JP2009254323A - Method for producing l-glutamic acid-based amino acid - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、Ｌ−グルタミン酸系アミノ酸を生産する細菌及びＬ−グルタミン酸系アミノ酸の製造法に関する。Ｌ−グルタミン酸は調味料原料等として広く用いられている。また、Ｌ−グルタミン、Ｌ−プロリン、Ｌ−オルニチン、Ｌ−シトルリン、及びＬ−アルギニンは、調味料、肝機能促進薬、アミノ酸輸液、および総合アミノ酸製剤等として有用である。 The present invention relates to a bacterium that produces L-glutamic acid-based amino acids and a method for producing L-glutamic acid-based amino acids. L-glutamic acid is widely used as a seasoning material. L-glutamine, L-proline, L-ornithine, L-citrulline, and L-arginine are useful as seasonings, liver function promoters, amino acid infusions, comprehensive amino acid preparations, and the like.
Ｌ−グルタミン酸は、主としてブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、ミクロバクテリウム属に属するいわゆるコリネ型細菌のＬ−グルタミン酸生産菌またはそれらの変異株を用いた発酵法により製造されている（例えば、非特許文献１参照）。その他の菌株を用いた発酵法によるＬ−グルタミン酸の製造法としては、バチルス属、ストレプトミセス属、ペニシリウム属等の微生物を用いる方法（例えば、特許文献１参照）、シュードモナス属、アースロバクター属、セラチア属、キャンディダ属等の微生物を用いる方法（例えば、特許文献２参照）、バチルス属、シュードモナス属、セラチア属、アエロバクター・アエロゲネス（現エンテロバクター・アエロゲネス）等の微生物を用いる方法（例えば、特許文献３参照）、エシェリヒア・コリの変異株を用いる方法（例えば、特許文献４参照）等が知られている。また、クレブシエラ属、エルビニア属又はパントテア属、エンテロバクター属に属する微生物を用いたＬ−グルタミン酸の製造法も開示されている（例えば、特許文献５〜７参照）。 L-glutamic acid is mainly produced by fermentation using so-called coryneform L-glutamic acid-producing bacteria belonging to the genus Brevibacterium, Corynebacterium, and Microbacterium, or mutants thereof (for example, Non-patent document 1). As a method for producing L-glutamic acid by fermentation using other strains, methods using microorganisms such as Bacillus genus, Streptomyces genus, Penicillium genus (for example, see Patent Document 1), Pseudomonas genus, Arthrobacter genus, Methods using microorganisms such as Serratia and Candida (for example, see Patent Document 2), methods using microorganisms such as Bacillus, Pseudomonas, Serratia, Aerobacter Aerogenes (current Enterobacter Aerogenes) (for example, Patent Document 3), a method using a mutant of Escherichia coli (for example, see Patent Document 4), and the like are known. Moreover, the manufacturing method of L-glutamic acid using the microorganisms which belong to Klebsiella genus, Erbinia genus or Pantothea genus, Enterobacter genus is also disclosed (for example, refer patent documents 5-7).
近年は、目的物質の発酵生産に、組換えＤＮＡ技術を用いることが行われている。例えば、Ｌ−アミノ酸生合成系酵素をコードする遺伝子の発現を増強すること（特許文献８、９）、又はＬ−アミノ酸生合成系への炭素源の流入を増強すること（特許文献１０）によって、微生物のＬ−アミノ酸生産効率を向上させることが行われている。Ｌ−グルタミン酸については、例えば、コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属細菌において、エシェリヒア・コリ又はコリネバクテリウム・グルタミクム由来のクエン酸シンターゼをコードする遺伝子の導入が、コリネ型細菌のＬ−グルタミン酸生産能の増強に効果的であったことが報告されている（例えば、特許文献１１参照）。またコリネ型細菌由来のクエン酸シンターゼ遺伝子のエンテロバクター属、クレブシエラ属、セラチア属、エルビニア属、又はエシェリヒア属に属する腸内細菌への導入が、Ｌ−グルタミン酸生産能の増強に効果的であったことが報告されている（例えば、特許文献７参照）。 In recent years, recombinant DNA technology has been used for fermentative production of target substances. For example, by enhancing the expression of a gene encoding an L-amino acid biosynthesis system enzyme (Patent Documents 8 and 9) or by enhancing the inflow of a carbon source into the L-amino acid biosynthesis system (Patent Document 10) Improvement of the L-amino acid production efficiency of microorganisms has been carried out. As for L-glutamic acid, for example, in the genus Corynebacterium or Brevibacterium, introduction of a gene encoding citrate synthase derived from Escherichia coli or Corynebacterium glutamicum may produce L-glutamic acid in coryneform bacteria. It has been reported that it was effective in enhancing the performance (see, for example, Patent Document 11). Moreover, introduction of the citrate synthase gene derived from coryneform bacteria into enterobacteria belonging to the genus Enterobacter, Klebsiella, Serratia, Erbinia, or Escherichia was effective in enhancing L-glutamic acid production ability. (For example, refer to Patent Document 7).
Ｌ−グルタミン酸以外のＬ−グルタミン酸系アミノ酸、例えばオルニチン及びシトルリン（非特許文献２〜４）、Ｌ−グルタミン（特許文献１２）、Ｌ−プロリン（特許文献１３）、及びＬ−アルギニン（特許文献１４、１５）等も、Ｌ−グルタミン酸と同様に、上記のような微生物を用いた発酵法により製造されている。 L-glutamic acid amino acids other than L-glutamic acid, such as ornithine and citrulline (Non-patent Documents 2 to 4), L-glutamine (Patent Document 12), L-proline (Patent Document 13), and L-arginine (Patent Document 14) 15) and the like are also produced by fermentation using microorganisms as described above, similarly to L-glutamic acid.
発酵法によるＬ−アミノ酸の比生産性は酸素の充足度に依存している（非特許文献５）。そのため、発酵槽あたりの目的物質の生産性は、発酵槽の酸素供給能力に制限される。装置の工夫による酸素供給能力の強化がいろいろ考案されてきた（非特許文献６「発酵ハンドブック（共立出版）」）。しかし、酸素の供給力に生産性が制限されることなく目的物質を発酵生産できる菌株を育種することにより、酸素供給律速を回避し目的物質の生産性を高めるといった試みはこれまで報告されていない。
本発明は、Ｌ−グルタミン酸系アミノ酸を嫌気又は微好気条件下で生産することのできる菌株を提供すること、及び該菌株を用いて嫌気又は微好気条件下でＬ−グルタミン酸系アミノ酸を生産する方法を提供することを課題とする。 The present invention provides a strain capable of producing an L-glutamic acid type amino acid under anaerobic or microaerobic conditions, and produces an L-glutamic acid type amino acid under anaerobic or microaerobic conditions using the strain. It is an object of the present invention to provide a method for performing the above.
本発明者らは、嫌気状態では、微生物は基質レベルのリン酸化によりATPを生産し、それに伴って生じるNAD(P)Hなどの中間電子受容体が再酸化され、細胞内での酸化還元バランスが維持されることが非常に重要となると考えた。そして、本発明者らは鋭意研究を行った結果、細菌を、NADHの阻害を受けないクエン酸シンターゼの活性が増大するように改変することにより、嫌気又は微好気条件下でＬ−グルタミン酸系アミノ酸を生産することができることを見出した。また、乳酸デヒドロゲナーゼ、アセトラクテートデカルボキシラーゼ、ホスフェートアセチルトランスフェラーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ及びアルコールデヒドロゲナーゼから選ばれる１又は２以上の酵素の活性を低下させること、あるいは、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ活性を増大させることにより、嫌気又は微好気条件下でのＬ−グルタミン酸系アミノ酸の生産性が一層向上することを見出し、本発明を完成するに至った。 In the anaerobic state, the present inventors produce ATP by phosphorylation at the substrate level, and accompanying intermediate electron acceptors such as NAD (P) H are reoxidized, and the redox balance in the cell. It was very important to maintain And as a result of intensive studies, the present inventors have modified bacteria so that the activity of citrate synthase that is not inhibited by NADH is increased, so that the L-glutamic acid system can be obtained under anaerobic or microaerobic conditions. It has been found that amino acids can be produced. Further, by reducing the activity of one or more enzymes selected from lactate dehydrogenase, acetolactate decarboxylase, phosphate acetyltransferase, malate dehydrogenase and alcohol dehydrogenase, or by increasing phosphoenolpyruvate carboxykinase activity The inventors have found that the productivity of L-glutamic acid amino acids under anaerobic or microaerobic conditions is further improved, and have completed the present invention.
すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−プロリン、Ｌ−オルニチン、Ｌ−シトルリン、及びＬ−アルギニンからなる群より選ばれる１又は２以上のＬ−アミノ酸の生産能を有し、かつ、ＮＡＤＨによる阻害を受けないクエン酸シンターゼの活性が増大するように改変された細菌を、嫌気又は微好気条件で培地中で培養し、前記Ｌ−アミノ酸を該培地中に生成蓄積させ、該培地からＬ−アミノ酸を回収することを特徴とする、Ｌ−アミノ酸の製造法。
（２）前記ＮＡＤＨによる阻害を受けないクエン酸シンターゼが、ｐｒｐＣ遺伝子によりコードされるメチルクエン酸シンターゼである、前記方法。
（３）前記メチルクエン酸シンターゼが、下記（Ａ）または（Ｂ）に記載のタンパク質で
ある前記方法。
（Ａ）配列番号７６に示すアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｂ）配列番号７６に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を有し、かつ、クエン酸シンターゼ活性を有するタンパク質。
（４）前記ｐｒｐＣ遺伝子が、下記（ａ）または（ｂ）に記載のＤＮＡである、前記方法。
（ａ）配列番号７５の塩基配列を含むＤＮＡ、または
（ｂ）配列番号７５の塩基配列または同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、クエン酸シンターゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（５）前記細菌が、乳酸デヒドロゲナーゼ、アセトラクテートデカルボキシラーゼ、ホスフェートアセチルトランスフェラーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ及びアルコールデヒドロゲナーゼからなる群より選ばれる１又は２以上の酵素の活性が低下するように改変された、前記方法。
（６）前記細菌が、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ活性が増大するように改変された、前記方法。
（７）前記細菌が、乳酸デヒドロゲナーゼ、アセトラクテートデカルボキシラーゼ、ホスフェートアセチルトランスフェラーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ及びアルコールデヒドロゲナーゼからなる群より選ばれる１又は２以上の酵素の活性が低下し、かつ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ活性が増大するように改変された、前記方法。
（８）前記細菌が、エシェリヒア属、エンテロバクター属、パントエア属、クレブシエラ属、及びセラチア属からなる群より選ばれる細菌である、前記方法。
（９）前記細菌が、エンテロバクター・アグロメランスである、前記方法。
（１０）前記微生物がコリネ型細菌である、前記方法。
That is, the present invention is as follows.
(1) having the ability to produce one or more L-amino acids selected from the group consisting of L-glutamic acid, L-glutamine, L-proline, L-ornithine, L-citrulline, and L-arginine; Bacteria modified to increase the activity of citrate synthase that is not inhibited by NADH are cultured in a medium under anaerobic or microaerobic conditions, and the L-amino acid is produced and accumulated in the medium. A method for producing an L-amino acid, comprising recovering the L-amino acid from
(2) The method described above, wherein the citrate synthase that is not inhibited by NADH is methyl citrate synthase encoded by the prpC gene.
(3) The method, wherein the methyl citrate synthase is a protein according to the following (A) or (B).
(A) A protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 76.
(B) A protein having an amino acid sequence including substitution, deletion, insertion, or addition of one or several amino acids and having citrate synthase activity in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 76.
(4) The method, wherein the prpC gene is the DNA described in (a) or (b) below.
(A) DNA containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 75, or (b) hybridizing under stringent conditions with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 75 or a probe that can be prepared from the nucleotide sequence, and having citrate synthase activity DNA encoding a protein having the same.
(5) The method, wherein the bacterium is modified so that the activity of one or more enzymes selected from the group consisting of lactate dehydrogenase, acetolactate decarboxylase, phosphate acetyltransferase, malate dehydrogenase and alcohol dehydrogenase is reduced. .
(6) The method as described above, wherein the bacterium has been modified to increase phosphoenolpyruvate carboxykinase activity.
(7) The bacterium has reduced activity of one or more enzymes selected from the group consisting of lactate dehydrogenase, acetolactate decarboxylase, phosphate acetyltransferase, malate dehydrogenase and alcohol dehydrogenase, and phosphoenolpyruvate carboxy The method, wherein the method has been modified to increase kinase activity.
(8) The method as described above, wherein the bacterium is selected from the group consisting of Escherichia, Enterobacter, Pantoea, Klebsiella, and Serratia.
(9) The method as described above, wherein the bacterium is Enterobacter agglomerans.
(10) The method as described above, wherein the microorganism is a coryneform bacterium.
本発明により、細菌を用いて、嫌気又は微好気条件でＬ−グルタミン酸系アミノ酸を生産することが可能となる。本発明によれば、嫌気又は微好気条件での発酵が可能となるため、発酵装置の酸素供給能力に依存せず、高密度培養による発酵生産が可能となる。 According to the present invention, L-glutamic acid amino acids can be produced using bacteria under anaerobic or microaerobic conditions. According to the present invention, since fermentation under anaerobic or microaerobic conditions is possible, fermentation production by high-density culture is possible without depending on the oxygen supply capacity of the fermentation apparatus.
以下、本発明を詳細に説明する。
＜１＞本発明の細菌
本発明の細菌は、嫌気又は微好気条件下でＬ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−プロリン、Ｌ−オルニチン、Ｌ−シトルリン、及びＬ−アルギニンからなる群より選ばれるＬ−アミノ酸生産能を有する微生物である。これらのアミノ酸は、Ｌ−グルタミン酸系アミノ酸とも呼ばれ、Ｌ−グルタミン酸、又はＬ−グルタミン酸を前駆体として生合成され得るＬ−アミノ酸である。また、本発明細書において、特記しない限り、「Ｌ−アミノ酸」は、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−プロリン、Ｌ−オルニチン、Ｌ−シトルリン、又はＬ−アルギニンを意味する。
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
<1> Bacteria of the Present Invention The bacteria of the present invention are selected from the group consisting of L-glutamic acid, L-glutamine, L-proline, L-ornithine, L-citrulline, and L-arginine under anaerobic or microaerobic conditions. It is a microorganism having L-amino acid producing ability. These amino acids are also called L-glutamic acid-based amino acids and are L-amino acids that can be biosynthesized using L-glutamic acid or L-glutamic acid as a precursor. In addition, unless otherwise specified, in the present specification, “L-amino acid” means L-glutamic acid, L-glutamine, L-proline, L-ornithine, L-citrulline, or L-arginine.
本発明の細菌は、具体的には、Ｌ−アミノ酸生産能を有し、かつ、かつ、NADHによる阻害を受けないクエン酸シンターゼの活性が増大するように改変された細菌である。 Specifically, the bacterium of the present invention is a bacterium modified to increase the activity of citrate synthase that has L-amino acid-producing ability and is not inhibited by NADH.
本発明の細菌の一形態は、NADHによる阻害を受けないクエン酸シンターゼの活性が増大し、かつ、乳酸デヒドロゲナーゼ、アセトラクテートデカルボキシラーゼ、ホスフェートアセチルトランスフェラーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ及びアルコールデヒドロゲナーゼからなる群より選ばれる１又は２以上の酵素の活性が低下するように改変された細菌である。 One form of the bacterium of the present invention has an increased activity of citrate synthase that is not inhibited by NADH, and is selected from the group consisting of lactate dehydrogenase, acetolactate decarboxylase, phosphate acetyltransferase, malate dehydrogenase, and alcohol dehydrogenase Bacteria modified to reduce the activity of one or more enzymes.
本発明の細菌の更なる形態は、NADHによる阻害を受けないクエン酸シンターゼの活性が増大し、かつ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ活性が増大するように改変された細菌である。 A further form of the bacterium of the present invention is a bacterium that has been modified to increase the activity of citrate synthase that is not inhibited by NADH and to increase the activity of phosphoenolpyruvate carboxykinase.
本発明の細菌の更なる形態は、NADHによる阻害を受けないクエン酸シンターゼの活性が増大し、乳酸デヒドロゲナーゼ、アセトラクテートデカルボキシラーゼ、ホスフェートアセチルトランスフェラーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ及びアルコールデヒドロゲナーゼからなる群より選ばれる１又は２以上の酵素の活性が低下し、かつ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ活性が増大するように改変された細菌である。
A further form of the bacterium of the present invention has an increased activity of citrate synthase that is not inhibited by NADH and is selected from the group consisting of lactate dehydrogenase, acetolactate decarboxylase, phosphate acetyltransferase, malate dehydrogenase and
本発明の細菌は、Ｌ−アミノ酸生産能を有する細菌に、上記のような改変を施すことによって得ることができる。また、上記のように改変された細菌に、Ｌ−アミノ酸生産能を付与することによっても取得することができる。 The bacterium of the present invention can be obtained by modifying the bacterium having L-amino acid producing ability as described above. It can also be obtained by imparting L-amino acid-producing ability to the bacteria modified as described above.
「Ｌ−アミノ酸生産能」とは、本発明の細菌を培地中で培養したときに、Ｌ−アミノ酸を細胞又は培地から回収できる程度に、細胞又は培地中に蓄積する能力をいう。本発明の細菌が生産するＬ−アミノ酸は、１種であってもよく、２種またはそれ以上のＬ−アミノ酸であってもよい。 The “L-amino acid-producing ability” refers to the ability to accumulate L-amino acids in cells or medium to such an extent that L-amino acids can be recovered from the cells or medium when the bacterium of the present invention is cultured in the medium. The L-amino acid produced by the bacterium of the present invention may be one kind or two or more L-amino acids.
Ｌ−アミノ酸生産能を有する細菌としては、本来的にＬ−アミノ酸生産能を有するものであってもよいが、変異法や組換えDNA技術を利用してＬ−アミノ酸生産能が付与された細菌であってもよく、又、Ｌ−アミノ酸生産能が増大するように改変された細菌であってもよい。 Bacteria having L-amino acid-producing ability may originally have L-amino acid-producing ability, but bacteria imparted with L-amino acid-producing ability using a mutation method or recombinant DNA technology It may also be a bacterium modified to increase L-amino acid production ability.
また、酵素の「活性が増大する」とは、もともと該酵素を有している細菌において、該酵素の活性が増大すること、及び、該酵素を有していない細菌に該酵素の活性を付与することの両方を含む。酵素活性が増大するとは、親株や野生株等の非改変株に比べて細胞当たりの酵素分子の数が増加した場合や、酵素分子当たりの活性が上昇した場合などが該当する。なお、比較対象となる野生株としては、例えばエンテロバクター・アエロゲネスではエンテロバクター・アエロゲネスATCC13048などが挙げられる。 In addition, “increasing the activity” of an enzyme means that the activity of the enzyme is increased in a bacterium that originally has the enzyme, and that the activity of the enzyme is imparted to a bacterium that does not have the enzyme. Including both to do. An increase in enzyme activity corresponds to a case where the number of enzyme molecules per cell is increased or an activity per enzyme molecule is increased as compared to an unmodified strain such as a parent strain or a wild strain. Examples of wild strains to be compared include, for example, Enterobacter aerogenes ATCC13048 in Enterobacter aerogenes.
さらに、酵素の「活性が低下する」とは、該酵素の活性が野生株又は親株等の非改変株に対して低下していることを意味し、活性が完全に消失していることを含む。 Furthermore, “the activity of the enzyme is reduced” means that the activity of the enzyme is reduced relative to an unmodified strain such as a wild strain or a parent strain, and includes that the activity is completely lost. .
＜１−１＞Ｌ−アミノ酸生産能の付与、及びＬ−アミノ酸生産能が付与された微生物
以下に、細菌にＬ−アミノ酸生産能を付与する方法、及び、本発明で使用することのできるＬ−アミノ酸生産能が付与された微生物を例示する。ただし、嫌気条件下で炭素源を消費し、Ｌ−アミノ酸生産能を有する限り、これらに制限されない。
<1-1> Giving L-amino acid-producing ability and microorganism to which L-amino acid-producing ability is imparted Hereinafter, a method for imparting L-amino acid-producing ability to bacteria, and L that can be used in the present invention -Illustrate microorganisms imparted with amino acid-producing ability. However, as long as the carbon source is consumed under anaerobic conditions and has the ability to produce L-amino acids, it is not limited thereto.
本発明に用いる細菌の親株としては、エシェリヒア（Escherichia）属、エンテロバクター（Enterobacter）属、パントエア（Pantoea）、クレブシエラ（Klebsiella）属、ラウルテラ（Raoultella）属、セラチア（Serratia）属、エルビニア（Erwinia）属、サルモネラ（Salmonella）属、モルガネラ（Morganella）属などのγ−プロテオバクテリアに属する腸内細菌や、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、ミクロバクテリウム属に属するいわゆるコリネ型細菌、アリサイクロバチルス（Alicyclobacillus）属、バチルス（Bacillus）属、サッカロマイセス（Saccharomyces）属等に属する微生物が挙げられる。γ−プロテオバクテリアは、NCBI（National Center for Biotechnology Information）タキソノミーデータベースhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?mode=Undef&id=1236&lvl=3&p=mapview&p=has_linkout&p=blast_url&p=genome_blast
&lin=f&keep=1&srchmode=1&unlock）に開示されている分類にしたがって分類される細菌が利用出来る。
As the parent strain of the bacterium used in the present invention, the genus Escherichia, Enterobacter, Pantoea, Klebsiella, Raoultella, Serratia, Erwinia Enterobacteria belonging to γ-proteobacteria such as genus, Salmonella genus, Morganella genus, so-called coryneform bacteria belonging to the genus Brevibacterium, Corynebacterium, Microbacterium, Alicyclobacillus Examples include microorganisms belonging to the genus (Alicyclobacillus), the genus Bacillus, the genus Saccharomyces and the like. γ-Proteobacteria is NCBI (National Center for Biotechnology Information) taxonomy database http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?mode=Undef&id=1236&lvl=3&p=mapview&p=has_linkout&p = blast_url & p = genome_blast
Bacteria classified according to the classification disclosed in & lin = f & keep = 1 & srchmode = 1 & unlock) can be used.
