JP2005500992A - アレルギーおよび喘息の治療用新規化合物 - Google Patents
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Abstract
Description
【0001】
本発明は、アレルギーおよび喘息を治療するための新規な化合物に関する。より正確には、本発明は新規な抗IgE Fab(抗体断片)およびその医学的な使用に関する。
【背景技術】
【0002】
I型アレルギーは、免疫性過敏症であり、世界の人口のほぼ25%が罹患している[1]。アレルギー患者では、他の点では無害な抗原(花粉アレルゲン、ダニアレルゲン、かびアレルゲン、毛/鱗屑アレルゲン)に対するIgE抗体の産生が不適正に増加する[1、2]。エフェクター細胞(例えば、肥満細胞、好塩基球)にFcεRIを介して結合しているIgE抗体がアレルゲンにより媒介されて架橋すると、生理活性なメディエイタ(ヒスタミン、ロイコトリエン)が即座に放出され、アトピー(例えば、アレルギー性鼻炎、結膜炎、喘息およびアナフィラキシーショック)の急性症状を引き起こす[3]。アレルゲンがプロフェッショナル抗原提示細胞(例えば、単球、樹状細胞)上のIgE−FcεRIを介して提示されると、T細胞が活性化され、Th2サイトカインが放出されて慢性の遅延型疾患症状(アトピー性皮膚炎、慢性喘息)をもたらす[4〜6]。
【0003】
したがって、アレルゲンとアレルゲン特異的IgEとFcεRIとの相互作用は、アトピーおよび様々な形式の喘息において鍵となる病理機序である。IgE抗体[7、8]およびFcεRI[9]が同定されこれらの特性が明らかにされて以来、これらの相互作用ドメインの解析、特にアトピー性疾患の汎用的な治療法のためのこの相互作用の競合物質を同定するために多大な努力が払われてきた[10]。ヒトIgEとFcεRIのα鎖の相互作用部位を決定しようとする試み[11〜14]としては、組換えタンパク質/ペプチド[15〜17]、突然変異タンパク質[14]、化学合成したペプチド[18、19]のスクリーニング、および構造解析[20]などがあった。また、IgEがFcεRIに結合するのを防止するために、IgEの受容体結合部位に対して自己抗体応答を誘導する試みがなされた[21]。他の治療上の取り組みとしては、IgE由来のペプチド[15、18、19]、核酸[22]およびヒト化抗IgE抗体[23〜25]の開発がある。前記競合物質のほとんどは、高度な細胞アッセイの評価結果(例えば、好塩基球のヒスタミン放出)[26]とあわせた手間のかかる構造的、理論的設計(rationale design)[19]または広範なin vivoでの試験[27]から得られる。これまで多数の化合物が記述されてきたが、この分野ではまだ改良の必要性が残っている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
本発明により、IgE−FcεRI相互作用の新規な阻害物質/競合物質でありFab 12と呼ばれる抗体断片である独特な化合物が同定された。
【0005】
Fab 12は、血中IgE抗体ならびにIgE保有細胞を枯渇させるために使用することができるので、アトピーおよび喘息の汎用治療用の候補分子となり得る。Fab 12は、主として、急性または慢性アトピーの治療、特にI型アレルギーおよび喘息の治療用薬物として使用することが意図される。
【課題を解決するための手段】
【0006】
第1の態様では、本発明は、以下の諸特性を有する、すなわち、
a)IgE−FcεRI相互作用を阻害し、
b)遊離のIgEおよび細胞に結合しているIgEに結合し、かつ
c)アナフィラキシー性ではない
IgG1アイソタイプの抗IgE Fab(抗体断片)を提供する。Fabは、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体から誘導することができる。
【0007】
あるいは、Fabは合成または組換えにより製造される。
【0008】
好ましい一実施形態では、Fabはヒト化フレームワーク領域を含む組換えFabである。
【0009】
