JP2005500806A - ＣｐＧに基づく免疫アゴニスト／免疫アンタゴニストの高スループットスクリーニングのためのプロセス - Google Patents

Abstract

本発明は、マウスＴＬＲ９およびマウス特異的アミノ酸を含む関連ＴＬＲ９、ならびにこれらのポリペプチドをコードする核酸に関する。本発明はまたマウスＴＬＲ９のフラグメントおよびマウスＴＬＲ９の生物学的に機能的な改変体を含む。本発はさらに、免疫刺激ＣｐＧ核酸のアゴニストおよびアンタゴニストについてのスクリーニング方法における、このようなマウスＴＬＲ９核酸およびマウスＴＬＲ９ポリペプチド、ならびに非マウスＴＬＲ９核酸および非マウスＴＬＲ９ポリペプチドなどを用いる方法に関する。マウスＴＬＲ９の発現または機能を阻害することによりマウスＴＬＲ９活性を阻害するマウスＴＬＲ９インヒビターもまた、含まれる。

Description

【０００１】
（関連出願）
本発明は、米国仮出願６０／２３３，０３５（２０００年９月１５日出願）；米国仮出願６０／２６３，６５７（２００１年１月２３日出願）；米国仮出願６０／２９１，７２６（２００１年５月１７日出願）；および米国仮出願６０／３００，２１０（２００１年６月２２日出願）の優先権を主張する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、免疫刺激核酸によるシグナル伝達に関する。
【０００３】
（発明の背景）
細菌ＤＮＡは、強力な免疫調節物質である。Ｙａｍａｍｏｔｏ Ｓら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３６：９８３−９９７（１９９２）。病原体由来のリガンドが、宿主の生得免疫応答および適応免疫応答を開始する未同定の病原体認識レセプターによって認識されるとの仮説が立てられている。Ｗａｇｎｅｒ Ｈ，Ａｄｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ７３：３２９−３６８（１９９９）。ＣｐＧモチーフを含有するオリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧ ＯＤＮ）は、細菌ＤＮＡの生物学を模倣し得る。Ｋｒｉｅｇ ＡＭら、Ｎａｔｕｒｅ ３７４：５４６−５４９（１９９５）。ＣｐＧ ＯＤＮおよびＤＮＡベクターは、近年、免疫刺激性の、造血特性およびアジュバント特性に起因して、臨床的な価値が示されている。
【０００４】
適応免疫系は、リコンビナーゼ活性化遺伝子（ＲＡＧ−１およびＲＡＧ−２）の前駆物を保有するトランスポゾンが、初期の顎のある脊椎動物の生殖細胞系に挿入された、約４億５０００万年前に現れた。Ａｇａｒｗａｌ Ａ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３９４：７４４（１９９８）。適応免疫応答を開始する能力によって、生物は、既に遭遇した病原を記憶することが可能となり、そして天然の選択によって、適応免疫応答が脊椎動物の実質的に普遍の特徴となった。しかし、このことによって、宿主防御の以前の形態である生得免疫系の放棄は導かれなかった。実際、この宿主防御の以前の形態は、同時刺激分子の発現を制御することによって、最初の適応免疫応答を刺激し、そしてこれを指向させるという、第２の機能をはたらくように選択される。
【０００５】
この１０年間、生得免疫系の細胞が、細菌病原体と関連する保存された分子パターンに対するレセプターを保有すると推定されている。このモデルに従って、病原体由来のタンパク質抗原がプロセスされ、そして特定のＴ細胞応答に対する刺激物として作用するペプチドとして提示される場合、抗原提示細胞上のパターン認識レセプター（ＰＲＲ）もまた、同時刺激分子、サイトカイン、およびケモカインの合成を誘導する。これらの活性化された抗原提示細胞は、全ての適応免疫応答に必須である抗原特異的Ｔ細胞を誘引し、かつこれを活性化するように作用する。Ｊａｎｅｗａｙ ＣＡＪ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ Ｑｕａｎｔ Ｂｉｏｌ ５４：１（１９８９）；Ｆｅａｒｏｎ ＤＴら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７２：５０（１９９６）；およびＭｅｄｚｈｉｔｏｖ Ｒら、Ｃｅｌｌ ９１：２９５（１９９７）。同時刺激を誘導し得る物質として、細菌リポ多糖（ＬＰＳ）、合成二本鎖ＲＮＡ、グリカンおよびマンナンが挙げられ得ることは公知であった。さらに、実験の証拠によって、Ｔ細胞に対するプロセスされた抗原リガンドが、同時刺激分子と同じ細胞上にあることが、示された。このことは、自己寛容を維持することに関して非常に重要なことであり；同時刺激分子の傍観者的な提示は、寛容が、感染が生じたときは必ず失われるということを意味する。
【０００６】
このモデルを検証するためには、病原体リガンドが結合した際に、同時刺激分子およびサイトカインの産生を導くシグナル伝達カスケードを開始する、細菌パターンに対するレセプターを同定する必要があった。マンノース結合タンパク質（ＭＢＰ）のような分子は、この役割について適任ではない。なぜなら、このような分子は、タンパク質分解カスケードを活性化するか、または食作用を促進するが、同時刺激を誘導することは知られていないからである。飛躍的な進歩によって、最初にｃＤＮＡとしてクローニングされ、そして後にｈＴＬＲ４（ヒトＴｏｌｌ様レセプター）と命名された、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｔｏｌｌのヒトホモログの同定がもたらされた。Ｍｅｄｚｈｉｔｏｖ Ｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３８８：３９４（１９９７）；Ｒｏｃｋ ＦＬら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９５：５８８（１９９８）；Ｃｈａｕｄｈａｒｙ ＰＭら、Ｂｌｏｏｄ ９１：４０２０−４０２７（１９９８）。
【０００７】
Ｔｏｌｌ様レセプター（ＴＬＲ）は、病原体認識および生得免疫系の活性化を促進する、生殖細胞系にコードされる膜貫通タンパク質のファミリーである。Ｈｏｆｆｍａｎｎ ＪＡら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８４、１３１３−１３１８（１９９９）；Ｒｏｃｋ ＦＬら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９５：５８８−５９３（１９９８）。ＴＬＲは、保存された病原体由来リガンドとかみ合い、そして引き続いてＴＬＲ／ＩＬ−１Ｒシグナル伝達経路を活性化して、種々のエフェクター遺伝子を誘導する。Ｍｅｄｚｈｉｔｏｖ Ｒら、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ ２：２５３−２５８（１９９８）；Ｍｕｚｉｏ Ｍら、Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １８７：２０９７−２１０１（１９９８）。
【０００８】
現在までに、１０個の異なる哺乳動物ＴＬＲが記載されている。Ｒｏｃｋ ＦＬら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９５：５８８−５９３（１９９８）；Ｃｈａｕｄｈａｒｙ ＰＭら、Ｂｌｏｏｄ ９１：４０２０−４０２７（１９９８）；Ｔａｋｅｕｃｈｉ Ｏら、Ｇｅｎｅ ２３１：５９−６５（１９９９）；Ａｄｅｒｅｍ Ａ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ４０６：７８２−７（２０００）。現在までに、遺伝子データによって、ＴＬＲが特有な機能を有し、かつ豊富には存在しないことが示唆されている。これらＴＬＲのほとんどに対するリガンドおよびこれらＴＬＲのほとんどの機能は、ＴＬＲ２およびＴＬＲ４以外、解明されるべきままである。
【０００９】
ＬＰＳ結合およびシグナル伝達レセプター複合体が、ＣＤ１４（グリコシル−ホスホイノシトールテイルによって細胞表面に保持された末梢膜タンパク質）に結合したＬＰＳとｈＴＬＲ４が相互作用する場合に、集合することが明らかとなっている。ＬＰＳ結合タンパク質（ＬＢＰ）の存在は、シグナル伝達をさらに増大させる。ｈＴＬＲ４タンパク質は、ＬＰＳと複合体化するＣＤ１４と相互作用するロイシンリッチ反復配列をその細胞外ドメインの中に有する。次いで、ＴＬＲ４は、膜を介してＬＰＳシグナルを伝達する。なぜなら、この遺伝子の破壊的な変異が、マウスにおいてＬＰＳ非応答性状態を導くからである。そしてこのことはまた、グラム陰性細菌のクリアランスにおいて欠損している。Ｐｏｌｔｏｒａｋ Ａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：２０８５（１９９８）；Ｑｕｒｅｓｈｉ ＳＴら、Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １８９：６１５−６２５（１９９９）；Ｅｄｅｎ ＣＳら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １４０：１８０（１９８８）。ヒトが、（ハエと同様に）多数のＴｏｌｌ様レセプター（ＴＬＲ）を有することが明らかになっている。
【００１０】
ＴＬＲ４および他のＴＬＲは、細胞質Ｔｏｌｌ／ＩＬ−１レセプター（ＴＩＲ）相同性ドメインを有する。このドメインは、ＴＩＲドメインの類似：類似相互作用によってＴＬＲ４と相互作用するアダプタータンパク質（ＭｙＤ８８）上の類似のドメインと通じる。次の相互作用は、そのそれぞれの「死のドメイン」と介する、アダプターとキナーゼとの間の相互作用である。このキナーゼは、次に、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）レセプター関連因子６（ＴＲＡＦ６）と相互作用する。Ｍｅｄｚｈｉｔｏｖ Ｒら、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ ２：２５３（１９９８）；Ｋｏｐｐ ＥＢら、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ １１：１５（１９９９）。ＴＲＡＦ６の後、２つの連続したキナーゼ活性化工程が、阻害タンパク質ＩκＢのリン酸化、およびＮＦ−κＢからのＩκＢの分離を導く。この最初のキナーゼは、ＮＦ−κＢ誘導キナーゼに対する、ＮＩＫとして公知の有糸***促進因子活性化キナーゼキナーゼキナーゼ（ＭＡＰＫＫＫ）である。このキナーゼの標的は、２つの鎖（ＩκＢキナーゼα（ＩＫＫα）およびＩκＢキナーゼβ（ＩＫＫβ）と称される）から構成される別のキナーゼであり、これは、ＩκＢをリン酸化するＩＫＫα：ＩＫＫβのヘテロダイマーを一緒に形成する。ＮＦ−κＢは核に転移し、そのプロモーターおよびエンハンサー中にκＢ結合部位を有する遺伝子（例えば、インターロイキン−１β（ＩＬ−１β）、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２のｐ４０タンパク質、ならびに同時刺激分子であるＣＤ８０およびＣＤ８６をコードする遺伝子）を活性化する。
【００１１】
ＣｐＧ ＤＮＡに応答するこの型の細胞（Ｂ細胞、樹状細胞（ＤＣ）およびマクロファージ）はまた、病原体由来のパターンを認識する他の因子（例えば、ＬＰＳ）によって刺激される。一般的に、生得免疫系のＰＲＲは、細胞表面上に位置し、この場所でＰＲＲはおそらく、微生物を最適に検出することができる。ＤＮＡに結合する細胞表面タンパク質は十分に記載され、そしてＣｐＧモチーフによって免疫活性化を媒介すると考えられている（Ｌｉａｎｇ Ｈら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ ９８：１１１９−１１２９（１９９８））が、この結合は、配列非依存的であり、そして細胞の活性化をもたらさない。Ｋｒｉｅｇ ＡＭら、Ｎａｔｕｒｅ ３７４：５４６−５４９（１９９５）；Ｙａｍａｍｏｔｏ Ｔら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３８：８３１−８３６（１９９４）；Ｈａｃｋｅｒ Ｈら、ＥＭＢＯ Ｊ １７：６２３０−６２４０（１９９８）。細胞取り込みを防ぐために固定化されたＣｐＧ ＯＤＮは非刺激性であるので（Ｋｒｉｅｇ ＡＭら、Ｎａｔｕｒｅ ３７４：５４６−５４９（１９９５）；Ｍａｎｚｅｌ Ｌら、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ ９：４５９−４６４（１９９９））、ＣｐＧ ＯＤＮはおそらく、細胞内レセプターに結合することによって作用するようである。この仮説の支持するものとして、ＯＤＮのエンドソーム酸性化／ＯＤＮのプロセシングを妨害するクロロキンのような薬物は、ＣｐＧ ＤＮＡの免疫刺激効果を特異的にブロックする。Ｈａｃｋｅｒ Ｈら、ＥＭＢＯ Ｊ １７：６２３０−６２４０（１９９８）；Ｍａｃｆａｒｌａｎｅ ＤＥら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６０：１１２２−１１３１（１９９８）；Ｙｉ ＡＫら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６０：４７５５−４７６１（１９９８）。エンドソーム工程は、ＣｐＧ誘導シグナル伝達経路に欠かせないと考えられている。Ｈａｃｋｅｒ Ｈら、ＥＭＢＯ Ｊ １７：６２３０−６２４０（１９９８）；Ｙｉ ＡＫら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６０：４７５５−４７６１（１９９８）。細菌ＤＮＡの非メチル化ＣｐＧモチーフ中に含まれる情報が遺伝子発現における変化をどのように誘発するかということは、これまでに明らかにされていない。
【００１２】
細菌ＤＭＡに対するレセプターが未知なので、直接的な結合分析を介した最適なＣｐＧモチーフについてのスクリーニングの開発は、制限されている。さらなる複雑化は、ＣｐＧ配列に対する種特異的選択性、すなわち、１つの種についての最適配列が、別の種について最適ではないかもしれない、ということである。
【００１３】
（発明の要旨）
マウスの３つのＴｏｌｌ様レセプター（Ｔｏｌｌ様レセプター７（ＴＬＲ７）、ＴＬＲ８、およびＴＬＲ９）をコードする核酸が、本発明者らによってここで同定され、単離され、クローニングされ、そして配列決定された。本発明は、一般的に、ＴＬＲをコードする単離された核酸分子およびこれらの核酸分子の単離されたフラグメント；単離されたＴＬＲポリペプチドおよびこれらのポリペプチドの単離されたフラグメント；上記の核酸分子を含む発現べベクター；上記の発現ベクターを有する宿主細胞；ＴＬＲポリペプチドおよびそのフラグメントを含む融合タンパク質；ならびに、これらのＴＬＲと相互作用する因子（特に、これらのＴＬＲ分子の発現を変更し、そしてこれらのＴＬＲ分子と関連するシグナル伝達を変更する、因子）を同定、比較、および最適化するのに有用なスクリーニング方法を提供する。好ましい実施形態において、スクリーニング方法は、高スループットのスクリーニング方法である。
【００１４】
本発明は、いくつかの局面において、ＴＬＲ９が、免疫刺激核酸（ＩＳＮＡ）誘導性の免疫刺激に関与するという驚くべき発見から生じている。本発明はまた、一部、ＴＬＲ９が、配列特異的様式および種特異的様式の両方で、ＩＳＮＡに応答した免疫活性化シグナルを変換するという驚くべき発見から生じている。
【００１５】
第一の局面において、本発明は、全長マウスＴＬＲ９をコードする単離された核酸分子を提供する。本発明のこの局面に従って、以下：（ａ）ストリンジェントな条件下で配列番号１に記載のヌクレオチド配列を有する核酸分子にハイブリダイズする、核酸分子であって、この核酸分子は、配列番号３に記載アミノ酸配列を有するマウスＴＬＲ９をコードする、核酸分子；（ｂ）遺伝暗号の縮重に起因して、コドン配列が（ａ）の核酸分子と異なる、核酸分子；ならびに（ｃ）（ａ）または（ｂ）の相補体、からなる群より選択される単離された核酸分子が提供される。特定の実施形態において、単離された核酸分子は、配列番号３をコードし、ここで、配列番号３は、全長マウスＴＬＲ９の推定アミノ酸配列を示す。いくつかの実施形態において、単離された核酸分子は、配列番号１または配列番号２のヌクレオチド配列を含み、ここで、これらは、それぞれ、マウスＴＬＲ９の全長ｃＤＮＡおよびオープンリーディングフレームに対応する。
【００１６】
本明細書中に使用される場合、用語「ストリンジェントな条件」は、塩、温度、有機溶媒、および必要に応じて当業者が精通する他の因子を含むパラメーターに基づく、組み合わせた条件をいう。核酸ハイブリダイゼーションパラメーターは、このような方法を編集する参考文献（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら、編、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８９、またはＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら、編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）中に見出され得る。より詳細には、本明細書中に使用される場合、ストリンジェントな条件は、例えば、ハイブリダイゼーション緩衝液（３．５×ＳＳＣ、０．０２％ Ｆｉｃｏｌｌ、０．０２％ ポリビニルピロリドン、０．０２％ ウシ血清アルブミン、２．５ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４（ｐＨ７）、０．５％ ＳＤＳ、２ｍＭ ＥＤＴＡ）中、６５℃でのハイブリダイゼーションをいう。ＳＳＣは、０．１５Ｍ 塩化ナトリウム／０．１５Ｍ クエン酸ナトリウム（ｐＨ７）であり；ＳＤＳは、ドデシル硫酸ナトリウムであり；そして、ＥＤＴＡは、エチレンジアミンテトラ酢酸である。ハイブリダイゼーション後、ＤＮＡが転写される膜は、室温にて２×ＳＳＣで洗浄され、次いで、室温から６８℃までにて０．１〜０．５×ＳＳＣ／０．１×ＳＤＳを用いて洗浄される。類似のストリンジェンシーの程度を生じる使用され得る他の条件、試薬などが、存在する。当業者はこのような条件に精通し、従ってこれらをここには提供しない。しかし、本発明のマウスＴＬＲ核酸の対立遺伝子の明らかな同定を可能にする様式で、当業者がこの条件を操作し得ることが、理解される。当業者はまた、後で慣用的に単離されるような分子の発現について細胞およびライブラリーをスクリーニングするための方法論、その後の適切な核酸分子の単離および配列決定に精通する。
【００１７】
第二の局面において、本発明は、単離されたＴＬＲ９ポリペプチドまたはそのフラグメントを提供する。単離されたＴＬＲ９ポリペプチドまたはそのフラグメントは、配列番号３のアミノ酸
【００１８】
【化４】

からなる群より選択されるマウスＴＬＲ９の少なくとも１つのアミノ酸を含み、ここで、このＴＬＲ９ポリペプチドまたはそのフラグメントは、マウスＴＬＲ９の少なくとも１つのアミノ酸以外はヒトＴＬＲ９ポリペプチドまたはそのフラグメントと同一であるアミノ酸配列を有する。本発明この局面に従う特定の実施形態において、ＴＬＲ９ポリペプチドまたはそのフラグメントはさらに、配列番号３のアミノ酸９４９、９７２、９７５、９７６、９９４、９９７、１０００、１００３、１００４、１０１０、１０１１、１０１８、１０２３、および１０２７からなる群より選択されるマウスＴＬＲ９の少なくとも１つのアミノ酸を含む。従って、詳細には、Ｃ末端９５アミノ酸およびそのフラグメントに限定されたＴＬＲ９フラグメントが、本発明の局面から除外される。
【００１９】
特定の実施形態において、本発明この局面に従うＴＬＲ９ポリペプチドおよびそのフラグメントは、上記の特定の部位における１つ以上の保存的アミノ酸置換によってのみヒトＴＬＲ９およびそのフラグメントと異なる、これらのＴＬＲ９ポリペプチドおよびそのフラグメントを除外する。当該分野で周知のように、「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸置換がなされたポリペプチドの相対的な電荷も大きさの特徴も一般的に変更しない、アミノ酸置換をいう。アミノ酸の保存的置換としては、代表的に、以下の群内のアミノ酸間でなされる置換が挙げられる：ミチオニン（Ｍ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、バリン（Ｖ）；フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、ヒスチジン（Ｈ）；アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；グルタミン（Ｑ）、アスパラギン（Ｎ）；ならびにグルタミン酸（Ｅ）、アスパラギン酸（Ｄ）。
【００２０】
本発明のこの局面および本発明の他の局面に従って、ＴＬＲ「ポリペプチドおよびそのフラグメント」を参照して、「そのフラグメント」は、少なくとも約８アミノ酸長である連続するアミノ酸残基のストレッチを有する、ポリペプチドフラグメントをいう。一般的に、このフラグメントは、少なくとも約１０アミノ酸長であり；より一般的には少なくとも１２アミノ酸長であり；しばしば、少なくとも約１４アミノ酸長であり；より頻繁には、少なくとも約１６アミノ酸長であり；代表的には少なくとも１８アミノ酸長であり；より代表的には、少なくとも２０アミノ酸長であり；通常、少なくとも２２アミノ酸長であり；そしてより通常では、少なくとも２４アミノ酸長である。特定の好ましい実施形態は、例えば、全長ＴＬＲポリペプチドまでのより長いフラグメント（例えば、少なくとも約３０アミノ酸長、少なくとも約４０アミノ酸長、少なくとも約５０アミノ酸長、少なくとも約１００アミノ酸長、少なくとも約２００アミノ酸長など）、および全長ＴＬＲポリペプチドよりも短い単一アミノ酸であるフラグメントを含む。
【００２１】
特定の実施形態において、ヒトＴＬＲ９は、配列番号６に記載アミノ酸配列を有する。
【００２２】
好ましい実施形態において、単離されたＴＬＲ９ポリペプチドまたはそのフラグメントは、配列番号３および配列番号３のフラグメントからなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。本発明のこの局面に従ういくつかの実施形態において、単離されたＴＬＲ９ポリペプチドまたはそのフラグメントは、上記のヒトＴＬＲ９ポリペプチドおよびマウスＴＬＲ９ポリペプチドの組み合わせを含む。
【００２３】
特定の好ましい実施形態において、単離されたＴＬＲ９ポリペプチドまたはそのフラグメントは、ＴＬＲ９の細胞質外ドメイン（本明細書中、細胞外ドメインとも称される）またはその一部である。本明細書中により詳細にさらに記載されるように、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８およびＴＬＲ９は、特定の構造ドメインおよび機能ドメインを有する。これらのＴＬＲの構造ドメインとしては、細胞質外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞質ドメインが挙げられるが、これらに限定されない。細胞質外ドメインは、エンドソーム／リソソーム小胞の内腔中に伸びる。細胞質ドメインとしては、Ｔｏｌｌ／インターロイキン１レセプター様ドメイン（Ｔｏｌｌ／ＩＬ−１Ｒドメイン、ＴＩＲ相同性ドメイン、またはＴＩＲドメインとも称される）が挙げられる。マウスＴＬＲ９において、細胞質外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞質ドメインは、それぞれ、アミノ酸１〜約８１９、約８２０〜約８３７、ならびに約８３８〜約１０３２に対応する。
【００２４】
上記のように、ＴＬＲ９が、当該分野で免疫刺激核酸（ＩＳＮＡ）（ＣｐＧ核酸を含む）と称される特定の核酸分子によって誘導される免疫活性化に関与するということが、本発明に従って発見された。ＩＳＮＡのＴＬＲ９への結合は、ＴＬＲ９のＴＩＲドメインを含むシグナル伝達を導くと、本発明者らによって考えられている。従って、本発明この局面に従う特定の実施形態において、単離されたＴＬＲ９ポリペプチドまたはそのフラグメントは、ＩＳＮＡ（ＣｐＧ核酸であるＩＳＮＡを含む）に選択的に結合する。
【００２５】
免疫刺激核酸（例えば、ＣｐＧ核酸）と相互作用すると本発明者らによって考えられている細胞質外ドメインの一部である、単離されたＴＬＲ９ポリペプチドまたはそのフラグメントもまた、本発明のこの局面に従って含まれる。特定の実施形態において、このような部分としては、配列番号１２６、１２７、２１０、および２１１のいずれか１つに記載のＭＢＤモチーフを含む。特定の実施形態において、本発明者らによって免疫刺激核酸と相互作用すると考えられている細胞質外ドメインの部分としては、配列番号１９６、１９７、および１９８のいずれか１つに記載のＣＸＸＣモチーフが挙げられる。
【００２６】
本発明の第三の局面に従って、上記の単離されたＴＬＲ９ポリペプチドまたはそのフラグメントをコードする単離された核酸分子が提供される。本発明のこの局面に従う単離された核酸分子は、詳細には、以下のＧｅｎＢａｎｋ登録番号：
【００２７】
【化５】

によって同定される特定の発現配列タグ（ＥＳＴ）を除外する。
【００２８】
第四の局面において、本発明は、全長マウスＴＬＲ７をコードする単離された核酸分子を提供する。本発明のこの局面に従って、以下：（ａ）ストリンジェントな条件下で配列番号１７３に記載のヌクレオチド配列を有する核酸分子にハイブリダイズする、核酸分子であって、この核酸分子は、配列番号１７５に記載アミノ酸配列を有するマウスＴＬＲ７をコードする、核酸分子；（ｂ）遺伝暗号の縮重に起因して、コドン配列が（ａ）の核酸分子と異なる、核酸分子；ならびに（ｃ）（ａ）または（ｂ）の相補体、からなる群より選択される単離された核酸分子が提供される。特定の実施形態において、単離された核酸分子は、配列番号１７５をコードし、ここで、配列番号１７５は、全長マウスＴＬＲ７の推定アミノ酸配列を示す。いくつかの実施形態において、単離された核酸分子は、配列番号１７３または配列番号１７４のヌクレオチド配列を含み、ここで、これらは、それぞれ、マウスＴＬＲ７の全長ｃＤＮＡおよびオープンリーディングフレームに対応する。
【００２９】
第五の局面において、本発明は、単離されたＴＬＲ７ポリペプチドまたはそのフラグメントを提供する。単離されたＴＬＲ７ポリペプチドまたはそのフラグメントは、配列番号１７５のアミノ酸
【００３０】
【化６】

からなる群より選択されるマウスＴＬＲ７の少なくとも１つのアミノ酸を含み、ここで、このＴＬＲ７ポリペプチドまたはそのフラグメントは、マウスＴＬＲ７の少なくとも１つのアミノ酸以外はヒトＴＬＲ７ポリペプチドまたはそのフラグメントと同一であるアミノ酸配列を有する。
【００３１】
特定の実施形態において、本発明のこの局面に従うＴＬＲ７ポリペプチドおよびそのフラグメントは、上記の特定の部位における１つ以上の保存的アミノ酸置換によってのみヒトＴＬＲ７およびそのフラグメントと異なる、これらのＴＬＲ７ポリペプチドおよびそのフラグメントを除外する。
【００３２】
特定の実施形態において、ヒトＴＬＲ７は、配列番号１７０に記載アミノ酸配列を有する。
【００３３】
好ましい実施形態において、単離されたＴＬＲ７ポリペプチドまたはそのフラグメントは、配列番号１７５および配列番号１７５のフラグメントからなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。本発明のこの局面に従ういくつかの実施形態において、単離されたＴＬＲ７ポリペプチドまたはそのフラグメントは、上記のヒトＴＬＲ７ポリペプチドおよびマウスＴＬＲ７ポリペプチドの組み合わせを含む。
【００３４】
特定の好ましい実施形態において、単離されたＴＬＲ７ポリペプチドまたはそのフラグメントは、ＴＬＲ７の細胞質外ドメインまたはその一部である。本発明のこの局面による特定の実施形態において、単離されたＴＬＲ７ポリペプチドまたはそのフラグメントは、ＩＳＮＡ（ＣｐＧ核酸であるＩＳＮＡを含む）に選択的に結合する。本発明のこの局面によれば、ＣｐＧ核酸のような免疫刺激核酸と相互作用すると本発明者らが考える細胞質外ドメインの一部である、単離されたＴＬＲ７ポリペプチドまたはそのフラグメントもまた含まれる。特定の実施形態において、このような部分は、配列番号２０３、配列番号２０４、配列番号２１２、および配列番号２１３のいずれか１つに記載のＭＢＤモチーフを含む。特定の実施形態において、免疫刺激核酸と相互作用すると本発明者らが考える細胞質外ドメインの部分は、配列番号１９６、配列番号１９９、および配列番号２００のいずれか１つに記載のＣＸＸＣモチーフを含む。
【００３５】
本発明の第六の局面によれば、上記単離されたＴＬＲ７ポリペプチドまたはそのフラグメントをコードする、単離された核酸分子が提供される。本発明のこの局面による、単離された核酸分子は、以下のＧｅｎＢａｎｋ登録番号によって同定される、特定のＥＳＴを特に排除する：
【００３６】
【化７】

本発明の第七の局面において、本発明は、マウス全長ＴＬＲ８をコードする、単離された核酸分子を提供する。本発明のこの局面によれば、以下からなる群より選択される単離された核酸分子が提供される：（ａ）配列番号１９０に記載のヌクレオチド配列を有する核酸分子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、そして配列番号１９２に記載のアミノ酸配列を有するマウスＴＬＲ８をコードする、核酸分子；（ｂ）遺伝コードの縮重に起因して、コドン配列が（ａ）の核酸分子と異なる核酸分子；および（ｃ）（ａ）または（ｂ）の相補体。特定の実施形態において、単離された核酸分子は、配列番号１９２をコードし、ここで配列番号１９２は、マウス全長ＴＬＲ８の推定アミノ酸配列を表す。いくつかの実施形態において、単離された核酸分子は、配列番号１９０または配列番号１９１のヌクレオチド配列を含み、ここでこれらは、マウスＴＬＲ８の全長ｃＤＮＡおよびオープンリーディングフレームにそれぞれ対応する。
【００３７】
本発明は、第八の局面において、単離されたＴＬＲ８ポリペプチドまたはそのフラグメントを提供する。単離されたＴＬＲ８ポリペプチドまたはそのフラグメントは、配列番号１９２のアミノ酸：
【００３８】
【化８】

からなる群より選択されるマウスＴＬＲ８の少なくとも１つのアミノ酸を含み、ここで、ＴＬＲ８ポリペプチドまたはそのフラグメントは、このマウスＴＬＲ８の少なくとも１つのアミノ酸を除いて、ヒトＴＬＲ８ポリペプチドと同一のアミノ酸配列を有する。
【００３９】
特定の実施形態において、本発明によるＴＬＲ８ポリペプチドおよびそのフラグメントは、上記特定の部位において、１つ以上の保存的アミノ酸置換のみによって、ヒトＴＬＲ８およびそのフラグメントと異なる、ＴＬＲ８ポリペプチドおよびそのフラグメントを排除する。
【００４０】
特定の実施形態において、ヒトＴＬＲ８は、配列番号１８４に記載のアミノ酸配列を有する。
【００４１】
好ましい実施形態において、単離されたＴＬＲ８ポリペプチドまたはそのフラグメントは、配列番号１９２および配列番号１９２のフラグメントからなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。本発明のこの局面によるいくつかの実施形態において、単離されたＴＬＲ８ペプチドまたはそのフラグメントは、上記ヒトＴＬＲ８ポリペプチドとマウスＴＬＲ８ポリペプチドとの組み合わせを含む。
【００４２】
特定の好ましい実施形態において、単離されたＴＬＲ８ポリペプチドまたはそのフラグメントは、ＴＬＲ８の細胞質外ドメインまたはその一部である。本発明のこの局面による特定の実施形態において、単離されたＴＬＲ８ポリペプチドまたはそのフラグメントは、ＩＳＮＡ（ＣｐＧ核酸であるＩＳＮＡを含む）と特異的に結合する。本発明のこの局面によれば、ＣｐＧ核酸のような免疫刺激核酸と相互作用すると本発明者らが考える細胞質外ドメインの一部である、単離されたＴＬＲ８ポリペプチドまたはそのフラグメントもまた含まれる。特定の実施形態において、このような部分は、配列番号２０５、配列番号２０６、配列番号２１４、および配列番号２１５のいずれか１つに記載のＭＢＤモチーフを含む。特定の実施形態において、免疫刺激核酸と相互作用すると本発明者らが考える細胞質外ドメインの部分は、配列番号１９６、配列番号２０１、および配列番号２０２のいずれか１つに記載のＣＸＸＣモチーフを含む。
【００４３】
本発明の第九の局面によれば、上記単離されたＴＬＲ８ポリペプチドまたはそのフラグメントをコードする、単離された核酸分子が提供される。本発明のこの局面による、単離された核酸分子は、以下のＧｅｎＢａｎｋ登録番号によって同定される、特定のＥＳＴを特に排除する：
【００４４】
【化９】