γ−プロテオバクテリアに属する腸内細菌は通性嫌気性菌であり、嫌気条件下での糖の発酵では混合酸発酵やブタンジオール発酵を行なう（The Microbial World 5th Edition 微生物学 培風館 19章）。このとき、主として乳酸、酢酸、コハク酸、蟻酸（又はCO2とH2）、エタノール、ブタンジオールが生成する。最終産物の量比は菌株によって著しく異なる。しかし、基本的には解糖系（エムデンーマイヤーホフ径路）などでの基質レベルのリン酸化によりATPを生産する点、また、その時生じたNAD(P)Hなどの中間電子受容体が再酸化され、細胞内での酸化還元バランスが維持されるように最終産物の量比を調整している点は共通している。 γ- intestinal bacteria belonging to the Proteobacteria are facultative anaerobic bacteria, the fermentation of sugar under anaerobic conditions for mixing acid fermentation and butanediol fermentation (The Microbial World 5 th Edition microbiological Baifukan chapter 19). At this time, mainly lactic acid, acetic acid, succinic acid, formic acid (or CO 2 and H 2 ), ethanol, and butanediol are produced. The quantity ratio of the final product varies significantly depending on the strain. However, basically, ATP is produced by phosphorylation at the substrate level in glycolysis (Emden-Meyerhof pathway), and the intermediate electron acceptors such as NAD (P) H are reoxidized. In addition, the amount ratio of the final product is adjusted so that the redox balance in the cell is maintained.
γ−プロテオバクテリアに属する腸内細菌は、分類学的に非常に近縁である（Harada H. and Ishikawa H. 1997. J. Gen. Appl. Microbiol. 43: 355-361; Kwon S.W. et al. 1997. Int. J. Syst. Bacteriol. 47: 1061-1067）。近年、DNA-DNAハイブリダイゼーション実験等により、エンテロバクター属に属する細菌には、パントエア・アグロメランス（Pantoea agglomerans）又はパントエア・ディスパーサ(Pantoea dispersa)等に再分類されているものがある（Gavini, F. et al. 1989. Int. J. Syst. Bacteriol. 39: 337-345）。また、エルビニア属に属する細菌にはパントエア・アナナス（Pantoea ananas）、パントエア・スチューアルティに再分類されているものがある（Mergaert, J. et al. 1993. Int. J. Syst. Bacteriol. 43: 162-173 参照）。 Enterobacteria belonging to γ-proteobacteria are taxonomically very closely related (Harada H. and Ishikawa H. 1997. J. Gen. Appl. Microbiol. 43: 355-361; Kwon SW et al. 1997. Int. J. Syst. Bacteriol. 47: 1061-1067). In recent years, bacteria belonging to the genus Enterobacter have been reclassified as Pantoea agglomerans or Pantoea dispersa by DNA-DNA hybridization experiments (Gavini, F. et al. 1989. Int. J. Syst. Bacteriol. 39: 337-345). In addition, some bacteria belonging to the genus Erbinia have been reclassified as Pantoea ananas and Pantoea stealty (Mergaert, J. et al. 1993. Int. J. Syst. Bacteriol. 43: 162-173).
エシェリヒア属細菌としては、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）等が挙げられる。エシェリヒア・コリを遺伝子工学的手法を用いて育種する場合には、エシェリヒア・コリK-12株及びその誘導体であるエシェリヒア・コリ MG1655株（ATCC 47076）、及びW3110株（ATCC 27325）を用いることができる。エシェリヒア・コリK-12株は、1922年にスタンフォード大学で分離されたものであり、λファージの溶原菌であるとともに、F因子を持ち、接合等遺伝的組み換え体の作製が可能である汎用性の高い菌株である。またエシェリヒア・コリK-12株のゲノム配列は既に決定されており、遺伝子情報も自由に利用出来る。エシェリヒア・コリK-12株や、誘導株を入手するには、例えばアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ATCC）より入手することができる（住所ATCC, Address: P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, United States of America）。すなわち各菌株に対応する登録番号が付与されており、この登録番号を利用して分譲を受けることが出来る。各菌株に対応する登録番号は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションのカタログに記載されている。以下に記載する、ATCC番号が付与された他の菌株についても同様である。 Examples of bacteria belonging to the genus Escherichia include Escherichia coli. When breeding Escherichia coli using genetic engineering techniques, Escherichia coli K-12 strain and its derivatives, Escherichia coli MG1655 strain (ATCC 47076), and W3110 strain (ATCC 27325) may be used. it can. Escherichia coli K-12 strain was isolated at Stanford University in 1922. It is a lysogen of λ phage and has F factor and can be used to produce genetic recombinants such as conjugation. It is a highly bacterial strain. The genomic sequence of Escherichia coli K-12 has already been determined, and genetic information can be freely used. To obtain Escherichia coli K-12 strain and derivative strain, for example, it can be obtained from American Type Culture Collection (ATCC, Address: PO Box 1549, Manassas, VA 20108, United States of America). That is, the registration number corresponding to each strain is given, and it can receive distribution using this registration number. The registration number corresponding to each strain is described in the catalog of American Type Culture Collection. The same applies to other strains to which ATCC numbers are assigned as described below.
エンテロバクター属細菌としては、エンテロバクター・アグロメランス（Enterobacter
agglomerans）、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）等が挙げられる。具体的には、欧州特許出願公開0952221号に例示された菌株を使用することが出来る。エンテロバクター属の代表的な株として、エンテロバクター・アグロメランスATCC12287株やエンテロバクター・アエロゲネスATCC13048株、エンテロバクター・アエロゲネスNBRC 12010株（Biotechnol Bioeng. 2007 Mar 27;98(2):340-348）、エンテロバクター・アエロゲネス AJ110637 (FERM P-21348)株等が挙げられる。また、エンテロバクター・アエロゲネス AJ110637株は、平成19年8月22日付で独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に受託番号FERM P-21348として寄託されている。
Enterobacter is an Enterobacter bacterium.
agglomerans) and Enterobacter aerogenes. Specifically, a strain exemplified in European Patent Application Publication No. 0952221 can be used. Representative strains of the genus Enterobacter include Enterobacter agglomerans ATCC 12287, Enterobacter aerogenes ATCC 13048, Enterobacter aerogenes NBRC 12010 (Biotechnol Bioeng. 2007 Mar 27; 98 (2): 340-348), Entero Examples include Bacter Aerogenes AJ110637 (FERM P-21348). In addition, Enterobacter Aerogenes AJ110637 was issued on August 22, 2007 by the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Biological Depositary Center (1st, 1st East, 1-chome, Tsukuba City, Ibaraki, 305-8566, Japan). Has been deposited under the accession number FERM P-21348.
パントエア属細菌の代表的な菌株として、パントエア・アナナティス（Pantoea ananatis）、パントエア・スチューアルティ（Pantoea stewartii）パントエア・アグロメラン
ス、パントエア・シトレア（Pantoea citrea）が挙げられる。具体的には、下記の菌株が挙げられる。
As typical strains of the genus Pantoea, Pantoea ananatis, Pantoea stewartii, Pantoea agglomerans, Pantoea citrea are listed. Specifically, the following strains are mentioned.
パントエア・アナナティスAJ13355株（FERM BP-6614）(欧州特許出願公開0952221号)
パントエア・アナナティスAJ13356株（FERM BP-6615）(欧州特許出願公開0952221号)
尚、これらの菌株は、欧州特許出願公開0952221号にはエンテロバクター・アグロメランスとして記載されているが、現在では、上記のとおり、16S rRNAの塩基配列解析などにより、パントエア・アナナティスに再分類されている。
Pantoea Ananatis AJ13355 (FERM BP-6614) (European Patent Application Publication No. 0952221)
Pantoea Ananatis AJ13356 (FERM BP-6615) (European Patent Application Publication No. 0952221)
Although these strains are described as Enterobacter agglomerans in European Patent Application Publication No. 0952221, they are currently reclassified as Pantoea Ananatis by 16S rRNA nucleotide sequence analysis and the like as described above. Yes.
エルビニア属細菌としては、エルビニア・アミロボーラ（Erwinia amylovora）、エルビニア・カロトボーラ（Erwinia carotovora）が挙げられ、クレブシエラ属細菌としては、クレブシエラ・オキシトカ(Klebsiella oxytoca)、クレブシエラ・プランティコーラ（Klebsiella planticola）が挙げられ、ラウルテラ属細菌としては、ラウルテラ・テリゲナ（Raoultella terrigena）、ラウルテラ・プランティコーラ（Raoultella planticola）が挙げられる。
具体的には、下記の菌株が挙げられる。
Examples of Erwinia bacteria include Erwinia amylovora and Erwinia carotovora. Examples of Klebsiella bacteria include Klebsiella oxytoca and Klebsiella planticola. Examples of the bacteria belonging to the genus Raulterra include Raoultella terrigena and Raoultella planticola.
Specifically, the following strains are mentioned.
エルビニア・アミロボーラ ATCC15580株
エルビニア・カロトボーラ ATCC15713株
クレブシエラ・プランティコーラAJ13399株（FERM BP-6600）(欧州特許出願公開0955368号)
クレブシエラ・プランティコーラAJ13410株（FERM BP-6617）(欧州特許出願公開0955368号)
ラウルテラ・プランティコーラ ATCC33531株
尚、AJ13399株及びAJ13410株は、寄託当時はクレブシエラ・プランティコーラとして分類されていたが、現在ではクレブシエラ・プランティコーラはラウルテラ・プランティコーラに分類されている（Drancourt, M. 2001. Int J Syst Evol Microbiol. 51:925-32）。
Elvinia Amilobola ATCC15580 Strain Elvinia Carotobola ATCC15713 Strain Klebsiella Planticola AJ13399 (FERM BP-6600) (European Patent Application Publication No. 0955368)
Klebsiella Planticola AJ13410 (FERM BP-6617) (European Patent Application Publication No. 0955368)
Raulterra Planticola ATCC33531 shares AJ13399 and AJ13410 shares were classified as Klebsiella Planticola at the time of deposit, but now Klebsiella Planticola is classified as Raulterra Planticola ( Drancourt, M. 2001. Int J Syst Evol Microbiol. 51: 925-32).
本発明でいうコリネ型細菌は、バージーズ・マニュアル・オブ・デターミネイティブ・バクテリオロジー（Bergey's Manual of Determinative Bacteriology）第8版599頁（1974）に定義されている一群の微生物であり、好気性、グラム陽性、非抗酸性、胞子形成能を有しない桿菌であって、従来ブレビバクテリウム属に分類されていたが現在コリネバクテリウム属細菌として統合された細菌を含み（Liebl, W., Ehrmann, M., Ludwig, W., and Schleifer, K. H. 1991, Int. J. Syst. Bacteriol. 41: 255-260）、またコリネバクテリウム属と非常に近縁なブレビバクテリウム属細菌及びミクロバテリウム属細菌を含む。 The coryneform bacterium referred to in the present invention is a group of microorganisms defined in Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8th edition, page 599 (1974), aerobic, Gram-positive, non-acid-fast, non-spore-forming gonococci, including bacteria previously classified as genus Brevibacterium but integrated as Corynebacterium (Liebl, W., Ehrmann, M., Ludwig, W., and Schleifer, KH 1991, Int. J. Syst. Bacteriol. 41: 255-260), Brevibacterium and Microbatterium, which are very closely related to Corynebacterium Contains bacteria.
Ｌ−グルタミン酸等のＬ−アミノ酸の製造に好適に用いられるコリネ型細菌としては、例えば以下に示すものが挙げられる。
コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム
コリネバクテリウム・アセトグルタミカム
コリネバクテリウム・アルカノリティカム
コリネバクテリウム・カルナエ
コリネバクテリウム・グルタミカム
コリネバクテリウム・リリウム（コリネバクテリウム・グルタミカム）
コリネバクテリウム・メラセコーラ
コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス（コリネバクテリウム・エフィシエンス）
コリネバクテリウム・ハーキュリス
ブレビバクテリウム・ディバリカタム（コリネバクテリウム・グルタミカム）
ブレビバクテリウム・フラバム（コリネバクテリウム・グルタミカム）
ブレビバクテリウム・インマリオフィラム
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（コリネバクテリウム・グルタミカム）
ブレビバクテリウム・ロゼウム
ブレビバクテリウム・サッカロリティカム
ブレビバクテリウム・チオゲニタリス
ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス（コリネバクテリウム・アンモニアゲネス）
ブレビバクテリウム・アルバム
ブレビバクテリウム・セリヌム
ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム
Examples of coryneform bacteria suitably used for the production of L-amino acids such as L-glutamic acid include the following.
Corynebacterium acetoacidophilum Corynebacterium acetoglutamicum Corynebacterium alkanolyticum Corynebacterium carnae Corynebacterium glutamicum Corynebacterium lylium (Corynebacterium glutamicum)
Corynebacterium melasecola Corynebacterium thermoaminogenes (Corynebacterium efficiens)
Corynebacterium herculis Brevibacterium divaricatam (Corynebacterium glutamicum)
Brevibacterium flavum (Corynebacterium glutamicum)
Brevibacterium immariophilum Brevibacterium lactofermentum (Corynebacterium glutamicum)
Brevibacterium roseumum Brevibacterium saccharolyticum Brevibacterium thiogenitalis Brevibacterium ammoniagenes (Corynebacterium ammoniagenes)
Brevibacterium album Brevibacterium cerinum Microbacterium ammonia film
具体的には、下記のような菌株を例示することができる。
コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム ＡＴＣＣ１３８７０
コリネバクテリウム・アセトグルタミカム ＡＴＣＣ１５８０６
コリネバクテリウム・アルカノリティカム ＡＴＣＣ２１５１１
コリネバクテリウム・カルナエ ＡＴＣＣ１５９９１
コリネバクテリウム・グルタミカム ＡＴＣＣ１３０２０、１３０３２、１３０６０
コリネバクテリウム・リリウム（コリネバクテリウム・グルタミカム） ＡＴＣＣ１５９９０
コリネバクテリウム・メラセコーラ ＡＴＣＣ１７９６５
コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス ＡＪ１２３４０（ＦＥＲＭ ＢＰ−１５３９）
コリネバクテリウム・ハーキュリス ＡＴＣＣ１３８６８
ブレビバクテリウム・ディバリカタム（コリネバクテリウム・グルタミカム） ＡＴＣＣ１４０２０
ブレビバクテリウム・フラバム（コリネバクテリウム・グルタミカム） ＡＴＣＣ１３８２６、ＡＴＣＣ１４０６７
ブレビバクテリウム・インマリオフィラム ＡＴＣＣ１４０６８
ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタム（コリネバクテリウム・グルタミカム） ＡＴＣＣ１３６６５、ＡＴＣＣ１３８６９
ブレビバクテリウム・ロゼウム ＡＴＣＣ１３８２５
ブレビバクテリウム・サッカロリティカム ＡＴＣＣ１４０６６
ブレビバクテリウム・チオゲニタリス ＡＴＣＣ１９２４０
ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス（コリネバクテリウム・アンモニアゲネス） ＡＴＣＣ６８７１
ブレビバクテリウム・アルバム ＡＴＣＣ１５１１１
ブレビバクテリウム・セリヌム ＡＴＣＣ１５１１２
ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム ＡＴＣＣ１５３５４
Specifically, the following strains can be exemplified.
Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870
Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 15806
Corynebacterium alkanolyticum ATCC21511
Corynebacterium carnae ATCC 15991
Corynebacterium glutamicum ATCC 13020, 13032, 13060
Corynebacterium lilium (Corynebacterium glutamicum) ATCC 15990
Corynebacterium melasecola ATCC 17965
Corynebacterium thermoaminogenes AJ12340 (FERM BP-1539)
Corynebacterium herculis ATCC 13868
Brevibacterium divaricatam (Corynebacterium glutamicum) ATCC14020
Brevibacterium flavum (Corynebacterium glutamicum) ATCC 13826, ATCC 14067
Brevibacterium immariophilum ATCC 14068
Brevibacterium lactofermentum (Corynebacterium glutamicum) ATCC 13665, ATCC 13869
Brevibacterium roseum ATCC 13825
Brevibacterium saccharolyticum ATCC 14066
Brevibacterium thiogenitalis ATCC 19240
Brevibacterium ammoniagenes (Corynebacterium ammoniagenes) ATCC6871
Brevibacterium album ATCC15111
Brevibacterium cerinum ATCC 15112
Microbacterium ammonia film ATCC15354
Ｌ−グルタミン酸生産菌
上述したような微生物にＬ−グルタミン酸生産能を付与又は増強するための改変の方法としては、例えば、Ｌ−グルタミン酸生合成に関与する酵素をコードする遺伝子の発現が増大するように改変する方法を挙げることができる。発現が増大するとは、親株や野生株等の非改変株に比べて細胞当たりの酵素分子の数が増加した場合や、酵素分子当たりの活性が上昇した場合などが該当する。
L-glutamic acid-producing bacteria As a modification method for imparting or enhancing L-glutamic acid-producing ability to the microorganism as described above, for example, the expression of a gene encoding an enzyme involved in L-glutamic acid biosynthesis is increased. Can be mentioned. The expression increases when the number of enzyme molecules per cell is increased or when the activity per enzyme molecule is increased compared to an unmodified strain such as a parent strain or a wild strain.
Ｌ−グルタミン酸生合成に関与する酵素としては、例えば、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（以下、「ＧＤＨ」ともいう）（gdhA）、クエン酸シンターゼ（以下、「ＣＳ」ともいう）、グルタミンシンテターゼ(glnA)、グルタミン酸シンターゼ(gltAB)、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（以下、「PEPC」ともいう）(ppc)、ピルビン酸カルボ
キシラーゼ(pyc)、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ(aceEF, lpdA)、ギ酸アセチルトランスフェラーゼ（ピルビン酸−ギ酸リアーゼ）(pfl)、ピルビン酸キナーゼ(pykA, pykF)、ホスホエノールピルビン酸シンターゼ(ppsA)、エノラーゼ(eno)、ホスホグリセルムターゼ(pgmA, pgmI)、ホスホグリセリン酸キナーゼ(pgk)、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ(gapA)、トリオースリン酸イソメラーゼ(tpiA)、フルトースビスリン酸アルドラーゼ(fbp)、ホスホフルクトキナーゼ(pfkA, pfkB）、グルコースリン酸イソメラーゼ(pgi)、６−ホスホグルコン酸デヒドラターゼ(edd）、２−ケト−３−デオキシ−６−ホスホグルコン酸アルドラーゼ(eda）、トランスヒドロゲナーゼ（pntAB）などが挙げられる。尚、酵素名の後のカッコ内は、遺伝子名である（以下の記載においても同様）。これらの酵素の中では、ＰＥＰＣ又はＧＤＨが好ましく、ＰＥＰＣ及びＧＤＨの両方がより好ましい。
尚、本発明の細菌は、NADHによる阻害を受けないクエン酸シンターゼの活性が増大しており、NADHによる阻害を受けるクエン酸シンターゼを保持している必要はないが、NADHによる阻害を受けるクエン酸シンターゼを保持していてよく、同酵素の活性が増大していても差支えない。
Examples of enzymes involved in L-glutamate biosynthesis include glutamate dehydrogenase (hereinafter also referred to as “GDH”) (gdhA), citrate synthase (hereinafter also referred to as “CS”), glutamine synthetase (glnA), and glutamate synthase. (gltAB), phosphoenolpyruvate carboxylase (hereinafter also referred to as “PEPC”) (ppc), pyruvate carboxylase (pyc), pyruvate dehydrogenase (aceEF, lpdA), formate acetyltransferase (pyruvate-formate lyase) (pfl ), Pyruvate kinase (pykA, pykF), phosphoenolpyruvate synthase (ppsA), enolase (eno), phosphoglycerum mutase (pgmA, pgmI), phosphoglycerate kinase (pgk), glyceraldehyde-3-phosphorus Acid dehydrogenase (gapA), triose phosphate isomerase (tpiA), fructose Phosphoaldolase (fbp), phosphofructokinase (pfkA, pfkB), glucose phosphate isomerase (pgi), 6-phosphogluconate dehydratase (edd), 2-keto-3-deoxy-6-phosphogluconate aldolase ( eda), transhydrogenase (pntAB) and the like. The parentheses after the enzyme name are gene names (the same applies to the following description). Among these enzymes, PEPC or GDH is preferable, and both PEPC and GDH are more preferable.
In addition, the bacterium of the present invention has an increased activity of citrate synthase that is not inhibited by NADH, and it is not necessary to retain citrate synthase that is inhibited by NADH, but citrate that is inhibited by NADH. Synthase may be retained, and the activity of the enzyme may be increased.
以下に、上記Ｌ−グルタミン酸生合成に関与する酵素をコードする遺伝子の発現が増大するように微生物を改変する方法について説明する。
１つ目の方法は、目的遺伝子を適当なプラスミド上にクローニングし、得られたプラスミドを用いて宿主微生物を形質転換することにより、該目的遺伝子のコピー数を高める方法である。例えば、目的遺伝子を適当なベクター上にクローニングし、得られたベクターを用いて宿主細菌を形質転換することにより、該遺伝子のコピー数を高めることができる。目的遺伝子は、例えばエシェリヒア属細菌、及びコリネバクテリウム属細菌において、既に塩基配列が明らかにされている場合は、その塩基配列に基づいてプライマーを合成し、染色体DNAを鋳型にしてPCR法により取得することが可能である。グルタミン酸デヒドロゲナーゼとしては、エシェリヒア・コリgdhA遺伝子（Vallea, F. et al. 1984. Gene 27:193-199）、コリネバクテリウム・グルタミカムgdh遺伝子（Bormann, E. R. et al. 1992. Mol. Microbiol. 6:317-326）が知られており、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼとしては、エシェリヒア・コリppc遺伝子（Fujita, N. et al. 1984. J. Biochem.
(Tokyo) 95:909-916）、コリネバクテリウム・グルタミカムppc遺伝子（Eikmanns, B. J. et al. 1989. Mol Gen Genet. 218:330-339）が知られている。クエン酸シンターゼとしては、エシェリヒア・コリgltA遺伝子（Ner, S.S. et al. 1983. Biochemistry. 22:5243-5249）、コリネバクテリウム・グルタミカムgltA遺伝子（Eikmanns B.J. et al. 1994. Microbiology.140 (Pt 8):1817-1828）が知られている。
Hereinafter, a method for modifying a microorganism so that expression of a gene encoding an enzyme involved in L-glutamic acid biosynthesis is increased will be described.
The first method is a method of increasing the copy number of a target gene by cloning the target gene on a suitable plasmid and transforming a host microorganism using the obtained plasmid. For example, the copy number of the gene can be increased by cloning the target gene on an appropriate vector and transforming the host bacterium with the obtained vector. If the base sequence has already been clarified in, for example, Escherichia bacteria or Corynebacterium bacteria, the target gene is synthesized by PCR using the chromosomal DNA as a template based on the primer. Is possible. As glutamate dehydrogenase, Escherichia coli gdhA gene (Vallea, F. et al. 1984. Gene 27: 193-199), Corynebacterium glutamicum gdh gene (Bormann, ER et al. 1992. Mol. Microbiol. 6: 317-326) and phosphoenolpyruvate carboxylase is known as Escherichia coli ppc gene (Fujita, N. et al. 1984. J. Biochem.