本発明のMab 12およびFab 12を産生するハイブリドーマ細胞系は、2002年3月27日に受託番号02032734でEuropean Collection of Cell Cultures(ECACC)、Salisbury、Wiltshire、SP4 OJG、UKに寄託されている。
【0010】
第2の態様では、本発明は、アトピー症状の治療用薬物を製造するための本発明によるFabの使用を提供する。アトピー症状は、急性アトピー症状でも慢性アトピー症状でもよい。また、本発明は前記Fabを使用してIgEおよびIgE保有細胞を血中から枯渇させることにも関する。前記Fabは体外で使用することが好ましい。
【0011】
本発明による別の使用は、細胞レベルでの治療介入のためにIgE保有細胞への標的化である。すなわち、エフェクター細胞、形質細胞(B細胞)および/または抗原提示細胞を不活性化するため、本発明によるFabに、例えば誘導体化によって、例えば毒素を付与する。
【発明を実施するための最良の形態】
【0012】
以下、本発明を、実験の項ならびに添付の図面とあわせてより詳細に記述する。
【0013】
実験
I.キメラBet v 1特異的IgE抗体Bip 1の生成および特性決定
主要アレルゲンとその対応するIgEとFcεRIとの相互作用に対するin vitroの分子モデルを確立するために、本発明者らは、主要なカバノキ花粉アレルゲンであるBet v 1に対する特異性を有するキメラモノクローナルIgE抗体Bip 1を構築した[28、29]。
【0014】
Quick Prep Micro mRNA精製キット(Amersham Pharmacia Biotech、Uppsala、Sweden)を用いてBip 1ハイブリドーマ細胞[29]からメッセンジャーRNAを単離した。Recombinant Phage Antibody System:Mouse ScFv Module(Amersham Pharmacia Biotech、Uppsala、Sweden)を用いて免疫グロブリンH鎖可変領域(VH)を特異的に増幅した。ヒトVH−4リーダー配列(L)をPCRで増幅し、その後Bip 1 VH領域にPCRにより融合させた。LVH断片の配列決定を、Auto Read Sequencing Kit(Amersham、Pharmacia、Biotech、Uppsala、Sweden)を用いて、Automated Laser Fluorescent DNA Sequencer(Amersham Pharmacia Biotech、Uppsala、Sweden)で実施した。Igプロモーター領域およびエンハンサー領域の制御下にある分泌された形のヒトIgEをコードするゲノム領域を含むε発現プラスミドのCla I/Spe I部位にLVH断片をサブクローニングした。この構築物をBip 1ハイブリドーマ細胞系にエレクトロポレーション(Gene Pulser、Biorad)により導入した。ゲネチシン(genecitin)を使用して安定なトランスフェクタントを培地中で選択した。SP2/0細胞への融合をPEGを用いて実施した。IgEのみを産生するクローンをELISAで同定し、サブクローニングしてモノクローナル細胞系を作製した。キメラBip 1 IgEを分泌する3種の異なるクローンのうち、クローン859をキメラIgEの発現に優れる(11μg/ml)ことから選択した。特異的なIgE全体を、血清無添加培地中で増殖したクローン859の上清について、Pharmacia CAP SystemおよびUni CAP System(Pharmacia&Upjohn Diagnostics、Uppsala、Sweden)の両方のシステムで試験した。
【0015】
rBet v 1 5mgをAminoLinkカラム(Pierce、Rockford、IL)に結合させてアフィニティーカラムを調製した。キメラBip 1 IgE抗体(2600kU/l IgE)を含有する細胞培養上清(100ml/ラン)をBet v 1アフィニティーカラムにかけた。カラムをPBSで洗浄し、結合したキメラBip 1 IgEを5M MgCl2で溶出させた。Bip 1 IgEを含有する溶出液を4℃でPBSで透析し、凍結乾燥させた。キメラBip 1 IgE抗体約90μgを精製することができた。精製した凍結乾燥キメラIgEをリン酸緩衝食塩水に溶解した。非還元SDS−PAGEおよびゲルのクーマシーブリリアントブルー(Imperial Chemical Industries,Ltd.、Macclesfield、U.K.)染色、ならびにニトロセルロースにブロットしたキメラBip 1 IgEの抗ヒトIgE抗体への曝露によって、キメラBip 1 IgEの純度、濃度および質を分析した。キメラBip 1は、190kDaの1本のバンドとして移動して分解した徴候は見られず、抗ヒトIgE抗体と反応した(データ示さず)。
