JP2005510448A - HedyotisDiffusaeから単離された活性な画分を含む組成物および使用方法 - Google Patents
HedyotisDiffusaeから単離された活性な画分を含む組成物および使用方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2005510448A JP2005510448A JP2002560655A JP2002560655A JP2005510448A JP 2005510448 A JP2005510448 A JP 2005510448A JP 2002560655 A JP2002560655 A JP 2002560655A JP 2002560655 A JP2002560655 A JP 2002560655A JP 2005510448 A JP2005510448 A JP 2005510448A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- extract
- agent
- effective amount
- sample
- fraction
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
- C07K14/70539—MHC-molecules, e.g. HLA-molecules
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
- A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
- A61P17/06—Antipsoriatics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
- A61P27/02—Ophthalmic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
- A61P27/02—Ophthalmic agents
- A61P27/06—Antiglaucoma agents or miotics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
- A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/14—Vasoprotectives; Antihaemorrhoidals; Drugs for varicose therapy; Capillary stabilisers
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Ophthalmology & Optometry (AREA)
- Vascular Medicine (AREA)
- Hematology (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Physical Education & Sports Medicine (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Emergency Medicine (AREA)
- Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
- Obesity (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Transplantation (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
Abstract
本発明は、Hedyotis Diffusaeから、薬学的に活性な画分を抽出するためのプロセスを提供する。本発明は、増殖阻害量の画分を細胞に送達することによる、内皮細胞の増殖を阻害するための方法を提供する。本発明はまた、抗血管新生量の画分を組織に送達することによる、組織における血管新生を阻害するための方法を提供する。癌を含む種々の疾患を処置する方法もまた、本明細書中で提供される。Hedyotis Diffusaeの組成物から、生物学的に活性な画分AHD04を調製するためのプロセスであって、このプロセスは、約210nmと約250nmとの間の光学吸光度を有する画分を抽出する工程を包含する。
Description
(関連出願に対する相互参照)
本出願は、米国仮出願60/255,502(2000年12月13日出願)(その内容は、本明細書によって本開示の中に参考として援用される)の35U.S.C.第119(e)の下での利益を主張する。
本出願は、米国仮出願60/255,502(2000年12月13日出願)(その内容は、本明細書によって本開示の中に参考として援用される)の35U.S.C.第119(e)の下での利益を主張する。
(発明の分野)
本発明は、薬学分野の発明である。詳細には、本発明は、疾患を予防および処置するための抗脈管形成医薬の分野に関する。
本発明は、薬学分野の発明である。詳細には、本発明は、疾患を予防および処置するための抗脈管形成医薬の分野に関する。
(背景)
新脈管形成は、新規脈管構造が既に存在する毛細血管からの成長によって生じるプロセスである。このプロセスにおいて、内皮細胞は、基底膜の支持がタンパク質分解酵素によって分解されるときに、この基底膜からはがされる。次いでこれらの細胞は、親血管から出て移動し、***し、そして新しく分化した脈管構造を形成する(Risau,(1997)Nature 386:671−674;Wiltingら(1995)Cell.Mol.Biol.Res.41(4):219−232)。種々の異なる生物学的因子が、血管形成の制御において機能することが見出されている(Bussolinoら(1997)Trends in Biochem Sci 22(7):251−256;FolkmanおよびD’Amore(1996)Cell 87:1153−1155)。これらとしては、種々の機能を有するタンパク質、例えば、増殖因子、細胞表面レセプター、プロテアーゼ、プロテアーゼインヒビター、および細胞外マトリックスタンパク質が挙げられる(AchenおよびStacker(1998)Int.J.Exp.Pathol.79:255−265;DevalarajaおよびRichmond(1999)Trends in Pharmacol.Sci.20(4):151−156;Hanahan(1997)Science 277:48−50;Maisonpierreら(1997)Science 277:55−60;Suriら(1996)Cell 87:1171−1180;Satoら(1995)Nature 376:70−74;MignattiおよびRifkin(1996)Enzyme Protein 49:117−137;Pintucciら(1996)Semin Thromb Hemost 22(6)517−524;VernonおよびSage(1995)Am.J.Pathol.147(4):873−883;Brooksら(1994)Science 264:569−571;Kochら(1995)Nature 376:517−519)。脈管形成プロセスの複雑性およびその発達を制御する因子の多様性によって、インビボにおいて血管形成を制御するための治療介入に対する、有用な多くの点が提供される。
新脈管形成は、新規脈管構造が既に存在する毛細血管からの成長によって生じるプロセスである。このプロセスにおいて、内皮細胞は、基底膜の支持がタンパク質分解酵素によって分解されるときに、この基底膜からはがされる。次いでこれらの細胞は、親血管から出て移動し、***し、そして新しく分化した脈管構造を形成する(Risau,(1997)Nature 386:671−674;Wiltingら(1995)Cell.Mol.Biol.Res.41(4):219−232)。種々の異なる生物学的因子が、血管形成の制御において機能することが見出されている(Bussolinoら(1997)Trends in Biochem Sci 22(7):251−256;FolkmanおよびD’Amore(1996)Cell 87:1153−1155)。これらとしては、種々の機能を有するタンパク質、例えば、増殖因子、細胞表面レセプター、プロテアーゼ、プロテアーゼインヒビター、および細胞外マトリックスタンパク質が挙げられる(AchenおよびStacker(1998)Int.J.Exp.Pathol.79:255−265;DevalarajaおよびRichmond(1999)Trends in Pharmacol.Sci.20(4):151−156;Hanahan(1997)Science 277:48−50;Maisonpierreら(1997)Science 277:55−60;Suriら(1996)Cell 87:1171−1180;Satoら(1995)Nature 376:70−74;MignattiおよびRifkin(1996)Enzyme Protein 49:117−137;Pintucciら(1996)Semin Thromb Hemost 22(6)517−524;VernonおよびSage(1995)Am.J.Pathol.147(4):873−883;Brooksら(1994)Science 264:569−571;Kochら(1995)Nature 376:517−519)。脈管形成プロセスの複雑性およびその発達を制御する因子の多様性によって、インビボにおいて血管形成を制御するための治療介入に対する、有用な多くの点が提供される。
