JP2005292839A - スリット共焦点顕微鏡およびその作動方法 - Google Patents

Abstract

【課題】焦点の変化にともなう映像の強度低下を防止する。
【解決手段】直線光源と、検知系と、光源からの光を試料上に集光させかつ戻り光を検知系に集光させる集光系とを配設する。さらに、検知系には、試料からの光が集光系によって直接または間接に集光される１次元の直線検知器アレイと、試料におけるピクセルの対応するラインからの光を直線検知器アレイに積分させる制御系を配設する。
【選択図】図５Ａ

Description

本発明は、スリット共焦点顕微鏡およびその作動方法に関する。

共焦点顕微鏡は特許文献１に記載されたのが最初であったが、現在では技術的に公知となっている。典型的な共焦点顕微鏡は、光源と、検知系と、その光源からの光を試料に集光させかつ戻り光を検知系に集光させる集光系とを具備している。典型的な例では、検知ピクセルに対して共焦点関係にある単一ピクセルの寸法を有する小さい領域から、物体が照射される。図１Ａおよび１Ｂは、このような従来の構成を示している。

このようにして、点光源１が光ビームを生成し、その光ビームがビーム分割器に入射し、そこから集光レンズ３に反射される。レンズ３は、光を物体４に集光し、そしてその物体によって反射されたまたは放射された光がレンズ３に戻り、そこで、視野絞りとして作用するピンホール（図示せず）の背後に配置された二次電子増倍管のような検知器５にビーム分割器２を通じて集光される。照射光源１はそのピンホールと同じ寸法である。

この系は円対称であり、したがって図１は側面からのおよび平面でのシステムの外観を示している。

共焦点性は、物体が焦点から離れる方向に移動すると、物体の映像の強度を低下させる。従来の多光子系では、ピンぼけ（defocusing）の影響は映像を不鮮明にするだけであった。共焦点系では、映像を不鮮明にするだけでなく、映像を暗くすることにもなる。これは、焦点外の物体は焦点内の物体に影響しないことを意味する。

焦点外の状況が図２に示されている。完全な２次元映像を生成するためには、検知器５および照射領域が通常、移動ミラーを通常有するラスター走査機構で物体４を横切って移動される。３次元映像が必要とされる場合には、異なる焦点面に２次元映像を生成することによって３次元映像が生成される。この３次元映像は、３次元映像形成装置を用いてあるいは３次元視覚化パッケージを用いて、視覚化することができる。あるいは、異なる焦点面の２次元映像を合体させて２次元映像を生成し、同じ分解能を有する多光子顕微鏡で生成できるものよりも焦点深度の大きい映像を生成することができる。

共焦点顕微鏡は光軸のまわりで回転対称であるから、光レベルの低下は、焦点からのずれ量（defocus）の４乗に比例する。これは、物体を照射する光レベルは焦点からのずれ量の２乗に比例して低下し、物体から検知される光レベルは焦点からのずれ量の２乗に比例して低下するからである。典型的な経験則では、ＰＳＦ（point spread function）が焦点状態よりも４倍だけ大きくなるまで映像は通常焦点が合った状態に見える。このことは、共焦点顕微鏡では、焦点深度の経験則状態に達した時点までに、光レベルが4⁴=256倍だけ低下したことを意味する。これによって、共焦点顕微鏡の映像を４つのＰＳＦに類似した焦点からのずれ距離だけ分離された場合に互いに加え合わすことができ、かつ各面が他の面によって影響されないようにすることができる。

直線光源がスリットと共焦点の光の線である場合には、多光子映像形成と共焦点画像形成の勲記合わせのハイブリッド系を生成することができる。この場合には、共焦点映像形成と多光子映像形成との混合を得る。それは、視覚的共焦点顕微鏡に対して用いられることが多く、それについての記述が非特許文献１に見られる。このような顕微鏡が「スリット共焦点顕微鏡」と呼ばれる。