さらなる局面において、本発明は、プロモーターに作動可能に結合した、上記単離された核酸分子を含む、ＴＬＲ発現ベクターを提供する。従って、ＴＬＲ９に関する特定の実施形態において、この発現ベクターは、プロモーターに作動可能に結合した、本発明の第一の局面または第三の局面による、単離された核酸分子を含む。ＴＬＲ７に関する他の実施形態において、この発現ベクターは、プロモーターに作動可能に結合した、本発明の第四の局面または第六の局面による、単離された核酸分子を含む。ＴＬＲ８に関するなお他の実施形態において、この発現ベクターは、プロモーターに作動可能に結合した、本発明の第七の局面または第九の局面による、単離された核酸分子を含む。
【００４５】
本発明のこの局面による発現ベクターは、これらが適切な条件下で細胞に組み込まれる場合に、組み込まれた単離された核酸分子によってコードされる遺伝子産物の発現を指向するように、設計および構築される。例えば、プロモーターは、構成的に活性であり得るか、またはこのプロモーターは、適切な誘発因子化合物もしくは抑制因子化合物との相互作用の際に、誘導性または抑制性であり得る。
【００４６】
別の局面によれば、本発明のＴＬＲ発現ベクターを含む宿主細胞が提供される。任意の適切な方法が使用され得るが、発現ベクターは、代表的に、トランスフェクションまたは形質転換によって、細胞に導入される。ＴＬＲ発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞は、いくつかの実施形態において、別のポリペプチドの発現のために有用な別の発現ベクターと、同時形質転換または同時トランスフェクトされる。あるいは、宿主細胞は、本発明のＴＬＲポリペプチドまたはそのフラグメント、ならびに（ｉ）少なくとも１つのさらなるＴＬＲポリペプチドまたはそのフラグメント、あるいは（ｉｉ）少なくとも１つの非ＴＬＲポリペプチドまたはそのフラグメントの発現を指向し得る発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされ得る。特定の好ましい実施形態において、この宿主細胞は、ＴＬＲ７ ＴＬＲ８、およびＴＬＲ９の任意の組み合わせに対する別個の発現ベクターを含む。いくつかの実施形態において、同時形質転換または同時トランスフェクトされた発現ベクターは、ＴＬＲ発現またはＴＬＲ関連シグナル伝達の検出または調節のために、有用であり得る。具体的には、特定の好ましい実施形態において、この宿主細胞は、ＴＩＲドメインと相互作用し得るレポーター構築物を提供する発現ベクターを含む。
【００４７】
別の局面において、本発明は、本発明の単離されたＴＬＲポリペプチドおよびそのフラグメントを選択的に結合する薬剤を提供する。特定の実施形態において、この薬剤は、ヒトＴＬＲポリペプチドまたはそのフラグメントに結合せず、ここでヒトＴＬＲは、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、およびＴＬＲ９から選択される。特定の実施形態において、この薬剤はポリペプチドであり、好ましくは、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、Ｆａｂ抗体フラグメント、Ｆ（ａｂ’）_２抗体フラグメント、Ｆｖ抗体フラグメント、ＣＤＲ３領域を含む抗体フラグメント、および融合タンパク質、ならびに任意のこのような抗体または抗体フラグメントを含む、他のポリペプチドからなる群より選択されるポリペプチドである。
【００４８】
上記単離された核酸分子を選択的に結合する薬剤もまた、提供され、この核酸分子は、好ましくは、ＴＬＲポリペプチドまたはそのフラグメントをコードする、上記単離された核酸分子のいずれ環選択的に結合する、アンチセンス核酸分子である。いくつかの実施形態において、この薬剤は、本発明の第一、第三、第四、第五、第六、および第八の局面のいずれかによって提供される単離された核酸分子に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、単離された核酸分子である。特定の好ましい実施形態において、この薬剤は、本発明の第一、第三、第四、第五、第六、および第八の局面のいずれかによって提供される単離された核酸分子に相補的なヌクレオチド配列を有する、単離された核酸分子である。
【００４９】
本発明のなお他の局面において、細胞においてＴＬＲ発現およびＴＬＲシグナル伝達を阻害するための方法が、提供される。この方法は、この細胞を、この細胞におけるＴＬＲ発現およびＴＬＲシグナル伝達を阻害するに効果的な量の薬剤と接触させる工程を包含し、ここで、このＴＬＲは、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、およびＴＬＲ９からなる群より選択される。いくつかの実施形態において、この細胞と接触される薬剤は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、Ｆａｂ抗体フラグメント、Ｆ（ａｂ’）_２抗体フラグメント、Ｆｖ抗体フラグメント、ＣＤＲ３領域を含む抗体フラグメント、および融合タンパク質、ならびに任意のこのような抗体または抗体フラグメントを含む、他のポリペプチドからなる群より選択される。いくつかの実施形態において、この細胞は、ＴＬＲに対して特異的なアンチセンス核酸と、この細胞におけるＴＬＲ発現を阻害するために効果的な量で接触される。いくつかの実施形態において、この細胞は、サイトカインまたは低分子のような薬剤と、この細胞におけるＴＬＲ発現を阻害するために効果的な量で接触される。
【００５０】
なお別の局面において、本発明は、ＴＬＲポリペプチドまたはそのフラグメントと相互作用する核酸分子を同定するための方法を提供する。この方法は、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、およびその核酸結合フラグメントからなる群より選択されるＴＬＲポリペプチドを、試験核酸分子と接触させる工程；ならびにこの試験核酸分子とＴＬＲポリペプチドまたはそのフラグメントとの相互作用を測定する工程を包含する。ＴＬＲの核酸結合フラグメントは、好ましくは、細胞質外ドメインまたはそのサブ部分（例えば、少なくともＭＢＤモチーフまたはＣＸＸＣモチーフ、あるいはＭＢＤモチーフとＣＸＸＣモチーフとの両方を含むもの）を含む。
【００５１】
ＴＬＲポリペプチドおよびそのフラグメントの使用方法に関する、本発明のこの局面および他の局面において、いくつかの実施形態において、ＴＬＲポリペプチドまたはそのフラグメントは、ＴＬＲ７である。同様に、ＴＬＲポリペプチドおよびそのフラグメントの使用方法に関する、本発明のこの局面および他の局面において、いくつかの実施形態において、ＴＬＲポリペプチドまたはそのフラグメントは、ＴＬＲ８である。また、ＴＬＲポリペプチドおよびそのフラグメントの使用方法に関する、本発明のこの局面および他の局面において、いくつかの実施形態において、ＴＬＲポリペプチドまたはそのフラグメントは、ＴＬＲ９である。
【００５２】
ＴＬＲポリペプチドおよびそのフラグメントの使用方法に関する、本発明のこの局面および他の局面において、いくつかの実施形態において、ＴＬＲポリペプチドまたはそのフラグメントは、細胞において発現される。ＴＬＲポリペプチドまたはそのフラグメントを発現する細胞は、ＴＬＲポリペプチドまたはそのフラグメントを天然に発現し得るか、あるいは本発明の他の局面によって提供されるような宿主細胞であり得る。
【００５３】
ＴＬＲポリペプチドおよびそのフラグメントの使用方法を包含する、本発明のこの局面および他の局面において、いくつかの実施形態において、ＴＬＲポリペプチドまたはそのフラグメントは、単離されたＴＬＲポリペプチドまたはそのフラグメントである。特定の好ましい実施形態において、この単離されたＴＬＲポリペプチドまたはそのフラグメントは、固体支持体（例えば、マルチウェルプレート、スライド、ＢＩＡｃｏｒｅチップ、ビーズ、カラムなど）に固定されている。この固定は、本発明の方法によって実施されるアッセイの目的に適切な、任意の化学的方法または物理的方法によって、達成され得る。
【００５４】
特定の実施形態において、ＴＬＲポリペプチドまたはそのフラグメントは、抗体のＦｃフラグメントと融合している。このような融合分子のＦｃフラグメント部分は、例えば、ＴＬＲポリペプチドまたはそのフラグメントを基質に付着させるため、あるいはＴＬＲポリペプチドまたはそのフラグメントの存在を検出するための標的を提供するために、有用であり得る。Ｆｃフラグメントは、任意の適切な脊椎動物種から選択され得、そして代表的に、ＩｇＧクラスの抗体に属する抗体由来であるが、このことは必須ではない。例えば、Ｆｃは、ヒトＦｃγまたはマウスＦｃγであり得る。特定の実施形態において、ＴＬＲポリペプチドまたはそのフラグメントは、ＴＬＲポリペプチドまたはそのフラグメントとＦｃフラグメントとの間の接合部またはその近くに特異的な切断部位を伴って、抗体のＦｃフラグメントと融合する。１つの好ましい実施形態において、この切断部位は、トロンビンプロテアーゼ認識部位である。好ましい実施形態において、Ｆｃフラグメントと融合したＴＬＲポリペプチドまたはそのフラグメントは、ＴＬＲ細胞質外ドメインを含む。
【００５５】
特定の実施形態において、ＴＬＲポリペプチドまたはそのフラグメントおよび試験核酸分子が関与する相互作用は、ＴＬＲポリペプチドまたはそのフラグメントと、試験核酸分子との間の結合である。
【００５６】
本発明のこの局面による特定の実施形態において、この測定は、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、生体分子相互作用アッセイ（ＢＩＡ）、電気移動性シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）、およびウェスタンブロットからなる群より選択される方法によって達成される。
【００５７】
特定の実施形態において、この測定は、ＴＬＲシグナル伝達経路によって媒介される応答を測定する工程を包含する方法によって、達成される。例えば、ＴＬＲシグナル伝達毛色によって媒介される応答は、ＮＦ−κＢプロモーターの制御下での遺伝子の誘導、およびサイトカインの分泌からなる群より選択され得る。特定の好ましい実施形態において、ＮＦ−κＢプロモーターの制御下にある遺伝子は、ＩＬ−８、ＩＬ−１２ ｐ４０、ＮＦ−κＢ−ｌｕｃ、ＩＬ−１２ ｐ４０−ｌｕｃ、およびＴＮＦ−ｌｕｃからなる群より選択される。特定の好ましい実施形態において、分泌されるサイトカインは、ＩＬ−８、ＴＮＦ−α、およびＩＬ−１２ ｐ４０からなる群より選択される。
【００５８】
別の実施形態において、本発明のこの局面による方法は、試験核酸分子が免疫刺激性核酸であるか否かを決定するために使用され得る。この方法は、（ａ）試験核酸分子の存在下で測定される場合の、ＴＬＲシグナル伝達経路によって媒介される応答と、（ｂ）試験核酸分子の非存在下で測定される場合の、ＴＬＲシグナル伝達経路によって媒介される応答とを比較する工程；および（ａ）が（ｂ）を超える場合に、この試験核酸分子が免疫刺激的核酸であると決定する工程を、さらに包含する。
【００５９】
なお別の実施形態において、本発明のこの局面による方法は、試験核酸分子に対する応答が、参照核酸分子に対する応答より強いか弱いかを決定するために、使用され得る。この方法は、この応答を、ＴＬＲポリペプチドが参照核酸分子に独立して接触された場合の参照応答と比較する工程；およびこの応答が参照応答より強いか弱いかを決定する工程を、さらに包含する。この実施形態において、この試験核酸分子および参照核酸分子は、競合も相互作用も起こし得ない。例えば、参照応答は、並行コントロールまたは歴史的コントロールであり得る。
【００６０】
別の実施形態において、この方法は、この応答を、ＴＬＲポリペプチドが参照核酸分子と並行的に接触される場合の参照応答と比較する工程；およびこの応答が参照応答より強いか弱いかを決定する工程を、さらに包含する。この実施形態において、試験核酸分子および参照核酸分子は、潜在的に、競合または相互作用し得る。なぜならこれらは、たとえば単一の反応において、両方が存在するからである。
【００６１】
別の局面において、本発明は、免疫刺激的核酸を同定するためのスクリーニング方法を提供する。この局面による方法は、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、およびＴＬＲ９からなる群より選択される機能的ＴＬＲを、試験核酸分子と接触させる工程；この機能的ＴＬＲと試験核酸分子との間の相互作用の結果として発生する、試験核酸分子の存在下での、ＴＬＲシグナル伝達経路によって媒介される応答の存在または非存在を決定する工程；およびＴＬＲシグナル媒介経路によって媒介される応答の存在が検出される場合に、その試験核酸分子がＩＳＮＡであると決定する工程を包含する。機能的ＴＬＲとは、リガンドと結合し得、そしてこの結合の結果として、少なくとも１つの工程またはさらなるポリペプチドが、このＴＬＲシグナル伝達経路に関与する、ＴＬＲポリペプチドまたはそのフラグメントをいう。
【００６２】
１つの実施形態において、本発明のこの局面による方法は、（ａ）機能的ＴＬＲと試験核酸分子との間の相互作用の結果として生じる、ＴＬＲシグナル伝達経路によって媒介される応答と、（ｂ）機能的ＴＬＲと参照ＩＳＮＡとの間の相互作用の結果として生じる応答とを比較する、さらなる工程を包含する。本発明のこのスクリーニングアッセイおよび他のスクリーニングアッセイにおいて、好ましい実施形態において、このスクリーニング方法は、複数の試験核酸に対して実施される。特定の好ましい実施形態において、ＴＬＲシグナル伝達経路によって媒介される応答は、定量的に測定され、そしてＴＬＲシグナル伝達経路によって媒介される、複数の試験核酸分子の各々に付随する応答は、機能的ＴＬＲと参照ＩＳＮＡとの間の相互作用の結果として生じる応答と比較される。
【００６３】
特定の好ましい実施形態において、複数の試験核酸分子のサブセットは、そのサブセットが、ＴＬＲシグナル伝達経路によって媒介される特異的応答を生じる能力に基づいて、選択される。例えば、特定の応答は、特定のサイトカインまたはサイトカインのパネル（例えば、Ｔｈ１サイトカイン）の誘導、あるいは特定のサイトカインまたはサイトカインのパネル（例えば、Ｔｈ２サイトカイン）の阻害であり得る。特定の応答は、特定のクラスまたはサブクラスの抗体、あるいは抗体のクラスまたはサブクラスのパネル（例えば、Ｔｈ１関連抗体またはＴｈ２関連抗体）の、誘導あるいは阻害であり得る。いくつかの実施形態における特異的応答は、特定の型の免疫細胞（例えば、Ｂ細胞、樹状細胞（ＤＣ）、およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞）の活性化または阻害であり得る。いくつかの実施形態において、特異的応答は、特定の型の免疫細胞（例えば、Ｂ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、樹状細胞、単球／マクロファージ）の増殖の誘導または阻害であり得る。従って、複数の試験核酸のサブセットは、このサブセットの試験核酸と、ＴＬＲシグナル伝達経路によって媒介される応答の特定の型との間の、共通の関連に基づいて、選択される。ＴＬＲシグナル伝達経路によって媒介される応答の特定の型は、代表的に、免疫細胞応答であるが、このことは必須ではない。
【００６４】
特定の実施形態において、ＴＬＲシグナル伝達経路によって媒介される応答は、ＮＦ−κＢプロモーターの制御下にある遺伝子の誘導、およびサイトカインの分泌からなる群より選択される。特定の好ましい実施形態において、ＮＦ−κＢプロモーターの制御下にある遺伝子は、ＩＬ−８、ＩＬ−１２ ｐ４０、ＮＦ−κＢ−ｌｕｃ、ＩＬ−１２ ｐ４０−ｌｕｃ、およびＴＮＦ−ｌｕｃからなる群より選択される。特定の好ましい実施形態において、サイトカインは、ＩＬ−８、ＴＮＦ−α、およびＩＬ−１２ ｐ４０からなる群より選択される。
【００６５】
特定の好ましい実施形態において、参照ＩＳＮＡは、ＣｐＧ核酸である。
【００６６】
特定の好ましい実施形態において、試験核酸分子は、ＣｐＧ核酸である。
【００６７】
機能的ＴＬＲがスクリーニングアッセイに関与する本発明のこの局面および他の局面によれば、いくつかの実施形態において、この機能的ＴＬＲは、細胞において発現される。いくつかの実施形態において、この機能低ＴＬＲは、細胞によって天然に発現される。特定の好ましい実施形態において、この細胞は、機能的ＴＬＲを天然に発現する、単離された哺乳動物細胞である。細胞がＴＬＲを天然に発現するのであっても、細胞が、プロモーターに作動可能に結合したＴＬＲをコードする単離された核酸分子を有する、ＴＬＲを発現するベクターが、この細胞に導入されたことに起因して発現するのであっても、いくつかの実施形態において、この細胞はさらに、プロモーターに作動可能に連結した、ＩＬ−８、ＩＬ−１２ ｐ４０、ＮＦ−κＢ−ｌｕｃ、ＩＬ−１２ ｐ４０−ｌｕｃ、およびＴＮＦ−ｌｕｃからなる群より選択されるレセプターをコードする単離された核酸分子を含む発現ベクターを、さらに含む。
【００６８】
また、機能的ＴＬＲがスクリーニングアッセイに関与する、本発明のこの局面および他の局面によれば、特定の実施形態において、この機能的ＴＬＲは、無細胞系の一部である。
【００６９】
また、機能的ＴＬＲがスクリーニングアッセイに関与する、本発明のこの局面および他の局面によれば、特定の実施形態において、この機能的ＴＬＲは、別のＴＬＲとの複合体の一部である。特定の好ましい実施形態において、この複合体は、ＴＬＲ９とＴＬＲ７との複合体である。特定の好ましい実施形態において、この複合体は、ＴＬＲ９とＴＬＲ８との複合体である。
【００７０】
また、機能的ＴＬＲがスクリーニングアッセイに関与する、本発明のこの局面および他の局面によれば、特定の実施形態において、この機能的ＴＬＲは、ＭｙＤ８８、ＩＲＡＫ、ＴＲＡＦ６、ＩκＢ、ＮＦ−κＢ、ならびにその機能的ホモログおよび誘導体からなる群より選択される非ＴＬＲとの、複合体の一部である。
【００７１】
さらに、機能的ＴＬＲがスクリーニングアッセイに関与する、本発明のこの局面および他の局面によれば、特定の実施形態において、ＴＬＲシグナル伝達経路によって媒介される応答は、ＮＦ−κＢプロモーターの制御下での遺伝子の誘導、およびサイトカインの分泌からなる群より選択される。
【００７２】
また、機能的ＴＬＲがスクリーニングアッセイに関与する、本発明のこの局面および他の局面によれば、特定の実施形態において、ＮＦ−κＢプロモーターの制御下にある遺伝子は、ＩＬ−８、ＩＬ−１２ ｐ４０、ＮＦ−κＢ−ｌｕｃ、ＩＬ−１２ ｐ４０−ｌｕｃ、およびＴＮＦ−ｌｕｃからなる群より選択される。
【００７３】
また、機能的ＴＬＲがスクリーニングアッセイに関与する、本発明のこの局面および他の局面によれば、特定の実施形態において、分泌されるサイトカインは、ＩＬ−８、ＴＮＦ−α、およびＩＬ−１２ ｐ４０からなる群より選択される。
【００７４】
さらなる局面において、本発明は、試験化合物のＴＬＲシグナル伝達活性を、ＩＳＮＡと比較するための、スクリーニング方法を提供する。この方法は、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、およびＴＬＲ９からなる群より選択される機能的ＴＬＲを、参照ＩＳＮＡと接触させる工程、ならびにＴＬＲシグナル伝達経路によって媒介される参照応答を検出する工程；ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、およびＴＬＲ９からなる群より選択される機能的ＴＬＲを、試験化合物と接触させる工程、ならびにＴＬＲシグナル伝達経路によって媒介される参照応答を検出する工程；ならびにこの試験応答を参照応答と比較して、試験化合物のＴＬＲシグナル伝達活性をＩＳＮＡと比較する工程を包含する。
【００７５】
本発明のこの局面による特定の実施形態において、参照ＩＳＮＡは、ＣｐＧ核酸である。
【００７６】
本発明のこの局面による特定の実施形態において、試験化合物は、ポリペプチドである。特定の実施形態において、試験化合物は、化合物のコンビナトリアルライブラリーの一部である。
【００７７】
特定の実施形態において、機能的ＴＬＲは、参照ＩＳＮＡおよび試験化合物と、独立して接触される。従って、特定の実施形態において、このスクリーニング方法は、ＩＳＮＡ模倣物を同定するための方法であり、そして試験応答が、参照ＩＳＮＡを用いて得られた参照応答と類似している場合には、その試験化合物はＩＳＮＡ模倣物であると決定される。試験応答と参照応答とが、定量的に類似しない場合でさえも、定性的に類似である場合に、試験応答は、参照応答に類似である。従って、例えば、試験応答および参照応答は、両方の応答がＴｈ−１様免疫応答の誘導を含む場合に、類似であるとみなされる。試験応答は、参照応答より定性的に低いか、およそ同じであるか、またはより大きくあり得る。
【００７８】
特定の他の実施形態において、機能的ＴＬＲは、参照ＩＳＮＡおよび試験化合物と接触されて、ＴＬＲシグナル伝達経路によって媒介される試験−参照応答を連続的に発生させ、ここで、試験−参照応答は、参照応答と比較され得る。特定の好ましい実施形態において、このスクリーニング方法は、ＩＳＮＡアゴニストを同定するための方法であり、ここで、試験−参照応答が参照応答より大きい場合には、その試験化合物は、ＩＳＮＡアゴニストである。特定の好ましい実施形態において、このスクリーニング方法は、ＩＳＮＡアンタゴニストを同定するための方法であり、ここで、試験−参照応答が参照応答より小さい場合には、その試験化合物は、ＩＳＮＡアンタゴニストである。
【００７９】
さらなる局面において、本発明は、ＩＳＮＡに特異的な種を同定するためのスクリーニング方法を提供する。本発明のこの局面による方法は、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、およびＴＬＲ９からなる群より選択される、第一種の機能的ＴＬＲを、試験ＩＳＮＡと接触させる工程；ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、およびＴＬＲ９からなる群より選択される、第二種の機能的ＴＬＲを、試験ＩＳＮＡと接触させる工程；第一種の機能的ＴＬＲを試験ＩＳＮＡと接触させるに関連する、ＴＬＲシグナル伝達経路によって媒介される応答を測定する工程；第二種の機能的ＴＬＲを試験ＩＳＮＡと接触させるに関連する、ＴＬＲシグナル伝達経路によって媒介される応答を測定する工程；ならびに（ａ）第一種の機能的ＴＬＲを試験ＩＳＮＡと接触させるに関連する、ＴＬＲシグナル伝達経路によって媒介される応答と、（ｂ）第二種の機能的ＴＬＲを試験ＩＳＮＡと接触させるに関連する、ＴＬＲシグナル伝達経路によって媒介される応答とを比較する工程を包含する。好ましい実施形態において、第一種のＴＬＲは、第二種のＴＬＲに対応する。例えば、第一種のＴＬＲは、ヒトＴＬＲ９であり、そして第二種のＴＬＲは、マウスＴＬＲ９である。特定の実施形態において、機能的ＴＬＲは、先に記載されたように、細胞において発現されても、無細胞系の一部であっても、別のＴＬＲまたは非ＴＬＲタンパク質との複合体の一部であってもよい。
【００８０】
なお別の局面において、本発明は、ＴＬＲ９シグナル伝達活性に関連する疾患の処置において有用な、薬理学的薬剤のためのリード化合物を同定するための方法を提供する。本発明のこの局面による方法は、本発明の第二の局面において提供されたような、ＴＬＲ９ポリペプチドまたはそのフラグメントを含む細胞を提供する工程；候補薬理学的薬物の非存在下では、第一の量のＴＬＲ９シグナル伝達活性を引き起こす条件下で、この細胞を候補薬理学的薬剤と接触させる工程；ならびにＴＬＲ９シグナル伝達活性に対する薬理学的薬剤の影響の測定値として、ＴＬＲ９シグナル伝達活性の第二の量を決定する工程であって、ここで、第一の量より少ない、第二の量のＴＬＲ９シグナル伝達活性は、その候補薬理学的薬物が、ＴＬＲ９シグナル伝達活性を減少させる薬理学的薬剤のためのリード化合物であること、および第一の量より多い、第二の量のＴＬＲ９シグナル伝達活性は、その候補薬理学的薬物が、ＴＬＲ９シグナル伝達活性を増加させる薬理学的薬剤のためのリード化合物であることを決定する工程を、包含する。
【００８１】
本発明のこれらおよび他の局面を、以下にさらに詳細に記載する。
【００８２】
（選択した配列の簡単な説明）
配列番号１は、マウスＴＬＲ９のｃＤＮＡをコードするヌクレオチド配列である。
【００８３】
配列番号２は、マウスＴＬＲ９のコード領域をコードするヌクレオチド配列である。
【００８４】
配列番号３は、配列番号１によってコードされるマウスＴＬＲ９のアミノ酸配列である。
【００８５】
配列番号１７３は、マウスＴＬＲ７のｃＤＮＡをコードするヌクレオチド配列である。
【００８６】
配列番号１７４は、マウスＴＬＲ７のコード領域をコードするヌクレオチド配列である。
【００８７】
配列番号１７５は、配列番号１７３によりコードされるマウスＴＬＲ７のアミノ酸配列である。
【００８８】
配列番号１９０は、マウスＴＬＲ８のｃＤＮＡをコードするヌクレオチド配列である。
【００８９】
配列番号１９１は、マウスＴＬＲ８のコード領域をコードするヌクレオチド配列である。
【００９０】
配列番号１９２は、配列番号１９０によってコードされるマウスＴＬＲ８のアミノ酸配列である。
【００９１】
（発明の詳細な説明）
１つの局面において、本発明は、マウスＴＬＲ９（本明細書中でマウス（ｍｕｒｉｎｅ）ＴＬＲ９と称され、ｍＴＬＲ９と同等である）をコードするｃＤＮＡの同定を包含する。マウスＴＬＲ９のｃＤＮＡのヌクレオチド配列は、配列番号１と示され、マウスＴＬＲ９のｃＤＮＡのコード領域は、配列番号２と示され、そしてマウスＴＬＲ９のアミノ酸配列は、配列番号３と示される。密接に関連したヒトＴＬＲ９（ｈＴＬＲ９と同等）は、ＧｅｎＢａｎｋに、登録番号ＡＦ２４５７０４およびＮＭ ０１７７４２として寄託された。
【００９２】
配列番号１と示されるマウスＴＬＲ９のｃＤＮＡのヌクレオチド配列は、３２００ヌクレオチド長であり、そして配列番号２と示されるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ、塩基４０〜３１３５）（これは、３０９６ヌクレオチドにわたる（停止コドンを除く））を含む。配列番号３と示されるマウスＴＬＲ９のアミノ酸配列は、１０３２アミノ酸（ａａ）長であり、細胞外ドメイン（ａａ １〜８１９）、膜貫通ドメイン（ａａ ８２０〜８３７）、および細胞内ドメイン（ａａ ８３８〜１０３２）を含むと考えられる。
【００９３】
従って、ヒトＴＬＲ９のアミノ酸配列（配列番号６）およびマウスＴＬＲ９のアミノ酸配列（配列番号３）の両方は、１０３２アミノ酸長である。マウスおよびヒトのＴＬＲ９分子の整列されたアミノ酸配列の比較により、マウスＴＬＲ９のａａ ４３５における一塩基挿入およびヒトＴＬＲ９のａａ ８６０における一塩基挿入が明らかとなる（以下の表４を参照のこと）。
【００９４】
本明細書中で示されるポリペプチドの多くはヒトＴＬＲ９と同一であるが、マウスＴＬＲ９はいくつかの単一アミノ酸の差異を有する。これらのアミノ酸の差異は、特に、以下の配列番号３のアミノ酸である：
【００９５】
【化１０】

いくつかの形態において、マウスタンパク質ｍＴＬＲ９は、Ｎ末端にシグナル配列（アミノ酸１〜２６）を含み、このシグナル配列は、小胞体へ、続く細胞表面または細胞内成分への輸送を可能にする。膜貫通領域（アミノ酸８２０〜８３７）は、このタンパク質を細胞膜に固定する。細胞質テールは、Ｔｏｌｌ／ＩＬ−１レセプター（ＴＩＲ）相同性ドメインを含み、このドメインは、リガンドが結合すると、シグナル伝達の機能を果たすと考えられる。ロイシンリッチ反復（ＬＲＲ）は、細胞外領域で見出され得（ＴＬＲの共通の特徴）、そしてリガンド結合または分子の二量化に関与し得る。
【００９６】
マウスＴＬＲ９およびヒトＴＬＲ９の両方は、他のＴＬＲと比較して、約１８０アミノ酸のＮ末端伸長を有する。挿入物はまた、アミノ酸２５３〜２６８で生じ、これはＴＬＲ１〜６では見出されず、ヒトＴＬＲ７およびヒトＴＬＲ８に存在する（図２６を参照のこと）。この挿入は、ＣＸＸＣドメインの形成に関与する２つのＣＸＸＣモチーフを有する。このＣＸＸＣドメインは、ジンクフィンガーモチーフと類似しており、そしてＤＮＡ結合タンパク質および特定の特異的ＣｐＧ結合タンパク質（例えば、メチル−ＣｐＧ結合タンパク質−１（ＭＢＤ−１））において見出される。Ｆｕｊｉｔａ Ｎら、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２０：５１０７−５１１８（２０００）。ヒトＴＬＲ９ ＣＸＸＣドメインおよびマウスＴＬＲ９ ＣＸＸＣドメインの両方は、ａａ ２５３〜３６８で生じる。
【００９７】
【化１１】

ＣｐＧ結合に関与するさらなるモチーフは、ＭＢＤモチーフであり、これもまた、配列番号１２５として以下に列挙されるＭＢＤ−１において見出される。Ｆｕｊｉｔａ，Ｎら、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２０：５１０７−１８（２０００）；Ｏｈｋｉ Ｉら、ＥＭＢＯ Ｊ １８：６６５３−６６６１（１９９９）。ｈＴＬＲ９のアミノ酸５２４〜５５４およびｍＴＬＲ９のａａ ５２５〜５５５は、以下に示されるＭＢＤ−１のＭＢＤモチーフに対応する：
【００９８】
【化１２】

