JP2005278643A - L-glutamic acid-producing microorganism and method for producing l-glutamic acid - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、Ｌ−グルタミン酸生産微生物及びＬ−グルタミン酸の製造法に関する。Ｌ−グルタミン酸は調味料原料等として広く用いられている。 The present invention relates to an L-glutamic acid-producing microorganism and a method for producing L-glutamic acid. L-glutamic acid is widely used as a seasoning material.
Ｌ−グルタミン酸は、主としてブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、ミクロバクテリウム属に属するいわゆるコリネ型細菌のＬ−グルタミン酸生産菌またはそれらの変異株を用いた発酵法により製造されている（例えば、非特許文献１参照）。その他の菌株を用いた発酵法によるＬ−グルタミン酸の製造法としては、バチルス属、ストレプトミセス属、ペニシリウム属等の微生物を用いる方法（例えば、特許文献１参照）、シュードモナス属、アースロバクター属、セラチア属、キャンディダ属等の微生物を用いる方法（例えば、特許文献２参照）、バチルス属、シュードモナス属、セラチア属、アエロバクター・アエロゲネス（現エンテロバクター・アエロゲネス）等の微生物を用いる方法（例えば、特許文献３参照）、エシェリヒア・コリの変異株を用いる方法（例えば、特許文献４参照）等が知られている。また、クレブシエラ属、エルビニア属又はパントテア属、エンテロバクター属に属する微生物を用いたＬ−グルタミン酸の製造法も開示されている（例えば、特許文献５〜７参照）。 L-glutamic acid is mainly produced by fermentation using so-called coryneform L-glutamic acid-producing bacteria belonging to the genus Brevibacterium, Corynebacterium, and Microbacterium, or mutants thereof (for example, Non-patent document 1). As a method for producing L-glutamic acid by fermentation using other strains, methods using microorganisms such as Bacillus genus, Streptomyces genus, Penicillium genus (for example, see Patent Document 1), Pseudomonas genus, Arthrobacter genus, Methods using microorganisms such as Serratia and Candida (for example, see Patent Document 2), methods using microorganisms such as Bacillus, Pseudomonas, Serratia, Aerobacter Aerogenes (current Enterobacter Aerogenes) (for example, Patent Document 3), a method using a mutant of Escherichia coli (for example, see Patent Document 4), and the like are known. Moreover, the manufacturing method of L-glutamic acid using the microorganisms which belong to Klebsiella genus, Erbinia genus or Pantothea genus, Enterobacter genus is also disclosed (for example, refer patent documents 5-7).
また、組換えＤＮＡ技術によりＬ−グルタミン酸の生合成酵素の活性を増強することによって、Ｌ−グルタミン酸の生産能を増加させる種々の技術が開示されている。例えば、コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属細菌において、エシェリヒア・コリ又はコリネバクテリウム・グルタミクム由来のクエン酸シンターゼをコードする遺伝子の導入が、コリネ型細菌のＬ−グルタミン酸生産能の増強に効果的であったことが報告されている（例えば、特許文献８参照）。またコリネ型細菌由来のクエン酸シンターゼ遺伝子のエンテロバクター属、クレブシエラ属、セラチア属、エルビニア属、又はエシェリヒア属に属する腸内細菌への導入が、L-グルタミン酸生産能の増強に効果的であったことが報告されている（例えば、特許文献９参照）。 Various techniques for increasing L-glutamic acid production ability by enhancing the activity of L-glutamic acid biosynthetic enzymes by recombinant DNA techniques have been disclosed. For example, in Corynebacterium or Brevibacterium, introduction of a gene encoding citrate synthase derived from Escherichia coli or Corynebacterium glutamicum is effective in enhancing the ability of coryneform bacteria to produce L-glutamate. (For example, refer to Patent Document 8). In addition, introduction of citrate synthase gene derived from coryneform bacteria into enterobacteria belonging to the genus Enterobacter, Klebsiella, Serratia, Erbinia, or Escherichia was effective in enhancing L-glutamic acid production ability. (For example, refer to Patent Document 9).
アミノ酸等の目的物質の生産能を向上させる方法として、物質の取り込み系、又は排出系を改変する方法が知られている。例えば、物質の取り込み系を改変する方法としては、目的物質の細胞内への取り込み系を欠失又は低下させることにより、目的物質の生産能を高める方法が知られている。具体的にはgluABCDオペロン又はその一部を欠失させ、Ｌ−グルタミン酸の細胞内への取り込みを欠失又は低下させることによってＬ−グルタミン酸の生産能を向上させる方法（例えば、特許文献１０参照）及びプリンヌクレオチドの細胞内への取り込みを弱化することによって、プリンヌクレオチド生産能を強化する方法（例えば、特許文献１１参照）等が知られている。 As a method for improving the ability to produce a target substance such as an amino acid, a method for modifying a substance uptake system or a discharge system is known. For example, as a method for modifying a substance uptake system, a method is known in which the target substance production ability is increased by deleting or reducing the uptake system of the target substance into cells. Specifically, a method for improving L-glutamic acid-producing ability by deleting the gluABCD operon or a part thereof and deleting or reducing the uptake of L-glutamic acid into cells (for example, see Patent Document 10) In addition, a method for enhancing the ability to produce purine nucleotides by weakening the uptake of purine nucleotides into cells (for example, see Patent Document 11) is known.
一方、排出系を改変する方法に関しては、目的物質の排出系を強化する方法、及び目的物質の生合成系の中間体又は基質の排出系を欠損または弱化させる方法が知られている。目的物質の排出系を強化する方法としては、例えばＬ−リジン排出遺伝子(LysE)を強化したコリネバクテリウム属細菌の菌株を用いたＬ−リジンの製造法（例えば、特許文献１２参照）が開示されている。また、Ｌ−アミノ酸の排出に関与することが示唆されているｒｈｔＡ，Ｂ，Ｃ遺伝子を用いたＬ−アミノ酸の製造法も報告されている（例えば、特許文献１３参照）。目的物質の生合成系の中間体又は基質の排出系を欠損等させる方法としては、目的物質がＬ−グルタミン酸の場合に２−オキソグルタレートパーミアーゼ遺伝子を変異又は破壊することにより、目的物質の中間体である２−オキソグルタル酸の排出を弱化する方法が知られている（例えば、特許文献１４参照）。 On the other hand, as a method for modifying the discharge system, a method for enhancing the discharge system of the target substance and a method for deleting or weakening the discharge system of the intermediate or substrate of the biosynthesis system of the target substance are known. As a method for enhancing the target substance excretion system, for example, a method for producing L-lysine using a strain of the genus Corynebacterium having an enhanced L-lysine excretion gene (LysE) (for example, see Patent Document 12) is disclosed. Has been. In addition, a method for producing L-amino acids using rhtA, B, and C genes, which are suggested to be involved in L-amino acid excretion, has also been reported (see, for example, Patent Document 13). As a method of deleting the intermediate of the biosynthetic system of the target substance or the substrate discharge system, etc., when the target substance is L-glutamic acid, the 2-oxoglutarate permease gene is mutated or destroyed to A method of weakening the discharge of 2-oxoglutaric acid as an intermediate is known (for example, see Patent Document 14).
その他にも、物質の細胞膜の透過に関与するATP結合カセット（ATP Binding cassette）スーパーファミリー（ABCトランスポーター）をコードする遺伝子をアミノ酸の細胞膜輸送が改変された微生物の育種に用いることが示唆されている（例えば、特許文献１５参照）。 In addition, it has been suggested that the gene encoding the ATP Binding cassette superfamily (ABC transporter) involved in the permeation of substances through the cell membrane is used for breeding microorganisms with altered cell membrane transport of amino acids. (See, for example, Patent Document 15).
Ｌ−グルタミン酸について、コリネ型細菌では、ビオチンや界面活性剤の添加時に細胞膜の膜透過性が変化することにより、細胞内から細胞外にＬ−グルタミン酸が流出する現象が知られており、コリネ型細菌のL-グルタミン酸排出には、排出遺伝子を介在していないことが報告されている。（例えば、非特許文献２参照）。さらに、エシェリヒア属細菌においてＬ−アミノ酸の排出に関与すると予想されるyfiK等の遺伝子を発現増強することにより、Ｌ−グルタミン酸の生産効率が向上したことが報告されている。（例えば、特許文献１６参照）。
しかし、パントエア属細菌や他の微生物では、Ｌ−グルタミン酸排出遺伝子の存在が知られておらず、新規のＬ−グルタミン酸排出遺伝子の創出が望まれていた。
With respect to L-glutamic acid, in coryneform bacteria, the membrane permeability of the cell membrane changes when biotin or a surfactant is added, and a phenomenon in which L-glutamic acid flows out from the cell to the outside of the cell is known. It has been reported that bacterial L-glutamate excretion does not involve an excretion gene. (For example, refer nonpatent literature 2). Furthermore, it has been reported that the production efficiency of L-glutamic acid has been improved by enhancing the expression of genes such as yfiK that are expected to be involved in L-amino acid excretion in Escherichia bacteria. (For example, refer to Patent Document 16).
However, the existence of L-glutamate excretion genes is not known in Pantoea bacteria and other microorganisms, and the creation of a novel L-glutamate excretion gene has been desired.
また、Ｌ−グルタミン酸の製造法には、微生物を酸性条件下で培養し、Ｌ−グルタミン酸を析出させながらＬ−グルタミン酸を発酵生産する方法が知られている（例えば、特許文献１７参照）。一般に、Ｌ−グルタミン酸は細胞内に取り込まれると、グルタミン酸デヒドロゲナーゼによってTCAサイクルの中間体である２−オキソグルタル酸に１段階で変換されるため、細胞内に取り込まれたＬ−グルタミン酸は容易に代謝されると考えられる。しかし、Ｌ−グルタミン酸を析出させる発酵生産においては、２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性が欠損もしくは低下したエンテロバクター属細菌等が用いられるが、（例えば特許文献７、１７）これらの微生物は、L-グルタミン酸を析出させる条件下ではL-グルタミン酸は電荷を持たないフリー体の形での存在比率が高くなり、これらは容易に細胞膜を透過し、結果として細胞内グルタミン酸濃度が上昇し、生育が阻害される。そこで、上記特許文献１７においては、変異処理により、２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性が欠損し、かつＬ−グルタミン酸を析出させながら生産することのできる菌株が育種され、Ｌ−グルタミン酸の製造に用いられた。しかしながら、Ｌ−グルタミン酸を析出させながら生産することのできる株は他には知られておらず、さらに、L-グルタミン酸を析出させる条件下において宿主微生物にＬ−グルタミン酸耐性を付与し、Ｌ−グルタミン酸生産能を向上させることのできる遺伝子は知られていなかった。 As a method for producing L-glutamic acid, a method is known in which microorganisms are cultured under acidic conditions, and L-glutamic acid is fermented and produced while L-glutamic acid is precipitated (see, for example, Patent Document 17). Generally, when L-glutamic acid is taken up into cells, it is converted into 2-oxoglutarate, which is an intermediate of the TCA cycle, by glutamate dehydrogenase in one step, so that L-glutamic acid taken up into cells is easily metabolized. It is thought. However, in fermentation production in which L-glutamic acid is precipitated, Enterobacter bacteria or the like in which 2-oxoglutarate dehydrogenase activity is deficient or reduced are used (for example, Patent Documents 7 and 17). These microorganisms are L-glutamic acid. L-glutamate increases in a free form with no charge under the conditions that cause precipitation, and these easily penetrate the cell membrane, resulting in an increase in intracellular glutamate concentration and inhibition of growth. . Therefore, in the above-mentioned Patent Document 17, a strain which is deficient in 2-oxoglutarate dehydrogenase activity and can be produced while precipitating L-glutamic acid was bred by mutation treatment and used for the production of L-glutamic acid. . However, no other strains are known that can be produced while precipitating L-glutamic acid. Furthermore, L-glutamic acid resistance is imparted to the host microorganism under conditions where L-glutamic acid is precipitated. No gene has been known that can improve productivity.
ｙｈｆＫ遺伝子は大腸菌のゲノム上に存在する遺伝子であり（例えば、非特許文献３参照）、予想されるアミノ酸配列のモチーフやトポロジーなどから何らかのトランスポーターをコードしていると考えられている（例えば、非特許文献４参照）。しかし、該遺伝子をクローニングしたり、発現させて解析した報告はなく、実際の機能は不明であった。
本発明は、Ｌ−グルタミン酸を効率よく生産することのできる菌株を提供すること、及び該菌株を用いてＬ−グルタミン酸を効率よく生産する方法を提供することを課題とする。 An object of the present invention is to provide a strain capable of efficiently producing L-glutamic acid, and to provide a method for efficiently producing L-glutamic acid using the strain.
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、Ｌ−グルタミン酸耐性に関与する遺伝子としてＬ−グルタミン酸排出遺伝子yhfKを単離し、yhfK遺伝子の発現を強化した菌株は、細胞内のＬ−グルタミン酸濃度を低減させ、Ｌ−グルタミン酸の生産性を向上させることを見出し、本発明を完成するに至った。 As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventors have isolated an L-glutamate excretion gene yhfK as a gene involved in L-glutamate resistance, and a strain having enhanced expression of the yhfK gene is a cell. It was found that the concentration of L-glutamic acid in the inner layer was reduced and the productivity of L-glutamic acid was improved, and the present invention was completed.
すなわち本発明は、以下のとおりである。
（１） Ｌ−グルタミン酸生産能を有し、かつyhfK遺伝子の発現が増強するように改変された微生物。
（２） yhfK遺伝子のコピー数を高めること又はyhfK遺伝子の発現調節配列を改変することにより、yhfK遺伝子の発現が増強するように改変された、（１）の微生物。
（３）ｙｈｆＫ遺伝子が、配列番号１０、１１、及び１２から選択されるアミノ酸配列を有し、かつ、Ｌ−グルタミン酸排出活性を有するタンパク質をコードする遺伝子である、（１）の微生物。
（４） yhfK遺伝子が、下記(A)又は(B)に記載のタンパク質をコードする遺伝子である（１）の微生物：
（A）配列番号２または４に示すアミノ酸配列を有するタンパク質、
（B）配列番号２または４に示すアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、または付加されたアミノ酸配列を有し、かつＬ−グルタミン酸排出能を有するタンパク質。
（５） yhfK遺伝子が、配列番号２または４に示すアミノ酸配列と７０％以上相同なアミノ酸配列を有し、かつＬ−グルタミン酸排出能を有するタンパク質をコードする遺伝子である、（１）の微生物。
（６） 前記yhfK遺伝子が、下記（ａ）又は（ｂ）に記載のＤＮＡである、（１）の微生物：
（ａ）配列番号１の１５３０〜３６２０または配列番号３の２０１〜２２８８に示す塩基配列を含むＤＮＡ、
（ｂ）配列番号１の１５３０〜３６２０または配列番号３の２０１〜２２８８に示す塩基配列又は同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、Ｌ−グルタミン酸排出活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（７） 前記微生物が、γ-プロテオバクテリアである、（１）〜（６）のいずれかの
微生物。
（８） 前記微生物がエシェリヒア属細菌、エンテロバクター属細菌、パントエア属細菌、クレブシエラ属細菌、セラチア属細菌からなる群より選ばれるいずれかの腸内細菌である、（１）〜（７）のいずれかの微生物。
（９）前記微生物が、コリネ型細菌である（１）〜（６）のいずれかの微生物。
（１０） （１）〜（９）のいずれかの微生物を培地中で培養し、該培地中にＬ−グルタミン酸を生成・蓄積せしめ、Ｌ−グルタミン酸を該培地から採取することを特徴とする、Ｌ−グルタミン酸の製造法。
（１１） 以下の(A)又は(B)に記載のタンパク質をコードする遺伝子。
（A）配列番号２に示すアミノ酸配列を有するタンパク質、
（B）配列番号２に示すアミノ酸配列と７１％以上相同なアミノ酸配列を有し、かつＬ−グルタミン酸排出能を有するタンパク質。
That is, the present invention is as follows.
(1) A microorganism having an ability to produce L-glutamic acid and modified so that expression of the yhfK gene is enhanced.
(2) The microorganism according to (1), which has been modified to enhance the expression of the yhfK gene by increasing the copy number of the yhfK gene or by modifying the expression regulatory sequence of the yhfK gene.
(3) The microorganism according to (1), wherein the yhfK gene is a gene having an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 10, 11, and 12, and encoding a protein having L-glutamic acid excretion activity.
(4) The microorganism of (1), wherein the yhfK gene is a gene encoding the protein described in (A) or (B) below:
(A) a protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or 4,
(B) A protein having an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted, inserted, or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or 4, and having an ability to excrete L-glutamate.
(5) The microorganism according to (1), wherein the yhfK gene is a gene encoding a protein having an amino acid sequence of 70% or more homologous to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or 4 and having an ability to excrete L-glutamate.
(6) The microorganism of (1), wherein the yhfK gene is the DNA described in (a) or (b) below:
(A) DNA comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 1530-3620 or SEQ ID NO: 3 201-2288,
(B) It hybridizes under stringent conditions with a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 1530-3620 or SEQ ID NO: 3 201-288 or a probe that can be prepared from the nucleotide sequence, and has L-glutamic acid excretion activity DNA encoding a protein having the same.
(7) The microorganism according to any one of (1) to (6), wherein the microorganism is γ-proteobacterium.
(8) Any of (1) to (7), wherein the microorganism is any enteric bacterium selected from the group consisting of Escherichia bacteria, Enterobacter bacteria, Pantoea bacteria, Klebsiella bacteria, Serratia bacteria Some microorganisms.
(9) The microorganism according to any one of (1) to (6), wherein the microorganism is a coryneform bacterium.
(10) The microorganism according to any one of (1) to (9) is cultured in a medium, L-glutamic acid is produced and accumulated in the medium, and L-glutamic acid is collected from the medium. A method for producing L-glutamic acid.
(11) A gene encoding the protein described in (A) or (B) below.
(A) a protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2,
(B) A protein having an amino acid sequence 71% or more homologous to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and having an ability to excrete L-glutamic acid.
本発明の微生物を用いることにより、Ｌ−グルタミン酸を効率よく発酵生産することができる。また、本発明の遺伝子はＬ−グルタミン酸生産菌の育種に好適に使用することができる。 By using the microorganism of the present invention, L-glutamic acid can be efficiently produced by fermentation. Moreover, the gene of the present invention can be suitably used for breeding L-glutamic acid-producing bacteria.