【0016】
II.組換えタンパク質および精製タンパク質の125I標識
組換えカバノキ花粉アレルゲンrBet v 1[28]を既報[30]の通りにE.coliで発現させ、精製した。組換えバキュロウイルスで発現したヒトFcεRIのα鎖を精製した[17]。同程度の量(30μg)の精製タンパク質をクロラミンT法で125I標識し、Sephadex PD10カラム(Pharmacia)により精製した。放射能標識したタンパク質の比活性を、γカウンター中の等量のアリコートをγカウントして決定した(Wallach、Turku、Finland)。
【0017】
III.抗IgE抗体およびその断片
125I標識抗ヒトIgE抗体(RAST)はPharmacia&Upjohn(Uppsala、Sweden)から購入した。マウスモノクローナルIgG1抗カバノキプロフィリン抗体4A6は記述されている[31]。精製したIgE(ND)Fc0.5mlを腹腔内に注射してBalb/cマウスを免疫することにより、1パネル25個のマウス抗ヒトIgEモノクローナル抗体を産生させた。初回は、CFA(完全フロインドアジュバント)で希釈して、75μgを注射し、その後30、33および34日に生理食塩水で希釈して、50μgのブースター注射を実施した。SP2/0細胞系パートナー(cell line partner)と融合させることによってハイブリドーマを作製した。ハイブリドーマのクローニングを限界希釈法により実施した。目視検査(ocular inspection)で判定して単一細胞起源のウェルからの培地を、受動的に吸着させたIgE(ND)を含むポリスチレンの96ウェルフォーマットを用いてELISAにより試験した。アフィニティー精製したウサギ抗マウスIgG(Fc)を検出抗体として使用した。等電点電気泳動Phast System(Pharmacia Biotech、Uppsala、Sweden)およびBIAcoreでの測定(Biacore、Uppsala、Sweden)によって、クローン性およびマウスIgG1アイソタイプを決定した。回転ボトル中のDMEMの血清無添加培地中でmAb 12が産生した。得られた0.45μmフィルターろ過培地(Millipore、Molsheim、France)を含有するmAb 12を、FPLC Systemを用いて、10cm XK50プロテインA Sepharose 4FFカラム(Pharmacia Biotech、Uppsala、Sweden)で30cm/hの線流速で精製し、pH5.0の0.1Mクエン酸緩衝液で溶出させた。得られた、mAbを含むピークを、1.0M NaOHで中和し、PM 30フィルターの付いたAmicon限外ろ過セルで最終濃度5mg/mlに濃縮し、その後pH7.4の0.02Mリン酸緩衝食塩水で平衡にした100cmのXK50 Superdex 200 pgカラム(Pharmacia Biotech、Uppsala、Sweden)でのサイズ排除クロマトグラフィにかけた。純度は、SDS−PAGE、Phast System(Pharmacia Biotech、Uppsala、Sweden)による測定で95%を超えた。ImmunoPure Fab調製キット(Pierce、Rockford、IL)を用いてパパイン消化により、精製したmAb 12からFab 12を産生させた。Fab 12調製物の純度および分子量をSDS−PAGEで確認した。
【0018】
IV.抗IgE抗体のスクリーニング
