JP2005511087A - プロナーゼからのトリプシンの単離および精製の方法ならびにそれらの使用 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、一回のアフィニティークロマトグラフィー工程におけるプロナーゼからのStreptomyces griseusトリプシン(SGT)の単離および精製の方法ならびに精製したSGTの使用に関する。
トリプシンは、広範囲の哺乳動物の消化管中に存在するセリンプロテアーゼである。トリプシンの機能は、ペプチド結合の加水分解性切断であり、従って大きなタンパク質のサイズを減少させ、そしてそのタンパク質を他のプロテアーゼによってさらに分解されることを可能にする。トリプシンは、生物工学的適用、特に哺乳動物細胞の培養において使用される。哺乳動物細胞の培養においては、トリプシンは、大きい細胞凝集物を崩壊させるため、またはマイクロキャリアもしくは培養プレートのような表面から細胞を除去するためのツールとして役立つ。トリプシンはまた、非トリプシン感受性バイオポリマーのプロセシングにおいて、酵素を分解するタンパク質として使用される。その周知の特異性のため、トリプシンはまた、分析プロセスおよび調製用プロセスの両方において選択的なタンパク質切断ツールとして使用される。トリプシンは、多数の特異的または非特異的プロテアーゼインヒビターによって不活化または阻害され得、それらの多くは、セルピンファミリーに属する。生物工学的適用において最も幅広く使用されるトリプシンインヒビターは、ダイズ由来のトリプシンインヒビターである。これらのトリプシンインヒビターの大部分は非常に特異的であるので、それらは他の夾雑プロテアーゼに対して不活性である。
従って、プロナーゼから精製されたStreptomyces griseusトリプシン(SGT)の単離のための方法を提供することが、本発明の目的である。
本発明の目的は、Streptomyces griseusトリプシン(SGT)の大規模精製の単純な方法を提供することである。本発明の方法は、SGTの大規模精製に有用であり、そして生理学的に受容可能な溶離剤を利用するいくつかの実施形態において、様々な生物工学プロセスにすぐに使用できる安定したSGT調製物を提供する。
(プロナーゼからのStrepomyces griseusトリプシンの精製)
(A.イオン交換クロマトグラフィー)
30gのプロナーゼ(Boehringer Ingelheim)を緩衝液A(0.02ピリジン、pH 5.0)中に溶解し、終濃度40mg/mlのプロナーゼにする。25mlの溶液を、緩衝液Aで平衡化した、CM Sepharose Cl 6B(Pharmacia)での陽イオン交換クロマトグラフィーに供する。室温で、カラム容量の5倍量の緩衝液A(0.02Mピリジン)および緩衝液B(0.75Mピリジン、pH 5.0)を用いた直線勾配を使用し、溶出を行う。
緩衝液A(50mM Tris,0.5M NaCl pH7.0)で平衡化したBenzamidine Sepharose 6B速流(Pharmacia)カラムに40mlのプロナーゼ溶液(75mg/ml、緩衝液A)を負荷する。溶出を、緩衝液B(50mM Tris、0.5M NaCl pH7.0、10mM ベンズアミジン塩酸塩pH7.0)、緩衝液C(0.5M NaCl、0.6Mアルギニン、pH5.5)または緩衝液D(0.5M NaCl、1Mアルギニン、pH5.5)を用いて行う。
(哺乳動物細胞の細胞培養に使用されるブタトリプシンおよび精製SGTの酵素活性の測)
各酵素のタンパク質含有量およびエステラーゼ活性を、ブタトリプシン(純粋グレード、IX型、結晶化、Sigma)、プロナーゼ(純粋グレード、Boehringer Ingelheim)、および実施例1Bに従い、ベンズアミジンSepharose 6Bでのアフィニティークロマトグラフィーおよび0.6Mのアルギニンを用いた溶出によって得られた精製SGTの基質として、BAEE(N−ベンゾイル−L−アルギニンエチルエステル)を使用して測定する。この実験およびさらなる実験の結果を表4にまとめる。