以下、本発明を詳細に説明する。 Hereinafter, the present invention will be described in detail.
＜１＞本発明のＬ−グルタミン酸生産微生物
本発明の微生物は、Ｌ−グルタミン酸生産能を有し、かつyhfK遺伝子の発現が増強するように改変された微生物である。「Ｌ−グルタミン酸生産能」とは、本発明の微生物を培地中で培養したときに、Ｌ−グルタミン酸を細胞又は培地から回収できる程度に、細胞又は培地中に生成、蓄積する能力をいう。Ｌ−グルタミン酸生産能を有する微生物としては、本来的にＬ−グルタミン酸生産能を有するものであってもよいが、以下に示すような微生物を、変異法や組換えDNA技術を利用してＬ−グルタミン酸生産能を有するように改変したものや、本発明の遺伝子を導入することによってＬ−グルタミン酸生産能が付与された微生物あってもよい。なお、上記親株は、本来内在的にyhfK遺伝子を有しているものであってもよいし、本来はyhfK遺伝子を有しないが、yhfK遺伝子を導入することにより、L-グルタミン酸排出活性や生産能が向上するものであってもよい。
<1> L-glutamic acid-producing microorganism of the present invention The microorganism of the present invention is a microorganism having an ability to produce L-glutamic acid and modified so that expression of the yhfK gene is enhanced. “L-glutamic acid-producing ability” refers to the ability to produce and accumulate L-glutamic acid in a cell or medium to such an extent that L-glutamic acid can be recovered from the cell or medium when the microorganism of the present invention is cultured in the medium. Microorganisms having L-glutamic acid-producing ability may be inherently L-glutamic acid-producing microorganisms, but microorganisms such as those shown below can be obtained by utilizing mutation methods or recombinant DNA techniques. There may be a microorganism modified to have glutamic acid-producing ability or a microorganism to which L-glutamic acid-producing ability has been imparted by introducing the gene of the present invention. Note that the parent strain may originally have the yhfK gene inherently or does not originally have the yhfK gene, but by introducing the yhfK gene, L-glutamate excretion activity and production ability May be improved.
改変に用いる微生物の親株としては、エシェリヒア（Escherichia）属、エンテロバクター（Enterobacter）属、パントエア（Pantoea）、クレブシエラ（Klebsiella）属、セラチア（Serratia）属、エルビニア（Erwinia）属、サルモネラ（Salmonella）属、モルガネラ（Morganella）属などのγ−プロテオバクテリアに属する腸内細菌や、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、ミクロバクテリウム属に属するいわゆるコリネ型細菌、アリサイクロバチルス（Alicyclobacillus）属、バチルス（Bacillus）属、サッカロマイセス（Saccharomyces）属等に属する微生物などが挙げられる。γ−プロテオバクテリアは、NCBI（National Center for Biotechnology Information）データベースhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/htbin-post/Taxonomy/wgetorg?mode=Tree&id=1236&lvl=3&keep=1&srchmode=1&unlock）に開示されている分類により微生物に属するものが利用出来る。 The parent strains of microorganisms used for modification include Escherichia genus, Enterobacter genus, Pantoea, Klebsiella genus, Serratia genus, Erwinia genus, Salmonella genus Intestinal bacteria belonging to γ-proteobacteria such as Morganella genus, so-called coryneform bacteria belonging to the genus Brevibacterium, Corynebacterium, Microbacterium, Alicyclobacillus, Bacillus ( Examples include microorganisms belonging to the genus Bacillus, the genus Saccharomyces, and the like. γ-proteobacteria are listed in NCBI (National Center for Biotechnology Information) database http://www.ncbi.nlm.nih.gov/htbin-post/Taxonomy/wgetorg?mode=Tree&id=1236&lvl=3&keep=1&srchmode=1&unlock) Those belonging to microorganisms can be used according to the disclosed classification.
また、安価に大量に入手可能な発酵原料であるメタノールからＬ−アミノ酸を生産出来るメタノール資化性細菌であるメチロフィラス属およびメチロバチラス属微生物等も利用できる。 In addition, Methylophilus and Methylobacillus microorganisms that are methanol-assimilating bacteria that can produce L-amino acids from methanol, which is a fermentation raw material that can be obtained in large quantities at low cost, can also be used.
エシェリヒア属細菌としては、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)等が挙げられる。エシェリヒア・コリを遺伝子工学的手法を用いて育種する場合には、E. coli K12株及
びその誘導体であるエシェリヒア・コリ MG1655株（ATCC No.47076）、及びW3110株（ATCC No.27325）を用いることができる。エシェリヒア・コリK12株は、1922年にスタンフォード大学で分離されたものであり、λファージの溶原菌であるとともに、F因子を持ち、接合等遺伝的組み換え体の作成が可能である汎用性の高い菌株である。またエシェリヒア・コリＫ１２株のゲノム配列は既に決定されており、遺伝子情報も自由に利用出来る。エシェリヒア・コリＫ１２株や、誘導株を入手するには、例えばアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ATCC）より分譲を受けることができる（住所ATCC, P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, United States of America）。
Examples of Escherichia bacteria include Escherichia coli. When breeding Escherichia coli using genetic engineering techniques, use the E. coli K12 strain and its derivatives, Escherichia coli MG1655 strain (ATCC No. 47076) and W3110 strain (ATCC No. 27325). be able to. Escherichia coli K12 strain was isolated at Stanford University in 1922. It is a lysogen of λ phage, has F factor, and can make genetic recombinants such as conjugation. It is a high strain. The genome sequence of Escherichia coli K12 strain has already been determined, and genetic information can be freely used. To obtain Escherichia coli K12 and derivatives, for example, you can obtain a sale from the American Type Culture Collection (ATCC) (address ATCC, PO Box 1549, Manassas, VA 20108, United States of America ).
また、エンテロバクター属細菌としては、エンテロバクター・アグロメランス（Enterobacter agglomerans）、エンテロバクター・アエロゲネス(Enterobacter aerogenes)等、パントエア属細菌としてはパントエア・アナナティス（Pantoea ananatis）が挙げられる。尚、近年、エンテロバクター・アグロメランスは、１６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列解析などにより、パントエア・アグロメランス（Pantoea agglomerans）又はパントエア・アナナティス（Pantoea ananatis）、パントエア・スチューアルティ（Pantoea stewartii）等に再分類されているものがある。本発明においては、γ−プロテオバクテリアに分類されるものであれば、エンテロバクター属又はパントエア属のいずれに属するものであってもよい。パントエア・アナナティスを遺伝子工学的手法を用いて育種する場合には、パントエア・アナナティスＡＪ１３３５５株（ＦＥＲＭ ＢＰ−６６１４）、ＡＪ１３３５６株（ＦＥＲＭ ＢＰ−６６１５）、ＡＪ１３６０１株（ＦＥＲＭ ＢＰ−７２０７）及びそれらの誘導体を用いることができる。これらの株は、分離された当時はエンテロバクター・アグロメランスと同定され、エンテロバクター・アグロメランスとして寄託されたが、上記のとおり、16S rRNAの塩基配列解析などにより、パントエア・アナナティスに再分類されている。 Examples of Enterobacter bacteria include Enterobacter agglomerans, Enterobacter aerogenes, and the like, and Pantoea ananatis is an example of Pantoea bacteria. In recent years, Enterobacter agglomerans has been reclassified as Pantoea agglomerans, Pantoea ananatis, Pantoea stewartii, etc., by the base sequence analysis of 16S rRNA. There is something. In the present invention, as long as it is classified as γ-proteobacteria, it may belong to either Enterobacter or Pantoea. When breeding Pantoea ananatis using genetic engineering techniques, Pantoea ananatis AJ13355 strain (FERM BP-6614), AJ13356 strain (FERM BP-6615), AJ13601 strain (FERM BP-7207) and derivatives thereof Can be used. These strains were identified as Enterobacter agglomerans when they were isolated, and deposited as Enterobacter agglomerans, but as described above, they have been reclassified as Pantoea Ananatis by 16S rRNA sequence analysis, etc. .
本発明でいうコリネ型細菌は、バージーズ・マニュアル・オブ・デターミネイティブ・バクテリオロジー（Bergey's Manual of Determinative Bacteriology）第8版599頁（1974）に定義されている一群の微生物であり、好気性，グラム陽性，非抗酸性，胞子形成能を有しない桿菌であって、従来ブレビバクテリウム属に分類されていたが現在コリネバクテリウム属細菌として統合された細菌を含み（Int. J. Syst. Bacteriol., 41, 255 (1991)）、またコリネバクテリウム属と非常に近縁なブレビバクテリウム属細菌及びミクロバテリウム属細菌を含む。 The coryneform bacterium referred to in the present invention is a group of microorganisms defined in the Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8th edition, page 599 (1974), aerobic, Gram-positive, non-acid-fast, non-spore-forming gonococci, including bacteria previously classified as genus Brevibacterium but integrated as Corynebacterium (Int. J. Syst. Bacteriol , 41, 255 (1991)), and Brevibacterium and Microbatterium bacteria that are very closely related to Corynebacterium.
Ｌ−グルタミン酸の製造に好適に用いられるコリネ型細菌としては、例えば以下に示すものが挙げられる。
コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム
コリネバクテリウム・アセトグルタミカム
コリネバクテリウム・アルカノリティカム
コリネバクテリウム・カルナエ
コリネバクテリウム・グルタミカム
コリネバクテリウム・リリウム（コリネバクテリウム・グルタミカム）
コリネバクテリウム・メラセコーラ
コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス（コリネバクテリウム・エフィシエンス）
コリネバクテリウム・ハーキュリス
ブレビバクテリウム・ディバリカタム（コリネバクテリウム・グルタミカム）
ブレビバクテリウム・フラバム（コリネバクテリウム・グルタミカム）
ブレビバクテリウム・インマリオフィラム
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（コリネバクテリウム・グルタミカム）
ブレビバクテリウム・ロゼウム
ブレビバクテリウム・サッカロリティカム
ブレビバクテリウム・チオゲニタリス
ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス（コリネバクテリウム・アンモニアゲネス）
ブレビバクテリウム・アルバム
ブレビバクテリウム・セリヌム
ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム
Examples of coryneform bacteria suitably used for the production of L-glutamic acid include those shown below.
Corynebacterium acetoacidophilum Corynebacterium acetoglutamicum Corynebacterium alkanolyticum Corynebacterium carnae Corynebacterium glutamicum Corynebacterium lylium (Corynebacterium glutamicum)
Corynebacterium melasecola Corynebacterium thermoaminogenes (Corynebacterium efficiens)
Corynebacterium herculis Brevibacterium divaricatam (Corynebacterium glutamicum)
Brevibacterium flavum (Corynebacterium glutamicum)
Brevibacterium immariophilum Brevibacterium lactofermentum (Corynebacterium glutamicum)
Brevibacterium roseumum Brevibacterium saccharolyticum Brevibacterium thiogenitalis Brevibacterium ammoniagenes (Corynebacterium ammoniagenes)
Brevibacterium album Brevibacterium cerinum Microbacterium ammonia film
具体的には、下記のような菌株を例示することができる。
コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム ＡＴＣＣ１３８７０
コリネバクテリウム・アセトグルタミカム ＡＴＣＣ１５８０６
コリネバクテリウム・アルカノリティカム ＡＴＣＣ２１５１１
コリネバクテリウム・カルナエ ＡＴＣＣ１５９９１
コリネバクテリウム・グルタミカム ＡＴＣＣ１３０２０、１３０３２、１３０６０
コリネバクテリウム・リリウム（コリネバクテリウム・グルタミカム） ＡＴＣＣ１５９９０
コリネバクテリウム・メラセコーラ ＡＴＣＣ１７９６５
コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス ＡＪ１２３４０（ＦＥＲＭ ＢＰ−１５３９）
コリネバクテリウム・ハーキュリス ＡＴＣＣ１３８６８
ブレビバクテリウム・ディバリカタム（コリネバクテリウム・グルタミカム） ＡＴＣＣ１４０２０
ブレビバクテリウム・フラバム（コリネバクテリウム・グルタミカム） ＡＴＣＣ１３８２６、ＡＴＣＣ１４０６７
ブレビバクテリウム・インマリオフィラム ＡＴＣＣ１４０６８
ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタム（コリネバクテリウム・グルタミカム） ＡＴＣＣ１３６６５、ＡＴＣＣ１３８６９
ブレビバクテリウム・ロゼウム ＡＴＣＣ１３８２５
ブレビバクテリウム・サッカロリティカム ＡＴＣＣ１４０６６
ブレビバクテリウム・チオゲニタリス ＡＴＣＣ１９２４０
ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス（コリネバクテリウム・アンモニアゲネス） ＡＴＣＣ６８７１
ブレビバクテリウム・アルバム ＡＴＣＣ１５１１１
ブレビバクテリウム・セリヌム ＡＴＣＣ１５１１２
ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム ＡＴＣＣ１５３５４
Specifically, the following strains can be exemplified.
Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870
Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 15806
Corynebacterium alkanolyticum ATCC21511
Corynebacterium carnae ATCC 15991
Corynebacterium glutamicum ATCC 13020, 13032, 13060
Corynebacterium lilium (Corynebacterium glutamicum) ATCC 15990
Corynebacterium melasecola ATCC 17965
Corynebacterium thermoaminogenes AJ12340 (FERM BP-1539)
Corynebacterium herculis ATCC 13868
Brevibacterium divaricatam (Corynebacterium glutamicum) ATCC14020
Brevibacterium flavum (Corynebacterium glutamicum) ATCC 13826, ATCC 14067
Brevibacterium immariophilum ATCC 14068
Brevibacterium lactofermentum (Corynebacterium glutamicum) ATCC 13665, ATCC 13869
Brevibacterium roseum ATCC 13825
Brevibacterium saccharolyticum ATCC 14066
Brevibacterium thiogenitalis ATCC 19240
Brevibacterium ammoniagenes (Corynebacterium ammoniagenes) ATCC6871
Brevibacterium album ATCC15111
Brevibacterium cerinum ATCC 15112
Microbacterium ammonia film ATCC15354
メチロフィラス属微生物として具体的には、メチロフィラス・メチロトロファスが挙げられ、代表的な株としてはAS1株（NCIMB10515）等が挙げられる。メチロフィラス・メチロトロファスAS1株はナショナル・コレクション・オブ・インダストゥリアル・アンド・マリン・バクテリア（National Collections of Industrial and Marine Bacteria、住所 NCIMB Lts., Torry Research Station 135, Abbey Road, Aberdeen AB9 8DG, United Kingdom）から入手可能である。 Specific examples of Methylophilus microorganisms include Methylophilus methylotrophus, and typical strains include AS1 strain (NCIMB10515). The Methylophilus methylotrophus AS1 strain is the National Collections of Industrial and Marine Bacteria (address NCIMB Lts., Torry Research Station 135, Abbey Road, Aberdeen AB9 8DG, United Kingdom) Is available from
メチロバチラス属微生物として具体的には、メチロバチラス・グリコゲネス（Methylobacillus glycogenes）、メチロバチラス・フラゲラタム(Methylobacillu flagellatum)等が挙げられる。メチロバチラス・グリコゲネスとしては、T-11株（NCIMB 11375）、ATCC 21276株、 ATCC 21371株、ATR80株(Appl. Microbiol. Biotechnol., (1994)、42巻, p67-72に記載）、A513株（Appl. Microbiol. Biotechnol., (1994)、42巻, p67-72に記載）等が挙げられる。メチロバチラス・グリコゲネスNCIMB 11375株は、ナショナル・コレクション・オブ・インダストゥリアル・アンド・マリン・バクテリア（National Collections
of Industrial and Marine Bacteria、住所 NCIMB Lts., Torry Research Station 135,
Abbey Road, Aberdeen AB9 8DG, United Kingdom）から入手可能である。また、メチロ
バチラス・フラゲラタムとしては、KT株(Arch. Microbiol., (1988), 149巻、p441-446に記載)等が挙げられる。
Specific examples of the microorganism belonging to the genus Methylobacillus include Methylobacillus glycogenes, Methylobacillus flagellatum, and the like. Examples of Methylobacillus glycogenes include T-11 (NCIMB 11375), ATCC 21276, ATCC 21371, ATR80 (Appl. Microbiol. Biotechnol., (1994), 42, p67-72), A513 ( Appl. Microbiol. Biotechnol., (1994), 42, p67-72). The Methylobacillus glycogenes NCIMB 11375 strain is the National Collection of Industrial and Marine Bacteria (National Collections)
of Industrial and Marine Bacteria, Address NCIMB Lts., Torry Research Station 135,
Abbey Road, Aberdeen AB9 8DG, United Kingdom). Examples of Methylobacillus flagellatam include KT strain (described in Arch. Microbiol., (1988), vol. 149, p441-446).
上述したような微生物にＬ−グルタミン酸生産能を付与するための改変の方法としては、例えば、Ｌ−グルタミン酸生合成に関与する酵素をコードする遺伝子の発現が増強するように改変する方法を挙げることができる。Ｌ−グルタミン酸生合成に関与する酵素としては、例えば、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（以下、「ＧＤＨ」ともいう）、グルタミンシンテターゼ、グルタミン酸シンターゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、アコニット酸ヒドラターゼ、クエン酸シンターゼ（以下、「ＣＳ」ともいう）、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（以下、「ＰＥＰＣ」ともいう）、ピルビン酸カルボキシラーゼ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、ホスホエノールピルビン酸シンターゼ、エノラーゼ、ホスホグリセルムターゼ、ホスホグリセリン酸キナーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、フルトースビスリン酸アルドラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコースリン酸イソメラーゼなどが挙げられる。これらの酵素の中では、ＣＳ、ＰＥＰＣおよびＧＤＨのいずれか１種以上が好ましく、３種全てがより好ましい。 Examples of the modification method for imparting L-glutamic acid-producing ability to the microorganism as described above include a method of modifying so that expression of a gene encoding an enzyme involved in L-glutamic acid biosynthesis is enhanced. Can do. Examples of enzymes involved in L-glutamate biosynthesis include glutamate dehydrogenase (hereinafter also referred to as “GDH”), glutamine synthetase, glutamate synthase, isocitrate dehydrogenase, aconite hydratase, and citrate synthase (hereinafter referred to as “CS”). ), Phosphoenolpyruvate carboxylase (hereinafter also referred to as “PEPC”), pyruvate carboxylase, pyruvate dehydrogenase, pyruvate kinase, phosphoenolpyruvate synthase, enolase, phosphoglycerate mutase, phosphoglycerate kinase, glycerin Aldehyde-3-phosphate dehydrogenase, triose phosphate isomerase, furtose bisphosphate aldolase, phosphofructokinase, glucose phosphate iso Hydrolase and the like. Among these enzymes, one or more of CS, PEPC and GDH are preferable, and all three are more preferable.