新脈管形成は、通常、胚発生の間、増殖の間、および特別な場合(例えば、創傷治癒および女性の生殖周期)に、慎重に制御された様式で生じる(WiltingおよびChrist(1996)Naturwissenschaften 83:153−164;GoodgerおよびRogers(1995)Microcirculation 2:329−343;Augustinら(1995)Am.J.Pathol.147(2):339−351)。新脈管形成プロセスにおけるいくつかの重要な工程は、以下である:1)増殖因子(すなわち、血管内皮増殖因子、VEGF)シグナル伝達;2)マトリックスメタロプロテイナーゼ(MMP)およびVEGFレセプター相互作用;3)増殖因子シグナル伝達の部位への内皮細胞移動;ならびに4)内皮細胞細管形成。病的な新脈管形成は、腫瘍増殖および転移癌、糖尿病性網膜症、慢性関節リウマチ、および他の炎症性疾患(例えば、乾癬)を含む、多数のヒト疾患において中心的な役割を果たす(Folkman(1995)Nature Med.1(1):27−31;Polverini(1995)Rheumatology 38(2):103−112;Healyら(1998)Hum.Reprod.Update 4(5):736−396)。これらの場合、疾患の進行は、持続性の無秩序な新脈管形成によって駆動される。例えば、慢性関節リウマチにおいて、新規毛細血管は、間接を侵略し、そして軟骨を破壊する。糖尿病性網膜症において、網膜中の毛細血管は、硝子液を侵略し、出血させ、そして失明を引き起こす。重要なことに、腫瘍増殖および転移(metastisis)は、新脈管形成依存性である。最も原発性の固形腫瘍は、長い無血管状態を経る(この間に、増殖は、約1〜2mmの直径に制限される)。この大きさまで、腫瘍細胞は、受動拡散によって必要な酸素および栄養分の供給を得ることができる。これらの微視的な腫瘍塊は、最終的に新脈管形成へと切り替わり、腫瘍塊を血管新生する毛細血管の出芽(sprouting capillary)を開始するために周囲の血管を補充し、離れた位置への腫瘍の拡大および悪性細胞の転移の持続可能性を提供する。病的な新脈管形成の間に生じる生物学的事象の理解は大いに前進したが、脈管形成をインビボで制御するために有用である有効な薬学的化合物は、現在存在しない。従って、新脈管形成を制御し得る有効な治療は、多数のヒト疾患を軽減する可能性を有する。
従来より、薬学的化合物は、所望の薬学的特性について合成化学化合物をスクリーニングし、次いでそれらをインビボで毒性および効果について試験することによって、開発されてきた。この方法で選択された化合物は、しばしば、インビボで毒性の副作用を有し、そしてこのアプローチは、疾患治療のための有効な新脈管形成インヒビターの開発において成功していない。より最近では、分子生物学の技術が、新脈管形成インヒビターを開発するために適用されている。実験モデルにおいて脈管形成を制御する新脈管形成のタンパク質インヒビターが発見されている:例えば、アンジオスタチン(O’Reillyら(1994)Cell 79(2):315−328)およびエンドスタチン(O’Reillyら(1997)Cell 88(2):277−285)。それにもかかわらず、このようなタンパク質治療を実施するには費用がかかり、そしてこのようなタンパク質治療は、処方することおよび被験体に送達することが難しいことが見出されている。現在、タンパク質新脈管形成インヒビターはなお、疾患患者のための治療医薬に開発される必要がある。従って、患者に安全に投与され得、そして脈管内皮細胞の病的増殖を阻害するのに有効であり得る治療化合物に対する必要性が存在する。本発明は、この目的のために有用である組成物および方法を提供し、そして関連する利点も同様に提供する。
(発明の開示)
本発明は、Hedyotis Diffusaeから薬学的に活性な画分(「抽出物」、「化合物」、または「薬物」とも称される)を抽出するためのプロセスを提供する。1つの局面において、このプロセスは、Hedyotis Diffusaeの熱い(約30分間、約80〜90℃)ティー(tea)からAHD04と称される画分(これは、約210nmと約250nmとの間の光学吸光度を有し、カラムクロマトグラフィーによって単離される)を抽出する工程を包含する。この画分を得るための1つの手段は、有効量の熱い湯に有効量のHedyotis Diffusaeを浸漬させて液体抽出物を得ること、次いでその抽出物を濾過して清澄な液体抽出物を得ることによる。この粗抽出物(EHDaと称される)は、食物または健康補助食品としての使用のために加工され得る。EHDaを凍結乾燥し、再懸濁し、そして薬学的に活性な画分ADH04は、クロマトグラフィーによって分離される。
本発明は、Hedyotis Diffusaeから薬学的に活性な画分(「抽出物」、「化合物」、または「薬物」とも称される)を抽出するためのプロセスを提供する。1つの局面において、このプロセスは、Hedyotis Diffusaeの熱い(約30分間、約80〜90℃)ティー(tea)からAHD04と称される画分(これは、約210nmと約250nmとの間の光学吸光度を有し、カラムクロマトグラフィーによって単離される)を抽出する工程を包含する。この画分を得るための1つの手段は、有効量の熱い湯に有効量のHedyotis Diffusaeを浸漬させて液体抽出物を得ること、次いでその抽出物を濾過して清澄な液体抽出物を得ることによる。この粗抽出物(EHDaと称される)は、食物または健康補助食品としての使用のために加工され得る。EHDaを凍結乾燥し、再懸濁し、そして薬学的に活性な画分ADH04は、クロマトグラフィーによって分離される。
本発明は、細胞に増殖阻害量の分画を送達することによって、内皮細胞の増殖を阻害するための方法を提供する。本発明はまた、組織に抗血管新生量の画分を送達することによって、その組織中の血管新生を阻害する方法を提供する。癌を含む種々の疾患を処置する方法もまた、本明細書中に提供される。
(発明を実行するための様式)
本開示を通して、種々の刊行物、特許および公開された特許明細書が、同定した引用によって参照される。これらの刊行物、特許および公開された特許明細書の開示は、本発明が属する技術分野の状態をより完全に記載するために、本明細書によって参考として本開示に援用される。
本開示を通して、種々の刊行物、特許および公開された特許明細書が、同定した引用によって参照される。これらの刊行物、特許および公開された特許明細書の開示は、本発明が属する技術分野の状態をより完全に記載するために、本明細書によって参考として本開示に援用される。
本発明の実施は、他に示されない限り、分子生物学(組換え技術を含む)、微生物学、有機化学、細胞生物学、生化学および免疫学の従来の技術(これらは、それらの当業者の範囲内である)を利用する。このような技術は、文献に完全に説明される。
(定義)
本明細書中に使用される場合、特定の用語は、以下に規定される意味を有し得る。
本明細書中に使用される場合、特定の用語は、以下に規定される意味を有し得る。
本明細書および特許請求の範囲に使用される場合、単数形の「a」、「an」、および「the」は、その文脈が他に明確に記載しない限り、複数形の参照を含む。例えば、用語「細胞(a cell)」は、複数の細胞(これらの混合を含む)を含む。