(Tokyo) 95: 909-916), Corynebacterium glutamicum ppc gene (Eikmanns, BJ et al. 1989. Mol Gen Genet. 218: 330-339) is known. Examples of citrate synthase include Escherichia coli gltA gene (Ner, SS et al. 1983. Biochemistry. 22: 5243-5249) and Corynebacterium glutamicum gltA gene (Eikmanns BJ et al. 1994. Microbiology. 140 (Pt 8 ): 1817-1828) is known.
形質転換に用いるベクターとしては、使用する微生物で自律複製可能なプラスミドが挙げられる。例えば、腸内細菌群に属する微生物の中で自律複製可能なプラスミドとして、pUC19、pUC18、pBR322、RSF1010、pHSG299、pHSG298、pHSG399、pHSG398、pSTV28、pSTV29（pHSG、pSTVはタカラバイオ社より入手可能）、pMW119、pMW118、pMW219、pMW218（pMWはニッポンジーン社より入手可能）等が挙げられる。また、コリネ型細菌用のプラスミドとしては、pAM330(特開昭58-67699号公報)、pHM1519(特開昭58-77895号公報)、pSFK6 (特開2000-262288号公報参照）、pVK7(米国特許出願公開明細書2003-0175912)、pAJ655、pAJ611、pAJ1844(特開昭58-192900号公報)、pCG1(特開昭57-134500号公報)、pCG2（特開昭58-35197号公報）、pCG4、pCG11（特開昭57-183799号公報）、pHK4（特開平5-7491号公報）などが挙げられる。また、これらのベクターからコリネ型細菌中でプラスミドを自律複製可能にする能力を持つDNA断片を取り出し、前記エシェリヒア・コリ用のベクターに挿入すると、エシェリヒア・コリ及びコリネ型細菌の両方で自律複製可能ないわゆるシャトルベクターとして使用することができる。なお、プラスミドの代わりにファージDNAをベクターとして用いてもよい。 Examples of the vector used for transformation include a plasmid capable of autonomous replication with the microorganism used. For example, pUC19, pUC18, pBR322, RSF1010, pHSG299, pHSG298, pHSG399, pHSG398, pSTV28, pSTV29 (pHSG and pSTV are available from Takara Bio Inc.) , PMW119, pMW118, pMW219, pMW218 (pMW is available from Nippon Gene). Further, plasmids for coryneform bacteria include pAM330 (JP 58-67699 A), pHM1519 (JP 58-77895 JP), pSFK6 (see JP 2000-262288 A), pVK7 (US) Patent Application Publication No. 2003-0175912), pAJ655, pAJ611, pAJ1844 (JP 58-192900), pCG1 (JP 57-134500), pCG2 (JP 58-35197), Examples thereof include pCG4, pCG11 (Japanese Patent Laid-Open No. 57-183799), pHK4 (Japanese Patent Laid-Open No. 5-7491). In addition, DNA fragments capable of autonomously replicating plasmids in coryneform bacteria can be extracted from these vectors and inserted into the Escherichia coli vector, allowing autonomous replication in both Escherichia coli and coryneform bacteria. It can be used as a so-called shuttle vector. In addition, phage DNA may be used as a vector instead of a plasmid.
形質転換法としては、例えば、エシェリヒア・コリ K-12について報告されているような、受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してDNAの透過性を増す方法（Mandel, M. and Higa, A. 1970. J. Mol. Biol. 53:159-162）、バチルス・ズブチリスについて報告されているような、増殖段階の細胞からコンピテントセルを調製してDNAを導入する方法（Duncan, C. et al. 1997. Gene 1:153-167）などが挙げられる。あるいは、バチルス・ズブチリス、放線菌類及び酵母について知られているような、DNA受容菌の細胞を、組換えDNAを容易に取り込むプロトプラストまたはスフェロプラストの状態にして組換えDNAをDNA受容菌に導入する方法（Chang, S. and Choen, S.N. 1979. Mol. Gen. Genet. 168:111-115; Bibb, M. et al. 1978. Nature 274:398-400; Hinnen, A. et al. 1978. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:1929-1933）も応用できる。また、電気パルス法（特開平2-207791号公報）によっても、微生物の形質転換を行うこともできる。 As a transformation method, for example, a method in which a recipient cell is treated with calcium chloride to increase DNA permeability as reported for Escherichia coli K-12 (Mandel, M. and Higa, A. 1970). J. Mol. Biol. 53: 159-162), a method of preparing competent cells from cells at the growth stage and introducing DNA as reported for Bacillus subtilis (Duncan, C. et al. 1997. Gene 1: 153-167). Alternatively, DNA-receptive cells, such as those known for Bacillus subtilis, actinomycetes, and yeast, can be placed in a protoplast or spheroplast state that easily incorporates recombinant DNA and the recombinant DNA is introduced into the DNA-receptor. (Chang, S. and Choen, SN 1979. Mol. Gen. Genet. 168: 111-115; Bibb, M. et al. 1978. Nature 274: 398-400; Hinnen, A. et al. 1978. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 1929-1933). Moreover, transformation of microorganisms can also be performed by an electric pulse method (Japanese Patent Laid-Open No. 2-207791).
遺伝子のコピー数を高めることは、目的遺伝子を微生物のゲノムDNA上に多コピー導入することによっても達成できる。微生物のゲノムDNA上に遺伝子を多コピーで導入するには、ゲノムDNA上に多コピー存在する配列を標的に利用して、相同組換え法（MillerI, J.
H. Experiments in Molecular Genetics, 1972, Cold Spring Harbor Laboratory）により行うことができる。ゲノムDNA上に多コピー存在する配列としては、レペティティブDNA、転移因子の端部に存在するインバーテッド・リピートが利用できる。あるいは、特開平2-109985号公報に開示されているように、目的遺伝子をトランスポゾンに搭載してこれを転移させてゲノムDNA上に多コピー導入することも可能である。さらに、Muファージを用いる方法（特開平2-109985号）で宿主ゲノムに目的遺伝子を組み込むこともできる。ゲノム上に目的遺伝子が転移したことの確認は、その遺伝子の一部をプローブとして、サザンハイブリダイゼーションを行うことによって確認出来る。
Increasing the gene copy number can also be achieved by introducing multiple copies of the target gene onto the genomic DNA of the microorganism. In order to introduce multiple copies of a gene into the genomic DNA of a microorganism, a homologous recombination method (Miller I, J.
H. Experiments in Molecular Genetics, 1972, Cold Spring Harbor Laboratory). As a sequence present in multiple copies on genomic DNA, repetitive DNA and inverted repeats present at the end of a transposable element can be used. Alternatively, as disclosed in JP-A-2-109985, a target gene can be mounted on a transposon, transferred, and introduced in multiple copies on genomic DNA. Furthermore, the target gene can also be incorporated into the host genome by a method using Mu phage (Japanese Patent Laid-Open No. 2-109985). Confirmation that the target gene has been transferred onto the genome can be confirmed by Southern hybridization using a part of the gene as a probe.
コピー数は、目的遺伝子の産物の活性を増強できればいずれでもよいが、2コピー以上であることが望ましい。 The number of copies may be any as long as the activity of the target gene product can be enhanced, but it is desirable that the number of copies be two or more.
２つ目の方法は、ゲノムDNA上またはプラスミド上において、目的遺伝子のプロモーター等の発現調節配列を適切な強さのものに置換することによって目的遺伝子の発現を増強させる方法である。例えば、thrプロモーター、lacプロモーター、trpプロモーター、trcプロモーター、pLプロモーター、tacプロモーター等がよく用いられるプロモーターとして知られている。コリネ型細菌における高発現型プロモーターとしては、エロンゲーションファクターTu（EF-Tu）遺伝子tufのプロモーター、コシャペロニンGroES-シャペロニンGroEL、チオレドキシンレダクターゼ、ホスホグリセリン酸ムターゼ、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ等をコードする遺伝子のプロモーターが挙げられる (WO2006/028063号公報、EP1697525号公報)。プロモーターの強度の評価法および強力なプロモーターの例は、GoldsteinとDoiの論文（Goldstein, M. A. and Doi R. H. 1995. Biotechnol. Annu. Rev., 1: 105-128）等に記載されている。 The second method is a method of enhancing the expression of a target gene by replacing an expression regulatory sequence such as a promoter of the target gene with an appropriate strength on genomic DNA or a plasmid. For example, thr promoter, lac promoter, trp promoter, trc promoter, pL promoter, tac promoter and the like are known as frequently used promoters. High expression promoters in coryneform bacteria include the promoter of the elongation factor Tu (EF-Tu) gene tuf, cochaperonin GroES-chaperonin GroEL, thioredoxin reductase, phosphoglycerate mutase, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, etc. Promoters of the genes that code for (WO2006 / 028063, EP1697525). Methods for evaluating promoter strength and examples of strong promoters are described in Goldstein and Doi's paper (Goldstein, MA and Doi R. H. 1995. Biotechnol. Annu. Rev., 1: 105-128).
また、国際公開WO00/18935に開示されているように、遺伝子のプロモーター領域に数塩基の塩基置換を導入し、適切な強度のものに改変することも可能である。発現調節配列の置換は、例えば、温度感受性プラスミドを用いた遺伝子置換と同様にして行うことができる。エシェリヒア・コリや、パントエア・アナナティスに用いることが出来る、温度感受性複製起点を有するベクターとしては、例えばWO 99/03988号国際公開パンフレットに記載の温度感受性プラスミドpMAN997やその誘導体等が挙げられる。また、λファージのレッド・リコンビナーゼ（Red recombinase）を利用した「Redドリブンインテグレーション(Red-driven integration)」と呼ばれる方法（Datsenko, K. A. and Wanner, B. L., 2000. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97: 6640-6645）や、Redドリブンインテグレーション法とλファージ由来の切り出しシステム（Cho, E. H. et al. 2002. J. Bacteriol. 184:
5200-5203）とを組合わせた方法（WO2005/010175号参照）等の直鎖状ＤＮＡを用いる方
法によっても、発現調節配列の置換を行うことができる。なお、発現調節配列の改変は、上述したような遺伝子のコピー数を高める方法と組み合わせてもよい。
Further, as disclosed in International Publication WO00 / 18935, it is possible to introduce a base substitution of several bases into the promoter region of a gene and modify it to have an appropriate strength. The replacement of the expression regulatory sequence can be performed, for example, in the same manner as the gene replacement using a temperature sensitive plasmid. Examples of vectors having a temperature-sensitive replication origin that can be used for Escherichia coli and Pantoea ananatis include the temperature-sensitive plasmid pMAN997 and derivatives thereof described in WO 99/03988 International Publication Pamphlet. In addition, a method called “Red-driven integration” using red recombinase of λ phage (Datsenko, KA and Wanner, BL, 2000. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97: 6640-6645), Red driven integration method and excision system derived from λ phage (Cho, EH et al. 2002. J. Bacteriol. 184:
The expression regulatory sequence can also be replaced by a method using linear DNA such as a method in combination with 5200-5203) (see WO2005 / 010175). The modification of the expression regulatory sequence may be combined with the method for increasing the gene copy number as described above.
さらに、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）と開始コドンとの間のスペーサ、特に開始コドンのすぐ上流の配列における数個のヌクレオチドの置換がmRNAの翻訳効率に非常に影響を及ぼすことが知られており、これらを改変することによって、翻訳量を向上させることが可能である。 Furthermore, it is known that the substitution of several nucleotides in the spacer between the ribosome binding site (RBS) and the start codon, particularly in the sequence immediately upstream of the start codon, greatly affects the translation efficiency of mRNA, It is possible to improve the amount of translation by modifying these.
以上のような方法によりＬ−グルタミン酸生産に関与する遺伝子の発現が増強大するように改変された微生物としては国際公開WO99/07853号パンフレット、欧州特許第1352966号等に記載された微生物が例示できる。 Examples of the microorganism modified so as to enhance the expression of a gene involved in L-glutamic acid production by the method as described above include those described in International Publication No. WO99 / 07853, European Patent No. 1352966, and the like. .
上記プラスミドまたはゲノム上に目的遺伝子を導入する場合、これらの遺伝子を発現させるためのプロモーターは使用する微生物において機能するものであればいかなるプロモーターであっても良く、用いる遺伝子自身のプロモーターであってもよいし、改変したものでもよい。使用する微生物で強力に機能するプロモーターを適宜選択することや、プロモーターの−35、−10領域をコンセンサス配列に近づけることによっても遺伝子の発現量の調節が可能である。以上のような方法により、クエン酸シンターゼ遺伝子、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子、及び／又はグルタミン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の発現が増強するように改変された微生物としては、WO00/18935号パンフレット、欧州特許出願公開1010755号明細書等に記載された微生物が例示できている。 When the target gene is introduced into the plasmid or genome, the promoter for expressing these genes may be any promoter that functions in the microorganism used, or the promoter of the gene itself used. It may be good or modified. The expression level of the gene can also be controlled by appropriately selecting a promoter that functions strongly in the microorganism to be used, or by bringing the −35 and −10 regions of the promoter closer to the consensus sequence. As a microorganism modified so that expression of citrate synthase gene, isocitrate dehydrogenase, pyruvate dehydrogenase gene, and / or glutamate dehydrogenase gene is enhanced by the above method, WO00 / 18935 pamphlet, European patent application Microorganisms described in the specification of the publication No. 1010755 etc. can be exemplified.
上記したような遺伝子の発現を増強する方法は、後述のNADHによる阻害を受けないクエン酸シンターゼ、及びホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼをコードする遺伝子等にも同様に適用することができる。 The above-described method for enhancing gene expression can be similarly applied to a citrate synthase that is not inhibited by NADH described later, a gene encoding phosphoenolpyruvate carboxykinase, and the like.
さらに、コリネ型細菌にＬ−グルタミン酸生産能を付与する方法として、yggB遺伝子(NCgl 1221；NP_600492 [gi:19552490]）を増幅する方法、コード領域内に変異を導入した変異型yggB遺伝子を導入する方法を用いることも可能である（WO2006/070944）。 Furthermore, as a method for imparting L-glutamic acid-producing ability to coryneform bacteria, a method of amplifying the yggB gene (NCgl 1221; NP_600492 [gi: 19552490]), a mutant yggB gene having a mutation introduced into the coding region is introduced. It is also possible to use a method (WO2006 / 070944).
Ｌ−グルタミン酸生産能は、Ｌ−グルタミン酸排出遺伝子であるyhfK遺伝子を増幅することによっても付与することができる（WO2005/085419）。 The ability to produce L-glutamic acid can also be imparted by amplifying the yhfK gene, which is an L-glutamic acid excretion gene (WO2005 / 085419).
Ｌ−グルタミン酸生産能を付与するための改変は、Ｌ−グルタミン酸の生合成経路から分岐して他の化合物を生成する反応を触媒する酵素の活性を低下または欠損させることにより行ってもよい。Ｌ−グルタミン酸の生合成経路から分岐してＬ−グルタミン酸以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素としては、α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ（sucA）、イソクエン酸リアーゼ(aceA)、グルタミン酸デカルボキシラーゼ(gadAB)、１−ピロリン−５−カルボキシレートデヒドロゲナーゼ（putA）などが挙げられる。この中では特に、α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性を低下又は欠損させることが好ましい。 The modification for imparting L-glutamic acid-producing ability may be performed by reducing or eliminating the activity of an enzyme that catalyzes a reaction that branches from the biosynthetic pathway of L-glutamic acid to produce other compounds. As an enzyme that catalyzes a reaction that branches from the biosynthetic pathway of L-glutamic acid to produce a compound other than L-glutamic acid, α-ketoglutarate dehydrogenase (sucA), isocitrate lyase (aceA), glutamate decarboxylase (gadAB) 1-pyrroline-5-carboxylate dehydrogenase (putA) and the like. Among these, it is particularly preferable to reduce or eliminate the α-ketoglutarate dehydrogenase activity.
上記のような酵素の活性を低下または欠損させるには、通常の変異処理法によって、あるいは遺伝子工学的手法によって、上記酵素の遺伝子に、細胞中の当該酵素の活性が低下または欠損するような変異を導入すればよい。変異処理法としては、たとえばＸ線や紫外線を照射する方法、またはＮ−メチル−Ｎ'−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン等の変異剤で処理する方法等がある。遺伝子に変異が導入される部位は、酵素タンパク質をコードするコード領域であってもよく、プロモーター等の発現制御領域であってもよい。また、遺伝子工学的手法には、例えば遺伝子組換え法、形質導入法、細胞融合法等を用いる方法
がある。
In order to reduce or eliminate the activity of the enzyme as described above, a mutation that reduces or eliminates the activity of the enzyme in the cell by a usual mutation treatment method or genetic engineering technique. Should be introduced. Examples of the mutation treatment method include a method of irradiating with X-rays and ultraviolet rays, a method of treating with a mutation agent such as N-methyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidine, and the like. The site where the mutation is introduced into the gene may be a coding region encoding an enzyme protein or an expression control region such as a promoter. Examples of genetic engineering techniques include a method using a gene recombination method, a transduction method, a cell fusion method and the like.
細胞中の目的酵素の活性が低下または欠損していること、および活性の低下の程度は、候補株の菌体抽出液または精製画分の酵素活性を測定し、野生株又は親株などの非改変株と比較することによって確認することができる。例えば、α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性は、Reedらの方法（Reed, L. J. and Mukherjee, B. B. 1969. Methods in Enzymology 13: 55-61）に従って測定することができる。 The activity of the target enzyme in the cell is reduced or deficient, and the degree of the activity reduction is determined by measuring the enzyme activity of the bacterial cell extract or purified fraction of the candidate strain, and not modifying the wild strain or the parent strain, etc. This can be confirmed by comparing with the stock. For example, α-ketoglutarate dehydrogenase activity can be measured according to the method of Reed et al. (Reed, L. J. and Mukherjee, B. B. 1969. Methods in Enzymology 13: 55-61).
エシェリヒア属細菌においてα−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性を欠損もしくは低下させる方法は、特開平5-244970号公報及び特開平7−203980号公報などに記載されている。また、コリネ型細菌においてα−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性を欠損もしくは低下させる方法は、国際公開95/34672号パンフレットに記載されている。さらに、エンテロバクター属細菌については、特開2001-333769号公報に開示されている。 Methods for deleting or reducing the α-ketoglutarate dehydrogenase activity in bacteria belonging to the genus Escherichia are described in JP-A-5-244970 and JP-A-7-203980. A method for deleting or reducing α-ketoglutarate dehydrogenase activity in coryneform bacteria is described in WO95 / 34672. Further, Enterobacter bacteria are disclosed in JP-A-2001-333769.
尚、本発明においては、Ｌ−グルタミン酸生産菌に限られず、α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性が低下していることが好ましい。 In the present invention, the activity of α-ketoglutarate dehydrogenase is preferably reduced without being limited to L-glutamic acid-producing bacteria.
例えば、α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性を低下させるには該酵素のE1oサブユニットをコードするsucA（odhA）遺伝子を改変すればよい。α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性が低下した株として、例えば、以下の株が挙げられる。 For example, to reduce the α-ketoglutarate dehydrogenase activity, the sucA (odhA) gene encoding the E1o subunit of the enzyme may be modified. Examples of strains with reduced α-ketoglutarate dehydrogenase activity include the following strains.
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムΔS株（国際公開95/34672号パンフレット）
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ12821(FERM BP−4172；フランス特許公報9401748号明細書参照)
ブレビバクテリウム・フラバムAJ12822 (FERM BP-4173；フランス特許公報9401748号明細書参照)
コリネバクテリウム・グルタミカムAJ12823(FERM BP-4174；フランス特許公報9401748号明細書参照)
コリネバクテリウム・グルタミカムATCC13869 OAGN、OA2-2、OAGN2-2 （国際公開パンフレット2006/028298号参照）
エシェリヒア・コリAJ12624（FERM BP-3853）
エシェリヒア・コリAJ12628（FERM BP-3854）
エシェリヒア・コリAJ12949（FERM BP-4881）
ブレビバクテリム・ラクトファーメンタム ΔS株 （国際公開95/34672号パンフレット参照）
パントエア・アナナティス AJ13601 (FERM BP-7207 欧州特許公開明細書1078989)
パントエア・アナナティス AJ13356 (FERM BP-6615 米国特許6.331,419号)
パントエア・アナナティス SC17sucA (FERM BP-8646 WO2005/085419)
クレブシエラ・プランティコーラ AJ13410 (FERM BP-6617 米国特許6,197,559号)
Brevibacterium lactofermentum strain ΔS (International pamphlet No. 95/34672)
Brevibacterium lactofermentum AJ12821 (FERM BP-4172; see French Patent Publication 9401748)
Brevibacterium flavum AJ12822 (FERM BP-4173; see French Patent No. 9401748)
Corynebacterium glutamicum AJ12823 (FERM BP-4174; see French Patent Publication 9401748)
Corynebacterium glutamicum ATCC13869 OAGN, OA2-2, OAGN2-2 (see International Publication Pamphlet 2006/028298)
Escherichia coli AJ12624 (FERM BP-3853)
Escherichia coli AJ12628 (FERM BP-3854)
Escherichia coli AJ12949 (FERM BP-4881)
Brevibacterium lactofermentum ΔS strain (see pamphlet of WO 95/34672)
Pantoea Ananatis AJ13601 (FERM BP-7207 European Patent Publication No. 1078989)
Pantoea Ananatis AJ13356 (FERM BP-6615 US Patent 6.331,419)
Pantoea Ananatis SC17sucA (FERM BP-8646 WO2005 / 085419)
Klebsiella Planticola AJ13410 (FERM BP-6617 U.S. Patent No. 6,197,559)
また、パントアエ・アナナティスのＬ−グルタミン酸生産菌として、α-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ（αKGDH）活性が欠損または低下したパントエア属に属する細菌が挙げられる。このような株としては、AJ13355株のαKGDH-E1サブユニット遺伝子（sucA）を欠損させたAJ13356(米国特許第6,331,419号)、及びAJ13355株から粘液質低生産変異株として選択されたSC17株由来のsucA遺伝子欠損株であるSC17sucA(米国特許第6,596,517号)がある。AJ13356は、1998年2月19日、工業技術院生命工学工業技術研究所（現 独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター、〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に受託番号FERM P-16645として寄託され、1999年1月11日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-6616が付与されている。AJ
13355、AJ13356、及び後述のAJ13601株は、上記寄託機関にEnterobacter agglomeransとして寄託されているが、本明細書では、Pantoea ananatisとして記載する。また、SC17sucA株は、ブライベートナンバーAJ417株が付与され、2004年2月26日に産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号FERM BP-08646として寄託されている。
Further, examples of L-glutamic acid-producing bacteria of Pantoae ananatis include bacteria belonging to the genus Pantoea in which α-ketoglutarate dehydrogenase (αKGDH) activity is deficient or reduced. Such strains include AJ13356 (US Pat. No. 6,331,419) in which the αKGDH-E1 subunit gene (sucA) of AJ13355 strain is deleted, and sucA derived from SC17 strain selected from AJ13355 strain as a low mucus production mutant. There is SC17sucA (US Pat. No. 6,596,517) which is a gene-deficient strain. AJ13356 was founded on February 19, 1998, National Institute of Biotechnology, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (currently the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Biological Deposit Center, 1-chome, 1-chome, Tsukuba, Ibaraki, Japan 305-8566 No. 6) was deposited under the deposit number FERM P-16645, transferred to an international deposit under the Budapest Treaty on January 11, 1999, and given the deposit number FERM BP-6616. AJ
13355, AJ13356, and the AJ13601 strain described below have been deposited as Enterobacter agglomerans in the above depository organization, but are described as Pantoea ananatis in this specification. The SC17sucA strain was assigned the private number AJ417 and was deposited at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology as the deposit number FERM BP-08646 on February 26, 2004.