以下に目的遺伝子の発現が増強するように微生物を改変する方法について説明する。 A method for modifying a microorganism so that expression of a target gene is enhanced will be described below.
１つ目の方法は、目的遺伝子を適当なプラスミド上にクローニングし、得られたプラスミドを用いて宿主微生物を形質転換することにより、該遺伝子のコピー数を高める方法である。例えば、目的遺伝子としてＣＳをコードする遺伝子（ｇｌｔＡ遺伝子）、ＰＥＰＣをコードする遺伝子（ｐｐｃ遺伝子）、およびＧＤＨをコードする遺伝子（ｇｄｈＡ遺伝子）を用いる場合、これらの遺伝子はエシェリヒア属細菌、及びコリネバクテリウム属細菌において、既に塩基配列が明らかにされていることから（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２２巻、５２４３〜５２４９頁、１９８３年；Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、第９５巻、９０９〜９１６頁、１９８４年；Ｇｅｎｅ、第２７巻、１９３〜１９９頁、１９８４年；Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、第１４０巻、１８１７〜１８２８頁、１９９４年；Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．、第２１８巻、３３０〜３３９頁、１９８９年；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、第６巻、３１７〜３２６頁、１９９２年）、それぞれの塩基配列に基づいてプライマーを合成し、染色体ＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲ法により取得することが可能である。 The first method is a method of increasing the copy number of a gene by cloning a target gene on an appropriate plasmid and transforming a host microorganism using the obtained plasmid. For example, when a gene encoding CS (gltA gene), a gene encoding PEPC (ppc gene), and a gene encoding GDH (gdhA gene) are used as the target gene, these genes are classified into bacteria belonging to the genus Escherichia and corynebacteria. Since the nucleotide sequence has already been clarified in the genus Baum (Biochemistry, Vol. 22, 5243-5249, 1983; J. Biochem., 95, 909-916, 1984; Gene, 27, 193-199, 1984; Microbiology, 140, 1817-1828, 1994; Mol. Gen. Genet., 218, 330-339, 1989; Molecular Microbiology, 6 roll, 317-326, 1992), primers can be synthesized based on the respective base sequences and obtained by PCR using chromosomal DNA as a template.
形質転換に用いるプラスミドは、腸内細菌群に属する微生物の中で自律複製可能なプラスミドとして、pUC19、pUC18、pBR322、RSF1010、pHSG299、pHSG298、pHSG399、pHSG398、pSTV28、pSTV29（pHSG、pSTVはタカラバイオ社より入手可）、pMW119、pMW118、pMW219、pMW218（pMWはニッポンジーン社より入手可）等が挙げられる。また、コリネ型細菌用のプラスミドとしては、pAM330(特開昭58-67699号公報)、pHM1519(特開昭58-77895号公報)、pAJ655，pAJ611，pAJ1844(特開昭58-192900号公報)、pCG1(特開昭57-134500号公報)、pCG2（特開昭58-35197号公報），pCG4，pCG11（特開昭57-183799号公報）、pHK4（特開平5-7491号公報）などが挙げられる。なお、プラスミドの代わりにファージＤＮＡをベクターとして用いてもよい。上記ＣＳ、ＰＥＰＣおよびＧＤＨの活性を同時に増強するためのプラスミドとして、ｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子及びｇｄｈＡ遺伝子が組み込まれたRSFCPGを挙げることができる（欧州特許出願公開第0952221号明細書参照）。 Plasmids used for transformation are plasmids that can autonomously replicate among microorganisms belonging to the group of enterobacteria, pUC19, pUC18, pBR322, RSF1010, pHSG299, pHSG298, pHSG399, pHSG398, pSTV28, pSTV29 (pHSG and pSTV are Takara Bio) PMW119, pMW118, pMW219, pMW218 (pMW is available from Nippon Gene). Further, plasmids for coryneform bacteria include pAM330 (JP 58-67699 A), pHM1519 (JP 58-77895 JP), pAJ655, pAJ611, pAJ1844 (JP 58-192900). , PCG1 (Japanese Unexamined Patent Publication No. 57-134500), pCG2 (Japanese Unexamined Patent Publication No. 58-35197), pCG4, pCG11 (Japanese Unexamined Patent Publication No. 57-183799), pHK4 (Japanese Unexamined Patent Publication No. 5-7491), etc. Is mentioned. In addition, phage DNA may be used as a vector instead of a plasmid. As a plasmid for simultaneously enhancing the activities of CS, PEPC and GDH, RSFCPG in which a gltA gene, a ppc gene and a gdhA gene are incorporated can be mentioned (see European Patent Application Publication No. 0952221).
メチロフィラス属微生物で機能するベクターとして、具体的には、広宿主域ベクターであるRSF1010及びその誘導体、例えばpAYC32（Chistorerdov, A.Y., Tsygankov, Y.D. Plasmid, 1986, 16, 161-167）、あるいはpMFY42（gene, 44, 53(1990)）、pRP301、pTB70（Nature, 287, 396, (1980)）等が挙げられる。 Specific examples of vectors that function in Methylophilus microorganisms include RSF1010, which is a broad host range vector, and derivatives thereof such as pAYC32 (Chistorerdov, AY, Tsygankov, YD Plasmid, 1986, 16, 161-167), or pMFY42 (gene 44, 53 (1990)), pRP301, pTB70 (Nature, 287, 396, (1980)) and the like.
形質転換法としては、例えば、エシェリヒア・コリ Ｋ−１２について報告されているような、受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してＤＮＡの透過性を増す方法（Mandel,M.and Higa,A.,J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)）、バチルス・ズブチリスについて報告されているような、増殖段階の細胞からコンピテントセルを調製してＤＮＡを導入する方法（Duncan,C.H.,Wilson,G.A.and Young,F.E., Gene, 1, 153 (1977)）などが挙げられる。
あるいは、バチルス・ズブチリス、放線菌類及び酵母について知られているような、ＤＮＡ受容菌の細胞を、組換えＤＮＡを容易に取り込むプロトプラストまたはスフェロプラストの状態にして組換えＤＮＡをＤＮＡ受容菌に導入する方法（ Chang,S.and Choen,S.N.,Molec. Gen. Genet., 168, 111 (1979);Bibb,M.J.,Ward,J.M.and Hopwood,O.A.,Nature, 274, 398 (1978);Hinnen,A.,Hicks,J.B.and Fink,G.R.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75
1929 (1978)）も応用できる。また、電気パルス法（特開平2-207791号公報）によっても、微生物の形質転換を行うこともできる。
As a transformation method, for example, as reported for Escherichia coli K-12, a recipient cell is treated with calcium chloride to increase DNA permeability (Mandel, M. and Higa, A., J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)), a method of introducing competent cells from proliferating cells and introducing DNA as reported for Bacillus subtilis (Duncan, CH, Wilson, GAand Young, FE, Gene, 1, 153 (1977)).
Alternatively, DNA-receptive cells, such as those known for Bacillus subtilis, actinomycetes, and yeast, are introduced into the DNA-receptor cells in a protoplast or spheroplast state that readily incorporates recombinant DNA. (Chang, S. and Choen, SN, Molec. Gen. Genet., 168, 111 (1979); Bibb, MJ, Ward, JMand Hopwood, OA, Nature, 274, 398 (1978); Hinnen, A. , Hicks, JBand Fink, GR, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75
1929 (1978)) can also be applied. Moreover, transformation of microorganisms can also be performed by an electric pulse method (Japanese Patent Laid-Open No. 2-207791).
遺伝子のコピー数を高めることは、目的遺伝子を微生物の染色体DNA上に多コピー導入することによっても達成できる。微生物の染色体DNA上に遺伝子を多コピーで導入するには、染色体DNA上に多コピー存在する配列を標的に利用して、相同組換え法（Experimentsin Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. (1972)）により行うことができる。染色体DNA上に多コピー存在する配列としては、レペティティブDNA、転移因子の端部に存在するインバーテッド・リピートが利用できる。あるいは、特開平2-109985号公報に開示されているように、目的遺伝子をトランスポゾンに搭載してこれを転移させて染色体DNA上に多コピー導入することも可能である。さらに、Muファージを用いる方法（特開平2-109985号）で宿主染色体に目的遺伝子を組み込むこともできる。 Increasing the gene copy number can also be achieved by introducing multiple copies of the target gene onto the chromosomal DNA of the microorganism. In order to introduce multiple copies of genes into chromosomal DNA of microorganisms, homologous recombination method (Experimentsin Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. (1972)) using multiple copies of sequences present on chromosomal DNA as targets Can be performed. As a sequence present in multiple copies on chromosomal DNA, repetitive DNA and inverted repeats present at the end of a transposable element can be used. Alternatively, as disclosed in JP-A-2-109985, a target gene can be mounted on a transposon, transferred, and introduced in multiple copies on chromosomal DNA. Furthermore, the target gene can also be integrated into the host chromosome by a method using Mu phage (Japanese Patent Laid-Open No. 2-109985).
２つ目の方法は、染色体DNA上またはプラスミド上において、目的遺伝子のプロモーター等の発現調節配列を強力なものに置換することによって目的遺伝子の発現を増強させる方法である。例えば、lacプロモーター、trpプロモーター、trcプロモーター、pLプロモーター等が強力なプロモーターとして知られている。また、国際公開WO00/18935に開示されているように、遺伝子のプロモーター領域に数塩基の塩基置換を導入し、より強力なものに改変することも可能である。発現調節配列の置換は、例えば、温度感受性プラスミドを用いた遺伝子置換と同様にして行うことができる。エシェリヒア・コリや、パントエア・アナナティスに用いることが出来る、温度感受性複製起点を有するベクターとしては、例えばWO 99/03988号国際公開パンフレットに記載のプラスミドpMAN997やその誘導体等が挙げられる。また、λファージのレッド・リコンビナーゼ（Red recombinase）を利用した方法（Datsenko, K.A., PNAS (2000) 97(12), 6640-6645）によっても、発現調節配列の置換を行うことができる。なお、発現調節配列の改変は、上述したような遺伝子のコピー数を高める方法と組み合わせてもよい。 The second method is a method for enhancing the expression of a target gene by replacing an expression regulatory sequence such as a promoter of the target gene with a strong one on a chromosomal DNA or a plasmid. For example, lac promoter, trp promoter, trc promoter, pL promoter and the like are known as strong promoters. Further, as disclosed in International Publication WO00 / 18935, it is possible to introduce a base substitution of several bases into the promoter region of a gene and modify it to be more powerful. The replacement of the expression regulatory sequence can be performed, for example, in the same manner as the gene replacement using a temperature sensitive plasmid. Examples of vectors having a temperature-sensitive replication origin that can be used for Escherichia coli and Pantoea ananatis include plasmid pMAN997 and derivatives thereof described in WO 99/03988 International Publication Pamphlet. The expression regulatory sequence can also be replaced by a method using red recombinase of λ phage (Datsenko, K.A., PNAS (2000) 97 (12), 6640-6645). The modification of the expression regulatory sequence may be combined with the method for increasing the gene copy number as described above.
以上のような方法によりクエン酸シンターゼ遺伝子、フォスフォエノールピルベートカルボキシラーゼ遺伝子、及び／又はグルタミン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の発現が増強するように改変された微生物としては、特開平2001-333769号公報、特開2000-106869号公報、特開2000-189169号公報、特開2000-333769等に記載された微生物が例示できる。 Examples of microorganisms modified so as to enhance the expression of citrate synthase gene, phosphoenolpyruvate carboxylase gene, and / or glutamate dehydrogenase gene by the method as described above are disclosed in JP-A Nos. 2001-333769 and 2000. -106869, JP-A 2000-189169, JP-A 2000-333769, etc.
また、Ｌ−グルタミン酸生産能は、６−ホスホグルコン酸デヒドラターゼ活性もしくは２−ケト−３−デオキシ−６−ホスホグルコン酸アルドラーゼ活性、又はこれらの両方の活性を増強させることによっても付与することが出来る。６−ホスホグルコン酸デヒドラターゼ活性、２−ケト−３−デオキシ−６−ホスホグルコン酸アルドラーゼ活性を上昇させた微生物としては、特開2003-274988に開示された微生物を挙げることが出来る。 The ability to produce L-glutamic acid can also be imparted by enhancing 6-phosphogluconate dehydratase activity, 2-keto-3-deoxy-6-phosphogluconate aldolase activity, or both of these activities. . Examples of microorganisms that have increased 6-phosphogluconate dehydratase activity and 2-keto-3-deoxy-6-phosphogluconate aldolase activity include those disclosed in Japanese Patent Application Laid-Open No. 2003-274988.
Ｌ−グルタミン酸生産能を付与するための改変は、Ｌ−グルタミン酸の生合成経路から分岐して他の化合物を生成する反応を触媒する酵素の活性を低下または欠損させることに
より行ってもよい。Ｌ−グルタミン酸の生合成経路から分岐してＬ−グルタミン酸以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素としては、２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ、イソクエン酸リアーゼ、リン酸アセチルトランスフェラーゼ、酢酸キナーゼ、アセトヒドロキシ酸シンターゼ、アセト乳酸シンターゼ、ギ酸アセチルトランスフェラーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、グルタミン酸デカルボキシラーゼ、１−ピロリンデヒドロゲナーゼなどが挙げられる。この中では特に、２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性を低下又は欠損させることが好ましい。
The modification for imparting L-glutamic acid-producing ability may be performed by reducing or eliminating the activity of an enzyme that catalyzes a reaction that branches from the biosynthetic pathway of L-glutamic acid to produce other compounds. Examples of the enzyme that catalyzes a reaction that branches from the biosynthetic pathway of L-glutamic acid to produce a compound other than L-glutamic acid include 2-oxoglutarate dehydrogenase, isocitrate lyase, phosphate acetyltransferase, acetate kinase, acetohydroxyacid synthase Acetolactate synthase, formate acetyltransferase, lactate dehydrogenase, glutamate decarboxylase, 1-pyrroline dehydrogenase and the like. Among these, it is particularly preferable to reduce or eliminate 2-oxoglutarate dehydrogenase activity.
上記のような酵素の活性を低下または欠損させるには、通常の変異処理法によって、あるいは遺伝子工学的手法によって、上記酵素の遺伝子に、細胞中の当該酵素の活性が低下または欠損するような変異を導入すればよい。変異処理法としては、たとえばＸ線や紫外線を照射する方法、またはＮ−メチル−Ｎ'−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン等の変異剤で処理する方法等がある。遺伝子に変異が導入される部位は、酵素タンパク質をコードするコード領域であってもよく、プロモーター等の発現制御領域であってもよい。また、遺伝子工学的手法には、例えば遺伝子組換え法、形質導入法、細胞融合法等を用いる方法がある。 In order to reduce or eliminate the activity of the enzyme as described above, a mutation that reduces or eliminates the activity of the enzyme in the cell by a usual mutation treatment method or genetic engineering technique. Should be introduced. Examples of the mutation treatment method include a method of irradiating with X-rays and ultraviolet rays, a method of treating with a mutation agent such as N-methyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidine, and the like. The site where the mutation is introduced into the gene may be a coding region encoding an enzyme protein or an expression control region such as a promoter. Examples of genetic engineering techniques include a method using a gene recombination method, a transduction method, a cell fusion method and the like.
細胞中の目的酵素の活性が低下または欠損していること、および活性の低下の程度は、候補株の菌体抽出液または精製画分の酵素活性を測定し、野生株と比較することによって確認することができる。例えば、２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性は、Reedらの方法（L.J.Reed and B.B.Mukherjee, Methods in Enzymology 1969, 13, p.55-61）に従って測定することができる。 Confirm that the activity of the target enzyme in the cell is reduced or missing, and the extent of the activity decrease by measuring the enzyme activity of the bacterial cell extract or purified fraction of the candidate strain and comparing it with the wild strain. can do. For example, 2-oxoglutarate dehydrogenase activity can be measured according to the method of Reed et al. (L.J. Reed and B.B.Mukherjee, Methods in Enzymology 1969, 13, p.55-61).
エシェリヒア属細菌において２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性を欠損もしくは低下させる方法は、特開平5-244970号公報及び特開平7−203980号公報などに記載されている。また、コリネ型細菌において２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性を欠損もしくは低下させる方法は、国際公開95/34672号パンフレットに記載されている。さらに、エンテロバクター属細菌については、特開２００１−３３３７６９号公報に開示されている。 Methods for eliminating or reducing 2-oxoglutarate dehydrogenase activity in Escherichia bacteria are described in JP-A-5-244970 and JP-A-7-203980. A method for deleting or reducing 2-oxoglutarate dehydrogenase activity in coryneform bacteria is described in WO95 / 34672. Furthermore, Enterobacter bacteria are disclosed in Japanese Patent Application Laid-Open No. 2001-333769.
２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性が欠損もしくは低下した細菌としては、具体的には次のような株が挙げられる。
エシェリヒア・コリAJ12624（FERM BP-3853）
エシェリヒア・コリAJ12628（FERM BP-3854）
エシェリヒア・コリAJ12949（FERM BP-4881）
ブレビバクテリム・ラクトファーメンタム ΔS株 （国際公開95/34672号パンフレット参照）
パントエア・アナナティス AJ13601(FERM BP-7207 欧州特許公開明細書1078989)
パントエア・アナナティス AJ13356(FERM BP-6615 米国特許6.331,419号)
パントエア・アナナティス SC17sucA(BP-8646)
クレブシエラ・プランティコーラ AJ13410(FERM BP-6617 米国特許6,197,559号)
尚、SC17sucA株は、SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB株（2001-333769）のプラスミドを導入する前の菌株であり、プライベートナンバーAJ４１７が付与され、平成１６年２月２６日に独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（郵便番号３０５−８５６６ 茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に受託番号FERM BP-08646として寄託されている。
Specific examples of the bacterium in which 2-oxoglutarate dehydrogenase activity is deficient or reduced include the following strains.