本明細書中に使用される場合、用語「含む(comprising)」は、組成物および方法が言及された要素を含む(include)が、他のものを除外しないことを意味することが、意図される。「本質的に〜からなる」は、組成物および方法を規定するために使用される場合、その組み合わせに対して本質的に有意な他の要素を除外することを意味するべきである。従って、本明細書中に規定される要素から本質的になる組成物は、単離方法および精製方法に由来する微量の夾雑物および薬学的に受容可能なキャリア(例えば、リン酸緩衝化生理食塩水、防腐剤など)を除外しない。「〜からなる」は、他の成分および本発明の組成物を投与するための実質的な方法の工程の微細な構成要素さえも排除することを意味するべきである。これらの変換用語の各々によって規定される実施形態は、本発明の範囲内である。
全ての数値指定(例えば、pH、温度、時間、濃度、および分子量)(範囲を含む)は近似であり、0.1の漸増で(+)または(−)に変化する。必ずしも明確に示されるわけではないが、全ての数値指定は、用語「約」が先行することが、理解されるべきである。必ずしも明確に示されるわけではないが、本明細書中に記載される試薬が、単に例示であり、それらの等価物が当該分野で周知であることもまた、理解されるべきである。
用語「単離された」は、その化合物が通常、自然状態で関連している構成要素(細胞性またはその他の構成要素)から分離された状態を意味する。
「被験体」または「宿主」は、脊椎動物、好ましくは動物または哺乳動物、より好ましくはヒト患者である。哺乳動物としては、マウス、サル、ヒト患者、家畜動物、競技用動物、および愛玩動物を含むがこれらに限定されない。
用語「癌」、「新生物」、および「腫瘍」は交換可能に使用され、単数または複数のいずれかの形態で、悪性の形質転換を受け、宿主生物に対して病原性となった細胞をいう。原発性の癌細胞(すなわち、悪性形質転換部位付近から獲得された細胞)は、十分に確立された技術(特に、組織学的試験)により、非癌性細胞と容易に識別され得る。本明細書中で使用される場合、癌細胞の定義は、原発性の癌細胞だけでなく、癌細胞祖先から誘導された任意の細胞も含む。これらとして、転移した癌細胞、ならびに癌細胞から誘導されたインビボ培養物および細胞株が挙げられる。通常、固形腫瘍として表される型の癌をいう場合、「臨床的に検出可能」な腫瘍は、腫瘍塊に基づき(例えば、CATスキャン、磁気共鳴画像法(MRI)、X線、超音波、または触診法のような手順により)検出可能な腫瘍である。この定義を満たすために、生化学的知見または免疫学的知見は単独では不十分であり得る。
本明細書中で使用される場合、「阻害」は、組織中の内皮細胞の成長、増殖、または細胞***、あるいは血管形成を停止、遅延、または緩慢にすることを意味する。阻害をモニターするための方法として、内皮細胞増殖アッセイ、血液含量の決定および血管構造の密度の定量的な決定による血管床(vascular bed)の容量の測定が挙げられるがこれらに限定されない。培養物が細胞の混合物である場合、新生血管形成は、内皮細胞特異的マーカー(例えば、脈管形成因子、タンパク質分解酵素、および内皮細胞特異的細胞接着分子)を発現する細胞の定量的な測定によりモニタリングされる。
「組成物」は、活性因子と別の化合物または組成物(不活性(例えば、検出可能因子または標識)でも活性でもよい)(例えば、アジュバント)との組み合わせを意味することを意図とする。
「薬学的組成物」は、その組成物をインビトロ、インビボ、またはエキソビボでの診断用途または治療用途に適するようにするキャリア(不活性でも活性でもよい)と、活性因子との組み合わせを含むことを意図する。
本明細書中で使用される場合、用語「薬学的に受容可能なキャリア」は、任意の標準的な薬学的キャリア(例えば、リン酸緩衝生理食塩水溶液、水、およびエマルジョン(油/水エマルジョンまたは水/油エマルジョン)、ならびに種々の型の湿潤剤を含む。この組成物はまた、安定化剤および防腐剤を含み得る。キャリア、安定化剤、およびアジュバントの例として、Martin、REMINGTON’S PHARM.SCI.第15版(Mack Publ.Co.、Easton(1975))を参照のこと。
「有効量」は、有益な結果または所望の結果をもたらすのに十分な量である。例えば、治療量は、所望の治療効果を達成する量である。この量は、予防有効量(疾患または疾患の徴候が発症するのを予防するのに必要とされる量)と同一であるかまたは異なり得る。有効量は、1以上の投与、適用、または投薬量で投与され得る。
本発明者らは、Hedyotis Diffusaeから薬学的に活性な画分を抽出するプロセスを同定した。1つの局面において、このプロセスは、Hedyotis Diffusaeの高温(約80〜90℃で約30分間)抽出物(hot tea)から、約210nmと約250nmとの間の吸光度を有する画分を抽出する工程を必要とする。さらなる局面において、活性画分は、約220nm〜約240nmの吸光度を有する。なおさらなる局面において、薬学的に活性な画分は、約230nmのクロマトグラフィー後の吸光度を有する。有効量のHedyotis Diffusaeは、有効量の熱水中で煎じられて液体抽出物を提供し、次いでこの抽出物は、清浄な液体抽出物を得るために濾過される。この抽出物は凍結乾燥され、次いで、適切なキャリア中に再懸濁され、そして薬学的に活性な画分が、クロマトグラフィーにより分離される。
本発明者らはまた、この画分が、内皮細胞の増殖を阻害し、抗新脈管形成特性を有することを発見した。これらの知見に従って、本発明は、増殖阻害量の画分を内皮細胞に送達することにより、その細胞の増殖を阻害する方法を提供する。本発明はまた、抗血管形成量のこの画分を組織に送達することにより、組織中の血管形成を阻害する方法を提供する。
本方法は、インビトロまたはインビボで実施され得る。インビトロで実施される場合、内皮細胞または血管形成した組織は、例えば、以下に例示するような当業者に周知の条件下で培養される。細胞および/または組織は、構築された細胞株由来であり得るか、または被験体から獲得した生検サンプルから培養され得る。次いで、この画分は、培養培地に直接添加されるか、または薬学的組成物の成分として送達される。
全ての治療が、各個人に対して有効ではないので、各患者に対する高価を評価するインビトロアッセイは有効である。本発明は、本発明の方法が患者を処置するか否かを決定する手段を提供する。例えば、組織生検は、患者から単離され、そして有効量の薬学的組成物または本明細書中で定義されるような治療と、細胞の成長および増殖に有効な条件下で接触される。従来手順(例えば、本明細書中に記載されるCPAEアッセイ)により決定される病理学的な細胞の増殖の阻害は、本発明の組成物および/または治療が患者の処置に有効であり得ることを示す。
新脈管形成または新規の脈管構造の形成は、新規の血管を形成する基本的なプロセスである。これは、必須の生理学的現象(例えば、生殖系の発達および創傷治癒)に関与している。通常の条件下では、新脈管形成は、高度に調節されている。しかし、多くの疾患は、持続的な調節されていない新脈管形成により引き起こされる。慢性関節リウマチにおいて、新規の毛細血管は、関節に侵入し、軟骨組織を破壊する。糖尿病性網膜症において、網膜における新規の毛細血管は、硝子体に侵入し、出血し、そして失明の原因となる。腫瘍の増殖および転移は新脈管形成依存性である。最も原発性の固形腫瘍は、長期の無血管状態、見かけ上の休眠、および増殖(到達可能な最大の大きさは直径約1〜2mmである)を経る。この大きさまで、腫瘍細胞は、単純な受動性拡散により必要な酸素および栄養素を獲得し得る。これらの微視的な腫瘍塊は、腫瘍塊に向かって成長し、最終的に腫瘍塊に浸透する新規の毛細血管の発生(sprouting)を開始するために、周囲の成熟宿主血管を補充することによって最終的に新脈管形成を開始し得る。これによって、腫瘍塊の容赦のない拡張および血行性転移的拡散の可能性が生じる。新脈管形成の開始は、異所性生成物および「腫瘍新脈管形成因子」(TAF)と呼ばれる成長因子の腫瘍細胞による同化により誘導されると、当初仮定されていた。
本発明はまた、被験体に治療有効量の抽出物またはこの抽出物を含む薬学的組成物を投与することにより、被験体における病理的な新生血管形成に関連する障害を処置する方法を提供する。この理由で使用する場合、「処置する」こととは、病理的な新生血管形成および新生血管形成の減少に関連する症候を緩和することを意味する。このような状態として、関節炎状態、新生血管形成に基づく皮膚状態、糖尿病性網膜症、カポージ肉腫、加齢性黄斑変性、再狭窄、毛細管拡張症(telangectasia)、緑内障、ケロイド、角膜移植拒絶、創傷肉芽化(granularization)、血管線維腫、オスラー−ウェバー症候群、心筋の新脈管形成、および強皮症が挙げられるがこれらに限定されない。関節炎状態の例は、慢性関節リウマチ、乾癬性関節炎、および変形性関節症からなる群より選択される。癌および固形腫瘍の処置のために、「処置」することとは、血管の成長を阻害することを含む。血管の成長の阻害により、腫瘍の栄養素および/または成長のために腫瘍により必要とされる癌細胞が欠乏する。腫瘍および成長は、大きさの面で減少し、消失する可能性がある。関節炎状態を処置するための投与は、軟骨組織(特に、関節)における血管形成の減少を引き起こす。これにより、これらの領域における運動性および可撓性が増加する。乾癬の処置については、投与は、皮膚学的な症状(例えば、瘡蓋形成(scabbing)、剥離(flaking)、および皮膚表面下の目に見える血管)を減少させる。糖尿病性網膜症において、活性画分の投与は、網膜における外来血管の形成を減少させる。これにより、視界が妨害されない。カポージ肉腫の処置において、活性化画分の投与は、成長および/またはさらなる血管形成を阻害し、それによって、病巣および/または腫瘍が生じるのを阻害する。