さらに、パントアエ・アナナティスのＬ−グルタミン酸生産菌として、SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB株、AJ13601株、NP106株、及びNA1株が挙げられる。SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB株は、SC17sucA株に、エシェリヒア・コリ由来のクエン酸シンターゼ遺伝子（gltA）、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子（ppsA）、およびグルタメートデヒドロゲナーゼ遺伝子（gdhA）を含むプラスミドRSFCPG、並びに、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム由来のクエン酸シンターゼ遺伝子（gltA）を含むプラスミドpSTVCBを導入して得た株である。AJ13601株は、このSC17sucA/RSFCPG+pSTVCB株から低pH下で高濃度のＬ−グルタミン酸に耐性を示す株として選択された株である。また、NP106株は、実施例に記載したように、AJ13601株からプラスミドRSFCPG+pSTVCBを脱落させた株である。AJ13601株は、1999年8月18日に、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに受託番号FERM P-17516として寄託され、2000年7月6日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-7207が付与されている。 Further, L-glutamic acid-producing bacteria of Pantoae ananatis include SC17sucA / RSFCPG + pSTVCB strain, AJ13601 strain, NP106 strain, and NA1 strain. The SC17sucA / RSFCPG + pSTVCB strain is a plasmid RSFCPG containing the citrate synthase gene (gltA), phosphoenolpyruvate carboxylase gene (ppsA), and glutamate dehydrogenase gene (gdhA) derived from Escherichia coli, This is a strain obtained by introducing a plasmid pSTVCB containing a citrate synthase gene (gltA) derived from bacteria lactofermentum. The AJ13601 strain is a strain selected from this SC17sucA / RSFCPG + pSTVCB strain as a strain resistant to a high concentration of L-glutamic acid at low pH. Further, as described in the Examples, the NP106 strain is a strain obtained by removing the plasmid RSFCPG + pSTVCB from the AJ13601 strain. AJ13601 was deposited on August 18, 1999 at the Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology under the accession number FERM P-17516, and transferred to an international deposit under the Budapest Treaty on July 6, 2000. And the accession number FERM BP-7207 is assigned.
エンテロバクター・アエロゲネスATCC13048株のsucA遺伝子の部分配列（N末端側及びC末端側）を、配列番号３４、３５に示した。エンテロバクター・アエロゲネスのsucA遺伝子は、これらの配列に基づいて欠損させることができる。 The partial sequences (N-terminal side and C-terminal side) of the sucA gene of Enterobacter aerogenes ATCC13048 strain are shown in SEQ ID NOs: 34 and 35. The Enterobacter aerogenes sucA gene can be deleted based on these sequences.
Ｌ−グルタミン酸生産能を付与または増強する別の方法として、有機酸アナログや呼吸阻害剤などへの耐性を付与する方法や、細胞壁合成阻害剤に対する感受性を付与する方法も挙げられる。例えば、モノフルオロ酢酸耐性を付与する方法（特開昭50-113209）、アデニン耐性またはチミン耐性を付与する方法（特開昭57-065198）、ウレアーゼを弱化させる方法（特開昭52-038088）、マロン酸耐性を付与する方法（特開昭52-038088）、ベンゾピロンまたはナフトキノン類への耐性を付与する方法（特開昭56-1889）、HOQNO耐性を付与する方法（特開昭56-140895）、α-ケトマロン酸耐性を付与する方法（特開昭57-2689）、グアニジン耐性を付与する方法（特開昭56-35981）、ペニシリンに対する感受性を付与する方法（特開平4-88994）などが挙げられる。 As another method for imparting or enhancing L-glutamic acid-producing ability, a method for imparting resistance to an organic acid analog, a respiratory inhibitor, or the like, or a method for imparting sensitivity to a cell wall synthesis inhibitor may be mentioned. For example, a method of imparting monofluoroacetic acid resistance (Japanese Patent Laid-Open No. 50-113209), a method of imparting adenine resistance or thymine resistance (Japanese Patent Laid-Open No. 57-065198), and a method of weakening urease (Japanese Patent Laid-Open No. 52-038088) A method for imparting resistance to malonic acid (Japanese Patent Laid-Open No. 52-038088), a method for imparting resistance to benzopyrone or naphthoquinones (Japanese Patent Laid-Open No. 56-1889), a method of imparting HOQNO resistance (Japanese Patent Laid-Open No. 56-140895) ), A method for imparting resistance to α-ketomalonic acid (Japanese Patent Laid-Open No. 57-2689), a method for imparting resistance to guanidine (Japanese Patent Laid-Open No. 56-35981), a method for imparting sensitivity to penicillin (Japanese Patent Laid-Open No. 4-88994), etc. Is mentioned.
このような耐性菌の具体例としては、下記のような菌株が挙げられる。
ブレビバクテリウム・フラバムAJ3949 (FERM BP-2632：特開昭50-113209参照)
コリネバクテリウム・グルタミカムAJ11628 (FERM P-5736；特開昭57-065198参照)
ブレビバクテリウム・フラバムAJ11355(FERM P-5007；特開昭56-1889号公報参照)
コリネバクテリウム・グルタミカムAJ11368(FERM P-5020；特開昭56-1889号公報参照)
ブレビバクテリウム・フラバムAJ11217(FERM P-4318；特開昭57-2689号公報参照)
コリネバクテリウム・グルタミカムAJ11218(FERM P-4319；特開昭57-2689号公報参照)
ブレビバクテリウム・フラバムAJ11564(FERM P-5472；特開昭56-140895公報参照)
ブレビバクテリウム・フラバムAJ11439(FERM P-5136；特開昭56-35981号公報参照)
コリネバクテリウム・グルタミカムH7684(FERM BP-3004；特開平04-88994号公報参照)
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ11426（FERM P-5123；特開平56-048890号公報参照）
コリネバクテリウム・グルタミカムAJ11440（FERM P-5137；特開平56-048890号公報参照）
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ11796（FERM P-6402；特開平58-158192号公報参照）
Specific examples of such resistant bacteria include the following strains.
Brevibacterium flavum AJ3949 (FERM BP-2632: see JP-A-50-113209)
Corynebacterium glutamicum AJ11628 (FERM P-5736; see JP 57-065198)
Brevibacterium flavum AJ11355 (FERM P-5007; see JP-A-56-1889)
Corynebacterium glutamicum AJ11368 (FERM P-5020; see JP 56-1889)
Brevibacterium flavum AJ11217 (FERM P-4318; see JP-A-57-2689)
Corynebacterium glutamicum AJ11218 (FERM P-4319; see JP-A-57-2689)
Brevibacterium flavum AJ11564 (FERM P-5472; see JP 56-140895 A)
Brevibacterium flavum AJ11439 (FERM P-5136; see JP-A-56-35981)
Corynebacterium glutamicum H7684 (FERM BP-3004; see JP 04-88994 A)
Brevibacterium lactofermentum AJ11426 (FERM P-5123; see JP-A-56-048890)
Corynebacterium glutamicum AJ11440 (FERM P-5137; see JP-A-56-048890)
Brevibacterium lactofermentum AJ11796 (FERM P-6402; see JP-A-58-158192)
Ｌ−グルタミン生産菌
Ｌ−グルタミン生産能を有する微生物として好ましい例は、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ活性を強化した細菌、グルタミンシンセターゼ（glnA）活性を強化した細菌、グルタミナーゼ遺伝子を破壊した細菌である（欧州特許出願公開1229121号、1424398号明細書）。グルタミンシンセターゼの活性増強は、グルタミンアデニニルトランスフェラーゼ（glnE）遺伝子の破壊、PII制御タンパク質遺伝子（glnB）の破壊によっても達成できる（EP1229121）。また、エシェリヒア属に属し、グルタミンシンセターゼの397位のチロシン残基が他のアミノ酸残基に置換された変異型グルタミンシンセターゼを有する菌株も好適なＬ−グルタミン生産菌として例示できる（米国特許出願公開第2003-0148474号明細書）。
L-glutamine-producing bacteria Preferred examples of microorganisms having L-glutamine-producing ability include bacteria with enhanced glutamate dehydrogenase activity, bacteria with enhanced glutamine synthetase (glnA) activity, and bacteria with a disrupted glutaminase gene (European patent application) (Publication Nos. 1229121 and 1424398). Enhancement of glutamine synthetase activity can also be achieved by disruption of the glutamine adenylyltransferase (glnE) gene or the PII regulatory protein gene (glnB) (EP1229121). Moreover, a strain having a mutant glutamine synthetase belonging to the genus Escherichia and having a glutamine synthetase at position 397 of the glutamine synthetase substituted with another amino acid residue can be exemplified as a suitable L-glutamine-producing bacterium (US patent application) Publication No. 2003-0148474).
Ｌ−グルタミン生産能を付与または増強する方法として、6-ジアゾ-5-オキソ-ノルロイシン耐性を付与する方法 (特開平3-232497)、プリンアナログ耐性及びメチオニンスルホキシド耐性を付与する方法(特開昭61-202694)、α-ケトマレイン酸耐性を付与する方法(特開昭56-151495)などが挙げられる。Ｌ−グルタミン生産能を有するコリネ型細菌の具体例として、以下の微生物が挙げられる。
ブレビバクテリウム・フラバムAJ11573 (FERM P-5492、特開昭56-161495)
ブレビバクテリウム・フラバムAJ11576 (FERM BP-10381、特開昭56-161495)
ブレビバクテリウム・フラバムAJ12212 (FERM P-8123、特開昭61-202694)
As a method of imparting or enhancing L-glutamine production ability, a method of imparting 6-diazo-5-oxo-norleucine resistance (Japanese Patent Laid-Open No. 3-232497), a method of imparting purine analog resistance and methionine sulfoxide resistance (Japanese Patent Laid-Open No. 61-202694) and a method for imparting resistance to α-ketomaleic acid (Japanese Patent Laid-Open No. 56-151495). Specific examples of coryneform bacteria having the ability to produce L-glutamine include the following microorganisms.
Brevibacterium flavum AJ11573 (FERM P-5492, JP 56-161495)
Brevibacterium flavum AJ11576 (FERM BP-10381, JP 56-161495)
Brevibacterium flavum AJ12212 (FERM P-8123, JP-A-61-202694)
Ｌ−プロリン生産菌
Ｌ−プロリン生産能を有する微生物としては、例えば、Ｌ−プロリンによるフィードバック阻害が解除されたγ−グルタミルキナーゼを保持する細菌や、Ｌ−プロリン分解系が弱化した細菌が挙げられる。Ｌ−プロリンによるフィードバック阻害が解除されたγ−グルタミルキナーゼをコードするDNAを用いて細菌を改変する方法は、DandekarとUratsuの文献（J. Bacteriol. 170, 12: 5943-5945 (1988)）に開示されている。また、Ｌ−プロリン分解系が弱化した細菌を得る方法としては、例えば、プロリンデヒドロゲナーゼ遺伝子に酵素活性を低下させる変異を導入する方法が挙げられる。Ｌ−プロリン生産能を有する細菌の例としては、エシェリヒア・コリ NRRL B-12403株及びNRRL B-12404株 (英国特許 2075056)、エシェリヒア・コリVKPM B-8012株 (米国特許公開2002-0058315)、および、ドイツ特許3127361号に開示されたプラスミド変異体や、Bloom F.R. らの文献 (The 15th Miami winter symposium, 1983, p.34) に開示されたプラスミド変異体などを保持する菌株が挙げられる。
L-proline-producing bacteria Examples of microorganisms having L-proline-producing ability include bacteria that retain γ-glutamyl kinase that has been desensitized to feedback inhibition by L-proline and bacteria that have weakened the L-proline degradation system. . A method for modifying bacteria using a DNA encoding γ-glutamyl kinase desensitized to feedback inhibition by L-proline is described in Dandekar and Uratsu (J. Bacteriol. 170, 12: 5943-5945 (1988)). It is disclosed. Examples of a method for obtaining a bacterium with a weakened L-proline degradation system include a method for introducing a mutation that reduces enzyme activity into the proline dehydrogenase gene. Examples of bacteria having L-proline producing ability include Escherichia coli NRRL B-12403 strain and NRRL B-12404 strain (UK Patent 2075056), Escherichia coli VKPM B-8012 strain (US Patent Publication 2002-0058315), Moreover, strains carrying the plasmid variant disclosed in German Patent No. 3127361, the plasmid variant disclosed in the document of Bloom FR et al. (The 15th Miami winter symposium, 1983, p.34), and the like can be mentioned.
また、Ｌ−プロリン生産能を有する微生物として好ましいものは、3,4-デヒドロキシプロリン、アザチジン−２−カルボキシレート耐性株であるエシェリヒア・コリ702株（VKPMB-8011）や、702のilvA欠損株である702ilvA株（VKPMB-8012株）や、b2682、b2683、b1242又はb3434遺伝子にコードされるタンパク質の活性を増強したE. coli等も挙げられる（特開2002−300874号公報）。 Preferred microorganisms having L-proline-producing ability include Escherichia coli 702 strain (VKPMB-8011) which is resistant to 3,4-dehydroxyproline and azatidine-2-carboxylate, and 702 ilvA-deficient strain. 702ilvA strain (VKPMB-8012 strain), and E. coli having enhanced activity of the protein encoded by b2682, b2683, b1242 or b3434 gene (Japanese Patent Laid-Open No. 2002-300874).
Ｌ−アルギニン生産菌
Ｌ−アルギニン生産能を有する微生物としては、α−メチルメチオニン、ｐ−フルオロフェニルアラニン、Ｄ−アルギニン、アルギニンヒドロキサム酸、Ｓ−（２−アミノエチル）−システイン、α−メチルセリン、β−２−チエニルアラニン、又はスルファグアニジンに耐性を有するエシェリヒア・コリ変異株（特開昭56-106598号公報参照）等が挙げられる。また、Ｌ−アルギニンによるフィードバック阻害に耐性な変異を有し、かつ、高い活性を有するＮ−アセチルグルタミン酸シンターゼを保持するＬ−アルギニン生産菌である、エシェリヒア・コリ237株（ロシア特許出願第2000117677号）も、好適なＬ−アルギニン生産株である。同株は、2000年４月10日にロシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオーガニズム（Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM), GNII Genetika ） にVKPM B-7925の受託番号で寄託され、2001年５月18日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管された。237株の誘導体で
、酢酸資化能を向上させたＬ−アルギニン生産菌である、エシェリヒア・コリ382株（特開2002-017342号公報）を用いることもできる。エシェリヒア・コリ382株は、2000年４月10日にRussian National Collection of Industrial Microorganisms（VKPM）にVKPM B-7926の受託番号で寄託されている。
L-Arginine-producing bacteria As microorganisms having L-arginine-producing ability, α-methylmethionine, p-fluorophenylalanine, D-arginine, arginine hydroxamic acid, S- (2-aminoethyl) -cysteine, α-methylserine, β Examples include Escherichia coli mutants having resistance to 2-thienylalanine or sulfaguanidine (see JP-A-56-106598). Further,
またＬ−アルギニン生産能が付与された微生物として、Ｌ−アルギニン生合成に関与する酵素をコードする遺伝子の発現量を向上させた微生物を用いることが出来る。例えば、Ｌ−アルギニン生合成系酵素しては、Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼ（argA）、Ｎ−アセチルグルタミルリン酸レダクターゼ（argC）、オルニチンアセチルトランスフェラーゼ（argJ）、N-アセチルグルタミン酸キナーゼ（argB）、アセチルオルニチントランスアミナーゼ（argD）、アセチルオルニチンデアセチラーゼ（argE）オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ（argF）、アルギニノコハク酸シンターゼ（argG）、アルギニノコハク酸リアーゼ（argH）カルバモイルリン酸シンターゼ（carAB）から選ばれる１種又は２種以上が挙げられる。N-アセチルグルタミン酸シンターゼ（argA）は、野生型の１５位〜１９位に相当するアミノ酸配列が置換されたＬ−アルギニンによるフィードバック阻害が解除された変異型の遺伝子を用いるとより好適である（欧州出願公開1170361号明細書）。 In addition, as a microorganism to which L-arginine-producing ability is imparted, a microorganism having an improved expression level of a gene encoding an enzyme involved in L-arginine biosynthesis can be used. For example, L-arginine biosynthetic enzymes include N-acetylglutamate synthase (argA), N-acetylglutamyl phosphate reductase (argC), ornithine acetyltransferase (argJ), N-acetylglutamate kinase (argB), acetyl One or more selected from ornithine transaminase (argD), acetylornithine deacetylase (argE) ornithine carbamoyltransferase (argF), argininosuccinate synthase (argG), argininosuccinate lyase (argH) carbamoyl phosphate synthase (carAB) Is mentioned. As for N-acetylglutamate synthase (argA), it is more preferable to use a mutant gene in which feedback inhibition by L-arginine in which the amino acid sequence corresponding to the 15th to 19th positions of the wild type is substituted is released (Europe). Publication No. 1170361).
コリネ型細菌のＬ−アルギニン生産菌としては、 Ｌ−アルギニン生産能を有するコリネ型細菌としては、Ｌ−アルギニン生産能を有するものであれば特に制限されないが、コリネ型細菌野生株；サルファ剤、２−チアゾールアラニン又はα−アミノ−β−ヒドロキシ吉草酸等の薬剤に耐性を有するコリネ型細菌；２−チアゾールアラニン耐性に加えて、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−プロリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−メチオニンまたはＬ−トリプトファン要求性を有するコリネ型細菌（特開昭54-44096号）；ケトマロン酸、フルオロマロン酸又はモノフルオロ酢酸に耐性を有するコリネ型細菌（特開昭57-18989号）；アルギニノールに耐性を有するコリネ型細菌（特開昭62-24075号）；または、Ｘ−グアニジン（Ｘは脂肪酸又は脂肪鎖の誘導体）に耐性を有するコリネ型細菌（特開平2-186995号）等が挙げられる。 The L-arginine-producing bacterium of the coryneform bacterium is not particularly limited as long as it has L-arginine-producing ability, as long as it has L-arginine-producing ability. Coryneform bacterium resistant to drugs such as thiazolealanine or α-amino-β-hydroxyvaleric acid; in addition to 2-thiazolealanine resistance, L-histidine, L-proline, L-threonine, L-isoleucine, L Coryneform bacterium having methionine or L-tryptophan requirement (Japanese Patent Laid-Open No. 54-44096); Coryneform bacterium resistant to ketomalonic acid, fluoromalonic acid or monofluoroacetic acid (Japanese Patent Laid-Open No. 57-18989); Coryneform bacterium resistant to argininol (Japanese Patent Laid-Open No. 62-24075); or X-guanidine (X is an inducer of fatty acid or fatty chain) Coryneform bacterium (Japanese Patent Laid-Open No. 2-186995) or the like which is resistant to the body) and the like.
また、Ｌ−アルギニン生産能を有するコリネ型細菌は、５−アザウラシル、６−アザウラシル、２−チオウラシル、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−アザシトシン、６−アザシトシン等に耐性な変異株；アルギニンヒドロキサメート、２−チオウラシルに耐性な変異株、アルギニンヒドロキサメート及び６−アザウラシルに耐性な変異株（特開昭49-126819号）；ヒスチジンアナログ又はトリプトファンアナログに耐性な変異株（特開昭52-114092号）、メチニオン、ヒスチジン、スレオニン、プロリン、イソロイシイン、リジン、アデニン、グアニンまたはウラシル（またはウラシル前駆体）の少なくとも一つに要求性を有する変異株（特開昭52-99289号参）；アルギニンヒドロキサメートに耐性な変異株（特公昭51-6754号）；コハク酸要求性又は核酸塩基アナログに耐性な変異株（特開昭58-9692号）；アルギニン分解能を欠損し、アルギニンのアンタゴニスト及びカナバニンに耐性を有し、リジンを要求する変異株（特開昭52-8729号）；アルギニン、アルギニンヒドロキサメート、ホモアルギニン、Ｄ−アルギニン、及びカナバニン耐性、またはアルギニンヒドロキサメート及び６−アザウラシル耐性の変異株（特開昭53-143288号）；及び、カナバニン耐性の変異株（特開昭53-3586号）等として育種することができる。
Ｌ−アルギニン生産能を有するコリネ型細菌の具体例としては、下記のような菌株が挙げられる。
Coryneform bacterium having L-arginine-producing ability is a mutant strain resistant to 5-azauracil, 6-azauracil, 2-thiouracil, 5-fluorouracil, 5-bromouracil, 5-azacytosine, 6-azacytosine and the like; Mutants resistant to hydroxamate, 2-thiouracil, mutants resistant to arginine hydroxamate and 6-azauracil (JP 49-126819); mutants resistant to histidine analogs or tryptophan analogs (JP No. 52-114092), a mutant having a requirement for at least one of methionion, histidine, threonine, proline, isoleucine, lysine, adenine, guanine or uracil (or uracil precursor) (see JP-A-52-99289) A mutant resistant to arginine hydroxamate (Japanese Patent Publication No. 51-6754); Mutants that are auxotrophic or resistant to nucleobase analogs (JP-A-58-9692); mutants that lack arginine resolution, are resistant to arginine antagonists and canavanine, and require lysine (JP-A 52-52) Arginine, arginine hydroxamate, homoarginine, D-arginine, and canavanine resistant, or arginine hydroxamate and 6-azauracil resistant mutants (Japanese Patent Laid-Open No. 53-143288); and canavanine resistant It can be bred as a mutant strain (Japanese Patent Laid-Open No. 53-3586).