キメラBip 1とα鎖の相互作用を阻害できる抗ヒトIgEモノクローナル抗体のスクリーニングを重層競合実験により実施した。1パネル25個のマウス抗ヒトIgEモノクローナル抗体と、対照の目的で、アイソタイプが一致しヒトIgEに対する特異性がないモノクローナル抗体4A6[31]、精製した組換えα鎖または緩衝液のみを、ニトロセルロースに結合したα鎖にキメラBip 1 IgEが結合するのを阻害できるかどうかについて試験した。50μg/mlの抗ヒトIgE抗体および対照試薬にキメラBip 1 IgEを4時間4℃で前もって吸収させ、次いで組換えα鎖が点在するニトロセルロースに4℃で終夜曝露した。膜を洗浄し、125I標識rBet v 1と共に終夜室温でインキュベーションして、結合したキメラBip 1 IgEを検出した。
【0019】
得られた遮断抗体の1つであるmAb 12およびmAb 12由来のFab断片は、独特な特性を示し、IgE−FcεRI相互作用を強く阻害し、α鎖ならびに好塩基球に結合したIgE抗体を認識した。
【0020】
V.免疫電子顕微鏡法
モノクローナル抗体および免疫複合体の免疫電子顕微鏡法による分析を、既報[32、33]の逆染色法により実施した。IgEは単独で観察され、また、全体またはmAb 12 F(ab’)2断片との複合物として観察された。mAb 12をペプシン−アガロース(Pierce)により終夜37℃で製造者の指示にしたがって消化した。HPLCによりF(ab’)2画分を他の消化産物から分離した。(各約1mg/mlの)反応物をホウ酸緩衝食塩水に混合し、室温で30分間インキュベートした。インキュベーション後、反応物をカーボン膜に結合させ、ギ酸ウラニルで染色し、銅グリッド上に載せて分析した。JEOL CX 1200電子顕微鏡で100,000倍の倍率で電子顕微鏡写真を撮影した。
【0021】
複合体を形成していないIgE分子の多くは、他の型の単量体Igに典型的な明瞭な3本腕の「Y」形配置を示さなかった(図1a)。これは、Fabの付いたIgEのFcが同様な配置を示した最近の報告[34]と一致する。mAb 12全体と混合すると、様々な小さな複合体、鎖および環が観察されたが、IgGプローブとIgE標的分子を区別することが困難なため解釈はできなかった(図示せず)。したがって、本発明者らはmAb 12をペプシンで消化してF(ab’)2断片を得た。IgEをモル過剰のF(ab’)2と混合すると、大部分の分子が、2対の長腕が2本または3本の短腕と直交する十字形の像を形成した(図1b)。等モルで混合すると、分子の鎖および、これより少ない頻度で分子の環が観察された(図1c)。より詳細に調べると、長腕はそれぞれ2つのセグメントからなることが判明した。本発明者らは、これらの画像が、IgEのFcの両側で分子の幾何的中央に極めて近い位置でエピトープと反応している2つのF(ab’)2抗IgE(図1bで横方向に位置する長腕および図1cの鎖の連結分子)を示していると解釈している。このことから、以前に報告されたIgEのモデルに基づいて、これらのエピトープがCε2−3連結(juncture)の近くに位置することになる。IgEの想定される3本の腕を明瞭に示す複合体は比較的少なかった(図1bおよび1c)。それよりも大部分の複合体が、図1bおよび1cに図示したように、1本の狭い腕(Fc)および近接しまたは部分的に互いに重なった一対の腕のように見えるもの(Fab)を示した。
【0022】
VI.ヒト好塩基球のトルイジンブルー/免疫蛍光複合染色
好塩基球に結合したIgEへの抗ヒトIgEモノクローナル抗体の結合を既報[35]のトルイジンブルーおよび間接免疫蛍光法を用いた二重染色技術によって分析した。抗ヒトIgEモノクローナル抗体E−124−2−8/Dε2(Immunotech、Marseille、France)、抗ヒトIgEモノクローナル抗体12、抗IL−3Rα(CD123)、モノクローナル抗体9F5(PharMingen、San Diego、CA)と、また、対照の目的で抗ヒトIgM抗体(PharMingen)または緩衝液のみと共に、2人の健常人ボランティアの末梢血から濃縮した単核細胞を4℃で30分間インキュベートした。インキュベーション後、単核細胞をリン酸緩衝食塩水で2回洗浄し、次いでフルオレセイン標識したヤギF(ab’)2抗マウスIgGに4℃で30分間曝露した。細胞を0.025%グルタルアルデヒド溶液で1分間固定し、トルイジンブルー(0.0125%)と室温で12分間インキュベートした。洗浄後、細胞を蛍光顕微鏡(Olympus、Vienna)で分析した。
【0023】