ＭＢＤ−１およびＴＬＲ９のシグナル伝達機能は非常に異なるが、コアＤ−Ｘ−ＹはＣｐＧ結合に関与し、そして保存される。ＭＢＤモチーフのＣ末端オクタマーＳ−ＸＸＸＸＸＸ−Ｙは、結合に関与し得ず、ＳはＬＲ９によって保存されない。他のミスマッチは、高度に保存されるかまたは中程度に保存される；例えば、ＲからＫまたはＲからＱ。これらの変化は、ＭＢＤ−１をメチル−ＣｐＧバインダーとして説明し得、そしてＴＬＲ９を非メチル−ＣｐＧバインダーとして説明し得る。マウスＴＬＲ９とヒトＴＬＲ９との間の差異は、ＣｐＧモチーフ配列の選択性における種間の差異を説明し得る。種間の配列選択性については、図１４を参照のこと。
【００９９】
以下の実施例１１において議論され、そして図２２および２３に示されるように、ＭＢＤモチーフのＤ−Ｘ−Ｙコアは、ｍＴＬＲ９（ａａ ５３５〜５３７）およびｈＴＬＲ９（ａａ ５３４〜５３６）の両方において、Ｄ−Ｌ−Ｙとして生じる。Ｄ−Ｘ−ＹコアにおけるＤのＡでの置換およびＹのＡでの置換は、Ｄ−Ｌ−Ｙの代わりにＡ−Ｌ−Ａを生じ、この置換は、ｍＴＬＲ９およびｈＴＬＲ９のレセプター活性を同様に破壊する。
【０１００】
１つの局面において、本発明はマウスＴＬＲ９の核酸およびポリペプチド、ならびにそれに関連する治療剤を包含する。本発明はまた、上記の核酸およびポリペプチドの、単離された機能的に等価な改変体、有用なアナログおよびフラグメント；上記の核酸の相補体；ならびに上記の核酸およびポリペプチドに選択的に結合する分子に関する。
【０１０１】
本発明のマウスＴＬＲ９核酸およびマウスＴＬＲ９ポリペプチドは単離される。本明細書中で核酸に関して使用する場合、用語「単離された」とは、以下を意味する：（ｉ）例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、インビトロで増幅されていること；（ｉｉ）クローニングによって組換え生成されていること；（ｉｉｉ）例えば、切断およびゲル分離によって精製されていること；または（ｉｖ）例えば、化学合成によって合成されること。単離された核酸は、当該分野で周知の組換えＤＮＡ技術によって、容易に操作される核酸である。従って、５’および３’制限部位が既知であるかまたはＰＣＲプライマー配列が開示されたベクターに含まれるヌクレオチド配列は、単離されたとみなされるが、天然の宿主におけるそのネイティブな状態で存在する核酸配列は、単離されたとみなされない。単離された核酸は、実質的に精製され得るが、その必要はない。例えば、クローニングベクターまたは発現ベクター内の単離された核酸は、この核酸が存在する細胞において極わずかな割合の物質を含み得るという点で、純粋ではない。しかし、このような核酸は当業者に公知の標準的な技術によって容易に使用されるため、この用語が本明細書中で使用される場合、この核酸は単離されている。本明細書中で使用されるような単離された核酸は、天然に存在する染色体ではない。
【０１０２】
ポリペプチドに関して本明細書中で使用する場合、「単離された」とは、その天然の環境から単離され、そしてその同定または使用を可能にするのに充分な質で存在することを意味する。タンパク質またはポリペプチドを言及する場合、単離されたとは、例えば、以下を意味する：（ｉ）発現クローニングによって選択的に生成されること；または（ｉｉ）例えば、クロマトグラフィーまたは電気泳動によって精製されること。単離されたタンパク質またはポリペプチドは、実質的に純粋であり得るが、その必要はない。用語「実質的に純粋」とは、このタンパク質またはポリペプチドが、それらが天然の系またはインビボ系において共に見出され得る実質的に他の物質を、それらの意図する用途に実用的かつ適切な程度まで含まないことを意味する。実質的に純粋なポリペプチドは、当該分野で周知の技術によって生成され得る。単離されたタンパク質は、薬剤調製において薬学的に受容可能なキャリアと混合され得るため、このタンパク質は、少ない重量％の調製物のみを含み得る。それにもかかわらずこのタンパク質は、このタンパク質が生きた系で会合し得る物質から分離されているという点で単離されている（すなわち、他のタンパク質から単離されている）。
【０１０３】
本明細書中で使用する場合、マウスＴＬＲ９核酸とは、マウスＴＬＲ９ポリペプチドをコードする単離された核酸分子をいう。このような核酸分子は、配列番号３の配列を含むマウスＴＬＲ９ポリペプチドおよびそのフラグメントをコードする。核酸分子は、配列番号１のヌクレオチド配列、配列番号２のヌクレオチド配列、ならびに遺伝コードの縮重に起因してコドン配列においてこの配列番号１および配列番号２の配列と異なるヌクレオチド配列を含む。本発明のＴＬＲ９核酸はまた、上記の核酸の対立遺伝子、および上記の核酸のフラグメントを含む。このようなフラグメントは、例えば、ハイブリダイゼーションアッセイにおけるプローブとして、およびポリメラーゼ連鎖反応におけるプライマーとして使用され得る。好ましいマウスＴＬＲ９核酸は、配列番号１および配列番号２の核酸配列を含む。上記の核酸の相補体もまた、本発明によって包含される。
【０１０４】
本明細書中で使用する場合、マウスＴＬＲ９核酸またはマウスＴＬＲ９ポリペプチドはまた、マウスＴＬＲ９のホモログおよび対立遺伝子を包含する。一般的に、ホモログおよび対立遺伝子は、代表的に、それぞれ、特定された核酸およびポリペプチドの配列に対して、少なくとも４０％のヌクレオチド同一性および／または少なくとも５０％のアミノ酸同一性を共有する。従って、マウスＴＬＲ９のホモログおよび対立遺伝子は、代表的に、それぞれ、マウスＴＬＲ９核酸およびＴＬＲ９ポリペプチドの配列に対して、少なくとも４０％のヌクレオチド同一性および／または少なくとも５０％のアミノ酸同一性を共有する。いくつかの例において、ホモログおよび対立遺伝子は、少なくとも５０％のヌクレオチド同一性および／または少なくとも６５％のアミノ酸同一性を共有し、さらに他の例において、少なくとも６０％のヌクレオチド同一性および／または少なくとも７５％のアミノ酸同一性を共有する。好ましくは、このホモログおよび対立遺伝子は、少なくとも８０％のヌクレオチド同一性および／または少なくとも９０％のアミノ酸同一性を共有し、さらに好ましくは、少なくとも９０％のヌクレオチド同一性および／または少なくとも９５％のアミノ酸同一性を共有する。最も好ましくは、このホモログおよび対立遺伝子は、少なくとも９５％のヌクレオチド同一性および／または少なくとも９９％のアミノ酸同一性を共有する。同一性は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）により開発された種々の公的に利用可能なソフトウエアツール（これは、インターネット（ｆｔｐ：／ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．／ｐｕｂ／）を介して得られ得る）を使用して計算され得る。代表的なツールとしては、ＮＣＢＩ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）から入手可能な、デフォルト設定で使用されるＢＬＡＳＴシステムが挙げられる。ＰａｉｒｗｉｓｅおよびＣｌｕｓｔａｌＷ整列（ＢＬＯＳＵＭ３０マトリクス設定）ならびにＫｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅヒドロパシー分析は、例えば、ＭａｃＶｅｃｔｏｒ配列分析ソフトウエア（Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｒｏｕｐ）を使用して得られ得る。上記の核酸のＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ相補体もまた、本発明によって包含される。
【０１０５】
本発明のマウスＴＬＲ９核酸の対立遺伝子は、従来の技術によって同定され得る。例えば、マウスＴＬＲ９の対立遺伝子は、少なくとも配列番号１または配列番号２のフラグメントを含むプローブを、ストリンジェントな条件下で、ｃＤＮＡライブラリにハイブリダイズし、そして陽性クローンを選択することによって、単離され得る。従って、本発明の局面は、マウスＴＬＲ９ポリペプチドをコードし、配列番号１または配列番号２からなる核酸分子にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列である。
【０１０６】
マウスＴＬＲ核酸のスクリーニングにおいて、サザンブロットは、放射性プローブと共に、上記のストリンジェントな条件を使用して実施され得る。ＤＮＡが最終的に移される膜を洗浄した後、この膜をＸ線フィルムに接して配置して、放射性シグナルを検出する。対応する非放射性方法もまた、当該分野で周知であり、類似の効果を得るために使用され得る。
【０１０７】
本発明のマウスＴＬＲ核酸はまた、天然の物質に存在する核酸に対する代替のコドンを含む縮重核酸を含む。例えば、セリン残基は、コドンＡＧＣ、ＡＧＴおよびＴＣＡ、ＴＣＣ、ＴＣＧおよびＴＣＴによりコードされる。この６個のコドンの各々は、セリン残基をコードする目的に対して等価である。従って、このセリンコードヌクレオチドトリプレットのいずれかは、タンパク質合成器をインビトロまたはインビボで指向して、セリン残基を伸長しているマウスＴＬＲポリペプチドに組み込むために使用され得ることが、当業者に明らかである。同様に、他のアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列トリプレットとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＣＣＡ、ＣＣＣ、ＣＣＧおよびＣＣＴ（プロリンコドン）；ＣＧＡ、ＣＧＣ、ＣＧＧ、ＣＧＴ、ＡＧＡおよびＡＧＧ（アルギニンコドン）；ＡＣＡ、ＡＣＣ、ＡＤＧおよびＡＣＴ（スレオニンコドン）；ＡＡＣおよびＡＡＴ（アスパラギンコドン）；ならびにＡＴＡ、ＡＴＣおよびＡＴＴ（イソロイシンコドン）。当業者に周知のように、他の特定のアミノ酸残基も同様に、複数のヌクレオチド配列によってコードされ得る。従って、本発明は、遺伝コードの縮重に起因して、コドン配列において生物学的に単離された核酸とは異なる縮重核酸を包含する。それにもかかわらず、特定の宿主生物における特定のコドンの使用の優先度があることが、当業者によって十分に理解されており、その結果、実施において、上記のコドン縮重は、特定の宿主における特定の縮重コドンを選択するためまたは回避するために好ましくあり得る。
【０１０８】
本発明はまた、１つ以上のヌクレオチドの付加、置換および欠失を含む改変された核酸分子を提供する。本発明のこの局面に従う改変された核酸分子は、完全にネイティブなヒトＴＬＲ９核酸分子（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ２４５７０４（配列番号４）およびＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ ０１７４４２（配列番号５））を排除する。好ましい実施形態において、これらの改変されていない核酸分子および／またはこれらがコードするポリペプチドは、この改変された核酸分子および／またはポリペプチドの少なくとも１つの活性または機能（例えば、シグナル伝達活性など）を保持する。特定の実施形態において、この改変された核酸分子は、改変されたポリペプチド、好ましくは、本明細書中のいずれかの場所に記載されるような保存的アミノ酸置換を有するポリペプチドをコードする。この改変された核酸分子は、改変されていない核酸分子と構造的に関連しており、そして好ましい実施形態において、改変されていない核酸分子と十分に構造的に関連しており、その結果、この改変された核酸分子および改変されていない核酸分子は、当業者に公知のストリンジェントな条件下でハイブリダイズする。
【０１０９】
例えば、単一アミノ酸の変化を有するポリペプチドをコードする改変された核酸分子が調製され得る。これらの核酸分子の各々は、本明細書中に記載されるような遺伝コードの縮重に対応するヌクレオチド変化を除いて、１，２または３個のヌクレオチド置換を有し得る。同様に、２アミノ酸の変化を有するポリペプチドをコードする改変された核酸分子が調製され得、これは例えば、２〜６ヌクレオチドの変化を有する。これらのような多数の改変された核酸分子は、当業者によって容易に想定され、例えば、アミノ酸２および３、２および４、２および５、２および６などをコードするコドンにおけるヌクレオチドの置換を含む。上記の例において、２つのアミノ酸の各組み合わせは、改変された核酸分子のセット、ならびにこのアミノ酸置換をコードする全てのヌクレオチド置換に含まれる。さらなる置換（すなわち３以上）、付加または欠失を有する（例えば、停止コドンまたはスプライス部位の導入による）を有するポリペプチドをコードするさらなる核酸分子がまた調製され得、そして当業者によって容易に想定されるように、本発明により包含される。任意の上記の核酸またはポリペプチドは、慣用的な実験によって、本明細書中で開示される核酸および／またはポリペプチドに対する構造的環系または活性の保持について試験され得る。
【０１１０】
本発明はまた、配列番号１および配列番号２の単離されたフラグメントを提供する。このフラグメントは、このような核酸を同定するためにサザンブロットアッセイのプローブとして使用され得るか、またはこのフラグメントは、ＰＣＲを使用するアッセイのような増幅アッセイにおいて使用され得る。より小さなフラグメントは、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、２０、２２、２５、３０、４０、５０、または７５個のヌクレオチド、およびそれらの間の全ての整数のヌクレオチドを含む、フラグメントであり、そして例えば、核酸増幅手順のためのプライマーとして有用である。当業者に公知であるように、より大きなプローブ（例えば、２００、２５０、３００、４００またはそれより多くのヌクレオチド）は、特定の使用（例えば、サザンブロット）のために好ましいが、より小さなフラグメントは、ＰＣＲのような使用のために好ましい。フラグメントをまた使用して、抗体を産生するためのポリペプチドフラグメントまたは結合を決定するための融合タンパク質を産生し得る。同様に、フラグメントを使用して、例えば、抗体の調製、免疫アッセイなどに有用なマウスＴＬＲ９ポリペプチドの非融合フラグメントを産生し得る。上記の核酸フラグメントをアンチセンス分子としてさらに使用して、特に以下でより詳細に記載されるような治療目的のために、マウスＴＬＲ９核酸およびポリペプチドの発現を阻害し得る。
【０１１１】
本発明はまた、マウスＴＬＲ９の機能的に等価な改変体を含み、これには、マウスＴＬＲ９の１つ以上の機能特性を保持する、改変体核酸および改変体ポリペプチドが挙げられる。好ましくは、このような改変体は、マウス特異的Ｎ末端ドメイン（例えば、配列番号３のアミノ酸１〜８１９またはアミノ酸１〜８３７）を含む。例えば、改変体は、マウスＴＬＲ９の細胞外ドメインおよび膜貫通ドメイン（すなわち、アミノ酸１〜８３７）を含む融合タンパク質を含み、これは、インタクトなマウスＴＬＲ９と同様の様式で、細胞外分子と相互作用する能力を保持する。代替の改変体は、例えば、マウスＴＬＲ９の細胞質ドメイン（すなわち、アミノ酸８３８〜１０３２）を含む融合タンパク質を含み、これは、インタクトなマウスＴＬＲ９と同様の様式で、細胞内分子と相互作用する能力を保持する。さらに他の機能的に等価な改変体は、配列番号３の配列に対する、アミノ酸の短縮、欠失、点変異、または付加を含み、これは、配列番号３の機能を保持する。例えば、ＦＬＡＧペプチド配列（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）が、Ｎ末端に付加され得るか、または緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）が、Ｃ末端に付加され得る。全てのこのような付加改変体ポリペプチドは、好ましくは、、適切なリーディングフレームを維持したままこれらの配列に付加された対応する適切なコード核酸配列を有する、配列番号１または配列番号２に基づく改変された核酸を翻訳することによって作製され得る。
【０１１２】
機能的に等価な改変体はまた、除去されるか、または別のＴＬＲ由来の類似ドメインによって置換される部分（例えば、Ｎ末端の部分）を有するマウスＴＬＲ９（例えば、「ドメインスワッピング（ｄｏｍａｉｎ−ｓｗａｐｐｉｎｇ）改変体」）を含む。このようなドメインスワッピング改変体の例としては、以下の少なくとも２つの型が挙げられる：ある種由来のＴＬＲ９ドメインを別の種由来のＴＬＲ９ドメインでスワッピングすることを含む改変体、およびＴＬＲ９由来のＴＬＲドメインを別のＴＬＲ由来のＴＬＲドメインでスワッピングすることを含む改変体。特定の好ましい実施形態において、このスワッピングは、異なるＴＬＲ分子間での対応するドメインを含む。特定のこのようなドメインスワッピング改変体は、特定のドメインスワッピング改変体が誘導されるインタクトな親ＴＬＲ分子のいずれかまたは両方よりも、これらの改変体が優れた様式で機能し得る範囲で、文字通り機能的に等価ではない。例えば、ヒトＴＬＲ９によって媒介されるＴＬＲ／ＩＬ−１Ｒシグナル伝達は、ＣｐＧ ＯＤＮと相互作用するこの細胞外ドメインの能力ではなく、ＴＬＲ／ＩＬ−１Ｒシグナル伝達経路に関与するこの細胞質ドメインの能力に限定され得る。このような状況において、別の種由来のＴＬＲ９に由来する、より強力な細胞質ドメインで置換することは、利点がある。このようなドメインスワッピング改変体（例えば、キメラｈＴＬＲ９／ｍＲＬＲ９）をＣｐＧ免疫アゴニスト／アンタゴニストのためのスクリーニングアッセイにおいて使用して、種特異性を変えることなく、このアッセイの感度を増強し得る。
【０１１３】
他の機能的に等価な改変体は、このような改変体を調製するための方法として、当業者に公知である。機能的に等価な改変体の活性は、本明細書ならびに他のＴＬＲおよび他の種のＴＬＲを使用するアッセイを記載した参考文献において、提供される方法を使用して決定され得る。このような改変体は、マウスＴＬＲ９に結合し、そして／またはマウスＴＬＲαのシグナル伝達機能を調節する化合物の同定のためのアッセイにおいて、薬物の生体適合性を評価するために、ならびにシグナル伝達活性のために必要とされるマウスＴＬＲ９の部分を決定するために、特に有用である。
【０１１４】
非機能的である改変体がまた、上記のように調製され得る。このような改変体は、例えば、ＴＬＲ９シグナル伝達活性を試験する実験においてネガティブコントロールとして有用である。非機能的な改変体の例としては、シグナル伝達に関してｍＴＬＲ９とｈＴＬＲ９との両方を非機能的にする、ａａ９１５のプロリンのヒスチジンへの変異（Ｐ９１５Ｈ）を取り込む改変体が挙げられる。非機能的な改変体のさらなる例としては、上記のように、ＣｐＧ ＤＮＡ結合に関してｍＴＬＲ９とｈＴＬＲ９との両方を非機能的にする、ＭＢＤモチーフのＤ−Ｘ−ＹコアのＡ−Ｌ−Ａへの変異を取り込む改変体が挙げられる。
【０１１５】
一つの実施形態において、マウスＴＬＲ９核酸は、真核生物細胞または原核生物細胞内のマウスＴＬＲ９核酸の発現を指向し得る遺伝子発現配列に作動可能に連結される。「遺伝子発現配列」は、任意の調節ヌクレオチド配列（例えば、プロモーター配列またはプロモーターエンハンサーの組み合わせ）であり、これは、作動可能に連結される核酸の効率的な転写および翻訳を容易にする。マウスＴＬＲ９核酸に関して、「遺伝子発現配列」は、任意の調節ヌクレオチド配列（例えば、プロモーター配列またはプロモーターエンハンサーの組み合わせ）であり、これは、作動可能に連結されるマウスＴＬＲ９核酸の効率的な転写および翻訳を容易にする。例えば、遺伝子発現配列は、哺乳動物またはウイルスのプロモーター（例えば、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーター）であり得る。哺乳動物の構成的プロモーターとしては、限定されないが、以下の遺伝子のプロモーターが挙げられる：ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）、アデノシンデアミナーゼ、ピルベートキナーゼ、β−アクチンプロモーター、および他の構成的プロモーター。真核生物細胞において構成的に機能する例示的なウイルスプロモーターとしては、例えば、シミアンウイルス（例えば、ＳＶ４０）、パピローマウイルス、アデノウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、モロニーマウス白血病ウイルスおよび他のレトロウイルスの長末端反復（ＬＴＲ）由来のプロモーター、ならびに単純疱疹ウイルスのチミジンキナーゼ（ＴＫ）プロモーターが挙げられる。他の構成的プロモーターは、当業者に公知である。本発明の遺伝子発現配列として有用なプロモーターはまた、誘導性プロモーターを含む。誘導性プロモーターは、誘導剤の存在下で発現される。例えば、メタロチオネン（ＭＴ）プロモーターを誘導して、特定の金属イオンの存在下で転写および翻訳を促進する。他の誘導性プロモーターは、当業者に公知である。
【０１１６】
一般に、遺伝子発現配列は、必要な場合、それぞれ、転写および翻訳の開始に関与する、５’非転写配列および５’非翻訳配列（例えば、ＴＡＴＡボックス、キャッピング配列、ＣＡＡＴ配列など）を含む。特に、このような５’非転写配列は、作動可能に結合されたマウスＴＬＲ９核酸の転写制御のためのプロモーター配列を含有するプロモーター領域を含む。この遺伝子発現配列は、所望の場合、エンハンサー配列または上流のアクチベーター配列を必要に応じて含む。
【０１１７】
一般に、核酸コード配列および遺伝子発現配列は、これらの配列が、遺伝子発現配列の影響または制御下で、核酸コード配列の転写および／または翻訳を引き起こすように共有結合される場合、「作動可能に連結された」といわれる。従って、マウスＴＬＲ９核酸配列および遺伝子発現配列は、これらの配列が、遺伝子発現配列の影響または制御下で、マウスＴＬＲ９コード配列の転写および／または翻訳を引き起こすように共有結合される場合、「作動可能に連結された」といわれる。マウスＴＬＲ９配列が、機能的タンパク質に翻訳されることが所望される場合、２つのＤＮＡ配列は、以下の場合に、作動可動に連結されるといわれる：５’遺伝子発現配列におけるプロモーターの誘導が、マウスＴＬＲ９配列の転写により生じる場合、ならびにこの２つのＤＮＡ配列の間の連結の性質が、（１）フレームシフト変異の導入を生じないか、（２）プロモーター領域の、マウスＴＬＲ９配列の転写に関与する能力に干渉しないか、または（３）対応するＲＮＡ転写物の、タンパク質に翻訳される能力に干渉しない場合。従って、遺伝子発現配列が、マウスＴＬＲ９核酸配列の転写に影響を与え得、その結果、得られた転写物が、所望のタンパク質またはポリペプチドに翻訳され得る場合、この遺伝子発現配列は、マウスＴＬＲ９核酸配列に作動可能に連結される。
【０１１８】
本発明のマウスＴＬＲ９核酸分子およびマウスＴＬＲ９ポリペプチド（以下に記載されるマウスＴＬＲ９インヒビターを含む）は、真核生物または原核生物の細胞に、単独でまたはベクターと組み合わせて送達され得る。その最も幅広い意味で、「ベクター」は、以下を促進し得る任意のビヒクルである：（１）核酸またはポリペプチドの標的細胞への送達、（２）標的細胞による、核酸もしくはポリペプチドの取り込み、または（３）標的細胞中での核酸分子もしくはポリペプチドの発現。この特定の設定において、「ベクター」は、以下を促進し得る任意のビヒクルである：（１）マウスＴＬＲ９核酸またはポリペプチドの標的細胞への送達、（２）標的細胞によるマウスＴＬＲ９核酸もしくはポリペプチドの取り込み、または（３）標的細胞中でのマウスＴＬＲ９核酸分子もしくはポリペプチドの発現。好ましくは、このベクターは、マウスＴＬＲ９核酸またはポリペプチドを標的細胞に輸送し、このベクターの非存在下で生じる分解の程度と比較して分解が減少する。必要に応じて、「標的化リガンド」は、その標的化リガンドに対する同族レセプター（例えば、レセプター、抗体によって認識される抗原）を、その表面上で発現する細胞にベクターを選択的に送達するために、ベクターに付着され得る。この様式において、このベクター（マウスＴＬＲ９核酸またはマウスＴＬＲ９ポリペプチドを含む）が、特定の細胞に選択的に送達され得る。一般に、本発明において有用なベクターは、２種のクラスに分類される：生物学的ベクターおよび化学的／物理学的ベクター。生物学的ベクターは、標的細胞へのマウスＴＬＲ９核酸の送達／標的細胞によるマウスＴＬＲ９核酸の取り込みのためにより有用である。化学的／物理学的ベクターは、標的細胞へのマウスＴＬＲ９核酸もしくはマウスＴＬＲ９タンパク質の送達／標的細胞によるマウスＴＬＲ９核酸もしくはマウスＴＬＲ９タンパク質の取り込みのためにより有用である。
【０１１９】
生物学的ベクターとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：プラスミド、ファージミド、ウイルス、本発明の核酸配列の挿入または取り込みによって操作されたウイルス供給源または細菌供給源由来の他のビヒクル、ならびに本発明の核酸配列に連結され得る遊離の核酸フラグメント。ウイルスベクターは、生物学的ベクターの好ましい型であり、これらとしては、以下のウイルス由来の核酸配列が挙げられるが、これらに限定されない：レトロウイルス（例えば、Ｍｏｌｏｎｅｙマウス白血病ウイルス）；Ｈａｒｖｅｙマウス肉腫ウイルス；マウス乳腺癌ウイルス；ラウス肉腫ウイルス；アデノウイルス；アデノ随伴ウイルス；Ｓ４０型ウイルス；ポリオーマウイルス；ポックスウイルス；Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルス；パピローマウイルス；疱疹ウイルス；ワクシニアウイルス；およびポリオウイルス。指定されていないが、当該分野で公知である、他のベクターを容易に使用し得る。
【０１２０】
好ましいウイルスベクターは、本質的でない遺伝子が目的の遺伝子で置換された、非細胞障害性の真核生物ウイルスに基づく。非細胞障害性のウイルスとしては、レトロウイルスが挙げられ、このウイルスのライフサイクルは、引き続くプロウイルスの宿主細胞ＤＮＡへの組込みを伴う、ゲノムウイルスＲＮＡのＤＮＡへの逆転写を含む。一般に、このレトロウイルスは、複製欠損性である（すなわち、所望のタンパク質の合成を指向し得るが、感染性粒子を製造し得ない）。このような遺伝子的に改変されたレトロウイルス発現ベクターは、インビボにおいて、高い効率で遺伝子を形質導入するための一般的な有用性を有する。複製欠損性のレトロウイルスを生成するための標準的なプロトコール（外因性遺伝物質をプラスミドに組み込む工程、プラスミドを用いたパッケージング細胞株のトランスフェクション、パッケージング細胞株による組換えレトロウイルスの生成、組織培養培地からのウイルス粒子の採取、およびウイルス粒子を用いた標的細胞の感染を含む）は、Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，Ｍ．，「Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ Ｃｏ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９０）およびＭｕｒｒａｙ，Ｅ．Ｊ．編，「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」，第７巻，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｃｌｉｆｔｏｎ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ（１９９１）に提供される。
【０１２１】
特定の適用のための別の好ましいウイルスは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、二重鎖ＤＮＡウイルスである。このＡＡＶを、複製欠損性となるように操作し得、そして広範囲の細胞型および種を感染し得る。ＡＡＶは、熱安定性および脂質溶媒安定性；多様な系統の細胞における高い形質転換頻度；および重感染阻害の欠如のような利点をさらに有し、これにより、複数の系の形質導入を可能にする。報告により、ＡＡＶは、部位特異的様式で、ヒト細胞ＤＮＡに一体化し得、これにより、挿入性突然変異誘発の可能性および挿入された遺伝子の発現の変動性を最小にする。さらに、野生型ＡＡＶ感染を、選択圧の非存在下において１００継代より多く組織培養物中で続ける。これは、ＡＡＶゲノム組み込みが比較的安定な事象であることを意味する。ＡＡＶはまた、染色体外の様式で機能し得る。
【０１２２】
発現に必要なエレメントの全てを含む発現ベクターは、市販されており、そして当業者に公知である。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら編，第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９を参照のこと。細胞は、マウスＴＬＲ９ポリペプチドまたはそのフラグメントもしくは改変体をコードする異種ＤＮＡ（ＲＮＡ）の細胞への導入によって遺伝子操作される。この異種ＤＮＡ（ＲＮＡ）は、宿主細胞中で異種ＤＮＡの発現を可能にするために、転写エレメントの作動可能な制御下に配置される。
【０１２３】
哺乳動物細胞におけるｍＲＮＡの発現のための好ましい系は、Ｇ４１８耐性を与える遺伝子のような選択可能なマーカー（これは、安定的にトランスフェクトされた細胞株の選択を容易にするマーカー）およびヒトＣＭＶエンハンサープロモーター配列を含む、ｐＲｃ／ＣＭＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡから入手可能）のような系である。さらに、ｐＣＥＰ４ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が、霊長類またはイヌの細胞株における発現に適切であり、このｐＣＥＰ４ベクターは、Ｅｐｓｔｅｉｎ Ｂａｒｒウイルス（ＥＢＶ）複製起点（マルチコピー染色体外エレメントとしてプラスミドの維持を促進する）を含む。別の発現ベクターは、ポリペプチド伸長因子１αのプロモーターを含むｐＥＦ−ＢＯＳプラスミド（これは、インビトロでの転写を効率的に刺激する）である。このプラスミドは、ＭｉｓｈｉｚｕｍａおよびＮａｇａｔａ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ １８：５３２２（１９９９））に記載され、そしてトランスフェクション実験におけるその使用は、例えば、Ｄｅｍｏｕｌｉｎ（Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １６：４７１０−４７１６（１９９６））によって開示されている。さらに別の好ましい発現ベクターは、Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ−Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔによって記載されるアデノウイルス（これは、Ｅ１タンパク質およびＥ３タンパク質を欠く）である（Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ ９０：６２６−６３０（１９９２））。
【０１２４】
生物学的ベクターに加えて、化学的／物理学的ベクターは、標的細胞に核酸またはポリペプチドを送達するため、および標的細胞による取り込みを促進するために証され得る。本明細書中で使用される場合、「化学的／物理学的ベクター」は、細菌学的な供給源またはウイルス供給源から誘導される分子以外の、単離された核酸またはポリペプチドを細胞に送達し得る天然分子または合成分子をいう。マウスＴＬＲ９核酸またはポリペプチドに関して、本明細書中で使用される場合、「化学的／物理学的ベクター」は、細菌学的な供給源またはウイルス供給源から誘導される分子以外の、単離されたマウスＴＬＲ９核酸またはポリペプチドを細胞に送達し得る天然分子または合成分子をいう。
【０１２５】
本発明の好ましい化学的／物理学的ベクターは、コロイド状の分散系である。コロイド状の分散系としては、油中水乳濁液、ミセル、混合ミセル、およびリポソームを含む脂質ベースの系が挙げられる。本発明の好ましいコロイド系は、リポソームである。リポソームは、インビトロまたはインビボでの送達ベクターとして有用である人工の膜小胞である。大きな単層小胞（ＬＵＶ）（これは、０．２〜４．０μｍのサイズの範囲である）が、大きな高分子をカプセル化し得ることが示されている。ＲＮＡ、ＤＮＡ、およびインタクトなビリオンは、水性内部にカプセル化され、そして生物学的に活性な形態で細胞に送達され得る（Ｆｒａｌｅｙら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｃｉ ６：７７（１９８１））。リポソームを有効な核酸移入ベクターとするために、以下の特徴の１つ以上が、存在すべきである：（１）生物学的な活性を保持したままでの、高効率での目的の核酸のカプセル化；（２）非標的細胞と比較して、標的細胞に対する優先的かつ実質的な結合；（３）標的細胞の細胞質への、高効率での小胞の水性内容物の送達；および（４）遺伝子情報の正確かつ効果的な発現。
【０１２６】
リポソームは、特定のリガンド（例えば、モノクローナル抗体、糖、糖脂質、またはタンパク質）にリポソームを連結することによって、特定の組織に標的化され得る。リポソームを特定の細胞に標的化するのに有用であり得るリガンドは、特定の細胞または組織型に依存する。さらに、ベクターが核酸をカプセル化する場合、このベクターは、核酸標的化ペプチドに連結され得、これにより、このマウスＴＬＲ９核酸を宿主細胞の核に指向する。
【０１２７】
リポソームは、Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬから、例えば、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ^ＴＭおよびＬＩＰＯＦＥＣＴＡＣＥ^ＴＭとして市販されており、これは、カチオン性脂質（例えば、Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）−プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）およびジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ））から形成される。リポソームを作製する方法は、当該分野で周知であり、そして多くの刊行物に記載されている。
【０１２８】
一般に、核酸、特に、マウスＴＬＲ９をコードする核酸の標的細胞による取り込みを促進するために使用され得る他の例示的な組成物としては、リン酸カリウムおよび細胞内輸送の他の化学的媒介物、微量注入組成物、エレクトロポレーション組成物ならびに相同組換え組成物（例えば、標的細胞の染色体内の予め選択した位置にマウスＴＬＲ９核酸を組み込むため）が挙げられる。
【０１２９】
本発明はまた、いわゆる発現キットを含み、これにより、技術者が所望の発現ベクターを調製するのを可能にする。このような発現キットは、上で議論したコード配列の少なくとも別々の部分を含む。所望される場合、必要とされる上に記載した配列が含まれる限り、他の成分が、添加され得る。
【０１３０】
本発明が、宿主細胞および細胞株をトランスフェクトするための発現ベクター中にマウスＴＬＲ９ ｃＤＮＡ配列の使用を含み、これらの宿主細胞および細胞株が、原核生物（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）、または真核生物（例えば、２９３線維芽細胞（ＡＴＣＣ，ＣＲＬ−１５７３）、ＭｏｎｏＭａｃ−６、ＴＨＰ−１、Ｕ９２７、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、酵母の発現系および昆虫細胞中での組換えバキュロウイルスの発現）であることがまた理解される。例えば、ヒト、ブタ、ヤギ、霊長類、げっ歯類、モルモットなどの哺乳動物の細胞が、特に有用である。これらは、広範な種々の組織型であり得、そして初代細胞および細胞株を含む。この発現ベクターは、適切な配列（すなわち、上述の核酸）が、プロモーターに作動可能に連結されることを必要とする。
【０１３１】
本発明はまた、単離されたマウスＴＬＲ９ポリペプチドを提供し、このマウスＴＬＲ９ポリペプチドは、上記のＴＬＲ９核酸によってコードされた、配列番号３のアミノ酸配列およびそのフラグメントを含む。マウスＴＬＲ９ポリペプチドはまた、このようなポリペプチドがＴＬＲ９活性を維持する場合、対立遺伝子、機能的に等価な改変体およびアナログ（開示されたマウスＴＬＲ９ポリペプチド由来のアミノ酸配列において、１個、２個、３個、４個、５個以上のアミノ酸が、変化する非対立遺伝子ポリペプチド）を含む。非対立遺伝子改変体はまた、本発明に包含され、これらは、アッセイにおけるネガティブコントロールなどとして、ＴＬＲ９シグナル伝達機能のアンタゴニストとして有用である。このような対立遺伝子、改変体、アナログおよびフラグメントは、例えば、単独で、またはアッセイの成分を含む、種々の目的のための融合タンパク質として有用である。
【０１３２】
ポリペプチドのフラグメントは、好ましくは、特に、種々の分子のレセプターとして、インタクトなポリペプチドの明確な機能的能力を維持するフラグメントである。従って、ＴＬＲ９ポリペプチドのフラグメントは、好ましくは、特に、種々の分子のレセプターとして、ＴＬＲ９ポリペプチドの明確な機能的能力を維持するフラグメントである。ＩＳＮＡに結合するフラグメント（例えば、ＣｐＧ核酸を結合するフラグメントを含む）が、特に興味深い。ポリペプチドのフラグメントに保持され得る他の機能的能力は、シグナル伝達（例えば、マウスＴＬＲ９によるＴＬＲ／ＩＬ−１Ｒシグナル伝達）、抗体との相互作用、および他のポリペプチドとの相互作用（例えば、タンパク質複合体において見出される相互作用）を含む。当業者には、マウスＴＬＲ９の機能的能力を保持するフラグメントを選択するために適用され得る方法は、周知である。このフラグメントの機能的能力の確認を、このフラグメントを合成し、そして標準的な方法に従ってこの能力を試験することによって実施し得る。例えば、マウスＴＬＲ９フラグメントのシグナル伝達活性を試験するために、シグナル伝達が測定され得る細胞においてフラグメントを挿入するか、または発現する。当該分野で標準的であるこのような方法は、本明細書中にさらに記載されている。
【０１３３】
本発明は、上記のマウスＴＬＲ９ポリペプチドの改変体を含む。本明細書中に使用される場合、ポリペプチドの「改変体」は、ポリペプチドの一次アミノ酸配列に対して、１つ以上の改変を含むポリペプチドである。従って、マウスＴＬＲ９ポリペプチドの「改変体」は、マウスＴＬＲ９ポリペプチドの一次アミノ酸配列に対して、１つ以上の改変を含むポリペプチドである。マウスＴＬＲ９改変体を作製する改変が、種々の理由のために、マウスＴＬＲ９ポリペプチドに対して作製され、この理由としては、以下が挙げられる：１）マウスＴＬＲ９ポリペプチドの活性（例えば、シグナル伝達）を減少または排除すること；２）マウスＴＬＲ９ポリペプチドの特性（例えば、シグナル伝達、核酸リガンドまたは他のリガンド分子に対する結合親和性、発現系におけるタンパク質の安定性、またはタンパク質−タンパク質結合の安定性）を増強させること；３）マウスＴＬＲ９ポリペプチドに対して新規な活性または特性（例えば、抗原性エピトープの付加または検出可能な部分（例えば、ルシフェラーゼ、ＦＬＡＧペプチド、ＧＦＰ））の付加を提供すること；４）アミノ酸置換基が、分子のシグナル伝達活性に影響を与えるか、または与えないことを確立すること；あるいは５）マウスＴＬＲ９ポリペプチドの免疫原性を減少させること。マウスＴＬＲ９ポリペプチドの改変は、代表的に、マウスＴＬＲ９ポリペプチドをコードする核酸に対して作製され、この改変としては、欠失、点変異、短縮、アミノ酸の置換およびアミノ酸または非アミノ酸部分の付加が挙げられ得る。あるいは、改変は、ポリペプチドに対して直接的になされ得る（例えば、切除、リンカー分子の付加、検出可能な部分（例えば、ビオチン、フルオロフォア、放射線同位体、酵素、またはペプチド）の付加、脂肪酸の付加など）。
【０１３４】
改変はまた、マウスＴＬＲ９アミノ酸配列の全てまたは一部を含む融合タンパク質を含む。当業者は、タンパク質配列中の変化、タンパク質のコンフォメーションに対する効果を予測するための方法に精通しており、従って、公知の方法に従って、改変体マウスＴＬＲ９を設計し得る。このような方法の一つの例は、ＤａｈｉｙａｔおよびＭａｙｏ、Ｓｃｉｅｎｃｅ １７８：８２〜８７（１９９７）（これによって、タンパク質が、新規に設計され得る）に記載されている。この方法は、ポリペプチド配列の一部のみを改変するために公知のタンパク質に適用され得る。ＤａｈｉｙａｔおよびＭａｙｏのコンピューターを利用した方法を適用することによって、マウスＴＬＲ９ポリペプチドの特定の改変体は、改変体が所望のコンフォメーションを保持するかどうかを決定するために提案され、そして試験され得る。
【０１３５】
改変体は、その生理学的な活性に関連しないポリペプチドの特徴を変えるために特異的に改変される、マウスＴＬＲ９ポリペプチドを含む。例えば、システイン残基は、望まないジスルフィド結合を防止するために、置換または欠失され得る。同様に、特定のアミノ酸（例えば、ＫＥＸ２プロテアーゼ活性が存在する、酵母の発現系における二塩基性アミノ酸残基）を変化させて、発現系においてプロテアーゼによるタンパク質分解を排除することによって、マウスＴＬＲ９ポリペプチドの発現を増強し得る。
【０１３６】
マウスＴＬＲ９ポリペプチドをコードする核酸の変異は、好ましくは、コード配列のアミノ酸リーディングフレームを保存し、そして好ましくは、改変体ポリペプチドの発現に有害であり得る二次構造（例えば、ヘアピンまたはループ）を形成するようにハイブリダイズする可能性がある、核酸領域を作製しない。
【０１３７】
変異が、アミノ酸置換基を選択することによって、またはポリペプチドをコードする核酸中の選択された部位のランダムな変異誘発によってなされ得る。次いで、変異により所望の特性を有する改変体ポリペプチドが提供されるかどうかを決定するために、改変体ポリペプチドを発現させ、そして１以上の活性について試験する。さらなる変異が、改変体（または、非改変体マウスのＴＬＲ９ポリペプチド）に対して作製され得、この変異は、ポリペプチドのアミノ酸配列についてサイレントであるが、特定の宿主における翻訳のための好ましいコドンを提供する。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ中の核酸の翻訳のための好ましいコドンは、当業者に周知である。さらに他の変異は、ポリペプチドの発現を増強するために、マウスＴＬＲ９遺伝子またはｃＤＮＡクローンの非コード配列に対して作製され得る。
【０１３８】
マウスＴＬＲ９ポリペプチドの改変体の活性は、改変体マウスＴＬＲ９ポリペプチドをコードする遺伝子を原核生物発現ベクターまたは真核生物（例えば、哺乳動物）発現ベクターにクローニングし、ベクターを適切な宿主細胞に導入し、改変体マウスＴＬＲ９ポリペプチドを発現させ、そして本明細書中に開示されるマウスＴＬＲ９ポリペプチドの機能的能力について試験することによって試験され得る。例えば、改変体マウスＴＬＲ９ポリペプチドは、実施例において、以下に記載されるように、シグナル伝達を提供する能力について試験され得る。他の改変体ポリペプチドの調製は、当業者に公知であるように、他の活性の試験を支持し得る。
【０１３９】
当業者はまた、保存的アミノ酸置換が、マウスＴＬＲ９ポリペプチドにおいてなされて、上記ポリペプチドの機能的に等価な改変体（すなわち、マウスＴＬＲ９ポリペプチドの機能的能力を保持する改変体）を提供し得ることを理解する。本明細書中で使用される場合、「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸置換がなされるポリペプチドの相対的な電荷またはサイズの特徴を変更しないアミノ酸置換をいう。改変体は、当業者に公知のポリペプチド配列を変更するための方法に従って調製され得、例えば、これは、このような方法を集めた参考文献（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら編、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｏｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８９、またはＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）に見出される。マウスＴＬＲ９ポリペプチドの例示的な機能的に等価な改変体としては、配列番号３の保存的アミノ酸置換が挙げられる。アミノ酸の保存的置換としては、以下の群内のアミノ酸間でなされる置換が挙げられる：（ａ）Ｍ、Ｉ、Ｌ、Ｖ；（ｂ）Ｆ、Ｙ、Ｗ；（ｃ）Ｋ、Ｒ、Ｈ；（ｄ）Ａ、Ｇ；（ｅ）Ｓ、Ｔ；（ｆ）Ｑ、Ｎ；および（ｇ）Ｅ、Ｄ。
【０１４０】
マウスＴＬＲ９の機能的に等価な改変体を作製するためのマウスＴＬＲ９ポリペプチドアミノ酸配列における保存的アミノ酸置換は、代表的に、マウスＴＬＲ９ポリペプチドをコードする核酸配列（例えば、配列番号１および配列番号２）の変更によってなされる。このような置換は、当業者に公知な種々の方法によってなされ得る。例えば、アミノ酸置換は、ＰＣＲ指向（ｄｉｒｅｃｔｅｄ）変異、Ｋｕｎｋｅｌ（Ｋｕｎｋｅｌ、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８２：４８８−４９２（１９８５）の方法に従う部位特異的変異誘発によって、またはマウスＴＬＲ９ポリペプチドをコードする遺伝子の化学的合成によってなされ得る。マウスＴＬＲ９ポリペプチドの機能的に等価な改変体フラグメントの活性は、変更されたマウスＴＬＲ９ポリペプチドをコードする遺伝子を細菌発現ベクターまたは哺乳動物発現ベクターにクローニングし、ベクターを適切な宿主細胞に導入し、変更されたマウスＴＬＲ９ポリペプチドを発現させ、そしてシグナル伝達事象を媒介するマウスＴＬＲ９ポリペプチドの能力について試験することのよって試験され得る。化学的に合成されたペプチドは、機能について直接的に試験され得る。
【０１４１】
当業者に周知な種々の方法論を利用して、単離されたマウスＴＬＲ９ポリペプチド分子を得ることができる。ポリペプチドは、クロマトグラフィー手段または免疫学的認識によってポリペプチドを天然に産生する細胞から精製され得る。あるいは、発現ベクターが、細胞に導入されて、ポリペプチドを産生し得る。別の方法において、ｍＲＮＡ転写物は、微量注入され得るかまたはそれ以外で細胞に導入されて、コードされるポリペプチドを産生し得る。網状赤血球溶解物系のような無細胞抽出物におけるｍＲＮＡ翻訳はまた、ポリペプチドを産生するために使用され得る。当業者はまた、マウスＴＬＲ９ポリペプチドを単離するための公知の方法に容易に従い得る。これらとしては、限定しないが、イムノクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーおよびイムノアフィニティークロマトグラフィーが挙げられる。
【０１４２】
本明細書中に記載される本発明は、多くの用途を有し、これらのいくつかは、本明細書の他の箇所に記載される。例えば、本発明によって、標準的なプロトコルを使用して単離され得る大量のポリペプチドを産生するための組換え核酸の発現によって、マウスＴＬＲ９ポリペプチド分子の単離が可能になる。別の例として、マウスＴＬＲ９遺伝子の単離によって、マウスＴＬＲ９が、ＴＬＲ９に関与する分子相互作用をアッセイするための方法に使用されることが可能になる。
【０１４３】
以下の実施例にさらに考察されるように、本発明の１つの局面に従って、ＩＳＮＡに対する応答性が、マウスＴＬＲ９（および特定のホモログおよびその改変体）の発現を指向する発現ベクターを、ＩＳＮＡ非応答性細胞に導入することによってＩＳＮＡ非応答性細胞中で再構築されることが発見された。このように再構築された細胞はまた、ホスホロチオエートＩＳＮＡ以外の物質（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡ、ホスホジエステルＣｐＧ−ＯＤＮ、およびさらにメチル化されたＣｐＧ−ＯＤＮ）に対する応答性を示す。
【０１４４】
以下の実施例でもさらに考察されるように、本発明の特定の局面に従って、ＴＬＲ９が、結合するＩＳＮＡに応答してシグナルを伝達する能力を細胞に与えるだけではなく、このようなシグナル伝達応答に対する配列特異性および種特異性の両方を与えることが発見された。ＣｐＧ−ＯＤＮ １６６８（最適なマウスＩＳＮＡと報告される）に応答してシグナル伝達するマウスＴＬＲ９は、ＣｐＧ−ＯＤＮ ２００６（最適なヒトＩＳＮＡと報告される）に応答してシグナル伝達する対応するマウスＴＬＲ９よりも有意に強力であることが見出された。逆もまた真である。すなわち、ＣｐＧ−ＯＤＮ ２００６に応答してシグナル伝達するヒトＴＬＲ９は、ＣｐＧ−ＯＤＮ １６６８に応答してシグナル伝達する対応するヒトＴＬＲ９よりも有意に強力であることが見出された。さらに、本発明に従って、特定の型の細胞が、ＴＬＲ９を優先的に発現することが発見された。例えば、ＴＬＲ９は、Ｂ細胞および形質細胞様樹状細胞（ＣＤ１２３＋ＤＣ）において強く発現されるが、Ｔ細胞、単球由来樹状細胞（ＭＤＤＣ）、およびＣＤ１４＋単球では弱くしか発現されない。対照的に、ＴＬＲ２およびＴＬＲ４は、ＭＤＤＣおよびＣＤ１４＋単球によって強く発現されるが、Ｂ細胞、ＣＤ１２３＋ＤＣ、およびＴ細胞では相対的に弱く発現される。
【０１４５】
本発明はまた、マウスＴＬＲ９核酸分子またはポリペプチドに選択的に結合する薬剤、ならびに本明細書中に記載されるポリペプチドおよび核酸の改変体およびフラグメントに結合する薬剤を包含する。この薬剤としては、マウスＴＬＲ９に結合するポリペプチド、およびアンチセンス核酸が挙げられ、これらの両方が、以下にさらに詳細に記載される。これらの薬剤は、マウスＴＬＲ９媒介シグナル伝達活性を阻害または増加し得る（それぞれアンタゴニストおよびアゴニスト）。
【０１４６】
いくつかの薬剤は、インヒビターである。マウスＴＬＲ９インヒビターは、細胞膜を横切るマウスＴＬＲ９媒介シグナル伝達を阻害する薬剤である。
【０１４７】
本明細書中で使用される場合、「ＴＬＲ９シグナル伝達」とは、ＴＬＲ／ＩＬ−１Ｒ（ＴＩＲ）シグナル伝達経路（これはまた、本明細書中において、ＴＬＲシグナル伝達経路とも呼ばれる）を活性化する、ＴＬＲ９ポリペプチドの能力をいう。いずれかの特定の理論に維持されることを意味しないが、ＴＬＲ／ＩＬ−１Ｒシグナル伝達経路は、分子骨髄球示差マーカー８８（ＭｙＤ８８）および腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）レセプター関連因子６（ＴＲＡＦ６）を介してシグナル伝達し、ＩκＢキナーゼ複合体およびｃ−ｊｕｎ ＮＨ_２末端キナーゼ（例えば、ＪＮＫ １／２）の活性化を導くと考えられる。Ｈａｃｋｅｒ Ｈら、Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １９２：５９５−６００（２０００）。ＴＬＲ９活性を阻害する分子（アンタゴニスト）は、ＴＬＲ／ＩＬ−１Ｒシグナル伝達経路のＴＬＲ９媒介活性化を阻害する分子であり、そしてＴＬＲ９活性を増加する分子（アゴニスト）は、ＴＬＲ／ＩＬ−１Ｒシグナル伝達経路のＴＬＲ９媒介活性化を増加する分子であるＴＬＲ９活性における変化は、本明細書中に開示されるアッセイのようなアッセイ（κＢ感受性プロモーターおよびエンハンサーの制御下の遺伝子の発現を含む）によって測定され得る。このような天然に存在する遺伝子としては、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８、インターロイキン１２のｐ４０サブユニット（ＩＬ−１２ｐ４０）、および同時刺激性分子ＣＤ８０およびＣＤ８６をコードする遺伝子が挙げられる。他の遺伝子は、このような調節エレメントの制御下（以下を参照）に置かれ得、従って、ＴＬＲ９シグナル伝達のレベルを報告するのに役立ち得る。さらなるヌクレオチド配列が、配列番号１または配列番号２に（好ましくは、配列番号２の５’末端または３’末端）付加されて、検出可能な部分またはレポーター部分（例えば、ＦＬＡＧ、ルシフェラーゼ（ｌｕｃ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）および当業者に公知の他のもの）を含むキメラポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を生じ得る。これらは、以下の実施例にさらに詳細に考察される。
【０１４８】
１つの実施形態において、マウスＴＬＲ９インヒビターは、マウスＴＬＲ９核酸分子に選択的に結合して、細胞におけるマウスＴＬＲ９（または別の種のＴＬＲ９）の発現を減少するアンチセンスオリゴヌクレオチドである。これは、ＴＬＲ９シグナル伝達活性の減少が望ましい実質的に任意の医学的条件下で望ましい。
【０１４９】
本明細書中で使用される場合、用語「アンチセンスオリゴヌクレオド」または「アンチセンス」は、生理学的条件下で、特定の遺伝子を含むＤＮＡまたはその遺伝子のｍＲＮＡ転写物にハイブリダイズし、それによってその遺伝子の転写および／またはそのｍＲＮＡの翻訳を阻害する、オリゴリボヌクレオチド、オリゴデオキシリボヌクレオチド、改変オリゴヌクレオチド、または改変オリゴデオキシリボヌクレオチドであるオリゴヌクレオチドを記載する。アンチセンス分子は、標的遺伝子または転写物とのハイブリダイゼーション時に標的遺伝子の転写または翻訳を妨害するように設計される。当業者は、アンチセンスオリゴヌクレオチドの正確な長さおよびその標的との相補性の程度が、選択される特定の標的（標的の配列およびその配列を含む特定の塩基を含む）に依存することを認識する。アンチセンスオリゴヌクレオチドが、生理学的条件下で、標的と選択的に結合し（すなわち、生理学的条件下で標的細胞中の任意の他の配列よりも標的配列に実質的に多くハイブリダイズする）ように構築され、そして配置されることが好ましい。
【０１５０】
配列番号１および配列番号２、または対立遺伝子もしくは相同性ゲノム配列および／またはｃＤＮＡ配列に基づいて、当業者は、本発明に従う使用に適切な任意の多数のアンチセンス分子を容易に選択および合成し得る。阻害に対して十分に選択的でありそして強力であるために、このようなアンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的に相補的である少なくとも１０個、より好ましくは少なくとも１５個の連続した塩基を含むべきであるが、特定の場合において、７塩基長という短さの改変オリゴヌクレオチドが、首尾良くアンチセンスオリゴヌクレオチドとして使用された。Ｗａｇｎｅｒ ＲＷら、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １４：８４０−８４４（１９９６）。最も好ましくは、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、２０〜３０塩基の相補的配列を含む。遺伝子またはｍＲＮＡ転写物の任意の領域に対してアンチセンスであるオリゴヌクレオチドが選択され得るが、好ましい実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオオチドは、翻訳開始部位、転写開始部位またはプロモーター部位のようなＮ末端または５’上流部位に対応する。さらに、３’非翻訳領域が、標的化され得る。ｍＲＮＡスプライシング部位への標的化がまた、当該分野において使用されているが、選択的ｍＲＮＡスプライシングが生じる場合、あまり好ましくなくあり得る。さらに、アンチセンスは、好ましくは、ｍＲＮＡ二次構造が予期されず（例えば、Ｓａｉｎｉｏら、Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ １４（５）：４３９−４５７（１９９４）を参照のこと）、そしてポリペプチドが結合することが予期されない部位に標的化される。従って、本発明はまた、配列番号１または配列番号２を含むマウスＴＬＲ９核酸に対応する対立遺伝子または相同的ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡに相補的であるアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。
【０１５１】
一セットの実施形態において、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、「天然」のデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、またはそれらの任意の組み合わせから構成され得る。すなわち、１つのネイティブなヌクレオチドの５’末端および別のネイティブなヌクレオチドの３’末端は、ホスホジエステルヌクレオシド間結合を介して、天然の系と同様に共有結合され得る。これらのオリゴヌクレオチドは、手動でまたは自動化合成機によって実行され得る当該分野で認識される方法によって調製され得る。これらはまた、ベクターによって組換え的に産生され得る。
【０１５２】
しかし、好ましい実施形態において、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、「改変」オリゴヌクレオチドを含み得る。すなわち、オリゴヌクレオチドは、それらがそれらの標的にハイブリダイズすることを妨げられないが、安定性または標的化を増強するか、またはそれ以外でそれらの治療的効果を向上する多くの方法で改変され得る。
【０１５３】
用語「改変オリゴヌクレオチド」は、本明細書中で使用される場合、（１）そのヌクレオチドの少なくとも２つが、合成ヌクレオシド間結合（すなわち、１つのヌクレオチドの５’末端と別のヌクレオチド３’末端との間のホスホジエステル結合以外の結合）を介して共有結合され、そして／または（２）核酸と通常関連しない化学基が、オリゴヌクレオチドに共有結合される、オリゴヌクレオチドを記載する。好ましい合成ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート、アルキルホスホネート、ホスホロジチオエート、リン酸エステル、アルキルホスホノチオエート、ホスホラミデート、カルバメート、カルボネート、リン酸トリエステル、アセトアミデート、カルボキシメチルエステルおよびペプチドである。
【０１５４】
用語「改変オリゴヌクレオチド」はまた、共有結合的に改変された塩基および／または糖を有するオリゴヌクレオチドを包含する。例えば、改変オリゴヌクレオチドは、３’位においてヒドロキシル基以外の低分子量有機基に、そして５’位においてホスフェート基以外の低分子量有機基に共有結合される骨格糖を有するオリゴヌクレオチドを含む。このように改変されたオリゴヌクレオチドは、２’−Ｏ−アルキル化リボース基を含み得る。さらに、改変オリゴヌクレオチドは、リボースの代わりにアラビノースのような糖を含み得る。本発明は、従って、薬学的に受容可能なキャリアとともに、マウスＴＬＲ９ポリペプチドをコードする核酸に、相補的であり、そして生理学的条件下でハイブリダイズ可能な改変アンチセンス分子を含む薬学的調製物を意図する。
【０１５５】
マウスＴＬＲ９に結合する薬剤はまた、マウスＴＬＲ９ポリペプチドおよびマウスＴＬＲ９ポリペプチドを含む複合体に結合する結合ペプチドおよび他の分子を含む。結合分子がインヒビターである場合、この分子は、マウスＴＬＲ９に結合し、その活性を阻害する。結合分子がアクチベーターである場合、この分子は、マウスＴＬＲ９に結合し、その活性を増加する。マウスＴＬＲ９結合剤がマウスＴＬＲ９に結合するか否かを決定するために、任意の公知の結合アッセイが利用され得る。例えば、結合剤は、表面上に固定化され、次いで、標識されたマウスＴＬＲ９ポリペプチドと接触する。次いで、マウスＴＬＲ９結合剤と相互作用するマウスＴＬＲ９の量またはマウスＴＬＲ９結合剤に結合しない量は、マウスＴＬＲ９結合剤がマウスＴＬＲ９に結合するか否かを決定するために定量化され得る。
【０１５６】
マウスＴＬＲ９結合剤は、マウスＴＬＲ９ポリペプチド、ならびにマウスＴＬＲ９ポリペプチドおよびそれらの結合パートナーの両方の複合体に、選択的にまたは優先的に結合する多数のサイズおよび型の分子を含む。これらの分子は、種々の供給源由来であり得る。例えば、マウスＴＬＲ９結合剤は、溶液中、固定形態で、またはファージディスプレーとして容易に調製され得る、変性ペプチドライブラリーをスクリーニングすることによって、提供され得る。コンビナトリアルライブラリーはまた、１つ以上のアミノ酸を含むペプチドから合成され得る。ライブラリーは、さらに、ペプチドおよび非ペプチド合成部分から合成され得る。
【０１５７】
ファージディスプレーは、本発明に従って有用な結合ペプチドを同定する際に特に効果的であり得る。簡単に述べると、従来の手順を使用して４〜８０アミノ酸残基の挿入物を提示する、ファージライブラリー（例えば、ｍ１３、ｆｄ、またはλファージを使用する）が調製される。この挿入物は、例えば、完全に変性したかまたは偏った（ｂｉａｓｅｄ）アレイを表し得る。次いで、マウスＴＬＲ９ポリペプチドに結合するファージ保有挿入物が選択され得る。このプロセスは、マウスＴＬＲ９ポリペプチドに結合するファージを再選択する数回のサイクルによって反復され得る。反復される回は、特定の配列を保有するファージの濃縮をもたらす。ＤＮＡ配列分析は、発現されるポリペプチドの配列を同定するために行われ得る。マウスＴＬＲ９ポリペプチドに結合する配列の最小の直鎖状部分が決定され得る。最小の直鎖状部分およびその上流または下流の１つ以上のさらなる変性残基の一部または全てを含む挿入物を含む偏ったライブラリーを使用する手順が反復され得る。酵母ツーハイブリットスクリーニング方法を使用して、マウスＴＬＲ９ポリペプチドに結合するポリペプチドを同定し得る。従って、本発明のマウスＴＬＲ９ポリペプチド、またはそのフラグメントを使用して、ペプチドライブラリー（ファージディスプレイライブラリーを含む）をスクリーニングし、本発明のマウスＴＬＲ９ポリペプチドのペプチド結合パートナーを同定および選択し得る。このような分子は、記載されるように、スクリーニングアッセイのために、精製プロトコルのために、マウスＴＬＲ９の機能を直接妨害するために、そして当業者に明らかな他の目的のために使用され得る。
【０１５８】
本発明はまた、本明細種中に記載されるマウスＴＬＲ９核酸分子と関連する特定の調節配列に選択的に結合する薬剤を包含する。この薬剤は、マウスＴＬＲ９の転写調節配列および翻訳調節配列に結合するポリペプチド、ならびにアンチセンス核酸（この両方は、以下にさらに詳細に記載される）を含む。薬剤は、マウスＴＬＲ９発現、ならびにシグナル伝達活性を阻害または増加（それぞれ、アンタゴニストおよびアゴニスト）し得る。マウスＴＬＲ９核酸分子と関連する調節配列に選択的に結合する薬剤は、当業者に知られた方法を使用して同定され得る。例えば、マウスＴＬＲ９のコード領域の上流（５’）の少なくとも１００、２００、３００、４００、５００以上のヌクレオチドを含むプロモーター領域は、プロモーターまたはプローブとして配列番号１または配列番号２の配列を使用して適切なゲノムＤＮＡ（例えば、ヌクレオチド配列）から単離され、次いで、プロモーター領域ＤＮＡを適切な発現ベクターに挿入して、ＴＬＲ９またはいくつかの他のレポーター遺伝子の発現を制御し、ＴＬＲ９プロモーターベクターを適切な宿主細胞に導入し、そして種々の試験薬剤の存在下および非存在下でのそれらのインキュベーションに続いてそれらの細胞によるＴＬＲ９またはレポーター発現についてスクリーニングすることによって同定され得る。ＴＬＲ９以外のレポーター遺伝子は、例えば、酵素、サイトカイン、細胞表面抗原、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）などを含み得る。ＴＬＲ９プロモーターの制御下でＴＬＲ９またはレポーターの発現を阻害する薬剤は、ＴＬＲ９発現インヒビターとして分類される。逆に、ＴＬＲ９プロモーターの制御下でＴＬＲ９またはレポーターの発現を増強する薬剤は、ＴＬＲ９発現エンハンサーとして分類される。本発明に従って、例えば、サイトカインＩＬ−４インヒビターが、ＴＬＲ９の発現を阻害することが発見された。この方法で、例えば、ＩＳＮＡに対する応答を増強するために、局所的投与によって、ＩＳＮＡとともに投与され得る薬剤を同定することが可能である。このような増強効果は、例えば、免疫化またはワクチン接種の設定において、所望であり得る。逆に、例えば、ＩＳＮＡに対する応答を阻害するために、局所的投与によって、ＩＳＮＡとともに投与され得る薬剤を同定することが可能である。このような阻害応答は、例えば、遺伝子置換療法の設定において、所望であり得る。
【０１５９】
従って、本発明は、一般的に、ＴＬＲ９活性に関連する状態の処置において有用な薬剤に対する薬理学的薬剤またはリード化合物を同定する効率的な方法、ならびにこのような同定される化合物および薬剤を提供する。一般的に、スクリーニング方法は、マウスＴＬＲ９を介するシグナル伝達を阻害または増強する化合物についてアッセイすることを包含する。このような方法は、化合物の自動化高処理能力スクリーニングに適合可能である。このような高処理能力スクリーニング方法の例は、米国特許第６，１０３，４７９号；同第６，０５１，３８０号；同第６，０５１，３７３号；同第５，９９８，１５２号；同第５，８７６，９４６号；同第５，７０８，１５８号；同第５，４４３，７９１号；同第５，４２９，９２１号；および同第５，１４３，８５４号に記載される。
【０１６０】
薬理学的薬剤についての種々のアッセイが提供され、これには、標識インビトロタンパク質結合アッセイ、検出可能な分子を使用するシグナル伝達アッセイなどが挙げられる。例えば、タンパク質結合スクリーンを使用して、候補薬理学的薬剤のマウスＴＬＲ９への結合を迅速に検査する。候補薬理学的薬剤は、例えば、コンビナトリアルペプチドまたは核酸ライブラリーから誘導され得る。このようなアッセイのための簡便な試薬は、当該分野において公知である。シグナル伝達の例示的な細胞ベースのアッセイは、マウスＴＬＲ９を有する細胞を候補薬理学的薬剤と、検出可能な分子の導入が生じ得る条件下で接触させる工程を包含する。特定の条件は、当該分野において周知であり、例えば、Ｈａｃｋｅｒ Ｈら、Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １９２：５９５−６００（２０００）、およびそこに引用される参考文献に記載される。候補薬理学的薬剤の存在下での検出可能な分子の減少した程度の誘導は、候補薬理学的薬剤が、マウスＴＬＲ９のシグナル伝達活性を減少することを示す。候補薬理学的薬剤の存在下での検出可能な分子の増加した程度の誘導は、候補薬理学的薬剤が、マウスＴＬＲ９のシグナル伝達活性を増加することを示す。
【０１６１】
本発明の方法において使用されるマウスＴＬＲ９は、単離されたポリペプチド（ここで、候補薬学的薬剤の結合が測定される）として、あるいはマウスＴＬＲ９ポリペプチドを含む細胞または他の膜カプセル化スペースとして、アッセイ混合物に添加され得る。後者のアッセイの構成において、細胞または他の膜カプセル化スペースは、マウスＴＬＲ９を、ポリペプチドとしてまたは核酸（例えば、マウスＴＬＲ９を含む発現ベクターをトランスフェクトされた細胞）として含み得る。本明細書中に記載されるアッセイにおいて、マウスＴＬＲ９ポリペプチドは、組換え的に産生され得るか、生物学的抽出物から単離され得るか、またはインビトロで合成され得る。マウスＴＬＲ９ポリペプチドは、別のペプチド（例えば、タンパク質−タンパク質結合を提供または増強し得るポリペプチド、シグナル伝達能力を増強し得るポリペプチド、検出を容易にし得るポリペプチド、またはアッセイ条件下においてマウスＴＬＲ９ポリペプチドの安定性を増強し得るポリペプチド）とマウスＴＬＲ９ポリペプチドの融合を含むキメラタンパク質を包含する。マウスＴＬＲ９ポリペプチドまたはそのフラグメントに融合されるポリペプチドはまた、例えば、免疫学的認識によって、または蛍光標識によって、融合タンパク質を容易に検出する手段を提供し得る。
【０１６２】
アッセイ混合物はまた、候補薬理学的薬剤を含む。代表的には、複数のアッセイ混合物が、異なる薬剤濃度で平行して実行されて、種々の濃度に対して異なる応答が獲得される。代表的に、これらの濃度の１つは、ネガティブコントロールとして（すなわち、０の濃度の薬剤でまたはアッセイ検出の限界より下の薬剤濃度で）、役立つ。候補薬学的薬剤は、多くの化学的クラスを包含するが、代表的には、これらは、有機化合物である。好ましくは、候補薬理学的薬剤は、小有機化合物（すなわち、５０より大きく、約２５００未満の分子量を有する化合物）である。ポリマー性候補薬剤は、より大きな分子量（例えば、約２５００〜約１２，５００の範囲のオリゴヌクレオチド）を有し得る。候補薬剤は、ポリペプチドとの構造的相互作用に必要な化学官能基を含み、そして少なくともアミン基、カルボニル基、ヒドロキシル基、またはカルボキシル基を含み得、好ましくは、少なくとも２つの化学官能基、より好ましくは、少なくとも３つの化学官能基を含み得る。候補薬剤は、上で同定される官能基の１つ以上で置換された、環式炭素構造または複素環式構造ならびに／あるいは芳香族構造またはポリ芳香族構造を含み得る。候補薬剤はまた、核酸、ペプチド、糖、脂肪酸、ステロール、イソプレノイド、プリン、ピリミジン、上記の誘導体または構造的アナログ、あるいはこれらの組み合わせなどのような生体分子であり得る。薬剤が核酸である場合、この薬剤は、代表的に、ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子であるが、非天然結合またはサブユニットを有する改変核酸もまた企図される。
【０１６３】
候補薬剤は、幅広い種々の供給源（天然化合物、合成化合物、または半合成化合物、あるいはその組み合わせのライブラリーを含む）から得られる。例えば、多くの手段が、幅広い種々の有機化合物および生体分子の無作為な合成および指向された合成に利用可能であり、これには、無作為化されたオリゴヌクレオチドの発現、合成有機コンビナトリアルライブラリー、ランダムなペプチドのファージディスプレイライブラリーなどが挙げられる。あるいは、細菌、真菌、植物および動物の抽出物の形態の天然化合物のライブラリーが利用可能であるかまたは容易に作製される。さらに、天然および合成的に作製されたライブラリーおよび化合物は、従来の化学的、物理的、および生化学的手段によって容易に改変され得る。さらに、公知の薬理学的薬剤を、アシル化、アルキル化、エステル化、アミド化（ａｍｉｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）などのような指向されたかまたは無作為化された化学修飾に供し、この薬剤の構造的アナログが生成され得る。
【０１６４】
従って、候補薬剤の供給源は、公知のＴＬＲ９リガンド（例えば、ＴＬＲ９と相互作用する、本明細書中に示されるＣｐＧオリゴヌクレオチド）に基づく分子のライブラリーであり、ここで、このリガンドの構造が、多少の化学的部分または異なる化学的部分を含むように、その分子の１つ以上の位置で変更される。アナログインヒビターのライブラリーを作製する際に、この分子になされるこの構造の変化は、指向され得るか、無作為であり得か、または指向および無作為な置換および／または付加の両方の組み合わせであり得る。コンビナトリアルライブラリーの調製において当業者は、既存のＴＬＲ９リガンドに基づき、このようなライブラリーを容易に調製し得る。
【０１６５】
種々の他の試薬はまた、この混合物中に含まれ得る。これらは、塩、緩衝液、天然タンパク質（例えば、アルブミン）、界面活性剤などのような試薬（これは、最適なタンパク質−タンパク質結合および／またはタンパク質−核酸結合を容易にするために使用され得る）を含む。このような試薬はまた、反応成分の非特異的相互作用またはバックグラウンド相互作用を減少し得る。プロテアーゼインヒビター、ヌクレアーゼインヒビター、抗菌剤などのようなアッセイの効率を改善する他の試薬もまた使用され得る。
【０１６６】
前記アッセイ材料の混合物は、候補薬理学的因子が存在しなければＴＬＲ９がＴＬＲ／ＩＬ−１Ｒのシグナル伝達を媒介する条件下でインキュベートされる。マウスＴＬＲ９への候補薬理学的因子の結合を決定するために、この混合物は、結合を許容する条件下でインキュベートされる。成分の添加、インキュベーション温度、インキュベーション時間、およびこのアッセイの他のパラメータのオーダーは容易に決定され得る。このような実験は、アッセイパラメータの最適化のみに関し、このアッセイの基本的な組成に関しない。インキュベーション温度は、代表的に、４℃と４０℃との間である。インキュベーション時間は、好ましくは、高速でハイスループットのスクリーニングを促進するために最小化され、代表的には、１分間と１０時間の間である。
【０１６７】
インキュベーション後、シグナル伝達のレベルまたはＴＬＲ９ポリペプチドと候補薬理学的因子との間の特異的結合のレベルは、使用者に利用可能な従来の任意の方法により検出される。無細胞結合型アッセイについて、結合した成分を未結合成分から分離するために、しばしば分離工程が用いられる。この分離工程は、種々の方法において達成され得る。例えば、分離は、溶液中で達成され得るか、または、好適には、少なくとも１つの成分が固体支持体に固定化され、そこから未結合の成分が容易に分離され得る。固体支持体は、広範な種々の材料からおよび広範な種々の形状（例えば、マイクロタイタープレート、マイクロビーズ、ディップスティック、樹脂粒子など）で作製され得る。基質は、好ましくは、シグナル−ノイズ比を最大化し、バックグラウンドの結合を最小化するように、ならびに分離の容易さおよび費用について選択される。
【０１６８】
分離は、例えば、リザーバからビーズまたはディップスティックを取り除くことにより、リザーバ（例えば、マイクロタイタープレートウェル）を空にするかまたは希釈することにより、水溶液または溶媒でビーズ、粒子、クロマトグラフィーカラム、またはフィルターをリンスすることによりもたらされ得る。この分離工程は、好ましくは、複数回のリンスまたは洗浄を含む。例えば、固体支持体がマイクロタイタープレートの場合、ウェルは、洗浄溶液で数回洗浄され得る。洗浄溶液は、代表的には、特異的結合に関与しないインキュベーション混合物の成分（例えば、塩、緩衝液、界面活性剤、非特異的タンパク質など）を含む。固体支持体が磁気ビーズの場合、ビーズは、洗浄溶液で１回以上洗浄され得、そして磁石を用いて分離され得る。
【０１６９】
検出は、細胞に基づくアッセイの任意の従来の方法（例えば、誘導されたポリペプチドの、細胞内での測定、細胞表面での測定、または細胞により分泌された誘導されたポリペプチドの測定）においてもたらされ得る。このような細胞に基づくアッセイにおいて有用な検出方法の例として、蛍光標識細胞分離（ＦＡＣＳ）分析、生物発光、蛍光、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、リバーストランスクリプターゼ−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）などが挙げられる。
【０１７０】
標識および他のアッセイ成分に基づき、標識を検出する種々の方法が、用いられ得る。例えば、標識は、固体支持体に結合している時に検出され得るか、または固体支持体から分離された後に検出され得る。標識は、光学密度または電子密度、放射性放出、非放射性エネルギー移動などを通して直接的に検出され得るか、または抗体結合、ストレプトアビジン−ビオチン結合などにより間接的に検出され得る。標識を検出する方法は、当該分野で周知である。
【０１７１】
マウスＴＬＲ９結合因子はまた、抗体または機能的に活性な抗体フラグメントであり得る。抗体は、免疫化学分野の当業者に周知である。本明細書中で使用する場合、用語「抗体」は、インタクトな抗体分子だけでなく、特異的な標的結合能力を保持する抗体分子のフラグメントもまた意味する。このようなフラグメントもまた当該分野で周知であり、そしてインビトロおよびインビボの両方で通常に用いられている。特に、本明細書中で用いる場合、用語「抗体」は、インタクトな免疫グロブリン分子だけでなく、周知の活性フラグメントであるＦ（ａｂ’）_２およびＦａｂも意味する。インタクトな抗体のＦｃフラグメントを欠くＦ（ａｂ’）_２およびＦａｂフラグメントは、循環中からより迅速に浄化し、そしてインタクトな抗体よりも非特異的結合が少ない（Ｗａｈｌ ＲＬら、Ｊ Ｎｕｃｌ Ｍｅｄ ２４：３１６−３２５（１９８３））。
【０１７２】
モノクローナル抗体は、免疫原としてマウスＴＬＲ９またはそのフラグメントを使用する分野で公知の任意の方法により作製され得る。あるいは、抗体は、マウスＴＬＲ９に特異的な、マウスＴＬＲ９活性を阻害するポリクローナル抗体であり得る。ポリクローナル抗体の調製および使用もまた、当業者に公知である。
【０１７３】
特に、当該分野で周知であるように、抗体分子の小部分（パラトープ）のみが、抗体のエピトープへの結合に関与する（一般的には、Ｃｌａｒｋ，Ｅ．Ｒ．（１９８６）Ｔｈｅ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｍｏｄｅｒｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｒｏｉｔｔ，Ｉ．（１９９１）Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，７ｔｈ Ｅｄ．，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｏｘｆｏｒｄ）。例えば、ｐＦｃ’およびＦｃ領域は、補体カスケードのエフェクターであるが、抗原結合に関与しない。ｐＦｃ’領域が酵素により切断された抗体またはｐＦｃ’領域を持たずに生成された抗体（Ｆ（ａｂ’）_２フラグメントと称される）は、インタクトな抗体の抗原結合部位の両方を保持する。同様に、Ｆｃ領域が酵素により切断された抗体またはＦｃ領域を持たずに生成された抗体（Ｆａｂフラグメントと称される）は、インタクトな抗体分子の抗原結合部位のうちの１つを保持する。さらに言及すると、Ｆａｂフラグメントは、共有結合した抗体軽鎖および抗体重鎖の一部分（Ｆｄと称される）からなる。Ｆｄフラグメントは、抗体の特異性の主要な決定因子であり（単一のＦｄフラグメントは、抗体特異性を変化させずに最大１０個の異なる軽鎖と結合され得る）、そしてＦｄフラグメントは、単離状態でエピトープ結合能力を保持する。
【０１７４】
当該分野で周知のように、抗体の抗原結合部分の中に、抗原のエピトープと直接的に相互作用する相補性決定領域（ＣＤＲ）、およびパラトープの三次構造を維持するフレームワーク領域（ＦＲ）が存在する（一般的には、Ｃｌａｒｋ，１９８６；Ｒｏｉｔｔ，１９９１）。重鎖ＦｄフラグメントおよびＩｇＧ免疫グロブリンの軽鎖の両方の中に、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）により分離されたそれぞれ４つのフレームワーク領域（ＦＲ１〜ＦＲ４）が存在する。ＣＤＲ、特に、ＣＤＲ３領域、より特に重鎖ＣＤＲ３は、抗体特異性の大部分を担っている。
【０１７５】
上記アッセイにおいて本発明に従って有用であることが同定された抗マウスＴＬＲ９モノクローナル抗体の抗原結合Ｆａｂ’部分の配列、ならびに関連するＦＲおよびＣＤＲ領域は、当該分野で慣用的なアミノ酸配列決定法を用いて決定され得る。哺乳動物抗体の非ＣＤＲ領域が、元の抗体のエピトープ特異性を保持しつつ、非特異的抗体またはヘテロ特異的抗体の対応する領域で置換され得ることは、十分に確立されている。この技術は、「ヒト化」抗体の作製および使用に有用である。ヒト化抗体において、非ヒトＣＤＲは、機能的な抗体を生成するために、ヒトＦＲおよび／またはＦｃ／ｐＦｃ’領域に共有結合される。ヒト化抗体に関する技術は、マウスＴＬＲ９活性を阻害する非ヒト動物（例えばマウス）抗体が同定されている場合に特に有用である。これらの非ヒト動物抗体は、本発明に従う方法においてヒト被験体の処置に使用するためにヒト化され得る。マウス抗体をヒト化するための方法の例は、米国特許第４，８１６，５６７号、同第５，２２５，５３９号、同第５，５８５，０８９号、同第５，６９３，７６２号、および同第５、８５９、２０５号に提供されている。他の抗体（抗原結合能力を有するインタクトな抗体のフラグメントを含む）は、しばしば、「キメラ」抗体と称される。
【０１７６】
従って、当業者に明らかなように、本発明はまた、抗マウスＴＬＲ９モノクローナル抗体のＦ（ａｂ’）_２およびＦａｂフラグメント；抗マウスＴＬＲ９抗体のＦｃおよび／またはＦＲならびに／あるいはＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２ならびに／あるいは軽鎖ＣＤＲ３領域が相同なヒトまたは非ヒト配列により置換されているキメラ抗体；抗マウスＴＬＲ９抗体のＦＲならびに／あるいはＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２ならびに／あるいは軽鎖ＣＤＲ３領域が相同なヒトまたは非ヒト配列により置換されているキメラＦ（ａｂ’）_２フラグメント抗体；ならびにＦＲならびに／あるいはＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２ならびに／あるいは軽鎖ＣＤＲ３領域が相同なヒトまたは非ヒト配列により置換されているキメラＦａｂフラグメント抗体を提供する。
【０１７７】
本発明に従って、マウスＴＬＲ９インヒビターもまた、配列番号３由来の「ドミナントネガティブ」なポリペプチドを含む。ドミナントネガティブなポリペプチドは、ポリペプチドの不活性な改変体であり、細胞機構と相互作用することにより、その細胞機構との相互作用において活性なポリペプチドと置き換わるか、または活性ポリペプチドと競合し、それによって活性なポリペプチドの効果を減少させる。例えば、リガンドに結合するが、そのリガンドの結合に応答してシグナルを伝達しないドミナントネガティブなレセプターは、そのレセプターの発現の生物学的効果を減少させる。以下の実施例に示すように、ａａ９１５のプロリンのヒスチジンへの置換を含むＴＬＲ９ポリペプチド（Ｐ９１５Ｈ変異）は、機能的に不活性であり、そしてネイティブのＴＬＲ９ポリペプチドに対してドミナントネガティブである。
【０１７８】
細胞中での本発明のドミナントネガティブなマウスＴＬＲ９ポリペプチドの発現の最終的な結果は、ＴＬＲ９活性（例えば、ＴＬＲ経路を通じたシグナル伝達）の減少である。当業者は、マウスＴＬＲ９ポリペプチドのドミナントネガティブ改変体の能力を評価することが可能であり、そして標準的な変異誘発技術を用いて、１つ以上のドミナントネガティブ改変体ポリペプチドを作製することが可能である。例えば、本明細書中に含まれるマウスＴＬＲ９ポリペプチドの技術が与えられれば、当業者は、部位特異的変異誘発、走査型変異誘発（ｓｃａｎｎｉｎｇ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）、部分的な遺伝子欠失または切断などによりマウスＴＬＲ９ポリペプチドの配列を改変することが可能である（例えば、米国特許第５，５８０，７２３号およびＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら編，第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９）。次いで、当業者は、マウスＴＬＲ９活性の減少および／またはこのような活性の保持について、変異ポリペプチドの集団を試験することが可能である。マウスＴＬＲ９ポリペプチドのドミナントネガティブ改変体を作製および試験するための他の同様の方法は、当業者に明らかである。
【０１７９】
本発明のこの局面に従う各々の組成物は、種々の治療目的および非治療目的に有用である。例えば、本発明のマウスＴＬＲ９核酸は、オリゴヌクレオチドプローブとして有用である。このようなオリゴヌクレオチドプローブは、本明細書中で、同一または実質的に類似する核酸配列を有するゲノムライブラリークローンまたはｃＤＮＡライブラリークローンを同定するために使用され得る。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、所望の配列にハイブリダイズし得る適切なオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドのセット、その改変体またはフラグメント、あるいはこのようなオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドのセットのアンチセンス相補体は、当該分野で周知の手段により合成され得（例えば、Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ａｎｄ ＲＮＡ，Ｓ．Ａ．Ｎａｒａｎｇ編，１９８７，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、そして当該分野で周知の技術により所望の配列、その改変体またはフラグメントを同定および単離するためのプローブとして使用される。核酸ハイブリダイゼーションおよびクローン同定の技術は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら編、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８９により開示されている。
【０１８０】
所望の核酸配列、またはその改変体もしくはフラグメントの検出を容易にするために（クローニング目的であろうと、配列の存在の検出のみのためであろうと）、上記のプローブは、検出可能な基で標識され得る。このような検出基は、検出可能な物理的または化学的特性を有する任意の物質であり得る。このような物質は、核酸ハイブリダイゼーションの分野で十分発達しており、一般的に、このような方法に有用な多くの標識が本発明に適用され得る。特に、放射性標識が有用である。十分なシグナルを提供し、そして十分な半減期を有する任意の放射性標識が用いられる。一本鎖の場合、オリゴヌクレオチドは、キナーゼ反応を用いて標識され得る。あるいは、オリゴヌクレオチドはまた、非放射性マーカー（例えば、ビオチン、酵素、または蛍光基）で標識される場合、核酸ハイブリダイゼーションプローブとして有用である。例えば、Ｌｅａｒｙ ＪＪら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８０：４０４５（１９８３）；Ｒｅｎｚ Ｍら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １２：３４３５（１９８４）；およびＲｅｎｚ Ｍ、ＥＭＢＯ Ｊ ６：８１７（１９８３）を参照のこと。
【０１８１】
さらに、マウスＴＬＲ９核酸の相補体は、アンチセンスオリゴヌクレオチドとして有用であり得、例えば、このアンチセンスオリゴヌクレオチドを動物に送達することにより、マウスＴＬＲ９「ノックアウト」表現型が誘導される。遺伝子発現をブロックするためのアンチセンスＲＮＡプローブの投与は、Ｌｉｃｈｔｅｎｓｔｅｉｎ Ｃ、Ｎａｔｕｒｅ ３３３：８０１−８０２（１９８８）において議論されている。
【０１８２】
あるいは、本発明のマウスＴＬＲ９核酸は、非ヒトトランスジェニック動物を調製するために使用され得る。「トランスジェニック動物」は、細胞中に人為的に挿入され、その細胞から生じたその動物のゲノムの一部となったＤＮＡを含む細胞を有する動物である。好ましいトランスジェニック動物は、霊長類、マウス、ラット、ウシ、ブタ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、およびネコである。トランスジェニック実験に適した動物は、標準的な販売元（例えば、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）、Ｔａｃｏｎｉｃ（Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ、ＮＹ）、Ｈａｒｌａｎ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）など）から入手され得る。特定の疾患に関連する特定の特性を有するトランスジェニック動物は、種々の薬物の効果およびその疾患に対する処置方法を研究するために使用され得、従って、多くのヒト疾患の遺伝的モデルとして役立つ。従って、本発明は、ＴＬＲ９媒介シグナル伝達に関与する障害の研究のためのモデルとしての、マウスＴＬＲ９ノックアウトおよびトランスジェニック動物の使用を意図する。本発明の関連するトランスジェニック動物の作製のための当業者に公知の種々の方法が利用可能である。
【０１８３】
内因性ＴＬＲ９遺伝子の不活性化または置換は、胚性幹細胞を用いた相同組換え系により達成され得る。ＴＬＲ９^−／−ノックアウト表現型を有する得られるトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、マウスＴＬＲ９についてトランスジェニックされ、そしてマウスＴＬＲ９のモジュレーター（アゴニストまたはアンタゴニスト／インヒビター）として化合物をスクリーニングするためのモデルとして使用される。この様式において、このような治療薬が同定され得る。
【０１８４】
さらに、マウスＴＬＲ９の正常バージョンまたは変異バージョンが、生殖細胞系に挿入され、マウスＴＬＲ９の正常形態または変異形態を保存的または誘導的に発現するトランスジェニック動物が作製され得る。これらの動物は、細胞でのマウスＴＬＲ９の役割および機能を規定するための研究において有用である。
【０１８５】
一般的に、活性化合物の用量は、１日当たり約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜１日あたり１０００ｍｇ／ｋｇである。５０〜５００ｍｇ／ｋｇの範囲の用量が１日あたり１回または数回の投与において適切である。より少ない用量は、他の形態の投与（例えば、静脈内投与）によりもたらされる。被験体における応答が適用された最初の用量で不十分である場合、より多い用量（または異なる、より局在的な送達経路による効果的に多い用量）が、患者の耐性が許容する範囲内で用いられ得る。１日あたり複数の投薬は、化合物の適切な全身レベルを達成するために考慮されるが、遅延放出薬物または化合物が持続放出薬物として調製される場合、より少ない用量が、代表的に、与えられる。
【０１８６】
本発明に従って有用なマウスＴＬＲ９のアンタゴニスト、アゴニスト、核酸、およびポリペプチドは、必要に応じて、薬学的に受容可能なキャリアと組み合わされ得る。従って、本発明はまた、本発明のこの局面の組成物を含む薬学的組成物およびこの薬学的組成物を調製するための方法もまた提供する。薬学的組成物は、本発明に従って有用なアンタゴニスト、アゴニスト、核酸、およびポリペプチド、ならびに、必要に応じて薬学的に受容可能なキャリアのいずれか１つまたはその組み合わせを含む。各々の薬学的組成物は、本発明に従って有用なマウスＴＬＲ９のアンタゴニスト、アゴニスト、核酸、またはポリペプチド、およびそれらの組み合わせを選択し、そして必要に応じて薬学的に受容可能なキャリアをそれと組み合わせることにより調製される。
【０１８７】
用語「薬学的に受容可能なキャリア」は、本明細書中で使用される場合、１つ以上の適合性の固体充填剤または液体充填剤、希釈剤、あるいはヒトへの投与に適したカプセル化物質を意味する。用語「キャリア」は、その適用を容易にするために活性成分と組合される有機成分または無機成分、天然成分または合成成分をいう。薬学的組成物の成分はまた、所望の薬学的効果を実質的に損なう相互作用が存在しないような様式で、本発明の分子と、および互いに混合され得る。
【０１８８】
薬学的組成物は、以下に挙げられる（しかし、これらに限定されない）適切な緩衝剤を含み得る：酢酸含有塩；クエン酸含有塩；およびリン酸含有塩。
【０１８９】
薬学的組成物はまた、必要に応じて、適切な防腐剤（例えば、塩化ベンズアルコニウム、クロロブタノール、パラベン、およびチメロサール）を含み得る。
【０１９０】
投与される場合、本発明の薬学的調製物は、薬学的に受容可能な量および薬学的に受容可能な組成で適用される。このような調製物は、慣用的に、塩、緩衝化剤、防腐剤、適合性キャリア、および必要に応じて他の治療剤が含まれ得る。医薬において使用される場合、塩は、薬学的に受容可能であるべきであるが、薬学的に受容可能でない塩が、薬学的に受容可能なその塩を調製するために従来的に使用され得、そしてこれも本発明の範囲から除外されない。このような薬理学的および薬学的に受容可能な塩として、以下の酸から調製される塩が挙げられるが、これらに限定されない：塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、マレイン酸、酢酸、サリチル酸、クエン酸、ギ酸、マロン酸、コハク酸など。また、薬学的に受容可能な塩は、アルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩（例えば、ナトリウム、カリウム、またはカルシウム塩）として調製され得る。
【０１９１】
種々の投与経路が利用可能である。当然のことながら、選択される特定の様式は、選択される特定の化合物、処置される状態の重篤度、および治療効果のために必要とされる用量に依存する。一般的に言うと、本発明の方法は、医学的に受容可能な任意の投与様式を用いて実施され得る。これは、臨床的に受容可能でない副作用を伴わずに活性成分の効果レベルを生じる任意の様式を意味する。このような投与様式として、経口経路、直腸経路、局所経路、鼻経路、皮内経路、または非経口経路が挙げられる。用語「非経口」とは皮下、経皮、静脈内、動脈内、くも膜下、筋肉内、腹腔内、粘膜内（胃腸粘膜を除く）、肺、病巣内、および注入が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１９２】
薬学的組成物は、従来的に、単位用量形態で調製され得、そして薬学分野で周知の任意の方法により調製され得る。全ての方法は、活性剤を、１つ以上のアクセサリー成分を構成するキャリアと一体にする工程を包含する。一般的に、この組成物は、活性成分を、液体キャリア、繊細に分離された固体キャリア、またはその両方と不均一かつ緊密に一体化し、次いで、必要な場合、生成物を形成することにより調製される。
【０１９３】
経口投与に適した組成物は、別個の単位（例えば、カプセル、錠剤、ロゼンジ）として存在し得、各々は、予め決定された量の活性成分を含む。他の組成物は、水性液体または非水性液体（例えば、シロップ、エリキシル、エマルジョン）中の懸濁物を含む。
【０１９４】
非経口投与に適した組成物は、好適には、マウスＴＬＲ９のアンタゴニスト、アゴニスト、核酸、またはポリペプチドの滅菌水性調製物を含み、好ましくは、レシピエントの血液と等張性である。この水性調製物は、適切な分散剤または湿潤剤および懸濁剤を用いて公知の方法に従い処方され得る。滅菌性の注入可能な調製物はまた、非毒性の非経口的に受容可能な希釈剤または溶媒中の滅菌性の注入可能な溶液または懸濁物（例えば、１，３−ブタンジオール中の溶液）であり得る。受容可能なビヒクルおよび溶媒の中で、水、リンガー液、および等張性塩化ナトリウム溶液が用いられ得る。さらに、滅菌性の固定油が、溶媒または懸濁媒体として従来的に用いられる。この目的のために、合成性のモノグリセリドまたはジグリセリドを含む無刺激の固定油が用いられ得る。経口投与、皮下投与、静脈内投与、くも膜下投与、筋肉内投与などに適したキャリア処方物は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡにおいて見出される。
【０１９５】
他の送達系として、時間放出系、遅延放出系、または持続放出系（例えば、上述の生物学的／化学的ベクター）が挙げられ得る。このような系は、活性成分の反復投与を回避し得、これにより、被験体および医者への利便性が増加する。多くの型の放出送達系は、当業者に利用可能であり、そして公知である。長期持続性放出移植片は、少なくとも３０日の間（好ましくは６０日の間）の治療レベルの活性成分を送達するために構築および改変される。長期持続性放出移植片は当業者に周知であり、上記の放出系のいくつかを含む。
【０１９６】
別の局面において、本発明は、マウスＴＬＲ７およびＴＬＲ８をコードするｃＤＮＡ（本明細書中でそれぞれマウスＴＬＲ７およびＴＬＲ８、それと同等にｍＴＬＲ７およびｍＴＬＲ８と称される）の同定に関する。マウスＴＬＲ７のヌクレオチド配列は、配列番号１７３として示され、マウスＴＬＲ７のｃＤＮＡのコード領域は配列番号１７４として示され、そしてマウスＴＬＲ７のアミノ酸配列は配列番号１７５として示される。緊密に関連するヒトＴＬＲ７（同等に、ｈＴＬＲ７）は、登録番号ＡＦ２４５７０２およびＡＦ２４０４６７の下でＧｅｎＢａｎｋに以前に登録された。配列番号１７３において示されるマウスＴＬＲ７のｃＤＮＡのヌクレオチド配列は３３５７ヌクレオチド長であり、そして塩基１１７−３２６６にわたり、３１５０ヌクレオチドにわたる（終止コドンを除く）ＯＲＦ（配列番号１７４として示される）を含む。配列番号１７５として示されるマウスＴＬＲ７のアミノ酸配列は１０５０アミノ酸長である。
【０１９７】
マウスＴＬＲ８のヌクレオチド配列は、配列番号１９０として示され、マウスＴＬＲ８のｃＤＮＡのコード領域は配列番号１９１として示され、そしてマウスＴＬＲ８のアミノ酸配列は配列番号１９２として示される。緊密に関連するヒトＴＬＲ８（同等に、ｈＴＬＲ８）は、登録番号ＡＦ２４５７０３およびＡＦ２４６９７１の下でＧｅｎＢａｎｋに以前に登録された。
【０１９８】
ヒトおよびマウスの両方のＴＬＲ９、ヒトＴＬＲ７、およびＴＬＲ８の各々は、１つのＣＸＸＣモチーフおよび１つのＭＢＤモチーフを含む。ｈＴＬＲ７ ＣＸＸＣモチーフは、アミノ酸２５８〜２７３を含み、そしてｈＴＬＲ８ ＣＸＸＣは、アミノ酸２２５〜２７０を含む。
【０１９９】
【化１３】