(無血清かつ無タンパク質のVERO細胞の継代および継代培養のための総タンパク質負荷の測定)
継代数124で、呼称ATCC CCL 81でAmerican Type Cell Culture Collection,Rockville,Marylandより得た、VERO細胞(アフリカミドリザル、Cercopthecus aethiops、腎臓)を、無血清かつ無タンパク質の培地中で培養する。細胞を、Kistnerら(1998.Vaccine 16:960−968,WO 96/15231、または米国特許第6,100,061号)に記載されるように、無血清かつ無タンパク質の培地中で増殖するように適応させる。無血清培地中での増殖のために、無機塩類、アミノ酸、重炭酸ナトリウム(2g/l)および酵母抽出物またはダイズ抽出物(0.1〜10 g/l)を補充された基本的なDMEM HAM’s F12培地を使用する。作業細胞バンクを、動物由来の培地組成物を全く使用せずに調製する。
(細胞増殖に関する哺乳動物由来トリプシン、プロナーゼおよび精製SGTの比較)
小規模ベースで、静置培養(Tフラスコ)およびマイクロキャリア培養(Cytodex3(登録商標)、Pharmacia)において増殖させたVero細胞の細胞剥離特性および増殖特性を比較する。VERO細胞を、上記のように無血清かつ無タンパク質の培地中で培養する。
(精製SGTを用いたVero細胞におけるウイルス抗原生成)
(5.1 ローラーボトル中のインフルエンザウイルスおよびウイルス生成のインビボ活性化)
2種類のVero培養物を、ローラーボトル中で増殖させ、1単位あたり約2×108の最終細胞密度のコンフルーエンシーにする。培養物に0.01のm.o.i.にてインフルエンザウイルスNanchang A/H3N2株を感染させる。ブタトリプシン(総タンパク質量:500μg)または精製SGT(総タンパク質量:50μg)を、インフルエンザウイルスのインビボ活性化のために添加する。この添加は、ウイルス増殖をさらに可能にする。48時間後の培養物における赤血球凝集活性を測定する。
Ham’s F12栄養混合物と1:1の比で混合したDMEM培地中で培養したVERO細胞の作業細胞バンク(WCB)の一つのアンプルを、ダイズ抽出物または酵母抽出物のいずれかを補充した無血清培地中に再懸濁する。規定の継代数を有するVero細胞を液体窒素より解凍し、そしてrouxおよびローラーボトル中で継代し、1.5リットルのバイオリアクターに接種するために十分な細胞を生成する。細胞を37℃で6〜8日間増殖させる。培養条件である酸素飽和度の20%±10%およびpHの7.1±pH0.2ならびに攪拌速度の30〜60rpmを制御する。最終細胞密度である1.5(1.0〜2.0)×106細胞/mlに到達後、細胞を精製SGT(1mg/l)により剥離し、そして2.5g/lのマイクロキャリア濃度(Cytodex III(登録商標),Pharmacia)を有する10リットルのバイオリアクターに移す。細胞数を細胞のトリプシン処理により測定し、そしてCASY(登録商標)細胞カウンターでカウントする。細胞をコンフルエントな培養条件下で培養し、1.0〜1.5×106細胞/mlの細胞密度を有するバイオマスに達する。
(無血清かつ無タンパク質の培地で増殖させた細胞において増殖により得られたインフルエンザウイルス抗原の純度およびウイルスの活性化のためのSGTまたはトリプシンの使用)
Vero細胞の2つの並行細胞培養物を増殖し、実施例5.2に記載したようなバイオマスにする。これにより、ひとつをトリプシンを用いて継代および継代培養し、そしてひとつを精製SGTを用いて、rouxおよびローラーボトル中で継代および継代培養し、1.5リットルのバイオリアクターに接種するために十分な細胞を生成する。最終細胞密度である1.5(1.0〜2.0)×106細胞/mlに到達後、細胞を精製SGTまたはトリプシンにより剥離し、そして2.5g/lのマイクロキャリア濃度を有する10リットルのバイオリアクターに移す。