Specific examples of coryneform bacteria having the ability to produce L-arginine include the following strains.
ブレビバクテリウム・フラバムAJ11169（FERM BP-6892）
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ12092（FERM BP-6906）
ブレビバクテリウム・フラバムAJ11336（FERM BP-6893）
ブレビバクテリウム・フラバムAJ11345（FERM BP-6894）
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ12430（FERM BP-2228）
Brevibacterium flavum AJ11169 (FERM BP-6892)
Brevibacterium lactofermentum AJ12092 (FERM BP-6906)
Brevibacterium flavum AJ11336 (FERM BP-6893)
Brevibacterium flavum AJ11345 (FERM BP-6894)
Brevibacterium lactofermentum AJ12430 (FERM BP-2228)
さらにアルギニンリプレッサーであるArgRを欠損した株(米国特許出願公開2002-0045223号、細胞内のグルタミンシンテターゼ活性を上昇させた株（米国特許出願公開2005-0014236号公報）を使用することが出来る。 Further, a strain lacking ArgR, which is an arginine repressor (US Patent Application Publication No. 2002-0045223, a strain with increased intracellular glutamine synthetase activity (US Patent Application Publication No. 2005-0014236)) can be used.
Ｌ−シトルリン、Ｌ−オルニチンもＬ−アルギニンと生合成経路が共通しており、Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼ（argA）、Ｎ−アセチルグルタミルリン酸レダクターゼ（argC）、オルニチンアセチルトランスフェラーゼ（argJ）、N-アセチルグルタミン酸キナーゼ（argB）、アセチルオルニチントランスアミナーゼ（argD）、アセチルオルニチンデアセチラーゼ（argE）の酵素活性を上昇させることによって、これらの生産能を付与することができる（国際公開2006-35831号パンフレット）。 L-citrulline and L-ornithine share the same biosynthetic pathway as L-arginine, and N-acetylglutamate synthase (argA), N-acetylglutamylphosphate reductase (argC), ornithine acetyltransferase (argJ), N- Production ability of acetylglutamate kinase (argB), acetylornithine transaminase (argD), and acetylornithine deacetylase (argE) can be increased by increasing the enzyme activity (International Publication 2006-35831 pamphlet) .
また、本発明に用いるＬ−アミノ酸生産菌は、固有の生合成系酵素をコードする遺伝子以外に、糖の取り込み、糖代謝（解糖系）、エネルギー代謝に関与する遺伝子が増幅されていてもよい。 In addition, the L-amino acid-producing bacterium used in the present invention may have a gene that is involved in sugar uptake, sugar metabolism (glycolysis), and energy metabolism in addition to a gene encoding a specific biosynthetic enzyme. Good.
糖代謝に関与する遺伝子としては、解糖系酵素をコードする遺伝子や糖の取り込み遺伝子が挙げられ、グルコース６−リン酸イソメラーゼ遺伝子（pgi；国際公開第01/02542号パンフレット）、ホスホエノールピルビン酸シンターゼ遺伝子（pps; 欧州出願公開877090号明細書）、ホスホグルコムターゼ遺伝子（pgm；国際公開03/04598号パンフレット）、フルクトース二リン酸アルドラーゼ遺伝子（pfkBfbp;国際公開03/04664号パンフレット）、ピルビン酸キナーゼ遺伝子（pykF;国際公開03/008609号パンフレット）、トランスアルドラーゼ遺伝子（talB;国際公開03/008611号パンフレット）、フマラーゼ遺伝子（fum;国際公開01/02545号パンフレット）、ホスホエノールピルビン酸シンターゼ遺伝子（pps;欧州出願公開877090号パンフレット）、non-PTSシュクロース取り込み遺伝子遺伝子（csc;欧州出願公開149911号パンフレット）、シュクロース資化性遺伝子（scrABオペロン；国際公開第90/04636号パンフレット）が挙げられる。 Examples of genes involved in sugar metabolism include genes encoding glycolytic enzymes and sugar uptake genes. Glucose 6-phosphate isomerase gene (pgi; WO 01/02542 pamphlet), phosphoenolpyruvate Synthase gene (pps; European application 877090), phosphoglucomutase gene (pgm; WO 03/04598 pamphlet), fructose diphosphate aldolase gene (pfkBfbp; WO 03/04664 pamphlet), pyruvate Kinase gene (pykF; WO 03/008609 pamphlet), transaldolase gene (talB; WO 03/008611 pamphlet), fumarase gene (fum; WO 01/02545 pamphlet), phosphoenolpyruvate synthase gene ( pps; European Application Publication No.877090 pamphlet), non-PTS sucrose incorporation Child gene (csc; European Application Publication 149911 pamphlet), sucrose-assimilating gene (ScrAB operon; WO 90/04636 pamphlet) and the like.
エネルギー代謝に関与する遺伝子としては、トランスヒドロゲナーゼ遺伝子（pntAB;米国特許 5,830,716号明細書）、チトクロムbo型オキシダーゼ（cytochromoe bo type oxidase）遺伝子(cyoB 欧州特許出願公開1070376号明細書)が挙げられる。 Examples of genes involved in energy metabolism include a transhydrogenase gene (pntAB; US Pat. No. 5,830,716) and a cytochrome bo type oxidase gene (cyoB European Patent Application Publication No. 1070376).
また、炭素源としてグリセロールを使用する場合、グリセロールの資化性を高めるために、glpR遺伝子（EP1715056）の発現が弱化されているか、glpA、glpB、glpC、glpD、glpE、glpF、glpG、glpK、glpQ、glpT、glpX、tpiA、gldA、dhaK、dhaL、dhaM、dhaR、fsa及びtalC遺伝子等のグリセロール代謝遺伝子（EP1715055A）の発現が強化されていてもよい。 When glycerol is used as a carbon source, the expression of glpR gene (EP1715056) is weakened or glpA, glpB, glpC, glpD, glpE, glpF, glpG, glpK, Expression of glycerol metabolic genes (EP1715055A) such as glpQ, glpT, glpX, tpiA, gldA, dhaK, dhaL, dhaM, dhaR, fsa and talC genes may be enhanced.
＜１−２＞嫌気又は微好気条件でＬ−アミノ酸を生産する細菌
本発明の細菌は、嫌気又は微好気条件でＬ−アミノ酸を生産する細菌である。具体的には、本発明の細菌は、Ｌ−グルタミン酸系アミノ酸の生産能を有し、かつ、NADHによる阻害を受けないクエン酸シンターゼの活性が増大するように改変された細菌である。
尚、前記したように、細菌がNADHによる阻害を受けないクエン酸シンターゼを有していない場合、同酵素を保持するように改変された微生物は、NADHによる阻害を受けないクエン酸シンターゼの活性が非改変株に比べて増大している。
<1-2> Bacteria that produce L-amino acids under anaerobic or microaerobic conditions The bacteria of the present invention are bacteria that produce L-amino acids under anaerobic or microaerobic conditions. Specifically, the bacterium of the present invention is a bacterium modified to increase the activity of citrate synthase that has an ability to produce an L-glutamic acid amino acid and is not inhibited by NADH.
As described above, when the bacterium does not have citrate synthase that is not inhibited by NADH, the microorganism modified to retain the enzyme has activity of citrate synthase that is not inhibited by NADH. Increased compared to unmodified strains.
＜１−２−１＞NADHによる阻害を受けないクエン酸シンターゼの活性の増強
本発明における「クエン酸シンターゼ」とは、下記反応を触媒する酵素であり、クエン
酸シンターゼの活性とは、この反応を触媒する活性をいう。
<1-2-1> Enhancement of Citrate Synthase Activity Not Inhibited by NADH “Citrate synthase” in the present invention is an enzyme that catalyzes the following reaction, and the activity of citrate synthase refers to this reaction. The activity which catalyzes.
アセチル-CoA + オキサロ酢酸 + H2O → クエン酸 + CoA-SH Acetyl-CoA + oxaloacetic acid + H 2 O → citric acid + CoA-SH
クエン酸シンターゼの活性は、Shiioら（Shiio I. et al. 1977. J. Biochem. 82:395-405）に記載された方法で測定することができる。具体的には、反応液（70 mM Tris-HCl pH8.0, 0.02mMオキサロ酢酸, 0.05mM アチセル-CoA, 0.05 mM 5,5'-ジチオビス(2-ニトロ安息香酸) (DNTB)）に酵素液を添加して反応をスタートさせ、412 nm の吸収光度の増加を測定する。遊離するCoAがDNTBと反応してTNB-とCoA-TNBを生成し、TNB-が412 nmの光を吸収する（ε= 13600M-1cm-1）ことから、吸収光度の変化によりアセチル-CoAの減少を定量できる。酵素活性の1ユニットは反応時間（分）当たり1 μmolのCoAが生成する酵素活性と定義できる。 The activity of citrate synthase can be measured by the method described in Shiio et al. (Shiio I. et al. 1977. J. Biochem. 82: 395-405). Specifically, the reaction solution (70 mM Tris-HCl pH 8.0, 0.02 mM oxaloacetate, 0.05 mM Atithel-CoA, 0.05 mM 5,5'-dithiobis (2-nitrobenzoic acid) (DNTB)) enzyme solution To start the reaction and measure the increase in absorbance at 412 nm. The liberated CoA reacts with DNTB to produce TNB- and CoA-TNB, and TNB- absorbs 412 nm light (ε = 13600M -1 cm -1 ). Can be quantified. One unit of enzyme activity can be defined as the enzyme activity produced by 1 μmol CoA per reaction time (minutes).
「NADHによる阻害を受けないクエン酸シンターゼ」とは、クエン酸シンターゼの活性がNADHの存在により低下しないか、又は、NADHによる阻害を受けるクエン酸シンターゼ、例えばエシェリヒア・コリのgltAによりコードされるクエン酸シンターゼよりも、同じ濃度のNADH存在下での比活性が高いクエン酸シンターゼを意味する。具体的には例えば、精製された酵素を用いて酵素活性を測定したときに、0.2mMのNADH存在下では反応が阻害されないクエン酸シンターゼが挙げられる。または、NADH非存在下でのクエン酸シンターゼ活性に比べて、1mMのNADH存在下でのクエン酸シンターゼ活性の減少が5%以下、好ましくは3%以下であるか、より好ましくは活性が阻害されないクエン酸シンターゼである。NADHに阻害されないクエン酸シンターゼとしては、例えば、以下の細菌が持つクエン酸シンターゼが挙げられる（Weitzman P.D.J. 1981. Adv. Microb. Pysiol. 22:185-244）。 “Citrate synthase not subject to inhibition by NADH” means that the activity of citrate synthase does not decrease due to the presence of NADH or a citrate synthase that is inhibited by NADH, for example, a citrate synthase encoded by gltA of Escherichia coli. It means citrate synthase having higher specific activity in the presence of the same concentration of NADH than acid synthase. Specifically, for example, citrate synthase whose reaction is not inhibited in the presence of 0.2 mM NADH when enzyme activity is measured using a purified enzyme. Or, compared to citrate synthase activity in the absence of NADH, the decrease in citrate synthase activity in the presence of 1 mM NADH is 5% or less, preferably 3% or less, or more preferably, the activity is not inhibited. Citrate synthase. Examples of citrate synthase that is not inhibited by NADH include citrate synthase possessed by the following bacteria (Weitzman P.D.J. 1981. Adv. Microb. Pysiol. 22: 185-244).
アクロモバクター・リケファシエンス（Acromobacter liquefaciens）
アースロバクター・アトロシアネウス（Arthrobacter atrocyaneus）
アースロバクター・グロビフォルミス（Arthrobacter globiformis）
アースロバクター・ニコチアナエ（Arthrobacter nicotianae）
バチルス・セレウス（Bacillus cereus）
バチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）
バチルス・ポリミキサ（Bacillus polymyxa）
バチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus）
バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）
ブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacterium flavum）
ブレビバクテリウム・リネンス（Brevibacterium linens）
セルロモナス・セラシア（cellasea）
クロストリジウム・アシディ−ウリチ（Clostridium acidi-urici）
コリネバクテリウム・エクイ（Corynebacterium equi）
コリネバクテリウム・ファシアンス（Corynebacterium fascians）
コリネバクテリウム・ミシガネンセ（Corynebacterium michiganense）
ヘモフィルス・ヴァジナリス（Haemophilus vaginalis）
クルシア・ゾプフイィ（Kurthia zopfii）
ミクロバクテリウム・サーモスファクタム（Microbacterium thermosphactum）
ミクロコッカス・ルテウス（Micrococcus luteus）
ミクロコッカス・エスピー．（Micrococcus sp.）
マイコバクテリウム・フレイ（Micobacterium phlei）
マイコバクテリウム・ロドクラス（Micobacterium rhodochrous）
マイコバクテリウム・スメグマティス（Micobacterium smegmatis）
ノカルディア・コラリナ（Nocardia corallina）
ノカルディア・ファルシニカ（Nocardia farcinica）
シュードモナス・イソジナム（Pseudomonas isodinum）
スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）
ストレプトマイセス・ソマリエンシス（Streptomyces somaliensis）
ストレプトマイセス・ヴィリドクロモジェンス（Streptomyces viridochromogens）
Acromobacter liquefaciens
Arthrobacter atrocyaneus
Arthrobacter globiformis
Arthrobacter nicotianae
Bacillus cereus
Bacillus megaterium
Bacillus polymyxa
Bacillus stearothermophilus
Bacillus subtilis
Brevibacterium flavum
Brevibacterium linens
Cellulomonas therasia (cellasea)
Clostridium acidi-urici
Corynebacterium equi
Corynebacterium fascians
Corynebacterium michiganense
Haemophilus vaginalis
Kurthia zopfii
Microbacterium thermosphactum
Micrococcus luteus
Micrococcus sp. (Micrococcus sp.)
Mycobacterium phlei
Mycobacterium rhodochrous
Mycobacterium smegmatis
Nocardia corallina
Nocardia farcinica
Pseudomonas isodinum
Staphylococcus aureus
Streptomyces somaliensis
Streptomyces viridochromogens
NADHによる阻害を受けるクエン酸シンターゼとしては、例えば、以下の細菌が持つクエン酸シンターゼが挙げられる（Weitzman P.D.J. 1981. Adv. Microb. Pysiol. 22:185-244）。 Examples of citrate synthase that is inhibited by NADH include citrate synthase possessed by the following bacteria (Weitzman P.D.J. 1981. Adv. Microb. Pysiol. 22: 185-244).
アエロモナス・フォルミカンス（Aeromonas formicans）
アリゾナ・アリゾナエ（Arizona arizonae）
エルヴィニア・ウレドボーラ（Eriwinia uredovora）
エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）
ハフィニア・アルヴェイ（Hafinia alvei）
クレブシエラ（アエロバクター）・アエロゲネス（Klebsiella (Aerobacter) aerogenes）
クレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae）
パストレラ・シュードツベルクローシス（Pasteurella pseudotuberculosis）
プロテウス・レットゲリ（Proteus rettgeri）
プロテウス・ヴルガリス（Proteus vulgaris）
サルモネラ・アナタム（anatum）
サルモネラ・コレラ−スイス（cholerae-suis）
サルモネラ・チフィムリウム（typhimurium）
セラチア・マルセセンス（Serrtia marcescens）
チオバチルス Ａ２（Thiobacilus A2）
Aeromonas formicans
Arizona arizonae
Erwinia uredovora
Escherichia coli
Hafinia alvei
Klebsiella (Aerobacter) aerogenes
Klebsiella pneumoniae
Pasteurella pseudotuberculosis
Proteus rettgeri
Proteus vulgaris
Salmonella anatum
Salmonella cholera-Switzerland (cholerae-suis)
Salmonella typhimurium
Serrtia marcescens
Thiobacilus A2
エシェリヒア・コリのprpC遺伝子によりコードされるメチルクエン酸シンターゼは、クエン酸シンターゼ活性を有し、NADHによる阻害を受けないことが知られており、本発明に好適に使用することができる。 Methyl citrate synthase encoded by the Escherichia coli prpC gene is known to have citrate synthase activity and is not inhibited by NADH, and can be suitably used in the present invention.
エシェリヒア・コリ W3110株ののprpC遺伝子の塩基配列、及び同遺伝子がコードするメチルクエン酸シンターゼのアミノ酸配列を、配列番号７５、７６に示す。 The nucleotide sequence of the prpC gene of Escherichia coli W3110 strain and the amino acid sequence of methyl citrate synthase encoded by the gene are shown in SEQ ID NOs: 75 and 76, respectively.
prpC遺伝子は、NADHによる阻害を受けないクエン酸シンターゼをコードする限り、上記配列を有する遺伝子に限られず、そのホモログであってもよく、yzzD、yahSと名付けられている場合がある。prpC遺伝子ホモログとは、他の微生物由来で、エシェリヒア・コリのprpC遺伝子と高い相同性を有し、かつ、クエン酸シンターゼ活性を持つ遺伝子をいう。他の微生物由来のprpC遺伝子ホモログとしては、配列番号７６のアミノ酸配列全体に対して好ましくは80%以上、より好ましくは90%以上、さらに好ましくは95%以上、特に好ましくは97%以上の相同性を有し、かつ、クエン酸シンターゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。尚、本明細書において、「相同性」（homology）」は、「同一性」（identity）を指すことがある The prpC gene is not limited to the gene having the above sequence as long as it encodes citrate synthase that is not inhibited by NADH, and may be a homologue thereof, and may be named yzzD or yahS. The prpC gene homolog is a gene derived from another microorganism, having high homology with the Escherichia coli prpC gene and having citrate synthase activity. The prpC gene homologue derived from other microorganisms is preferably 80% or more, more preferably 90% or more, still more preferably 95% or more, particularly preferably 97% or more homology with respect to the entire amino acid sequence of SEQ ID NO: 76. And a gene encoding a protein having citrate synthase activity. In the present specification, “homology” may refer to “identity”.
アミノ酸配列および塩基配列の相同性は、例えばKarlin and AltschulによるアルゴリズムBLAST（Karlin, S. and Altschul, S. F. 1993. Pro. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873）やFASTA（Pearson W.R. 1990. Methods Enzymol. 183:63-98）を用いて決定することができる。このアルゴリズムBLASTに基づいて、BLASTNやBLASTXとよばれるプログラムが開発されている (http://www.ncbi.nlm.nih.govbi.nlm.nih.gov参照)。 The homology of the amino acid sequence and the base sequence is determined by, for example, the algorithm BLAST (Karlin, S. and Altschul, SF 1993. Pro. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873) by FA and (Pearson WR 1990. Methods Enzymol). 183: 63-98). Based on this algorithm BLAST, programs called BLASTN and BLASTX have been developed (see http://www.ncbi.nlm.nih.govbi.nlm.nih.gov).
prpC遺伝子は、コードされるタンパク質がNADHによる阻害を受けないクエン酸シンター
ゼ活性を有する限り、配列番号７６のアミノ酸配列において、１若しくは複数の位置での１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加等を含む配列を有する保存的バリアントをコードする変異体又は人為的な改変体であってもよい。ここで、「数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によっても異なるが、好ましくは１から２０個、より好ましくは１から１０個、特に好ましくは１から５個である。また、このようなアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、または逆位等には、pckA遺伝子を保持する微生物の個体差、種の違いに基づく場合などの天然に生じる変異（mutant又はvariant）によって生じるものも含まれる。
The prpC gene has one or several amino acid substitutions, deletions at one or more positions in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 76, as long as the encoded protein has citrate synthase activity that is not inhibited by NADH. It may be a mutant encoding a conservative variant having a sequence including insertion or addition, or an artificial modification. Here, “several” varies depending on the position and type of the amino acid residue in the three-dimensional structure of the protein, but is preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, particularly preferably 1 to 5. is there. In addition, such amino acid substitutions, deletions, insertions, additions, or inversions are naturally occurring mutations (mutants or variants) such as those based on individual differences or species differences of the microorganisms that carry the pckA gene. Also included by
上記置換は機能的に変化しない中性変異である保存的置換が好ましい。保存的変異とは、置換部位が芳香族アミノ酸である場合には、phe,trp,tyr間で、置換部位が疎水性アミノ酸である場合には、leu,ile,val間で、極性アミノ酸である場合には、gln,asn間で、塩基性アミノ酸である場合には、lys,arg,his間で、酸性アミノ酸である場合には、asp,glu間で、ヒドロキシル基を持つアミノ酸である場合には、ser,thr間でお互いに置換する変異である。より具体的には、保存的置換としては、alaからser又はthrへの置換、argからgln、his又はlysへの置換、asnからglu、gln、lys、his又はaspへの置換、aspからasn、glu又はglnへの置換、cysからser又はalaへの置換、glnからasn、glu、lys、his、asp又はargへの置換、gluからgly、asn、gln、lys又はaspへの置換、glyからproへの置換、hisからasn、lys、gln、arg又はtyrへの置換、ileからleu、met、val又はpheへの置換、leuからile、met、val又はpheへの置換、lysからasn、glu、gln、his又はargへの置換、metからile、leu、val又はpheへの置換、pheからtrp、tyr、met、ile又はleuへの置換、serからthr又はalaへの置換、thrからser又はalaへの置換、trpからphe又はtyrへの置換、tyrからhis、phe又はtrpへの置換、及び、valからmet、ile又はleuへの置換が挙げられる。 The substitution is preferably a conservative substitution which is a neutral mutation that does not change functionally. A conservative mutation is a polar amino acid between phe, trp, and tyr when the substitution site is an aromatic amino acid, and between leu, ile, and val when the substitution site is a hydrophobic amino acid. In the case of a basic amino acid between gln and asn, between lys, arg and his, in the case of an acidic amino acid, between asp and glu, when the amino acid has a hydroxyl group Is a mutation that substitutes between ser and thr. More specifically, conservative substitutions include ala to ser or thr, arg to gln, his or lys, asn to glu, gln, lys, his or asp, asp to asn , Glu or gln, cys to ser or ala, gln to asn, glu, lys, his, asp or arg, glu to gly, asn, gln, lys or asp, gly Replacement from to pro, replacement from his to asn, lys, gln, arg or tyr, replacement from ile to leu, met, val or phe, replacement from leu to ile, met, val or phe, lys to asn , Glu, gln, his or arg, met to ile, leu, val or phe, phe to trp, tyr, met, ile or leu, ser to thr or ala, thr Substitution from ser to ala, trp to phe or tyr, tyr to his, phe or trp, and val to met, ile or leu.