ヒトおよびマウスのＴＬＲ９、ヒトＴＬＲ７、およびＴＬＲ８はまた、単一のＭＢＤモチーフを有する。ｈＴＬＲ７ ＭＢＤは、アミノ酸５４５〜５７５にまたがり、そしてｈＴＬＲ８ ＭＢＤモチーフはアミノ酸５３３〜５６３にまたがる。
【０２００】
【化１４】

ＭＢＤモチーフにおけるコアＤ−Ｘ−Ｙは、ＭＢＤ−１タンパク質のＣｐＧ結合に関与し、そしてＴＬＲ９において保存されているが、ＴＬＲ８およびＴＬＲ７においては部分的に保存されているのみである（ＹからＤまたはＬ）。他の不一致は、高度に保存されているか、または中程度に保存されている；例えば、ＲからＫ、Ｑ、またはＤへ。これらの変化により、ＭＢＤ−１がメチル−ＣｐＧバインダーであり、そしてＴＬＲ９がＣｐＧ−ＤＮＡのバインダーであることが説明され得る。ｈＴＬＲ７およびＴＬＲ８におけるコア配列（Ｄ−Ｘ−Ｙ）における改変（それぞれ、Ｄ−Ｘ−ＬおよびＤ−Ｘ−Ｄ）は、異なる核酸モチーフの認識のための構造的基礎である可能性がある。ＣＸＸＣドメインの存在と合わせて、ＴＬＲ７およびＴＬＲ８は、確かに、生得的な免疫系に関連する核酸結合レポーターである可能性があり、従って臨床的な価値を有する可能性がある。
【０２０１】
本発明は、１つの局面において、マウスＴＬＲ７およびマウスＴＬＲ８核酸およびポリペプチドならびにそれらに関連する治療剤に関する。本発明はまた、前記のマウスＴＬＲ７およびマウスＴＬＲ８核酸およびポリペプチドの単離された機能的に等価な改変体、有用なアナログおよびフラグメント；前記のマウスＴＬＲ７およびマウスＴＬＲ８核酸およびポリペプチドの相補体；および前記のマウスＴＬＲ７およびマウスＴＬＲ８核酸およびポリペプチドに選択的に結合する分子を包含する。
【０２０２】
本発明のマウスＴＬＲ７およびマウスＴＬＲ８核酸およびポリペプチドは単離されている。マウスＴＬＲ７およびＴＬＲ８核酸およびポリペプチドに関して用語「単離された」は、本明細書中の他で用いられるのと同一の意味を有する。
【０２０３】
本明細書中で用いる場合、マウスＴＬＲ７核酸は、マウスＴＬＲ７ポリペプチドをコードする単離された核酸分子をいう。このような核酸分子は、配列番号１７５の配列およびそのフラグメントを含むマウスＴＬＲ７ポリペプチドをコードする。この核酸分子は、配列番号１７３、配列番号１７４の核酸配列、および遺伝子コードの縮重に起因して、コドン配列において配列番号１７３および配列番号１７４の配列と異なるヌクレオチド配列を含む。
【０２０４】
また、本明細書中で使用される場合、マウスＴＬＲ８核酸とは、マウスＴＬＲ８ポリペプチドをコードする単離された核酸分子をいう。このような核酸分子は、配列番号１９３の配列およびそのフラグメントを含むマウスＴＬＲ８ポリペプチドをコードする。この核酸分子は、配列番号１９０、配列番号１９１のヌクレオチド配列、ならびに遺伝コードの縮重に起因してコドン配列が配列番号１９０および配列番号１９１の配列とは異なるヌクレオチド配列を含む。
【０２０５】
本発明のマウスＴＬＲ７核酸およびマウスＴＬＲ８核酸はまた、前述の核酸の対立遺伝子およびフラグメントを含む。このようなフラグメントは、例えば、ハイブリダイゼーションアッセイにおいてプローブとして、そしてポリメラーゼ連鎖反応においてプライマーとして、使用され得る。好ましいマウスＴＬＲ７核酸は、配列番号１７３および配列番号１７４の核酸配列を含む。好ましいマウスＴＬＲ８核酸は、配列番号１９０および配列番号１９１の核酸配列を含む。前述の核酸の相補体もまた、本発明に包含される。
【０２０６】
本明細書中で使用される場合、マウスＴＬＲ７核酸またはマウスＴＬＲ７ポリペプチドはまた、マウスＴＬＲ７のホモログおよび対立遺伝子を包含する。同様に、本明細書中で使用される場合、マウスＴＬＲ８核酸またはマウスＴＬＲ８ポリペプチドもまた、マウスＴＬＲ８のホモログおよび対立遺伝子を包含する。マウスＴＬＲ７およびマウスＴＬＲ８のホモログおよび対立遺伝子は、マウスＴＬＲ９のホモログおよび対立遺伝子に関して本明細書中で以前に示された、ヌクレオチドおよびアミノ酸の同一性の程度に従う。
【０２０７】
本発明のマウスＴＬＲ７核酸およびマウスＴＬＲ８核酸の対立遺伝子は、従来技術によって同定され得る。例えば、マウスＴＬＲ７の対立遺伝子は、ストリンジェントな条件下で、配列番号１７３または配列番号１７４の少なくとも１つのフラグメントを含むプローブを、ｃＤＮＡライブラリーとハイブリダイズさせ、そして陽性クローンを選択することによって単離され得る。従って、本発明の１つの局面は、マウスＴＬＲ７ポリペプチドをコードし、そしてストリンジェントな条件下で配列番号１７３または配列番号１７４からなる核酸分子にハイブリダイズする核酸配列である。同様に、本発明の１つの局面は、マウスＴＬＲ８ポリペプチドをコードし、そしてストリンジェントな条件下で配列番号１９０または配列番号１９１からなる核酸分子にハイブリダイズする核酸配列である。この文脈におけるストリンジェントな条件は、本明細書中の別の箇所に記載したのと同じ意味を有し、適切なハイブリダイゼーション緩衝液および約６５℃の温度の使用を含む。
【０２０８】
マウスＴＬＲ７核酸またはマウスＴＬＲ８核酸のスクリーニングにおいて、サザンブロットを、放射性プローブと一緒に、本明細書に以前に記載されたストリンジェントな条件を使用して実行し得る。ＤＮＡが最終的に移されるメンブレンの洗浄後、このメンブレンを、Ｘ線フィルムに対して配置して、放射性シグナルを検出し得る。対応する非放射性の方法もまた、当該分野で周知であり、かつ類似の効果のために使用され得る。
【０２０９】
本発明のマウスＴＬＲ７核酸およびマウスＴＬＲ８核酸はまた、本明細書中に上記したように、ネイティブの物質中に存在するコドンの代替のコドンを含む縮重核酸も含む。
【０２１０】
本発明はまた、１つ以上のヌクレオチドの付加、置換および欠失を含む改変核酸分子を提供する。本発明のこの局面に従う改変核酸分子は、完全にネイティブなヒトＴＬＲ７核酸分子（配列番号１６８、配列番号１６９、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ２４５７０２およびＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ２４０４６７）および完全にネイティブなヒトＴＬＲ８核酸分子（配列番号１８２、配列番号１８３、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ２４５７０３およびＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ２４６９７１）を排除する。好ましい実施形態において、これらの改変核酸分子および／またはそれがコードするポリペプチドは、未改変核酸分子および／またはポリペプチドの少なくとも１つの活性または機能（例えば、シグナル伝達活性など）を保持する。特定の実施形態において、この改変核酸分子は、改変ポリペプチド、好ましくは、本明細書中の別の箇所に記載されたような保存的アミノ酸置換を有するポリペプチドをコードする。この改変核酸分子は、未改変核酸分子と構造的に関連し、そしてより好ましい実施形態においては、未改変核酸分子と構造的に十分に関連するので、当業者に公知のストリンジェントな条件下で、この改変核酸分子と未改変核酸分子とはハイブリダイズする。
【０２１１】
本発明はまた、マウスＴＬＲ７のヌクレオチド配列（配列番号１７３および配列番号１７４）およびマウスＴＬＲ８のヌクレオチド配列（配列番号１９０および配列番号１９１）の単離されたフラグメントを提供する。これらのフラグメントは、サザンブロットアッセイにおいてプローブとして使用されて、このような核酸を同定し得るか、またはＰＣＲを使用するような増幅アッセイにおいて使用され得る。より小さいフラグメントは、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、２０、２２、２５、３０、４０、５０または７５ヌクレオチド、およびその間の全ての整数のヌクレオチドを含むフラグメントであり、そして、例えば、核酸増幅手順のためのプライマーとして有用である。当業者に公知なように、例えば、２００、２５０、３００、４００またはそれ以上のヌクレオチドのより大きいプローブは、サザンブロットのような特定の用途のために好ましいが、より小さいフラグメントは、ＰＣＲのような用途のために好ましい。フラグメントはまた、抗体の生成またはポリペプチドフラグメントの結合の決定のための融合タンパク質を生成するために使用され得る。同様に、フラグメントは、例えば、抗体の調製、免疫アッセイなどにおいて有用な、マウスＴＬＲ７ポリペプチドおよびマウスＴＬＲ８ポリペプチドの非融合フラグメントを生成するために使用され得る。前述の核酸フラグメントは、さらに、マウスＴＬＲ７およびマウスＴＬＲ８の核酸およびポリペプチドの発現を阻害するためにアンチセンス分子として使用され得る。
【０２１２】
本発明はまた、マウスＴＬＲ７およびマウスＴＬＲ８の機能的に等価な改変体を含み、これには、マウスＴＬＲ７およびマウスＴＬＲ８の少なくとも１つの機能的特性を保持する、改変核酸および改変ポリペプチドが含まれる。好ましくはこのような改変体は、マウス特異的なＮ末端ドメインを含む。
【０２１３】
機能的に等価な改変体はまた、一部（例えば、Ｎ末端の）が除去されたか、または別のＴＬＲ由来の類似のドメインによって置換された、マウスＴＬＲ７またはマウスＴＬＲ８を含む（例えば、「ドメイン交換（ｄｏｍａｉｎ−ｓｗａｐｐｉｎｇ）」改変体）。このようなドメイン交換改変体の例としては、別の種由来のＴＬＲ７ドメインの交換および別のＴＬＲ由来のＴＬＲドメインの交換に関与する改変体が挙げられる。
【０２１４】
他の機能的に等価な改変体ならびにこのような改変体を調製するための方法は、当業者に公知である。機能的に等価な改変体の活性は、本明細書中ならびに他のＴＬＲおよび他種のＴＬＲを使用するアッセイを記載した参考文献中に提供される方法を使用して、決定され得る。このような改変体は、とりわけ、薬物のバイオアベイラビリティーの評価のために、マウスＴＬＲ７およびマウスＴＬＲ８に結合する化合物および／またはマウスＴＬＲ７およびマウスＴＬＲ８のシグナル伝達機能を調節する化合物の同定のためのアッセイにおいて、そしてシグナル伝達活性に必要なマウスＴＬＲ７およびマウスＴＬＲ８の部分を決定するために、有用である。
【０２１５】
非機能的な改変体もまた、上記のように調製され得る。このような改変体は、例えば、ＴＬＲ７およびＴＬＲ８のシグナル伝達活性を試験する実験においてネガティブコントロールとして有用である。非機能的な改変体の例としては、リガンド結合またはシグナル伝達活性に重要であると考えられるアミノ酸の短縮または変異を組み込んでいる改変体が挙げられる。
【０２１６】
特定の実施形態において、マウスＴＬＲ７核酸またはマウスＴＬＲ８核酸は、真核生物細胞および原核生物細胞内でマウスＴＬＲ７核酸またはマウスＴＬＲ８核酸の発現を指向し得る遺伝子発現配列に、作動可能に連結される。用語「遺伝子発現配列」および「作動可能に連結される」は、本明細書中で上で定義した通りである。
【０２１７】
本発明のマウスＴＬＲ７核酸分子およびマウスＴＬＲ８核酸分子、ならびにマウスＴＬＲ７ポリペプチドおよびマウスＴＬＲ８ポリペプチドは、真核生物細胞または原核生物細胞に、単独でか、またはベクターと組み合わせて送達され得る。マウスＴＬＲ７核酸分子およびマウスＴＬＲ８核酸分子に適用する場合、「ベクター」は、以下を促進し得る任意のビヒクルである：（１）マウスＴＬＲ７またはマウスＴＬＲ８の核酸またはポリペプチドの、標的細胞への送達、（２）マウスＴＬＲ７またはマウスＴＬＲ８の核酸またはポリペプチドの、標的細胞による取り込み、あるいは（３）マウスＴＬＲ７またはマウスＴＬＲ８の核酸分子またはポリペプチドの、標的細胞における発現。
【０２１８】
生物学的ベクターに加えて、化学的／物理的ベクターが使用されて、マウスＴＬＲ７またはマウスＴＬＲ８の核酸またはポリペプチドを標的細胞に送達し得、そして標的細胞による取り込みを促進し得る。マウスＴＬＲ７またはマウスＴＬＲ８の核酸またはポリペプチドに関して本明細書中で使用される場合、「化学的／物理的ベクター」とは、単離されたマウスＴＬＲ７またはマウスＴＬＲ８の核酸またはポリペプチドを細胞に対して送達し得る、細菌学的供給源またはウイルス供給源由来のもの以外の、天然または合成の分子をいう。
【０２１９】
標的細胞によるマウスＴＬＲ７核酸またはマウスＴＬＲ８核酸の取り込みを促進するために使用され得る他の例示的組成物としては、リン酸カルシウム、および細胞内輸送の化学的中間体、マイクロインジェクション組成物、エレクトロポレーションならびに（例えば、標的細胞染色体内の予め選択された位置へ、マウスＴＬＲ７核酸またはマウスＴＬＲ８核酸を組み込むための）相同組換え組成物が挙げられる。
【０２２０】
本発明が、宿主細胞および細胞株（原核生物（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）または真核生物（例えば、２９３繊維芽細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ−１５７３）、ＭｏｎｏＭａｃ−６、ＴＨＰ−１、Ｕ９２７、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、酵母発現系および昆虫における組換えバキュウロウイルス発現））をトランスフェクトするために、発現ベクター中のマウスＴＬＲ７ｃＤＮＡ配列およびマウスＴＬＲ８ｃＤＮＡ配列の使用を包含することもまた認識される。特に有用なものは、哺乳動物細胞（例えば、ヒト、ブタ、ヤギ、霊長類、モルモットなど）である。これらは、広範な種々の組織型のものであり得、そして霊長類の細胞および細胞株を含む。適切な配列（すなわち、前出に記載の核酸）を必要とする発現ベクターは、プロモーターに作動可能に連結される。
【０２２１】
本発明はまた、上記のマウスＴＬＲ７核酸およびマウスＴＬＲ８核酸によってコードされる、単離されたマウスＴＬＲ７ポリペプチドおよび単離されたマウスＴＬＲ８ポリペプチド（これは、配列番号１７５、配列番号１９２およびこれらのフラグメントのアミノ酸配列を含む）を提供する。マウスＴＬＲ７ポリペプチドおよびマウスＴＬＲ８ポリペプチドはまた、対立遺伝子、機能的に等価な改変体およびアナログ（これらの非対立遺伝子ポリペプチドは、１、２、３、４、５またはそれ以上のアミノ酸が、開示されたマウスＴＬＲ７ポリペプチドおよびマウスＴＬＲ８ポリペプチドのアミノ酸とは異なる）を包含するが、但し、このようなポリペプチドは、マウスＴＬＲ７またはマウスＴＬＲ８の活性を保持する。非機能的な改変体もまた、本発明に包含される；これらは、ＴＬＲ７およびＴＬＲ８のシグナル伝達機能のアンタゴニストとして、アッセイにおけるネガティブコントロールなどとして有用である。このような対立遺伝子、改変体、アナログおよびフラグメントは、例えば、単独で、または種々の目的のための融合タンパク質として（アッセイの成分としてを含む）、有用である。
【０２２２】
本発明はまた、上記のマウスＴＬＲ７ポリペプチドおよびマウスＴＬＲ８ポリペプチドの改変体を包含する。マウスＴＬＲ７改変体またはマウスＴＬＲ８改変体を作製する改変は、以下を含む種々の理由のために、マウスＴＬＲ７ポリペプチドまたはマウスＴＬＲ８ポリペプチドに対してなされ得る：１）マウスＴＬＲ７ポリペプチドまたはマウスＴＬＲ８ポリペプチドの活性（例えば、シグナル伝達）を減少または排除するため；２）マウスＴＬＲ７ポリペプチドまたはマウスＴＬＲ８ポリペプチドの特性（例えば、シグナル伝達、核酸リガンドもしくは他のリガンド分子に対する結合親和性、発現系におけるタンパク質の安定性、またはタンパク質−タンパク質結合の安定性）を増強するため；３）マウスＴＬＲ７ポリペプチドまたはマウスＴＬＲ８ポリペプチドに対する新規活性または特性（例えば、抗原性エピトープの付加、または検出可能部分（例えば、ルシフェラーゼ、ＦＬＡＧペプチド、ＧＦＰ）の付加）を提供するため；４）分子のシグナル伝達活性に影響するかまたは影響しないアミノ酸置換を確立するため；あるいは５）免疫原性を減少させるため。マウスＴＬＲ７ポリペプチドまたはマウスＴＬＲ８ポリペプチドに対する改変は、代表的に、マウスＴＬＲ７ポリペプチドまたはマウスＴＬＲ８ポリペプチドをコードする核酸に対してなされ、そして改変としては、欠失、点変異、短縮、アミノ酸置換およびアミノ酸または非アミノ酸部分の付加が挙げられ得る。あるいは、改変は、例えば、切断、リンカー分子の付加、検出可能部分（例えば、ビオチン、蛍光団、放射性同位体、酵素またはペプチド）の付加、脂肪酸の付加などによって、ポリペプチドに対して直接なされ得る。
【０２２３】
改変はまた、マウスＴＬＲ７アミノ酸配列またはマウスＴＬＲ８アミノ酸配列の全てまたは一部を含む融合タンパク質を包含する。
【０２２４】
改変体としては、その生理学的活性に無関係な各ポリペプチドの特徴を特異的に変更するように改変されたマウスＴＬＲ７ポリペプチドおよびマウスＴＬＲ８ポリペプチドが挙げられる。例えば、システイン残基は、望まれないジスルフィド結合を予防するために置換または欠失され得る。同様に、特定のアミノ酸は、発現系におけるプロテアーゼによるタンパク質分解を排除することによって、マウスＴＬＲ７ポリペプチドまたはマウスＴＬＲ８ポリペプチドの発現を増強するように変化され得る（例えば、ＫＥＸ２プロテアーゼ活性が存在する酵母発現系における二塩基性アミノ酸残基）。
【０２２５】
マウスＴＬＲ７ポリペプチドまたはマウスＴＬＲ８ポリペプチドをコードする核酸の変異は、好ましくは、コード配列のアミノ酸リーディングフレームを保存し、そして好ましくは、ハイブリダイズして二次構造（例えば、ヘアピンまたはループ（これらは、改変体ポリペプチドの発現に対して有害であり得る））を形成する可能性のある領域を核酸中に作製しない。マウスＴＬＲ７またはマウスＴＬＲ８の変異を作製する方法は、マウスＴＬＲ９の変異の作製に関して本明細書中の別の箇所に記載される通りである。
【０２２６】
マウスＴＬＲ７ポリペプチドまたはマウスＴＬＲ８ポリペプチドの改変体の活性を、原核生物または真核生物（例えば、哺乳動物）の発現ベクター中に、改変体マウスＴＬＲ７ポリペプチドまたは改変体マウスＴＬＲ８ポリペプチドをコードする遺伝子をクローニングし、このベクターを適切な宿主細胞に導入し、改変体マウスＴＬＲ７ポリペプチドまたは改変体マウスＴＬＲ８ポリペプチドを発現させ、そしてこのマウスＴＬＲ７ポリペプチドまたはマウスＴＬＲ８ポリペプチドの機能的能力を、本明細書中に開示のように試験することによって、試験し得る。
【０２２７】
当業者はまた、保存的アミノ酸置換がマウスＴＬＲ７ポリペプチドおよびマウスＴＬＲ８ポリペプチド中に作製されて、上記のポリペプチドの機能的に等価な改変体（すなわち、マウスＴＬＲ７ポリペプチドおよびマウスＴＬＲ８ポリペプチドの機能的能力を保持する改変体）を提供し得ることを認識する。
【０２２８】
当業者に周知の種々の方法論を使用して、マウスＴＬＲ９ポリペプチドに関して上記されたように、単離されたマウスＴＬＲ７ポリペプチド分子およびマウスＴＬＲ８ポリペプチド分子を獲得し得る。
【０２２９】
本明細書中に記載される発明は、多数の用途を有し、このうちいくつかは、本明細書中の別の箇所に記載される。例えば、本発明は、マウスＴＬＲ７ポリペプチド分子およびマウスＴＬＲ８ポリペプチド分子の単離を可能にし、これは、例えば、標準的なプロトコールを使用して単離され得る大量のポリペプチドを生成するための組換え核酸の発現による。別の例として、マウスＴＬＲ７遺伝子の単離は、マウスＴＬＲ７が、ＴＬＲ７が関与する分子相互作用をアッセイするための方法において使用されることを可能にする。
【０２３０】
本発明はまた、マウスＴＬＲ７またはマウスＴＬＲ８の核酸分子またはポリペプチドに選択的に結合する因子、ならびに本明細書中に記載されるようなポリペプチドおよび核酸の改変体およびフラグメントに結合する因子を包含する。この因子としては、マウスＴＬＲ７またはマウスＴＬＲ８に結合するポリペプチド、およびアンチセンス核酸が挙げられ、これらは両方とも、以下により詳細に記載される。いくつかの因子は、マウスＴＬＲ７が媒介するシグナル伝達活性を阻害または増大し得（それぞれ、アンタゴニストおよびアゴニスト）、そしていくつかは、マウスＴＬＲ８が媒介するシグナル伝達活性を阻害または増大し得る。
【０２３１】
１つの実施形態において、マウスＴＬＲ７インヒビターは、マウスＴＬＲ７核酸分子に選択的に結合して、細胞中のマウスＴＬＲ７（または別種のＴＬＲ７）の発現を減少させる、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。これは、ＴＬＲ７シグナル伝達活性の減少が所望される、実質的に任意の医学的状態において所望される。配列番号１７３および配列番号１７４に基づいて、または対立遺伝子もしくはホモログのゲノム配列および／もしくはｃＤＮＡ配列に基づいて、当業者は、本発明に従って使用するための、任意の多数の適切なアンチセンス分子を、容易に選択および合成し得る。
【０２３２】
１つの実施形態において、マウスＴＬＲ８インヒビターは、マウスＴＬＲ８核酸分子に選択的に結合して、細胞中のマウスＴＬＲ８（または別種のＴＬＲ８）の発現を減少させる、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。これは、ＴＬＲ８シグナル伝達活性の減少が所望される、実質的に任意の医学的状態において所望される。配列番号１９０および配列番号１９１に基づいて、または対立遺伝子もしくはホモログのゲノム配列および／もしくはｃＤＮＡ配列に基づいて、当業者は、本発明に従って使用するための、任意の多数の適切なアンチセンス分子を、容易に選択および合成し得る。
【０２３３】
マウスＴＬＲ７またはマウスＴＬＲ８についてのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、本明細書中に上記したような、「天然」オリゴヌクレオチドおよび「改変」オリゴヌクレオチドを含み得る。
【０２３４】
マウスＴＬＲ７またはマウスＴＬＲ８を結合する因子としてはまた、マウスＴＬＲ７ポリペプチドまたはマウスＴＬＲ８ポリペプチド、およびそれぞれマウスＴＬＲ７ポリペプチドまたはマウスＴＬＲ８ポリペプチドを含む複合体に結合する、結合ペプチドあるいは他の分子が挙げられる。結合分子がインヒビターである場合、この分子は、マウスＴＬＲ７またはマウスＴＬＲ８に結合し、その活性を阻害する。結合分子がアクチベーターである場合、この分子は、マウスＴＬＲ７またはマウスＴＬＲ８に結合して、その活性を増大させる。マウスＴＬＲ７結合因子またはマウスＴＬＲ８結合因子が、マウスＴＬＲ７またはマウスＴＬＲ８に結合するか否かを決定するために、任意の公知の結合アッセイが使用され得る。例えば、この結合因子は、表面に固定化され、次いで標識されたマウスＴＬＲ７ポリペプチドまたはマウスＴＬＲ８ポリペプチドと接触させられ得る。次いで、マウスＴＬＲ７結合因子またはマウスＴＬＲ８結合因子と相互作用するマウスＴＬＲ７またはマウスＴＬＲ８の量、あるいはマウスＴＬＲ７結合因子またはマウスＴＬＲ８結合因子に結合しないマウスＴＬＲ７またはマウスＴＬＲ８の量を定量して、マウスＴＬＲ７結合因子またはマウスＴＬＲ８結合因子がマウスＴＬＲ７またはマウスＴＬＲ８に結合するか否かを決定し得る。
【０２３５】
マウスＴＬＲ７結合因子またはマウスＴＬＲ８結合因子としては、マウスＴＬＲ７ポリペプチドまたはマウスＴＬＲ８ポリペプチドに対して、およびマウスＴＬＲ７ポリペプチドまたはマウスＴＬＲ８ポリペプチドとそれらの結合パートナーとを含む複合体に対して、選択的または優先的に結合する、多数のサイズおよび型の分子が挙げられる。これらの分子は、種々の供給源に由来し得る。例えば、マウスＴＬＲ７結合因子またはマウスＴＬＲ８結合因子は、固定化形態の、またはファージディスプレイライブラリーとしての変性ペプチドライブラリー（これは、溶液中に容易に調製され得る）をスクリーニングすることによって提供され得る。組み合わせライブラリーもまた、１以上のアミノ酸を含むペプチドから合成され得る。ライブラリーは、さらに、ペプトイドおよび非ペプチド合成部分から合成され得る。
【０２３６】
マウスＴＬＲ７結合ペプチドおよびマウスＴＬＲ８結合ペプチドを同定するために有用な例示的方法は、マウスＴＬＲ９結合ペプチドを同定するための方法に関して本明細書中に記載された方法と類似であるので、ここでは繰り返さない。
【０２３７】
従って、本発明は一般に、ＴＬＲ７活性およびＴＬＲ８活性に関連する状態の処置において有用な因子について、薬理学的因子またはリード化合物を同定する有効な方法、ならびにこうして同定された化合物および因子を提供する。一般に、このスクリーニング方法は、マウスＴＬＲ７またはマウスＴＬＲ８の発現あるいはマウスＴＬＲ７またはマウスＴＬＲ８を介したシグナル伝達を阻害または増強する化合物についてアッセイする工程を包含する。このような方法は、化合物の自動化されたハイスループットスクリーニングに適用可能である。
【０２３８】
薬理学的因子についての種々のアッセイが提供され、これには、標識インビトロタンパク質結合アッセイ、検出可能な分子を使用するシグナル伝達アッセイなどが含まれる。例えば、タンパク質結合スクリーニングは、マウスＴＬＲ７またはマウスＴＬＲ８に対する候補薬理学的因子の結合を迅速に試験するために使用される。候補薬学的因子は、例えば、組み合わせのペプチドライブラリーまたは核酸ライブラリーに由来し得る。このようなアッセイのための従来の試薬は、当該分野で公知である。例示的な細胞ベースのシグナル伝達アッセイは、それによって検出可能な分子の誘導が生じ得る条件下で、マウスＴＬＲ７またはマウスＴＬＲ８を有する細胞を、候補薬学的因子と接触させる工程を包含する。候補薬理学的因子の存在下での、検出可能な分子の誘導の減少した程度は、この候補薬理学的因子が、マウスＴＬＲ７またはマウスＴＬＲ８のシグナル伝達活性を減少させることを示す。候補薬理学的因子の存在下での、検出可能な分子の誘導の増大した程度は、この候補薬理学的因子が、マウスＴＬＲ７またはマウスＴＬＲ８のシグナル伝達活性を増大させることを示す。
【０２３９】
本発明の方法において使用されるマウスＴＬＲ７またはマウスＴＬＲ８は、単離されたポリペプチド（ここで、候補薬理学的因子の結合が測定される）としてか、または細胞もしくは他の膜カプセル化空間（これは、マウスＴＬＲ７ポリペプチドまたはマウスＴＬＲ８ポリペプチドを含む）として、アッセイ混合物に添加され得る。後者のアッセイ構成において、細胞または他の膜カプセル化空間は、ポリペプチドまたは核酸として、マウスＴＬＲ７またはマウスＴＬＲ８を含み得る（例えば、マウスＴＬＲ７をコードする核酸分子を含む発現ベクターによって形質転換された細胞）。本明細書中に記載されるアッセイにおいて、マウスＴＬＲ７ポリペプチドまたはマウスＴＬＲ８ポリペプチドは、組換え的に生成され得るか、生物学的抽出物から単離される得か、またはインビトロで合成され得る。マウスＴＬＲ７ポリペプチドまたはマウスＴＬＲ８ポリペプチドは、別のポリペプチド（例えば、タンパク質−タンパク質結合を提供もしくは増強し得るか、シグナル伝達能力を増強し得るか、検出を容易にし得るか、またはアッセイ条件下でマウスＴＬＲ７ポリペプチドもしくはマウスＴＬＲ８ポリペプチドの安定性を増強し得るポリペプチド）との、マウスＴＬＲ７ポリペプチドまたはマウスＴＬＲ８ポリペプチドの融合を含む、キメラタンパク質を包含する。マウスＴＬＲ７ポリペプチドまたはマウスＴＬＲ８ポリペプチドあるいはこれらのフラグメントに融合したポリペプチドはまた、例えば、免疫学的認識または蛍光標識によって融合タンパク質を容易に検出する手段を提供し得る。
【０２４０】
このアッセイ混合物はまた、マウスＴＬＲ９に関して上記されたように、候補薬理学的因子を含む。候補薬理学的因子は、広範な種々の供給源（天然、合成、または半合成の化合物、あるいはこれらの任意の組み合わせのライブラリーを含む）から獲得される。現在、マウスＴＬＲ７およびマウスＴＬＲ８の天然のリガンドは未知であるが、ＣｐＧ−ＯＤＮは含まないようである。
【０２４１】
種々の他の試薬がまた、アッセイ混合物中に含まれ得る。これらとしては、最適のタンパク質−タンパク質結合および／またはタンパク質−核酸結合を促進するために使用され得る、塩、緩衝液、中性タンパク質（例えば、アルブミン）、界面活性剤などの試薬が挙げられる。このような試薬はまた、反応成分の非特異的相互作用またはバックグラウンド相互作用を減少させ得る。アッセイ効率を改善する他の試薬（例えば、プロテアーゼインヒビター、ヌクレアーゼインヒビター、抗菌剤など）もまた使用され得る。
【０２４２】
上記アッセイ材料の混合物を、候補薬理学的因子の存在について、マウスＴＬＲ７またはマウスＴＬＲ８が、マウスＴＬＲ７媒介性またはマウスＴＬＲ８媒介性のシグナル伝達、好ましくはＴＬＲ／ＩＬ−１Ｒシグナル伝達を媒介するような条件下で、インキュベートする。候補薬理学的因子のマウスＴＬＲ７またはマウスＴＬＲ８に対する結合を決定するために、この混合物を、結合を可能にする条件下でインキュベートする。成分の添加の順番、インキュベーション温度、インキュベーション時間およびこのアッセイの他のパラメーターは、容易に決定され得る。このような実験は、単に、アッセイパラメーターの最適化のみを伴い、このアッセイの基本的な組成物の最適化を伴わない。インキュベーション温度は、代表的には、４℃と４０℃との間である。インキュベーション時間は、好ましくは、迅速な高スループットスクリーニングを容易にするために最小化され、そして代表的には１分と１０時間との間である。
【０２４３】
インキュベーション後、マウスＴＬＲ７ポリペプチドまたはマウスＴＬＲ８ポリペプチドと候補薬理学的因子との間のシグナル伝達レベルまたは特異的結合レベルは、本明細書中の別の箇所に記載のように、使用者に利用可能な任意の従来方法によって検出される。
【０２４４】
マウスＴＬＲ７結合因子またはマウスＴＬＲ８結合因子はまた、抗体または機能的に活性な抗体フラグメントであり得る。抗体（モノクローナル抗体および抗体フラグメントを含む）は、免疫学の科学分野の当業者に周知であり、本明細書中の別の箇所に記載された通りである。モノクローナル抗体は、マウスＴＬＲ７もしくはマウスＴＬＲ８またはこれらのフラグメントを免疫原として使用する、当該分野で公知の方法のいずれかによって作製され得る。あるいは、この抗体は、マウスＴＬＲ７活性またはマウスＴＬＲ８活性を阻害する、マウスＴＬＲ７またはマウスＴＬＲ８に特異的なポリクローナル抗体であり得る。ポリクローナル抗体の調製および使用もまた、当業者に公知である。
【０２４５】
上記で提供されたアッセイにおいて本発明に従って有用であると同定された、抗マウスＴＬＲ７モノクローナル抗体または抗マウスＴＬＲ８モノクローナル抗体の抗原結合Ｆａｂ’部分、ならびに関連のＦＲ領域およびＣＤＲ領域の配列は、当該分野で慣用的なアミノ酸配列決定方法を使用して決定され得る。このような配列情報は、本明細書中の別の箇所に記載のように、ヒト化抗体およびキメラ抗体、ならびに種々の融合タンパク質および結合フラグメントを作製するために使用され得る。
【０２４６】
従って、当業者に明らかなように、本発明はまた、抗マウスＴＬＲ７モノクローナル抗体または抗マウスＴＬＲ８モノクローナル抗体のＦ（ａｂ’）_２フラグメントおよびＦａｂフラグメント；抗マウスＴＬＲ７抗体または抗マウスＴＬＲ８抗体のＦｃ領域および／またはＦＲ領域および／またはＣＤＲ１領域および／またはＣＤＲ２領域および／または軽鎖ＣＤＲ３領域が、相同なヒトまたは非ヒトの配列によって置換されているキメラ抗体；抗マウスＴＬＲ７抗体または抗マウスＴＬＲ８抗体のＦＲ領域および／またはＣＤＲ１領域および／またはＣＤＲ２領域および／または軽鎖ＣＤＲ３領域が、相同なヒトまたは非ヒトの配列によって置換されているキメラＦ（ａｂ’）_２フラグメント抗体；ならびにＦＲ領域および／またはＣＤＲ１領域および／またはＣＤＲ２領域および／または軽鎖ＣＤＲ３領域が、相同なヒトまたは非ヒトの配列によって置換されているキメラＦａｂフラグメント抗体、を提供する。
【０２４７】
本発明に従えば、マウスＴＬＲ７インヒビターおよびマウスＴＬＲ８インヒビターはまた、それぞれ、配列番号１７５または配列番号１９２由来の「ドミナントネガティブ」ポリペプチドを含む。細胞中の本発明のドミナントネガティブマウスＴＬＲ７ポリペプチドまたはドミナントネガティブマウスＴＬＲ８ポリペプチドの発現の最終結果は、ＴＩＲ経路を通じたシグナル伝達のようなＴＬＲ７またはマウスＴＬＲ８活性の減少である。当業者は、マウスＴＬＲ７のドミナントネガティブ改変体またはドミナントネガティブマウスＴＬＲ８ポリペプチドが、標準的な突然変異誘発技術を用いて、１つ以上のドミナントネガティブ改変体ポリペプチドを作製する能力を評価し得る。
【０２４８】
本発明のこの局面に従う各々の組成物は、種々の治療目的および非治療目的のために有用である。例えば、本発明のマウスＴＬＲ７およびマウスＴＬＲ８核酸は、オリゴヌクレオチドプローブとして有用である。このようなオリゴヌクレオチドプローブは、同一の核酸配列または実質的に類似の核酸配列を保有するゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーのクローンを同定するために、本明細書において用いられ得る。ハイブリダイゼーション、プローブの合成、および欠失の方法は一般に、本明細書において他のいずれかに記載されている。
【０２４９】
さらに、マウスＴＬＲ７核酸およびマウスＴＬＲ８核酸の相補体は、例えば、マウスＴＬＲ７またはマウスＴＬＲ８の「ノックアウト」表現型を誘導するために動物にアンチセンスオリゴヌクレオチドを送達することによって、アンチセンスオリゴヌクレオチドとして有用であり得る。
【０２５０】
あるいは、本発明のマウスＴＬＲ７核酸およびマウスＴＬＲ８核酸は、非ヒトトランスジェニック動物を作成するために用いられ得る。従って、本発明は、ＴＬＲ７媒介シグナル伝達およびマウスＴＬＲ８媒介シグナル伝達に関与する障害の研究のためのモデルとして、マウスＴＬＲ７およびマウスＴＬＲ８のノックアウト動物およびトランスジェニック動物の使用を意図する。当業者に公知の種々の方法が、本発明に関連したトランスジェニック動物の産生のために利用可能である。
【０２５１】
内因性ＴＬＲ７またはＴＬＲ８の遺伝子の不活性化または置換は、胚性幹細胞を用いた相同組み換えシステムによって達成され得る。ＴＬＲ７^−／−またはＴＬＲ８^−／−ノックアウト表現型を有する、得られたトランスジェニック非ヒト動物は、マウスＴＬＲ７またはマウスＴＬＲ８に対してトランスジェニックにされ、そしてマウスＴＬＲ７またはマウスＴＬＲ８の調節因子（アゴニストまたはアンタゴニスト／インヒビター）として化合物をスクリーニングするためのモデルとして用いられ得る。この様式において、このような治療薬が同定され得る。
【０２５２】
さらに、マウスＴＬＲ７またはマウスＴＬＲ８の正常バージョンまたは変異バージョンが生殖細胞株に挿入され、マウスＴＬＲ７またはマウスＴＬＲ８の正常型または変異型を構成的にまたは誘導性に発現するトランスジェニック動物を産生し得る。これらの動物は、細胞におけるマウスＴＬＲ７またはマウスＴＬＲ８の役割および機能を規定する研究において有用である。
【０２５３】
本発明による有用なマウスＴＬＲ７およびマウスＴＬＲ８のアンタゴニスト、アゴニスト、核酸、およびポリペプチドは、必要に応じて、薬学的に受容可能なキャリアと組み合わせられ得る。従って、本発明はまた、薬学的組成物、および本発明のこの局面の組成物を含む薬学的組成物を調製するための方法を提供する。この薬学的組成物は、本発明による有用なマウスＴＬＲ７およびマウスＴＬＲ８のアンタゴニスト、アゴニスト、核酸、およびポリペプチドの１つまたは任意の組み合わせ、ならびに必要に応じて薬学的に受容可能なキャリアを含む。各薬学的組成物は、本発明に従う有用なマウスＴＬＲ７およびマウスＴＬＲ８のアンタゴニスト、アゴニスト、核酸、またはポリペプチド、ならびにそれらの任意の組み合わせを選択することによって、そして必要に応じてそれを薬学的に受容可能なキャリアと組み合わせることによって調製される。
【０２５４】
種々の投与経路が、本明細書に以前に記載されたように利用可能である。選択された特定の様式は、当然ながら、選択された特定の化合物、処置されている状態の重篤度、および治療有効性に必要な投与量に依存する。
【０２５５】
同様に、マウスＴＬＲ９に関して上記の考察を類推すれば、単位用量の固体、液体、徐放性処方物などを含む種々の処方物が意図される。
【０２５６】
（スクリーニングアッセイ）
別の局面において、本発明は、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、およびＴＬＲ９を介するＩＳＮＡ誘導免疫調節において、ＩＳＮＡ模倣物、アゴニスト、またはアンタゴニストとして作用する候補化合物をスクリーニングするための方法を提供する。好ましくは、スクリーニング方法は、例えば、ロボットのまたは自動化されたアレイ取り扱いデバイスと組み合わせてサンプルのマルチウェルアレイの使用を通じて達成され得るような、ハイスループットスクリーニングアッセイを提供するように適合され得る。
【０２５７】
免疫刺激核酸としては、ＣｐＧ核酸が挙げられるがこれらに限定されない。
【０２５８】
本明細書に用いられるような「ＣｐＧ核酸」または「ＣｐＧ免疫刺激核酸」は、少なくとも１つの非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含む核酸（シトシン−グアニンジヌクレオチド配列、すなわち、「ＣｐＧ ＤＮＡ」または５’シトシン、続いて３’グアニンを含み、そしてリン酸結合で連結されたＤＮＡ）であり、そして免疫系の成分を活性化する。ＣｐＧ核酸の全体が、メチル化されていなくてもよいし、部分がメチル化されていなくてもよいが、５’ＣＧ３’の少なくともＣは、メチル化されていてはならない。
【０２５９】
１つの実施形態において、ＣｐＧ核酸は、少なくとも以下の式によって示され：
５’−Ｎ_１Ｘ_１ＣＧＸ_２Ｎ_２−３’
ここで、Ｘ_１およびＸ_２は、ヌクレオチドであり、Ｎは任意のヌクレオチドであり、そしてＮ_１およびＮ_２は、各々約０〜２５Ｎからなる核酸配列である。いくつかの実施形態において、Ｘ_１はアデニン、グアニン、またはチミンであり、そして／またはＸ_２は、シトシン、アデノン、またはチミンである。他の実施形態において、Ｘ_１は、シトシンであり、そして／またはＸ_２は、グアニンである。
【０２６０】
他の実施形態において、ＣｐＧ核酸は、少なくとも以下の式によって示され：
５’−Ｎ_１Ｘ_１Ｘ_２ＣＧＸ_３Ｘ_４Ｎ_２−３’
ここで、Ｘ_１、Ｘ_２、Ｘ_３、およびＸ_４は、ヌクレオチドであり、Ｎは任意のヌクレオチドであり、そしてＮ_１およびＮ_２は、各々約０〜２５Ｎからなる核酸配列である。いくつかの実施形態において、Ｘ_１Ｘ_２は、ＧｐＴ、ＧｐＧ、ＧｐＡ、ＡｐＡ、ＡｐＴ、ＡｐＧ、ＣｐＴ、ＣｐＡ、ＣｐＧ、ＴｐＡ、ＴｐＴ、およびＴｐＧからなる群より選択されるヌクレオチドであり；そしてＸ_３Ｘ_４は、ＴｐＴ、ＣｐＴ、ＡｐＴ、ＴｐＧ、ＡｐＧ、ＣｐＧ、ＴｐＣ、ＡｐＣ、ＣｐＣ、ＴｐＡ、ＡｐＡ、およびＣｐＡからなる群より選択されるヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、Ｘ_１Ｘ_２は、ＧｐＡまたはＧｐＴであり、そしてＸ_３Ｘ_４は、ＴｐＴである。他の実施形態において、Ｘ_１またはＸ_２またはその両方は、プリンであり、そしてＸ_３またはＸ_４またはその両方は、ピリミジンであるか、あるいはＸ_１Ｘ_２はＧｐＡであり、そしてＸ_３またはＸ_４またはその両方は、ピリミジンである。
【０２６１】
別の実施形態において、ＣｐＧ核酸は少なくとも以下の式によって示され：
５’−ＴＣＮ_１ＴＸ_１Ｘ_２ＣＧＸ_３Ｘ_４−３’
ここで、Ｘ_１、Ｘ_２、Ｘ_３、およびＸ_４は、ヌクレオチドであり；Ｎは任意のヌクレオチドであり；そしてＮ_１およびＮ_２は、各々約０〜２５Ｎからなる核酸配列である。いくつかの実施形態において、Ｘ_１Ｘ_２は、ＧｐＴ、ＧｐＧ、ＧｐＡ、ＡｐＡ、ＡｐＴ、ＡｐＧ、ＣｐＴ、ＣｐＡ、ＣｐＧ、ＴｐＡ、ＴｐＴ、およびＴｐＧからなる群より選択されるヌクレオチドであり；そしてＸ_３Ｘ_４は、ＴｐＴ、ＣｐＴ、ＡｐＴ、ＴｐＧ、ＡｐＧ、ＣｐＧ、ＴｐＣ、ＡｐＣ、ＣｐＣ、ＴｐＡ、ＡｐＡ、およびＣｐＡからなる群より選択されるヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、Ｘ_１Ｘ_２は、ＧｐＡまたはＧｐＴであり、そしてＸ_３Ｘ_４は、ＴｐＴである。他の実施形態において、Ｘ_１またはＸ_２またはその両方は、プリンであり、そしてＸ_３またはＸ_４またはその両方は、ピリミジンであるか、あるいはＸ_１Ｘ_２はＧｐＡであり、そしてＸ_３またはＸ_４またはその両方は、ピリミジンである。
【０２６２】
本発明に従うＣｐＧ核酸の例としては、表１に列挙される核酸（例えば、配列番号２１〜２９、３１〜４２、４４、４６〜５０、５２〜６２、６４〜７５、７７〜８８、９０〜１１７、１１９〜１２４）が挙げられるがこれらに限定されない。
【０２６３】
【表１】