1.0〜1.5×106/mlの細胞密度に到達することによってコンフルエントな培養条件に到達した後、バイオマスにインフルエンザウイルスTexas−36株を感染させる(m.o.i. 0.01)。ウイルスの活性化に関して、精製SGTまたはトリプシンを各細胞培養物に添加する。ウイルス増殖プロセスの終わりに、ウイルスを含む、澄んだ上澄み収集物をスクロース勾配による超遠心分離法で精製する。スクロース勾配精製抗原の純度は、タンパク質に対する抗原の比により測定される。赤血球凝集素の濃度を、Woodら(1977.J.Biol.Stand.5:237−247)により記載されるような、一元放射免疫拡散法(SRD)で測定し、そしてその結果をA/Texas−36株に対して、72時間後に比較する。その結果を表9にまとめる。
(A型肝炎ウイルスの生成)
(7.1 無血清かつ無タンパク質の培地で増殖させた細胞上のHAV抗原の生成)
細菌プラスミドpHAV/7にクローン化された弱毒化株HM175/7のゲノムの完全長cDNA(Cohenら,1987,J.Virol.61:3035−3039)を使用し、インビトロ転写により完全長ゲノムRNAを調製する。無血清かつ無タンパク質の、34℃のVERO細胞に、インビトロで転写したHAV RNAをトランスフェクトして、外来因子を含まないHAV HM175/7のウイルスストックを生成する。VERO細胞バイオマスを実施例5.2に従って調製する。
実施例7.1の細胞培養上清のHAV収集物を、Prostak Ultrafilter 200 Kでの限外濾過により100倍濃縮し、続いて緩衝液を50mM Tris緩衝液pH 8.0、0.01% Tweenに交換して、ダイアフィルトレーション工程(Prostak 200 K,Diafilter)を行う。調製物中に存在し得る、残留した宿主細胞の核酸を、1000U/lの濃度(1mM MgCl2中に溶解)のBenzonase(登録商標)(Serratia marcescens由来のエンドヌクレアーゼ、Benzonase(登録商標)として市販(Benzon PharmaA/S))とともに、3時間室温でダイアフィルトレーション残留物(Diaretenate)をインキュベーションすることにより除去する。続いて、0.5〜5U/mlの濃度での精製Streptomyces griseusトリプシン(SGT)を添加し、残留物(retentate)を室温で24時間さらにインキュベートする。宿主細胞夾雑物(すなわち、核酸および/またはタンパク質)を、緩衝液として20mM PBS pH7.4を用いる100Kメンブランでのダイアフィルトレーションにより除去する。
(固定化された精製SGTによる、トロンビンへのプロトロンビンの活性化、およびアフィニティークロマトグラフィーによるトロンビンの回収)
精製SGT(1gの湿ったゲルあたり100mgタンパク質)をアガロースゲル(ゲル1mlあたり5000 BAEE U SGT)と結合させる。ガラスカラムに0.1mlの固定化SGT−アガロースを充填し、そして組換えプロトロンビンを米国特許第6,010,844号に記載される、同一の条件下で固定化SGTに供する。米国特許第6,010,844号に記載される方法に従い、トロンビンを単離および調製する。この方法は、本明細書中に参考として援用される。
Claims (25)
- Streptomyces griseusプロナーゼよりStreptomyces griseusトリプシン(SGT)を単離する方法であって、該方法は、前記プロナーゼを、アミジン、グアナジン(guanadine)、またはアミン含有種からなる群より選択される固定化されたアフィニティー部分と接触させる工程、および該固定化されたアフィニティー部分から、アミジン、グアナジン、またはアミン含有種からなる群より選択される溶離剤を含む溶離液を用いて該SGTを選択的に溶出する工程、を包含する、方法。
- 前記溶離剤が、グアナジンである、請求項1に記載の方法。
- 前記溶離剤が、アルギニンである、請求項1に記載の方法。
- 前記アルギニンが、0.5〜1.2Mの間の濃度にある、請求項3に記載の方法。