さらに、prpC遺伝子は、導入する宿主により遺伝暗号の縮重性が異なるので、prpCが導入される宿主で使用しやすいコドンに置換したものでもよい。同様にprpC遺伝子は、NADHによる阻害を受けないクエン酸シンターゼをコードする限り、N末端側、及び／又はC末端側が延長したタンパク質、あるいは削られているタンパク質をコードする遺伝子でもよい。例えば延長・削除する長さは、アミノ酸残基で50以下、好ましくは20以下、より好ましくは10以下、特に好ましくは5以下である。より具体的には、配列番号７６のアミノ酸配列のＮ末端側50アミノ酸から5アミノ酸、又はＣ末端側50アミノ酸から5アミノ酸が延長又は削除されたタンパク質をコードする遺伝子でもよい。 Furthermore, since the degeneracy of the genetic code differs depending on the host into which the prpC gene is introduced, the prpC gene may be replaced with a codon that is easy to use in the host into which prpC is introduced. Similarly, as long as the prpC gene encodes citrate synthase that is not inhibited by NADH, the prpC gene may be a gene encoding a protein with an extended N-terminal side and / or C-terminal side or a truncated protein. For example, the length to be extended / deleted is 50 or less, preferably 20 or less, more preferably 10 or less, and particularly preferably 5 or less in terms of amino acid residues. More specifically, it may be a gene encoding a protein in which 5 amino acids have been extended or deleted from the 50 amino acids on the N-terminal side or 5 amino acids from the 50 amino acids on the C-terminal side of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 76.
上記のような保存的バリアントをコードする遺伝子は、例えば、部位特異的変異法によって、コードされるタンパク質の特定の部位のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入または付加を含むように配列番号７５の塩基配列を改変することによって取得することができる。また、以下のような従来知られている変異処理によっても取得され得る。変異処理としては、pckA遺伝子をヒドロキシルアミン等でインビトロ処理する方法、および該遺伝子を保持する微生物、例えばコリネ型細菌を、紫外線またはN-メチル-N’-ニトロ-N-ニトロソグアニジン(NTG)もしくはエチルメタンスルフォネート（EMS）等の通常変異処理に用いられている変異剤によって処理する方法、エラープローンPCR(Cadwell,R.C. PCR Meth. Appl.
2, 28(1992))、DNA shuffling(Stemmer,W.P. Nature 370, 389(1994))、StEP-PCR(Zhao,H. Nature Biotechnol. 16, 258(1998))によって、遺伝子組換えにより人工的にprpC遺伝子に変異を導入する方法が挙げられる。
A gene encoding a conservative variant as described above is represented by SEQ ID NO: 75 so that the amino acid residue at a specific site of the encoded protein contains a substitution, deletion, insertion or addition, for example, by site-directed mutagenesis. It can be obtained by modifying the base sequence. It can also be obtained by a conventionally known mutation treatment as follows. Mutation treatment includes in vitro treatment of the pckA gene with hydroxylamine and the like, and microorganisms carrying the gene, such as coryneform bacteria, with ultraviolet light or N-methyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidine (NTG) or A method using a mutagen that is usually used for mutagenesis, such as ethyl methanesulfonate (EMS), error prone PCR (Cadwell, RC PCR Meth. Appl.
2, 28 (1992)), DNA shuffling (Stemmer, WP Nature 370, 389 (1994)), StEP-PCR (Zhao, H. Nature Biotechnol. 16, 258 (1998)). A method for introducing a mutation into the prpC gene can be mentioned.
また、prpC遺伝子は、配列番号７５の塩基配列に相補的な配列、又は同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつNADHによる阻害を受けないクエン酸シンターゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡが挙げられる。ここで、「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。「ストリンジェントな条件」と
は、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。一例を示せば、相同性が高いＤＮＡ同士、例えば80％以上、好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上、特に好ましくは97％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼ−ションの洗いの条件である60℃、1×SSC，0.1% SDS、好ましくは、0.1×SSC、0.1% SDSさらに好ましくは、68℃、0.1×SSC、0.1% SDSに相当する塩濃度、温度で、１回より好ましくは２〜３回洗浄する条件が挙げられる。
The prpC gene has a citrate synthase activity that hybridizes with a probe complementary to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 75, or a probe that can be prepared from the nucleotide sequence under stringent conditions and is not inhibited by NADH. DNA which codes the protein which has is mentioned. Here, “stringent conditions” refers to conditions under which so-called specific hybrids are formed and non-specific hybrids are not formed. “Stringent conditions” refers to conditions under which so-called specific hybrids are formed and non-specific hybrids are not formed. For example, DNAs having high homology, for example, 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, particularly preferably 97% or more, are hybridized to each other. 60 ° C., 1 × SSC, 0.1% SDS, preferably 0.1 × SSC, 0.1% SDS, which is a condition that DNAs having low homology do not hybridize with each other, or washing conditions for normal Southern hybridization The conditions include washing at a salt concentration and temperature corresponding to 68 ° C., 0.1 × SSC, 0.1% SDS, and more preferably once to 2-3 times.
プローブとして、配列番号７５に相補的な塩基配列の一部の配列を用いることもできる。そのようなプローブは、これらの塩基配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとし、これらの配列を含むＤＮＡ断片を鋳型とするＰＣＲによって作製することができる。例えば、プローブとして、300bp程度の長さのＤＮＡ断片を用いる場合には、ハイブリダイゼーションの洗いの条件は、50℃、2×SSC、0.1% SDSが挙げられる。 A partial sequence of a base sequence complementary to SEQ ID NO: 75 can also be used as a probe. Such probes can be prepared by PCR using oligonucleotides prepared based on these base sequences as primers and DNA fragments containing these sequences as templates. For example, when a DNA fragment having a length of about 300 bp is used as a probe, hybridization washing conditions include 50 ° C., 2 × SSC, and 0.1% SDS.
上記遺伝子ホモログ及び保存的変異に関する記載は、本明細書に記載された他の酵素遺伝子についても同様に適用される。 The above descriptions regarding gene homologues and conservative mutations are similarly applied to other enzyme genes described herein.
上記のようなNADHによる阻害を受けないクエン酸シンターゼの活性は、前記のＬ−グルタミン酸生合成に関与する酵素と同様にして増大させることができる。 The activity of citrate synthase that is not inhibited by NADH as described above can be increased in the same manner as the enzyme involved in L-glutamate biosynthesis.
＜１−２−２＞乳酸デヒドロゲナーゼ、アセトラクテートデカルボキシラーゼ、ホスフェートアセチルトランスフェラーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、又はアルコールデヒドロゲナーゼの活性の低下
本発明の細菌は、NADHによる阻害を受けないクエン酸シンターゼの活性が増大していることに加えて、さらに、乳酸デヒドロゲナーゼ（EC1.1.1.27）（以下、「LDH」ともいう）、アセトラクテートデカルボキシラーゼ（EC4.1.1.5）（以下、「ALD」ともいう）、ホスフェートアセチルトランスフェラーゼ（EC2.3.1.8）（以下、「PTA」ともいう）、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（EC1.1.1.37）（以下、「MDH」ともいう）、及び、アルコールデヒドロゲナーゼ（EC1.1.1.1）（以下、「ADH」ともいう）から選ばれる１又は２以上の酵素の活性が低下していることが好ましい。
<1-2-2> Decrease in activity of lactate dehydrogenase, acetolactate decarboxylase, phosphate acetyltransferase, malate dehydrogenase, or alcohol dehydrogenase The bacterium of the present invention has an increased activity of citrate synthase that is not inhibited by NADH. In addition, lactate dehydrogenase (EC1.1.1.27) (hereinafter also referred to as “LDH”), acetolactate decarboxylase (EC4.1.1.5) (hereinafter also referred to as “ALD”), phosphate Acetyltransferase (EC 2.3.1.8) (hereinafter also referred to as “PTA”), malate dehydrogenase (EC 1.1.1.37) (hereinafter also referred to as “MDH”), and alcohol dehydrogenase (EC 1.1.1.1) It is preferable that the activity of one or more enzymes selected from (hereinafter also referred to as “ADH”) is reduced. That's right.
活性を低下させる酵素の組合わせは特に制限されないが、ADHとMDHの一方の活性は低下させないことが好ましい。解糖系によりグルコースからホスホエノールピルビン酸が生成する際に、NAD+がNADHに還元される。アルコールデヒドロゲナーゼ及びリンゴ酸デヒドロゲナーゼは、NADHからNAD+への再酸化に働く。したがって、解糖系で生じたNADHを嫌気又は微好気条件下で再酸化するためには、ADHとMDHの一方の活性は維持されることが好ましいと考えられる。 The combination of the enzymes that reduce the activity is not particularly limited, but it is preferable not to reduce the activity of one of ADH and MDH. NAD + is reduced to NADH when phosphoenolpyruvate is produced from glucose by the glycolytic system. Alcohol dehydrogenase and malate dehydrogenase serve to reoxidize NADH to NAD + . Therefore, in order to reoxidize NADH produced in glycolysis under anaerobic or microaerobic conditions, it is considered preferable to maintain the activity of one of ADH and MDH.
エシェリヒア・コリのLDH、ALD、PTA、MDH、及びADHは、各々ldh、aldC、pta、mdh、adhE遺伝子によってコードされている。本明細書では、他の細菌のこれらの遺伝子のホモログも、同じ遺伝子名で呼ぶ。 Escherichia coli LDH, ALD, PTA, MDH, and ADH are encoded by the ldh, aldC, pta, mdh, and adhE genes, respectively. In the present specification, homologues of these genes of other bacteria are also referred to by the same gene name.
酵素活性を低下させる方法は、上述したα−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性を低下させる方法と同様にして行うことができる。
具体的には例えば、標的酵素の活性を低下または欠損させるには、通常の変異処理法によって、ゲノムの該酵素遺伝子に、細胞中の該酵素の活性が低下するような変異を導入すればよい。例えば、遺伝子組換えによって、ゲノム上の酵素をコードする遺伝子を欠損させたり、プロモーターやシャインダルガルノ（SD）配列等の発現調節配列を改変したりすることなどによって達成される。また、ゲノム上の標的酵素をコードする領域にアミノ酸置換（ミスセンス変異）を導入すること、また終始コドンを導入すること（ナンセンス変
異）、一〜二塩基付加・欠失するフレームシフト変異を導入すること、遺伝子の一部分あるいは全領域を欠失させることによっても達成出来る（Journal of Biological Chemistry 272:8611-8617（1997）。また、遺伝子破壊、例えばコード領域が欠失したような変異型酵素をコードする遺伝子を構築し、相同組換えなどによって、ゲノム上の正常型酵素遺伝子を置換すること、又は、トランスポゾン、IS因子を該遺伝子に導入することによっても標的酵素の活性を低下または欠損させることができる。
The method for reducing the enzyme activity can be carried out in the same manner as the method for reducing the α-ketoglutarate dehydrogenase activity described above.
Specifically, for example, in order to reduce or eliminate the activity of the target enzyme, a mutation that reduces the activity of the enzyme in the cell may be introduced into the enzyme gene of the genome by a usual mutation treatment method. . For example, it can be achieved by deleting a gene encoding an enzyme on the genome by genetic recombination or by modifying an expression regulatory sequence such as a promoter or Shine-Dalgarno (SD) sequence. In addition, amino acid substitution (missense mutation) is introduced into the region encoding the target enzyme on the genome, a termination codon is introduced (nonsense mutation), and a frameshift mutation that adds or deletes 1 to 2 bases is introduced. (Journal of Biological Chemistry 272: 8611-8617 (1997). Also, gene disruption, for example, coding for a mutant enzyme in which the coding region is deleted) The target enzyme activity may be reduced or deleted by replacing the normal enzyme gene on the genome by homologous recombination, or by introducing a transposon or IS factor into the gene. it can.
例えば、標的酵素の活性を低下させるような変異を遺伝子組換えにより導入する為には、以下のような方法が用いられる。標的酵素遺伝子の部分配列を改変し、正常に機能する酵素を産生しないようにした変異型遺伝子を作製し、該遺伝子を含むＤＮＡで形質転換し、変異型遺伝子と染色体上の遺伝子で組換えを起こさせることにより、ゲノム上の標的遺伝子を変異型に置換することが出来る。このような相同組換えを利用した遺伝子置換による部位特異的変異導入は既に確立しており、DatsenkoとWannerによって開発された「Redドリブンインテグレーション(Red-driven integration)」と呼ばれる方法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, vol. 97, No. 12, p6640-6645）や、Redドリブンインテグレーション法とλファージ由来の切り出しシステム（Cho, E. H., Gumport, R. I., Gardner, J. F. J. Bacteriol. 184: 5200-5203 (2002)）とを組合わせた方法（WO2005/010175）等の直鎖状ＤＮＡを用いる方法や温度感受性複製起点を含むプラスミドを用いる方法などがある（米国特許第6303383号、又は特開平05-007491号、WO2005/010175）。また、上述のような相同組換えを利用した遺伝子置換による部位特異的変異導入は、宿主中で複製能力を持たないプラスミドを用いても行うことが出来る。 For example, in order to introduce a mutation that reduces the activity of the target enzyme by gene recombination, the following method is used. Modify the partial sequence of the target enzyme gene to create a mutant gene that does not produce a normally functioning enzyme, transform with the DNA containing the gene, and recombine with the mutant gene and the gene on the chromosome. By causing it to occur, the target gene on the genome can be replaced with a mutant type. Site-directed mutagenesis by gene replacement using such homologous recombination has already been established, and a method called “Red-driven integration” developed by Datsenko and Wanner (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, vol. 97, No. 12, p6640-6645), Red driven integration method and λ phage-derived excision system (Cho, EH, Gumport, RI, Gardner, JFJ Bacteriol. 184: 5200 -5203 (2002)) and the like (WO2005 / 010175), a method using linear DNA, a method using a plasmid containing a temperature sensitive replication origin (US Pat. No. 6,303,383, or 05-007491, WO2005 / 010175). In addition, site-directed mutagenesis by gene replacement using homologous recombination as described above can also be performed using a plasmid that does not have replication ability in the host.
変異型遺伝子を得るための遺伝子断片は、例えば、公知の遺伝子配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとし、目的とする細菌のゲノムＤＮＡを鋳型として用いたPCRによって、取得することができる。エンテロバクター・アエロゲネスATCC13048株のadhE、mdh、ldh、pta、及びaldC遺伝子の部分配列（N末側配列及びC末側配列）は、配列番号３０、３１、３８、３９、４２、４３、４６、４７、５１、及び５２に示した。後述の実施例に示すように、これらの配列に基づいて、各遺伝子を欠損させることができる。 A gene fragment for obtaining a mutant gene can be obtained, for example, by PCR using an oligonucleotide prepared based on a known gene sequence as a primer and genomic DNA of the target bacterium as a template. The partial sequences (N-terminal sequence and C-terminal sequence) of adhE, mdh, ldh, pta, and aldC genes of Enterobacter aerogenes ATCC13048 strain are SEQ ID NOs: 30, 31, 38, 39, 42, 43, 46, 47, 51, and 52. As shown in the Examples described later, each gene can be deleted based on these sequences.
各々の酵素活性は、野生株又は親株等の非改変株に比べて低下していればよいが、菌体当りの活性として10%以下に低下していることが好ましく、完全に消失していることがより好ましい。 Each enzyme activity only needs to be lower than that of an unmodified strain such as a wild strain or a parent strain, but the activity per cell is preferably decreased to 10% or less, and is completely lost. It is more preferable.
各々の酵素活性が低下したことは、改変株と非改変株の各々の酵素活性を測定することによって確認することができる。
LDH活性は、例えば、Stolzenbach, F. 1966. Meth. Enzymol. 9:278-288に記載された方法でLDH活性を測定することができる。
ALD活性は、例えば、Juni, E. 1952. J. Biol. Chem. 195:715-726に記載された方法で測定することができる。
PTA活性は、例えば、Klotzsch, H. R. 1969. Meth. Enzymol. 12:381-386）に記載された方法で測定することができる。
MDH活性は、例えば、Banaszak, L. J. and Bradshaw, R. A. 1975．The Enzymes (3rd ed.) 11:369-396に記載された方法で測定することができる。
ADH活性は、例えば、Branden, C.-I et al. 1975. The Enzymes (3rd ed.) 11:103-190に記載された方法で測定することができる。
That each enzyme activity fell can be confirmed by measuring each enzyme activity of a modified strain and a non-modified strain.
LDH activity can be measured by the method described in Stolzenbach, F. 1966. Meth. Enzymol. 9: 278-288, for example.
ALD activity can be measured, for example, by the method described in Juni, E. 1952. J. Biol. Chem. 195: 715-726.
PTA activity can be measured, for example, by the method described in Klotzsch, HR 1969. Meth. Enzymol. 12: 381-386).
MDH activity is described, for example, in Banaszak, LJ and Bradshaw, RA 1975. It can be measured by the method described in The Enzymes (3 rd ed.) 11: 369-396.
ADH activity can be measured, for example, by the method described in Branden, C.-I et al. 1975. The Enzymes (3 rd ed.) 11: 103-190.
また、各酵素の活性は、各酵素をコードする遺伝子のmRNAの量を野生株又は親株等の非改変株と比較することによって確認できる。発現量の確認方法としては、ノーザンハイブリダイゼーション、Reverse-Transcriptase PCR（RT-PCR）が挙げられる（Sambrook, J.
et al. 2001. Molecular Cloning A Laboratory Manual/Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York）。また、酵素活性の増大は、酵素タンパク質量が非改変株と比較して増大していることによって確認することができ、例えば抗体を用いてウェスタンブロットによって検出することが出来る（Sambrook, J. et al. 2001. Molecular Cloning A Laboratory Manual/Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York）。
In addition, the activity of each enzyme can be confirmed by comparing the amount of mRNA of the gene encoding each enzyme with an unmodified strain such as a wild strain or a parent strain. Examples of the expression level confirmation method include Northern hybridization and Reverse-Transcriptase PCR (RT-PCR) (Sambrook, J. et al.
et al. 2001. Molecular Cloning A Laboratory Manual / Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York. In addition, the increase in enzyme activity can be confirmed by an increase in the amount of enzyme protein compared to the unmodified strain, and can be detected by Western blotting using, for example, an antibody (Sambrook, J. et al. al. 2001. Molecular Cloning A Laboratory Manual / Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York).
本明細書に記載した他の酵素の活性についても、同様にして増大又は低下していることを確認することができる。 It can be confirmed that the activities of other enzymes described in the present specification are increased or decreased in the same manner.
＜１−２−２＞ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ活性の増強
本発明の細菌は、NADHによる阻害を受けないクエン酸シンターゼの活性が増大していること、又は、NADHによる阻害を受けないクエン酸シンターゼの活性が増大し、かつ、LDH、ALD、PTA、MDH、及びADHから選ばれる１又は２以上の酵素の活性が低下していることに加えて、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ活性が増大していることが好ましい。
<1-2-2> Enhancement of phosphoenolpyruvate carboxykinase activity The bacterium of the present invention has an increased activity of citrate synthase that is not inhibited by NADH, or citrate that is not inhibited by NADH. In addition to increased synthase activity and decreased activity of one or more enzymes selected from LDH, ALD, PTA, MDH, and ADH, increased phosphoenolpyruvate carboxykinase activity. It is preferable.
本発明においてホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（PEPCK）は、ホスホエノールピルビン酸（PEP）から炭酸固定によりオキサロ酢酸（OAA）を生成する反応を可逆的に触媒する酵素である。本発明においてPEPCK活性とは、このPEPからOAAを生成する反応を触媒する活性をいう。本発明に利用するPEPCKは、平衡がPEPからOAAを生産する方向に傾いているものが好ましい。酵素活性は、例えば、Kim等の方法に従い、Sigma Diagnostics ATP Kitを用いて37℃におけるATP生成量を測定する方法で決定できる（Kim, P. et al. 2004. Applied And Environmental Microbiology 70:1238-1241）。 In the present invention, phosphoenolpyruvate carboxykinase (PEPCK) is an enzyme that reversibly catalyzes a reaction for producing oxaloacetate (OAA) from phosphoenolpyruvate (PEP) by carbon fixation. In the present invention, the PEPCK activity refers to an activity that catalyzes a reaction for producing OAA from this PEP. The PEPCK used in the present invention is preferably one whose equilibrium is inclined in the direction of producing OAA from PEP. The enzyme activity can be determined by, for example, a method of measuring the amount of ATP produced at 37 ° C. using Sigma Diagnostics ATP Kit according to the method of Kim et al. (Kim, P. et al. 2004. Applied And Environmental Microbiology 70: 1238- 1241).
PEPCK活性は、野生株又は親株等の非改変株と比較して増大していればいずれでもよいが、例えば非改変株と比べて1.5倍以上、より好ましくは2倍以上、さらに好ましくは3倍以上増大していることが望ましい。 The PEPCK activity may be any as long as it is increased as compared with a non-modified strain such as a wild strain or a parent strain, for example, 1.5 times or more, more preferably 2 times or more, and even more preferably 3 times compared to an unmodified strain. It is desirable to increase more than this.
本発明に使用できるPEPCKをコードする遺伝子としては、アクチノバチルス・サクシノゲネス由来のpckA遺伝子（Genbank Accession No. YP_001343536.1：配列番号７７）、またはこのpckA遺伝子のホモログが挙げられる。pckA遺伝子ホモログとしては、例えば、Haemophilus influenzae（ハエモフィルス・インフルエンザ）のpckA遺伝子（Genbank Accession No. YP_248516.1：配列番号７９）、Pasteurella multocida（パスツレラ・マルトシダ）のpckA遺伝子（Genbank Accession No. NP_246481.1：配列番号８１）、マンヘイミア・サクシニシプロデューセンスのpckA遺伝子（Genbank Accession No. YP_089485.1：配列番号８３）Yersinia pseudotuberculosis（エルシニア・シュードツベルクローシス）のpckA遺伝子（Genbank Accession No. YP_072243 配列番号８５）、Vibrio cholerae（ビブリオ・コレラ）のpckA遺伝子（Genbank Accession No. ZP_01981004.1：配列番号８７）が挙げられる。これらのpckA遺伝子がコードするアミノ酸配列を、配列番号７８、８０、８２、８４、８６、及び８８に示す。 Examples of a gene encoding PEPCK that can be used in the present invention include a pckA gene derived from Actinobacillus succinogenes (Genbank Accession No. YP_001343536.1: SEQ ID NO: 77) or a homologue of this pckA gene. Examples of the pckA gene homologue include the pckA gene of Haemophilus influenzae (Genbank Accession No. YP_248516.1: SEQ ID NO: 79) and the pckA gene of Pasteurella multocida (Genbank Accession No. NP — 246481.1). : SEQ ID NO: 81), pckA gene of Manheimia succinici produced (Genbank Accession No. YP_089485.1: SEQ ID NO: 83) pckA gene of Yersinia pseudotuberculosis (Genbank Accession No. YP_072243 SEQ ID NO: 85) ), PckA gene (Genbank Accession No. ZP — 0981004.1: SEQ ID NO: 87) of Vibrio cholerae. The amino acid sequences encoded by these pckA genes are shown in SEQ ID NOs: 78, 80, 82, 84, 86, and 88.