他のＩＳＮＡとしては、Ｔ−リッチ核酸、ポリＧ核酸、およびリン酸修飾骨格（例えば、ホスホロチオエート骨格）を有する核酸が挙げられるがこれらに限定されない。
【０２６４】
「Ｔリッチ核酸」または「Ｔリッチ免疫刺激核酸」は、少なくとも１つのポリＴ配列を含み、そして／または２５％より大きいＴヌクレオチド残基からなるヌクレオチドを有し、そして免疫系の成分を活性化する核酸である。ポリＴ配列を有する核酸は、５’ＴＴＴＴ３’のように、列中に少なくとも４つのＴを含む。好ましくは、Ｔリッチ核酸は、１より多いポリＴ配列を含む。好ましい実施形態において、Ｔリッチ核酸は、２，３，４などのポリＴ配列を有し得る。本発明に従って発見された最も高度に免疫刺激性のＴリッチオリゴヌクレオチドは、全体としてＴヌクレオチド残基からなる核酸である。他のＴリッチ核酸は、２５％より大きいＴヌクレオチド残基からなるヌクレオチド組成を有するが、ポリＴ配列を含む必要はない。これらのＴリッチ核酸において、Ｔヌクレオチド残基は、他のタイプのヌクレオチド残基（すなわち、Ｇ、ＣおよびＡ）によってお互いに分離され得る。いくつかの実施形態において、Ｔリッチ核酸は、Ｔヌクレオチド残基が３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、および９９％より大きい、そしてあらゆるその間の％のヌクレオチド組成物を有する。好ましくは、Ｔリッチ核酸は、少なくとも１つのポリＴ配列、および２５％より大きいＴヌクレオチド残基のヌクレオチド組成物を有する。
【０２６５】
１つの実施形態において、Ｔリッチ核酸は、少なくとも以下の式によって示され：
５’Ｘ_１Ｘ_２ＴＴＴＴＸ_３Ｘ_４３’
ここで、Ｘ_１、Ｘ_２、Ｘ_３、およびＸ_４は、ヌクレオチドである。１つの実施形態において、Ｘ_１Ｘ_２は、ＴＴであり、そして／またはＸ_３Ｘ_４は、ＴＴである。別の実施形態において、Ｘ_１Ｘ_２は、以下のヌクレオチドのいずれか１つであり：ＴＡ、ＴＧ、ＴＣ、ＡＴ、ＡＡ、ＡＧ、ＡＣ、ＣＴ、ＣＣ、ＣＡ、ＣＧ、ＧＴ、ＧＧ、ＧＡ、およびＧＣ；そしてＸ_３Ｘ_４は、以下のヌクレオチドのいずれか１つである：ＴＡ、ＴＧ、ＴＣ、ＡＴ、ＡＡ、ＡＧ、ＡＣ、ＣＴ、ＣＣ、ＣＡ、ＣＧ、ＧＴ、ＧＧ、ＧＡ、およびＧＣ。
【０２６６】
いくつかの実施形態において、Ｔリッチ核酸は、ポリＣ（ＣＣＣＣ）、ポリＡ（ＡＡＡＡ）、ポリＧ（ＧＧＧＧ）、ＣｐＧモチーフ、または複数のＧＣを含まないことが好ましい。他の実施形態において、Ｔリッチ核酸は、これらのモチーフを含む。従って、本発明のいくつかの実施形態において、Ｔリッチ核酸は、ＣｐＧジヌクレオチドを含み、そして他の実施形態において、Ｔリッチ核酸は、ＣｐＧジヌクレオチドを含まない。ＣｐＧジヌクレオチドは、メチル化されていてもいなくてもよい。
【０２６７】
ポリＧ含有核酸はまた免疫刺激性である。ＰｉｓｅｔｓｋｙおよびＲｅｉｃｈ，１９９３ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｏｒｔｓ，１８：２１７〜２２１；ＫｒｉｅｇｅｒおよびＨｅｒｚ，１９９４、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６３：６０１〜６３７；Ｍａｃａｙａら、１９９３、ＰＮＡＳ，９０：３７４５〜３７４９；Ｗｙａｔｔら、１９９４、ＰＮＡＳ，９１：１３５６〜１３６０；Ｒａｎｄｏ、およびＨｏｇａｎ，１９９８、Ａｐｐｌｉｅｄ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ編、ＫｒｉｅｇおよびＳｔｅｉｎ、第３３５〜３５２頁；およびＫｉｍｕｒａら、１９９４、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１６，９９１〜９９４を含む種々の参考文献がまた、ポリＧ核酸の免疫刺激特性を記載している。
【０２６８】
ポリＧ核酸は好ましくは、以下の式を有する核酸であり：
５’Ｘ_１Ｘ_２ＧＧＧＸ_３Ｘ_４３’
ここで、Ｘ_１、Ｘ_２、Ｘ_３、およびＸ_４は、ヌクレオチドである。好ましい実施形態において、少なくとも１つのＸ_３およびＸ_４は、Ｇである。他の実施形態において、Ｘ_３およびＸ_４の両方は、Ｇである。なお他の実施形態において、好ましい式は、５’ＧＧＧＮＧＧＧ３’、または５’ＧＧＧＮＧＧＧＮＧＧＧ３’であり、ここでＮは、０ヌクレオチド〜２０ヌクレオチドを示す。他の実施形態において、ポリＧ核酸は、メチル化されていないＣＧジヌクレオチドを含まない。他の実施形態において、ポリＧ核酸は、少なくとも１つのメチル化されていないＣＧジヌクレオチドを含む。
【０２６９】
修飾骨格（例えば、ホスホロチオエート骨格）を有する核酸はまた、免疫刺激核酸のクラス内におさまる。米国特許第５，７２３，３３５号および同第５，６６３，１５３号（Ｈｕｔｃｈｅｒｓｏｎらに発行）および関連のＰＣＴ公開ＷＯ９５／２６２０４は、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドアナログを用いる免疫刺激を記載する。これらの特許は、ホスホロチオエート骨格が、非配列特異的な様式で免疫系を刺激する能力を記載している。
【０２７０】
ＩＳＮＡは、二本鎖であっても一本鎖であってもよい。一般に二本鎖分子は、インビボでより安定であり得るが、一本鎖分子は、活性が増大しているかもしれない。用語「核酸」および「オリゴヌクレオチド」とは、複数のヌクレオチドすなわち、リン酸基および交換可能な有機塩基に連結された糖（例えば、リボースまたはデオキシリボース）を含む分子をいう。この塩基は、置換されたピリミジン（例えば、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、またはウラシル（Ｕ））、または置換されたプリン（例えば、アデニン（Ａ）、またはグアニン（Ｇ））、または改変された塩基のいずれかである。本明細書において用いる場合、この用語は、オリゴヌクレオチドおよびオリゴデオキシリボヌクレオチドをいう。この用語はまた、ポリヌクレオチド（すなわち、ポリヌクレオチド、マイナスホスフェート）、および任意の他の有機塩基含有ポリマーを含む。用語「核酸」および「オリゴヌクレオチド」はまた、共有結合的に修飾された塩基および／または糖を有する核酸またはオリゴヌクレオチドを包含する。例えば、それらは、３’位置でヒドロキシル基以外の、５’位置でホスフェート基以外の低分子量有機基に共有結合している骨格糖を有する核酸を含む。従って、改変された核酸は、２’−Ｏ−アルキル化リボース基を含み得る。さらに、改変された核酸は、リボースの変わりにアラビノースのような糖を含み得る。従って、この核酸は、骨格組成において異種（外来）であり、それによってペプチド−核酸（核酸塩基を有するアミノ酸骨格を有する）のような、一緒に連結されたポリマー単位の任意の可能な組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、この核酸は骨格組成において同種である。
【０２７１】
ＩＳＮＡの置換されたプリンおよびピリミジンは、標準的なプリンおよびピリミジン（例えば、システイン）、ならびに塩基アナログ（例えば、Ｃ−５プロピン置換された塩基）を含む。Ｗａｇｅｒ ＲＷら、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １４：８４０〜８４４（１９９６）。プリンおよびピリミジンはとしては、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、５−メチルシトシン、２−アミノプリン、２−アミノ−６−クロロプリン、２，６−ジアミノプリン、ヒポキサンチン、および他の天然に存在する核酸塩基および天然に存在しない核酸塩基、置換された芳香族部分および置換されていない芳香族部分が挙げられるがこれらに限定されない。
【０２７２】
ＩＳＮＡは、塩基またはヌクレオチドの連結ポリマーである。核酸の連結単位について、本明細書において用いる場合、「連結した（された）（ｌｉｎｋｅｄ）」または「連結（ｌｉｎｋａｇｅ）」とは、２つのものが任意の物理化学的な手段でお互いに結合していることを意味する。当業者に公知の任意の共有結合的な連結、または非共有結合的な連結が包含される。このような連結は、当業者に周知である。天然の連結（核酸の個々の単位に対する接続が通常天然に見出される）が最も一般的である。しかし、核酸の個々の単位は、合成連結または改変された連結によって連結されてもよい。
【０２７３】
核酸が文字の配列で示されている時はいつも、ヌクレオチドは左から右に５’〜３’方向であること、そして他に注記しない限り、「Ａ」はアデニンを示し、「Ｃ」はシトシンを示し、「Ｇ」はグアニンを示し、「Ｔ」はチミジンを示し、そして「Ｕ」は、ウラシルを示すことが理解される。
【０２７４】
本発明による有用な免疫刺激性核酸分子は、天然の核酸供給源（例えば、ゲノム核またはミトコンドリアＤＮＡまたはｃＤＮＡ）から得られ得るか、または合成である（例えば、オリゴヌクレオチド合成によって生成される）。既存の核酸供給源から単離された核酸は、本明細書において、ネイティブ、天然、または単離された核酸と称される。本発明による有用な核酸は、真核生物供給源、原核生物供給源、核ＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡなどを含む任意の供給源から単離され得る。従って、核酸という用語は、合成核酸および単離された核酸の両方を包含する。
【０２７５】
用語「単離された」とは、ＩＳＮＡに関して本明細書において用いる場合、その意図される用途に実際的でかつ適切である程度まで、天然で通常関連する成分（例えば、核酸、タンパク質、脂質、炭水化物、またはインビボ系）を実質的に含まないか、またはそのような成分から分離されたことを意味する。詳細には、核酸は、例えば、薬学的な調製物の生成において有用であるように、実質的に純粋であり、そして宿主細胞の他の生物学的構成要素を実質的に含まない。本発明の単離された核酸は、薬学的な調製物中で薬学的に受容可能なキャリアと混合され得るので、核酸は、この調製物の重量あたりわずかな割合しか含まれないかもしれない。核酸は、それでもなお、生存している系においては関与し得る物質から実質的に分離されているという点で実質的に純粋である。
【０２７６】
ＩＳＮＡは、プラスミドにおいて大規模で実施され得（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら、編、第二版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８９を参照のこと）、そして小片に分割されるか、または全体で投与され得る。被験体に投与された後、このプラスミドは、オリゴヌクレオチドに分解され得る。当業者は、標準的な技術（例えば、制限酵素、エキソヌクレアーゼ、またはエンドヌクレアーゼを使用する技術）を用いて、ウイルス、細菌、真核生物、核酸などを精製し得る。
【０２７７】
本発明における使用のために、ＩＳＮＡは、当該分野で周知の多数の手順のいずれかを用いて新しく合成され得る。例えば、βシアノエチルホスホルアミダイト法（Ｂｅａｕｃａｇｅ ＳＬ、およびＣａｒｕｔｈｅｒｓ ＭＨ、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔ ２２：１８５９（１９８１））；ヌクレオシドＨ−ホスフェート法（Ｇａｒｅｇｇら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔ ２７：４０５１〜４０５４（１９８６）；Ｆｒｏｅｈｌｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ １４：５３９９〜５４０７（１９８６）；Ｇａｒｅｇｇら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔ ２７：４０５５〜４０５８（１９８６）；Ｇａｆｆｎｅｙら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔ ２９：２６１９〜２６２２（１９８８））。これらの化学は、市場において利用可能な種々の自動化されたオリゴヌクレオチドシンセサイザーによって実施され得る。
【０２７８】
改変骨格（例えば、ホスホロチオエート骨格）を有するＩＳＮＡもまた、免疫刺激性核酸のクラス内におさまる。米国特許第５，７２３，３３５号および同第５，６６３，１５３号（Ｈｕｔｃｈｅｒｓｏｎらに発行）および関連のＰＣＴ公開ＷＯ９５／２６２０４は、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドアナログを用いる免疫刺激を記載している。これらの特許は、ホスホロチオエート骨格が非配列特異的な様式で免疫応答を刺激する能力を記載している。
【０２７９】
ＩＳＮＡは、少なくとも６ヌクレオチドの任意のサイズであり得るが、いくつかの実施形態においては、６〜１００ヌクレオチドのサイズの範囲であり、またはいくつかの実施形態では８〜３５ヌクレオチドのサイズの範囲である。免疫刺激核酸は、プラスミドにおいて大規模に生成され得る。これらは、プラスミド形態で投与されてもよいし、あるいはそれらは投与の前にオリゴヌクレオチドに分解されてもよい。
【０２８０】
「回文構造の配列（パリンドローム配列）」とは、逆位反復（すなわち、ＡＢＣＤＥＥ’Ｄ’Ｃ’Ｂ’Ａ’のような配列、ここでＡおよびＡ’，ＢおよびＢ’などは、通常のワトソン−クリック塩基対を形成し得る塩基であり、このパリンドロームは少なくとも６ヌクレオチドを含む）を意味する。インビボにおいて、このような配列は、二本鎖構造を形成し得る。１実施形態において、核酸は、回文構造の配列を含む。いくつかの実施形態において、核酸がＣｐＧ核酸である場合、この文脈で用いられる回文構造の配列とは、ＣｐＧがパリンドロームの一部であり、そして必要に応じてパリンドロームの中心であるパリンドロームをいう。別の実施形態において、核酸はパリンドロームを含まない。パリンドロームを含まない核酸は、パリンドロームである６ヌクレオチド以上の長さのいずれの領域も有さない。パリンドロームを含まない核酸は、回文構造である６ヌクレオチド未満の領域を含み得る。
【０２８１】
「安定化されたＩＳＮＡ」とは、インビボの分解（例えば、エキソヌクレアーゼまたはエンドヌクレオチドを介する）に対して比較的耐性である核酸分子を意味する。安定化は、長さまたは二次構造の関数であり得る。数十〜数百ｋｂｓの長さである核酸は、インビボ分解に対して比較的耐性である。より短い核酸については、二次構造が、それらの効果を安定化しかつ増大し得る。例えば、オリゴヌクレオチドの３’末端が上流領域に対して半相補性を有し、それによって３’末端が折り畳み得、そしていわゆるステムループ構造を形成し得るような場合、このオリゴヌクレオチドは安定化し、従ってさらに活性を示す。
【０２８２】
本発明のいくつかの安定化されたＩＳＮＡは、改変された骨格を有する。オリゴヌクレオチド骨格の改変が、インビボで投与された場合、ＩＳＮＡの活性を強化することが実証された。核酸（オリゴヌクレオチドの５’末端で少なくとも２つのホスホロチオエート連結、および３’末端で複数（好ましくは５個）のホスホロチオエート連結を含む）は、最大の活性を提供し得、そして細胞内のエキソヌクレアーゼおよびエンドヌクレアーゼによる分解からオリゴヌクレオチドを保護し得る。他の改変されたオリゴヌクレオチドとしては、ホスホジエステル改変オリゴヌクレオチド、ホスホジエステルおよびホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの組み合わせ、メチルホスホネート、メチルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ならびにそれらの組み合わせが挙げられる。免疫細胞に対するこれらの組み合わせの各々およびそれらの特別な効果は、米国特許第６，１９４，３８８号、および同第６，２０７，６４６号（本明細書においてその内容全体が参考として援用される）にさらに詳細に考察される。これらの改変されたオリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼ耐性の強化、細胞取り込みの増大、タンパク質結合の増大、および／または細胞内局在化の変化に起因して、より刺激性の活性を示し得る。ホスホロチオエート核酸およびホスホジエステル核酸の両方が免疫細胞において活性である。
【０２８３】
他の安定化されたＩＳＮＡとしては、以下が挙げられる：非イオン性ＤＮＡアナログ（例えば、アルキルホスフェートおよびアリールホスフェート）（ここで荷電したホスホネート酸素は、アルキル基またはアリール基で置換されている）、ホスホジエステルおよびアルキルホスホトリエステル（ここで荷電された酸素部分はアルキル化されている）。いずれかの末端で、または両方の末端でジオール（例えば、テトラエチレングリコールまたはヘキサエチレングリコール）を含むオリゴヌクレオチドはまた、ヌクレアーゼ分解に対して実質的に耐性であることが示されている。
【０２８４】
インビボ使用に関して、ＩＳＮＡは好ましくは、分解（例えば、エンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼを介する）に対して比較的耐性である。二次構造（例えばステムループ）は、分解に対して核酸を安定化し得る。あるいは、核酸安定化は、リン酸骨格の改変を介して達成され得る。安定化された核酸の１つのタイプは、ホスホロチオエート改変骨格の少なくとも一部を有する。ホスホロチオエートは、ホスホラミデートまたはＨ−ホスホネート化学のいずれかを使用して自動化技術を用いて合成され得る。アリールホスホネートおよびアルキルホスホネートは、例えば、米国特許第４，４６９，８６３号に記載のように作成され得；そしてアルキルホスホトリエステル（ここで荷電された酸素部分は、米国特許第５，０２３，２４３号および欧州特許第０９２，５７４号に記載のように、アルキル化されている）は、市販の試薬を用いて自動化された固相合成によって調製され得る。他のＤＮＡ骨格改変および置換を作成するための方法が記載されている。Ｕｈｌｍａｎｎ ＥおよびＰｅｙｍａｎ Ａ、Ｃｈｅｍ Ｒｅｖ ９０：５４４（１９９０）；Ｇｏｏｄｃｈｉｌｄ Ｊ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ １：１６５（１９９０）。
【０２８５】
本発明によって有用な免疫刺激核酸の他の供給源としては、標準的なウイルスおよび細菌ベクター（その多くが市販されている）が挙げられる。広義では、「ベクター」は、細胞に対して核酸を送達し、核酸の移入を促進するために通常用いられる任意の核酸材料である。本明細書において用いられるベクターは、空のベクターまたは発現され得る遺伝子を運ぶベクターであり得る。ベクターが遺伝子を運ぶ場合、このベクターは一般に遺伝子を標的細胞に輸送するが、このときベクターの非存在下で生じる分解の程度に対して分解は低下している。この場合、ベクターは必要に応じて、標的細胞（例えば、免疫細胞）における遺伝子の発現を増強するような遺伝子発現配列を含む。ただし、この細胞において遺伝子が発現されることは必要ではない。
【０２８６】
特定のスクリーニングアッセイのための基礎は、細胞における機能的なＴＬＲ７、ＴＬＲ８、またはＴＬＲ９の存在である。ある場合の機能的なＴＬＲは、細胞によって天然に発現される。他の場合、機能的なＴＬＲの発現は、細胞または細胞株への種特異的なＴＬＲ９の導入または再構成（この細胞または細胞株はさもなければＴＬＲを欠くか、ＩＳＮＡに対する反応性を欠く）を包含し得、これによってＩＳＮＡとの接触に応答してＴＬＲ／ＩＬ−１Ｒシグナル伝達経路を活性化し得る細胞または細胞株を生じる。ＴＬＲ９またはＩＳＮＡ反応性を欠く細胞株の例としては、２９３線維芽細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５７３）、ＭｏｎｏＭａｃ−６、ＴＨＰ−１、Ｕ９３７、ＣＨＯ、および任意のＴＬＲ９ノックアウトが挙げられるがこれらに限定されない。細胞または細胞株への種特異的なＴＬＲの導入は好ましくは、遺伝子発現配列（上記のような）に作動可能に連結されたＴＬＲコード核酸配列での細胞または細胞株の一過性のトランスフェクションまたは安定なトランスフェクションによって達成される。
【０２８７】
種特異的ＴＬＲ（ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、およびＴＬＲ９を含む）は、マウスＴＬＲに限定されず、むしろマウスまたは非マウス供給源由来のＴＬＲを含み得る。非マウス供給源の例としては、ヒト、ウシ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、およびウマが挙げられるがこれらに限定されない。他の種としては、ニワトリおよび魚類（例えば、養殖魚種）が挙げられる。
【０２８８】
種特異的ＴＬＲ（ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、およびＴＬＲ９を含む）はまた、ネイティブなＴＬＲポリマーに限定されない。特定の実施形態において、ＴＬＲは例えば、細胞外ドメインおよび細胞質ドメインが、異なる種由来のＴＬＲポリペプチドに由来するキメラＴＬＲであり得る。このようなキメラＴＬＲポリペプチドは、上記のように、例えば、ヒトＴＬＲ細胞外ドメインおよびマウスＴＬＲ細胞質ドメイン（各ドメインは、各種の対応するＴＬＲ７、ＴＬＲ８、またはＴＬＲ９に由来する）を含み得る。別の実施形態において、このようなキメラＴＬＲポリペプチドは、異なるＴＬＲ種の改変体またはアロタイプで作成されたキメラを含み得る。ＩＳＮＡ模倣物、アゴニスト、およびアンタゴニストをスクリーニングする目的のために有用な他のキメラＴＬＲポリペプチドは、第一タイプのＴＬＲ（例えば、ＴＬＲ９）、および第一タイプのＴＬＲと同じかもしくは別の種の別のＴＬＲ（例えば、ＴＬＲ７またはＴＬＲ８）で作成されたキメラポリペプチドを含み得る。また、２つ以上のポリペプチド由来の配列、例えば、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞質ドメイン（全て異なるポリペプチド供給源由来）を組み込むキメラポリペプチドも、このようなドメインの少なくとも１つがＴＬＲ７、ＴＬＲ８、またはＴＬＲ９のポリペプチド由来であるという条件で、企図される。さらなる例として、１つのＴＬＲ９の細胞外ドメイン、別のＴＬＲ９の細胞内ドメイン、および非ＴＬＲレポーター（例えば、ルシフェラーゼ、ＧＦＰなど）を含む構築物もまた企図される。当業者は、このようなキメラＴＬＲポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を設計および生成する方法を認識している。
【０２８９】
スクリーニングアッセイは、ＴＬＲ／ＩＬ−１Ｒシグナル伝達経路またはＩＳＮＡに対する応答をアッセイするために有用な他のアッセイのいずれかに基づく、多数の可能な読み出し系のいずれかを有し得る。ＣｐＧ免疫刺激性配列による免疫細胞活性化は、ある点ではエンドソームプロセシングに依存することが報告されている。ＴＬＲ９がこのエンドソーム経路に直接関与するか否か、またはＴＬＲ９とエンドソームとの間に数種の中間体が存在しているか否かは、まだ知られていない。
【０２９０】
好ましい実施形態において、スクリーニングアッセイのための読み出しは、ネイティブの遺伝子の使用に基づくか、またはあるいは、同時トランスフェクトされるか、さもなければＴＬＲ／ＩＬ−１Ｒシグナル伝達経路に感応性であるレポーター遺伝子構築物（ＭｙＤ８８、ＴＲＡＦ６、ｐ３８、および／またはＥＲＫを含む）を同時導入される。Ｈａｅｃｋｅｒ Ｈら、ＥＭＢＯ Ｊ １８：６９７３〜６９８２（１９９９）。これらの経路は、キナーゼ（κＢキナーゼ複合体およびｃ−Ｊｕｎ Ｎ末端キナーゼを含む）を活性化させる。従って、アッセイのために特に有用なレポーター遺伝子およびレポーター遺伝子構築物は、ＮＦ−κＢに応答性のプロモーターに作動可能に連結されたレポーター遺伝子を含み得る。このようなプロモーターの例としては、限定しないが、ＮＦ−κＢ、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２ ｐ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６およびＴＮＦ−αが挙げられる。ＴＬＲ７−応答性プロモーター、ＴＬＲ８−応答性プロモーターまたはＴＬＲ９−応答性プロモーターに作動可能に連結されたレポーター遺伝子としては、限定しないが、酵素（例えば、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）など）、生物発光（例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ、米国特許第５，４９１，０８４号）など）、表面発現分子（例えば、ＣＤ２５）、および分泌分子（例えば、ＩＬ−８、ＩＬ−１２ ｐ４０、ＴＮＦ−α）が挙げられ得る。好ましい実施形態において、レポーターは、ＩＬ−８、ＴＮＦ−α、ＮＦ−κＢ−ルシフェラーゼ（ＮＦ−κＢ−ｌｕｃ；Ｈａｅｃｋｅｒ Ｈら、ＥＭＢＯ Ｊ １８：６９７３〜６９８２（１９９９））、ＩＬ−１２ ｐ４０−ｌｕｃ（Ｍｕｒｐｈｙ ＴＬら、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １５：５２５８〜５２６７（１９９５））、ならびにＴＮＦ−ｌｕｃ（Ｈａｅｃｋｅｒ Ｈら、ＥＭＢＯ Ｊ １８：６９７３〜６９８２（１９９９））から選択される。酵素活性読み出しに依存するアッセイにおいて、基質がアッセイの一部として供給され、そして検出は、化学発光、蛍光、着色、放射活性レベルの取り込み、薬物耐性、または酵素活性の他のマーカーの測定を含み得る。分子の表面発現に依存するアッセイについて、検出は、ＦＡＣＳ分析または機能的アッセイを使用して達成され得る。分泌分子は、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）またはバイオアッセイを使用してアッセイされ得る。このような多くの読み出し系が当該分野で周知であり、そして市販されている。
【０２９１】
別の局面において、本発明は、免疫刺激性核酸分子（ＩＳＮＡ）を同定するためのスクリーニング方法を提供する。この方法は、以下の工程を必要とする：ＴＬＲ７、ＴＬＲ８およびＴＬＲ９からなる群より選択される機能的ＴＬＲを、試験核酸分子と接触させる工程；試験核酸分子の存在下で、機能的ＴＬＲと試験核酸分子との間の相互作用の結果として生じるＴＬＲシグナル伝達経路によって媒介される応答の存在の有無を検出する工程；ならびに、ＴＬＲシグナル伝達経路によって媒介される応答の存在が検出された場合に、この試験核酸分子がＩＳＮＡであるか否かを決定する工程。「機能的ＴＬＲ」および「細胞発現機能的ＴＬＲ」は、本明細書中の他の箇所で記載される通りである。ＴＬＲシグナル伝達経路によって媒介される応答は、ＴＬＲ／ＩＬ−１Ｒシグナル伝達経路に対して応答性のプロモーター（ＮＦ−κＢに対して応答性のプロモーターが挙げられるがこれらに限定されない）の制御下での遺伝子の導入を含む。従って、生物学的応答は、例えば、ＩＬ−８の分泌、およびＮＦ−κＢ−ｌｕｃ、ＩＬ−１２ ｐ４０−ｌｕｃまたはＴＮＦ−ｌｕｃでトランスフェクトされた細胞におけるルシフェラーゼ活性を含み得る。試験核酸分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡまたは本明細書中に記載されるような改変された核酸分子を含み得る。いくつかの実施形態において、この試験核酸分子は、ＣｐＧ核酸である。
【０２９２】
好ましくは、この試験核酸分子は、参照ＩＳＮＡの配列改変体であり、これらは、特定の参照ＩＳＮＡと比較して、少なくとも１つの代替的塩基、少なくとも１つの代替的ヌクレオチド間骨格結合、または少なくとも１つの代替的糖部分を含む。好ましい実施形態において、試験核酸分子は、このような試験核酸分子のライブラリーのメンバーである。
【０２９３】
本方法の１つの実施形態に従って、参照ＩＳＮＡに対する比較がなされ得る。この参照ＩＳＮＡは、任意のＩＳＮＡ（ＣｐＧ核酸を含む）であり得る。好ましい実施形態において、このスクリーニング方法は、複数の試験核酸を使用して達成され得る。好ましくは、試験応答と参照応答との比較は、各例における応答の定量的な測定の比較に基づく。
【０２９４】
本方法を使用して、ＴＬＲシグナル伝達経路によって媒介される類似の特異的応答を誘導する試験核酸分子の能力に基づいて、それらの試験核酸分子のサブセットを分泌させ得る。例えば、本方法を使用して、優勢にＢ細胞を活性化させるＣｐＧ核酸として、または優勢にＩＦＮ−αを誘導するＣｐＧ核酸として、試験ＣｐＧ核酸を分類し得る。ＩＳＮＡの他の新たなクラスは、本方法を使用して同定および特徴づけされ得る。
【０２９５】
本方法の適用によって、ＩＳＮＡを同定すること、所定のＴＬＲの配列特異性を描写すること、および、ＩＳＮＡ配列を最適化することもまた可能になる。ＩＳＮＡの同定は、上記のような候補ＩＳＮＡをスクリーニングすること、および規定されるような応答を誘導する任意のＩＳＮＡを選択することを含む。配列特異性の描写は、特定のＴＬＲ９について、上記のような候補ＩＳＮＡをスクリーニングすること、規定されるような応答を誘導する任意のＩＳＮＡを選択すること、およびそれらの配列に基づいて応答を誘導するＩＳＮＡと応答を誘導しないＩＳＮＡとに分類することを含む。ＩＳＮＡ配列の最適化は、上記のような方法を繰返し適用することを含み、この方法は、任意の所定の段階またはスクリーニング回数において最良の配列を選択する工程、および次のスクリーニングにおける基準または参照としてとしてそれを代用する工程をさらに包含する。この後者のプロセスは、スクリーニングするための候補ＩＳＮＡを選択および作製する際に、変更するためのパラメータの選択をさらに含み得る。
【０２９６】
別の局面において、本発明は、ＩＳＮＡの種特異性を同定するためのスクリーニング方法を提供する。この方法は、以下を包含する：第一種のＴＬＲ７、ＴＬＲ８およびＴＬＲ９からなる群より選択される機能的ＴＬＲを、試験ＩＳＮＡと接触させる工程；第二種のＴＬＲ７、ＴＬＲ８およびＴＬＲ９からなる群より選択される機能的ＴＬＲを、試験ＩＳＮＡと接触させる工程；ＴＬＲシグナル伝達経路によって媒介される応答を測定する工程であり、このＴＬＲシグナル伝達経路が、第一種の機能的ＴＬＲを試験ＩＳＮＡと接触させることに関連する、工程；ＴＬＲシグナル伝達経路によって媒介される応答を測定する工程であり、このＴＬＲシグナル伝達経路が、第二種の機能的ＴＬＲを試験ＩＳＮＡと接触させることに関連する、工程；ならびに、（ａ）第一種の機能的ＴＬＲを試験ＩＳＮＡと接触させることに関連するＴＬＲシグナル伝達経路によって媒介される応答と、（ｂ）第二種の機能的ＴＬＲを試験ＩＳＮＡと接触させることに関連するＴＬＲシグナル伝達経路によって媒介される応答とを比較する工程。この機能的ＴＬＲは、細胞によって発現されても、無細胞系の一部であってもよい。この機能的ＴＬＲは、別のＴＬＲまたは別のタンパク質（例えば、ＭｙＤ８８、ＩＲＡＫ、ＴＲＡＦ６、ＩκＢ、ＮＦ−κＢ、もしくはそれらの機能的ホモログおよび誘導体）のいずれかとの複合体の一部であり得る。従って、例えば、所定のＯＤＮは、種々の種由来のＴＬＲ７、ＴＬＲ８またはＴＬＲ９でトランスフェクトされた２９３繊維芽細胞のパネルに対して試験され得、そしてＴＬＲ／ＩＬ−１Ｒ活性経路に対して応答性のレポーター構築物（例えば、ＮＦ−κＢ−ｌｕｃ）と、必要に応じて同時トランスフェクトされ得る。従って、別の局面において、本発明は、所定の核酸配列に対する種選択性をスクリーニングするための方法を提供する。
【０２９７】
上記で言及されるように、１つの局面において、本発明は、ＴＬＲシグナル伝達活性または参照ＩＳＮＡの対応するＴＬＲシグネル伝達活性に対する試験化合物を比較するためのスクリーニング方法を提供する。この方法は、一般的には、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８およびＴＬＲ９からなる群より選択される機能的ＴＬＲを、参照ＩＳＮＡと接触させる工程、ならびにＴＬＲシグナル伝達経路によって媒介される参照応答を検出する工程；ＴＬＲ７、ＴＬＲ８およびＴＬＲ９からなる群より選択される機能的ＴＬＲを、試験化合物と接触させる工程、ならびにＴＬＲシグナル伝達経路によって媒介される試験応答を検出する工程；ならびに、試験応答を参照応答と比較して、試験化合物のＴＬＲシグナル伝達活性をＩＳＮＡと比較する工程を包含する。試験化合物および参照ＩＳＮＡが独立してＴＬＲと接触するアッセイを使用して、ＩＳＮＡ模倣物である試験化合物を同定し得る。試験化合物および参照ＩＳＮＡが同時にＴＬＲと接触するアッセイを使用して、ＩＳＮＡアゴニストおよびＩＳＮＡアンタゴニストである試験化合物を同定し得る。
【０２９８】
本明細書中で使用される場合、ＩＳＮＡ模倣物は、ＴＬＲシグナル伝達経路によって媒介される応答を引き起こす化合物である。本明細書中で使用される場合、用語「ＴＬＲシグナル伝達経路によって媒介される応答」とは、ＩＳＮＡ−ＴＬＲ相互作用に特徴的である応答をいう。本明細書中で実証されるように、ＩＳＮＡ−ＴＬＲ相互作用に特徴的である応答は、ＩＳＮＡ特異的プロモーター（例えば、ＮＦ−κＢプロモーター）の制御下での遺伝子の導入、Ｔｈ１サイトカインレベルの増加などを含む。ＮＦ−κＢプロモーターの制御下での遺伝子は、天然にＮＦ−κＢプロモーターを含む遺伝子であり得るか、またはＮＦ−κＢプロモーターが挿入されている構築物中の遺伝子であり得る。天然にＮＦ−κＢプロモーターを含む遺伝子としては、ＩＬ−８、ＩＬ−１２ ｐ４０、ＮＦ−κＢ−ｌｕｃ、ＩＬ−１２ ｐ４０−ｌｕｃおよびＴＮＦ−ｌｕｃが挙げられるがこれらに限定されない。Ｔｈ１サイトカインレベルの増加は、ＩＳＮＡ−ＴＬＲ相互作用に特徴的な別の尺度である。Ｔｈ１サイトカインレベルの増加は、ＩＳＮＡ−ＴＬＲ相互作用に対するＴｈ１試験核酸分子の、増加した産生または低下した安定性または増加した分泌から起こり得る。Ｔｈ１サイトカインとしては、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−１２が挙げられるがこれらに限定されない。ＩＳＮＡ−ＴＬＲ相互作用に特徴的である他の応答としては、Ｔｈ２サイトカインレベルの減少が挙げられるがこれらに限定されない。Ｔｈ２サイトカインとしては、ＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＬ−１０が挙げられるがこれらに限定されない。
【０２９９】
ＩＳＮＡ−ＴＬＲ相互作用に特徴的である応答は、直接的な応答または間接的な応答であり得る。直接的な応答は、ＩＳＮＡ−ＴＬＲ相互作用の結果として、直接的に起こる応答である。間接的な応答は、それが起こる前に他のパラメータの変更を含む応答である。
【０３００】
本明細書中で使用される場合、ＩＳＮＡアゴニストは、ＴＬＲシグナル伝達経路によって媒介されるＩＳＮＡに対する増強された応答を引き起こす化合物である。従って、本明細書中で使用される場合、ＩＳＮＡアゴニストは、参照ＩＳＮＡによって通常誘導される免疫応答の少なくとも１つの局面の増加を引き起こす化合物である。例えば、ＩＳＮＡによって通常誘導される免疫応答は、特に、免疫刺激性ＣｐＧ核酸に対するＴＬＲ７−媒介シグナル伝達、ＴＬＲ８−媒介シグナル伝達またはＴＬＲ９−媒介シグナル伝達を含み得る。ＩＳＮＡアゴニストは、いくつかの実施形態において、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８またはＴＬＲ９に結合するためにＩＳＮＡと競合する。他の実施形態において、ＩＳＮＡアゴニストは、ＩＳＮＡに結合するための部位からとは異なるＴＬＲ７、ＴＬＲ８またはＴＬＲ９上の部位に結合する。さらに他の実施形態において、ＩＳＮＡアゴニストは、別の分子またはＴＬＲ７、ＴＬＲ８またはＴＬＲ９とは異なる経路を介して作用する。
【０３０１】
本明細書中で使用される場合、ＩＳＮＡアンタゴニストは、ＴＬＲシグナル伝達経路によって媒介されるＩＳＮＡに対する減少した応答を引き起こす化合物である。従って、本明細書中で使用される場合、ＩＳＮＡアンタゴニストは、参照ＩＳＮＡによって通常誘導される免疫応答の少なくとも１つの局面の減少を引き起こす化合物である。例えば、ＩＳＮＡによって通常誘導される免疫応答は、特に、免疫刺激性ＣｐＧ核酸に対するＴＬＲ７−媒介シグナル伝達、ＴＬＲ８−媒介シグナル伝達またはＴＬＲ９−媒介シグナル伝達を含み得る。ＩＳＮＡアンタゴニストは、いくつかの実施形態において、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８またはＴＬＲ９に結合するためにＩＳＮＡと競合する。他の実施形態において、ＩＳＮＡアンタゴニストは、ＩＳＮＡに結合するための部位とは異なるＴＬＲ７、ＴＬＲ８またはＴＬＲ９上の部位に結合する。さらに他の実施形態において、ＩＳＮＡアンタゴニストは、別の分子またはＴＬＲ７、ＴＬＲ８またはＴＬＲ９とは異なる経路を介して作用する。
【０３０２】
試験化合物のＴＬＲシグナル伝達活性をＩＳＮＡのシグナル伝達活性と比較するためのスクリーニング方法は、試験化合物の不在下で、参照ＩＳＮＡが免疫応答の少なくとも１つの局面を誘導するのが可能な条件下で、少なくとも１つの試験化合物を、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８およびＴＬＲ９から選択される機能的ＴＬＲと接触させる工程を包含する。この機能的ＴＬＲは、細胞によって発現されても、無細胞系の一部であってもよい。機能的ＴＬＲを発現する細胞は、天然にＴＬＲを発現する細胞であるか、またはＴＬＲ発現ベクターを導入している細胞であるか、またはＴＬＲが細胞によって発現されるのが可能な様式においてＴＬＲを発現し、かつＴＬＲのシグナル伝達部分によって天然でシグナル伝達が可能な条件下でシグナルを伝達するように操作された細胞である。ＴＬＲは、ネイティブのＴＬＲであり得るか、または上記のような、そのフラグメントまたは改変体であり得る。これらの方法に従って、試験化合物を、参照ＩＳＮＡを機能的ＴＬＲまたはＴＬＲ発現細胞と接触させる前、接触させた後、または接触と同時に、機能的ＴＬＲまたはＴＬＲ発現細胞と接触させる。機能的ＴＬＲまたはＴＬＲ発現細胞の応答が測定され、そして試験化合物の不在下と同じ条件下で得られるかまたは得られるであろう、対応する応答と比較される。試験化合物の不在下での応答は、同時コントロールまたは歴史的コントロールとして決定され得ることが明らかである。このような応答の例としては、限定することなしに、ＴＬＲシグナル伝達経路によって媒介される応答、サイトカインの分泌、細胞増殖および細胞活性が挙げられる。好ましい実施形態において、応答の測定は、ＩＬ−８分泌の検出（例えば、ＥＬＩＳＡによる）を含む。別の好ましい実施形態において、この応答の測定は、ルシフェラーゼ活性（例えば、ＮＦ−κＢ−ｌｕｃ、ＩＬ−１２ ｐ４０−ｌｕｃまたはＴＮＦ−ｌｕｃ）の検出を含む。
【０３０３】
参照ＩＳＮＡの例としては、限定することなしに、表１（上記）に列挙されるものが挙げられる。いくつかの好ましい実施形態において、参照ＩＳＮＡはＣｐＧ核酸である。
【０３０４】
試験化合物としては、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、抗体、ポリペプチド、炭水化物、脂質、ホルモンおよび低分子が挙げられるがこれらに限定されない。試験化合物はさらに、上記の代替物のいずれかまたはそれらの組み合わせを取り込んだ参照ＩＳＮＡの改変体を含み得る。試験化合物は、化合物のコンビナトリアルライブラリーのメンバーとして生成され得る。
【０３０５】
好ましい実施形態において、試験化合物、試験核酸分子、試験ＩＳＮＡおよび候補薬理学的薬剤をスクリーニングするための方法は、例えば、アレイベースのアッセイ系および少なくとも１つ自動化工程または半自動化工程を組み込むことによって、大規模に、ハイスループットを用いて行われ得る。例えば、アッセイは、複数のウェルプレートを使用して設定され得、ここにおいて、細胞は個々のウェルに分配され、そして試薬が、複数ウェルプレートのジオメトリに適した、複数ウェル送達デバイスを使用する系統的な様式において、加えられる。ハイスループットスクリーニングアッセイにおける使用に適した、手動およびロボットの複数ウェル送達デバイスは、当業者に周知である。各ウェルまたはアレイエレメントを、特定の試験条件（例えば、試験化合物）に対して、一対一の様式でマッピングし得る。読み出しはまた、この複数ウェルアレイにおいて、好ましくは、複数ウェルプレートリーダーデバイスなどを使用して、行われ得る。このようなデバイスの例は、当該分野で周知であり、かつ商業的な供給源から入手可能である。サンプルおよび試薬の操作を自動化して、スクリーニングアッセイのスループット能力をさらに増強させ得、その結果、数十、数百、数千または数百万の並列アッセイを、１日または１週間で行い得る。完全にロボット化されたシステムは、合成化合物のコンビナトリアルライブラリーの作製および分析のような適用について当該分野で公知である。例えば、米国特許第５，４４３，７９１号および同第５，７０８，１５８号を参照のこと。
【０３０６】
本発明は、以下の実施例を参照することによって、より完全に理解される。しかしながら、これらの実施例は、単に本発明の実施形態を例示することが意図されており、本発明の範囲を限定するように構成されてはいない。
【０３０７】
（実施例）
（実施例１．マウスＴＬＲ９をクローニングする方法）
ｔｆａｓｔａを使用する、マウスＥＳＴデータベースとヒトＴＬＲ９タンパク質配列のアライメントは、マウスＥＳＴ配列を有する７ヒット（ａａ１９７４４２、ａｉ４５１２１５、ａａ１６２４９５、ａｗ０４８１１７、ａｉ４６３０５６、ａｗ０４８５４８、およびａａ２７３７３１）を得た。マウスＴＬＲ９ ｃＤＮＡの５’末端および３’末端を増幅させるためのＲＡＣＥ−ＰＣＲにおける使用のためのａａ１９７４４２ ＥＳＴ配列に結合する２つのプライマーを、設計した。ＲＡＣＥ ＰＣＲのために使用されるライブラリーは、Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈから市販されている、マウス脾臓マラソンレディーｃＤＮＡであった。この方法によって得られた１８００ｂｐの長さを有する５’フラグメントを、Ｐｒｏｍｅｇａ ｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙベクターにクローニングした。５’末端を配列決定した後、さらなるプライマーを、完全なマウスＴＬＲ９ ｃＤＮＡの増幅のために設計した。５’末端についてのプライマーを、５’ＲＡＣＥ産物の配列から獲得し、それによって３’末端についてのプライマーを、マウスＥＳＴ配列ａａ２７３７３１から選択した。
【０３０８】
３つの独立したＰＣＲ反応を、マウスマクロファージＲＡＷ２６４．７（ＡＴＣＣ ＴＩＢ−７１）ｃＤＮＡをテンプレートとして使用して設定し、そして得られた増幅産物を、ｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙベクターにクローニングした。挿入物を完全に配列決定し、タンパク質中に翻訳し、そしてヒトタンパク質配列に対して整列させた。３つのクローンうちの１つを、アライメント比較（クローンｍｔｌｒ９３２ｅ．ｐｅｐ）に基づいて誤りのないようにした。ｍＴＬＲ９についてのｃＤＮＡ配列は、配列番号１であり、表２に示す。ＡＴＧ開始コドンは、４０塩基で生じ、ＴＡＧ終止コドンは、３１３６塩基で生じる。配列番号１の４０〜３１３５塩基に対応する配列番号２（表３）は、配列番号３のポリペプチドについてのコード領域である。
【０３０９】
（表２．マウスＴＬＲ９についてのｃＤＮＡ配列（５’側〜３’側；配列番号１））
【０３１０】
【表２】