活性画分を被験体(例えば、マウス、ラット、またはヒト患者)に投与する場合、この薬剤は、薬学的に重要可能なキャリアに添加され得、そして被験体に全身投与、経口投与、経皮投与、または局所投与される。治療量は、経験的に決定され得、処置される病理、処置される被験体、および治療方法において使用される画分の形態の毒性と共に変化する。活性画分は、経口送達、静脈内送達、腹膜内送達、または経皮送達され得る。動物に投与される場合、この方法は、活性画分の効果をさらに確認するのに有用である。
動物モデルの例として、ヌードマウス(Balb/c NCR nu/nu雌、Simonsen、Gilroy、CA)は、各々、本明細書中に記載されるような約105〜約109の病理細胞を皮下接種される。移植が完成した場合、この画分、抽出物、または化合物が、例えば、移植物付近に皮下注入することにより投与される。移植物の大きさの減少を決定するための測定は、1週間に2回、ベニアはさみ(venier caliper)を用いて二次元的に実施される。
Jackson Labs(Maine)由来のMRL/lprマウス(MRL/MpJ−Faslpr)は、関節炎状態における効果を試験またはモニターするのに有用である。ポジティブな治療上の利益として、動物の関節および後足の減少した膨張ならびに減少した軟骨組織の分解が挙げられ、これらはX線によってモニターされ得る。
インビボ投与は、処置過程を通して、単一用量で、複数用量で、連続的に、または断続的に実施され得る。投与の最も有効な手段および投薬量を決定する方法は、当業者に周知であり、治療に使用される組成物、治療の目的、処置される標的細胞、および処置される被験体と共に変化する。単一の投与または複数の投与は、処置専門医により選択された用量レベルおよびパターンで実施され得る。適切な投薬処方物および試薬を投与する方法は、以下で見出され得る。
本発明の組成物および薬学的処方物は、医薬の製造において、および従来手順(例えば、薬学的組成物中の活性成分)に従って投与することによりヒトおよび他の動物を処置するために使用され得る。
薬学的組成物は、経口投与、鼻腔内投与、非経口投与されるか、または吸入療法により投与され得、錠剤、トローチ剤、顆粒、カプセル剤、丸剤、アンプル、坐薬、またはエアロゾル形態の形態を取り得る。これらはまた、水性または非水性希釈剤、シロップ、顆粒、または粉末中の活性成分の懸濁物、溶液、およびエマルジョンの形態を取り得る。本発明の化合物に加えて、薬学的組成物はまた、他の薬学的活性成分を含み得る。
より詳細には、本明細書中で活性成分と言われる活性画分はまた、任意の適切な経路(経口、直腸、経鼻、局所(経皮、エアロゾル、頬側および舌下を含む)、膣、非経口(parental)(皮下、筋内、静脈内および皮内を含む)および肺が挙げられる)によって、治療のために投与され得る。好ましい経路は、レシピエントの状態および年齢、ならびに処置される疾患によって変更されることがまた、理解される。
本発明の活性画分の適切な投薬は、疾患の型および重篤度および段階に依存し得、そして患者ごとに変更され得ることが理解される。最適投薬量の決定は、一般的に、本発明の処置における全ての危険性または有害な副作用に対する治療利益のレベルのバランスに関連する。
理想的には、この画分、抽出物または化合物(「薬物」)あるいはそれを含む組成物は、疾患部位で、活性化合物の濃度がピークに達するように投与されるべきである。これは、例えば、薬物の静脈内注射(必要に応じて、生理食塩水中)、または経口投与(例えば、活性成分を含む錠剤、カプセルもしくはシロップ)によって達成され得る。この薬物の望ましい血液レベルは、疾患組織内に、治療量の活性成分を提供するための連続的な注入によって維持され得る。有効な組み合わせの使用は、各個別の治療化合物または薬物が単独で使用される場合に必要とされ得るよりも、各成分薬剤のより低い全投薬量を必要とする治療的組み合わせを提供し、それによって有害な副作用を低減させる。
薬物成分は単独で投与される可能性があるが、この薬物成分のための1つ以上の薬学的に受容可能なキャリアおよび必要に応じて他の治療剤と一緒に、上記のような少なくとも1つの活性成分を含む薬学的処方物として示されることが好ましい。各キャリアは、処方物の他の成分に適合可能という意味で「受容可能」でなければならない。
処方物には、経口、直腸、経鼻、局所(経皮、頬側および舌下を含む)、膣、非経口(皮下、筋内、静脈内および皮内を含む)および肺投与にとって適切な処方物が含まれる。処方物は、単位投薬形態で都合よく示され得、そして薬学の分野において周知の任意の方法によって調製され得る。このような方法は、活性成分を、1つ以上の補助的成分を構成するキャリアと結合させる工程を包含する。一般的に、処方物は、活性成分と液体キャリアまたは細かく粉砕した固体キャリアあるいはそれら両方とを結合させて、均一かつ密に調製され、次いで必要に応じて、その製品を成形する。
経口投与に適切な本発明の処方物は、例えば、カプセル、カシェ剤または錠剤のような別個の単位(これらの各々は所定の量の活性成分を含んでいる)として;粉末または顆粒として;水性または非水性液体中の溶液または懸濁液として;あるいは水中油液体エマルジョンもしくは油中水液体エマルジョンとして示され得る。これらの活性成分はまた、ボーラス、舐剤またはペーストで示され得る。
錠剤は、必要に応じて1つ以上の補助成分と共に、圧縮または成形によって作製され得る。圧縮錠剤は、自由流動形態(例えば、必要に応じて結合剤(例えば、ポビドン、ゼラチン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース)、滑沢剤、不活性希釈剤、保存剤、崩壊剤(例えば、グリコール酸ナトリウムデンプン(sodium starch glycolate)、架橋したポビドン、架橋したカルボキシルメチルセルロースナトリウム)、界面活性剤または分散剤と混合された粉末または顆粒)の活性成分を適切な機械で圧縮することによって調製され得る。成形された錠剤は、不活性液体希釈剤を用いて湿らせた粉末化化合物の混合物を、適切な機械で成形することによって作製され得る。錠剤は必要に応じてコートされ得るか、または刻み目を付けられ(score)得、そして例えば、種々の割合のヒドロキシプロピルメチルセルロースを用いて、その中に活性成分の徐放または制御放出を提供するように処方されて、所望の放出プロフィールを提供し得る。錠剤は、必要に応じて、腸溶性コーティングと共に提供され、胃以外の消化管の部分での放出を提供し得る。
口における局所投与のために適切な処方物としては、ロゼンジ(通常、ショ糖およびアラビアゴムまたはトラガカントゴムである風味付けした基剤中に活性成分を含む);香錠(ゼラチンおよびグリセリンまたはショ糖およびアラビアゴムのような不活性な基剤中に活性成分を含む);ならびにマウスウォッシュ(適切な液体キャリアに活性成分を含む)が挙げられる。
本発明に従う局所投与のための薬学的組成物は、軟膏、クリーム、懸濁液、ローション、粉末、溶液、ペースト、ゲル、噴霧、エアロゾルまたは油として処方され得る。あるいは、処方物は、活性成分および必要に応じて、1つ以上の賦形剤もしくは希釈剤に浸漬させた包帯または接着ギブスのようなパッチまたは包帯を含み得る。
眼または他の外部組織(例えば、口および皮膚)の疾患のために、処方物は、好ましくは、活性成分を含む、局所的な軟膏またはクリームとして適用される。軟膏にて処方される場合、薬物は、パラフィン系または水混和性の軟膏基剤のいずれかと共に使用され得る。あるいは、薬物成分は、水中油クリーム基剤と共にクリーム中に処方され得る。