mAb 12は、ヒトIgEがFcεRIに結合するのを阻止するその能力、およびヒトIgEのFcεRI結合領域に対するその反応性にもかかわらず、α鎖および好塩基球に結合したIgE抗体を認識できたので、既報の抗ヒトIgE抗体(例えば、BSW17)[36、37]とは実質的に異なる。これに対する最も可能性が高い説明は、mAb 12がヒトIgEの受容体結合部位そのものまたはそのごく近傍と相互作用し、IgE−FcεRI相互作用の化学量論が1:1である[38、39]ためにIgE定常ドメインの1つに結合する一方、第2のドメインがα鎖と相互作用できるというものである。この仮説は、2通りの実験から得られた結果、すなわち、1)mAb 12由来のFabは、受容体に結合したIgEと反応しIgEが受容体に結合するのを阻止するにもかかわらずヒト好塩基球からのヒスタミンの遊離を誘導しなかった、2)逆染色免疫電子顕微鏡からmAb 12F(ab’)2がIgEのFcの両側のCε2−3連結近傍で結合したことが示されたことから支持される。
【0024】
VII.ヒスタミン遊離実験
ヒスタミン遊離実験を、抗ヒトIgE抗体E−124−2−8/Dε2(Immunotech、Marseille、France)、mAb 12ならびにFab 12を用いて、健常人ボランティアの末梢血多形核白血球(PMN)で実施した。PMNを、ヘパリン添加血液試料からDextran T70を用いて濃縮し[40]、洗浄し、ヒスタミン遊離用緩衝液(HRB)に再懸濁した。25mMトリス(pH=7.6)、5mM KCl、130mM NaClおよびヒト血清アルブミン0.33mg/mlを含有するHRBを使用して細胞を洗浄した。0.6mM Ca2+および1mM Mg2+を補給した同じ緩衝液をヒスタミン遊離実験に使用した。FcεRIに結合したIgE抗体が架橋することによって抗ヒトIgE抗体が好塩基球ヒスタミンの遊離を誘導できるかどうか、既報[40]のように、いくつかの濃度の抗ヒトIgE抗体に37℃で30分間PMNを曝し、遊離したヒスタミンを測定して試験した。抗IgEによって誘導されるヒスタミン放出に対する抗ヒトIgE抗体E−124−2−8/Dε2およびmAb 12の脱感作効果を、以下のように分析した[41]。簡潔に述べると、まず、PMNを、i)0.01M EDTAを含有するHRB、ii)0.01M EDTAおよびE−124−2−8/Dε2(1μg/ml)を含有するHRB、iii)0.01M EDTAおよびmAb 12(1μg/ml)を含有するHRB、またはiv)0.01M EDTAおよび抗ヒトIgM抗体(1μg/ml)(PharMingen)を含有するHRBのいずれかと共に37℃で10分間インキュベートした。次いで、細胞を洗浄し、HRBで希釈した異なる濃度のE−124−2−8/Dε2(0.01、0.1または1.0μg/ml)またはmAb 12(0.01、0.1または1.0μg/ml)と共に37℃で30分間インキュベートした。細胞を遠心分離し、細胞を含まない上清を回収した。細胞を含まない上清中に放出されたヒスタミンをラジオイムノアッセイ(Immunotech)で測定し、(細胞および細胞外の)総ヒスタミンに対する百分率として計算した。
【0025】
EDTA含有HRBで希釈したmAb 12またはE−124−2−8/Dε2と共に濃縮したヒト好塩基球をプレインキュベーションすると、IgEに依存する細胞のその後の活性化に対する脱感作が起きた(図2aおよび2b)。特に、続いてmAb 12またはE−124−2−8/Dε2のいずれかに曝露すると、HRBとEDTAのみで希釈したヒト好塩基球または対照抗ヒトIgM抗体を含有するHRBとEDTAで希釈したヒト好塩基球のプレインキュベーションよりも、ヒスタミン遊離応答が著しく減少した(図2aおよび2b)。EDTA含有HRBで希釈した抗ヒトIgE抗体と好塩基球のインキュベーションによってメディエイタが放出される可能性は、プレインキュベーション後に顆粒球から得られた培養上清中にヒスタミンが存在しないことから排除された(図示せず)。
【0026】
本発明者らは、精製抗ヒトIgEモノクローナル抗体(mAb 12またはE−124−2−8/Dε2)の濃度を増加させながらヒトPMNをインキュベートすると、mAb 12がE124−2−8/Dε2よりも極めて少ない(約50%の減少)ヒスタミン放出を誘導することを見出した(図3)。ヒトIgEがα鎖に結合するのを阻害し、α鎖に結合したIgEと反応したmAb 12由来のFabとまったく同じ調製物は、濃度5μg/mlまでヒスタミン放出を誘導しなかった(図3)。