Escherichia coli AJ12624 (FERM BP-3853)
Escherichia coli AJ12628 (FERM BP-3854)
Escherichia coli AJ12949 (FERM BP-4881)
Brevibacterium lactofermentum ΔS strain (see pamphlet of WO 95/34672)
Pantoea Ananatis AJ13601 (FERM BP-7207 European Patent Publication No. 1078989)
Pantoea Ananatis AJ13356 (FERM BP-6615 US Patent 6.331,419)
Pantoea Ananatis SC17sucA (BP-8646)
Klebsiella Planticola AJ13410 (FERM BP-6617 U.S. Patent No. 6,197,559)
The SC17sucA strain is a strain before the plasmid of the SC17sucA / RSFCPG + pSTVCB strain (2001-333769) was introduced. The private number AJ417 was assigned, and on February 26, 2004, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology. The depository is FERM BP-08646, which is deposited at the Patent Biological Deposit Center (postal code 305-8586, 1st, 1st, 1st, 1st East, Tsukuba, Ibaraki Prefecture).
本発明の微生物は、上述したようなＬ−グルタミン酸生産能を有する微生物を、yhfK遺伝子の発現が増強するように改変することによって得ることができる。ただし、先にyhfK遺伝子の発現が増強するように改変を行った後に、Ｌ−グルタミン酸生産能を付与しても
よい。また、yhfK遺伝子の増幅により、Ｌ−グルタミン酸生産能が付与された微生物でもよい。なお、yhfK遺伝子の発現増強は、後述するように、プロモーター改変を始めとする発現調節領域改変などによる内因性yhfK遺伝子の発現増強であってもよいし、yhfK遺伝子を含むプラスミドの導入などによる外因性yhfK遺伝子の発現増強であってもよい。さらに、これらを組み合わせてもよい。
The microorganism of the present invention can be obtained by modifying a microorganism having the ability to produce L-glutamic acid as described above so that expression of the yhfK gene is enhanced. However, L-glutamic acid-producing ability may be imparted after the modification is performed so that the expression of the yhfK gene is enhanced. Alternatively, a microorganism to which L-glutamic acid-producing ability is imparted by amplification of the yhfK gene may be used. As described later, the expression enhancement of the yhfK gene may be an enhancement of expression of the endogenous yhfK gene by modifying an expression regulatory region such as a promoter modification, or an external factor by introduction of a plasmid containing the yhfK gene. It may be enhanced expression of the sex yhfK gene. Furthermore, these may be combined.
yhfKの発現が親株、例えば野生株や非改変株と比べて向上していることの確認は、yhfKのmRNAの量を野生型、あるいは非改変株と比較することによって確認出来る。発現量の確認方法としては、ノーザンハイブリダイゼーション、RT-PCRが挙げられる（Molecular cloning（Cold spring Harbor Laboratory Press,Cold spring Harbor(USA),2001））。発現量については、野生株あるいは非改変株と比較して、上昇していればいずれでもよいが、例えば野生株、非改変株と比べて１．５倍以上、より好ましくは２倍以上、さらに好ましくは３倍以上上昇していることが望ましい。 Confirmation that the expression of yhfK is improved compared to the parent strain, for example, a wild strain or an unmodified strain, can be confirmed by comparing the amount of mRNA of yhfK with that of a wild type or an unmodified strain. Examples of the method for confirming the expression level include Northern hybridization and RT-PCR (Molecular cloning (Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor (USA), 2001)). The expression level may be any as long as it is increased compared to the wild strain or the unmodified strain, but for example, 1.5 times or more, more preferably 2 times or more compared to the wild strain or the non-modified strain, It is desirable that it rises 3 times or more.
本発明による「ｙｈｆＫ遺伝子」とは、エシェリヒア・コリのｙｈｆＫ遺伝子、パントエア・アナナティスのyhfK遺伝子等、γ−プロテオバクテリア由来、腸内細菌群のyhfK遺伝子あるいはそのホモログをいう。エシェリヒア・コリのｙｈｆＫ遺伝子としては、配列番号４に示すアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子、好ましくは、配列番号３の塩基番号201番目から2288番目の塩基配列を含む遺伝子を例示することができる。（Genbank Accession No.NP_417817.[gi:16131237]）また、パントエア・アナナティス由来のｙｈｆＫ遺伝子としては、配列番号２に示すアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子、好ましくは、配列番号１の塩基番号1530番目から3620番目の塩基配列を含むDNAを例示することができる。さらに、GenBank Accession No. AE016992の塩基番号230947〜233037番で示されるシゲラ・フレキシネリ（Shigella flexneri）のyhfK遺伝子、GenBank Accession No. AE008859の塩基番号4272〜6359番で示されるサルモネラ・ティフィムリウム（Salmonella typhimurium）のyhfK遺伝子を例示することができる。さらに、yhfK遺伝子は、上記で例示された遺伝子との相同性に基づいて、エンテロバクター属、クレブシエラ属、セラチア属、エルビニア属、エルシニア属等のγ―プロテオバクテリア、コリネバクテリウム・グルタミカム、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム等のコリネ型細菌、シュードモナス・アエルジノーサ等のシュードモナス属細菌、マイコバクテリウム・ツベルクロシス等のマイコバクテリウム属細菌等からクローニングされるものであってもよく、例えば配列番号５、６、あるいは配列番号７、８に示される合成オリゴヌクレオチドを用いて増幅出来るものであってもよい。
なお、上記シゲラ・フレキシネリ、サルモネラ・ティフィムリウムのyhfK遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号４のアミノ酸配列と、それぞれ、９９％、８６％相同であり、配列番号２のアミノ酸配列と、それぞれ、７０％、７１％の相同性である。さらに、配列番号２と４のアミノ酸配列の間の相同性は７０％である。アミノ酸配列および塩基配列の相同性は、例えばKarlin and AltschulによるアルゴリズムBLAST(Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873(1993))やFASTA(Methods Enzymol., 183, 63
(1990))を用いて決定することができる。このアルゴリズムBLASTに基づいて、BLASTNやBLASTXとよばれるプログラムが開発されている (http://www.ncbi.nlm.nih.gov参照)。
The “yhfK gene” according to the present invention refers to a yhfK gene derived from γ-proteobacteria such as Escherichia coli yhfK gene, Pantoea ananatis yhfK gene, or a homolog thereof. Examples of the yhfK gene of Escherichia coli include a gene encoding a protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4, preferably a gene containing the nucleotide sequence from nucleotide numbers 201 to 2288 of SEQ ID NO: 3. . (Genbank Accession No. NP — 417817. [gi: 16131237]) Further, as the yhfK gene derived from Pantoea ananatis, a gene encoding a protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, preferably the base number 1530 of SEQ ID NO: 1 A DNA containing the 3620th to 3620th base sequence can be exemplified. Furthermore, the yhfK gene of Shigella flexneri represented by nucleotide numbers 230947 to 233037 of GenBank Accession No. AE016992, and Salmonella typhimurium (Salmonella represented by nucleotide numbers 4272 to 6359 of GenBank Accession No. AE008859). typhimurium) yhfK gene. Furthermore, the yhfK gene is based on homology with the genes exemplified above, and γ-proteobacteria such as Enterobacter, Klebsiella, Serratia, Erbinia, Yersinia, etc., Corynebacterium glutamicum, Brevibacterium It may be cloned from coryneform bacteria such as um lactofermentum, pseudomonas bacteria such as Pseudomonas aeruginosa, mycobacterium bacteria such as Mycobacterium tuberculosis, etc., for example, SEQ ID NOs: 5 and 6 Alternatively, those that can be amplified using the synthetic oligonucleotides shown in SEQ ID NOs: 7 and 8 may be used.
The amino acid sequence of the protein encoded by the yhfK gene of Shigella flexinelli and Salmonella typhimurium is 99% and 86% homologous to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, respectively. The amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 And 70% and 71% homology, respectively. Furthermore, the homology between the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 2 and 4 is 70%. The homology between the amino acid sequence and the base sequence can be determined by, for example, the algorithm BLAST (Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873 (1993)) or FASTA (Methods Enzymol., 183, 63) by Karlin and Altschul.
(1990)). Based on this algorithm BLAST, programs called BLASTN and BLASTX have been developed (see http://www.ncbi.nlm.nih.gov).
yhfK遺伝子ホモログとは、エシェリヒア・コリ、パントエア・アナナティスのyhfK遺伝子構造と高い相同性を示し、かつＬ−グルタミン酸排出機能を持つ遺伝子をいう。
例えば配列番号１０に示すアミノ酸配列をコードする遺伝子、配列番号１１、１２に示すアミノ酸配列をコードする遺伝子が挙げられる。（配列番号１０のアミノ酸配列は、エシェリヒア・コリ、パントエア・アナナティス、シゲラ・フレキシネリ、サルモネラ・ティフィムリウムのyhfKタンパク質の間で保存されている配列、配列番号１１のアミノ酸配列は、エシェリヒア・コリとサルモネラ・ティフィムリウムのyhfKタンパク質の間で保存されている配列、配列番号１２は、エシェリヒア・コリ、サルモネラ・エンテリカのyhfKタ
ンパク質の間で保存されている配列を示す。）yhfK遺伝子ホモログは、例えば、配列番号２または、４のアミノ酸配列全体と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上の相同性を有し、かつ、L-グルタミン酸排出活性を有するタンパク質をコードするものを意味する。
The yhfK gene homolog is a gene having high homology with the yhfK gene structure of Escherichia coli and Pantoea ananatis and having an L-glutamate excretion function.
Examples thereof include a gene encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10, and a gene encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 11 and 12. (The amino acid sequence of SEQ ID NO: 10 is a sequence conserved among the yhfK proteins of Escherichia coli, Pantoea ananatis, Shigella flexinelli, Salmonella typhimurium, and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11 is Escherichia coli. The sequence conserved among the yhfK proteins of Salmonella typhimurium, SEQ ID NO: 12 represents the sequence conserved between the yhfK proteins of Escherichia coli and Salmonella enterica.) The yhfK gene homologue is, for example, Having a homology of 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, particularly preferably 95% or more with the entire amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or 4, and L-glutamic acid excretion activity It means the one that encodes the protein possessed.
ｙｈｆＫ遺伝子は、コードされるタンパク質の活性、すなわち、Ｌ−グルタミン酸排出活性が損なわれない限り、配列番号２又は４のアミノ酸配列において、１若しくは数個の位置で１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入または付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするものであってもよい。ここで、数個とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によっても異なるが、好ましくは２〜２０個、より好ましくは２〜１０個特に好ましくは２〜５個である。
上記置換は機能的に変化しない中性変異である保存的置換が好ましい。保存的変異とは、置換部位が芳香族アミノ酸である場合には、phe, trp, tyr間で、置換部位が疎水性アミノ酸である場合には、leu, ile, val間で、極性アミノ酸である場合には、gln, asn間で、塩基性アミノ酸である場合には、lys, arg, his間で、酸性アミノ酸である場合には、asp, glu間で、ヒドロキシル基を持つアミノ酸である場合には、ser, thr間でお互いに置換する変異である。例えば、配列番号10、11、12のＸの領域を野生型のアミノ酸配列を元にして中性的変異を導入することにより、機能上同一のYhfKタンパクを取得することが出来る。
より具体的には、alaからser又はthrへの置換、argからgln、his又はlysへの置換、asnからglu、gln、lys、his又はaspへの置換、aspからasn、glu又はglnへの置換、cysからser又はalaへの置換、glnからasn、glu、lys、his、asp又はargへの置換、gluからgly、asn、gln、lys又はaspへの置換、glyからproへの置換、hisからasn、lys、gln、arg又はtyrへの置換、ileからleu、met、val又はpheへの置換、leuからile、met、val又はpheへの置換、lysからasn、glu、gln、his又はargへの置換、metからile、leu、val又はpheへの置換、pheからtrp、tyr、met、ile又はleuへの置換、serからthr又はalaへの置換、thrからser又はalaへの置換、trpからphe又はtyrへの置換、tyrからhis、phe又はtrpへの置換、及び、valからmet、ile又はleuへの置換が挙げられる。また、上記のようなアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、または逆位等には、yhfK遺伝子を保持する微生物の個体差、種の違いに基づく場合などの天然に生じる変異（mutant又はvariant）によって生じるものも含まれる。
さらに、yhfK遺伝子は、配列番号２又は４のアミノ酸配列全体に対して、７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上の相同性を有し、かつ、Ｌ−グルタミン酸排出活性を有するタンパク質をコードするものであってもよい。また、それぞれ導入する宿主により、遺伝子の縮重性が異なるので、それぞれyhfKが導入される宿主で使用しやすいコドンに置換したものでもよい。同様にyhfK遺伝子は、Ｌ−グルタミン酸の排出機能を有する限り、Ｎ末端側、C末端側が延長したものあるいは、削られているものでもよい。例えば延長する長さは、アミノ酸残基で50以下、好ましくは20以下、より好ましくは10以下、特に好ましくは5以下である。
The yhfK gene is substituted with one or several amino acids at one or several positions in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or 4, as long as the activity of the encoded protein, ie, L-glutamic acid excretion activity is not impaired. It may encode a protein having a deleted, inserted or added amino acid sequence. Here, the number of amino acids varies depending on the position and type of the protein in the three-dimensional structure of the amino acid residue, but preferably 2 to 20, more preferably 2 to 10, particularly preferably 2 to 5.
The substitution is preferably a conservative substitution which is a neutral mutation that does not change functionally. A conservative mutation is a polar amino acid between phe, trp, and tyr when the substitution site is an aromatic amino acid, and between leu, ile, and val when the substitution site is a hydrophobic amino acid. In the case of an amino acid having a hydroxyl group between gln and asn, in the case of a basic amino acid between lys, arg and his, in the case of an acidic amino acid between asp and glu Is a mutation that substitutes between ser and thr. For example, functionally identical YhfK proteins can be obtained by introducing neutral mutations in the X regions of SEQ ID NOs: 10, 11, and 12 based on the wild-type amino acid sequence.
More specifically, ala to ser or thr, arg to gln, his or lys, asn to glu, gln, lys, his or asp, asp to asn, glu or gln Substitution, substitution from cys to ser or ala, substitution from gln to asn, glu, lys, his, asp or arg, substitution from glu to gly, asn, gln, lys or asp, substitution from gly to pro, his to asn, lys, gln, arg or tyr, ile to leu, met, val or phe, leu to ile, met, val or phe, lys to asn, glu, gln, his Or arg, met to ile, leu, val or phe, phe to trp, tyr, met, ile or leu, ser to thr or ala, thr to ser or ala Substitution, trp to phe or tyr, tyr to his, phe or trp, and val to met, ile or leu. In addition, amino acid substitutions, deletions, insertions, additions, or inversions as described above include naturally occurring mutations (mutant or variant) such as those based on individual differences or species differences of microorganisms that retain the yhfK gene. ) Is also included.
Furthermore, the yhfK gene has a homology of 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, particularly preferably 95% or more with respect to the entire amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or 4. Or a protein encoding L-glutamic acid excretion activity. Further, since the degeneracy of the gene differs depending on the host to be introduced, it may be replaced with a codon that can be easily used in the host into which yhfK is introduced. Similarly, as long as the yhfK gene has a function of discharging L-glutamic acid, the Nh-terminal side and the C-terminal side may be extended or deleted. For example, the length of extension is 50 or less, preferably 20 or less, more preferably 10 or less, and particularly preferably 5 or less in amino acid residues.
このような遺伝子は、例えば、部位特異的変異法によって、コードされるタンパク質の特定の部位のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入または付加を含むように配列番号１、または３に示す塩基配列を改変することによって取得することができる。また、従来知られている変異処理によっても取得され得る。変異処理としては、配列番号１、または３に示す塩基配列を有する遺伝子をヒドロキシルアミン等でインビトロ処理する方法、および該遺伝子を保持する微生物、例えばエシェリヒア属細菌を、紫外線またはN-メチル-N’-ニトロ-N-ニトロソグアニジン(NTG)もしくはエチルメタンスルフォネート（EMS）等の通常変異処理に用いられている変異剤によって処理する方法が挙げられる。また、上記のようなアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、または逆位等には、yhfK 遺伝子を保持する微生物の個体差、種の違いに基づく場合などの天然に生じる変異（mutant又はvariant）によっ
て生じるものも含まれる。これらの遺伝子がＬ−グルタミン酸排出活性を有するタンパク質をコードしているか否かは、例えば、これらの遺伝子を適当な細胞で発現させ、培地中に排出されるＬ−グルタミン酸の量を増大させているかを調べることにより、確かめることができる。
Such a gene has, for example, the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 3 so that the amino acid residue at a specific site of the encoded protein includes substitution, deletion, insertion or addition by site-directed mutagenesis. Can be obtained by modifying. It can also be obtained by a conventionally known mutation process. Mutation treatment includes a method of treating a gene having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 3 in vitro with hydroxylamine or the like, and a microorganism carrying the gene, such as an Escherichia bacterium, with ultraviolet light or N-methyl-N ′. Examples thereof include a method of treating with a mutation agent usually used for mutation treatment such as -nitro-N-nitrosoguanidine (NTG) or ethyl methanesulfonate (EMS). In addition, amino acid substitutions, deletions, insertions, additions, or inversions as described above include naturally occurring mutations (mutant or variant) such as those based on individual differences or species differences of microorganisms that retain the yhfK gene. ) Is also included. Whether or not these genes code for proteins having L-glutamate excretion activity, for example, whether these genes are expressed in appropriate cells and the amount of L-glutamate excreted in the medium is increased. Can be verified by checking
ｙｈｆＫ遺伝子は、さらに、配列番号１の塩基番号1530番目から3620番目からなる塩基配列を有するDNA、配列番号３の塩基番号201番目から2288番目からなる塩基配列を有するDNA、またはこれらの塩基配列を有するDNAから調製され得るプローブと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＬ−グルタミン酸排出活性を有するタンパク質をコードするDNAであってもよい。 The yhfK gene further comprises DNA having a nucleotide sequence consisting of nucleotide numbers 1530 to 3620 of SEQ ID NO: 1, DNA having a nucleotide sequence consisting of nucleotide numbers 201 to 2288 of SEQ ID NO: 3, or these nucleotide sequences. It may be a DNA that hybridizes with a probe that can be prepared from the DNA it has under stringent conditions and encodes a protein having L-glutamic acid excretion activity.
