｓｎ、Ａｓｎ−ＮＨ２である、
    請求項１に記載のペプチドの利用。
  3. 前記ペプチドが以下：
    （１）ＰｙｒｏＧｌｕ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ
    （２）ＰｙｒｏＧｌｕ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ
    （３）ＰｙｒｏＧｌｕ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ
    （４）ＰｙｒｏＧｌｕ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−β−Ａｌａ−ＮＨ２
    （５）ＰｙｒｏＧｌｕ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｄ−Ａｓｎ
    （６）ＰｙｒｏＧｌｕ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−ＮＨ２
    （７）ＰｙｒｏＧｌｕ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ
    （８）ＰｙｒｏＧｌｕ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｎｖａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ
    （９）ＰｙｒｏＧｌｕ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｓｐ
    （１０）Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ
    （１１）Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ
    （１２）Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ
    （１３）Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−β−Ａｌａ−ＮＨ２
    （１４）Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｄ−Ａｓｎ
    （１５）Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−ＮＨ２
    （１６）Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ
    （１７）Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｎｖａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ
    （１８）Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｓｐ
    （１９）Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ
    （２０）Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ
    （２１）Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ
    （２２）Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−β−Ａｌａ−ＮＨ２
    （２３）Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｄ−Ａｓｎ
    （２４）Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−ＮＨ２
    （２５）Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ
    （２６）Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｎｖａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ
    （２７）Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｓｐ
    （２８）Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ
    （２９）Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ
    （３０）Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ
    （３１）Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−β−Ａｌａ−ＮＨ２
    （３２）Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｄ−Ａｓｎ
    （３３）Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−ＮＨ２
    （３４）Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ
    （３５）Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｎｖａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ
    （３６）Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｓｐ
    （３７）Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ
    （３８）Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ
    （３９）Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ
    （４０）Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−β−Ａｌａ−ＮＨ２
    （４１）Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｄ−Ａｓｎ
    （４２）Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−ＮＨ２
    （４３）Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ
    （４４）Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｎｖａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ
    （４５）Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｓｐ
    である請求項１及び２に記載のペプチドの利用。
  4. 前記ペプチドが以下：
    （１９）Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ
    （１）ＰｙｒｏＧｌｕ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ
    （１０）Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ
    （２８）Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ
    （３７）Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ
    である請求項１〜３に記載のペプチドの利用。
  5. 前記薬物が鎮痛特性及び／又は抗炎症特性を有することを特徴とする請求項１〜４に記載のペプチドの利用。
  6. 偏頭痛、坐骨神経痛、神経障害及び／又は急性又は慢性の炎症性の痛みの治療のための、請求項１〜５に記載のペプチドの利用。
  7. 投与される用量が１μｇ〜１０ｍｇ／ｋｇの間である請求項１〜６に記載のペプチドの利用。
  8. 非経口経路又は経鼻経路による投与ができるように前記薬物が処方される請求項１〜７に記載のペプチドの利用。
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