試料上でスリットを光学的に走査することによって、２次元映像の生成が行われる。デジタル映像の場合には、低い光レベルの状態に対しては、フィルム・カメラ、またはＣＣＤまたは冷却ＣＣＤのような２Ｄ検知器を使用することが、非特許文献１の第１２章、第１９５頁に記載されている。

１次元での共焦点性の喪失は影響があることはあるが、それは比較的小さい。第１近似として、光強度と焦点との関係式は下記のとおりである。

ここで、

であり、ここで、

であり、ここで、
λ＝光の波長
ｗ＝ピクセル寸法
ｚ＝焦点面からの距離
ｎａ＝開口数
Ｉ＝強度
ｗ_o＝焦点面におけるピクセル寸法
ｗ_z＝焦点面から距離zにおけるピクセル寸法
Ｉ_SC＝スリット共焦点系の強度
である。

スリット共焦点系が第１近似を設定するための式は、式（ii）および（iii）を用いると、下記のようになる。

ここで、

であり、ここで、

である。
米国特許第３０１３４６７号 ジェームズ ビー ポーリ著「ハンドブック・オブ・バイオロジカル・コンフォーカル・マイクロスコピイ」第２版、プレナム・プレス（"Handbook of Biological Confocal Microscopy", 2nd Edition, James B Pawley, Plenum Press）

これは、図３に示されているように、焦点の変化にともなってかなり似通った強度の低下を生ずる。

スリット共焦点の場合には、２つの焦点面間のクロストークがこのようにして増大するが、図４に見られるように、これは限定されており、非共焦点の場合や多光子系の場合よりもはるかに少ない。

スリット・スキャナーに対して２Ｄ検知器を使用することは難点が多い。１つは、積分時間、すなわち検知器が光子を受け取る時間が、全フレームのための時間として設定されることである。積分時間が長いと、検知器からのダークノイズが大きくなる。温度を下げることでサーマルノイズを少なくするから、これらの系で冷却ＣＣＤカメラで用いられるのは、そのためである。

本発明の第１の態様によれば、スリット共焦点顕微鏡が、直線光源と、検知系と、光源からの光を試料上に集光させかつ戻り光を検知系に集光させる集光系とを具備しており、検知系が、試料からの光が集光系によって直接または間接に集光される１次元の直線検知器アレイと、試料におけるピクセルの対応するラインからの光を直線検知器アレイに積分させる制御系を具備している。

本発明の第２の態様によれば、本発明の第１の態様によるスリット共焦点顕微鏡を動作する方法が、ａ）試料からのピクセルのラインを照射し、試料からの光が直線検知器アレイに集光されるようにする工程と、ｂ）ピクセルのラインに対応した検知器に対する入射光を積分する工程と、ｃ）試料におけるピクセルの一連のラインに対して同じ直線検知器アレイでもって工程ａ）およびｂ）を反復する工程を含む。

本発明では、公知の２Ｄ検知器に代えて、検知器スリットの位置でＣＣＤのような１次元ライン走査検知器を用いるか、あるいは、それと共焦点状態で他の映像形成光学系を用いて、積分時間が単一ライン積分時間と同程度の長さであればよいようにする。例えば、５１２ライン映像の場合には、熱的効果によるノイズは、２Ｄ検知器では、ライン走査検知器の場合よりも５１２倍大きくなる。映像が大きい場合、例えば１０，０００本のラインを有する場合には、２Ｄ検知器では、サーマルノイズが１０，０００倍大きい。このように、ライン走査検知器を用いると、ノイズが相当に小さくなって、大きい映像を走査することができ、あるいは低い光レベルを検知でき、あるいはまた検知器の冷却の使用を回避できる点で、２Ｄ検知器よりも明らかな利点がある。

２Ｄ映像を形成するためには、照射のラインと試料との間で相対移動を生じさせなければならないが、これは種々の従来方法で行うことができる。例えば、試料を顕微鏡に対して動かすだけでも、あるいはその逆を行うだけでもよい。あるいは、直線検知器アレイを、移動スリットまたは固定スリット構成で配設された任意のスリットと同期した状態で映像形成面を横切る方向に移動させてもよい。ミラー等を使用した適当な走査系が非特許文献１の第２５章における図２および３に示されている。