所望の場合、クリーム基剤の水相は、例えば、少なくとも約30% w/wの多価アルコール(すなわち、2つ以上のヒドロキシル基を有するアルコール(例えば、プロピレングリコール、ブタン−1,3−ジオール、マンニトール、ソルビトール、グリセロールおよびポリエチレングリコールならびにそれらの混合物))を含み得る。局所処方物は、望ましくは、皮膚または他の病気に冒された領域を通る薬物成分の吸収または浸透を増強する化合物を含み得る。このような真皮浸透増強剤の例としては、ジメチルスルホキシドおよび関連するアナログが挙げられる。
本発明のエマルジョンの油相は、任意の公知の様式において、公知の成分から構成され得る。この相は、乳化剤(他の点では、排出促進剤として公知)のみを含み得るが、望ましくは、脂肪または油と共にか、あるいは脂肪および油と共に、少なくとも1つの乳化剤を含む。好ましくは、親水性乳化剤が、安定化剤として作用する親油性乳化剤と共に含まれる。油および脂肪の両方が含まれることもまた、好ましい。同時に、安定化剤を伴うか、または伴わない乳化剤は、いわゆる乳化ワックスを構成し、そしてワックスは、油および/もしくは脂肪と一緒に、いわゆる乳化軟膏基剤(これは、クリーム処方物の油状分散相を形成する)を構成する。
本発明の処方物における使用のために適切な排出促進剤およびエマルジョン安定化剤としては、Tween60、Span80、セトステアリルアルコール、ミリスチルアルコール、グリセリモノステアレートおよびラウリル硫酸ナトリウムが挙げられる。
薬学的エマルジョン処方物においておそらく使用される大部分の油状物における活性化合物の可溶性は、非常に低いので、処方のために適切な油または脂肪の選択は、所望の美的特性の達成に基づく。従って、クリームは、好ましくは、チューブまたは他の容器からの漏出を避けるために適切な粘稠度を有する、非脂肪性、非着色性および洗浄可能な製品であるべきである。直鎖または分枝鎖の、塩基性モノアルキルエステルまたは二塩基性アルキルエステル(例えば、ジ−イソアジペート、ステアリン酸イソセチル、ココナツ脂肪酸のプロピレングリコールジエステル、ミリスチン酸イソプロピル、オレイン酸デシル、パルミチン酸イソプロピル、ステアリン酸ブチル、2−エチルへキシルパルミテート、またはCrodamol CAPとして公知の分枝鎖エステルの混合物が使用され得る。これらは、必要とされる特性に依存して、単独または組み合わせて使用され得る。あるいは、融点の高い脂質(例えば、白色ソフトパラフィンおよび/または液体パラフィン)または他の鉱物油が使用され得る。
眼への局所投与のために適切な処方物はまた、点眼剤を含み、ここで、活性成分は、適切なキャリア(特に、活性成分用の水性溶媒)に溶解されるか、または懸濁される。直腸投与のための処方物は、適切な基剤(例えば、ココアバターまたはサリチル酸塩を含む)と共に坐剤として示され得る。
膣投与のために適切な処方物は、ペッサリー、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、発泡剤または噴霧処方物として示され得、これらは、活性成分と併せて、適切であることが当該分野において公知のキャリアを含む。
経鼻投与のために適切な処方物(キャリアは固体である)は、例えば、約20〜約500ミクロンの間の範囲の粒子サイズを有する、粗い粉末を含み、これは、鼻から吸い込む様式(すなわち、鼻に密着させた、粉末の容器から鼻腔を通って迅速に吸入される)により投与される。適切な処方物は、活性成分の水性溶液または油性溶液を含み、ここで、キャリアは、例えば、鼻内噴霧、点鼻剤としての投与、またはネブライザーによるエアロゾル投与による投与のための液体である。
非経口投与のために適切な処方物は、処方物を、意図されたレシピエントの血液と等張性にし得、水性および非水性の滅菌注射溶液(これらは、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤および溶質を含み得る);ならびに水性および非水性の滅菌懸濁液(これらは、懸濁剤および増粘剤を含み得る)、およびリポソームまたは他の微粒子系(これらは、化合物が血液成分もしくは1つ以上の器官を標的化するように設計される)を含む。これらの処方物は、単回用量または複数回用量の密封容器(例えば、アンプルおよびバイアル)において示され得、そして使用の直前に、滅菌液体キャリア(例えば、注射用水)の添加だけを必要とするフリーズドライ(凍結乾燥)状態で保存され得る。即席の注射溶液および懸濁液は、先に記載した種類の滅菌の粉末、顆粒および錠剤から調製され得る。
好ましい単位投薬量の処方物は、本明細書中で上に列挙されるような、薬物成分の、一日用量または単位、一日準用量(subdose)またはそれらの適切な一部を含む処方物である。
好ましい単位投薬量の処方物は、本明細書中で上に列挙されるような、薬物成分の、一日用量または単位、一日準用量またはそれらの適切な一部を含む処方物である。これらはまた、さらなる活性薬剤(例えば、抗腫瘍剤、抗癌剤、抗新血管形成剤または免疫増強剤)を含み得る。
上記に特に言及される成分に加えて、本発明の処方物は、問題となる処方物の型を考慮して、当該分野における慣用的な他の薬剤を含み得ることが理解されるべきである(例えば、経口投与に適切な薬剤は、甘味剤、増粘剤および香味剤のようなさらなる薬剤を含み得る)。
同一の抽出物(「薬物」)または組成物はまた、獣医学の処方物の形態において使用されるために示され得、これは、例えば、当該分野で慣用的方法によって調製され得る。
本発明はさらに、新血管形成または内皮細胞増殖を阻害するための治療剤についてスクリーニングする方法を提供する。このスクリーニングは以下を包含する:
(a)薬剤と適切な細胞または組織サンプルとを接触させる工程;
(b)適切な細胞または組織の別個のサンプルと、治療有効量の本発明の抽出物またはその抽出物を含有する薬学的に受容可能な組成物とを接触させる工程;および
(c)工程(a)のサンプルの増殖と、工程(b)のサンプルの増殖とを比較する工程であって、ここで、工程(b)のサンプルと同一または類似した程度に増殖を阻害する工程(a)の任意の薬剤は、新血管形成または内皮細胞増殖を阻害するための治療剤である。
(a)薬剤と適切な細胞または組織サンプルとを接触させる工程;
(b)適切な細胞または組織の別個のサンプルと、治療有効量の本発明の抽出物またはその抽出物を含有する薬学的に受容可能な組成物とを接触させる工程;および
(c)工程(a)のサンプルの増殖と、工程(b)のサンプルの増殖とを比較する工程であって、ここで、工程(b)のサンプルと同一または類似した程度に増殖を阻害する工程(a)の任意の薬剤は、新血管形成または内皮細胞増殖を阻害するための治療剤である。
本明細書中で使用される場合、適切なサンプルは、内皮細胞を含む任意のサンプルを意図する。本方法は、本明細書中で記載されるように、インビトロまたはインビボで実施され得る。
被験体における病理学的な新血管形成に関連する疾患を障害するためのキットもまた、本発明によって提供される。このキットは、治療有効量の抽出物および使用のための指示書を含む。このキットは、以下からなる群より選択される障害を処置するために有用である:関節炎状態、脈管新生に基づく皮膚の状態、糖尿病性網膜炎、カポージ肉腫、加齢性筋肉変性、再狭窄、毛細管拡張症(telangectasia)、緑内障、ケロイド、角膜移植拒絶、創傷の肉芽化(granularization)、血管線維腫、オスラー−ウェバー(Osler−Webber)症候群、心筋の新脈管形成、強皮症、慢性関節リウマチ、乾癬性関節炎および骨粗鬆症。
以下の実施例は説明の目的であり、本発明を限定しない。
(実施例)
(材料)
次の材料を、以下に記載の方法において使用した。
(材料)
次の材料を、以下に記載の方法において使用した。
草本(Herba)Hedyotis Diffusaeの乾燥植物を、ホモジナイズし、そして熱水(80℃〜90℃(Sigma);酢酸ナトリウム(Sigma);硫酸アンモニウム(Sigma);塩酸(VWR Scientific);ホスファターゼ基質(Sigma);Sephadex G−25(Sigmna);およびTriton X−100(Sigma))により抽出した。
(実施例1)
(単離および精製)
本発明は、Hedyotis Diffusaeから生物学的に活性な画分を調製するためのプロセスのいくつかの実施形態を提供する。1つの局面において、例えば、図1に示されるプロセスは、約210nm〜約250nmの間の光学吸光度を有する可溶性画分AHD04を抽出する工程を包含する。さらなる局面において、この画分は、約220nm〜約240nmの吸光度を有する。なおさらなる局面において、この活性な画分の吸光度は、約230nmである。さらなる局面において、植物の葉および/または茎が、熱水(約60℃以上の任意の温度、好ましくは約90℃より高い温度)中に浸される。ティー(tea)は、抽出され、そして濃縮されて、EHDaを提供する。