ここでいう「ストリンジェントな条件」とはいわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、相同性が高いDNA同士、例えば７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましく９０％以上、特に好ましくは９５％以上の相同性を有するDNA同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いDNA同士がハイブリダイズしない条件、あるいは、通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６０℃、１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ、好ましくは、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳさらに好ましくは、６８℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度、温度で、１回より好ましくは２〜３回洗浄する条件が挙げられる。 The “stringent conditions” referred to herein are conditions under which so-called specific hybrids are formed and non-specific hybrids are not formed. Although it is difficult to quantify this condition clearly, for example, highly homologous DNAs, for example, 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, particularly preferably 95% or more. The conditions are such that DNAs having the same homology are hybridized and DNAs having lower homology are not hybridized with each other, or normal Southern hybridization washing conditions at 60 ° C., 1 × SSC, 0.1% SDS, preferably 0.1 × SSC, 0.1% SDS, more preferably 68 ° C., 0.1 × SSC, salt concentration and temperature corresponding to 0.1% SDS, more preferably 2 times. The condition of washing three times is mentioned.
プローブは、yhfK遺伝子の一部の配列を有するものであってもよい。そのようなプローブは、当業者によく知られた方法により、各遺伝子の塩基配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとし、各遺伝子を含むDNA断片を鋳型とするPCR反応により作製することができる。なお、プローブに300bp程度の長さのDNA断片を用いる場合には、上記の条件でハイブリダイズさせた後の洗いの条件としては、50℃、2×SSC, 0.1%SDSが挙げられる。 The probe may have a partial sequence of the yhfK gene. Such a probe can be prepared by a PCR reaction using an oligonucleotide prepared based on the base sequence of each gene as a primer and a DNA fragment containing each gene as a template by a method well known to those skilled in the art. . When a DNA fragment having a length of about 300 bp is used for the probe, the washing conditions after hybridization under the above conditions include 50 ° C., 2 × SSC, 0.1% SDS.
上述のようなyhfK遺伝子の発現を増強するための改変は、例えば、遺伝子組換え技術を利用して、細胞中のyhfK遺伝子のコピー数を高めることによって行うことができる。例えば、yhfK遺伝子を含むＤＮＡ断片を、宿主微生物で機能するベクター、好ましくはマルチコピー型のベクターと連結して組換えDNAを作製し、これを微生物に導入して形質転換すればよい。 The modification for enhancing the expression of the yhfK gene as described above can be performed, for example, by increasing the copy number of the yhfK gene in the cell using a gene recombination technique. For example, a DNA fragment containing the yhfK gene may be ligated with a vector that functions in a host microorganism, preferably a multi-copy vector, to produce a recombinant DNA, which is introduced into the microorganism and transformed.
yhfK遺伝子としてエシェリヒア・コリのyhfK遺伝子を用いる場合、配列番号３の塩基配列に基づいて作製したプライマー、例えば、配列番号７及び８に示すプライマーを用いて、エシェリヒア・コリの染色体DNAを鋳型とするPCR法（PCR：polymerase chain reaction； White,T.J. et al., Trends Genet. 5, 185 (1989)参照）によって、yhfK遺伝子を取得することができる。また、yhfK遺伝子としてパントエア・アナナティスのyhfK遺伝子を用いる場合、配列番号１の塩基配列に基づいて作製したプライマー、例えば、配列番号５及び６に示すプライマーを用いて、パントエア・アナナティスの染色体DNAを鋳型とするPCR法によって取得することが出来る。他の微生物のyhfK遺伝子も、その微生物において公知のyhfK遺伝子もしくは他種の微生物のyhfK遺伝子又はYhfKタンパク質の配列情報に基づいて作製した例えば配列番号5、6あるいは7、8のオリゴヌクレオチドをプライマーとするＰＣＲ法、又は、前記配列情報に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプローブとするハイブリダイゼーション法によって、微生物の染色体ＤＮＡ又は染色体ＤＮＡライブラリーから、取得することができる。なお、染色体ＤＮＡは、ＤＮＡ供与体である微生物から、例えば、斎藤、三浦の方法（H. Saito and K.Miura, Biochem.B iophys. Acta, 72, 619 (1963)、生物工学実験書、日本生物工学会編、９７〜９８頁、培風館、１９９２年参照）等により調製することができる。 When the yhfK gene of Escherichia coli is used as the yhfK gene, a primer prepared based on the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3, such as the primers shown in SEQ ID NOs: 7 and 8, is used, and the chromosome DNA of Escherichia coli is used as a template. The yhfK gene can be obtained by PCR (PCR: polymerase chain reaction; see White, TJ et al., Trends Genet. 5, 185 (1989)). In addition, when using the Pantoea ananatis yhfK gene as the yhfK gene, a template prepared based on the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, for example, the primers shown in SEQ ID NOs: 5 and 6, is used as a template for the chromosomal DNA of Pantoea ananatis Can be obtained by the PCR method. The yhfK gene of another microorganism is also prepared based on the known yhfK gene of the microorganism, the yhfK gene of another microorganism, or the sequence information of the YhfK protein.For example, the oligonucleotide of SEQ ID NO: 5, 6 or 7, 8 is used as a primer. From a chromosomal DNA or a chromosomal DNA library of a microorganism by a PCR method or a hybridization method using an oligonucleotide prepared based on the sequence information as a probe. Chromosomal DNA can be obtained from microorganisms that are DNA donors, for example, the method of Saito and Miura (H. Saito and K. Miura, Biochem. Biophys. Acta, 72, 619 (1963), Biotechnology Experiments, Japan. Biomedical Society edition, pages 97-98, Bafukan, 1992).
次に、PCR法により増幅されたyhfK遺伝子を、宿主微生物の細胞内において機能することのできるベクターDNAに接続して組換えDNAを調製する。宿主微生物の細胞内において機能することのできるベクターとしては、宿主微生物の細胞内において自律複製可能なベクターを挙げることができる。
エシェリヒア・コリ細胞内において自律複製可能なベクターとしては、pUC19、pUC18、pHSG299, pHSG399, pHSG398, pACYC184, pTrc99（pHSG、pACYCは宝バイオ社より入手可）, RSF1010, pBR322, pMW219（pMWはニッポンジーン社より入手可）等が挙げられる。
コリネ型細菌で自律複製できるプラスミドとして具体的には、以下のものが例示される。
pAM330 （特開昭58-67699号公報参照）
pHM1519 （特開昭58-77895号公報参照）
pSFK6 （特開2000-262288号公報参照）
pVK7 (米国特許出願公開明細書2003-0175912)
また、これらのベクターからコリネ型細菌中でプラスミドを自律複製可能にする能力を持つＤＮＡ断片を取り出し、前記エシェリヒア・コリ用のベクターに挿入すると、エシェリヒア・コリ及びコリネ型細菌の両方で自律複製可能ないわゆるシャトルベクターとして使用することができる。
Next, a recombinant DNA is prepared by connecting the yhfK gene amplified by the PCR method to a vector DNA that can function in the cells of the host microorganism. Examples of the vector capable of functioning in the host microorganism cell include a vector capable of autonomous replication in the host microorganism cell.
Vectors that can replicate autonomously in Escherichia coli cells include pUC19, pUC18, pHSG299, pHSG399, pHSG398, pACYC184, pTrc99 (pHSG and pACYC are available from Takara Bio Inc.), RSF1010, pBR322, pMW219 (pMW is Nippon Gene) More available).
Specific examples of plasmids that can autonomously replicate in coryneform bacteria include the following.
pAM330 (refer to Japanese Patent Laid-Open No. 58-67699)
pHM1519 (refer to Japanese Patent Laid-Open No. 58-77895)
pSFK6 (see JP 2000-262288 A)
pVK7 (U.S. Patent Application Publication 2003-0175912)
In addition, DNA fragments capable of autonomously replicating plasmids in coryneform bacteria can be extracted from these vectors and inserted into the aforementioned Escherichia coli vector, allowing autonomous replication in both Escherichia coli and coryneform bacteria. It can be used as a so-called shuttle vector.
メチロフィラス属微生物で自律複製出来るプラスミドとして具体的には、広宿主域ベクターであるRSF1010及びその誘導体、例えばpAYC32（Chistorerdov, A.Y., Tsygankov, Y.D. Plasmid, 1986, 16, 161-167）、あるいはpMFY42（gene, 44, 53(1990)）、pRP301、pTB70（Nature, 287, 396, (1980)）等が挙げられるyhfK遺伝子と上記プラスミドとを連結して組換えDNAを調製するには、yhfK遺伝子の末端に合うような制限酵素でベクターを切断する。連結はT4DNAリガーゼ等のリガーゼを用いて行うのが普通である。 Specifically, plasmids capable of autonomous replication in Methylophilus microorganisms include RSF1010, which is a broad host range vector, and derivatives thereof such as pAYC32 (Chistorerdov, AY, Tsygankov, YD Plasmid, 1986, 16, 161-167), or pMFY42 (gene , 44, 53 (1990)), pRP301, pTB70 (Nature, 287, 396, (1980)) and the like. Cleave the vector with a restriction enzyme that suits your needs. Ligation is usually performed using a ligase such as T4 DNA ligase.
上記のように調製した組換えDNAを微生物に導入するには、これまでに報告されている形質転換法に従って行えばよい。例えば、エシェリヒア・コリＫ−１２について報告されているような、受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してＤＮＡの透過性を増す方法（Mandel,M.and Higa,A.,J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)）があり、バチルス・ズブチリスについて報告されているような、増殖段階の細胞からコンピテントセルを調製してＤＮＡを導入する方法（ Duncan,C.H.,Wilson,G.A.and Young,F.E., Gene, 1, 153 (1977)）がある。あるいは、バチルス・ズブチリス、放線菌類及び酵母について知られているような、ＤＮＡ受容菌の細胞を、組換えＤＮＡを容易に取り込むプロトプラストまたはスフェロプラストの状態にして組換えＤＮＡをＤＮＡ受容菌に導入する方法（ Chang,S.and Choen,S.N.,Molec. Gen. Genet., 168, 111 (1979);Bibb,M.J.,Ward,J.M.and Hopwood,O.A.,Nature, 274, 398 (1978);Hinnen,A.,Hicks,J.B.and Fink,G.R.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 1929 (1978)）も応用できる。また、コリネ型細菌の形質転換は、電気パルス法（杉本ら、特開平2-207791号公報）によっても行うことができる。 In order to introduce the recombinant DNA prepared as described above into a microorganism, it may be carried out according to the transformation methods reported so far. For example, a method for increasing DNA permeability by treating recipient cells with calcium chloride as reported for Escherichia coli K-12 (Mandel, M. and Higa, A., J. Mol. Biol. , 53, 159 (1970)), and a method for preparing competent cells from proliferating cells and introducing DNA as reported for Bacillus subtilis (Duncan, CH, Wilson, GA and Young, FE, Gene, 1, 153 (1977)). Alternatively, DNA-receptive cells, such as those known for Bacillus subtilis, actinomycetes, and yeast, are introduced into the DNA-receptor cells in a protoplast or spheroplast state that readily incorporates recombinant DNA. (Chang, S. and Choen, SN, Molec. Gen. Genet., 168, 111 (1979); Bibb, MJ, Ward, JMand Hopwood, OA, Nature, 274, 398 (1978); Hinnen, A Hicks, JBand Fink, GR, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 1929 (1978)). Further, transformation of coryneform bacteria can also be performed by the electric pulse method (Sugimoto et al., Japanese Patent Laid-Open No. 2-207791).
一方、yhfK遺伝子のコピー数を高めることは、yhfK遺伝子を微生物の染色体DNA上に多コピー存在させることによっても達成できる。微生物の染色体DNA上にyhfK遺伝子を多コピーで導入するには、染色体DNA上に多コピー存在する配列を標的に利用して相同組換えにより行う。染色体DNA上に多コピー存在する配列としては、レペティティブDNA、転移因子の端部に存在するインバーテッド・リピートが利用できる。あるいは、特開平2-109985号公報に開示されているように、yhfK遺伝子をトランスポゾンに搭載してこれを転移させて染色体DNA上に多コピー導入することも可能である。染色体上にyhfK遺伝子が転移したことの確認は、yhfK遺伝子の一部をプローブとして、サザンハイブリダイゼーションを行うことによって確認出来る。 On the other hand, increasing the copy number of the yhfK gene can also be achieved by making multiple copies of the yhfK gene on the chromosomal DNA of the microorganism. In order to introduce the yhfK gene in multiple copies on the chromosomal DNA of a microorganism, homologous recombination is performed using a sequence present on the chromosomal DNA as a target. As a sequence present in multiple copies on chromosomal DNA, repetitive DNA and inverted repeats present at the end of a transposable element can be used. Alternatively, as disclosed in Japanese Patent Application Laid-Open No. 2-109985, it is also possible to mount the yhfK gene on a transposon, transfer it, and introduce multiple copies onto the chromosomal DNA. Confirmation that the yhfK gene has been transferred onto the chromosome can be confirmed by Southern hybridization using a part of the yhfK gene as a probe.
さらに、yhfK遺伝子の発現の増強は、上記した遺伝子コピー数の増幅以外に、国際公開00/18935号パンフレットに記載されたようにして、染色体DNA上またはプラスミド上のyhfK遺伝子のプロモーター等の発現調節配列を強力なものに置換することや、yhfKの発現を上昇させるようなレギュレーターを増幅、yhfKの発現を低下させるようなレギュレーターを欠失または弱化させることによっても達成される。例えば、lacプロモーター、trpプロモーター、trcプロモーター、pLプロモーター等が強力なプロモーターとして知られている。また、yhfK遺伝子のプロモーター領域に塩基置換等を導入し、より強力なものに改変することも可能である。プロモーターの強度の評価法および強力なプロモーターの例は、Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎらの論文（Prokaryotic promoters in biotechnology. Biotechnol. Annu. Rev., 1995, 1, 105-128）等に記載されている。さらに、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）と開始コドンとの間のスペーサ、特に開始コドンのすぐ上流の配列における数個のヌクレオチドの置換がｍＲＮＡの翻訳効率に非常に影響を及ぼすことが知られており、これらを改変することも可能である。
また、発現量の上昇は、m-RNAの生存時間を延長させることや、酵素タンパク質の細胞内での分解を防ぐことによっても達成可能である。
yhfKのプロモーター等の発現調節領域は、プロモーター検索ベクターやGENETYX等の遺伝子解析ソフトを用いて決定することも出来る。これらのプロモーター置換または改変によりyhfK遺伝子の発現が強化される。発現調節配列の置換は、例えば温度感受性プラスミドを用いて行うことができる。コリネ型酸菌の温度感受性プラスミドとしては、p48K及びpSFKT2（以上、特開2000-262288号公報）、pHSC4（フランス特許公開1992年2667875号公報、特開平5-7491号公報）等が挙げられる。これらのプラスミドは、コリネ型細菌中で少なくとも25℃では自律複製することができるが、37℃では自律複製できない。なお、発現調節配列の改変は、yhfK遺伝子のコピー数を高めることと組み合わせてもよい。
Furthermore, in addition to the amplification of the gene copy number described above, the enhancement of the expression of the yhfK gene can be performed by regulating the expression of the yhfK gene promoter on the chromosomal DNA or on the plasmid as described in International Publication No. 00/18935 pamphlet. It can also be achieved by replacing the sequence with a strong one, amplifying a regulator that increases the expression of yhfK, and deleting or weakening a regulator that decreases the expression of yhfK. For example, lac promoter, trp promoter, trc promoter, pL promoter and the like are known as strong promoters. It is also possible to introduce a base substitution into the promoter region of the yhfK gene and modify it to a stronger one. Methods for evaluating promoter strength and examples of strong promoters are described in Goldstein et al. (Prokaryotic promoters in biotechnology. Biotechnol. Annu. Rev., 1995, 1, 105-128). Furthermore, it is known that substitution of several nucleotides in the spacer between the ribosome binding site (RBS) and the start codon, especially in the sequence immediately upstream of the start codon, has a great influence on the translation efficiency of mRNA, These can be modified.
An increase in the expression level can also be achieved by prolonging the survival time of m-RNA or preventing degradation of the enzyme protein in the cell.
Expression regulatory regions such as the yhfK promoter can also be determined using a promoter search vector or gene analysis software such as GENETYX. These promoter substitutions or modifications enhance the expression of the yhfK gene. The substitution of the expression regulatory sequence can be performed using, for example, a temperature sensitive plasmid. Examples of temperature-sensitive plasmids of coryneform acid bacteria include p48K and pSFKT2 (above, JP 2000-262288 A), pHSC4 (French Patent Publication No. 2667875, JP 5-7491 A) and the like. These plasmids can replicate autonomously in coryneform bacteria at least at 25 ° C, but cannot replicate at 37 ° C. The modification of the expression regulatory sequence may be combined with increasing the copy number of the yhfK gene.
yhfK遺伝子によってコードされるタンパク質の活性を増強するために、Ｌ−グルタミン酸排出系活性が上昇するような変異をyhfK遺伝子に導入してもよい。yhfK遺伝子によってコードされるタンパク質（YhfKタンパク質）の活性が上昇するような変異としては、yhfK遺伝子の転写量が増大するようなプロモーター配列の変異、及び、YhfKタンパク質の比活性が高くなるようなyhfK遺伝子のコード領域内の変異が挙げられる。 In order to enhance the activity of the protein encoded by the yhfK gene, a mutation that increases the L-glutamate efflux activity may be introduced into the yhfK gene. Mutations that increase the activity of the protein encoded by the yhfK gene (YhfK protein) include a promoter sequence mutation that increases the transcription amount of the yhfK gene and a yhfK that increases the specific activity of the YhfK protein. Examples include mutations in the coding region of the gene.
ｙｈｆ遺伝子の発現量の増強は、上述したような方法により、形質転換や相同組み換えによってｙｈｆ遺伝子のコピー数を高めたり、ｙｈｆ遺伝子の発現調節配列を改変したりすることすることや、yhfKの発現を上昇させるようなレギュレーターを増幅、yhfKの発現を低下させるようなレギュレーターを欠失または弱化させることによっても達成出来る。 The enhancement of the expression level of the yhf gene can be achieved by increasing the copy number of the yhf gene or modifying the expression regulatory sequence of the yhf gene by transformation or homologous recombination, as described above. It can also be achieved by amplifying a regulator that raises the expression and deleting or weakening a regulator that lowers the expression of yhfK.