スリット・スキャナーに対する２Ｄ検知器の第２の難点は、カラー映像形成が必要とされる場合である。通常、２Ｄ ＣＣＤカメラは、赤、緑、および青の感光サイトのモザイクで作製される。このことは、単一のピクセルが３色全部を試料の正確に同じ場所から検知される場所が存在しないことを意味する。このことは、映像の実解像度の低下をもたらす。２Ｄカメラでこの問題を克服するために検知器をデイザリング（dithering）する通常の方法は、映像の連続したフレーム走査間で検知器がデイザリングされなければスリット・スキャナーでは有効に作用しないし、また映像のジッタ−を防止するために各フレームが非常に正確に整列される（aligned）必要があるので、この方法は遅くてかつ難しい。１つのピクセルの１０分の１の誤差を検知でき、１つのピクセルの５分の１の誤差を容易に検知することができる。

ライン走査検知器アレイを用いる場合には、カラー映像を２つの異なる方法で生成することができる。１つは、スリー・ストライプＣＣＤ検知器を用いることである。これは、少数のラインだけ互いに変位される３の検知器ラインを有している。これを行うためには、異なるカラーの、例えば赤、緑および青（ＲＧＢ）の３つのラインで試料を照射して、事実上、３つの共焦点ラインを有するようにする必要がある。次に、それらのラインが映像を横切って移動され、そしてそれらのカラーのうちの２つを適当な量だけ遅延まはたシフトさせることによって、各カラーが位置合わせし直される（reregistered）。これは、ジッタ−の問題を排除することになり、かつカラー位置合わせが１ピクセルの約３分の１程度と裕度がはるかに大きいので、実施するのがその分だけ容易であり、数個のフレーム程度の長い時間にわたって高い精度を要求するものではなく、数本のライン程度の短い時間だけ精度を有していればよいのである。これはまた、その時間の間に移動する試料に対する感度を低下させる。このようにして、試料のすべてのピクセルが、３色のカラー全部を検知される。

カラー映像を生成するためにライン走査検知器アレイを使用する他の方法は、単一のモノクロ・ライン走査検知器を使用し、かつ直線光源からの光のカラーを変更することである。例えば、光のカラーをライン毎に変更することができ、その場合には、カラーは１ピクセルの３分の１だけ常に位置ずれするが、それは、必要に応じて、補間法を用いて補償することができ、長時間の積分を維持することを必要としない。これを行う他の方法は、フレーム毎にカラーを変更することであるが、これは、満足しうる映像を生成するためには３つのフレームにわたって１ピクセルの３分の１の位置合わせを必要とし、それはさらに困難である。

添付図面を参照し、公知の顕微鏡と対比して、本発明によるスリット共焦点顕微鏡の幾つかの実施例について説明する。

図５Ａおよび５Ｂは、本発明によるスリット共焦点顕微鏡の１つの実施例を、それぞれ側面図および平面図で示している。この場合には、光源１は、１本の白色光ラインを生成する直線光源１０よりなり、その白色光ラインがレンズ３によって物体上に集光され、そこで、平面図において、直線領域１１を照射する。戻り光は、直線検知器アレイ１３に集光される。その直線検知器アレイ１３の正面には、実効的にレンズ３の焦点に、光スリット開口１２が配設されている。

検知器１３は処理器１４に接続され、そしてその処理器１４はデータ記憶器１５に接続されている。

使用時には、物体が光源１０からの１本の光のラインによって照射され、これによって、物体によって反射されたおよび／または放出された光が、典型的にはＣＣＤアレイである検知器１３の直線アレイに集光される。積分時間の後で、処理器１４がアレイ１３を制御して、各検知器における蓄積電荷を転送ゲートに転送させ、そしてその電荷が処理器１４に直列にダウンロードされ、記憶器１５に格納される。