配列番号７８、８０、８２、８４、８６、及び８８のアミノ酸配列のアラインメントを図１〜３に示す。また、これらのコンセンサス（共通）配列を配列番号８９に示す。前記pckA遺伝子ホモログには、配列番号８９のアミノ酸配列をコードする遺伝子、及び配列番号８９のアミノ酸配列に対して、90%以上、好ましくは95%以上、より好ましくは98%、特に好ましくは99%以上の相同性を有し、かつ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼをコードする遺伝子も含まれる。 An alignment of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 78, 80, 82, 84, 86, and 88 is shown in FIGS. In addition, these consensus (common) sequences are shown in SEQ ID NO: 89. The pckA gene homologue is 90% or more, preferably 95% or more, more preferably 98%, particularly preferably 99% with respect to the gene encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 89 and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 89. A gene having the above homology and encoding phosphoenolpyruvate carboxykinase is also included.
pckA遺伝子は、上記のとおり、既にいくつかの配列が明らかにされているので、それら
の塩基配列に基づいて作製したプライマーを用いて得ることができる。例えば、配列番号２２及び２３に示すプライマーを用いて、アクチノバチルス・サクシノゲネスの染色体DNAを鋳型とするPCR法（PCR：polymerase chain reaction； White,T.J. et al., Trends Genet. 5, 185 (1989)参照）によって、アクチノバチルス・サクシノゲネスのpckAのコード領域と、その制御領域を含む隣接領域を取得することができる。アクチノバチルス・サクシノゲネスの具体例としては、130Z（ATCC55618）株が挙げられる。同株は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（住所 10801 University Boulevard, Manassas,
VA 20110, United States of America）から入手することができる。他の微生物のpckAのホモログも、同様にして取得され得る。
Since several sequences have already been clarified as described above, the pckA gene can be obtained using a primer prepared based on these base sequences. For example, PCR using the primers shown in SEQ ID NOs: 22 and 23 and chromosomal DNA of Actinobacillus succinogenes as a template (PCR: polymerase chain reaction; White, TJ et al., Trends Genet. 5, 185 (1989) By reference), it is possible to obtain the coding region of pckA of Actinobacillus succinogenes and the adjacent region including the control region. A specific example of Actinobacillus succinogenes is the 130Z (ATCC55618) strain. The stock is owned by American Type Culture Collection (address 10801 University Boulevard, Manassas,
VA 20110, United States of America). Other microorganism pckA homologues can be obtained in the same manner.
本発明の細菌の構築において、NADHによる阻害を受けないクエン酸シンターゼの活性の増強、LDH、ALD、PTA、MDH、又はADHの活性の低下、及びホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ活性の低下のための改変の順序は特に制限されず、どのような順序でもよい。 In the construction of the bacterium of the present invention, for enhancing the activity of citrate synthase that is not inhibited by NADH, reducing the activity of LDH, ALD, PTA, MDH, or ADH, and reducing the activity of phosphoenolpyruvate carboxykinase The order of modification is not particularly limited, and any order may be used.
＜２＞本発明のＬ−グルタミン酸系アミノ酸の製造方法
本発明の方法は、上記細菌を、嫌気又は微好気条件で培地中で培養し、Ｌ−グルタミン酸系アミノ酸を該培地中に生成蓄積させ、該培地からＬ−アミノ酸を回収することを特徴とする、Ｌ−アミノ酸の製造法である。
<2> Method for Producing L-Glutamic Acid Amino Acid of the Present Invention The method of the present invention comprises culturing the bacterium in a medium under anaerobic or microaerobic conditions, and producing and accumulating L-glutamic acid based amino acid in the medium. A method for producing an L-amino acid, which comprises recovering the L-amino acid from the medium.
通常、微生物の培養時は、通気、攪拌し酸素を供給する好気的条件で培養することが好ましい。一方、本発明の方法では、嫌気又は微好気条件で培養を行う。 Usually, when culturing microorganisms, it is preferable to culture under aerobic conditions in which oxygen is supplied by aeration and agitation. On the other hand, in the method of the present invention, the culture is performed under anaerobic or microaerobic conditions.
本発明において、「嫌気又は微好気条件」とは、通気をせずに培養すること、又は、培地中の溶存酸素濃度（DO）を低く抑えて培養することを意味する。溶存酸素濃度は、好ましくは0〜1.5 mg/l、より好ましくは0〜1mg/l、さらに好ましくは0〜0.5mg/lである。嫌気又は微好気条件は、例えば、培地への通気量や培地の攪拌を通常よりも低下させること、培養容器を密閉して無通気で培養すること、炭酸ガス等の不活性ガスを培地に通気すること等により、培地中の溶存酸素濃度を調整することによって達成される。 In the present invention, “anaerobic or microaerobic conditions” means culturing without aeration, or culturing with a low dissolved oxygen concentration (DO) in the medium. The dissolved oxygen concentration is preferably 0 to 1.5 mg / l, more preferably 0 to 1 mg / l, and still more preferably 0 to 0.5 mg / l. Anaerobic or microaerobic conditions include, for example, lowering the amount of aeration to the medium and stirring of the medium than usual, sealing the culture vessel and culturing without aeration, and inert gas such as carbon dioxide in the medium. This is achieved by adjusting the dissolved oxygen concentration in the culture medium by aeration or the like.
本発明においては、全培養期間を通じて嫌気又は微好気条件で培養してもよいが、培養期間を、細菌を増殖させる培養期と、Ｌ−グルタミン酸系アミノ酸を生産させる培養期に分け、それぞれ異なる培地又は条件で培養を行ってもよい。例えば、好気的情報、例えば通気及び／又は攪拌下で細菌を増殖させた後、嫌気又は微好気条件下でＬ−グルタミン酸系アミノ酸を生産させてもよい。 In the present invention, the culture may be performed under anaerobic or microaerobic conditions throughout the entire culture period, but the culture period is divided into a culture period for growing bacteria and a culture period for producing L-glutamic acid amino acids, which are different from each other. You may culture | cultivate with a culture medium or conditions. For example, bacteria may be grown under aerobic information such as aeration and / or agitation, and then L-glutamic acid amino acids may be produced under anaerobic or microaerobic conditions.
また、細菌を培地で培養するに当たっては、寒天培地等の固体培地で斜面培養したものを直接液体培地に接種しても良いが、細菌を予め液体培地で培養（種培養又は前培養）したものを本培養用の培地（発酵培地）に接種するのが好ましい。種培養又は前培養では、通常、好気的条件で培養を行うことが好ましい。前培養は、複数回行ってもよい。 In addition, when cultivating bacteria in a medium, one that is slant-cultured in a solid medium such as an agar medium may be directly inoculated into a liquid medium, but the bacteria are previously cultured in a liquid medium (seed culture or pre-culture). Is preferably inoculated into a medium for culture (fermentation medium). In seed culture or preculture, it is usually preferable to perform culture under aerobic conditions. The pre-culture may be performed multiple times.
培養に用いる培地は、炭素源、窒素源、無機塩類、その他必要に応じてアミノ酸、ビタミン等の有機微量栄養素を含有する、通常微生物の培養に用いられる培地を用いることができる。例えば、硫酸アンモニウム、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム等の無機塩からなる組成に、肉エキス、酵母エキス、ペプトン等の天然栄養源を添加した一般的な培地を用いることができる。 As a medium used for culture, a medium usually used for culture of microorganisms containing a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts, and other organic micronutrients such as amino acids and vitamins as necessary can be used. For example, a general medium in which a natural nutrient source such as meat extract, yeast extract or peptone is added to a composition composed of inorganic salts such as ammonium sulfate, potassium phosphate and magnesium sulfate can be used.
炭素源としては、細菌が資化してＬ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−プロリン、Ｌ−オルニチン、Ｌ−シトルリン、又はＬ−アルギニンを生成させうる炭素源であれば特に限定されないが、通常、ガラクトース、ラクトース、グルコース、フルクトース、グリ
セロール、シュークロース、サッカロース、デンプン、セルロース、脂肪酸等の炭水化物がよく用いられ、グリセロール、マンニトール、キシリトール、リビトール、エタノール等のアルコール類等糖質も用いられる。炭素源は、１種でもよく、２種以上の混合物であってもよい。
The carbon source is not particularly limited as long as it is a carbon source that can be assimilated by bacteria to produce L-glutamic acid, L-glutamine, L-proline, L-ornithine, L-citrulline, or L-arginine. Carbohydrates such as galactose, lactose, glucose, fructose, glycerol, sucrose, saccharose, starch, cellulose and fatty acids are often used, and saccharides such as alcohols such as glycerol, mannitol, xylitol, ribitol and ethanol are also used. The carbon source may be one type or a mixture of two or more types.
また、上記糖質を含有する澱粉糖化液、糖蜜、粗グリセロールなども使用される。粗グリセロールとしては、、例えばバイオディーゼル燃料生産において産生される粗グリセロールが挙げられる。 Further, starch saccharified solution, molasses, crude glycerol and the like containing the above-mentioned carbohydrates are also used. The crude glycerol includes, for example, crude glycerol produced in biodiesel fuel production.
上記炭素源の濃度は特に限定されないが、Ｌ−グルタミン酸系アミノ酸の生成を阻害しない範囲で可能な限り高くするのが有利であり、通常、5〜30%（W/V）、好ましくは10〜20%（W/V）の範囲内で発酵が行われる。また、発酵の進行に伴う上記炭素源の減少にあわせ、炭素源の追加添加を行っても良い。 The concentration of the carbon source is not particularly limited, but is advantageously as high as possible within a range not inhibiting the production of L-glutamic acid-based amino acids, usually 5 to 30% (W / V), preferably 10 to Fermentation is carried out within a range of 20% (W / V). Moreover, additional addition of a carbon source may be performed in accordance with the decrease in the carbon source as the fermentation progresses.
また、窒素源としては、細菌が資化してＬ−グルタミン酸系アミノ酸を生成させうる窒素源であれば特に限定されないが、具体的には、アンモニウム塩、硝酸塩、尿素、大豆加水分解物、カゼイン分解物、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、コーンスティープリカーなどの各種の有機、無機の窒素化合物が挙げられる。無機塩としては各種リン酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カリウム、マンガン、鉄、亜鉛等の金属塩が用いられる。また、ビオチン、パントテン酸、イノシトール、ニコチン酸等のビタミン類、ヌクレオチド、アミノ酸などの生育を促進する因子を必要に応じて添加する。また、培養時の発泡を抑えるために、培地には市販の消泡剤を適量添加しておくことが望ましい。 The nitrogen source is not particularly limited as long as it is a nitrogen source that can be assimilated by bacteria to produce L-glutamic acid amino acids. Specifically, ammonium salts, nitrates, urea, soybean hydrolysates, casein degradation Various organic and inorganic nitrogen compounds such as food, peptone, yeast extract, meat extract and corn steep liquor. As the inorganic salt, various phosphates, sulfates, magnesium, potassium, manganese, iron, zinc, and other metal salts are used. In addition, factors that promote growth such as vitamins such as biotin, pantothenic acid, inositol, and nicotinic acid, nucleotides, and amino acids are added as necessary. In order to suppress foaming during culture, it is desirable to add an appropriate amount of a commercially available antifoaming agent to the medium.
培養液のpHは、アンモニアガス、アンモニア水、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、重炭酸カリウム、炭酸マグネシウム、水酸化ナトリウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム等を添加することによって調整することができる。本培養におけるpHは、通常、pH5〜10、好ましくはpH6〜9.5であることが好ましいので、培養中も必要に応じて培養液のpHはアルカリ性物質、炭酸塩、尿素などによって上記範囲内に調節する。 The pH of the culture solution can be adjusted by adding ammonia gas, aqueous ammonia, sodium carbonate, sodium bicarbonate, potassium carbonate, potassium bicarbonate, magnesium carbonate, sodium hydroxide, calcium hydroxide, magnesium hydroxide, etc. it can. Since the pH in the main culture is usually pH 5 to 10, preferably 6 to 9.5, the pH of the culture solution is adjusted within the above range by alkaline substances, carbonates, urea, etc. as necessary during the culture. To do.
本発明で用いる培地には、上記した炭素源と、炭酸イオン、重炭酸イオン又は炭酸ガスを含有させ、微好気又は嫌気的条件で培養することができる培地が好ましい。炭酸イオン又は重炭酸イオンは、中和剤としても用いることのできる炭酸マグネシウム、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、重炭酸カリウム等の炭酸塩又は重炭酸塩から供給されるが、必要に応じて炭酸ガスから供給することもできる。炭酸又は重炭酸の塩の具体例としては、例えば炭酸マグネシウム、炭酸アンモニウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、重炭酸アンモニウム、重炭酸ナトリウム、重炭酸カリウム等が挙げられる。そして、炭酸イオン、重炭酸イオンは、0.001〜5M、好ましくは0.1〜3M、さらに好ましくは1〜2Mの濃度で添加する。炭酸ガスを含有させる場合は、溶液1L当たり50mg〜25g、好ましくは100mg〜15g、さらに好ましくは150mg〜10gの炭酸ガスを含有させる。 The medium used in the present invention is preferably a medium that contains the above-described carbon source and carbonate ion, bicarbonate ion, or carbon dioxide gas and can be cultured under microaerobic or anaerobic conditions. Carbonate ions or bicarbonate ions are supplied from carbonates or bicarbonates such as magnesium carbonate, sodium carbonate, sodium bicarbonate, potassium carbonate, potassium bicarbonate which can also be used as a neutralizing agent, but if necessary It can also be supplied from carbon dioxide gas. Specific examples of the carbonate or bicarbonate salt include magnesium carbonate, ammonium carbonate, sodium carbonate, potassium carbonate, ammonium bicarbonate, sodium bicarbonate, and potassium bicarbonate. Carbonate ions and bicarbonate ions are added at a concentration of 0.001 to 5M, preferably 0.1 to 3M, and more preferably 1 to 2M. When carbon dioxide is contained, 50 mg to 25 g, preferably 100 mg to 15 g, and more preferably 150 mg to 10 g of carbon dioxide is contained per liter of the solution.
培養温度は、通常、25℃〜40℃、好ましくは30℃〜37℃である。培養時間は1時間〜168時間が好ましく、3時間〜72時間がより好ましい。 The culture temperature is usually 25 ° C to 40 ° C, preferably 30 ° C to 37 ° C. The culture time is preferably 1 hour to 168 hours, more preferably 3 hours to 72 hours.
また、Ｌ−グルタミン酸が析出するような条件に調製された液体培地を用いて、培地中にＬ−グルタミン酸を析出させながら培養を行うことも出来る。Ｌ−グルタミン酸が析出する条件としては、例えば、pH5.0〜4.0、好ましくはpH4.5〜4.0、さらに好ましくはpH4.3〜4.0、特に好ましくはpH4.0を挙げることができる。 Moreover, it can also culture | cultivate, making L-glutamic acid precipitate in a culture medium using the liquid medium prepared on the conditions that L-glutamic acid precipitates. Examples of conditions under which L-glutamic acid precipitates include pH 5.0 to 4.0, preferably pH 4.5 to 4.0, more preferably pH 4.3 to 4.0, and particularly preferably pH 4.0.
培養終了後の培養液からＬ−グルタミン酸系アミノ酸を採取する方法は、公知の回収方
法に従って行えばよい。例えば、培養液から菌体を除去した後に濃縮晶析する方法あるいはイオン交換クロマトグラフィー等によって採取される。Ｌ−グルタミン酸が析出するような条件下で培養した場合、培養液中に析出したＬ−グルタミン酸は、遠心分離又は濾過等により採取することができる。この場合、培地中に溶解しているＬ−グルタミン酸を晶析した後に、併せて単離してもよい。
A method for collecting L-glutamic acid-based amino acids from the culture solution after completion of the culture may be performed according to a known recovery method. For example, it is collected by removing microbial cells from the culture solution and then concentrating crystallization or ion exchange chromatography. When culturing under conditions where L-glutamic acid is precipitated, L-glutamic acid precipitated in the culture solution can be collected by centrifugation or filtration. In this case, L-glutamic acid dissolved in the medium may be crystallized and then isolated together.
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明はこれにより制限されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples, but the present invention is not limited thereto.
〔参考例〕
はじめに、実施例において遺伝子破壊のツールとして使用したプラスミドについて記載する。
[Reference example]
First, the plasmid used as a gene disruption tool in the examples is described.
（１）RSF-Red-TER
λのgam、bet及びexoの各遺伝子を発現する新規なヘルパープラスミドRSF-Red-TER（図４）を構築した。RSF-Red-TERの構築スキームを図５に示す。
構築の最初の工程として、RSFsacBPlacMCSベクターをデザインした。そのために、pACYC184プラスミドのcat遺伝子（クロラムフェニコール耐性遺伝子）、及びバチルス・サブチリスのsacB遺伝子の構造部分を含むＤＮＡ断片を、それぞれ配列番号１、２、３、４のオリゴヌクレオチドを用いて、PCRにより増幅した。これらのオリゴヌクレオチドは各々、さらなるクローニングに必要な、都合のよいBglII、SacI、XbaI、及びBamHI制限酵素部位を5'末端に含んでいる。得られた1.5kbのsacB断片を、先に得たpMW119-PlaclacIベクターのXbaI-BamHI部位にクローニングしpMW-PlaclacIsacBプラスミドを得た。pMW119-PlaclacIベクターは、pMW118-PlaclacIベクターについての記載（Skorokhodova, A.Yu et al, Biotekhnologiya (Rus), 5, 3-21 (2004)）と同様にして構築した。但し、同ベクターは、pMW218プラスミドの代わりにpMW219からのポリリンカー部位を含んでいる。
(1) RSF-Red-TER
A new helper plasmid RSF-Red-TER (FIG. 4) expressing each of the gam, bet and exo genes of λ was constructed. Fig. 5 shows the RSF-Red-TER construction scheme.
As the first step of construction, the RSFsacBPlacMCS vector was designed. For this purpose, a DNA fragment containing the structural part of the cat gene (chloramphenicol resistance gene) of the pACYC184 plasmid and the sacB gene of Bacillus subtilis, respectively, using the oligonucleotides of SEQ ID NOs: 1, 2, 3, and 4, Amplified by PCR. Each of these oligonucleotides contains convenient BglII, SacI, XbaI, and BamHI restriction enzyme sites at the 5 ′ end that are necessary for further cloning. The obtained 1.5 kb sacB fragment was cloned into the XbaI-BamHI site of the previously obtained pMW119-P lac lacI vector to obtain a pMW-P lac lacIsacB plasmid. The pMW119-P lac lacI vector was constructed in the same manner as described for the pMW118-P lac lacI vector (Skorokhodova, A. Yu et al, Biotekhnologiya (Rus), 5, 3-21 (2004)). However, this vector contains a polylinker site from pMW219 instead of the pMW218 plasmid.
次に、前記の1.0kbのcat断片をBglII及びSacIで処理し、先の工程で得たpMW-PlaclacIsacBプラスミドのBamHI-SacI部位にクローニングした。得られたプラスミドpMW-PlaclacIsacBcatは、PlacUV5-lacI-sacB-cat断片を含んでいる。この断片をRSF1010ベクターにサブクローンするために、pMW-PlaclacIsacBcatをBglIIで消化し、DNAポリメラーゼＩクレノーフラグメントで処理して平滑末端化し、続いてSacIで切断した。pMW-PｌａｃlacIsacBcatプラスミドの3.8kbのBglII-SacI断片を1%アガロースゲルから溶出させ、PstIで切断後末端を平滑化し、さらにSacIで処理したRSF1010ベクターに連結した。ライゲーション混合液でエシェリヒア・コリTG1を形質転換し、クロラムフェニコール（50mg/L）を含むLB培地にプレートした。生育したクローンから単離したプラスミドの制限酵素解析を行い、RSFsacBプラスミドを得た。RSFsacBPlacMCSベクターを構築するために、配列番号５及び６のオリゴヌクレオチドをプライマーとして、pMW119-PlaclacIプラスミドを鋳型として用いて、PlacUV5プロモーターを含むDNA断片をPCRにより増幅した。得られた146bpの断片をSacI及びNotIで消化し、RSFsacBプラスミドのSacI-NotI大断片と連結した。その後、配列番号７及び８のオリゴヌクレオチドをプライマーとして、pKD46プラスミド（Datsenko,
K.A., Wanner, B.L., Proc.Nat1.Acad.Sci.USA, 97, 6640-6645, (2000)）を鋳型とし用いたPCRにより、λRedαβγ遺伝子、及び転写ターミネーターtL3を含む2.3kbのDNA断片を増幅した。得られた断片をRSFsacBPlacMCSベクターのPvuI-NotI部位にクローニングした。こうして、RSFRedプラスミドをデザインした。
Next, the cat fragment of 1.0 kb was treated with BglII and SacI and cloned into the BamHI-SacI site of the pMW-P lac lacIsacB plasmid obtained in the previous step. The resulting plasmid pMW-P lac lacIsacBcat contains the PlacUV5-lacI-sacB-cat fragment. In order to subclone this fragment into the RSF1010 vector, pMW-P lac lacIsacBcat was digested with BglII, treated with DNA polymerase I Klenow fragment to make blunt ends and subsequently cut with SacI. A 3.8 kb BglII-SacI fragment of the pMW-PlaclacIsacBcat plasmid was eluted from a 1% agarose gel, cut with PstI, blunted, and further ligated to an RSF1010 vector treated with SacI. Escherichia coli TG1 was transformed with the ligation mixture and plated on LB medium containing chloramphenicol (50 mg / L). Restriction enzyme analysis of the plasmid isolated from the grown clone was performed to obtain RSFsacB plasmid. In order to construct an RSFsacBP lac MCS vector, a DNA fragment containing the P lacUV5 promoter was amplified by PCR using the oligonucleotides of SEQ ID NOs: 5 and 6 as primers and the pMW119-P lac lacI plasmid as a template. The resulting 146 bp fragment was digested with SacI and NotI and ligated with the SacI-NotI large fragment of the RSFsacB plasmid. Thereafter, the pKD46 plasmid (Datsenko,
KA, Wanner, BL, Proc. Nat1. Acad. Sci. USA, 97, 6640-6645, (2000)) was used as a template to amplify a 2.3 kb DNA fragment containing the λRedαβγ gene and the transcription terminator tL3. did. The obtained fragment was cloned into the PvuI-NotI site of the RSFsacBP lac MCS vector. Thus, the RSFRed plasmid was designed.