本発明の微生物は、ｙｈｆＫ遺伝子の発現が増強することにより、Ｌ−グルタミン酸の排出活性が向上していることが好ましい。「Ｌ−グルタミン酸の排出活性が向上した」ことは、本発明の微生物を培養したときに培地中に排出されるＬ−グルタミン酸の量を、ｙｈｆＫ遺伝子が導入されていない対照のＬ−グルタミン酸生産微生物と比較することによって確認することができる。すなわち、「Ｌ−グルタミン酸の排出活性の向上」は、対照の微生物に比べて、本発明の微生物を培養したときに培地中に蓄積するＬ−グルタミン酸濃度が高くなることによって観察される。また、「Ｌ−グルタミン酸の排出活性の向上」は、本発明の微生物の細胞内においてＬ−グルタミン酸濃度が低下することによっても観察され得る。「Ｌ−グルタミン酸の排出活性」は、野生株またはｙｈｆＫ遺伝子非導入株に比べて、ｙｈｆK遺伝子導入株の細胞内のＬ−グルタミン酸の濃度が、10％以上、好ましくは20％以上、特に好ましくは、30％以上減少していることが好ましい。微生物の絶対的な「Ｌ−グルタミン酸の排出活性」は、微生物の細胞内のＬ−グルタミン酸の濃度と細胞外のＬ−グルタミン酸の濃度の差を測定することによって検出できる。さらに、「Ｌ−グルタミン酸の排出活性」は、反転膜を利用して、ラジオアイソトープにて細胞内のアミノ酸の取り込み活性を測定することによっても検出出来る（J.Biol.Chem 2002 Vol277.No
.51 p49841-49849）。例えば、yhfK遺伝子を発現させた菌体より反転膜小胞を作成し、ATPあるいはその他駆動力となる基質を添加し、RIラベルしたグルタミン酸の取り込み活性を測定することによって測定可能である。また生菌を使用して、ラベル化グルタミン酸と非ラベル化グルタミン酸の交換反応の速度を検出することによっても測定できる。
The microorganism of the present invention preferably has enhanced L-glutamic acid excretion activity by enhancing expression of the yhfK gene. “Improved L-glutamic acid excretion activity” means that the amount of L-glutamic acid excreted in the medium when the microorganism of the present invention is cultured is determined as a control L-glutamic acid-producing microorganism into which the yhfK gene has not been introduced. Can be confirmed by comparing with. That is, “improvement of L-glutamic acid excretion activity” is observed when the concentration of L-glutamic acid accumulated in the medium increases when the microorganism of the present invention is cultured as compared to the control microorganism. “Improved L-glutamic acid excretion activity” can also be observed by a decrease in the L-glutamic acid concentration in the cells of the microorganism of the present invention. The “L-glutamic acid excretion activity” indicates that the concentration of L-glutamic acid in the cell of the yhfK gene-introduced strain is 10% or more, preferably 20% or more, particularly preferably, as compared to the wild type or the yhfK gene-introduced strain. , It is preferably reduced by 30% or more. The absolute “L-glutamic acid excretion activity” of the microorganism can be detected by measuring the difference between the intracellular L-glutamic acid concentration and the extracellular L-glutamic acid concentration. Furthermore, “L-glutamic acid excretion activity” can also be detected by measuring intracellular amino acid uptake activity with a radioisotope using an inversion membrane (J. Biol. Chem 2002 Vol277.No.
.51 p49841-49849). For example, it can be measured by preparing an inverted membrane vesicle from a bacterial cell expressing the yhfK gene, adding ATP or another substrate for driving force, and measuring the RI-labeled glutamate uptake activity. It can also be measured by detecting the rate of the exchange reaction between labeled glutamic acid and unlabeled glutamic acid using live bacteria.
本発明の微生物は、酸性条件下で培養したときに液体培地中にＬ−グルタミン酸の飽和濃度を越える量のＬ−グルタミン酸を蓄積する能力（以下、酸性条件下でのＬ−グルタミン酸蓄積能ということがある）を有する微生物であってもよい。このような微生物は、yhfK遺伝子の発現が増強することによって、酸性条件下でのＬ−グルタミン酸蓄積能を有するようになったものであってもよいし、本来的に酸性条件下でのＬ−グルタミン酸蓄積能を有するものであってもよい。 The microorganism of the present invention can accumulate L-glutamic acid in an amount exceeding the saturation concentration of L-glutamic acid in a liquid medium when cultured under acidic conditions (hereinafter referred to as L-glutamic acid accumulating ability under acidic conditions). There may be a microorganism having Such a microorganism may have an ability to accumulate L-glutamic acid under acidic conditions by enhancing the expression of the yhfK gene, or L- It may have glutamic acid accumulation ability.
本来的に酸性条件下でのＬ−グルタミン酸蓄積能を有する微生物として具体的には、パントエア・アナナティスＡＪ１３３５５株（ＦＥＲＭ ＢＰ−６６１４）、AJ13356株（ＦＥＲＭ ＢＰ−６６１５）、及びAJ13601株（FERM BP-7207）（以上、特開２００１−３３３７６９号公報参照）などが挙げられる。パントエア・アナナティスＡＪ１３３５５は、平成１０年２月１９日に、通産省工業技術院生命工学工業技術研究所（現名称、産業技術総合研究所生命工学工業技術研究所）に、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１６６４４として寄託され、平成１１年１月１１日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−６６１４が付与されている。尚、同株は、分離された当時はエンテロバクター・アグロメランス（Enterobacter agglomerans）と同定され、エンテロバクター・アグロメランスＡＪ１３３５５として寄託されたが、近年１６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列解析などにより、パントエア・アナナティス（Pantoea ananatis）に再分類されている（後記実施例参照）。また、後述するＡＪ１３３５５から誘導された菌株ＡＪ１３３５６、及びＡＪ１３６０１も、同様にエンテロバクター・アグロメランスとして前記寄託機関に寄託されているが、本明細書ではパントエア・アナナティスと記述する。AJ13601は、１９９９年8月１８日に独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（郵便番号３０５−８５６６ 茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に受託番号FERMP17156として寄託され、２０００年７月６日にブタペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-7207が付与されている。 Specifically, microorganisms having an ability to accumulate L-glutamic acid under acidic conditions are specifically Pantoea ananatis AJ13355 strain (FERM BP-6614), AJ13356 strain (FERM BP-6615), and AJ13601 strain (FERM BP- 7207) (see JP 2001-333769 A). On February 19, 1998, Pantoea Ananatis AJ13355 was transferred to the Biotechnology Institute of Industrial Technology, Ministry of International Trade and Industry (currently the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology) as the accession number FERM P-16644. Deposited and transferred to an international deposit based on the Budapest Treaty on January 11, 1999, and assigned the deposit number FERM BP-6614. The strain was identified as Enterobacter agglomerans at the time of its isolation and deposited as Enterobacter agglomerans AJ13355. Recently, the strain was analyzed by pantoea ananatis (Pantoea ananatis) by 16S rRNA sequence analysis and the like. ) (See Examples below). In addition, strains AJ13356 and AJ13601 derived from AJ13355, which will be described later, are similarly deposited with the depository organization as Enterobacter agglomerans, but are described as Pantoea ananatis in this specification. AJ13601 was deposited on August 18, 1999 at National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Biological Depositary Center (Postal Code 305-8666, 1st, 1st East, 1st Street, Tsukuba City, Ibaraki Prefecture) as deposit number FERMP17156. It was transferred to an international deposit based on the Budapest Treaty on July 6, 2000, and the deposit number FERM BP-7207 was assigned.
＜２＞本発明のＬ−グルタミン酸の製造方法
本発明の微生物を培地に培養し、培地中にＬ−グルタミン酸を生成蓄積せしめ、Ｌ−グルタミン酸を該培地から採取することにより、Ｌ−グルタミン酸を製造することが出来る。
<2> Method for producing L-glutamic acid of the present invention L-glutamic acid is produced by culturing the microorganism of the present invention in a medium, producing and accumulating L-glutamic acid in the medium, and collecting L-glutamic acid from the medium. I can do it.
培養に用いる培地は、炭素源、窒素源、無機塩類、その他必要に応じてアミノ酸、ビタミン等の有機微量栄養素を含有する通常の培地を用いることができる。合成培地または天然培地のいずれも使用可能である。培地に使用される炭素源および窒素源は培養する菌株が利用可能であるものならばいずれの種類を用いてもよい。 As a medium used for the culture, a normal medium containing a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts, and other organic micronutrients such as amino acids and vitamins as necessary can be used. Either synthetic or natural media can be used. Any type of carbon source and nitrogen source may be used as long as the strain to be cultured is available.
炭素源としては、グルコース、グリセロール、フラクトース、スクロース、マルトース、マンノース、ガラクトース、澱粉加水分解物、糖蜜等の糖類が使用でき、その他、酢酸、クエン酸等の有機酸、エタノール等のアルコール類も単独あるいは他の炭素源と併用して用いることができる。窒素源としては、アンモニア、硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、塩化アンモニウム、りん酸アンモニウム、酢酸アンモニウム等のアンモニウム塩または硝酸塩等が使用することができる。有機微量栄養素としては、アミノ酸、ビタミン、脂肪酸、核酸、更にこれらのものを含有するペプトン、カザミノ酸、酵母エキス、大豆たん白分解物等が使用でき、生育にアミノ酸などを要求する栄養要求性変異株を使用する場合には要求される栄養素を補添することが好ましい。無機塩類としてはりん酸塩、マグネ
シウム塩、カルシウム塩、鉄塩、マンガン塩等が使用できる。
As the carbon source, saccharides such as glucose, glycerol, fructose, sucrose, maltose, mannose, galactose, starch hydrolysate and molasses can be used. In addition, organic acids such as acetic acid and citric acid, and alcohols such as ethanol alone Or it can use together with another carbon source. As the nitrogen source, ammonia, ammonium salts such as ammonium sulfate, ammonium carbonate, ammonium chloride, ammonium phosphate, and ammonium acetate, nitrates, and the like can be used. Organic micronutrients include amino acids, vitamins, fatty acids, nucleic acids, and peptone, casamino acids, yeast extracts, soybean protein breakdown products, etc. containing these, and auxotrophic mutations that require amino acids for growth. When using a strain, it is preferable to supplement the required nutrients. As inorganic salts, phosphates, magnesium salts, calcium salts, iron salts, manganese salts and the like can be used.
培養は、好ましくは、発酵温度２０〜４５℃、ｐＨを３〜９に制御し、通気培養を行う。培養中にｐＨが下がる場合には、例えば、炭酸カルシウムを加えるか、アンモニアガス等のアルカリで中和する。このような条件下で、好ましくは１０時間〜１２０時間程度培養することにより、培養液中に著量のＬ−グルタミン酸が蓄積される。 The culture is preferably carried out with aeration while controlling the fermentation temperature at 20 to 45 ° C. and the pH at 3 to 9. When the pH is lowered during the culture, for example, calcium carbonate is added or neutralized with an alkali such as ammonia gas. By culturing preferably for about 10 to 120 hours under such conditions, a significant amount of L-glutamic acid is accumulated in the culture solution.
また、Ｌ−グルタミン酸が析出するような条件に調整された液体培地を用いて、培地中にＬ−グルタミン酸を析出させながら培養を行うことも出来る。Ｌ−グルタミン酸が析出する条件としては、例えば、ｐＨ５．０〜４．０、好ましくはｐＨ４．５〜４．０、さらに好ましくはｐＨ４．３〜４．０、特に好ましくはｐＨ４．０を挙げることができる。 Moreover, it can also culture | cultivate, making L-glutamic acid precipitate in a culture medium using the liquid culture medium adjusted to the conditions which L-glutamic acid precipitates. Examples of conditions for precipitation of L-glutamic acid include pH 5.0 to 4.0, preferably pH 4.5 to 4.0, more preferably pH 4.3 to 4.0, and particularly preferably pH 4.0. Can do.
培養終了後の培養液からＬ−グルタミン酸を採取する方法は、公知の回収方法に従って行えばよい。例えば、培養液から菌体を除去した後に濃縮晶析する方法あるいはイオン交換クロマトグラフィー等によって採取される。Ｌ−グルタミン酸が析出するような条件下で培養した場合、培養液中に析出したＬ−グルタミン酸は、遠心分離又は濾過等により採取することができる。この場合、培地中に溶解しているＬ−グルタミン酸を晶析した後に、併せて単離してもよい。 The method for collecting L-glutamic acid from the culture solution after completion of the culture may be performed according to a known recovery method. For example, it is collected by removing microbial cells from the culture solution and then concentrating crystallization or ion exchange chromatography. When culturing under conditions where L-glutamic acid is precipitated, L-glutamic acid precipitated in the culture solution can be collected by centrifugation or filtration. In this case, L-glutamic acid dissolved in the medium may be crystallized and then isolated together.
［実施例］
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
[Example]
Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples.
＜Ｌ−グルタミン酸排出遺伝子の探索＞
Ｌ−グルタミン酸排出遺伝子の探索は以下のようにして行った。Ｌ−グルタミン酸は、グルタミン酸デヒドロゲナーゼによってトリカルボン酸サイクルの中間体である２−オキソグルタル酸に、1段階で変換されるため、グルタミン酸デヒドロゲナーゼやトリカルボン酸サイクルを持つ多くの微生物では、酸性条件で細胞内に流入するＬ−グルタミン酸は容易に代謝されることが予想される。しかし、2-オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼを欠損させた株は、酸性条件でＬ−グルタミン酸に対して感受性を示す。ここでは、2-オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ欠損株としてパントエア・アナナティスSC17sucA株を用い、酸性条件下でのＬ−グルタミン酸耐性を指標にＬ−グルタミン酸排出系遺伝子の取得を試みた。
<Search for L-glutamic acid excretion gene>
The search for L-glutamate excretion genes was performed as follows. L-glutamate is converted to 2-oxoglutarate, which is an intermediate of the tricarboxylic acid cycle, by glutamate dehydrogenase in a single step. Therefore, in many microorganisms having glutamate dehydrogenase and tricarboxylic acid cycle, it flows into cells under acidic conditions. L-glutamic acid is expected to be easily metabolized. However, strains deficient in 2-oxoglutarate dehydrogenase are sensitive to L-glutamic acid under acidic conditions. Here, Pantoea ananatis SC17sucA strain was used as a 2-oxoglutarate dehydrogenase-deficient strain, and an attempt was made to acquire an L-glutamate excretion gene using L-glutamate resistance under acidic conditions as an index.
野生株であるパントエア・アナナティスＡＪ１３３５５株より染色体DNAを常法にて抽出し、制限酵素Sau3AIで部分分解後、約10kbの断片を回収し、pSTV28（タカラバイオ社）のBamHIサイトに導入した、プラスミドライブラリーを作成した。このプラスミドライブラリーをSC17sucA株に常法により、エレクトロポレーションにより導入した。なお、SC17sucA株は、SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB株（特開2001-333769号公報参照）のプラスミドを導入する前の菌株であり、プライベートナンバーAJ４１７が付与され、平成１６年２月２６日に独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（郵便番号３０５−８５６６ 茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に受託番号FERM BP-08646 として寄託されている。 Chromosomal DNA was extracted from the wild strain Pantoea ananatis AJ13355 by a conventional method, and after partial degradation with the restriction enzyme Sau3AI, a fragment of about 10 kb was recovered and introduced into the BamHI site of pSTV28 (Takara Bio Inc.). Created a library. This plasmid library was introduced into the SC17sucA strain by electroporation by a conventional method. The SC17sucA strain is a strain before introducing the plasmid of the SC17sucA / RSFCPG + pSTVCB strain (see JP-A-2001-333769), and is assigned a private number AJ417. It is deposited under the accession number FERM BP-08646 at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology patent biological deposit center (postal code 305-8586, 1st, 1st, 1st, 1st, 1st, Tsukuba, Ibaraki Prefecture).
プラスミドライブラリーを導入したSC17sucA株を、クロラムフェニコール耐性を指標にL培地（バクトトリプトン10 g、イーストエキストラクト 5 g、NaCl 5 g、寒天15 gを純水1Lに含む培地、pH7.0）に、最少培地成分（ グルコース0.5g、硫酸マグネシウム2mM、リン酸一カリウム3g、塩化ナトリウム0.5g 塩化アンモニウム1g リン酸2ナトリウム6g を純水1Lに含む培地）を加えたプレートにて選択し、4.33×105個のコロニーを形質転換体として取得した。この4.33×105個の形質転換体をSC17sucAがコロニーを形成できない、
高濃度のＬ−グルタミン酸を含むpH4.5の最少培地（最少培地にＬ−グルタミン酸を30g/L, Ｌ−リジン塩酸塩,、DL-メチオニン,ジアミノピメリン酸各100mg/Lを混合したpH4.5に調整した培地 糖源としてグルコースとシュークロースを用いた）に塗布した。
The SC17sucA strain into which the plasmid library was introduced was prepared using L medium (bactotryptone 10 g, yeast extract 5 g, NaCl 5 g, agar 15 g in pure water 1 L, pH 7. 0) to the plate with the minimum medium components (medium containing 0.5 g glucose, 2 mM magnesium sulfate, 3 g monopotassium phosphate, 0.5 g sodium chloride, 1 g ammonium chloride and 6 g disodium phosphate in 1 liter of pure water). 4.33 × 10 5 colonies were obtained as transformants. SC17sucA cannot form colonies from these 4.33 × 10 5 transformants,
PH 4.5 minimal medium containing high concentration of L-glutamic acid (Minimum medium mixed with 30 g / L L-glutamic acid, L-lysine hydrochloride, DL-methionine, 100 mg / L each of diaminopimelic acid) The prepared medium was applied to glucose and sucrose as sugar sources.
34℃で3日間培養し、出現したコロニーに導入されているベクターに挿入された遺伝子について解析した。それぞれのライブラリーからプラスミドを抽出して、制限酵素で処理してプラスミドの大きさを確認したところ、炭素源がスクロースである最少培地より取得したクローン１６株中、１５株が同じ制限酵素パターンを示した。炭素源がグルコースである最少培地より取得した１１株のクローン内にも同様の制限酵素パターンを示すプラスミドが導入されており、これをプラスミドLib10と名づけた。 After culturing at 34 ° C. for 3 days, the gene inserted into the vector introduced into the appearing colony was analyzed. Plasmids were extracted from each library and treated with a restriction enzyme to confirm the size of the plasmid. Of the 16 clones obtained from the minimal medium whose carbon source was sucrose, 15 strains had the same restriction enzyme pattern. Indicated. A plasmid showing a similar restriction enzyme pattern was also introduced into 11 clones obtained from a minimal medium in which the carbon source was glucose, and this was named plasmid Lib10.