図５Ａは直線スリット開口１２が存在していることを示しているが、検知器１３がレンズ３の焦点位置に配置される場合には、それは必要でなく、したがって、図５Ｂでは省略されている。

他の構成（図示せず）では、スリット開口１２に、それの背後に離間された検知器１３と、スリット開口１２を通じて受光された光を検知器アレイ１３に集光させるための他の集光光学系とを配設してもよい。言い換えると、検知器１３とスリット開口１２との間に第２の共焦点構成が配設される。これは、検知器アレイをレンズ３の焦点位置に配置することが難しい場合の観点から有用である。

物体４の表面の２次元映像を生成できる方法は多数ある。１つの手法は、一方におけるスリット共焦点顕微鏡と他方における物体４との間で相対的な本体移動を生じさせ、光源１０に物体の表面上の一連のピクセル・ラインを照射させるようにすることである。そして、これらのピクセル・ラインからの光が、記憶器１５の対応するアレイに格納される。

しかし、従来の共焦点系では、この遅い走査は、正確に反復すること、走査速度を一定にすること、大きい面積をカバーすることが難しい走査ミラー系を用いて発生されるのが通常である。典型的には、映像寸法は５１２×５１２ピクセルである。この手法は、ライン・スキャナー・スリット共焦点系が光通路に移動ミラーを必要としない本発明では有利に利用できるとともに、反復可能性がはるかに高くかつそれを正確に行うのがより容易である。また、ＣＣＤ検知器１３の長さが通常１００００ピクセルであり、そして横動の長さ（length of traverse）は物体をあるいは走査系をどの程度まで移動させることが所望されているかによってのみ制限されるから、大きい面積を走査するのが容易である。遅い走査方向では、典型的な走査寸法は、10,000×10,000ピクセル程度あるいはそれより長くてもよい。このようにして、スリット開口１２または検知器１３は固定状態に維持され、光源１からの光を物体表面４上の複数のピクセル・ラインに照射させるためにミラー系が用いられる。適当な系が非特許文献１の第２５章の図２および３に示されている。

他の実施例では、物体上の一連のピクセル・ラインを光源１からの光ラインで照射させるためにミラー系が配設され、そして検知器１３がレンズ３によって画定された共焦点面を横切って移動されて、各照射されたピクセル・ラインからの光を記録する。言い換えると、検知器の正面のスリットが省略され、検知器アレイが実効的に「スリット」と同期して移動される。

これまで説明した実施例では、検知器は単色型のものであり、かつ光源１は白色光または単色光のラインを生成するものであった。カラー映像形成を行えるように図５Ａおよび５Ｂに示された装置を修正することが可能である。

第１の例では、検知器１３が、図６に示されたマルチストライプＣＣＤ（または他の）アレイ１３’で置換される。この場合には、検知器の３つのラインまたはストライプ、すなわち、赤感応検知器２０、緑感応検知器２１および青感応検知器２２のラインが、共通の支持体上に配設される。検知器の各ラインは、それぞれのトランスファー・ゲート２３、２４、２５に関連されている。これらは、処理器１４に個別に接続されている。実際には、検知器２０、２１、２２の各ラインは、検知器の隣接ラインから約１２ラインだけ離間されている。この場合には、ライン光源が、異なるカラーの、典型的には赤、緑、青の３つのスリット状ビーム４０、４１、４２を生成する。これらは、ビーム分割器２によって反射された後で、レンズ３によって物体４上の離間されたラインに集光される。そして、物体４からの光がレンズ３によって戻され、さらにビーム分割器２によって３つの異なる共焦点場所４３−４５に集光される（図８）。したがって、実効的には、３つのスリット共焦点系が画定されたことになる。

検知器アレイ１３’が次に図８に示されているように左から右へと横動されて、該当する検知器のアレイを結像された映像と合致させる。このようにして、赤感応検知器２０が焦点４３に対して整列され、次にアレイ１３’が移動されて緑感応検知器２１を焦点位置４４に対して整列した状態にし、そしてもう一度移動されて青感応検知器２２を焦点４５に対して整列した状態にする。完全な走査の後で、赤、緑および赤の映像が物体４上の各ラインから得られ、そしてこれらが処理器１４によって簡単な態様で互いに同期して再配列され、物体４上の各ピクセルに対する合成カラーを生成することができる。