（表３．マウスＴＬＲ９についてのコード領域（配列番号２））
【０３１１】
【表３】

１０３２アミノ酸残基を含む、マウスＴＬＲ９についての推定アミノ酸配列（配列番号３）を、ｍｔｌｒ９３２ｅ．ｐｅｐとの整列した配列比較において、以下の表４に示す。１０３２アミノ酸残基を含む、ヒトＴＬＲ９についての推定アミノ酸配列（配列番号６）を、ｈｔｌｒ９．ｐｒｏとの整列した配列比較において、以下の表４に示す。
【０３１２】
（表４．マウスＴＬＲ９およびヒトＴＬＲ９についてのアミノ酸配）
【０３１３】
【表４】

以下の配列番号は、表４に示される配列に対応している：ｈｔｌｒ９．ｐｒｏ：配列番号６；ｍｔｌｒ９３２ｅ．ｐｅｐ：配列番号３；ａａ１９７４４２．ｐｅｐ：配列番号８；ｍｏｕｓｅｐｅｐ１：配列番号１７；ｈｕｍａｎｐｅｐ１：配列番号１９；ａａ１６２４９５．ｐｅｐ：配列番号１４；ａｉ４５１２１５．ｐｅｐ：配列番号１６；ａａ２７３７３１．ｐｅｐ：配列番号１０；ａｉ４６３０５６．ｐｅｐ：配列番号１２；ｈｕｍａｎｐｅｐ２：配列番号２０；およびｍｏｕｓｅｐｅｐ２：配列番号１８。
【０３１４】
（実施例２．２９３繊維芽細胞におけるＴＬＲ９シグナル伝達の再構成）
ｐＴ−Ａｄｖベクター（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈから）中の、クローン化したマウスＴＬＲ９ ｃＤＮＡ（上記参照）およびヒトＴＬＲ９ ｃＤＮＡ（Ｂ．Ｂｅｕｔｌｅｒ，Ｈｏｗａｒｄ Ｈｕｇｈｅｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｄａｌｌａｓ，ＴＸから贈呈された）を、ＥｃｏＲＩ部位を用いて、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎからの発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（−）にクローニングした。「機能の獲得（ｇａｉｎ ｏｆ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）」アッセイを使用して、ＣｐＧ ＤＮＡ非応答性ヒト２９３繊維芽細胞（ＡＴＣＣ，ＣＲＬ−１５７３）における、ヒトＴＬＲ９（ｈＴＬＲ９）およびマウスＴＬＲ９（ｍＴＬＲ９）のシグナル伝達を再構成することが可能であった。上記で言及した発現ベクターを、リン酸カルシウム法を使用して、２９３線維芽細胞にトランスフェクトした。
【０３１５】
ＮＦ−κＢ活性は、ＩＬ−１／ＴＬＲシグナル伝達経路の中枢であるので（Ｍｅｄｚｈｉｔｏｖ Ｒら、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ ２：２５３〜２５８（１９９８）；Ｍｕｚｉｏ Ｍら、Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １８７：２０９７〜２１０１（１９９８））、細胞を、ｈＴＬＲ９でトランスフェクトするか、またはｈＴＬＲ９およびＮＦ−κＢ−駆動ルシフェラーゼレポーター構築物で同時トランスフェクトした。ヒト繊維芽細胞の２９３細胞を、ｈＴＬＲ９（図１Ａ）および６回のＮＦ−κＢ−ルシフェラーゼレポータープラスミド（ＮＦ−κＢ−ｌｕｃ，Ｐａｔｒｉｃｋ Ｂａｅｕｅｒｌｅ，Ｍｕｎｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙによって適切に提供される）、またはｈＴＬＲ９単独（図１Ｂ）で過渡的にトランスフェクした。ＣｐＧ−ＯＤＮ（２００６、２μＭ、ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴ、配列番号１１２）、ＧｐＣ−ＯＤＮ（２００６−ＧＣ、２μＭ、ＴＧＣＴＧＣＴＴＴＴＧＴＧＣＴＴＴＴＧＴＧＣＴＴ、配列番号１１８）、ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）または媒介物で刺激した後、ルシフェラーゼ読み出しによるＮＦ−κＢ活性（８時間、図１Ａ）またはＥＬＩＳＡによるＩＬ−８産物（４８時間、図１Ｂ）をモニタリングした。結果を、３つの独立した実験で表わす。図１は、ＬＰＳではなくＣｐＧ−ＤＮＡに応答するｈＴＬＲ９を発現する細胞を示す。
【０３１６】
図２は、ｍＴＬＲ９のトランスフェクトのための同じ原理を示す。ヒト繊維芽細胞の２９３細胞を、ｍＴＬＲ９およびＮＦ−κＢ−ｌｕｃ構築物で過渡的にトランスフェクトした（図２）。類似のデータをＩＬ−８産物について得た（図示せず）。従って、２９３細胞におけるＴＬＲ９（ヒトおよびマウス）の発現は、ＬＰＳ応答のｈＴＬＲ４再構成と類似のＣｐＧ−ＤＮＡ刺激に対する機能の増加を生じる。
【０３１７】
ヒトＴＬＲ９、マウスＴＬＲ９またはＮＦ−κＢ−ｌｕｃレポータプラスミドを有するＴＬＲ９を発現する安定なクローンを作製するために、２９３細胞を、１６μｇのＤＮＡを用いて１０ｃｍプレート（２×１０^６細胞／プレート）でトランスフェクトし、そして０．７ｍｇ／ｍｌ Ｇ４１８（ＰＡＡ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ ＧｍｂＨ，Ｃｏｅｌｂｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて選択した。クローンを、例えば、図３に示されるように、ＲＴ−ＰＣＲによるＴＬＲ９発現について試験した。このクローンをまた、ＯＤＮでの刺激後に、ＩＬ−８産生またはＮＦ−κＢ−ルシフェラーゼ活性についてスクリーニングした。４つの異なる型のクローンを作製した。
【０３１８】
２９３−ｈＴＬＲ９−ｌｕｃ：ヒトＴＬＲ９および６倍ＮＦ−κＢ−ルシフェラーゼレポーターを発現する
２９３−ｍＴＬＲ９−ｌｕｃ：マウスＴＬＲ９および６倍ＮＦ−κＢ−ルシフェラーゼレポーターを発現する
２９３−ｈＴＬＲ９：ヒトＴＬＲ９を発現する
２９３−ｍＴＬＲ９：マウスＴＬＲ９を発現する。
【０３１９】
図４は、ＮＦ−κＢ活性をモニタリングすることによって測定されるように、ＣｐＧ−ＯＤＮ（２００６、２μＭ）、ＧｐＣ−ＯＤＮ（２００６−ＧＣ、２μＭ）、Ｍｅ−ＣｐＧ−ＯＤＮ（２００６ メチル化、２μＭ；ＴＺＧＴＺＧＴＴＴＴＧＴＺＧＴＴＴＴＧＴＺＧＴＴ、Ｚ＝５−メチルシチジン、配列番号１２８）、ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）、または媒介物で刺激した後の、安定な２９３−ｈＴＬＲ９−ｌｕｃクローンの応答性を示す。安定なクローン２９３−ｈＴＬＲ９とのＩＬ−８産生を使用して、類似の結果が得られた。２９３−ｍＴＬＲ９−ｌｕｃはまた、ＮＦ−κＢ活性をモニタリングすることによって測定されるように（図５）、ＣｐＧ−ＯＤＮ（１６６８、２μＭ；ＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＴＧＣＴ、配列番号８４）、ＧｐＣ−ＯＤＮ（１６６８−ＧＣ、２μＭ；ＴＣＣＡＴＧＡＧＣＴＴＣＣＴＧＡＴＧＣＴ、配列番号８５）、Ｍｅ−ＣｐＧ−ＯＤＮ（１６６８ メチル化、２μＭ；ＴＣＣＡＴＧＡＺＧＴＴＣＣＴＧＡＴＧＣＴ、Ｚ＝５−メチルシチジン、配列番号２０７）、ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）、または媒介物で刺激した。安定なクローン２９３−ｍＴＬＲ９とのＩＬ−８産物を使用して、類似の結果が得られた。これらの結果を、少なくとも２つの独立した実験で表わす。これらの結果は、ＣｐＧ−ＤＮＡ非応答性細胞株は、モチーフ特異的な様式においてＣｐＧ ＤＮＡに応答するように、ＴＬＲ９で遺伝的に、安定に補完され得ることを示す。これらの細胞を、複数種においてＴＬＲ９によって駆動される生得免疫応答について、任意のリガンドをスクリーニングために使用し得る。
【０３２０】
（実施例３．酵母細胞（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）における、可溶性組換えヒトＴＬＲ９の発現）
アミノ酸１〜８１１をコードする、ヒトＴＬＲ９ ｃＤＮＡを、以下のプライマー：５’−ＡＴＡＧＡＡＴＴＣＡＡＴＡＡＴＧＧＧＴＴＴＣＴＧＣＣＧＣＡＧＣＧＣＣＣＴ−３’（配列番号１９４）および５’−ＡＴＡＴＣＴＡＧＡＴＣＣＡＧＧＣＡＧＡＧＧＣＧＣＡＧＧＴＣ−３’（配列番号１９５）を使用して、ＰＣＲによって増幅し、ＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩで消化し、酵母発現ベクターｐＰＩＣＺＢ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｇｒｏｎｉｎｇｅｎ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）にクローニングし、そして酵母細胞（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）にトランスフェクトした。クローンを、抗菌性ゼオジン（ｚｅｏｚｉｎ）を用いて選択し、そして可溶性ヒトＴＬＲ９のタンパク質産生を、メタノールを用いて誘導した（図６を参照のこと：ＳＤＳ−ＰＡＧＥ，Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ染色、矢印 ｈＴＬＲ９；レーン１：メタノールで誘導した培養物の上清；レーン２：誘導していない培養物の上清）。従って、ＴＬＲ９タンパク質を、トランスフェクト体から単離し得、そしてさらに、タンパク質研究およびワクチン接種目的のために使用し得る。
【０３２１】
（実施例４．ＣｐＧ−ＤＮＡ応答性に関連するｈＴＬＲ９発現）
細菌ＤＮＡは、マウスおよびヒトの両方のＢ細胞に対するマイトジェンとして記載されている。ＬＰＳもまた、マウスＢ細胞に対するマイトジェンであるが、ＬＰＳはヒトＢ細胞に対するマイトジェンではないことが一般に受け入れられている。図７は、ヒトＢ細胞が、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡまたはＣｐＧ−ＯＤＮを用いた後に増殖するが、ＤＮａｓｅ消化したＥ．ｃｏｌｉ ＤＮＡまたはコントロールＧｐＣ−ＯＤＮは用いた刺激の後に増殖しないことを示す。精製したヒトＢ細胞を、５０μｇ／ｍｌ Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡ、匹敵する量のＤＮａｓｅ Ｉ消化したＥ．ｃｏｌｉ ＤＮＡ、２μＭ ＣｐＧ−ＯＤＮ（２００６）、２μＭ ＧｐＣ−ＯＤＮ（２００６−ＧＣ）、または１００ｎｇ／ｍｌ ＬＰＳで刺激した。Ｂ細胞増幅を、^３Ｈチミジン取り込みによって２日目にモニタリングした。これらのデータは、マイトジェンであるＥ．ｃｏｌｉ ＤＮＡ調製物内のＤＮＡであり、そして必要とされるＯＤＮ内のＣｐＧモチーフであることを示す。
【０３２２】
ヒト樹状細胞（ＤＣ）は、ＣｐＧ−ＤＮＡに応答性であると主張されている。ＣｐＧ−ＤＮＡに応答性であるヒト樹状細胞を分析する間、本発明者らは、ＬＰＳではなくＣｐＧ−ＤＮＡに曝されると、プラスマ細胞様ＤＣ（ＣＤ１２３＋ＤＣ）がＩＦＮ−α、ＴＮＦ、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−８を産生することを示した（図８および未公開データ）。単球を誘導する樹状細胞（ＭＤＤＣ）の刺激に対して、逆も当てはまる（図８および未公開データ）。精製したＣＤ１２３＋ＤＣまたはＭＤＤＣを、５０μｇ／ｍｌ Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡ、匹敵する量のＤＮａｓｅ Ｉ消化したＥ．ｃｏｌｉ ＤＮＡ、２μＭ ＣｐＧ−ＯＤＮ（２００６）、２μＭ ＧｐＣ−ＯＤＮ（２００６−ＧＣ）、または１００ｎｇ／ｍｌ ＬＰＳで刺激した（図８）。ＩＬ−８およびＴＮＦ濃度を、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）によって決定した。ＣＤ１２３＋ＤＣ応答は、制限されたＤＮＡ−モチーフおよびＣｐＧ−モチーフであった。しかしながら、単球を誘導する樹状細胞（ＭＤＤＣ）は、逆応答パターン、ＣｐＧ−ＤＮＡではなくＬＰＳに対する応答を示した。この隔離した応答に起因して、本発明者らは、ＴＬＲ発現を分析した。
【０３２３】
本発明者らは、ＣｐＧ−ＤＮＡがＴｏｌｌ／ＩＬ−１Ｒ（ＴＩＲ）シグナル伝達経路を利用する（このことはＣｐＧ−ＤＮＡシグナル伝達レセプター中のＴＩＲドメインについての必要性を意味する）ことを示した。Ｈａｅｃｋｅｒ Ｈら、Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １９２：５９５−６００（２０００）。ＴＬＲ−９欠損マウスが、ＣｐＧ−ＯＤＮに応答しないことをさらに示した。Ｈｅｍｍｉ Ｈら、Ｎａｔｕｒｅ ４０８：７４０−５。半定量的ＲＴ−ＰＣＲにより、Ｂ細胞およびＣＤ１２３＋ＤＣの両方がｈＴＬＲ９に対して陽性シグナルを生じたが、ＭＤＤＣ、単球およびＴ細胞は、弱く、ネガティブであった（図９）。ｃＤＮＡを、以下から調製した：単球由来樹状細胞（ＭＤＤＣ）、レーン１；精製ＣＤ１４＋単球、レーン２；Ｂ細胞、レーン３；ＣＤ１２３＋ ＤＣ、レーン４；ＣＤ４＋ Ｔ細胞、レーン５；およびＣＤ８＋ Ｔ細胞、レーン６．ｃＤＮＡ量を、ＧＡＰＤＨ量に基づいて、ＴＡＧ−ＭＡＮ ＰＣＲ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）により、標準化した。ＲＴ−ＰＣＲを、１：５で希釈したヒトＴＬＲ２、４、および９についての標準化したｃＤＮＡ（ＧＡＰＤＨは、１：１２５で希釈した）について、３０サイクル実施した。本発明者らはまた、ｈＴＬＲ２およびｈＴＬＲ４の発現についても試験した。ＭＤＤＣおよび単球は、陽性であったが、Ｂ細胞、Ｔ細胞およびＣＤ１２３＋ＤＣは、弱く、ネガティブであった（図９）。ＰＣＲによりもたらされた弱いシグナルは、混入した細胞により説明され得るが、強いポジティブシグナルは、発現を意味する。これらのデータは、ｈＴＬＲ９ ｍＲＮＡ発現とＢ細胞との間の明らかな相関またはＣＤ１２３＋ ＤＣのＣｐＧ−ＤＮＡに対する応答性を実証した（図７および８）。相関はまた、ｈＴＬＲ２およびｈＴＬＲ４の発現ならびにＭＤＤＣのＬＰＳに対する応答性を示した（図８）。このデータは、ｈＴＬＲ９が、ＣｐＧ−ＤＮＡ応答性に対する関連レセプターであり、その発現が応答性を示すことを実証する。ＴＬＲ９発現が調節され得た場合、ＣｐＧ−ＤＮＡ応答の作用性または拮抗作用が達成され得る。
【０３２４】
（実施例５．ＴＬＲ９シグナル伝達の種特異性）
ＣＧジヌクレオチドに囲まれた隣接配列の繰り返しの実験により、ＣｐＧモチーフが同定された。逆説的に、または予想外の状態により、ヒトの最適化ＣｐＧモチーフ、ＧＴＣＧＴＴ（配列番号６６）は、マウスモチーフであるＧＡＣＧＴＴ（配列番号１２９）と異なっている。ヒト末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）（図１０Ａ）およびマウス脾臓細胞（図１０Ｂ）を、ＯＤＮ ２００６（黒丸、ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴ、配列番号１１２）、ＯＤＮ ２００６−ＧＣ（白丸）、ＯＤＮ １６６８（黒三角、ＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＴＧＣＴ、配列番号８４）またはＯＤＮ １６６８−ＧＣ（白三角、ＴＣＣＡＴＧＡＧＣＴＴＣＣＴＧＡＴＧＣＴ、配列番号８５）で、指示された濃度で刺激し、ＩＬ−１２生成物を、８時間後にモニターした。図１０Ａは、最適化ヒトＯＤＮ、２００６の滴定を示し、ＰＢＭＣがＩＬ−１２生成物を誘導することを示す。しかし最適化マウス配列、１６６８は、ＰＢＭＣからＩＬ−１２を誘導することにおいて、かなり有効でなかった。２つのコントロールＣｐＧ−ＯＤＮは、基本的にネガティブであった。マウス脾臓細胞については、最適化ＩＬ−１２を誘導するマウス配列において、逆が真であり（図１０Ｂ）、一方ヒト配列は、いわんや有効でなかった。１６６８に対するマウス脾臓細胞のＫ_ａｃ（最大の半分まで活性化する濃度）は、２００６に対するヒトＰＢＭＣより大きいかったことに有目すべきである（図１０Ａ〜図１０Ｂ）。
【０３２５】
安定なＴＬＲ９トランスフェクト体は、初代細胞のＣｐＧ−ＤＮＡに対する応答性を反映したので（図４および図５）、安定なトランスフェクト体は、潜在的に種特異的なＣｐＧ−モチーフをＴＬＲ９レセプターを介して識別し得ることが仮定された。従って、２９３−ｈＴＬＲ９−ｌｕｃクローン（ヒトＴＬＲ９および６倍のＮＦ−κＢ−ｌｕｃレポーターを発現する）、２９３−ｍＴＬＲ９−ｌｕｃクローン（マウスＴＬＲ９および６倍のＮＦ−κＢ−ｌｕｃレポーターを発現する）、２９３−ｈＴＬＲ９クローン（ヒトＴＬＲ９を発現する）および２９３−ｍＴＬＲ９クローン（マウスＴＬＲ９を発現する）を、ＣｐＧ−ＤＮＡモチーフ応答性について試験した。図１１は、２００６または１６６８およびこれらのコントロール対ｈＴＬＲ９細胞またはｍＴＬＲ９細胞のいずれかについての滴定曲線を示す。読み取られて示されるものは、ＮＦ−κＢ誘導性ルシフェラーゼとＩＬ−８生成についての両方である。６つの連なったＮＦ−κＢ結合部位を含む最小プロモーターに調節されるホタルルシフェラーゼの発現誘導の測定により決定されるたように、２９３ｈＴＬＲ９−ｌｕｃ細胞および２９３ｍＴＬＲ９−ｌｕｃ細胞の両方を、ＣｐＧ−ＤＮＡで刺激することは、ＮＦ−κＢ活性化を生じた。細胞ルシフェラーゼの溶解を、酵素反応に基づいて、光子を生じるルシフェラーゼにより測光的に検出し得る。ＩＬ−８生成は、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）を用いてモニターした。図１１は、ＯＤＮ ２００６（黒丸）、ＯＤＮ２００６−ＧＣ（白丸）、ＯＤＮ１６６８（黒三角）またはＯＤＮ１６６８−ＧＣ（白三角）で、示された濃度で刺激したクローンを示し、ＮＦ−κＢ活性化またはＩＬ−８生成を、１０時間後および４８時間後にそれぞれ測定した。図１１に示される結果は、３つの独立した実験を示す。ＣｐＧ−モチーフ配列特異性は際立って、ＴＬＲ９により種特異的様式で与えられる。さらに、２００６または１６６８のいずれかについての最大の半分の濃度は、初代細胞において決定された濃度とほぼ同じであるように思われる（図１０および図１１を比較）。これらのデータは、ＴＬＲ９がＣｐＧ−ＤＮＡレセプターであることを示し、そしてＣｐＧ−ＤＮＡ配列に対する精巧な特異性が、ＴＬＲ９により与えられることを実証する。
【０３２６】
（実施例６．ホスホロチオエートＯＤＮ以外の基質に対する応答性を試験するための安定なＴＬＲ９クローンの使用）
前記実施例において記載されるように、安定なＴＬＲ９クローンは、最初にホスホロチオエートＯＤＮ応答性の忠実度についてスクリーニングされた。２９３−ｈＴＬＲ９細胞は、ＣｐＧ−モチーフ依存性の様式においてＣｐＧ−ＤＮＡに対する応答性を実証し、ＬＰＳに対しては応答性がないことを実証した（図４および５）。本実施例において、安定なＴＬＲ９トランスフェクト体を、さらなるＤＮＡに対する応答性について試験した。２９３−ｈＴＬＲ９−ｌｕｃ細胞中で、ＮＦ−κＢ活性化を、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡ（黒棒）またはＤＮＡｓｅ Ｉで消化したＥ．ｃｏｌｉ ＤＮＡ（灰色棒）で刺激した後、モニターした。図１２は、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡ用量依存性の、ホスホロチオエートＣｐＧ−ＯＤＮに対して比較可能なレベルまでのＮＦ−κＢ誘導性ルシフェラーゼ発現を例証する（図１１）。活性をＤＮａｓｅ Ｉ消化により破壊し、ＤＮＡに対する応答特異性を示し混入細菌産物に対しては応答特異性を示さないことを示した。安定なＴＬＲ９トランスフェクト体を用いて、様々な種由来のＤＮＡの活性または免疫系刺激を目的とするベクターＤＮＡの活性をスクリーニングし得る。特に、ＴＬＲ９トランスフェクト体を用いて、様々な種の病原体由来のＤＮＡ、ＤＮＡ構築物、ワクチンとしての使用を目的とするＤＮＡ、遺伝子置換治療、および核酸ベクターの免疫刺激活性をスクリーニングし、比較し得る。
【０３２７】
２９３−ｈＴＬＲ９−ｌｕｃ細胞をまた、示された濃度において、ＯＤＮ２００６（黒丸）、ＯＤＮ２００６−ＧＣ（白丸）、ＯＤＮ１６６８（黒三角）またはＯＤＮ１６６８−ＧＣ（白三角）のホスホロジエステル改変体で刺激し、ＮＦ−κＢ活性化を１２時間後にモニターした（図１３Ａ）。同様に、２９３−ｍＴＬＲ９−ｌｕｃ細胞をまた、示された濃度において、ＯＤＮ２００６（黒丸）、ＯＤＮ２００６−ＧＣ（白丸）、ＯＤＮ１６６８（黒三角）またはＯＤＮ１６６８−ＧＣ（白三角）のホスホロジエステル改変体で刺激し、ＮＦ−κＢ活性化を１２時間後にモニターした（図１３Ｂ）。これらのアッセイは、安定なＴＬＲ９トランスフェクト体が、ホスホロチオエート修飾ＯＤＮ以外のＤＮＡに応答することを示す。これらのデータは、安定なＴＬＲトランスフェクト体の、ＴＬＲ９レセプターのアゴニストについてスクリーニングすることについての有用性を実証する。
【０３２８】
（実施例７．ＴＬＲ９は、ＣｐＧ−ＯＤＮ活性を例証する）
２００６および１６６８は、ＣｐＧ−モチーフ相異の点から議論されるが、これらは、いくつかの局面において、非常に異なる（比較についての表５を参照）。長さは、２４対２０ヌクレオチドと異なり、２００６は、１６６８中の１つと比較して、４つのＣＧジヌクレオチドを有する。さらなる相異は、５’および３’末端に対応するＣＧ位置であり、５’配列もまた異なる。モチーフ特異性が、モチーフの本質であるか、全体的な配列環境ではないことか否かを決定するために、この実験のためにいくつかの配列を生成して、これらの可変定数を維持した。開始点として、１６６８配列を、中心のＣをＴに、そして遠位のＴＧをＣＧに改変することによって改変し、このことによって、第２のＣＧを、生じた配列５０００中に作製した（配列番号１３０、表５）。次いで、ヌクレオチド点変異を作製し、２００６様配列、５００７（配列番号９８）にした。ＯＤＮ５００２（配列番号１３２）は、１２位および１９位におけるＣがＴに変換されたことを除いて、１６６８とほぼ同様である。ＯＤＮ５００７の最後の１６ヌクレオチドは、Ｔが加わっていることを除いて２００６の最後の１５ヌクレオチドと同様である。最大活性の半分（Ｋ_ａｃ）のＯＤＮ濃度を、２９３−ｈＴＬＲ９−ｌｕｃ細胞または２９３−ｍＴＬＲ９−ｌｕｃ細胞のいずれか、およびＮＦ−κＢ誘導性ルシフェラーゼ発現を読み出した情報を用いて、ＯＤＮ滴定曲線を生じることによって決定した。例の曲線は、図１４において提供される。安定なトランスフェクト体２９３−ｈＴＬＲ９−ｌｕｃおよび２９３ｍＴＬＲ９−ｌｕｃを、ＯＤＮ５００２（黒丸）またはＯＤＮ５００７（白丸）で、示された濃度において刺激し、ＮＦ−κＢ活性化を１２時間後にモニターした。図１４に示す結果は、３つの独立した実験を例証する。複数のＯＤＮについてのＫ_ａｃに対する値は、表５に示される。同様の結果を、２９３−ｈＴＬＲ９細胞および２９３−ｍＴＬＲ９細胞で、ＩＬ−８を用いて試験したＯＤＮについて読み出した情報として得た。
【０３２９】
（表５．ヒトおよびマウスＴＬＲ９シグナル伝達活性のＣｐＧ−ＯＤＮ配列特異性）
【０３３０】
【表５】