- 前記溶離液が、約pH4.0と約pH9.0との間の範囲のpHを有する、請求項1〜4のいずれかに記載の方法。
- 前記アフィニティー部分が、ベンズアミジンである、請求項1〜5のいずれかに記載の方法。
- 前記溶離液が、約0.1Mと約1Mとの間の濃度の無機塩を含む、請求項1〜6のいずれかに記載の方法。
- 前記SGTが、0.5M〜1.2Mのアルギニンを含有する溶液中に得られ、そして該SGTが、少なくとも95%の純度を有する、請求項1に記載の方法。
- 精製された前記SGTから溶離剤を除去する工程をさらに含む、請求項1〜8のいずれかに記載の方法。
- 調製物が、タンパク質1mgあたり少なくとも約25×103Uの比活性を有する、SGT精製調製物。
- 少なくとも約0.5Mの濃度のアルギニンを含み、そして、少なくとも95%の純度を有する、請求項10に記載のSGT精製調製物。
- 前記プロナーゼを、アミジン、グアナジン、またはアミン含有種からなる群より選択される固定化されたアフィニティー部分と接触させる工程、およびを該固定化されたアフィニティー部分から、アミジン、グアナジン、またはアミン含有種からなる群より選択される溶離剤を含む溶離液を用いて該SGTを選択的に溶出させる工程、を包含する方法を用いて得られた、請求項10に記載の調製物。
- 生物プロセスにおける、請求項10に記載の調製物の使用。
- 細胞のバイオマスを生成するための方法であって、該方法は、細胞の培養物を提供する工程、請求項10に記載の調製物を使用して該細胞を継代および継代培養する工程、および該細胞増殖させてバイオマスにする工程、を包含する、方法。
- 前記細胞が、無血清培地中で増殖される、請求項14に記載の方法。
- ウイルスまたはウイルス抗原を生成するのための方法であって、該方法は、細胞の細胞培養物を提供する工程であって、該細胞が、請求項10に記載の調製物を使用して継代および継代培養される、工程、該細胞を増殖させてバイオマスにする工程、該バイオマスの細胞にウイルスを感染させる工程、および該細胞をインキュベートして該ウイルスを増殖する工程、を包含する、方法。
- ウイルスまたはウイルス抗原を生成するための方法であって、該方法は、細胞の細胞培養物を提供する工程であって、該細胞は、請求項10に記載の調製物を使用して継代および継代培養される、工程、該細胞に、パラミクソウイルス科、オルトミクソウイルス科、ロタウイルス科の群より選択されるウイルスを感染させる工程、タンパク質1mgあたり少なくとも約25×103Uの比活性を有するSGT精製調製物を添加して該ウイルスを活性化する工程、および生成した前記ウイルスを収集する工程、を包含する、方法。
- 前記生成されたウイルスを精製する工程をさらに包含する、請求項17に記載の方法。
- 請求項17に記載の方法によって得られた、ウイルスまたはウイルス抗原調製物。
- 組換え細胞から組換え産物を生成するための方法であって、該方法は、組換え細胞の細胞培養物バイオマスを提供する工程であって、該細胞が、請求項10に記載の調製物を使用して継代および継代培養された工程、組換え産物が生成される条件下で前記細胞を培養する工程、および生成された組換え産物を収集する工程、を包含する、方法。
- 請求項20に記載の方法によって得られた、組換え産物。
- 血清もタンパク質も含まない培地中で増殖させたバイオマスであって、該バイオマスは、請求項10に記載の精製SGTを用いて継代および継代培養され、そして哺乳動物由来のトリプシンの使用により同一の条件下で培養した細胞培養物と比較して、総プロテアーゼタンパク質負荷が、少なくとも75%低減される、バイオマス。
- ウイルスまたはウイルス抗原の精製プロセスにおける、請求項10に記載の調製物の使用。
- ワクチン生成のためにウイルスを生成するための、請求項10に記載の調製物の使用。
- プロタンパク質からのタンパク質の活性化のための、請求項10に記載の調製物の使用。
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