図６に示された検知器アレイは、２次元アレイとして使用されているのではなくて、物体４の表面上のピクセルの同じ直線アレイから光を得る一組の１次元アレイとして使用されていることが理解されるであろう。

他の手法が図７に示されており、単色検知器アレイ１３が使用されているが、光源１によって生成されたカラーが変化される。これは、多くの異なる方法で達成できるものであり、図７はそれらの一例である。この場合には、直線光源１からの白色光が、回転自在に装着されたフィルター・ホイール３３上に配置された一組の３つの赤、緑および青フィルター３０−３２のうちの１つを通過する。第１のステージでは、赤フィルター３０が白色光に対して整列されて赤色光だけがビーム分割器２に入射する前にフィルター・ホイール３３を通じて照射スリット３４に到達するように、フィルター・ホイール３３が構成されている。次に、物体４からの情報が検知器アレイ１３によって記録され、そして処理器１４にダウンロードされる。そして、フィルター・ホイール３３が回転されて、緑フィルター３１を白色光に対して整列した状態し、この工程が繰り返される。フィルター３２を白色光源に対して整列した状態にして、この工程がもう一度繰り返される。そして、物体４上の同じライン内の各ピクセルに対する３つの組のカラー情報が上述のようにして処理される。

使用時には、検知器１３、レンズ３および照射スリット３４が互いに対してすべて固定されており、かつ物体４が連続的に移動される実施例について考える。赤、緑および青ピクセルを取り出す時間がｔであるとすると、１つの特定のカラーのピクセルの各ライン、例えば、赤フィルター・ホイールが照射通路内にある場合には赤、フィルター・ホイールの緑フィルターが照射通路内にある場合に緑、あるいはフィルター・ホイールの青フィルターが照射通路内にある場合には青が、ｔ／３の時間で得られる。試料４が時間ｔで顕微鏡に関してｘだけ移動しているように、照射スリット３４の幅はｘであるようになされている。このようにして、一連の赤、緑および青ラインｘ／３を互いに同期していない状態で検知する。これは、もし所望されれば、補間を用いて補正できる。

もちろん、他の手段が相対移動を生じさせるようになされている場合には、同様の方法を用いてもよい。

他の実施例（図示せず）では、光源は、選択的に付勢された波長の異なる光を発生するＬＥＤのような多数の異なるカラーの光源で構成されうる。

従来の共焦点顕微鏡の主要構成要素を示している。 図１の顕微鏡を示しているが、物体は焦点外位置にある。 スリット共焦点顕微鏡において１００焦点単位だけ分離された２つの平面に対して焦点を変化させた場合の各平面からの強度の変化を示している。 スリット共焦点顕微鏡、共焦点顕微鏡および多光子顕微鏡において１００焦点単位だけ分離された２つの平面に対して焦点を変化させた場合の強度を示している。 本発明によるスリット共焦点顕微鏡の１つの実施例の側面図である。 本発明によるスリット共焦点顕微鏡の１つの実施例の平面図である。 マルチカラー（多色）ＣＣＤアレイを示す図である（実寸ではない）。 他の照射系を概略的に示している。 マルチカラー（多色）スリット共焦点顕微鏡の一部を示している。

符号の説明

２ ビーム分割器
３ レンズ
４ 物体
１０ 直線光源
１２ 光スリット開口
１３ 直線検知器アレイ
１４ 処理器１４
１５ 記憶器
２０ 赤感応検知器
２１ 緑感応検知器
２２ 青感応検知器
２３、２４、２５ トランスファー・ゲート
３０ 赤フィルター
３１ 緑フィルター
３２ 青フィルター
３３ フィルター・ホイール
３４ 照射スリット

Claims (15)