本発明者らによって以前に公表されていない研究において、マウスＣｐＧ−モチーフをＧＡＣＧＴＴＣからＧＡＣＧＴＣＡに変換するＣＡ置換が、有害であることに着目した。本発明者らのモチーフを拡張するために、３より多いＯＤＮを作製して、この影響を分析した（５００８−５０１０、配列番号１３７−１３９、表５）。
【０３３１】
２９３−ｈＴＬＲ９−ｌｕｃクローンによって示された活性は、マウス配列をヒト配列に変換した進行性ヌクレオチド置換で増大した（表５、配列５０００−５００７）。この変換は、２９３−ｍＴＬＲ９−ｌｕｃクローンについて当てはまり、これは、マウス配列について最高の活性を示した。元来仮定されたＣｐＧ−モチーフは、プリン−プリン−ＣＧ−ピリミジン−ピリミジンであった。ＴＬＲ９遺伝子相補性によって決定されるモチーフ規定に対して最も際立つことは、ＣＧの５’直後のプリンのＡからＴへの変換に対する非保存性ピリミジンである（表５）。これらの変換は、２９３−ｈＴＬＲ９−ｌｕｃ応答性を改善したが、２９３−ｍＴＬＲ９−ｌｕｃ応答性を減少した。これらの結果は、好ましいマウスモチーフが、ＡＣＧを含む一方、好ましいヒト配列がＴＣＧを含むことの概念を支持する。マウスモチーフ中のピリミジン変換ＴからＣ（ＡＣＧＴＴ対ＡＣＧＴＣ）（５００２対５００９））に対する保存的ピリミジンは、２９３−ｍＴＬＲ９応答性を完全に破壊した。ＣｐＧ−モチーフの完全な反復性分析ではないが、このデータは、本発明者らのモチーフの理解を高める。より重要なことに、これらのデータは、ＴＬＲ９による直接のＣｐＧ−モチーフの使用を強く支持する。
【０３３２】
（実施例８．アンタゴニストの規定）
ＤＮＡ取りこみおよびエンドソームの成熟が、ＣｐＧ−ＤＮＡによるシグナル開始に必要であることが実証された。ＤＮＡがエンドソーム／リソソーム画分に入るために、非ＣｐＧ依存性の取りこみレセプターが必要とされ得ると仮定されている。２９３細胞をｍＴＬＲ９で一過性にトランスフェクトして、培地のみか１．０μＭ ＣｐＧ−ＯＤＮ １６６８で処置した（図１５）。さらに、１６６８処置ＴＬＲ９トランスフェクト体を、種々の用量の非ＣｐＧ ＯＤＮ（ＰＺ２；５’−ＣＴＣＣＴＡＧＴＧＧＧＧＧＴＧＴＣＣＴＡＴ−３’、配列番号４３）に同時に曝した。ＩＬ−８生成を、４８時間後ＥＬＩＳＡによりモニターした。図１５は、ＰＺ２が、用量依存的様式で、ＣｐＧ ＯＤＮで刺激されたＴＬＲ９トランスフェクト細胞の活性化を拮抗し得たことを示す。
【０３３３】
図１６は、安定なＴＬＲ９トランスフェクト体（２９３−ｈＴＬＲ９−ｌｕｃ細胞）が、非ＣｐＧ−ＯＤＮ遮断に対して感受性であることを例証する。２９３−ｈＴＬＲ９−ｌｕｃ細胞を、示したように、ＣｐＧ−ＯＤＮ（０．５μＭ）（黒棒）またはＴＮＦ−α（１０ｎｇ／ｍｌ）（灰色棒）と、漸増濃度のブロッキングＯＤＮ（５’−ＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨＷＧＧＧＧＧ−３’、配列番号１４０；Ｈ＝Ａ、Ｔ、Ｃ；Ｗ＝Ａ、Ｔ）とインキュベートした。ＮＦ−κＢ活性化を、１２時間後にモニターしたこのＮＦ−κＢ活性化を、パーセント収率として表す。したがって、ｍＴＬＲ９とｈＴＬＲ９の両方の活性は、非刺激的ＯＤＮにより遮断され得る。この遮断は、ＴＮＦ誘導性ＮＦ−κＢシグナルが減少しなかったので、ブロッキングＯＤＮに対して特異的である。従って、ＣｐＧ−ＤＮＡの拮抗は、安定なＴＬＲ９細胞において規定され得るので、ハイスループットスクリーニングをＴＬＲ９アンタゴニストに対してなし得る。
【０３３４】
バフィロマイシンＡは、エンドソームの成熟に必要である、エンドソーム内へのＨ^＋移入に必要な、プロトンポンプに有害である。図１７は、２９３−ｈＴＬＲ９−ｌｕｃ細胞中のエンドソーム成熟の遮断が、ＮＦ−κＢのＣｐＧ−ＯＤＮ誘導を十分に遮断することを示す。２９３−ｈＴＬＲ９−ｌｕｃ細胞を、１０ｎＭバフィロマイシンＡ（灰色棒）またはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）コントロール（黒棒）で３０分間プレインキュベートし、そしてＣｐＧ−ＯＤＮ（２００６、０．５μＭ）、ＩＬ−１（１０ｎｇ／ｍｌ）またはＴＮＦ−α（１０ｎｇ／ｍｌ）で、示したように刺激した。ＮＦ−κＢ活性化を、１２時間後にモニターし、パーセント収率として示す。ＩＬ−１とＴＮＦの両方のＮＦ−κＢが、不十分であったので、遮断は、ＣｐＧ−ＤＮＡ産生シグナルに対して特異的であった。これらのデータは、ｈＴＬＲ９と安定して相補的である２９３細胞が、細胞取りこみおよびエンドソーム成熟がＣｐＧ−ＤＮＡによるシグナルの誘導に必要であることにおいて、一次ＣｐＧ−ＤＮＡ応答性初代細胞に類似した様式の挙動をとることを示す。従って、安定なトランスフェクト体は、ＴＬＲ９薬物アンタゴニストに対する指標として使用され得る。
【０３３５】
ＣｐＧ−ＤＮＡシグナルは、Ｔｏｌｌ／ＩＬ−１Ｒ−様経路を介して生じるように思われる。マウスにおいて、ＣｐＧ−ＤＮＡシグナル伝達は、ＭｙＤ８８、ＩＲＡＫおよびＴＲＡＦ６に依存することが示された。Ｈａｃｋｅｒ Ｈら、ＪＥｘｐ Ｍｅｄ １９２：５９５−６００（２０００）。Ｈｅｍｍｉらは、ｍＴＬＲ９欠損マウスが、ＣｐＧ−ＯＤＮ刺激においての、ＩＲＡＫの活性化を欠くことを示した。Ｈｅｍｍｉ Ｈら、Ｎａｔｕｒｅ ４０８：７４０−５（２０００）。図１８は、ヒトＴＬＲ９を介したＣｐＧ−ＤＮＡシグナル伝達が、ＭｙＤ８８依存性であったことを示す。ｈＴＬＲ９（２９３−ｈＴＬＲ９）を、６倍のＮＦ−κＢルシフェラーゼレポータープラスミドおよび漸増濃度のドミナントネガティブヒトＭｙＤ８８発現ベクターで同時トランスフェクトした。細胞を刺激しないか（黒丸）、ＣｐＧ−ＯＤＮ（２００６、２μＭ）（白丸）またはＴＮＦ−α（１０ｎｇ／ｍｌ）（黒三角）で刺激して、ＮＦ−κＢ活性化を１２時間後にモニターした。結果は、少なくとも２つの独立した実験を表す。図１８は、ドミナントネガティブなＭｙＤ８８が、ＣｐＧ−ＤＮＡで刺激した後の２９３−ｈＴＬＲ９細胞においてのＮＦ−κＢ誘導を阻害することを示す。ＭｙＤ８８の阻害は、ＴＮＦ誘導性シグナル伝達を介したＮＦ−κＢ誘導に影響しなかった。共通して、これらのデータは、ＭｙＤ８８の、ＴＬＲシグナル伝達についての中心的役割およびＣｐＧ−ＤＮＡ開始シグナルにおけるＭｙＤ８８の特定の役割を確認する。従って、ＴＬＲ９でトランスフェクトされたヒト細胞を、指標として用いて、遺伝子的メカニズムを介してＣｐＧ−ＤＮＡに拮抗する分子を見つけ得る。
【０３３６】
（実施例９．抗体生成）
ヒトおよびマウスのＴＬＲ９に対するペプチドをキャリアタンパク質に結合するよう設計し、そしてウサギに注射して、抗ペプチドポリクローナル抗血清を得た。マウスペプチド１（ｍｏｕｓｅｐｅｐ １、表４を参照）を、ＥＳＴａａ１９７４４２中で見出し得、そしてペプチド２（ｍｏｕｓｅｐｅｐ ２、表４を参照）を、ＥＳＴａａ２７３７３１およびａｉ４６３０５６中で見出し得る。ヒトペプチド１（ｈｕｍａｎｐｅｐ １、表４を参照）およびペプチド２（ｈｕｍａｎｐｅｐ ２、表４を参照）を、公開されたヒト配列から取得した。
【０３３７】
３つのウサギ抗血清をこの方法により得た：抗ｍｏｕｓｅｐｅｐ １（マウスＴＬＲ９の細胞外ドメインに特異的）；抗ｈｕｍａｎｐｅｐ １（ｈＴＬＲ９の細胞外ドメインに特異的）；およびｍｏｕｓｅｐｅｐ ２およびｈｕｍａｎｐｅｐ ２の組み合わせに対する抗血清（マウスおよびヒトＴＬＲ９の両方の細胞質ドメインに特異的）。抗ＦＬＡＧ抗体での免疫沈降物を、ＰＡＧＥにより電気泳動し、標準的なウエスタンブロット技術を用いて、膜に転写し、種々の抗血清で探索した。図１９は、ｈＴＬＲ９−ＦＬＡＧおよびｍＴＬＲ９−ＦＬＡＧに対する応答性を示す。これらのブロットの中のＴＬＲ９を、矢印で示し、低分子量のバンドは、抗ＦＬＡＧ抗体を示す。
【０３３８】
（実施例１０．ＣＸＸＣドメインに隣接した変異（ｈＴＬＲ９−ＣＸＸＣｍ、ｍＴＬＲ９−ＣＸＸＣｈ））
ＣＸＸＣモチーフは、ジンクフィンガーモチーフに似ており、ＤＮＡ結合タンパク質および特定の特異的ＣｐＧ結合タンパク質において見出される（例えば、メチル−ＣｐＧ結合タンパク質−１）（ＭＢＤ−１）。Ｆｕｊｉｔａ Ｎら、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２０：５１０７−５１１８（２０００）。ヒトおよびマウスＴＬＲ９は、２つのＣＸＸＣモチーフを含む。ＣＸＸＣドメインは、極性および大きさにおいて全く異なる６アミノ酸（ａａ）が後に続き、ヒトおよびマウスのＴＬＲ９間で高度に保存される。部位特異的変異キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用することによって、これらの６つのアミノ酸残基（ヒト：ＰＲＨＦＰＱ ２６９−２７４）；マウス：ＧＱＫＳＬＨ ２６９−２７４）を、ヒトおよびマウスのＴＬＲ９間で相互交換した。これらの変異を、製造業者のプロトコルに従って、以下のプライマーを使用することにより作製した：
ヒトＴＬＲ９に対して、
５’−ＣＴＧＣＡＴＧＧＡＧＴＧＣＧＧＣＣＡＡＡＡＧＴＣＣＣＴＣＣＡＣＣＴＡＣＡＴＣＣＣＧＡＴＡＣ−３’（配列番号１４１）および
５’−ＧＴＡＴＣＧＧＧＡＴＧＴＡＧＧＴＧＧＡＧＧＧＡＣＴＴＴＴＧＧＣＣＧＣＡＣＴＣＣＡＴＧＣＡＧ−３’（配列番号１４２）、ならびにマウスＴＬＲ９に対して以下のプライマー：
５’−ＣＴＧＴＡＴＡＧＡＡＴＧＴＣＣＴＣＧＴＣＡＣＴＴＣＣＣＣＣＡＧＣＴＧＣＡＣＣＣＴＧＡＧＡＣ−３’（配列番号１４３）および
５’−ＧＴＣＴＣＡＧＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＧＧＧＡＡＧＴＧＡＣＧＡＧＧＡＣＡＴＴＣＴＡＴＡＣＡＧ−３’（配列番号１４４）。
【０３３９】
ＣＸＸＣモチーフ：ＣＸＸＣＸＸＸＸＸＸＣＸＸＣ（配列番号１４５）
野生型ｈＴＬＲ９：ＣＲＲＣＤＨＡＰＮＰＣＭＥＣＰＲＨＦＰＱ （ａａ ２５５−２７４ 配列番号１４６）
ｈＴＬＲ９−ＣＸＸＣｍ：ＣＲＲＣＤＨＡＰＮＰＣＭＥＣＧＱＫＳＬＨ （ａａ ２５５−２７４ 配列番号１４７）
野生型ｍＴＬＲ９：ＣＲＲＣＤＨＡＰＮＰＣＭＩＣＧＱＫＳＬＨ （ａａ ２５５−２７４ 配列番号１４８）
ｍＴＬＲ９−ＣＸＸＣｈ：ＣＲＲＣＤＨＡＰＮＰＣＭＩＣＰＲＨＦＰＱ （ａａ ２５５−２７４ 配列番号１４９）
ｈＴＬＲ９改変体であるｈＴＬＲ９−ＣＸＸＣｍの刺激について、２９３細胞を、一過性にｈＴＬＲ９またはｈＴＬＲ９−ＣＸＸＣｍでトランスフェクトし、１６時間後に、示された濃度において、ＯＤＮ２００６およびＯＤＮ１６６８で刺激した（図２０）。刺激の４８時間後において、上清を回収し、ＩＬ−８生成物をＥＬＩＳＡで測定した。このデータは、ｈＴＬＲ９が、ヒトＣＸＸＣドメインをマウスＣＸＸＣドメインに変更されたことにより、改善され得ることを示す。ｍＴＬＲ９改変体ｍＴＬＲ９−ＣＸＸＣｈの刺激について、２９３細胞を一過性に、ｍＴＬＲ９またはｍＴＬＲ９−ＣＸＸＣｈでトランスフェクトし、１６時間後に、示された濃度において、ＯＤＮ２００６およびＯＤＮ１６６８で刺激した（図２１）。刺激の４８時間後において、上清を回収し、ＩＬ−８生成物をＥＬＩＳＡで測定した。ヒトＣＸＸＣドメインは、ｍＴＬＲ９−ＣＸＸＣｈ活性を、野生型ｍＴＬＲ９比較して減じ得るように思われる。
【０３４０】
（実施例１１．ＭＢＤモチーフ中の変異（ｈＴＬＲ９−ＭＢＤｍｕｔ、ｍＴＬＲ９−ＭＢＤｍｕｔ））
ＭＢＤモチーフは、最近記載された、ＭＢＤ−１タンパク質中のＣｐＧ結合のためのドメインである。Ｆｕｊｉｔａ Ｎら、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２０：５１０７−５１１８（２０００）；Ｏｈｋｉ Ｉら、ＥＭＢＯ Ｊ １８：６６５３−６６６１（１９９９）。ヒトおよびマウスのＴＬＲ９は、このモチーフを５２４−５５４位および５２５−５５５位においてそれぞれ含む。
【０３４１】
ＭＢＤ−１ Ｒ−ＸＸＸＸＸＸＸ−Ｒ−Ｘ−Ｄ−Ｘ−Ｙ−ＸＸＸＸＸＸＸＸＸ−Ｒ−Ｓ−ＸＸＸＸＸＸ−Ｙ （配列番号１２５）
ｈＴＬＲ９ Ｑ−ＸＸＸＸＸＸＸ−Ｋ−Ｘ−Ｄ−Ｘ−Ｙ−ＸＸＸＸＸＸＸＸＸ−Ｒ−Ｌ−ＸＸＸＸＸＸ−Ｙ （配列番号１２６）
ｍＴＬＲ９ Ｑ−ＸＸＸＸＸＸＸ−Ｋ−Ｘ−Ｄ−Ｘ−Ｙ−ＸＸＸＸＸＸＸＸＸ−Ｑ−Ｌ−ＸＸＸＸＸＸ−Ｙ （配列番号１２７）
このドメインのコアは、ヒトＴＬＲ９（ａａ ５３４−５３６）およびマウスＴＬＲ９（ａａ ５３５−５３７）中のＤ−Ｌ−Ｙからなる。部位特異的変異誘発を介して、ヒトＴＬＲ９中のＤ５３４およびＹ５３６、ならびにマウスＴＬＲ９中のＤ５３５およびＹ５３７を、アラニンに変異して、ヒトＴＬＲ９（ａａ ５３４−５３６）およびマウスＴＬＲ９（ａａ ５３５−５３７）について、配列Ａ−Ｌ−Ａを作製した。これらの変異を、製造業者のプロトコルに従って、以下のプライマーを使用して作製した：
ヒトＴＬＲ９について
５’−ＣＡＣＡＡＴＡＡＧＣＴＧＧＣＣＣＴＣＧＣＣＣＡＣＧＡＧＣＡＣＴＣ−３’（配列番号１５０）および
５’−ＧＡＧＴＧＣＴＣＧＴＧＧＧＣＧＡＧＧＧＣＣＡＧＣＴＴＡＴＴＧＴＧ−３’（配列番号１５１）、ならびにマウスＴＬＲ９について以下のプライマー：
５’−ＣＡＴＡＡＣＡＡＡＣＴＧＧＣＣＴＴＧＧＣＣＣＡＣＴＧＧＡＡＡＴＣ−３’（配列番号１５２）および
５’−ＧＡＴＴＴＣＣＡＧＴＧＧＧＣＣＡＡＧＧＣＣＡＧＴＴＴＧＴＴＡＴＧ−３’（配列番号１５３）。
【０３４２】
ｍＴＬＲ９改変体（ｍＴＬＲ９−ＭＢＤ−ｍｕｔ）の刺激について、２９３細胞を、一過性にｍＴＬＲ９またはｍＴＬＲ９−ＭＢＤ−ｍｕｔでトランスフェクトし、１６時間後に、示された濃度においてＯＤＮ２００６およびＯＤＮ１６６８で刺激した（図２２）。刺激の４８時間後において、上清を回収し、ＩＬ−８生成物をＥＬＩＳＡで測定した。ｈＴＬＲ９改変体（ｈＴＬＲ９−ＭＢＤ−ｍｕｔ）の刺激について、２９３細胞を、一過性にｈＴＬＲ９またはｈＴＬＲ９−ＭＢＤ−ｍｕｔでトランスフェクトし、１６時間後に、示された濃度においてＯＤＮ２００６およびＯＤＮ１６６８で刺激した（図２３）。刺激の４８時間後において、上清を回収し、ＩＬ−８生成物をＥＬＩＳＡで測定した。ＴＬＲ９中の推定ＣｐＧ結合ドメインＤＸＹの破壊は、レセプター活性を破壊した。これらのデータは、ＭＢＤモチーフが恐らくＣｐＧ−ＤＮＡ結合に関与し、従って、これを操作してＣｐＧ−ＤＮＡの結合および効率をより理解し得ることを実証する。
【０３４３】
（実施例１２．ＴＩＲ−ドメイン中のプロリンからヒスチジンへの変異（ｈＴＬＲ９−ＰＨｍｕｔ、ｍＴＬＲ９−ＰＨｍｕｔ））
Ｔｏｌｌ様レセプターは、細胞質Ｔｏｌｌ／ＩＬ−１レセプター（ＴＩＲ）ホモロジードメインを有し、これは、アダプター分子ＭｙＤ８８の結合後のシグナル伝達を開始する。Ｍｅｄｚｈｉｔｏｖ Ｒら、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ ２：２５３−８（１９９８）；Ｋｏｐｐ ＥＢら、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ １１：１５−８（１９９９）。他による報告は、マウスＴＬＲ４中のシグナル伝達ＴＩＲドメイン中の１つの点変異（Ｐｒｏ７１２からＨｉｓへ）またはヒトＴＬＲ２中のシグナル伝達ＴＩＲドメイン中の１つの点変異（Ｐｒｏ６８１からｈｉｓへ）、またはリポ多糖もしくはグラム陽性細菌に対する宿主の免疫応答を破壊することを示した。Ｐｏｌｔｏｒａｋ Ａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：２０８５−８（１９９８）；Ｕｎｄｅｒｈｉｌｌ ＤＭら、Ｎａｔｕｒｅ ４０１：８１１−５（１９９９）。部位特異的変異誘発を介して、ヒトおよびマウスのＴＬＲ９の９１５位における等価のプロリンを、ヒスチジンに変異した（Ｐｒｏ９１５からＨｉｓへ）。これらの変異を、製造業者のプロトコルに従って、以下のプライマーの使用により作製した：
ヒトＴＬＲ９について、
５’−ＧＣＧＡＣＴＧＧＣＴＧＣＡＴＧＧＣＡＡＡＡＣＣＣＴＣＴＴＴＧ−３’（配列番号１５４）および
５’−ＣＡＡＡＧＡＧＧＧＴＴＴＴＧＣＣＡＴＧＣＡＧＣＣＡＧＴＣＧＣ−３’（配列番号１５５）ならびにマウスＴＬＲ９について以下のプライマー：
５’−ＣＧＡＧＡＴＴＧＧＣＴＧＣＡＴＧＧＣＣＡＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣ−３’（配列番号１５６）および
５’−ＧＡＡＧＡＧＣＧＴＣＴＧＧＣＣＡＴＧＣＡＧＣＣＡＡＴＣＴＣＧ−３’（配列番号１５７）。
【０３４４】
ｍＴＬＲ９改変体（ｍＴＬＲ９−ＰＨｍｕｔ）の刺激について、２９３細胞を、一過性にｍＴＬＲ９またはｍＴＬＲ９−ＰＨｍｕｔでトランスフェクトし、１６時間後に、示された濃度においてＯＤＮ２００６およびＯＤＮ１６６８で刺激した（図２２）。刺激の４８時間後において、上清を回収し、ＩＬ−８生成物をＥＬＩＳＡで測定した。ｈＴＬＲ９改変体（ｈＴＬＲ９−ｐＨｍｕｔ）の刺激について、２９３細胞を、一過性にｈＴＬＲ９またはｈＴＬＲ９−ＰＨｍｕｔでトランスフェクトし、１６時間後に、示された濃度においてＯＤＮ２００６およびＯＤＮ１６６８で刺激した（図２３）。刺激の４８時間後において、上清を回収し、ＩＬ−８生成物をＥＬＩＳＡで測定した。これらのデータは、ＴＬＲ９活性がＰｒｏからＨｉｓへの変異により破壊され得ることを実証する。この変異は、ＴＬＲ９活性を阻害するドミナントネガティブとして使用される潜在性を有し、従って、遺伝性変異体は、リガンドまたはシグナル伝達パートナーに対し競合し、シグナル伝達を破壊し得た。
【０３４５】
（実施例１３．マウスＴＬＲ９とヒトＴＬＲ９（ｈＴＬＲ９−ＴＩＲｍ、ｍＴＬＲ９−ＴＩＲｈ）との間のＴＩＲドメインの交換）
Ｔｏｌｌ様レセプターは、アダプター分子ＭｙＤ８８の結合後のシグナル伝達を開始する細胞質Ｔｏｌｌ／ＩＬ−１レセプター（ＴＩＲ）相同性ドメインを有する。Ｍｅｄｚｈｉｔｏｖ Ｒら、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ ２：２５３−８（１９９８）；Ｋｏｐｐ ＥＢら、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ １１：１５−８（１９９９）。これはまた、ＴＬＲ９についてもあてはまる。ヒト細胞外ＴＬＲ９およびマウスＴＩＲドメイン（ｈＴＬＲ９−ＴＩＲｍ）またはマウス細胞外ＴＬＲ９およびヒトＴＩＲドメイン（ｍＴＬＲ９−ＴＩＲｈ）からなる分子を作製するために、以下のアプローチを選択した。部位特異的変異誘発を介して、ＣｌａＩ制限部位を、ヒトＴＬＲ９およびマウスＴＬＲ９に導入した。ヒトＴＬＲ９について、ＤＮＡ配列５’−ＧＧＣＣＴＣＡＧＣＡＴＣＴＴＴ−３’（３０２６−３０４０、配列番号１５８）を、５’−ＧＧＣＣＴＡＴＣＧＡＴＴＴＴＴ−３’（配列番号１５９）に変異させ、ＣｌａＩ部位（配列の下線部）を導入するが、アミノ酸配列（ＧＬＳＩＦ、ａａ７９８−８０２）は変化させなかった。マウスＴＬＲ９について、ＤＮＡ配列５’−ＧＧＣＣＧＴＡＧＣＡＴＣＴＴＣ−３’（２４３４−２４４７、配列番号１６０）を、５’−ＧＧＣＣＴＡＴＣＧＡＴＴＴＴＴ−３’（配列番号１６１）に変異させ、ＣｌａＩ部位を導入し、野生型マウスＴＬＲ９配列（ＧＲＳＩＦ、ａａ７９９−８０３）と１位置（ａａ８００）異なるがヒト配列と同一であるアミノ酸配列（ＧＬＳＩＦ、ａａ７９９−８０３）を作製した。
【０３４６】
（ｈＴＬＲ９−ＴＩＲｍ）ヒトＴＬＲ９について使用したプライマーは、５’−ＣＡＧＣＴＣＣＡＧＧＧＣＣＴＡＴＣＧＡＴＴＴＴＴＧＣＡＣＡＧＧＡＣＣ−３’（配列番号１６２）および５’−ＧＧＴＣＣＴＧＴＧＣＡＡＡＡＡＴＣＧＡＴＡＧＧＣＣＣＴＧＧＡＧＣＴＧ−３’（配列番号１６３）であった。マウスＴＩＲドメインに連結されたヒトＴＬＲ９の細胞外部分を含む発現ベクターを作製するために、ヒト発現ベクターをＣｌａＩおよび制限量のＥｃｏＲＩで切断し、マウスＴＬＲ９発現ベクターのＣｌａＩおよびＥｃｏＲＩ消化によって作製されたマウスＴＩＲドメインをコードするフラグメントを、ｈＴＬＲ９の細胞外部分を含むベクターフラグメント中に連結した。Ｅ．ｃｏｌｉへのトランスフェクションにより、発現ベクターｈＴＬＲ９−ＴＩＲｍ（ヒト細胞外ＴＬＲ９−マウスＴＩＲ−ドメイン）を得た。
【０３４７】
（ｍＴＬＲ９−ＴＩＲｈ）マウスＴＬＲ９について使用したプライマーは、５’−ＣＡＧＣＴＧＣＡＧＧＧＣＣＴＡＴＣＧＡＴＴＴＴＣＧＣＡＣＡＧＧＡＣＣ−３’（配列番号１６４）および５’−ＧＧＴＣＣＴＧＴＧＣＧＡＡＡＡＴＣＧＡＴＡＧＧＣＣＣＴＧＣＡＧＣＴＧ−３’（配列番号１６５）であった。ヒトＴＩＲドメインに連結されたマウスＴＬＲ９の細胞外部分を含む発現ベクターを作製するために、マウス発現ベクターをＣｌａＩおよび制限量のＥｃｏＲＩで切断し、ヒトＴＬＲ９発現ベクターのＣｌａＩおよびＥｃｏＲＩ消化によって作製されたヒトＴＩＲドメインをコードするフラグメントを、ｍＴＬＲ９の細胞外部分を含むベクターフラグメント中に連結した。Ｅ．ｃｏｌｉへのトランスフェクションにより、発現ベクターｍＴＬＲ９−ＴＩＲｈ（マウス細胞外ＴＬＲ９−ヒトＴＩＲ−ドメイン）を得た。
【０３４８】
ｍＴＬＲ９改変体（ｍＴＬＲ９−ＴＩＲｈ）の刺激のために、２９３細胞を、ｍＴＬＲ９またはｍＴＬＲ９−ＴＩＲｈで一過的にトランスフェクトし、そして示された濃度でＯＤＮ２００６およびＯＤＮ１６６８で１６時間後に刺激した（図２４）。刺激の４８時間後、上清を収集し、ＩＬ−８生成をＥＬＩＳＡによって測定した。ｈＴＬＲ９改変体（ｈＴＬＲ９−ＴＩＲｍ）の刺激のために、２９３細胞を、ｈＴＬＲ９またはｈＴＬＲ９−ＴＩＲｍで一過的にトランスフェクトし、そして示された濃度でＯＤＮ２００６およびＯＤＮ１６６８で１６時間後に刺激した（図２５）。刺激の４８時間後、上清を収集し、ＩＬ−８生成をＥＬＩＳＡによって測定した。マウスＴＬＲ９−ＴＩＲドメインのヒトＴＬＲ９−ＴＩＲドメインでの置換は、ｍＴＬＲ９活性に有意に影響しなかった。しかし、ヒトＴＬＲ９−ＴＩＲドメインのマウスＴＬＲ９−ＴＩＲドメインでの置換は、ｈＴＬＲ９活性に負の影響を与えるようである。これらのデータは、ＴＬＲ９活性に影響する操作が行なわれたことを実証する。
【０３４９】
（実施例１４．緑色蛍光タンパク質とのＴＬＲ９融合タンパク質（ｈＴＬＲ９−ＧＦＰ、ｍＴＬＲ９−ＧＦＰ））
ヒトＴＬＲ９およびマウスＴＬＲ９を、ベクターｐＥＧＦＰ−Ｎ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）に個々にクローニングして、Ｃ末端の緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）に融合したＮ末端ＴＬＲ９タンパク質からなるヒトおよびマウス融合タンパク質をコードする発現ベクターを作製する。これらの構築物を使用して、ＴＬＲ９の局在化および発現をトレースし得る。このような検出を、ＦＡＣＳ分析、共焦点顕微鏡およびウエスタンブロットにおける染色のため、またはポリペプチドの精製および引き続く抗体産生のために使用し得る。
【０３５０】
（実施例１５．ＦＬＡＧペプチドとのＴＬＲ９融合タンパク質（ｈＴＬＲ９−ＦＬＡＧ、ｍＴＬＲ９−ＦＬＡＧ））
ヒトＴＬＲ９およびマウスＴＬＲ９を、ベクターｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ−１（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）中に個々にクローニングして、Ｎ末端リーダーペプチド（タンパク質のプロセシングの間に細胞内で切断されるプレプロトリプシン）、ＦＬＡＧペプチド（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）およびそれ自身シグナルペプチドを含まないＴＬＲ９からなるヒトおよびマウス融合タンパク質をコードする発現ベクターを作製する。これらの構築物を使用して、例えば、抗ＦＬＡＧ抗体を使用して、ＴＬＲ９の局在化および発現をトレースし得る。このような検出を、ＦＡＣＳ分析、共焦点顕微鏡およびウエスタンブロットにおける染色のため、またはポリペプチドの精製および引き続く抗体産生のために使用し得る。
【０３５１】
（実施例１６．ヒトＴＬＲ７をクローニングする方法）
ＧｅｎＢａｎｋデータベース中の２つの登録番号（ＡＦ２４５７０２およびＡＦ２４０４６７）は、ヒトＴＬＲ７についてのＤＮＡ配列を記載する。ヒトＴＬＲ７についての発現ベクターを作製するために、ヒトＴＬＲ７ ｃＤＮＡを、プライマー５’−ＣＡＣＣＴＣＴＣＡＴＧＣＴＣＴＧＣＴＣＴＣＴＴＣ−３’（配列番号１６６）および５’−ＧＣＴＡＧＡＣＣＧＴＴＴＣＣＴＴＧＡＡＣＡＣＣＴＧ−３’（配列番号１６７）を使用して、ヒト末梢単核血球（ＰＢＭＣ）から作製したｃＤＮＡより増幅した。フラグメントを、ｐＧＲＭ−Ｔ Ｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）にクローニングし、制限酵素ＮｏｔＩで切断し、そしてＮｏｔＩ消化ｐＣＤＮＡ３．１発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に連結した。インサートを完全に配列決定し、そしてタンパク質に翻訳した。ｈＴＬＲ７についてのｃＤＮＡ配列は、配列番号１６８であり、表６に示す。オープンリーディングフレームは、塩基１２４で開始し、塩基３２７３で終わり、そして１０４９アミノ酸のタンパク質をコードする。配列番号１６８（表６）の塩基１２４〜３２７３に対応する配列番号１６９（表７）は、配列番号１７０（表８）のポリペプチドのコード領域である。
【０３５２】
クローニングされたｈＴＬＲ７ ｃＤＮＡのタンパク質配列は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ２４０４６７の元で記載される配列と一致する。ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ２４５７０２の元で寄託された配列は、７２５位（ＬからＨ）および７３８位（ＬからＰ）における２つのアミノ酸変異を含む。
【０３５３】
【表６】

表８において、配列は以下のように割り当てられる：ｈＴＬＲ７．ｐｅｐ、配列番号１７０；ＡＦ２４０４６７．ｐｅｐ、配列番号１７１；ＡＦ２４５７０２．ｐｅｐ、配列番号１７２。
【０３５４】
（実施例１７．マウスＴＬＲ７をクローニングする方法）
ｔｆａｓｔａを使用するヒトＴＬＲ７タンパク質配列のマウスＥＳＴデータベースとの整列は、マウスＥＳＴ配列ｂｂ１１６１６３、ａａ２６６７４４、ｂｂ２１０７８０およびａａ２７６８７９との４つのヒットを生じた。マウスＴＬＲ７ ｃＤＮＡの５’末端および３’末端を増幅するために、ＲＡＣＥ−ＰＣＲにおける使用のためのａａ２６６７４４配列に結合する２つのプライマーを設計した。ＲＡＣＥ ＰＣＲについて使用したライブラリーは、Ｃｌｏｎｔｅｃｈから市販されているマウス脾臓ｍａｒａｔｈｏｎ−ｒｅａｄｙ ｃＤＮＡであった。この方法によって得られた３０００ｂｐの長さを有する５’フラグメントを、Ｐｒｏｍｅｇａ ｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙベクターにクローニングした。５’末端の配列決定後、さらなるプライマーをマウスＴＬＲ７ ｃＤＮＡを完成するための増幅のために設計した。５’末端についてのプライマーを、５’ＲＡＣＥ産物の配列から得て、一方、３’末端についてのプライマーを、マウスＥＳＴ配列ａａ２６６７４４から選択した。
【０３５５】
プライマー５’−ＣＴＣＣＴＣＣＡＣＣＡＧＡＣＣＴＣＴＴＧＡＴＴＣＣ−３’（配列番号２０８）および５’−ＣＡＡＧＧＣＡＴＧＴＣＣＴＡＧＧＴＧＧＴＧＡＣＡＴＴＣ−３’（配列番号２０９）を用いて、鋳型としてマウスマクロファージＲＡＷ２６４．７（ＡＴＣＣ ＴＩＢ−７１）ｃＤＮＡを使用して、３つの独立したＰＣＲ反応を設定した。得られた増幅産物を、ｐＧＲＭ−Ｔ Ｅａｓｙべクターにクローニングして、完全に配列決定した（配列番号１７３；表９）。ｍＴＬＲ７（配列番号１７４；表１０）のオープンリーディングフレームは、塩基４９で開始し、塩基３２０１で終わり、そして１０５０アミノ酸（配列番号１７５；表１１）のタンパク質をコードする。マウスＴＬＲ７ ｃＤＮＡについての発現ベクターを作製するために、ｐＧＲＭ−Ｔ ＥａｓｙベクターおよびｍＴＬＲ７インサートを、ＮｏｔＩで切断し、フラグメントを単離し、そしてＮｏｔＩで消化したｐＣＤＮＡ３．１発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に連結した。
【０３５６】
【表７】

表１１において、配列は以下のように割り当てられる：ｍＴＬＲ７．ｐｅｐ、配列番号１７５；ｈＴＬＲ７．ｐｅｐ、配列番号１７０；ｂｂ２１０７８８．ｐｅｐ、配列番号１７６；ａａ２７６８７９．ｐｅｐ、配列番号１７７；ａａ２６６７４４．ｐｅｐ、配列番号１７８；およびｂｂ１１６１６３．ｐｅｐ、配列番号１７９。
【０３５７】
（実施例１８．ヒトＴＬＲ８をクローニングする方法）
ＧｅｎＢａｎｋデータベース中の２つの登録番号（ＡＦ２４５７０３およびＡＦ２４６９７１）は、ヒトＴＬＲ８についてのＤＮＡ配列を記載する。ヒトＴＬＲ８についての発現ベクターを作製するために、ヒトＴＬＲ８ ｃＤＮＡを、プライマー５’−ＣＴＧＣＧＣＴＧＣＴＧＣＡＡＧＴＴＡＣＧＧＡＡＴＧ−３’（配列番号１８０）および５’−ＧＣＧＣＧＡＡＡＴＣＡＴＧＡＣＴＴＡＡＣＧＴＣＡＧ−３’（配列番号１８１）を使用して、ヒト末梢単核血球（ＰＢＭＣ）から作製したｃＤＮＡより増幅した。フラグメントを、ｐＧＲＭ−Ｔ Ｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）にクローニングし、制限酵素ＮｏｔＩで切断し、そしてＮｏｔＩ消化ｐＣＤＮＡ３．１発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に連結した。インサートを完全に配列決定し、そしてタンパク質に翻訳した。ｈＴＬＲ８についてのｃＤＮＡ配列は、配列番号１８２であり、表１２に示す。オープンリーディングフレームは、塩基８３で開始し、塩基３２０８で終わり、そして１０４１アミノ酸のタンパク質をコードする。配列番号１８２（表１２）の塩基８３〜３２０５に対応する配列番号１８３（表１３）は、配列番号１８４（表１４）のポリペプチドのコード領域である。
【０３５８】
クローニングされたｈＴＬＲ８ ｃＤＮＡのタンパク質配列は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ２４５７０３の元で記載される配列と一致する。ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ２４６９７１の元で寄託された配列は、Ｎ末端の１５アミノ酸（ＭＫＥＳＳＬＱＮＳＳＣＳＬＧＫＥＴＫＫ；配列番号１８５）の挿入物ならびに２１７位（ＰからＳ）、２６６位（ＬからＰ）および８６７位（ＶからＩ）における３つの単一アミノ酸変化を含む。
【０３５９】
【表８】

表１４において、配列は以下のように割り当てられる：ｈＴＬＲ８．ｐｅｐ、配列番号１８４；ＡＦ２４５７０３．ｐｅｐ、配列番号１８６；およびＡＦ２４６９７１．ｐｅｐ、配列番号１８７。
【０３６０】
（実施例１９．マウスＴＬＲ８をクローニングする方法）
ｔｆａｓｔａを使用するヒトＴＬＲ８タンパク質配列のマウスＥＳＴデータベースとの整列は、マウスＥＳＴ配列ｂｆ１３５６５６との１つのヒットを生じた。マウスＴＬＲ８ ｃＤＮＡの５’末端および３’末端を増幅するために、ＲＡＣＥ−ＰＣＲにおける使用のためのｂｆ１３５６５６配列に結合する２つのプライマーを設計した。ＲＡＣＥ ＰＣＲについて使用したライブラリーは、Ｃｌｏｎｔｅｃｈから市販されているマウス脾臓ｍａｒａｔｈｏｎ−ｒｅａｄｙ ｃＤＮＡであった。この方法によって得られた２９００ｂｐの長さを有する５’フラグメントおよび２９００ｂｐの長さを有する３’フラグメントを、Ｐｒｏｍｅｇａ ｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙベクターにクローニングした。各々のフラグメントの５’末端および３’末端の配列決定後、ｍＴＬＲ８の部分配列を得て、完全なＴＬＲ８ ｃＤＮＡの増幅のためのプライマーの設計を可能にした。
【０３６１】
プライマー５’−ＧＡＧＡＧＡＡＡＣＡＡＡＣＧＴＴＴＴＡＣＣＴＴＣ−３’（配列番号１８８）および５’−ＧＡＴＧＧＣＡＧＡＧＴＣＧＴＧＡＣＴＴＣＣＣ−３’（配列番号１８９）を用いて、鋳型としてＣｌｏｎｔｅｃｈからのマウス脾臓ｃＤＮＡを使用して、３つの独立したＰＣＲ反応を設定した。得られた増幅産物を、ｐＧＲＭ−Ｔ Ｅａｓｙべクターにクローニングして、完全に配列決定して、タンパク質に翻訳して、ヒトＴＬＲ８タンパク質配列と整列させた（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ２４５７０３）。ｍＴＬＲ８についてのｃＤＮＡ配列は配列番号１９０であり、表１５に示す。ｍＴＬＲ８のオープンリーディングフレームは、塩基５９で開始し、塩基３１５７で終わり、そして１０３２アミノ酸のタンパク質をコードする。配列番号１９０（表１５）の塩基５９〜３１５４に対応する配列番号１９１（表１６）は、配列番号１９２（表１７）のポリペプチドのコード領域である。マウスＴＬＲ８ ｃＤＮＡについての発現ベクターを作製するために、ｍＴＬＲインサートを有するｐＧＲＭ−Ｔ Ｅａｓｙベクターを、ＮｏｔＩで切断し、フラグメントを単離し、そしてＮｏｔＩで消化したｐＣＤＮＡ３．１発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に連結した。
【０３６２】
【表９】

表１７において、配列は以下のように割り当てられる：ｍＴＬＲ８．ｐｅｐ、配列番号１９２；ｈＴＬＲ８．ｐｅｐ、配列番号１８４；およびｂｆ１３５６５６．ｐｅｐ、配列番号１９３。
【０３６３】
（実施例２０．ＴＬＲ８およびＴＬＲ７を発現する一過的トランスフェクト体）
クローニングされたヒトＴＬＲ７およびヒトＴＬＲ８のｃＤＮＡ（本発明者らの結果）を、ＮｏｔＩ部位を使用して、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎからの発現ベクターｐＣＤＮＡ３．１（−）にクローニングした。「機能獲得（ｇａｉｎ ｏｆ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）」を利用して、ｈＴＬＲ７およびｈＴＬＲ８の発現ベクターを、リン酸カルシウム方法を使用して、ヒト２９３線維芽細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ−１５７３）において一過的に発現させた。ＣｐＧ−ＯＤＮ（２００６または１６６８（２μｌ））またはＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）での刺激後、活性化を、ＩＬ−８生成によってモニターした。使用された刺激のいずれも、ｈＴＬＲ７またはｈＴＬＲ８のいずれかでトランスフェクトした２９３細胞を活性化しなかった。
【０３６４】
（実施例２１．ＴＬＲ９、ＴＬＲ８、およびＴＬＲ７修飾因子のスクリーニング）
ヒトＴＬＲレセプター９、ヒトＴＬＲレセプター８、およびヒトＴＬＲレセプター７は、プロモーター構造における差異に起因し得る組織間で示差的に発現される。Ｄｕ Ｘら、Ｅｕｒ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｎｅｔｗ １１：３６２−７１（２０００）；Ｃｈｕａｎｇ ＴＨら、Ｅｕｒ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｎｅｔｗ １１：３７２−８（２０００）。ヒトＴｏｌｌ様レセプター９、ヒトＴｏｌｌ様レセプター８、ヒトＴｏｌｌ様レセプター７について、ゲノム位置が規定され、そして配列決定されている。ＴＬＲ９は、第３染色体上に位置し（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＴ ００５９８５、ＡＣ００６２５２）、ＴＬＲ７は、Ｘ染色体上に位置し（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＴ ０１１７７４、ＡＣ００５８５９、ＡＣ００３０４６）、そしてＴＬＲ７に近いＴＬＲ８もまた、Ｘ染色体上に位置する（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＴ ０１１７７４、ＡＣ００５８５９）。プロモーター領域における差異を確認するために、各遺伝子の推定プロモーター領域を、複数のクローニング部位に隣接してルシフェラーゼ遺伝子（ｌｕｃ）を含むｐＧＬ２−Ｂａｓｉｃ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）のようなレポーターベクターにクローニングする。種々の細胞株におけるこれらの構築物の一過的なトランスフェション後、種々の刺激を、ルシフェラーゼ活性によって検出される、挿入されたプロモーター領域の活性化について試験し得る。ｍＴＬＲ９、ｍＴＬＲ８およびｍＴＬＲ７のクローニングによって定義されるプロモーター領域を、同じ様式で使用し得る。ＴＬＲ９、ＴＬＲ８、またはＴＬＲ７の発現をアゴナイズまたはアンタゴナイズする化合物の規定を使用して、スクリーニングによって規定される核酸リガンドまたは任意のＴＬＲ９、ＴＬＲ８、もしくはＴＬＲ７リガンドに対する応答を強化またはくじき得る。これらの構築物を、ＴＬＲ９の安定なトランスフェクト体の使用に類似した安定なトランスフェクション後のハイスループットスクリーニングに適合させ得る。
【０３６５】
前述の特許、特許出願および参考文献の各々は、本明細書中に参考として援用される。本発明は特定の実施形態に関して記載されるが、多数の改変および変化が、本発明の精神から逸脱することなく当業者によって行なわれ得ることが理解されるはずである。このような改変、変化および等価物は、上述の特許請求の範囲内であることが意図される。
【０３６６】
（実施例２２．ヒトＩｇＧ１ Ｆｃに融合されたマウス細胞外ＴＬＲ９ドメインおよびヒト細胞外ＴＬＲ９ドメインをクローニングする方法）
センスおよびアンチセンスプライマーの５’ＴＡＴＧＧＡＴＣＣＴＣＴＴＧＴＧＡＣＡＡＡＡＣＴＣＡＣＡＣＡＴＧＣ（配列番号２１６）および５’ＡＴＡＡＡＧＣＴＴＴＣＡＴＴＴＡＣＣＣＧＧＡＧＡＣＡＧＧＧＡＧＡＧ（配列番号２１７）を使用して、ヒトＢ細胞ｃＤＮＡからヒトＩｇＧ１ Ｆｃを増幅し、制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いる消化後にｐＣＤＮＡ３．１（−）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に連結し、ベクターｐｃＤＮＡ−ＩｇＧＦｃを作製する。ヒトＴＬＲ９（アミノ酸１〜８１５）の細胞外ドメインを、センスおよびアンチセンスプライマーの５’ＴＡＴＧＡＡＴＴＣＣＣＡＣＣＡＴＧＧＧＴＴＴＣＴＧＣＣＧＣＡＧ（配列番号２１８）および５’ＡＴＡＧＧＡＴＣＣＣＣＧＧＧＧＣＡＣＣＡＧＧＣＣＧＣＣＧＣＣＧＣＧＧＣＣＧＣＣＧＧＡＧＡＧＧＧＣＣＴＣＡＴＣＣＡＧＧＣ（配列番号２１９）を用いて増幅した。プライマーは、ヒトＴＬＲ９の細胞外ドメインを増幅し、そしてアミノ酸８１５に隣接して、さらなるＮｏｔＩ制限部位、グリシンリンカーおよびトロンビンプロテアーゼ認識部位を作製する。アミノ酸８１２で開始するこの領域の翻訳された配列は、ＤＥＡＬＳＧＧＲＧＧＧＬＶＰＲＧＳ（配列番号２２０）である。このフラグメントをＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで切断し、そしてｐｃＤＮＡ−ＩｇＧＦｃにクローニングし、ヒトＩｇＧ１（ｐｃＤＮＡｈＴＬＲ９ＩｇＧＦｃ）のＦｃ部分に融合されたヒトＴＬＲ９の細胞外ドメインの融合部分をコードするベクターを作製する。発現された細胞外ＴＬＲ９タンパク質を、トロンビンでの消化によってＩｇＧ１ Ｆｃフラグメントから分離し得る（図を参照のこと）。
【０３６７】
マウスＴＬＲ９の細胞外部分（アミノ酸１〜８１６）を、センスおよびアンチセンスプライマーの５’ＴＡＴＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＣＣＡＣＣＡＴＧＧＴＴＣＴＣＣＧＴＣＧＡＡＧ（配列番号２２１）および５’ＴＡＴＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＣＡＧＡＧＡＧＧＡＣＣＴＣＡＴＣＣＡＧＧＣ（配列番号２２２）を用いて増幅し、そしてＰＣＲフラグメントおよびベクターのＮｏｔＩ消化後にｐｃＤＮＡｈＴＬＲ９ＩｇＧＦｃにクローニングした。この手順は、ＴＬＲ９のヒト細胞外部分をマウスの対応物と交換した。
【０３６８】
（実施例２３．ヒトＩｇＧ１ Ｆｃに融合されたＴＬＲ９の細胞外ドメインの発現方法および精製方法）
ヒトＴＬＲ９またはマウスＴＬＲ９のヒトＩｇＧＦｃ融合タンパク質をコードするベクターＤＮＡを、Ｃａ_２ＰＯ_４法によって２９３線維芽細胞にトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を、０．７ｍｇ／ｍｌ Ｇ４１８で選択し、クローニングした。融合タンパク質の発現を、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）によってモニターした。細胞を、溶解緩衝液（ＰＢＳ，１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）中で溶解し、そして上清を、ヒトＩｇＧ−Ｆｃに対するポリクローナル抗体でコーティングしたＥＬＩＳＡプレートに適用した。結合した融合タンパク質を、ヒトＩｇＧ−Ｆｃに対するビオチン化ポリクローナル抗体およびストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体と共にインキュベートすることによって検出した。
【０３６９】
融合タンパク質の精製のために、１０^９細胞からの細胞溶解物を生成し、そしてヒトＩｇＧ−Ｆｃに固く結合するプロテインＡセファロースと共にインキュベートした。プロテアーゼトロンビンとのインキュベーションは、ヒトＴＬＲ９の可溶性細胞外ドメインを放出する。図２７は、銀染色したＳＤＳゲルによって可視化したＴＬＲ９融合タンパク質の例を示す。図２７は、トランスフェクトされた細胞の溶解物は、疑似トランスフェクト細胞の溶解物またはトランスフェクトされた上清もしくは疑似トランスフェクト細胞のいずれにおいても存在しない１００ｋＤと１５０ｋＤとの間で移動する強いバンドを含んだ。バンドのみかけの分子量は、トロンビン処理後に減少し、細胞外ＴＬＲ９ドメインとＦｃフラグメントとの間に挿入されるトロンビンプロテアーゼ認識部位における切断と一致する。
【０３７０】
（実施例２４．ヒトＩｇＧ１ Ｆｃに融合されたマウスおよびヒトの細胞外ＴＬＲ７ドメインおよびＴＬＲ８ドメインをクローニングする方法、ならびに２９３細胞におけるその発現）
マウスＴＬＲ７（アミノ酸１〜８３７）、ヒトＴＬＲ７（アミノ酸１〜８３６）、マウスＴＬＲ８（アミノ酸１〜８１６）およびヒトＴＬＲ８（アミノ酸１〜８２５）の細胞外ドメインを、それぞれ、プライマー対：
【０３７１】
【化１５】