次に、SC17sucAと、プラスミドLib10が導入された菌株、SC17sucALib10を最少培地（グルコース0.5g又はシュークロース0.5g 、硫酸マグネシウム2mM、リン酸一カリウム3g、塩化ナトリウム0.5g 塩化アンモニウム1g リン酸2ナトリウム6g を純水1Lに含む培地）をpH4.5 に調整し、Ｌ−グルタミン酸を30g/L, リジン,メチオニン,ジアミノピメリン酸各100mg/Lを含有した液体培地で培養し、酸性条件下の高濃度Ｌ−グルタミン酸存在下での最少培地における生育を調べた。 Next, SC17sucA and the strain into which plasmid Lib10 was introduced, SC17sucALib10, were added to a minimal medium (glucose 0.5 g or sucrose 0.5 g, magnesium sulfate 2 mM, monopotassium phosphate 3 g, sodium chloride 0.5 g ammonium chloride 1 g disodium phosphate 6 g Medium containing 1 mg of pure water) is adjusted to pH 4.5, cultured in a liquid medium containing 30 g / L of L-glutamic acid, 100 mg / L of lysine, methionine, and diaminopimelic acid, and high concentration L under acidic conditions. -Growth in minimal medium in the presence of glutamic acid was examined.
結果を図１に示す。SC17sucAと比べ、プラスミドLib10が導入されたSC17sucALib10は、酸性条件下での高濃度Ｌ−グルタミン酸存在下での生育が大幅に向上することが分かった。従ってLib10内に、酸性下でＬ−グルタミン酸で耐性を示す形質が含まれていると考えられたので、Lib10の塩基配列を決定し、Lib10にコードされているタンパク質の機能について推定することとした。 The results are shown in FIG. Compared with SC17sucA, SC17sucALib10 into which plasmid Lib10 was introduced was found to greatly improve growth in the presence of high-concentration L-glutamic acid under acidic conditions. Therefore, Lib10 was considered to contain a trait that was resistant to L-glutamic acid under acidic conditions. Therefore, the base sequence of Lib10 was determined and the function of the protein encoded by Lib10 was estimated. .
塩基配列の決定は常法によって行い、GenBankに登録されている遺伝子との相同性を比較した。この領域には、yhfK（AE000411.1:9304..11394）と相同性を有する遺伝子が含まれていた。yhfKに関しては機能未知であることが分かった。 The nucleotide sequence was determined by a conventional method, and the homology with a gene registered in GenBank was compared. This region contained a gene having homology with yhfK (AE000411.1: 9304..11394). It was found that yhfK has unknown functions.
＜yhfK遺伝子増幅の効果の確認＞
yhfKに関しては、タンパク質のモチーフ検索の結果、トランスポーターをコードしている可能性が示唆されていたため（J.Mol.Microbiol.Biotechnol.(2000) 2 (2):195-198）、上記遺伝子のうち、yhfKに関して単独増幅効果を検証することとした。
<Confirmation of the effect of yhfK gene amplification>
Regarding yhfK, the search for protein motifs suggested that it might encode a transporter (J. Mol. Microbiol. Biotechnol. (2000) 2 (2): 195-198). Among them, it was decided to verify the single amplification effect for yhfK.
配列番号５と配列番号６に示されるオリゴヌクレオチドyhfK-F1,yhfK-R2 を用いて、パントエア・アナナティス野生株No.359（ＡＪ１３３５５）株の染色体を鋳型として、PCRによりyhfK遺伝子断片を増幅した。Promega 社製TAクローニングベクターpGEM-Teasyに連結して、pGEM-yhfKを作成した。PGEM-yhfKをEcoRIで切断し、pSTV28(宝酒造株式会社製)をEcoRIで処理したものと連結しyhfK遺伝子増幅用ベクターpSTV-yhfKを構築した。プラスミドの構築図を図２に示す。 Using the oligonucleotides yhfK-F1 and yhfK-R2 shown in SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6, the yhfK gene fragment was amplified by PCR using the chromosome of Pantoea ananatis wild strain No. 359 (AJ13355) as a template. PGEM-yhfK was prepared by ligating to Promega TA cloning vector pGEM-Teasy. PGEM-yhfK was cleaved with EcoRI and ligated with pSTV28 (Takara Shuzo Co., Ltd.) treated with EcoRI to construct a vector pSTV-yhfK for gene amplification of yhfK. A construction diagram of the plasmid is shown in FIG.
yhfK遺伝子増幅用ベクターpSTV-yhfKと、対照用プラスミドpSTV28、エレクトロポレーションによりSC17sucA株に導入し、クロラムフェニコール耐性を示す形質転換体を得た。プラスミドを抽出して確認し、yhfK増幅株をSC17sucA/pSTV-yhfK、対照用のpSTV導入株をSC17sucA/pSTV28と名付けた。 The yhfK gene amplification vector pSTV-yhfK, the control plasmid pSTV28, and electroporation were introduced into the SC17sucA strain to obtain a transformant exhibiting chloramphenicol resistance. The plasmid was extracted and confirmed, and the yhfK amplified strain was named SC17sucA / pSTV-yhfK, and the control pSTV-introduced strain was named SC17sucA / pSTV28.
SC17sucA/pSTV-yhfKを最少培地（グルコース0.5g又はシュークロース0.5g 、硫酸マグネシウム2mM、リン酸一カリウム3g、塩化ナトリウム0.5g 塩化アンモニウム1g リン酸2ナトリウム6g を純水1Lに含む培地）に、Ｌ−グルタミン酸を30g/L, Ｌ−リジン塩酸塩,DL-メチオニン,ジアミノピメリン酸各100mg/Lを含有し、アンモニア水にてpH4.5に調整した
培地に塗布した。SC17sucAがコロニーを形成出来ないのに対し、SC17sucA/pSTV-yhfKは最少培地上でコロニーを形成することを確認した。
SC17sucA / pSTV-yhfK in minimal medium (medium containing 0.5 g glucose or 0.5 g sucrose, 2 mM magnesium sulfate, 3 g monopotassium phosphate, 0.5 g sodium chloride, 1 g ammonium chloride, 6 g disodium phosphate in 1 L pure water) L-glutamic acid was applied to a medium containing 30 g / L, L-lysine hydrochloride, DL-methionine, and
次に、最少培地（グルコース0.5g又はシュークロース0.5g 、硫酸マグネシウム2mM、リン酸一カリウム3g、塩化ナトリウム0.5g 塩化アンモニウム1g リン酸2ナトリウム6g を純水1Lに含む培地）に、Ｌ−グルタミン酸を30g/L, リジン,メチオニン,ジアミノピメリン酸各100mg/Lを含有し、アンモニア水にてpH4.5に調整した液体培地で培養し、酸性条件下での最少培地における生育を調べた。結果を図3に示す。
Next, in a minimal medium (glucose 0.5 g or sucrose 0.5 g, magnesium sulfate 2 mM, monopotassium phosphate 3 g, sodium chloride 0.5 g ammonium chloride 1 g disodium phosphate 6 g in 1 L of pure water), L-glutamic acid Was cultured in a liquid medium containing 30 g / L, lysine, methionine and
対照のSC17sucA/pSTV28と比べ、SC17sucA/pSTV-yhfKは、Lib10導入と同様に生育が回復することから、yhfK遺伝子がSC17sucA株に酸性下でのＬ−グルタミン酸耐性の形質を付与することが明らかになった。 Compared with the control SC17sucA / pSTV28, SC17sucA / pSTV-yhfK recovers its growth in the same manner as Lib10 introduction, so it is clear that the yhfK gene confers L-glutamic acid resistant traits to the SC17sucA strain under acidic conditions. became.
＜yhfK遺伝子増幅の中性pH下でのＬ−グルタミン酸生産の効果＞
次にこの遺伝子が、Ｌ−グルタミン酸生産に与える影響を検討するため、yhfK増幅用プラスミドpSTV-yhfKを配列番号９に示すＬ−グルタミン酸生産用プラスミドRSFCPG を有するＬ−グルタミン酸生産菌SC17sucA/RSFCPG（特開平2001-333769号公報参照）に導入して、Ｌ−グルタミン酸生産における影響を調べた。
<Effect of L-glutamic acid production under neutral pH of yhfK gene amplification>
Next, in order to examine the influence of this gene on L-glutamic acid production, the plasmid pSTV-yhfK for yhfK amplification was used as an L-glutamic acid-producing bacterium SC17sucA / RSFCPG (specialized) having the L-glutamic acid production plasmid RSFCPG shown in SEQ ID NO: 9. Introduced in Kaihei 2001-333769), the influence on L-glutamic acid production was examined.
SC17sucA/RSFCPGに、調整したpSTV-yhfK、比較対照用のプラスミドpSTV29(宝酒造株式会社製)をエレクトロポレーションによりそれぞれ導入し、クロラムフェニコール耐性を指標にして、形質転換体を取得した。プラスミドを確認後、yhfK増幅用プラスミド導入株をSC17sucA/ RSFCPG+pSTV-yhfKと、pSTV29導入株をSC17sucA/ RSFCPG+pSTV29と名付けた。 The prepared pSTV-yhfK and comparative plasmid pSTV29 (Takara Shuzo Co., Ltd.) were introduced into SC17sucA / RSFCPG by electroporation, and transformants were obtained using chloramphenicol resistance as an index. After confirming the plasmid, the plasmid-introduced strain for yhfK amplification was named SC17sucA / RSFCPG + pSTV-yhfK, and the pSTV29-introduced strain was named SC17sucA / RSFCPG + pSTV29.
次にSC17sucA/ RSFCPG+pSTV-yhfKと、対象のSC17sucA/ RSFCPG+pSTV29を用いて培養を行い、Ｌ−グルタミン酸の生産能について検討した。
培地は以下の組成で行った。
〔培養培地組成〕
シュークロース 50g/L
MgSO4・7H20 0.4g/L
KH2PO4 2.0g/L
酵母エキス 4.0g/L
FeSO4・7H20 0.01g/L
MnSO4・5H20 0.01g/L
Ｌ−リジン塩酸塩 0.4g/L
DL-メチオニン 0.4g/L
ε−ジアミノピメリン酸 0.4g/L
テトラサイクリン塩酸塩 25mg/L
クロラムフェニコール 25mg/L
Next, the cells were cultured using SC17sucA / RSFCPG + pSTV-yhfK and the target SC17sucA / RSFCPG + pSTV29, and the ability to produce L-glutamic acid was examined.
The medium was performed with the following composition.
[Composition of culture medium]
Sucrose 50g / L
MgSO 4・
KH 2 PO 4 2.0g / L
Yeast extract 4.0g / L
FeSO 4・
MnSO 4・
L-lysine hydrochloride 0.4g / L
DL-methionine 0.4g / L
ε-Diaminopimelic acid 0.4g / L
Tetracycline hydrochloride 25mg / L
Chloramphenicol 25mg / L
SC17sucA/ RSFCPG+pSTV29と、SC17sucA/ RSFCPG+pSTV-yhfKをL培地（バクトトリプトン10 g、イーストエキストラクト 5 g、NaCl 5 g、寒天15 gを純水1Lに含む培地 pH7.0）に、最小培地成分（ グルコース0.5g、硫酸マグネシウム2mM、リン酸一カリウム3g、塩化ナトリウム0.5g 、塩化アンモニウム1g リン酸2ナトリウム6g を純水1Lに含む培地）に25mg/Lのクロラムフェニコール, 12.5mg/Lテトラサイクリンを加えた培地で前培養し、プレート1枚ジャーファメンターに植菌し、34℃、pH6.0にて、通気1/1vvm 34℃で酸素濃度が5％以上になるように攪拌制御を行った。 SC17sucA / RSFCPG + pSTV29 and SC17sucA / RSFCPG + pSTV-yhfK in L medium (medium pH 7.0 containing 10 g bactotryptone, 5 g yeast extract, 5 g NaCl, 15 g agar in 1 L pure water) 25mg / L chloramphenicol, 12.5 in the minimum medium components (medium containing 0.5g glucose, 2mM magnesium sulfate, 3g monopotassium phosphate, 0.5g sodium chloride, 1g ammonium chloride, 6g disodium phosphate in 1L of pure water) Pre-culture in a medium supplemented with mg / L tetracycline, inoculate one plate jar fermenter, and at 34 ° C, pH6.0, aeration 1 / 1vvm 34 ° C, oxygen concentration should be 5% or more Stirring control was performed.
結果を表１に示す。対照のSC17sucA/RSFCPG+pSTV29と比べ、yhfK増幅株であるSC17sucA/RSFCPG+pSTV-yhfKは、Ｌ−グルタミン酸生産に関して、Ｌ−グルタミン酸蓄積が約3g/L 上昇し、対糖収率で約5％上昇した。 The results are shown in Table 1. Compared with the control SC17sucA / RSFCPG + pSTV29, the yhfK amplified strain SC17sucA / RSFCPG + pSTV-yhfK increased L-glutamic acid accumulation by about 3 g / L with respect to L-glutamic acid production and about 5% in terms of sugar yield. Rose.
＜エシェリヒア・コリのyhfK遺伝子の増幅効果と酸性条件下での増幅効果＞
次にエシェリヒア・コリのyhfK遺伝子のパントエア・アナナティスSC17sucA/RSFCPG株に導入して効果を調べた。
<Amplification effect of Escherichia coli yhfK gene and amplification under acidic conditions>
Next, the yhfK gene of Escherichia coli was introduced into the Pantoea ananatis SC17sucA / RSFCPG strain to examine the effect.
エシェリヒア・コリのGeneBank NC_000913 に登録されているyhfKの配列（配列番号３）を基に、配列番号７、８に示したオリゴヌクレオチドを用いて、エシェリヒア・コリ W3110株（ATCC 27325） の染色体を鋳型にPCR反応を行い、yhfK遺伝子を含む約2.4ｋｂの断片を得た。この断片をEcoRI、PstI処理し、pSTV29（宝酒造株式会社製）の同サイトに連結した。得られたエシェリヒア・コリのyhfK増幅用プラスミドをyhfK増幅用プラスミドpSTV-EcoyhfKとした。構築方法を図２に示す。 Based on the sequence of yhfK (SEQ ID NO: 3) registered in GeneBank NC_000913 of Escherichia coli, the chromosome of Escherichia coli W3110 strain (ATCC 27325) was used as a template using the oligonucleotides shown in SEQ ID NOs: 7 and 8. PCR reaction was performed to obtain a fragment of about 2.4 kb containing the yhfK gene. This fragment was treated with EcoRI and PstI and ligated to the same site of pSTV29 (Takara Shuzo Co., Ltd.). The resulting Escherichia coli yhfK amplification plasmid was designated as yhfK amplification plasmid pSTV-EcoyhfK. The construction method is shown in FIG.
得られたエシェリヒア・コリyhfK遺伝子増幅用プラスミドpSTV-EcoyhfKをエレクトロポレーションにより上記のSC17sucA/RSFCPG株に導入し、クロラムフェニコール耐性を指標として形質転換体を得た。得られた株をエシェリヒア・コリyhfK遺伝子増幅株 SC17sucA/RSFCPG+pSTV-EcoyhfKと名付けた。 The obtained Escherichia coli yhfK gene amplification plasmid pSTV-EcoyhfK was introduced into the above-mentioned SC17sucA / RSFCPG strain by electroporation to obtain a transformant using chloramphenicol resistance as an index. The obtained strain was named Escherichia coli yhfK gene amplified strain SC17sucA / RSFCPG + pSTV-EcoyhfK.
次にこの菌株についてＬ−グルタミン酸生産培養を行った。次にSC17sucA/RSFCPG+pSTV-yhfKとSC17sucA/RSFCPG+pSTV-EcoyhfKと対象のSC17sucA/RSFCPG+pSTV29を用いて培養を行い、Ｌ−グルタミン酸の生産能について検討した。培養は、菌体を形成させる種培養と、Ｌ−グルタミン酸を生成する本培養の2段階に分けて行った。 Next, L-glutamic acid production culture was performed on this strain. Next, culture was performed using SC17sucA / RSFCPG + pSTV-yhfK, SC17sucA / RSFCPG + pSTV-EcoyhfK, and the target SC17sucA / RSFCPG + pSTV29, and the production ability of L-glutamic acid was examined. The culture was performed in two stages: seed culture for forming cells and main culture for producing L-glutamic acid.
種培養は以下の培地組成で行った
〔種培養培地組成〕
シュークロース 50g/L
MgSO4・7H20 0.4g/L
GD113 0.1mL/L
(NH4)2SO4 4g/L
KH2PO4 2.0g/L
酵母エキス 4.0g/L
FeSO4・7H20 0.01g/L
MnSO4・5H20 0.01g/L
Ｌ−リジン塩酸塩 0.4g/L
DL-メチオニン 0.4g/L
ε−ジアミノピメリン酸 0.4g/L
テトラサイクリン塩酸塩 12.5mg/L
クロラムフェニコール 25mg/L
Seed culture was performed with the following medium composition [seed culture medium composition]
Sucrose 50g / L
MgSO 4・
GD113 0.1mL / L
(NH 4 ) 2 SO 4 4g / L
KH 2 PO 4 2.0g / L
Yeast extract 4.0g / L
FeSO 4・
MnSO 4・
L-lysine hydrochloride 0.4g / L
DL-methionine 0.4g / L
ε-Diaminopimelic acid 0.4g / L
Tetracycline hydrochloride 12.5mg / L
Chloramphenicol 25mg / L
SC17sucA/RSFCPG+pSTV29株とSC17sucA/RSFCPG+pSTV-yhfK株と SC17sucA/RSFCPG+pSTV-EcoyhfK株とをL培地（バクトトリプトン10 g、イーストエキストラクト 5 g、NaCl 5 g、寒天15 gを純水1Lに含む培地、pH7.0）に、最小培地成分（ グルコース0.5g、硫酸マグネシウム2mM、リン酸一カリウム3g、塩化ナトリウム0.5g 塩化アンモニウム1g リン酸2ナトリウム6g を純水1Lに含む培地）に25mg/Lのクロラムフェニコール, 12.5mg/Lテトラサイクリンを加えた培地で前培養し、プレート1枚をジャーファメンターに植菌し、34℃、pH6.0にて、通気1/1vvm 34℃で酸素濃度が5％以上になるように約14時間攪拌制御を行った。培養中のpHは、6.0となるようにアンモニアガスを添加することにより調整を行った。培地中の糖の枯渇を指標に種培養を終了した。本培養培地組成は以下に示す。 SC17sucA / RSFCPG + pSTV29 strain, SC17sucA / RSFCPG + pSTV-yhfK strain and SC17sucA / RSFCPG + pSTV-EcoyhfK strain are mixed with L medium (bactotryptone 10 g, yeast extract 5 g, NaCl 5 g, agar 15 g Medium containing 1L of water, pH 7.0) and minimum medium components (medium containing 0.5g glucose, 2mM magnesium sulfate, 3g monopotassium phosphate, 0.5g sodium chloride, 1g ammonium chloride and 6g disodium phosphate in 1L pure water) Pre-cultured in a medium supplemented with 25 mg / L chloramphenicol and 12.5 mg / L tetracycline, inoculated one plate into a jar fermenter, aerated 1/1 vvm at 34 ° C, pH 6.0 Stirring was controlled for about 14 hours so that the oxygen concentration at 5 ° C. was 5% or more. The pH during the culture was adjusted by adding ammonia gas to 6.0. The seed culture was terminated using the depletion of sugar in the medium as an indicator. The composition of the main culture medium is shown below.