(単離および精製)
本発明は、Hedyotis Diffusaeから生物学的に活性な画分を調製するためのプロセスのいくつかの実施形態を提供する。1つの局面において、例えば、図1に示されるプロセスは、約210nm〜約250nmの間の光学吸光度を有する可溶性画分AHD04を抽出する工程を包含する。さらなる局面において、この画分は、約220nm〜約240nmの吸光度を有する。なおさらなる局面において、この活性な画分の吸光度は、約230nmである。さらなる局面において、植物の葉および/または茎が、熱水(約60℃以上の任意の温度、好ましくは約90℃より高い温度)中に浸される。ティー(tea)は、抽出され、そして濃縮されて、EHDaを提供する。
(実施例2)
(内皮細胞培養(EGG)アッセイによる、新脈管形成阻害の決定)
新脈管形成阻害の割合を決定するために使用されるアッセイは、酸性ホスファターゼ活性のレベルによって細胞数を決定するための改変(LiangおよびWong(1999)ANGIOGENESIS:FROM THE MOLECULAR TO INTEGRATIVE PHARMACOLOGY(Maradoudakis編、Kluwer Academic/Plenum.Publishers、New York)を有する、D.T.Connallyら(1986)Anal.Biochem.152:136−4によって開発されたアッセイのバリエーションであった。American Type Tissue Culture(ATCC)から獲得したCPAE(心肺動脈内皮細胞、ウシ)を、MEM−10E中でほぼ95%のコンフルエンスまで増殖させた。これらの細胞を、0.25%のトリプシン溶液を用いて組織培養フラスコから分離させ、そして10,000細胞/ウェルの密度で同じ培養培地中に、24ウェルの組織培養プレートに植えつけた。その後、プレートを、5.0%CO2インキュベーター中で、37℃にて8時間培養した。アッセイサンプルおよびコントロールを添加した。各サンプルを、再現性を保障するために、100μL/ウェルで、2つの異なるウェルにロードした。サンプルとの60時間のインキュベーション後、培地を吸引し、そして細胞数を、細胞の酸性ホスファターゼの比色測定に基づいて測定した。
(内皮細胞培養(EGG)アッセイによる、新脈管形成阻害の決定)
新脈管形成阻害の割合を決定するために使用されるアッセイは、酸性ホスファターゼ活性のレベルによって細胞数を決定するための改変(LiangおよびWong(1999)ANGIOGENESIS:FROM THE MOLECULAR TO INTEGRATIVE PHARMACOLOGY(Maradoudakis編、Kluwer Academic/Plenum.Publishers、New York)を有する、D.T.Connallyら(1986)Anal.Biochem.152:136−4によって開発されたアッセイのバリエーションであった。American Type Tissue Culture(ATCC)から獲得したCPAE(心肺動脈内皮細胞、ウシ)を、MEM−10E中でほぼ95%のコンフルエンスまで増殖させた。これらの細胞を、0.25%のトリプシン溶液を用いて組織培養フラスコから分離させ、そして10,000細胞/ウェルの密度で同じ培養培地中に、24ウェルの組織培養プレートに植えつけた。その後、プレートを、5.0%CO2インキュベーター中で、37℃にて8時間培養した。アッセイサンプルおよびコントロールを添加した。各サンプルを、再現性を保障するために、100μL/ウェルで、2つの異なるウェルにロードした。サンプルとの60時間のインキュベーション後、培地を吸引し、そして細胞数を、細胞の酸性ホスファターゼの比色測定に基づいて測定した。
(実施例3)
(細胞溶解性/細胞傷害性アッセイ)
ウシ肺動脈内皮(CPAE)細胞を、1ウェル当たり10,000細胞で、24ウェル培養プレートにプレートする。37℃、5%CO2で約60時間の増殖インキュベーション後、1投薬量のサンプル(約50μl〜約100μl)を各サンプルウェルに添加し、そして30分間再インキュベートする。インキュベーション後、細胞の存在を検出するために細胞を倒立顕微鏡下で可視的にアッセイし、そしてECCアッセイの使用を介してアッセイする。両方の方法を、各ウェル中の内皮細胞の存在または非存在を検出するために使用する。サンプルを含まないコントロール細胞が使用され、そして正常に増殖した。
(細胞溶解性/細胞傷害性アッセイ)
ウシ肺動脈内皮(CPAE)細胞を、1ウェル当たり10,000細胞で、24ウェル培養プレートにプレートする。37℃、5%CO2で約60時間の増殖インキュベーション後、1投薬量のサンプル(約50μl〜約100μl)を各サンプルウェルに添加し、そして30分間再インキュベートする。インキュベーション後、細胞の存在を検出するために細胞を倒立顕微鏡下で可視的にアッセイし、そしてECCアッセイの使用を介してアッセイする。両方の方法を、各ウェル中の内皮細胞の存在または非存在を検出するために使用する。サンプルを含まないコントロール細胞が使用され、そして正常に増殖した。
(実施例4)
(サンプル滴定アッセイ)
画分(例えば、ADH04)からの抗新脈管形成活性が、投薬量に関連するか否かを決定するために、滴定アッセイを内皮細胞に対して実行した。サンプルを、1.0mg/mL〜0.00625mg/mLの滴定濃度で作製した。異なるサンプルを細胞にロードし、一方、ブランクは、コントロールである。結果を表1(以下)に示す。
(サンプル滴定アッセイ)
画分(例えば、ADH04)からの抗新脈管形成活性が、投薬量に関連するか否かを決定するために、滴定アッセイを内皮細胞に対して実行した。サンプルを、1.0mg/mL〜0.00625mg/mLの滴定濃度で作製した。異なるサンプルを細胞にロードし、一方、ブランクは、コントロールである。結果を表1(以下)に示す。
(表1:異なる濃度でのAHD04の新脈管形成阻害アッセイ)
(阻害特異性)
この阻害活性が、内皮細胞特異的であるか否かを決定するために、FCCアッセイを、コントロールとしてHEP−2細胞(ヒト喉頭組織から単離された)を使用することによって、実行した。結果は、HEP−2細胞が、活性な画分に対して感受性でないことを示す。
結果を表2に示す。
(MMPアッセイ)
P.C.Brooksら(1996)は、「Localization of matrix metalloproteinase MMP−2 to the surface of invasive cells by interaction with integrin αvβ3」、Cell 85:683−93において、マトリックスメタロプロテイナーゼとαv/β3インテグリンとの相互作用に対するインビトロアッセイを記載する。MMP−2/αvβ3インテグリン複合体に対する実験サンプルの効果は、このサンプルの作用機構が、脈管形成経路のこの区域の任意の破壊を含むか否かを決定する。これは、この実験サンプルが、αvβ3インテグリンとのMMP−2の相互作用を阻害し得るか否かを試験する工程を包含する。最初に、これを、MMP−2に対する抗体を使用するELISAによって行い、そしてサンプルに対するこれらの抗体の結合を試験する。陽性の結果が生じるか否かのさらなる研究を続ける。MMP−2の公知の天然のインヒビターであるTIMP−2(マトリックスメタロプロテアーゼ−2の組織インヒビター)を、コントロールとして使用する。
(実施例7)
(内皮細胞細管/索形成アッセイ)
マトリゲル(matrigel)(10mg/mlを60μl;Collaborative Lab #35423)を、氷冷した96ウェルプレートの各ウェルに配置する。このプレートを、15分間室温に置き、次いで37℃で30分間インキュベートして、マトリゲルの重合を可能にする。一方で、HUVECを、EGM−2(Clonetic # CC3162)中で、2×105細胞/mlの濃度で調製する。この試験化合物を、同じ培地中に所望の濃度(5つの濃度レベル)の2×で調製する。細胞(500μl)および2×の画分または化合物(500μl)を混合し、この懸濁物の200μlを、重合したマトリゲル上に二連で配置する。24時間のインキュベーション後、Bioquant Image Analysis systemを使用して、各濃度について三連で写真を撮影する。薬物効果(IC50)を、形成された索/細管の長さおよび連結の数を測定することによって、未処理のコントロールと比較して評価する。TNP−470(NSC 642492)およびパクリタキセル(NSC 125973)を、参照化合物として使用する。
(内皮細胞細管/索形成アッセイ)