【0027】
Fab 12は、IgE−FcεRI相互作用に対するやや低分子量の非アナフィラキシー性競合物質である。ヒト化フレームワーク領域を含有する組換えFab断片として生成されると、血中IgEと複合体を形成してそれを除去するためにrhuMAb−E25などのようにアトピー患者に投与することができる[23〜25、42]。既報の抗ヒトIgE抗体(rhuMAb−E25)[23〜25、42]と比べ、Fab 12は重要な利点を有すると本発明者らは考えている。すなわち、アナフィラキシー活性の欠如に加え、Fab 12は、FcεRIを介して好塩基球に結合しているIgE抗体と反応し、したがっておそらくFcεRIに結合したIgEを含有する肥満細胞、好酸球、および抗原提示細胞に結合しているIgE抗体とも反応する。したがって、Fab 12は、血中からIgE抗体を枯渇させるのに使用できるだけでなく、細胞レベルの治療介入のためにアトピーのエフェクター細胞および誘導細胞を標的とすることもできる。選択的体外血漿分離交換法に使用すると、Fab 12は患者へ投与することなくIgE抗体およびIgE保有細胞を枯渇させることができる[43]。
【0028】
VIII.アレルギー患者のヘパリン添加血液から精製したヒト好塩基球
アレルギー患者および非アトピー患者から採取したmAb 12ヘパリン添加血液試料を用いて全血から分離したIgE保有細胞を、PBS、0.1%BSAで1回洗浄し、mAb 12(10μg/ml)またはアイソタイプが同じ対照抗体(10μg/ml)と室温で30分間静かに撹拌しながらインキュベートした。前処理した細胞を800×gで15分間遠心分離して収集し、PBS、0.1%BSAで2回洗浄して結合していない抗体を除去した。DNAリンカーを介して付着しているヒト抗マウスIgGを含有するCELLection(商標) Dynabeads(Dynal、Hamburg、Germany)を製造者の指示に従って洗浄し、前処理した細胞と4℃で30分間転倒回転(end over end rotation)させてインキュベートした。ビーズと標的細胞の比は、少なくとも5:1であった。Dynal Magnetic Particle Concentrator(Dynal)により標的細胞を管壁に付着させ、上清を廃棄した。ロゼット細胞(rosetted cells)を2回PBS、0.1%BSAで洗浄した。最後の洗浄を行なった後、HEPES、L−グルタミン(Gibco BRL)および1%FCSを含み37℃に予熱されたRPMI 1640培地にロゼット細胞を静かに再分散させた。DNアーゼを含有する遊離用緩衝液(releasing buffer)(Dynal)を室温で20分間添加して細胞からビーズを除去した。試料中の細胞数を測定した後、サイトスピン調製物をギムザ染色して単離細胞を同定した。
【0029】
結果:ヒト好塩基球の1段精製に抗体12を使用することができる。IgE保有細胞を枯渇させるのに抗体12を使用できるかどうかを試験するために、アトピー患者由来のヘパリン添加血液試料を、抗体12、およびヒト抗マウスIgGを含むDynabeadsと共にインキュベートした。図4に例示するように、80%を超える純粋な好塩基球を1段精製操作でアトピー患者の血液から直接単離することができた。好塩基球に加え、少量の割合の他のIgE保有細胞(単球、リンパ球:図4および好酸球:図示せず)が同時精製された。図5の近接写真は精製した好塩基球を示す。
【0030】
IX.患者の血清のIgE濃度の減少
患者Aの全血清IgE濃度はCAP測定で12620kU/Lで、患者Bは1614kU/Lであった。CnBrで活性化されたSepharose 4Bに結合しているゲル体積10mlの抗体12を含むアフィニティーカラムに各血清50mlをかけた。血清をカラムにかけた後、患者Aの場合は全血清IgEが272kU/Lに減少し、患者Bの場合は12kU/Lに減少した。全IgEの測定値は、測定を2回繰返した結果である。これらの結果から、抗体12は、IgE濃度が高いアレルギー患者の血清/血漿から95%を超えるIgEを枯渇させることができると考えられる。