〔本培養培地組成〕（20％種培養液を植菌した後の濃度）
シュークロース 50g/L
(NH4) 2S04 5.0g/L
MgSO4・7H20 0.4g/L
GD113 0.1mL/L
酵母エキス 6.0g/L
KH2PO4 6.0g/L
NaCl 1.5g/L
FeSO4・7H20 0.02g/L
MnSO4・5H20 0.02g/L
Ｌ−リジン塩酸塩 0.8g/L
DL-メチオニン 0.6g/L
DL-α,ε-ジアミノピメリン酸 0.6g/L
テトラサイクリン塩酸塩 12.5mg/L
クロラムフェニコール 25mg/L
塩化カルシウム二水塩 0.75g/L
パントテン酸カルシウム 12mg/L（パントテン酸添加培養時のみ添加）
[Main culture medium composition] (Concentration after inoculating 20% seed culture)
Sucrose 50g / L
(NH 4 ) 2 S0 4 5.0 g / L
MgSO 4・
GD113 0.1mL / L
Yeast extract 6.0g / L
KH 2 PO 4 6.0g / L
NaCl 1.5g / L
FeSO 4・
MnSO 4・
L-lysine hydrochloride 0.8g / L
DL-methionine 0.6g / L
DL-α, ε-Diaminopimelic acid 0.6g / L
Tetracycline hydrochloride 12.5mg / L
Chloramphenicol 25mg / L
Calcium chloride dihydrate 0.75g / L
Calcium pantothenate 12mg / L (added only when pantothenic acid is added)
得られた菌体60mlを以下の組成の培地を240ml張り込んだ１L容ミニジャーに注入し、pH4.7で培養を行った。本培養培地の50g/Lのシュークロースを消費した時点で、培養中、シュークロース溶液700g/L（W/V）（オートクレーブで殺菌した）をポンプ輸送することによって、小型発酵槽内の糖濃度を5〜20g/Lに調節した。 The obtained microbial cells (60 ml) were poured into a 1-L minijar in which 240 ml of a medium having the following composition was put, and cultured at pH 4.7. When 50g / L sucrose was consumed in the main culture medium, the sugar concentration in the small fermenter was pumped during the cultivation by pumping 700g / L (W / V) sucrose solution (sterilized by autoclaving). Was adjusted to 5-20 g / L.
結果を表２に示す。本培養においては、培養時間を一定にて終了した。エシェリヒア属YhfK遺伝子増幅株であるSC17sucA/RSFCPG+pSTV-EcoyhfK株、パントエア・アナナティスのyhfK遺伝子増幅株であるSC17sucA/RSFCPG+pSTV-yhfK株ともに、比較対照株のSC17sucA/RSFCPG+pSTV29と比べ、大幅にＬ−グルタミン酸の生産性が上昇し、糖消費速度も高く、生産性向上効果とともに、yhfK遺伝子増幅はＬ−グルタミン酸生産培養における生育改善効果があることが明らかになった。 The results are shown in Table 2. In the main culture, the culture time was fixed. Both the Escherichia genus YhfK gene amplification strain SC17sucA / RSFCPG + pSTV-EcoyhfK strain, Pantoea Ananatis yhfK gene amplification strain SC17sucA / RSFCPG + pSTV-yhfK strain, compared with the comparative control strain SC17sucA / RSFCPG + pSTV29 In addition, the productivity of L-glutamic acid was increased, the sugar consumption rate was high, and it was revealed that the yhfK gene amplification had a growth improving effect in the L-glutamic acid production culture as well as the productivity improving effect.
＜YhfKのＬ−グルタミン酸排出能の確認＞
YhfK遺伝子増幅株の菌体内のＬ−グルタミン酸の濃度を測定した。菌体内のＬ−グルタミン酸の濃度はA.Ishizaki et al, Biotech.Teqniq.(1995) Vol9, No.6,p409-の方法を参考に測定した。500mLのシリコンオイルを張り込んだ1.5mL Tubeに1mL培養液を加え、すぐに遠心機にて15000回転 3分遠心し、チューブの底を切り取り、菌体を回収する。この菌体を200μLの5規定の過塩素酸の入った2mL チューブに入れ、測定まで-80℃にて保存した。この過塩素酸溶液を室温で溶かし、菌体を懸だくし、200mLの2.5モル の炭酸カリウムを添加することにより中和し、遠心にて沈殿を除去後、上澄みを菌体内抽出物としてＬ−グルタミン酸濃度を測定した。
<Confirmation of Lh-glutamic acid excretion ability of YhfK>
The concentration of L-glutamic acid in the bacterial body of the YhfK gene amplification strain was measured. The concentration of L-glutamic acid in the cells was measured with reference to the method of A. Ishizaki et al, Biotech. Teqniq. (1995) Vol 9, No. 6, p409-. Add 1mL culture solution to 1.5mL Tube with 500mL of silicone oil, and immediately centrifuge at 15000 rpm for 3 minutes in a centrifuge. Cut the bottom of the tube and collect the cells. The cells were placed in a 2 mL tube containing 200 μL of 5N perchloric acid and stored at −80 ° C. until measurement. This perchloric acid solution is dissolved at room temperature, the cells are suspended, neutralized by adding 200 mL of 2.5 molar potassium carbonate, the precipitate is removed by centrifugation, and the supernatant is extracted as an intracellular extract. The glutamic acid concentration was measured.
結果を図４に示す。横軸に細胞外のＬ−グルタミン酸濃度、縦軸に細胞内のＬ−グルタミン酸濃度を示す。対象であるSC17sucA/RSFCPG+pSTV29株が、細胞内でのＬ−グルタミン酸濃度が、細胞外でのＬ−グルタミン酸濃度と比べて高いのに対し、SC17sucA/RSFCPG+pSTV-EcoyhfK、SC17sucA/RSFCPG+pSTV-yhfKは、細胞内でのＬ−グルタミン酸濃度が、細胞外のＬ−グルタミン酸濃度より低いことが明らかになった。この結果、yhfK遺伝子増幅株である、SC17sucA/RSFCPG pSTV-EcoyhfK、SC17sucA/RSFCPG pSTV-yhfKは、細胞内のＬ−グルタミン酸をより細胞外に排出しやすくなったことを示している。従ってyhfKは、細胞内のＬ−グルタミン酸を細胞外に排出するＬ−グルタミン酸排出タンパク質をコードしている遺伝子であることが明らかになった。 The results are shown in FIG. The horizontal axis shows the extracellular L-glutamic acid concentration, and the vertical axis shows the intracellular L-glutamic acid concentration. The target SC17sucA / RSFCPG + pSTV29 strain has a higher intracellular L-glutamic acid concentration than the extracellular L-glutamic acid concentration, whereas SC17sucA / RSFCPG + pSTV-EcoyhfK, SC17sucA / RSFCPG + pSTV -yhfK was found to have a lower intracellular L-glutamic acid concentration than the extracellular L-glutamic acid concentration. As a result, SC17sucA / RSFCPG pSTV-EcoyhfK and SC17sucA / RSFCPG pSTV-yhfK, which are yhfK gene amplification strains, indicate that intracellular L-glutamic acid is more easily discharged out of the cell. Therefore, it was revealed that yhfK is a gene encoding an L-glutamate excretion protein that excretes intracellular L-glutamate to the outside of the cell.
＜エシェリヒア・コリでのyhfK遺伝子増幅によるＬ−グルタミン酸生産能の確認＞
次にパントエア・アナナティス由来のyhfK遺伝子をエシェリヒア・コリに導入して増幅効果を検討した。
<Confirmation of L-glutamate production ability by yhfK gene amplification in Escherichia coli>
Next, the amplification effect was examined by introducing the yhfK gene derived from Pantoea ananatis into Escherichia coli.
上述のパントエア・アナナティス由来のyhfK遺伝子増幅用ベクターpSTV-yhfKと、対照用プラスミドpSTV28をエレクトロポレーションによりエシェリヒア・コリの野生株であるW3110株に導入し、クロラムフェニコール耐性を示す形質転換体を得た。yhfK増幅株をW3110/pSTV-yhfK、対照用のpSTV29導入株をW3110/pSTV29と名付けた。 The above-described pantoea ananatis-derived yhfK gene amplification vector pSTV-yhfK and the control plasmid pSTV28 were introduced into the wild strain W3110 of Escherichia coli by electroporation, and a transformant exhibiting resistance to chloramphenicol Got. The yhfK amplified strain was named W3110 / pSTV-yhfK, and the control pSTV29-introduced strain was named W3110 / pSTV29.
次にW3110/pSTV-yhfKと対照のW3110/pSTV29を用いて培養を行い、Ｌ−グルタミン酸の生産能について検討した。W3110/pSTV-yhfKと対照のW3110/pSTV29とをL培地（バクトトリプトン10 g、イーストエキストラクト 5 g、NaCl 5 g、寒天15 gを純水1Lに含む培地、pH7.0）に、クロラムフェニコールを加えた培地で前培養し、Nunc社製1mL容エーゼ1かきを以下の組成の培地で5mL張り込みの試験管に植菌しpH7.0で34℃にて16時間振とう培養した。 Next, culture was performed using W3110 / pSTV-yhfK and control W3110 / pSTV29, and the production ability of L-glutamic acid was examined. Add W3110 / pSTV-yhfK and control W3110 / pSTV29 to L medium (medium containing 10 g bactotryptone, 5 g yeast extract, 5 g NaCl, and 15 g agar in 1 L pure water, pH 7.0). Pre-cultured in a medium supplemented with ramphenicol, inoculated with 1 mL of 1 mL ase from Nunc into a test tube with 5 mL of medium with the following composition, and cultured with shaking at pH 7.0 for 16 hours at 34 ° C. .
〔培養培地組成〕
グルコース 40g/L
MgSO4・7H20 1.0g/L
(NH4)2SO4 20g/L
KH2PO4 1.0g/L
酵母エキス 1.0g/L
FeSO4・7H20 0.01g/L
MnSO4・5H20 0.01g/L
クロラムフェニコール 25mg/L
炭酸カルシウム 30g/L
（pH7.0に調整）
[Composition of culture medium]
Glucose 40g / L
MgSO 4・
(NH 4 ) 2 SO 4 20 g / L
KH 2 PO 4 1.0g / L
Yeast extract 1.0g / L
FeSO 4・
MnSO 4・
Chloramphenicol 25mg / L
Calcium carbonate 30g / L
(Adjusted to pH 7.0)
パントエア・アナナティスのyhfK遺伝子増幅株であるエシェリヒア・コリ W3110 /pSTV-yhfK216は、対照のベクター導入株W3110/pSTV29株と比べて、大幅にＬ−グルタミン酸の蓄積が上昇した。 In Escherichia coli W3110 / pSTV-yhfK216, a yhfK gene amplification strain of Pantoea ananatis, accumulation of L-glutamic acid was significantly increased as compared to the control vector-introduced strain W3110 / pSTV29.
＜コリネ型細菌でのyhfK遺伝子増幅によるＬ−グルタミン酸生産能の確認＞
コリネ型細菌のＬ−グルタミン酸生産株としてコリネバクテリウム・グルタミカムATCC13869株を用いることが出来る。またyhfK増幅株の親株としては、α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性を低下させた菌株が好適である。ATCC13869株のyhfK増幅株は例えば以下のような方法で構築することが出来る。
yhfK遺伝子は、エシェリヒア・コリ、パントエア・アナナティス等の腸内細菌の染色体を鋳型にして、yhfKと相補的な合成オリゴヌクレオチド、例えば、配列番号5,6あるいは7,8のプライマーを用いてPCRにて増幅出来る。得られたPCR産物は、pCG1由来のエシェリヒア・コリネ型細菌のシャトルベクターpVK７(米国特許出願公開明細書2003-0175912)にクローニングし、yhfK増幅用プラスミドpVK9yhfKと命名する。 pVK７yhfKと比較対照用プラスミドpVK7を形質転換し、カナマイシン耐性株を得る。このようにして、yhfK増幅株ATCC13869/pVK9yhfK,比較対照用プラスミド導入株ATCC13869/pVK9を取得出来る。
<Confirmation of L-glutamic acid production ability by yhfK gene amplification in coryneform bacteria>
Corynebacterium glutamicum ATCC13869 strain can be used as an L-glutamic acid producing strain of coryneform bacterium. Moreover, as a parent strain of the yhfK amplified strain, a strain having a reduced α-ketoglutarate dehydrogenase activity is suitable. The yhfK amplified strain of ATCC13869 strain can be constructed by the following method, for example.
The yhfK gene is used for PCR using a synthetic oligonucleotide complementary to yhfK, for example, a primer of SEQ ID NO: 5, 6 or 7, 8 using the chromosome of an enteric bacterium such as Escherichia coli or Pantoea ananatis as a template. Can be amplified. The obtained PCR product was cloned into pCG1-derived Escherichia coryneform bacterium shuttle vector pVK7 (US Patent Application Publication No. 2003-0175912) and named as yhfK amplification plasmid pVK9yhfK. pVK7yhfK and control plasmid pVK7 are transformed to obtain a kanamycin resistant strain. In this way, the yhfK amplified strain ATCC13869 / pVK9yhfK and the control plasmid-introduced strain ATCC13869 / pVK9 can be obtained.
ATCC13869/pVK7yhfKとATCC13869/pVK7株をCMDX固体培地（5 g/L グルコース, 10 g/L ペプトン, 10 g/L酵母エキス, 1 g/L of リン酸2カリウム, 0.4 g/L , 10 mg/L FeSO4・7H2O, 10 mg/L MnSO4・4 to 5H2O, 3 g/L Urea, 2 g/L 大豆タンパク質加水分解物, 20 g/L 寒天, pH 7.5）で18〜24時間培養する。
生育した菌体を20mlのフラスコ培地（グルコース30g/l, 硫酸アンモニウム 15g/l, KH2PO4 1g/l, MgSO4・7H2O 0.4g/l, FeSO4・7H2O 0.01g/l, MnSO4・4〜5H2O 0.01g/l, VB1
200μg/l, Biotin 300μg/l, 大豆加水分解物（T-N）0.48g/l, KOHを用いてpH8.0に調整：オートクレーブ115℃10分）に接種した後、予め乾熱滅菌しておいた炭酸カルシウムを1g加え、31.5℃で20-40時間振とう培養を行う。培養終了後、残糖とＬ−グルタミン酸の濃度をバイオテックアナライザーで測定する。このような方法でＬ−グルタミン酸生産能の向上したコリネ型細菌のyhfK増幅株を取得することが出来る。
ATCC13869 / pVK7yhfK and ATCC13869 / pVK7 strains in CMDX solid medium (5 g / L glucose, 10 g / L peptone, 10 g / L yeast extract, 1 g / L of dipotassium phosphate, 0.4 g / L, 10 mg / L FeSO 4 · 7H 2 O, 10 mg / L MnSO 4 · 4 to 5H 2 O, 3 g / L Urea, 2 g / L Soy Protein Hydrolyzate, 20 g / L Agar, pH 7.5) 18-24 Incubate for hours.
The grown bacterial cells were placed in a 20 ml flask medium (glucose 30 g / l, ammonium sulfate 15 g / l, KH 2 PO 4 1 g / l, MgSO 4 · 7H 2 O 0.4 g / l, FeSO 4 · 7H 2 O 0.01 g / l, MnSO 4・ 4〜5H 2 O 0.01g / l, VB1
200 μg / l, Biotin 300 μg / l, soy hydrolyzate (TN) 0.48 g / l, adjusted to pH 8.0 with KOH: autoclave 115 ° C. for 10 minutes) Add 1g of calcium carbonate and shake culture at 31.5 ° C for 20-40 hours. After completion of the culture, the concentrations of residual sugar and L-glutamic acid are measured with a Biotech Analyzer. By such a method, a yhfK amplified strain of coryneform bacterium having improved L-glutamic acid-producing ability can be obtained.
本発明の微生物を用いることにより、Ｌ−グルタミン酸の生産効率を向上させることが出来る。Ｌ−グルタミン酸は調味料原料等として有用なアミノ酸である。 By using the microorganism of the present invention, the production efficiency of L-glutamic acid can be improved. L-glutamic acid is an amino acid useful as a seasoning raw material.
Claims (11)
（A）配列番号２または４に示すアミノ酸配列を有するタンパク質、
（B）配列番号２または４に示すアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、または付加されたアミノ酸配列を有し、かつＬ−グルタミン酸排出能を有するタンパク質。 The microorganism according to claim 1, wherein the yhfK gene is a gene encoding the protein described in (A) or (B) below:
(A) a protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or 4,
(B) A protein having an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted, inserted, or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or 4, and having an ability to excrete L-glutamate.
（ａ）配列番号１の１５３０〜３６２０または配列番号３の２０１〜２２８８に示す塩基配列を含むＤＮＡ、
（ｂ）配列番号１の１５３０〜３６２０または配列番号３の２０１〜２２８８に示す塩基配列又は同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、Ｌ−グルタミン酸排出活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。 The microorganism according to claim 1, wherein the yhfK gene is the DNA described in (a) or (b) below:
(A) DNA comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 1530-3620 or SEQ ID NO: 3 201-2288,
(B) It hybridizes under stringent conditions with a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 1530-3620 or SEQ ID NO: 3 201-288 or a probe that can be prepared from the nucleotide sequence, and has L-glutamic acid excretion activity DNA encoding a protein having the same.
（A）配列番号２に示すアミノ酸配列を有するタンパク質、
（B）配列番号２に示すアミノ酸配列と７１％以上相同なアミノ酸配列を有し、かつＬ−グルタミン酸排出能を有するタンパク質。
The gene which codes the protein as described in the following (A) or (B).
(A) a protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2,
(B) A protein having an amino acid sequence 71% or more homologous to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and having an ability to excrete L-glutamic acid.
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