マトリゲル(matrigel)(10mg/mlを60μl;Collaborative Lab #35423)を、氷冷した96ウェルプレートの各ウェルに配置する。このプレートを、15分間室温に置き、次いで37℃で30分間インキュベートして、マトリゲルの重合を可能にする。一方で、HUVECを、EGM−2(Clonetic # CC3162)中で、2×105細胞/mlの濃度で調製する。この試験化合物を、同じ培地中に所望の濃度(5つの濃度レベル)の2×で調製する。細胞(500μl)および2×の画分または化合物(500μl)を混合し、この懸濁物の200μlを、重合したマトリゲル上に二連で配置する。24時間のインキュベーション後、Bioquant Image Analysis systemを使用して、各濃度について三連で写真を撮影する。薬物効果(IC50)を、形成された索/細管の長さおよび連結の数を測定することによって、未処理のコントロールと比較して評価する。TNP−470(NSC 642492)およびパクリタキセル(NSC 125973)を、参照化合物として使用する。
(実施例8)
(内皮細胞移動アッセイ)
移動を、48ウェルのBoydenチャンバおよび8μmの孔サイズのコラーゲン被覆した(10μl/mlラット尾部コラーゲン;Collaborative Laboratories)ポリカーボネートフィルタ(Osmonics,Inc.)を使用して評価する。下のチャンバウェルは、27〜29μlのDMEM培地単独(基準)または化学誘引物質(bFGF、VEGFまたはSwiss 3T3細胞馴化培地)を含有する培地を受ける。上のチャンバは、画分もしくは化合物有りまたは無しでDMEM+1%BSA中に調製されたHUVEC細胞懸濁物(1×106細胞/ml)45μlを受ける。37℃で5時間のインキュベーション後、膜をPBSでリンスし、固定し、そしてDiff−Quick溶液中で染色する。フィルタを、移動した細胞を下に向けてガラススライド上に配置し、上部の細胞を、Kimwipeを使用して除去する。試験を、4〜6回複製して実行し、5つの視野を各ウェルから計数する。陰性の非刺激コントロール値を、刺激コントロールから差し引き、そして画分または化合物で試験した値およびデータを、平均移動細胞±S.D.でプロットする。IC50を、このプロットしたデータから算定する。TNP−470(NSC 642492)およびパクリタキセル(NSC 125973)を、参照化合物として使用する。
(内皮細胞移動アッセイ)
移動を、48ウェルのBoydenチャンバおよび8μmの孔サイズのコラーゲン被覆した(10μl/mlラット尾部コラーゲン;Collaborative Laboratories)ポリカーボネートフィルタ(Osmonics,Inc.)を使用して評価する。下のチャンバウェルは、27〜29μlのDMEM培地単独(基準)または化学誘引物質(bFGF、VEGFまたはSwiss 3T3細胞馴化培地)を含有する培地を受ける。上のチャンバは、画分もしくは化合物有りまたは無しでDMEM+1%BSA中に調製されたHUVEC細胞懸濁物(1×106細胞/ml)45μlを受ける。37℃で5時間のインキュベーション後、膜をPBSでリンスし、固定し、そしてDiff−Quick溶液中で染色する。フィルタを、移動した細胞を下に向けてガラススライド上に配置し、上部の細胞を、Kimwipeを使用して除去する。試験を、4〜6回複製して実行し、5つの視野を各ウェルから計数する。陰性の非刺激コントロール値を、刺激コントロールから差し引き、そして画分または化合物で試験した値およびデータを、平均移動細胞±S.D.でプロットする。IC50を、このプロットしたデータから算定する。TNP−470(NSC 642492)およびパクリタキセル(NSC 125973)を、参照化合物として使用する。
上記の発明を、理解を明確にする目的のために、例示および実施例によって、いくらか詳細に記載してきたが、特定の変化および改変が実行されることが、当業者に明らかである。例えば、当業者に明らかなように、本発明の方法は、1以上の既知の抗腫瘍、抗脈管形成または免疫増強の治療剤および組成物(例えば、サメ軟骨、チロスフィンゴシン(tyrosphingosine)またはスフィンゴシン)と組み合わせられ得る。従って、記載および実施例は、添付の特許請求の範囲によって規定される本発明の範囲を限定するとは解釈されるべきではない。
Claims (21)
- Hedyotis Diffusaeの組成物から、生物学的に活性な画分AHD04を調製するためのプロセスであって、該プロセスは、約210nmと約250nmとの間の光学吸光度を有する画分を抽出する工程を包含する、プロセス。
- Hedyotis Diffusaeの組成物から、生物学的に活性な画分EHDaを調製するためのプロセスであって、該プロセスは、有効量のHedyotis Diffusaeを有効量の熱水中に浸して、液体抽出物を得る工程、および該抽出物を濾過してEHDaを得る工程、を包含するプロセス。
- 請求項1に記載のプロセスであって、該プロセスは、以下の工程:
(a)有効量のHedyotis Diffusaeを熱水中に浸して、液体抽出物を得る工程;
(b)遠心分離して、透明な液体抽出物を得る工程;
(c)該液体抽出物を乾燥して、受容可能なキャリア中に再懸濁する工程;および
(d)約210nmと約250nmとの間の光学吸光度を有する生物学的に活性な抽出物AHD04を得るように、クロマトグラフィーによって前記活性な画分を得る工程、
を包含する、プロセス。 - 請求項1のいずれかに記載のプロセスによって得られる、生物学的に活性な抽出物。
- 請求項4に記載の抽出物および薬学的に受容可能なキャリアを含有する、組成物。
- 有効量の、抗脈管形成剤、抗腫瘍剤および免疫増強剤からなる群より選択される薬剤をさらに含有する、請求項5に記載の組成物。
- 内皮細胞の増殖を阻害するための方法であって、該方法は、増殖阻害量の請求項4に記載の抽出物を該細胞に送達する工程を包含する、方法。
- 組織における血管新生を阻害する方法であって、該方法は、抗血管新生量の請求項4に記載の抽出物を該組織に送達する工程を包含する、方法。
- 被験体における病理学的新生血管形成と関連する障害を処置する方法であって、該方法は、治療有効量の請求項4に記載の抽出物を被験体に投与する工程を包含する、方法。
- 請求項9に記載の方法であって、前記障害が、癌、関節炎状態、新生血管ベースの皮膚科学的状態、糖尿病性網膜炎、再狭窄、カポージ肉腫、加齢性黄斑変性、毛細管拡張症、緑内障、ケロイド、角膜移植拒絶、創傷肉芽化、血管線維腫、オースラー−ウェーバー症候群、心筋新脈管形成および強皮症からなる群より選択される、方法。
- 前記障害が、慢性関節リウマチ、乾癬性関節炎および変形性関節症からなる群より選択される関節炎状態である、請求項10に記載の方法。
- 前記送達する工程が、経口投与、静脈内投与、腹腔内投与または経皮投与による、請求項10に記載の方法。
- 前記被験体が動物である、請求項9に記載の方法。
- 前記動物が、愛玩動物、家畜またはヒト患者からなる群より選択される、請求項13に記載の方法。
- 有効量の、抗脈管形成剤、抗腫瘍剤または免疫増強剤からなる群より選択される薬剤を、前記被験体に投与する工程をさらに包含する、請求項7、8または9のいずれか1項に記載の方法。
- 新生血管形成または内皮細胞増殖を阻害するための治療剤についてスクリーニングするための方法であって、該方法は、以下の工程:
(a)該薬剤を、適切な細胞サンプルまたは組織サンプルと接触させる工程;
(b)適切な細胞サンプルまたは組織サンプルの別個のサンプルを、治療有効量の請求項4に記載の抽出物と接触させる工程;および
(c)工程(a)のサンプルの増殖を、工程(b)のサンプルの増殖と比較する工程であって、ここで、工程(b)のサンプルと同じかまたは類似する程度まで該増殖を阻害する工程(a)の任意の薬剤は、新生血管形成または内皮細胞の増殖を阻害するための治療剤である、工程、
を包含する方法。 - 前記接触させる工程が、インビトロまたはインビボである、請求項16に記載の方法。
- 前記工程(b)のサンプルを、抗脈管形成剤、抗腫瘍剤および免疫増強剤からなる群より選択される薬剤と接触させる工程をさらに包含する、請求項16に記載の方法。
- 宿主における病理学的新生血管形成と関連する障害を処置するためのキットであって、該キットは、治療有効量の請求項4に記載の抽出物および使用のための指示書を備える、キット。
- 請求項19に記載のキットであって、前記障害が、癌、関節炎状態、新生血管ベースの皮膚科学的状態、糖尿病性網膜炎、カポージ肉腫、加齢性黄斑変性、再狭窄、毛細管拡張症、緑内障、ケロイド、角膜移植拒絶、創傷肉芽化、血管線維腫、オースラー−ウェーバー症候群、心筋脈管形成および強皮症からなる群より選択される、キット。