1. 直線光源と、検知系と、光源からの光を試料上に集光させかつ戻り光を検知系に集光させる集光系とを具備しており、検知系が、試料からの光が集光系によって直接または間接に集光される１次元の直線検知器アレイと、試料におけるピクセルの対応するラインからの光を直線検知器アレイに積分させる制御系を具備しているスリット共焦点顕微鏡。
2. 前記試料からの光の焦点にスリットを画成するマスクをさらに具備している、請求項１に記載の顕微鏡。
3. 前記スリットを前記直線検知器アレイに結像させる他の集光系をさらに具備している、請求項２に記載の顕微鏡。
4. 前記直線検知器アレイが前記集光系の焦点に配置されている、請求項１〜３のうちの１つに記載の顕微鏡。
5. 前記検知器アレイ（およびもし配設されている場合にはスリット）を、前記集光系の映像面内で試料に対して移動させる手段をさらに具備する、請求項１〜４のうちの１つに記載の顕微鏡。
6. 前記検知系が、１つより多い直線検知器アレイを具備し、前記アレイは互いに実質的に平行であり、各検知器アレイがそれぞれ異なるカラーに感応する、請求項１〜５のうちの１つに記載の顕微鏡。
7. 前記光源が、それぞれ異なるカラーの１つより多いビームを生成するようになされており、前記集光系が戻り光をそれぞれ異なる焦点位置に集光させ、前記検知系が、各アレイを前記集光系の対応する焦点位置に持って行くように可動である、請求項６に記載の顕微鏡。
8. 前記検知系が単一の直線検知器アレイを具備しており、前記直線光源が異なるカラーのラインを交互に生成するようになされており、前記検知系は前記直線光源によって生成されるすべてのカラーに感応する、請求項１〜７のうちの１つに記載の顕微鏡。
9. カラーが赤、緑および青よりなる、請求項６〜８のうちの１つに記載のスリット共焦点顕微鏡。
10. 前記検知器アレイがＣＣＤアレイよりなる、請求項１〜９のうちの１つに記載の顕微鏡。
11. 直線光源と、検知系と、光源からの光を試料上に集光させかつ戻り光を検知系に集光させる集光系とを具備しており、検知系が、試料からの光が集光系によって直接または間接に集光される１次元の直線検知器アレイと、試料におけるピクセルの対応するラインからの光を直線検知器アレイに積分させる制御系を具備しているスリット共焦点顕微鏡の作動方法であって、
    ａ）試料からのピクセルのラインを照射し、試料からの光が直線検知器アレイに集光されるようにする工程と、
    ｂ）ピクセルのラインに対応した検知器に対する入射光を積分する工程と、
    ｃ）試料におけるピクセルの一連のラインに対して同じ直線検知器アレイでもって工程ａ）およびｂ）を反復する工程を含む、スリット共焦点顕微鏡の作動方法。
12. 前記試料上の異なるピクセル・ラインを照射するために、前記顕微鏡のすべてまたは一部分と前記試料との間で相対移動を生じさせる工程をさらに含む、請求項１１に記載の方法。
13. １つのカラーに対して前記工程ａ）−ｃ）を実行し、そして１つ以上の他のカラーで照射された場合に同じピクセル・ラインに対して前記工程ａ）−ｃ）を反復する工程を含む、請求項１１または１２に記載の方法。
14. 各ピクセル・ラインに対して、前記工程ｃ）を実行する前に２以上のカラーのそれぞれにつき前記工程ａ）−ｂ）を実行する工程を含む、請求項１１〜１３のうちの１つに記載の方法。
15. 前記試料上の一連のピクセル・ラインが前記検知系に結像されるように前記試料と前記検知系との間に連続の相対移動を生じさせる工程と、１つのカラーで照射された１つのピクセル・ラインが次のカラーで照射された１つのピクセル・ラインと重なり合うように前記試料に所定の速度で異なるカラーを照射させる工程と、各照射されたピクセル・ラインに対して、検知器に対する入射光を積分する工程を含む、請求項１１〜１４のうちの１つに記載の方法。

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