【0031】
【表1】
【図面の簡単な説明】
【0032】
【図1−1】電子顕微鏡写真。未反応キメラBip 1 IgE分子の一視野の電子顕微鏡写真(a)。過剰モル(b)または等モル(c)のmAb 12 F(ab’)2と複合体を形成したIgEの電子顕微鏡写真ギャラリーおよび解釈図である。(d)は過剰モルのmAb 12 F(ab’)2と反応したIgEである。IgE Fcの上向きのC末端領域を斑点を付けて示す。矢印は、タンパク質がZ軸方向で最も厚い領域を示す(d)。すべての図で、横棒は25nmに相当する。解釈図の白抜きの図形はIgE、塗り潰した図形はmAb 12 F(ab)2を表す。
【図1−2】電子顕微鏡写真。未反応キメラBip 1 IgE分子の一視野の電子顕微鏡写真(a)。過剰モル(b)または等モル(c)のmAb 12 F(ab’)2と複合体を形成したIgEの電子顕微鏡写真ギャラリーおよび解釈図である。(d)は過剰モルのmAb 12 F(ab’)2と反応したIgEである。IgE Fcの上向きのC末端領域を斑点を付けて示す。矢印は、タンパク質がZ軸方向で最も厚い領域を示す(d)。すべての図で、横棒は25nmに相当する。解釈図の白抜きの図形はIgE、塗り潰した図形はmAb 12 F(ab)2を表す。
【図2A】mAb 12はヒト好塩基球を脱感作することができる。濃縮した好塩基球を、mAb 12、E−124−2−8/Dε2、IgEとの反応性がない対照抗体(co−ab)または緩衝液単体とプレインキュベートした。次いで、細胞をいくつかの濃度のmAb 12(a)またはE−124−2−8/Dε2(b)(x軸)に曝した。y軸は、総ヒスタミンに対する遊離したヒスタミンの割合を示す。結果は3回繰返した平均である。
【図2B】mAb 12はヒト好塩基球を脱感作することができる。濃縮した好塩基球を、mAb 12、E−124−2−8/Dε2、IgEとの反応性がない対照抗体(co−ab)または緩衝液単体とプレインキュベートした。次いで、細胞をいくつかの濃度のmAb 12(a)またはE−124−2−8/Dε2(b)(x軸)に曝した。y軸は、総ヒスタミンに対する遊離したヒスタミンの割合を示す。結果は3回繰返した平均である。
【図3】Fab 12は、アナフィラキシー活性がない。抗ヒトIgEモノクローナル抗体(E−124−2−8/Dε2、ab12)およびFab 12(x軸)の濃度を増加させながら、ヒト好塩基球と共にインキュベートした。y軸は、総ヒスタミンに対する遊離ヒスタミンの百分率である。結果は2回繰返し測定の平均である。
【図4】アトピー患者の血液から抗体12を用いて精製した細胞のギムザ染色したサイトスピン試料である。図4は代表的な細胞調製物の全体像であり、図5は精製した好塩基球の近接写真である。
【図5】アトピー患者の血液から抗体12を用いて精製した細胞のギムザ染色したサイトスピン試料である。図4は代表的な細胞調製物の全体像であり、図5は精製した好塩基球の近接写真である。
Claims (10)
- a)IgE−FcεRI相互作用を阻害し、
b)遊離のIgEおよび細胞に結合しているIgEに結合し、かつ
c)アナフィラキシー性ではない
特性を有するIgG1アイソタイプの抗IgE Fab(抗体断片)。 - モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体に由来する請求項1に記載のFab。
- 合成または組換えによって製造される請求項1に記載のFab。
- ヒト化フレームワーク領域を含む組換えFabである請求項3に記載のFab。
- アトピー症状の治療用薬物を製造するための請求項1から4のいずれかに記載のFabの使用。
- アトピー症状が急性アトピー症状である請求項5に記載の使用。
- アトピー症状が慢性アトピー症状である請求項5に記載の使用。
- IgEおよびIgE保有細胞を血中から枯渇させる請求項5から7のいずれかに記載の使用。
- 使用が体外である請求項8に記載の使用。
- IgE保有細胞が細胞レベルでの治療介入の標的である請求項5から7のいずれかに記載の使用。
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