- 前記障害が、慢性関節リウマチ、乾癬性関節炎および変形性関節症からなる群より選択される関節炎状態である、請求項20に記載のキット。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US25550100P | 2000-12-13 | 2000-12-13 | |
PCT/US2001/048144 WO2002060464A2 (en) | 2000-12-13 | 2001-12-12 | Compositions containing an active fraction isolated from hedyotis diffusae and methods of use |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2005510448A true JP2005510448A (ja) | 2005-04-21 |
Family
ID=29215792
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2002560655A Pending JP2005510448A (ja) | 2000-12-13 | 2001-12-12 | HedyotisDiffusaeから単離された活性な画分を含む組成物および使用方法 |
Country Status (4)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP1357925A2 (ja) |
JP (1) | JP2005510448A (ja) |
CN (1) | CN1499979A (ja) |
WO (1) | WO2002060464A2 (ja) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101496845B (zh) * | 2008-02-01 | 2013-02-20 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 一种白花蛇舌草提取物及其分离制备方法 |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AU5213586A (en) * | 1985-10-03 | 1987-04-09 | John Ky | Extract of plant species hedyotis used as an anti-cancer tea |
-
2001
- 2001-12-12 CN CNA018224105A patent/CN1499979A/zh active Pending
- 2001-12-12 WO PCT/US2001/048144 patent/WO2002060464A2/en not_active Application Discontinuation
- 2001-12-12 EP EP01994223A patent/EP1357925A2/en not_active Withdrawn
- 2001-12-12 JP JP2002560655A patent/JP2005510448A/ja active Pending
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP1357925A2 (en) | 2003-11-05 |
WO2002060464A2 (en) | 2002-08-08 |
WO2002060464A3 (en) | 2003-07-31 |
CN1499979A (zh) | 2004-05-26 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Raymond et al. | Isolation and identification of stimulatory and inhibitory cell growth factors in bovine vitreous | |
Goncharova et al. | PI3K is required for proliferation and migration of human pulmonary vascular smooth muscle cells | |
CN1954825B (zh) | 超微通心络中药组合物及其新用途 | |
EP1729788B1 (en) | Restenosis therapy using mesenchymal stem cells | |
US8226988B2 (en) | Compositions containing an active fraction isolated from Lycium barbarum and methods of using the same | |
JP2005502579A (ja) | 新生血管形成に関連する状態を処置するための方法および組成物 | |
US20030095981A1 (en) | Compositions containing an active fraction isolated from ganoderma lucidum and methods of use | |
Freedman et al. | Eggs of Schistosoma mansoni stimulate endothelial cell proliferation in vitro | |
KR101804852B1 (ko) | 사멸화된 세포를 이용한 암 전이 억제용 조성물 | |
CN112584846A (zh) | 用于皮肤病的药物组合物及其用途 | |
JP2005501816A (ja) | Scutellariaebarbataeから単離された活性な画分を含む組成物および使用方法 | |
US6468960B1 (en) | Therapeutic compositions and methods for enhancing angiogenesis | |
JP2005510448A (ja) | HedyotisDiffusaeから単離された活性な画分を含む組成物および使用方法 | |
JP2006508047A (ja) | 新血管新生に関連する状態を治療する方法及び配合物 | |
KR102481553B1 (ko) | 신혈관 형성 억제를 위한 c-19 스테로이드 | |
US20020132016A1 (en) | Compositions containing an active fraction isolated from hedyotis diffusae and methods of use | |
US20020164390A1 (en) | Compositions containing an active fraction isolated from tricholoma conglobatum and methods of use | |
WO2004043345A2 (en) | Extract of trapa natans and methods of using the same | |
US20220047640A1 (en) | Pharmaceutical composition for treating pancreatitis, comprising clonal stem cells | |
CN116555175B (zh) | 一种细胞修复蛋白提取物及其制备方法和其应用 | |
CN116925186B (zh) | 一种新生儿肺发育不良的间充质干细胞治疗方法 | |
KR100750334B1 (ko) | 펠리누스 린테우스에서 추출한 다당류를 포함하는 혈관신생 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 | |
CN108685896B (zh) | 千层纸素a在制备治疗和/或预防慢性周围血管闭塞性疾病药物中的用途 | |
KR20030002972A (ko) | 항염증 활성 및 항동맥경화 활성을 나타내는 틸리아닌 | |
CN109172567A (zh) | 马索亚内酯在制备预防和/或治疗自身免疫疾病药物或保健品方面的应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20080827 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20090402 |