を用いて増幅した。フラグメントを、ＮｏｔＩ消化後にｐｃＤＮＡ−ＩｇＧＦｃにクローニングした。
【０３７２】
ヒトＩｇＧＦｃ融合タンパク質に融合されたヒトまたはマウスのＴＬＲ７またはＴＬＲ８の細胞外ドメインをコードするベクターＤＮＡを、Ｃａ_２ＰＯ_４法によって、２９３線維芽細胞にトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を、０．７ｍｇ／ｍｌ Ｇ４１８で選択し、クローニングした。融合タンパク質の発現を、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）によってモニターした。細胞を、溶解緩衝液（ＰＢＳ，１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）中で溶解し、そして上清を、ヒトＩｇＧ−Ｆｃに対するポリクローナル抗体でコーティングしたＥＬＩＳＡプレートに適用した。結合した融合タンパク質を、ヒトＩｇＧ−Ｆｃに対するビオチン化ポリクローナル抗体およびストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体と共にインキュベートすることによって検出した。
【０３７３】
（実施例２５．マウスＴＬＲ９およびヒトＴＬＲ９に対する抗体産生の方法ならびに活性の特徴付け）
Ｃ５７／Ｂ６マウスを、１０ｎｍｏｌのＣｐＧ−ＯＤＮ １６６８と混合した２０μｇのヒトＴＬＲ９の細胞外ドメインの腹腔内投与によって３回免疫した。免疫したマウスから得たＢ細胞を、標準的なプロトコルを使用して、非抗体産生Ｂ細胞ハイブリドーマＰ３ＸＡＧ８と融合させた。ハイブリドーマ上清を、マウスＴＬＲ９およびヒトＴＬＲ９融合タンパク質を使用して、ＥＬＩＳＡにおける反応性についてスクリーニングした。陽性のハイブリドーマの同定のために、ＥＬＩＳＡプレートを、ヒトＩｇＧ−Ｆｃに対するポリクローナル抗体でコーティングし、そしてマウスＴＬＲ９ ＩｇＧ−Ｆｃ融合タンパク質またはヒトＴＬＲ９ ＩｇＧ−Ｆｃ融合タンパク質を含む溶解物と共にインキュベートした。次いで、プレートを個々のハイブリドーマ上清と共にインキュベートし、そして結合したＴＬＲ９特異的抗体を、マウスＩｇＧに対するビオチン化ポリクローナル抗体およびストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体と共にインキュベートすることによって検出した。
【０３７４】
ＩｇＧ１アイソタイプ、ＩｇＧ２ａアイソタイプおよびＩｇＧ２ｂアイソタイプである１０個の抗体を単離した。これらを、ヒトＴＬＲ９およびマウスＴＬＲ９に対する反応性、ならびにウエスタンブロッティングまたは細胞内染色におけるこれらの性能について試験した。表１８は、名称（ＩＤ）、アイソタイプ、反応性ならびにウエスタンブロッティングおよび細胞内染色における性能を示す。
【０３７５】
全ての単離された抗体を、標準的なプロテインＡ親和性クロマトグラフィーを使用して容易に精製した。
【０３７６】
（表１８．マウスＴＬＲ９およびヒトＴＬＲ９に対して惹起されたモノクローナル抗体）
【０３７７】
【表１０】

（実施例２６．細胞内染色のための方法）
疑似トランスフェクトした２９３細胞およびヒトＴＬＲ９でトランスフェクトした２９３細胞を、カバースリップ上に播種し、一晩培養した。後日、細胞をＰＢＳ中で洗浄し、そして室温で１０分間２％ホルマリンで固定した。細胞を、ＰＢＳ中０．２％サポニンで浸透し、そして２μｇ／ｍｌ抗ヒトＴＬＲ９特異的抗体２−１Ｅ２と共に１時間インキュベートした。２回の洗浄工程後、細胞をＡｌｅｘｉｓ４８８結合体化ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体とインキュベートし、そしてＴＬＲ９を、Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ５１０顕微鏡の共焦点顕微鏡を利用して可視化した。結果は、疑似トランスフェクト２９３細胞ではなく、ヒトＴＬＲ９でトランスフェクトした２９３細胞の細胞質が、ヒトＴＬＲ９に対して陽性で染色したことを示した。
【０３７８】
（実施例２７．ウエスタンブロッティングのための方法）
マウスＴＬＲ９ ＩｇＧ１−Ｆｃ融合タンパク質、ヒトＴＬＲ９ ＩｇＧ１−Ｆｃ融合タンパク質またはマウスＴＬＲ２ ＩｇＧ１−Ｆｃ融合タンパク質でトランスフェクトした２９３細胞の溶解物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した。製造業者のプロトコルに従って、ＢｉｏＲａｄ半乾燥ブロッターを利用してナイロン膜に転写した。この膜を、２μｇ／ｍｌのヒトＴＬＲ９特異的抗体２−１Ｅ２と共にインキュベートし、そしてＴＬＲ９を、ポリクローナルヤギ抗ペルオキシダーゼ結合体によって検出した。ペルオキシダーゼ活性を、ＥＣＬ試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いてモニターし、そしてフィルム上で膜をインキュベートする（図２９を参照のこと）。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、種々の刺激（ＣｐＧ−ＯＤＮ、ＧｐＣ−ＯＤＮ、ＬＰＳおよび培地を含む）への暴露に応答して、ヒトＴＬＲ９でトランスフェクトされた２９３線維芽細胞により産生される、（Ａ）ＮＦ−κＢの誘導および（Ｂ）ＩＬ−８の量、を示す二組の棒グラフである。
【図２】
図２は、種々の刺激（ＣｐＧ−ＯＤＮ、メチル化ＣｐＧ−ＯＤＮ（Ｍｅ−ＣｐＧ−ＯＤＮ）、ＧｐＣ−ＯＤＮ、ＬＰＳおよび培地を含む）への暴露に応答して、マウスＴＬＲ９でトランスフェクトされた２９３線維芽細胞により産生されたＮＦ−κＢの誘導を示す棒グラフである。
【図３】
図３は、トランスフェクトしていないコントロール２９３細胞、ｍＴＬＲ９でトランスフェクトした２９３細胞（２９３−ｍＴＬＲ９）、およびｈＴＬＲ９でトランスフェクトした２９３細胞（２９３−ｈＴＬＲ９）における、マウスＴＬＲ９（ｍＴＬＲ９）、ヒトＴＬＲ９（ｈＴＬＲ９）およびグリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）についての逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）アッセイの結果を示す、一連のゲル画像である。
【図４】
図４は、安定にトランスフェクトされた２９３−ｈＴＬＲ９細胞における、種々の刺激によるＮＦ−κＢ−ｌｕｃの誘導の程度を示すグラフである。
【図５】
図５は、安定にトランスフェクトされた２９３−ｍＴＬＲ９細胞における、種々の刺激によるＮＦ−κＢ−ｌｕｃの誘導の程度を示すグラフである。
【図６】
図６は、誘導された（レーン１）かまたは誘導されていない（レーン２）、ｈＴＬＲ９でトランスフェクトされた酵母細胞の上清中の可溶性ｈＴＬＲ９の存在を示す、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ染色したポリアクリルアミドゲルの画像である。
【図７】
図７は、種々の刺激（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡ、ＤＮａｓｅで消化したＥ．ｃｏｌｉ ＤＮＡ、ＣｐＧ−ＯＤＮ、ＧｐＣ−ＯＤＮおよびＬＰＳを含む）に応答する、ヒトＢ細胞の増殖を示すグラフである。
【図８】
図８は、種々の刺激（Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡ、ＤＮａｓｅで消化したＥ．ｃｏｌｉ ＤＮＡ、ＣｐＧ−ＯＤＮ、ＧｐＣ−ＯＤＮおよびＬＰＳを含む）に応答する、プラズマ細胞の樹状細胞（ＣＤ１２３＋ＤＣ）および単球由来の樹状細胞（ＭＤＤＣ）におけるＩＬ−８（上）およびＴＮＦ（下）の誘導を示す二組の棒グラフである。
【図９】
図９は、ヒト末梢血細胞：ＭＤＤＣ（レーン１）、精製ＣＤ１４＋単球（レーン２）、Ｂ細胞（レーン３）、ＣＤ１２３＋ＤＣ（レーン４）、ＣＤ４＋Ｔ細胞（レーン５）、およびＣＤ８＋Ｔ細胞（レーン６）における、ヒトＴＬＲ９ ｍＲＮＡ、ヒトＴＬＲ２ ｍＲＮＡ、およびヒトＴＬＲ４ ｍＲＮＡの相対発現レベルを比較した、半定量的ＲＴ−ＰＣＲの結果を示す染色したゲルの一連の画像である。ＧＡＰＤＨは、ｃＤＮＡの量を定量するためのコントロールである。
【図１０】
図１０は、示された濃度の種々のＯＤＮ（ＯＤＮ ２００６（黒丸）、ＯＤＮ ２００６−ＧＣ（白丸）、ＯＤＮ １６６８（黒三角）およびＯＤＮ １６６８−ＧＣ（白三角）を含む）に応答する、（Ａ）ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）および（Ｂ）マウス脾細胞において誘導されるＩＬ−１２の量を示す一組のグラフである。
【図１１】
図１１は、示された濃度の種々のＯＤＮ（ＯＤＮ ２００６（黒丸）、ＯＤＮ ２００６−ＧＣ（白丸）、ＯＤＮ １６６８（黒三角）、およびＯＤＮ １６６８−ＧＣ（白三角）を含む）で刺激された際の、ｈＴＬＲ９（左パネル）またはｍＴＬＲ９（右パネル）でトランスフェクトされた２９３細胞の応答性を示す４つ組のグラフである。応答は、ＮＦ−κＢ−ｌｕｃ（上パネル）およびＩＬ−８（下パネル）の誘導という形で示される。
【図１２】
図１２は、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡ（黒棒）およびＤＮａｓｅ−で消化したＥ．ｃｏｌｉ ＤＮＡ（灰色の棒）に対する、２９３−ｈＴＬＲ９細胞の用量応答を示す棒グラフである。
【図１３】
図１３は、示された濃度のホスホジエステル形態のＯＤＮ ２００６（黒丸）、ＯＤＮ ２００６−ＧＣ（白丸）、ＯＤＮ １６６８（黒三角）、およびＯＤＮ １６６８−ＧＣ（白三角）に対する、（Ａ）２９３−ｈＴＬＲ９および（Ｂ）２９３−ｍＴＬＲ９細胞の応答性を示す一組のグラフである。
【図１４】
図１４は、示された濃度のＯＤＮ ５００２（黒丸）およびＯＤＮ ５００７（白丸）に対する２９３−ｈＴＬＲ９細胞および２９３−ｍＴＬＲ９細胞の応答性を示す一組のグラフである。
【図１５】
図１５は、ＣｐＧ−ＯＤＮ １６６８に対するｍＴＬＲ９でトランスフェクトした２９３細胞の応答が、非ＣｐＧ−ＯＤＮ ＰＺ２に同時暴露することにより用量依存的な様式で阻害されることを示す、棒グラフである。
【図１６】
図１６は、ブロッキング非ＣｐＧ−ＯＤＮの示された量の存在下における、ＣｐＧ−ＯＤＮ（黒棒）またはＴＮＦ（灰色の棒）に対する２９３−ｈＴＬＲ９細胞の応答を示す棒グラフである。
【図１７】
図１７は、Ｂａｆｉｌｏｍｙｃｉｎ Ａ（灰色の棒）の存在下における、ＩＬ−１でもＴＮＦでもなく、ＣｐＧ−ＯＤＮに対する２９３−ｈＴＬＲ９の応答の妨害を示す棒グラフである。ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を用いるコントロール処理は、黒色の棒で示す。
【図１８】
図１８は、ＣｐＧ−ＯＤＮ（白丸）、ＴＮＦ−α（黒丸）またはコントロール（黒三角）で刺激した２９３−ｈＴＬＲ９細胞におけるＮＦ−κＢの誘導に対する、種々の濃度のドミナントネガティブなヒトＭｙＤ８８の影響を示すグラフである。
【図１９】
図１９は、精製ｈＴＬＲ９−ＧＬＡＧおよびｍＴＬＲ９−ＦＬＡＧ：（上パネル）抗ヒトおよび抗マウス細胞内；（中）抗マウス細胞外；および（下）抗ヒト細胞外に対する、種々のポリクローナル抗体の応答を示す、一連の３つのウエスタンブロット画像である。矢印は、各ブロットにおけるＴＬＲ９の位置を示す。
【図２０】
図２０は、異なる濃度における種々の刺激に対する、ネイティブ形態のｈＴＬＲ９およびｈＴＬＲ９改変体形態のｈＴＬＲ９−ＣＸＸＣｍの応答性を示す棒グラフである。
【図２１】
図２１は、異なる濃度における種々の刺激に対する、ネイティブ形態のｍＴＬＲ９およびｍＴＬＲ９改変体形態のｍＴＬＲ９−ＣＸＸＣｍの応答性を示す棒グラフである。
【図２２】
図２２は、異なる濃度における種々の刺激に対する、ネイティブ形態のｍＴＬＲ９、ｍＴＬＲ９改変体形態のｍＴＬＲ９−Ｐｈｍｕｔ、およびｍＴＬＲ９改変体形態のｍＴＬＲ９−ＭＢＤｍｕｔの応答性を示す棒グラフである。
【図２３】
図２３は、異なる濃度における種々の刺激に対する、ネイティブ形態のｈＴＬＲ９、ｈＴＬＲ９改変体形態のｈＴＬＲ９−ＰＨｍｕｔ、およびｈＴＬＲ９改変体形態のｈＴＬＲ９−ＭＢＤｍｕｔの応答性を示す棒グラフである。
【図２４】
図２４は、異なる濃度における種々の刺激に対する、ネイティブ形態のｍＴＬＲ９およびｍＴＬＲ９改変体形態のｍＴＬＲ９−ＴＩＲｈの応答性を示す棒グラフである。
【図２５】
図２５は、異なる濃度における種々の刺激に対する、ネイティブ形態のｈＴＬＲ９およびｈＴＬＲ９改変体形態のｈＴＬＲ９−ＴＩＲｍの応答性を示す棒グラフである。
【図２６】
図２６は、ヒトＴＬＲ７、ＴＬＲ８、およびＴＬＲ９ポリペプチドの種々の特徴を表す一連の線形マップである。
【図２７】
図２７は、融合タンパク質の銀染色ポリアクリルアミドゲルの画像および概略図であり、ここでヒトＴＬＲ９（ｈＴＬＲ９）の細胞外ドメインは、介在するトロンビンプロテアーゼ認識部位を有するヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメイン（ｈＩｇＧ−ＦＣ）に融合される。左から右へ、ゲルを、（１）形質転換体の上清；（２）トロンビンで処理された形質転換体の溶解物；（３）形質転換体の未処理の溶解物；（４）分子量マーカー；（５）モック形質転換体の上清；（６）トロンビンで処理したモック形質転換体の溶解物；および（７）モック形質転換体の未処理の溶解物で負荷した。可溶性ｈＴＬＲ９およびＦｃは、トロンビン処理の後にインタクトなｈＴＬＲ９−ＩｇＧ−Ｆｃから放出された産物である。分子量は、銀染色ゲル画像の右側に沿って示される。

Claims (120)

1. 単離された核酸分子であって、該核酸分子は、以下：
   （ａ）配列番号１に記載のヌクレオチド配列を有する核酸分子にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するマウスＴＬＲ９をコードする、核酸分子、
   （ｂ）遺伝暗号の縮重に起因して、コドン配列が（ａ）の核酸分子と異なる、核酸分子、ならびに
   （ｃ）（ａ）または（ｂ）の相補体、
   からなる群より選択される単離される、核酸分子。
2. 前記単離された核酸分子が配列番号３をコードする、請求項１に記載の単離された核酸分子。
3. 前記単離された核酸分子が、配列番号１に記載のヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の単離された核酸分子。
4. 前記単離された核酸分子が、配列番号２に記載のヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の単離された核酸分子。
5. 単離されたＴＬＲ９ポリペプチドまたはそのフラグメントであって、該ＴＬＲ９ポリペプチドまたはそのフラグメントは、配列番号３のアミノ酸
   

   

   からなる群より選択されるマウスＴＬＲ９の少なくとも１つのアミノ酸を含み、ここで、該ＴＬＲ９ポリペプチドまたはそのフラグメントが、マウスＴＬＲ９の少なくとも１つのアミノ酸以外はヒトＴＬＲ９ポリペプチドまたはそのフラグメントと同一であるアミノ酸配列を有する、単離されたＴＬＲ９ポリペプチドまたはそのフラグメント。
6. 請求項５に記載の単離されたＴＬＲ９ポリペプチドまたはそのフラグメントであって、配列番号３のアミノ酸９４９、９７２、９７５、９７６、９９４、９９７、１０００、１００３、１００４、１０１０、１０１１、１０１８、１０２３、および１０２７からなる群より選択されるマウスＴＬＲ９の少なくとも１つのアミノ酸をさらに含む、単離されたＴＬＲ９ポリペプチドまたはそのフラグメント。
7. 前記ヒトＴＬＲ９が配列番号６に記載のアミノ酸配列を有する、請求項５に記載の単離されたＴＬＲ９ポリペプチドまたはそのフラグメント。
8. 配列番号３および配列番号３のフラグメントからなる群より選択されるアミノ酸配列を有する、請求項５に記載の単離されたＴＬＲ９ポリペプチドまたはそのフラグメント。
9. ＴＬＲ９の細胞質外ドメインである、請求項５に記載の単離されたＴＬＲ９ポリペプチドまたはそのフラグメント。
10. 配列番号１２６または配列番号１２７に記載のＭＢＤモチーフを含む、請求項５に記載の単離されたＴＬＲ９ポリペプチドまたはそのフラグメント。
11. 免疫刺激核酸（ＩＳＮＡ）に選択的に結合する、請求項５に記載の単離されたＴＬＲ９ポリペプチドまたはそのフラグメント。
12. ＣｐＧ核酸に選択的に結合する、請求項５に記載の単離されたＴＬＲ９ポリペプチドまたはそのフラグメント。
13. 請求項５に記載の単離されたＴＬＲ９ポリペプチドまたはそのフラグメントをコードする、単離された核酸分子。
14. プロモーターに作動可能に連結された請求項１に記載の単離された核酸分子を含む、発現ベクター。
15. 請求項１４に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
16. 請求項１５に記載の宿主細胞であって、以下：
    （ａ）プロモーターに作動可能に連結された、単離されたＴＬＲ７ポリペプチドをコードする核酸分子を含む、発現ベクター、および
    （ｂ）プロモーターに作動可能に連結された、単離されたＴＬＲ８ポリペプチドをコードする核酸分子を含む、発現ベクター
    からなる群より選択される少なくとも１つの発現ベクターをさらに含む、宿主細胞。
17. ＴＩＲドメインと相互作用し得るレポーター構築物をさらに含む、請求項１５に記載の宿主細胞。
18. プロモーターに作動可能に連結された請求項１３に記載の単離された核酸分子を含む、発現ベクター。
19. 請求項１８に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
20. 請求項１９に記載の宿主細胞であって、以下：
    （ａ）プロモーターに作動可能に連結された、単離されたＴＬＲ７ポリペプチドをコードする核酸分子を含む、発現ベクター、および
    （ｂ）プロモーターに作動可能に連結された、単離されたＴＬＲ８ポリペプチドをコードする核酸分子を含む、発現ベクター
    からなる群より選択される少なくとも１つの発現ベクターをさらに含む、宿主細胞。
21. ＴＩＲドメインと相互作用し得るレポーター構築物をさらに含む、請求項１９に記載の宿主細胞。
22. 単離された核酸分子であって、該核酸分子は、以下：
    （ａ）配列番号１７３に記載のヌクレオチド配列を有する核酸分子にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ配列番号１７５に記載のアミノ酸配列を有するマウスＴＬＲ７をコードする、核酸分子、
    （ｂ）遺伝暗号の縮重に起因して、コドン配列が（ａ）の核酸分子と異なる、核酸分子、ならびに
    （ｃ）（ａ）または（ｂ）の相補体、
    からなる群より選択される単離される、核酸分子。
23. 前記単離された核酸分子が配列番号１７５をコードする、請求項２２に記載の単離された核酸分子。
24. 前記単離された核酸分子が、配列番号１７３に記載のヌクレオチド配列を含む、請求項２２に記載の単離された核酸分子。
25. 前記単離された核酸分子が、配列番号１７４に記載のヌクレオチド配列を含む、請求項２２に記載の単離された核酸分子。
26. 単離されたＴＬＲ７ポリペプチドまたはそのフラグメントであって、該ＴＬＲ７ポリペプチドまたはそのフラグメントは、配列番号１７５のアミノ酸
    

    

    からなる群より選択されるマウスＴＬＲ７の少なくとも１つのアミノ酸を含み、ここで、該ＴＬＲ７ポリペプチドまたはそのフラグメントが、マウスＴＬＲ７の少なくとも１つのアミノ酸以外はヒトＴＬＲ７ポリペプチドまたはそのフラグメントと同一であるアミノ酸配列を有する、単離されたＴＬＲ７ポリペプチドまたはそのフラグメント。
27. 前記ヒトＴＬＲ７が配列番号１７０に記載のアミノ酸配列を有する、請求項２６に記載の単離されたＴＬＲ７ポリペプチドまたはそのフラグメント。
28. 配列番号１７５および配列番号１７５のフラグメントからなる群より選択されるアミノ酸配列を有する、請求項２６に記載の単離されたＴＬＲ７ポリペプチドまたはそのフラグメント。
29. ＴＬＲ７の細胞質外ドメインである、請求項２６に記載の単離されたＴＬＲ７ポリペプチドまたはそのフラグメント。
30. 配列番号２０３、２０４、２１２および２１３のいずれか１つに記載のＭＢＤモチーフを含む、請求項２６に記載の単離されたＴＬＲ７ポリペプチドまたはそのフラグメント。
31. ＩＳＮＡに選択的に結合する、請求項２６に記載の単離されたＴＬＲ７ポリペプチドまたはそのフラグメント。
32. ＣｐＧ核酸に選択的に結合する、請求項２６に記載の単離されたＴＬＲ７ポリペプチドまたはそのフラグメント。
33. 請求項２６に記載の単離されたＴＬＲ７ポリペプチドまたはそのフラグメントをコードする、単離された核酸分子。
34. プロモーターに作動可能に連結された請求項２２に記載の単離された核酸分子を含む、発現ベクター。
35. 請求項３４に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
36. ＴＩＲドメインと相互作用し得るレポーター構築物をさらに含む、請求項３５に記載の宿主細胞。
37. プロモーターに作動可能に連結された請求項３３に記載の単離された核酸分子を含む、発現ベクター。
38. 請求項３７に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
39. ＴＩＲドメインと相互作用し得るレポーター構築物をさらに含む、請求項３８に記載の宿主細胞。
40. 単離された核酸分子であって、該核酸分子は、以下：
    （ａ）配列番号１９０に記載のヌクレオチド配列を有する核酸分子にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ配列番号１９２に記載のアミノ酸配列を有するマウスＴＬＲ８をコードする、核酸分子、
    （ｂ）遺伝暗号の縮重に起因して、コドン配列が（ａ）の核酸分子と異なる、核酸分子、ならびに
    （ｃ）（ａ）または（ｂ）の相補体、
    からなる群より選択される単離される、核酸分子。
41. 前記単離された核酸分子が配列番号１９２をコードする、請求項４０に記載の単離された核酸分子。
42. 前記単離された核酸分子が、配列番号１９０に記載のヌクレオチド配列を含む、請求項４０に記載の単離された核酸分子。
43. 前記単離された核酸分子が、配列番号１９１に記載のヌクレオチド配列を含む、請求項４０に記載の単離された核酸分子。
44. 単離されたＴＬＲ８ポリペプチドまたはそのフラグメントであって、該ＴＬＲ８ポリペプチドまたはそのフラグメントは、配列番号１９２のアミノ酸
    

    

    からなる群より選択されるマウスＴＬＲ８の少なくとも１つのアミノ酸を含み、ここで、該ＴＬＲ８ポリペプチドまたはそのフラグメントが、マウスＴＬＲ８の少なくとも１つのアミノ酸以外はヒトＴＬＲ８ポリペプチドまたはそのフラグメントと同一であるアミノ酸配列を有する、単離されたＴＬＲ８ポリペプチドまたはそのフラグメント。
45. 前記ヒトＴＬＲ８が配列番号１８４に記載のアミノ酸配列を有する、請求項４４に記載の単離されたＴＬＲ８ポリペプチドまたはそのフラグメント。
46. 配列番号１９２および配列番号１９２のフラグメントからなる群より選択されるアミノ酸配列を有する、請求項４４に記載の単離されたＴＬＲ８ポリペプチドまたはそのフラグメント。
47. ＴＬＲ８の細胞質外ドメインである、請求項４４に記載の単離されたＴＬＲ８ポリペプチドまたはそのフラグメント。
48. 配列番号２０５、２０６、２１４、および２１５のいずれか１つに記載のＭＢＤモチーフを含む、請求項４４に記載の単離されたＴＬＲ８ポリペプチドまたはそのフラグメント。
49. ＩＳＮＡに選択的に結合する、請求項４４に記載の単離されたＴＬＲ８ポリペプチドまたはそのフラグメント。
50. ＣｐＧ核酸に選択的に結合する、請求項４４に記載の単離されたＴＬＲ８ポリペプチドまたはそのフラグメント。
51. 請求項４４に記載の単離されたＴＬＲ８ポリペプチドまたはそのフラグメントをコードする、単離された核酸分子。
52. プロモーターに作動可能に連結された請求項４０に記載の単離された核酸分子を含む、発現ベクター。
53. 請求項５２に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
54. ＴＩＲドメインと相互作用し得るレポーター構築物をさらに含む、請求項５３に記載の宿主細胞。
55. プロモーターに作動可能に連結された請求項５１に記載の単離された核酸分子を含む、発現ベクター。
56. 請求項５５に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
57. ＴＩＲドメインと相互作用し得るレポーター構築物をさらに含む、請求項５６に記載の宿主細胞。
58. 請求項１または請求項１３に記載の単離された核酸分子にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、単離された核酸分子。
59. 細胞中のＴＬＲ９シグナル伝達活性を阻害するための方法であって、該細胞を、該細胞におけるＴＬＲ９ポリペプチドの発現を阻害するのに有効な量の請求項５８に記載の単離された核酸分子と接触させる工程を包含する、方法。
60. 請求項１または請求項１３に記載の単離された核酸分子のヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子。
61. 細胞中のＴＬＲ９シグナル伝達活性を阻害するための方法であって、該細胞を、該細胞におけるＴＬＲ９ポリペプチドの発現を阻害するのに有効な量の請求項６０に記載の単離された核酸分子と接触させる工程を包含する、方法。
62. ＴＬＲポリペプチドまたはそのフラグメントと相互作用する核酸分子を同定するための方法であって、該方法は、以下：
    ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、およびこれらの核酸結合フラグメントからなる群より選択されるＴＬＲポリペプチドを、試験核酸分子と接触させる工程；ならびに
    該試験核酸分子と該ＴＬＲポリペプチドまたはそのフラグメントとの相互作用を測定する工程を包含する、
    方法。
63. 前記ＴＬＲポリペプチドまたはそのフラグメントが細胞中で発現される、請求項６２に記載の方法。
64. 前記ＴＬＲポリペプチドまたはそのフラグメントが単離されたＴＬＲポリペプチドまたはそのフラグメントである、請求項６２に記載の方法。
65. 前記単離されたＴＬＲポリペプチドまたはそのフラグメントが固体支持体に固定される、請求項６４に記載の方法。
66. 前記ＴＬＲポリペプチドまたはそのフラグメントが抗体のＦｃフラグメントに融合される、請求項６２に記載の方法。
67. 前記ＴＬＲポリペプチドまたはそのフラグメントがＴＬＲ細胞質外ドメインを含む、請求項６６に記載の方法。
68. 前記相互作用が結合である、請求項６２に記載の方法。
69. 請求項６８に記載の方法であって、前記測定が、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、生体分子相互作用アッセイ（ＢＩＡ）、電気移動性シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）、およびウエスタンブロットからなる群より選択される方法によって達成される、方法。
70. 前記測定が、ＴＬＲシグナル伝達経路によって媒介される応答を測定する工程を包含する方法によって達成される、請求項６３に記載の方法。
71. 請求項７０に記載の方法であって、前記ＴＬＲシグナル伝達経路によって媒介される応答が、ＮＦ−κＢプロモーターの制御下での遺伝子誘導およびサイトカインの分泌からなる群より選択される、方法。
72. 前記ＮＦ−κＢプロモーターの制御下の遺伝子が、ＩＬ−８、ＩＬ−１２ ｐ４０、ＮＦ−κＢ−ｌｕｃ、ＩＬ−１２ ｐ４０−ｌｕｃ、およびＴＮＦ−ｌｕｃからなる群より選択される、請求項７１に記載の方法。
73. 前記サイトカインが、ＩＬ−８、ＴＮＦ−α、およびＩＬ−１２ ｐ４０からなる群より選択される、請求項７１に記載の方法。
74. 請求項７０に記載の方法であって、該方法は、
    （ａ）前記試験核酸分子の存在下で測定されるＴＬＲシグナル伝達経路によって媒介される応答を、（ｂ）該試験核酸分子の非存在下で測定されるＴＬＲシグナル伝達経路によって媒介される応答と比較する工程；ならびに
    （ａ）が（ｂ）を超えた場合に、該試験核酸分子がＩＳＮＡであると決定する工程、
    をさらに包含する、方法。
75. 請求項７０に記載の方法であって、該方法は、
    前記応答を、前記ＴＬＲポリペプチドを参照核酸分子と独立して接触させた場合の参照応答と比較する工程；および
    該応答が該参照応答よりも強いかまたは弱いかを決定する工程、
    をさらに包含する、方法。
76. 請求項７０に記載の方法であって、該方法は、
    前記応答を、前記ＴＬＲポリペプチドを参照核酸分子と同時に接触させた場合の参照応答と比較する工程；および
    該応答が該参照応答よりも強いかまたは弱いかを決定する工程、
    をさらに包含する、方法。
77. 前記ＴＬＲポリペプチドまたはそのフラグメントがＴＬＲ７である、請求項６２に記載の方法。
78. 前記ＴＬＲポリペプチドまたはそのフラグメントがＴＬＲ８である、請求項６２に記載の方法。
79. 前記ＴＬＲポリペプチドまたはそのフラグメントがＴＬＲ９である、請求項６２に記載の方法。
80. ＩＳＮＡを同定するためのスクリーニング方法であって、該方法は、
    ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、およびＴＬＲ９からなる群より選択される機能的ＴＬＲを試験核酸分子と接触させる工程；
    該機能的ＴＬＲと該試験核酸分子との間の相互作用の結果として生じる、該試験核酸分子の存在下でのＴＬＲシグナル伝達経路によって媒介される応答の存在または非存在を決定する工程；ならびに
    該ＴＬＲシグナル伝達経路によって媒介される応答の存在が検出された場合、該試験核酸分子がＩＳＮＡであることを決定する工程、
    を包含する、方法。
81. 請求項８０に記載の方法であって、
    前記機能的ＴＬＲと前記試験核酸分子との間の相互作用の結果として生じる、ＴＬＲシグナル伝達経路によって媒介される応答を、機能的ＴＬＲおよび参照ＩＳＮＡとの間の相互作用の結果として生じる応答と比較する工程、
    をさらに包含する、方法。
82. 前記スクリーニング方法が複数の試験核酸分子上で実行される、請求項８１に記載の方法。
83. 請求項８２に記載の方法であって、前記ＴＬＲシグナル伝達経路によって媒介される応答が、定量的に測定され、そして該複数の試験核酸分子の各々と関連するＴＬＲシグナル伝達経路によって媒介される応答が、機能的ＴＬＲと参照ＩＳＮＡとの間の相互作用の結果として生じる応答と比較される、方法。
84. 請求項８３に記載の方法であって、前記複数の試験核酸分子のうちのサブセットが、前記ＴＬＲシグナル伝達経路によって媒介される特定の応答を生成する該サブセットの能力に基づいて選択される、方法。
85. 前記機能的ＴＬＲが細胞中で発現される、請求項８０に記載の方法。
86. 前記細胞が、前記機能的ＴＬＲを天然に発現する単離された哺乳動物細胞である、請求項８５に記載の方法。
87. 請求項８６に記載の方法であって、ここで、前記細胞が、ＩＬ−８、ＩＬ−１２ ｐ４０、ＮＦ−κＢ−ｌｕｃ、ＩＬ−１２ ｐ４０−ｌｕｃ、およびＴＮＦ−ｌｕｃからなる群より選択されるレポーター構築物をコードする単離された核酸分子を含む発現ベクターを含む、方法。
88. 前記機能的ＴＬＲが無細胞系の一部である、請求項８０に記載の方法。
89. 前記機能的ＴＬＲが別のＴＬＲとの複合体の一部である、請求項８０に記載の方法。
90. 前記複合体がＴＬＲ９およびＴＬＲ７の複合体である、請求項８９に記載の方法。
91. 前記複合体がＴＬＲ９およびＴＬＲ８の複合体である、請求項８９に記載の方法。
92. 請求項８０に記載の方法であって、前記機能的ＴＬＲが、ＭｙＤ８８、ＩＲＡＫ、ＴＲＡＦ６、ＩκＢ、ＮＦ−κＢ、ならびにこれらの機能的ホモログおよび誘導体からなる群より選択される非ＴＬＲタンパク質との複合体の一部である、方法。
93. 前記参照ＩＳＮＡがＣｐＧ核酸である、請求項８０に記載の方法。
94. 前記試験核酸分子がＣｐＧ核酸である、請求項８０に記載の方法。
95. 請求項８０に記載の方法であって、ここで、前記ＴＬＲシグナル伝達経路によって媒介される応答が、ＮＦ−κＢプロモーターの制御下での遺伝子誘導およびサイトカインの分泌からなる群より選択される、方法。
96. 前記ＮＦ−κＢプロモーターの制御下の遺伝子が、ＩＬ−８、ＩＬ−１２ ｐ４０、ＮＦ−κＢ−ｌｕｃ、ＩＬ−１２ ｐ４０−ｌｕｃ、およびＴＮＦ−ｌｕｃからなる群より選択される、請求項９５に記載の方法。
97. 前記サイトカインが、ＩＬ−８、ＴＮＦ−α、およびＩＬ−１２ ｐ４０からなる群より選択される、請求項９５に記載の方法。
98. 試験化合物とＩＳＮＡのＴＬＲシグナル伝達活性を比較するためのスクリーニング方法であって、該方法は、以下：
    ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、およびＴＬＲ９からなる群より選択される機能的ＴＬＲを、参照ＩＳＮＡと接触させる工程、およびＴＬＲシグナル伝達経路によって媒介される参照応答を検出する工程；
    ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、およびＴＬＲ９からなる群より選択される機能的ＴＬＲを、試験化合物と接触させる工程、およびＴＬＲシグナル伝達経路によって媒介される試験応答を検出する工程；ならびに
    該試験応答を参照応答と比較して、該試験化合物とＩＳＮＡのＴＬＲシグナル伝達活性を比較する工程、
    を包含する、方法。
99. 前記機能的ＴＬＲを、前記参照ＩＳＮＡおよび前記試験化合物と独立して接触させる、請求項９８に記載の方法。
100. 請求項９９に記載の方法であって、前記スクリーニング方法は、ＩＳＮＡ模倣物を同定するための方法であって、前記試験応答が前記参照応答と類似する場合、該試験化合物はＩＳＮＡ模倣物である、方法。
101. 請求項９８に記載の方法であって、前記機能的ＴＬＲを、前記参照ＩＳＮＡおよび前記試験化合物と同時に接触させて、ＴＬＲシグナル伝達経路によって媒介される試験−参照応答を生成し、該試験−参照応答が前記参照応答に対して比較され得る、方法。
102. 請求項１０１に記載の方法であって、前記スクリーニング方法は、ＩＳＮＡアゴニストを同定するための方法であって、前記試験−参照応答が前記参照応答よりも大きい場合、前記試験化合物がＩＳＮＡアゴニストである、方法。
103. 請求項１０１に記載の方法であって、前記スクリーニング方法は、ＩＳＮＡアンタゴニストを同定するための方法であって、前記試験−参照応答が前記参照応答よりも小さい場合、前記試験化合物がＩＳＮＡアンタゴニストである、方法。
104. 前記機能的ＴＬＲが、細胞中で発現される、請求項９８に記載の方法。
105. 前記細胞が、前記機能的ＴＬＲ９を天然に発現する単離された哺乳動物細胞である、請求項１０４に記載の方法。
106. 請求項１０５に記載の方法であって、前記細胞は、ＩＬ−８、ＩＬ−１２ ｐ４０、ＮＦ−κＢ−ｌｕｃ、ＩＬ−１２ ｐ４０−ｌｕｃ、およびＴＮＦ−ｌｕｃからなる群より選択されるレポーター構築物をコードする単離された核酸分子を含む発現ベクターを含む、方法。
107. 前記機能的ＴＬＲが無細胞系の一部である、請求項９８に記載の方法。
108. 前記機能的ＴＬＲが別のＴＬＲとの複合体の一部である、請求項９８に記載の方法。
109. 請求項９８に記載の方法であって、前記機能的ＴＬＲが、ＭｙＤ８８、ＩＲＡＫ、ＴＲＡＦ６、ＩκＢ、ＮＦ−κＢ、ならびにこれらの機能的ホモログおよび誘導体からなる群より選択される非ＴＬＲタンパク質との複合体の一部である、方法。
110. 前記参照ＩＳＮＡがＣｐＧ核酸である、請求項９８に記載の方法。
111. 前記試験化合物が核酸分子ではない、請求項９８に記載の方法。
112. 前記試験化合物がポリペプチドである、請求項９８に記載の方法。
113. 前記試験化合物が化合物のコンビナトリアルライブラリーの一部である、請求項９８に記載の方法。
114. ＩＳＮＡの種特異性を同定するためのスクリーニング方法であって、該方法は、以下：
     第１の種のＴＬＲ７、ＴＬＲ８、およびＴＬＲ９からなる群より選択される機能的ＴＬＲを、試験ＩＳＮＡと接触させる工程；
     第２の種のＴＬＲ７、ＴＬＲ８、およびＴＬＲ９からなる群より選択される機能的ＴＬＲを、該試験ＩＳＮＡと接触させる工程；
     該第１の種の機能的ＴＬＲを該試験ＩＳＮＡと接触させることと関連する、ＴＬＲシグナル伝達経路によって媒介される応答を測定する工程；
     該第２の種の機能的ＴＬＲを該試験ＩＳＮＡと接触させることと関連する、ＴＬＲシグナル伝達経路によって媒介される応答を測定する工程；ならびに
     （ａ）該第１の種の機能的ＴＬＲを該試験ＩＳＮＡと接触させることと関連する、ＴＬＲシグナル伝達経路によって媒介される該応答を、（ｂ）該第２の種の機能的ＴＬＲを該試験ＩＳＮＡと接触させることと関連する、ＴＬＲシグナル伝達経路によって媒介される該応答を、比較する工程、
     を包含する、方法。
115. 前記機能的ＴＬＲが、細胞中で発現される、請求項１１４に記載の方法。
116. 前記細胞が、前記機能的ＴＬＲを天然に発現する単離された哺乳動物細胞である、請求項１１５に記載の方法。
117. 前記機能的ＴＬＲが、無細胞系の一部である、請求項１１４に記載の方法。
118. 前記機能的ＴＬＲが、別のＴＬＲとの複合体の一部である、請求項１１４に記載の方法。
119. 請求項１１４に記載の方法であって、ここで、前記機能的ＴＬＲが、ＭｙＤ８８、ＩＲＡＫ、ＴＲＡＦ６、ＩκＢ、ＮＦ−κＢ、ならびにこれらの機能的ホモログおよび誘導体からなる群より選択される非ＴＬＲタンパク質との複合体の一部である、方法。
120. ＴＬＲ９シグナル伝達活性と関連する疾患の処置において有用な薬理学的因子について、リード化合物を同定するための方法であって、該方法は、以下：
     請求項５に提供されるＴＬＲ９を含む細胞を提供する工程；
     候補薬理学的因子の非存在下で、該細胞を該候補薬理学的因子と接触させて、ＴＬＲ９シグナル伝達活性の第１の量を生じる工程；および
     該ＴＬＲ９シグナル伝達活性に対する該薬理学的因子の効果の測定として、ＴＬＲ９シグナル伝達活性の第２の量を決定する工程、
     を包含し、ここで、
     該第１の量よりも低い該ＴＬＲ９シグナル伝達活性の第２の量は、該候補薬理学的因子がＴＬＲ９シグナル伝達活性を低減する薬理学的因子のリード化合物であることを示し、ここで、
     該第１の量よりも高い該ＴＬＲ９シグナル伝達活性の第２の量は、該候補薬理学的因子がＴＬＲ９シグナル伝達活性を増大させる薬理学的因子のリード化合物であることを示す、方法。

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