Red遺伝子のリードスルー転写を排除するために、エシェリヒア・コリのrrnBオペロンのρ−依存性転写ターミネーターを、cat遺伝子とPlacUV5プロモーターとの間に挿入した。そのために、配列番号９及び１０のオリゴヌクレオチドをプライマーとして、エシェリ
ヒア・コリBW3350の染色体を鋳型として用いたPCRにより、PlacUV5プロモーターとTrrnBターミネーターを含むDNA断片を増幅した。得られたこれらの断片をKpnIで処理して、連結した。その後、配列番号１１及び１２のオリゴヌクレオチドをプライマーとするオリゴヌクレオチドを用いたPCRにより、PlacUV5及びTrrnBの両方を含む0.5kb断片を、増幅した。得られたDNA断片をEcoRIで消化し、DNAポリメラーゼＩクレノーフラグメントで処理して平滑末端化し、BamHIで切断し、RSF-RedベクターのEcl136II-BamHI大断片と連結した。得られたプラスミドをRSF-Red-TERと命名した。
In order to eliminate read-through transcription of the Red gene, the p-dependent transcription terminator of the Escherichia coli rrnB operon was inserted between the cat gene and the P lacUV5 promoter. Therefore, a DNA fragment containing the P lacUV5 promoter and the TrrnB terminator was amplified by PCR using the oligonucleotides of SEQ ID NOs: 9 and 10 as primers and the chromosome of Escherichia coli BW3350 as a template. These fragments obtained were treated with KpnI and ligated. Thereafter, a 0.5 kb fragment containing both P lacUV5 and TrrnB was amplified by PCR using oligonucleotides of SEQ ID NOs: 11 and 12 as primers. The obtained DNA fragment was digested with EcoRI, treated with DNA polymerase I Klenow fragment to make blunt ends, cut with BamHI, and ligated with the large Ecl136II-BamHI fragment of RSF-Red vector. The resulting plasmid was named RSF-Red-TER.
（２）RSF-int-xis
遺伝子破壊株から、遺伝子の破壊に用いたプラスミドに由来する抗生物質耐性遺伝子を除去するためのプラスミドとして、RSF-int-xisを構築した。RSF-int-xis構築の材料として、pMW-intxis-tsを用いた。pMW-intxis-tsは、λファージのインテグラーゼ（Int）をコードする遺伝子、エクシジョナーゼ(Xis)をコードする遺伝子を搭載し、温度感受性の複製能を有するプラスミドである（WO2007/037460、特開2005-058827）。
(2) RSF-int-xis
RSF-int-xis was constructed as a plasmid for removing an antibiotic resistance gene derived from the plasmid used for gene disruption from the gene disruption strain. PMW-intxis-ts was used as a material for RSF-int-xis construction. pMW-intxis-ts is a plasmid carrying a gene encoding λ phage integrase (Int) and gene encoding exonase (Xis) and having temperature-sensitive replication ability (WO2007 / 037460, special Open 2005-058827).
プライマーintxis_f（配列番号１３）とプライマーintxis_R（配列番号１４）、及び、pMW-intxis-tsを鋳型として用いたPCRにより、intxis領域を含むDNA断片を増幅した。得られたDNA断片をNotI及びPvuIで消化し、RSF-Red-TERプラスミドのNotI及びPvuIで消化した大断片と連結した。得られたプラスミドをRSF-int-xisと命名した。 A DNA fragment containing the intxis region was amplified by PCR using primer intxis_f (SEQ ID NO: 13), primer intxis_R (SEQ ID NO: 14), and pMW-intxis-ts as a template. The obtained DNA fragment was digested with NotI and PvuI and ligated with the large fragment digested with NotI and PvuI of the RSF-Red-TER plasmid. The obtained plasmid was named RSF-int-xis.
（３）pMW118-attL-Tc-attR
pMW118-attL-Tc-attRは、pMW118(宝バイオ社製)にλファージのアタッチメントサイトであるattL及びattR遺伝子とテトラサイクリン耐性遺伝子であるTc遺伝子を挿入したプラスミドであり、attL-Tc-attRの順で挿入されている（WO2005/010175、特開2005-58227）。
(3) pMW118-attL-Tc-attR
pMW118-attL-Tc-attR is a plasmid in which attL and attR genes, which are attachment sites for λ phage, and a Tc gene, which is a tetracycline resistance gene, are inserted into pMW118 (Takara Bio Inc.) in the order of attL-Tc-attR. (WO2005 / 010175, JP2005-58227).
（４）pMW118-attL-Km-attR
pMW118-lattL-Km-attRプラスミドは、pMW118-attL-Tc-attRプラスミドから、テトラサイクリン耐性マーカー遺伝子をpUC4Kプラスミド（Vieira, J. and Messing, J., Gene, 19(3): 259-68 (1982)）のカナマイシン耐性遺伝子で置換することによって構築した。そのために、pMW118-attL-Tc-attRプラスミドのEcoRI-PstI大断片を、pUC4KプラスミドのHindIII-PstI(676bp)及びEcoRI-HindIII(585bp)の２つの断片に連結した（WO2005/010175、特開2005-58227）。
(4) pMW118-attL-Km-attR
The pMW118-lattL-Km-attR plasmid is a pUC4K plasmid (Vieira, J. and Messing, J., Gene, 19 (3): 259-68 (1982) from the pMW118-attL-Tc-attR plasmid. )) By replacement with kanamycin resistance gene. For this purpose, the EcoRI-PstI large fragment of the pMW118-attL-Tc-attR plasmid was ligated to two fragments of HindIII-PstI (676 bp) and EcoRI-HindIII (585 bp) of the pUC4K plasmid (WO2005 / 010175, JP2005). -58227).
〔実施例１〕prpC遺伝子増幅用プラスミドRSFPPGの構築
Ｌ−グルタミン酸生合成系遺伝子としてppc遺伝子、及びgdh遺伝子（欧州出願公開0999282号明細書）、並びにprpC遺伝子（国際公開2006/051660号パンフレット）を保持するプラスミドRSFPPGを構築した。同プラスミドは、ppc遺伝子、gdh遺伝子及びgltA遺伝子を保持するプラスミドRSFCPG（欧州出願公開1233068号）を材料とし、gltA遺伝子をprpC遺伝子に置換えることにより構築した。
[Example 1] Construction of plasmid RSFPPG for amplification of prpC gene The ppc gene and gdh gene (European Application Publication No. 0999282) and the prpC gene (International Publication No. 2006/051660 pamphlet) are used as L-glutamic acid biosynthesis genes. The plasmid RSFPPG to be retained was constructed. This plasmid was constructed by replacing the gltA gene with the prpC gene using the plasmid RSFCPG (European Application Publication No. 1233068) holding the ppc gene, gdh gene and gltA gene as a material.
RSFCPGのgltA遺伝子のORF以外の部分を増幅するプライマーRSFBgl-2（配列番号１５）とプライマーRSFKpn（配列番号１６）を設計した。このプライマーを用いて、RSFCPGを鋳型にPCRを行い、約14.9kbの断片を取得した。一方、prpCに関してはプライマーcoliprpCBgl-1（配列番号１７）とプライマーcoliprpCKpn（配列番号１８）を用い、E. coli W3110株の染色体DNAを鋳型としてPCRを行い、約1.2kbの断片を取得した。両PCR産物をそれぞれBglII、KpnIで処理し、ライゲーション後、E. coli JM109株を形質転換した。出現したコロニーを全て集菌し、混合物としてプラスミドを抽出した。このプラスミド混合物でクエン酸シンターゼ（CS）欠損株であるE. coli ME8330株を形質転換し、50mg/Lウラシル、5mg/Lチアミン-HClを含有するM9最少培地（グルコース5 g、硫酸マグネシウム2mM、リン酸
一カリウム3g、塩化ナトリウム0.5g 、塩化アンモニウム1g リン酸2ナトリウム6g を純水1Lに含む培地）に塗布した。出現した株よりプラスミドを抽出し、これをRSFPPGとした。出現したコロニーを全て集菌し、混合物としてプラスミドを抽出し、このプラスミド混合物でP. ananatisのＬ−グルタミン酸生産菌であるNP106株を形質転換した。出現したクローンについて中性条件で試験管培養を行い、G106S株と同等のＬ−グルタミン酸収率を示す株をNA1とした。また本菌株よりプラスミドを抽出しこれをprpC, gdh, ppc強化用プラスミドRSFPPGとした。
Primer RSFBgl-2 (SEQ ID NO: 15) and primer RSFKpn (SEQ ID NO: 16) were designed to amplify the portion other than the ORF of the gltA gene of RSFCPG. Using this primer, PCR was performed using RSFCPG as a template to obtain a fragment of about 14.9 kb. On the other hand, for prpC, PCR was performed using the primer coliprpCBgl-1 (SEQ ID NO: 17) and primer coliprpCKpn (SEQ ID NO: 18), using the chromosomal DNA of the E. coli W3110 strain as a template to obtain a fragment of about 1.2 kb. Both PCR products were treated with BglII and KpnI, and after ligation, E. coli strain JM109 was transformed. All the emerged colonies were collected and the plasmid was extracted as a mixture. A citrate synthase (CS) -deficient E. coli ME8330 strain was transformed with this plasmid mixture, and M9 minimal medium (glucose 5 g, magnesium sulfate 2 mM, containing 50 mg / L uracil, 5 mg / L thiamine-HCl, A medium containing 3 g of monopotassium phosphate, 0.5 g of sodium chloride, 1 g of ammonium chloride and 6 g of disodium phosphate in 1 L of pure water was applied. A plasmid was extracted from the appearing strain and designated RSFPPG. All the emerged colonies were collected, a plasmid was extracted as a mixture, and P. ananatis L-glutamic acid-producing NP106 strain was transformed with this plasmid mixture. The appearing clone was cultured in a test tube under neutral conditions, and a strain showing an L-glutamic acid yield equivalent to that of the G106S strain was designated as NA1. A plasmid was extracted from this strain and designated as plasmid RSFPPG for strengthening prpC, gdh, and ppc.
前記NP106S株は、パントエア・アナナティスAJ13601株から、同菌株が保有しているエシェリヒア・コリ由来のgltA、ppc、gdhAの各遺伝子を含むプラスミドRSFCPG、及びブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム由来のgltA遺伝子を含むプラスミドpSTVCBを脱落させた株である。また、前記G106S株は、AJ13601株から、pSTVCBのみを脱落させた株である。 The NP106S strain is derived from the Pantoea ananatis AJ13601 strain, the plasmid RSFCPG containing gltA, ppc, and gdhA genes derived from Escherichia coli possessed by the strain, and the gltA gene derived from Brevibacterium lactofermentum. It is a strain from which the plasmid pSTVCB containing it was dropped. The G106S strain is a strain obtained by dropping only pSTVCB from the AJ13601 strain.
〔実施例２〕pckA増幅用プラスミドの構築
（１）エシェリヒア・コリ MG1655株のスレオニンオペロンプロモーター断片の取得
エシェリヒア・コリ(エシェリヒア・コリK-12株)のゲノムの全塩基配列（Genbank Accession No. U00096）は既に明らかにされている（Science, 277, 1453-1474 (1997)）。本配列を基にスレオニンオペロン（thrLABC）のプロモーター領域のPCR増幅を行った。5'プライマーとしてSalIサイトを有する配列番号１９に示す合成オリゴヌクレオチド、及び、3'プライマーとして配列番号２０に示す合成オリゴヌクレオチドを用いて、エシェリヒア・コリ MG1655株（ATCC47076, ATCC700926）のゲノムDNAを鋳型としてPCRを行い、スレオニンオペロンプロモーター断片（A）（配列番号２１）を得た。
[Example 2] Construction of plasmid for pckA amplification (1) Acquisition of the threonine operon promoter fragment of Escherichia coli MG1655 strain The entire base sequence of the genome of Escherichia coli (Escherichia coli K-12 strain) (Genbank Accession No. U00096) ) Has already been clarified (Science, 277, 1453-1474 (1997)). PCR amplification of the threonine operon (thrLABC) promoter region was performed based on this sequence. Using the synthetic oligonucleotide shown in SEQ ID NO: 19 having a SalI site as a 5 ′ primer and the synthetic oligonucleotide shown in SEQ ID NO: 20 as a 3 ′ primer, a genomic DNA of Escherichia coli MG1655 strain (ATCC47076, ATCC700926) was used as a template As a result, PCR was performed to obtain a threonine operon promoter fragment (A) (SEQ ID NO: 21).
（２）アクチノバチルス・サクシノゲネス130Z（ATCC55618）株のホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ遺伝子断片の取得
アクチノバチルス・サクシノゲネス130Z株のゲノムの全塩基配列（Genbank Accession No. CP000746）も既に公開されており、PEPCKをコードする遺伝子（遺伝子名pckA）の塩基配列を基にプライマーを設計し、PCR増幅を行った。5'プライマーとして配列番号２２に示す合成オリゴヌクレオチド、及び、3'側プライマーとしてSalIサイトを有する配列番号２３に示す合成オリゴヌクレオチドを用いて、アクチノバチルス・サクシノゲネス130Z株のゲノムDNAを鋳型としてPCRを行い、pckA遺伝子断片（B）（配列番号２４）を得た。
(2) Acquisition of phosphoenolpyruvate carboxykinase gene fragment of Actinobacillus succinogenes 130Z (ATCC55618) strain The complete nucleotide sequence of the genome of Actinobacillus succinogenes 130Z strain (Genbank Accession No. CP000746) has already been published, PEPCK Primers were designed based on the base sequence of the gene encoding the gene (gene name pckA), and PCR amplification was performed. Using the synthetic oligonucleotide shown in SEQ ID NO: 22 as the 5 ′ primer and the synthetic oligonucleotide shown in SEQ ID NO: 23 having the SalI site as the 3 ′ primer, PCR was performed using the genomic DNA of Actinobacillus succinogenes 130Z as a template. PckA gene fragment (B) (SEQ ID NO: 24) was obtained.
（３）pckA遺伝子増幅用プラスミドpSTV-pckの構築
上記、断片（A）と（B）を鋳型にし、SalIサイトを有した配列番号１９と配列番号２３のプライマーを用いてPCR反応を行い、断片（A）と（B）が結合された遺伝子断片（C）を得た。この遺伝子断片（C）を制限酵素SalIにて処理、精製した産物を、制限酵素SalIで消化したプラスミドベクターpSTV28（宝バイオ社製）に結合して、pckA増幅用プラスミドpSTV28::Pthr::pckA（以下、「pSTV-pck」とも記載する）を構築した。
(3) Construction of plasmid pSTV-pck for pckA gene amplification Using the above fragments (A) and (B) as a template, PCR reaction was performed using the primers of SEQ ID NO: 19 and SEQ ID NO: 23 having SalI sites. A gene fragment (C) in which (A) and (B) were combined was obtained. The product obtained by treating and purifying this gene fragment (C) with the restriction enzyme SalI is ligated to the plasmid vector pSTV28 (Takara Bio Inc.) digested with the restriction enzyme SalI, and the pckA amplification plasmid pSTV28 :: Pthr :: pckA (Hereinafter also referred to as “pSTV-pck”).
〔実施例３〕目的遺伝子欠損株の構築
（１）エンテロバクター・アエロゲネスATCC13048株の目的遺伝子の部分配列の決定
エンテロバクター・アエロゲネスATCC13048株のadhE、sucA、mdh、ldh、pta、及びaldC遺伝子を破壊するために、同株の各遺伝子の部分配列を以下のようにして決定した。
[Example 3] Construction of target gene-deficient strain (1) Determination of partial sequence of target gene of Enterobacter aerogenes ATCC13048 Destroy adhE, sucA, mdh, ldh, pta and aldC genes of Enterobacter aerogenes ATCC13048 strain Therefore, the partial sequence of each gene of the same strain was determined as follows.
（Ａ）adhE
E. coliのadhE遺伝子配列を参考にして設計した、配列番号２６及び２７のオリゴヌクレオチドをプライマーとし、ATCC13048ゲノムＤＮＡを鋳型とし、TaKaRa Ex Taq(タカラバイオ社製)DNAポリメラーゼ用いたPCRにより、adhE領域のDNA断片を増幅し、pGEM-T Vector(Promega社製)にクローニングした。インサートの両端をpUC/M13フォワードプライマ
ー（Forward Primer）（配列番号２８）及びリバースプライマー（Reverse Primer）（配列番号２９）を用いてシークエンスし、ATCC13048株adhE遺伝子の部分配列を決定した（N末側配列：配列番号３０、C末側配列：配列番号３１）。
(A) adhE
PCR was carried out by PCR using TaKaRa Ex Taq (manufactured by Takara Bio Inc.) DNA polymerase using the oligonucleotides of SEQ ID NOS: 26 and 27 as primers, ATCC13048 genomic DNA as a template, designed with reference to the E. coli adhE gene sequence. The DNA fragment of the region was amplified and cloned into pGEM-T Vector (Promega). Both ends of the insert were sequenced using pUC / M13 forward primer (SEQ ID NO: 28) and reverse primer (SEQ ID NO: 29) to determine the partial sequence of the ATCC13048 strain adhE gene (N-terminal side) Sequence: SEQ ID NO: 30, C-terminal sequence: SEQ ID NO: 31).
（Ｂ）sucA
E. coliのsucA遺伝子配列を参考にして設計した、配列番号３２及び３３のオリゴヌクレオチドをプライマーとし、ATCC13048ゲノムＤＮＡを鋳型とし、Pyrobest DNAポリメラーゼ(タカラバイオ社製)を用いたPCRにより、sucA領域のDNA断片を増幅し、pHSG399(タカラバイオ社製)のSmaIサイトにクローニングした。インサートの両端をpUC/M13フォワードプライマー（配列番号２８）及びリバースプライマー（配列番号２９）を用いてシークエンスし、ATCC13048株sucA遺伝子の部分配列を決定した（N末側配列：配列番号３４ 、C末側配列：配列番号３５）。
(B) sucA
The sucA region was designed by PCR using Pyrobest DNA polymerase (manufactured by Takara Bio Inc.) using the oligonucleotides of SEQ ID NOs: 32 and 33 as primers, ATCC13048 genomic DNA as a template, and designed with reference to the sucA gene sequence of E. coli. The DNA fragment was amplified and cloned into the SmaI site of pHSG399 (Takara Bio Inc.). Both ends of the insert were sequenced using pUC / M13 forward primer (SEQ ID NO: 28) and reverse primer (SEQ ID NO: 29), and a partial sequence of the ATCC13048 strain sucA gene was determined (N-terminal sequence: SEQ ID NO: 34, C-terminal) Side sequence: SEQ ID NO: 35).
（Ｃ）mdh
E. coliのmdh遺伝子配列を参考にして設計した、配列番号３６及び３７のオリゴヌクレオチドをプライマーとし、ATCC13048ゲノムＤＮＡを鋳型とし、TaKaRa Ex Taq(タカラバイオ社製)DNAポリメラーゼ用いたPCRにより、mdh領域のDNA断片を増幅し、pGEM-T Vector(Promega社製)にクローニングした。インサートの両端をpUC/M13フォワードプライマー（配列番号２８）及びリバースプライマー（配列番号２９）を用いてシークエンスし、ATCC13048株mdh遺伝子の部分配列を決定した（N末側配列：配列番号３８、C末側配列：配列番号３９）。
(C) mdh
PCR was carried out by PCR using TaKaRa Ex Taq (manufactured by Takara Bio Inc.) DNA polymerase using the oligonucleotides of SEQ ID NOs: 36 and 37, which were designed with reference to the E. coli mdh gene sequence as a primer, ATCC13048 genomic DNA as a template, and DNA polymerase. The DNA fragment of the region was amplified and cloned into pGEM-T Vector (Promega). Both ends of the insert were sequenced using pUC / M13 forward primer (SEQ ID NO: 28) and reverse primer (SEQ ID NO: 29) to determine a partial sequence of the ATCC13048 strain mdh gene (N-terminal sequence: SEQ ID NO: 38, C-terminal). Side sequence: SEQ ID NO: 39).
（Ｄ）ldh
E. coliのldhA遺伝子配列を参考にして設計した、配列番号４０及び４１のオリゴヌクレオチドをプライマーとし、ATCC13048ゲノムＤＮＡを鋳型とし、TaKaRa Ex Taq(タカラバイオ社製)DNAポリメラーゼを用いたPCRにより、ldh領域のDNA断片を増幅した。得られたPCR断片をDNA Blunting Kit (タカラバイオ社製)で平滑化し 、pHSG399(タカラバイオ社製)のSmaIサイトにクローニングした。インサートの両端をpUC/M13フォワードプライマー（配列番号２８）及びリバースプライマー（配列番号２９）を用いてシークエンスし、ATCC13048株ldh遺伝子の部分配列を決定した（N末側配列：配列番号４２、C末側配列：配列番号４３）。
(D) ldh
By PCR using TaKaRa Ex Taq (manufactured by Takara Bio Inc.) DNA polymerase, designed with reference to the ldhA gene sequence of E. coli, using the oligonucleotides of SEQ ID NOs: 40 and 41 as primers, ATCC13048 genomic DNA as a template, A DNA fragment in the ldh region was amplified. The obtained PCR fragment was blunted with a DNA Blunting Kit (manufactured by Takara Bio Inc.) and cloned into the SmaI site of pHSG399 (manufactured by Takara Bio Inc.). Both ends of the insert were sequenced using pUC / M13 forward primer (SEQ ID NO: 28) and reverse primer (SEQ ID NO: 29) to determine the partial sequence of the ATCC13048 strain ldh gene (N-terminal sequence: SEQ ID NO: 42, C-terminal). Side sequence: SEQ ID NO: 43).
（Ｅ）pta
E. coliのpta遺伝子配列を参考にして設計した、配列番号４４及び４５のオリゴヌクレオチドをプライマーとし、ATCC13048ゲノムＤＮＡを鋳型とし、TaKaRa Ex Taq(タカラバイオ社製)DNAポリメラーゼ用いたPCRにより、pta領域のDNA断片を増幅し、pGEM-T Vector(Promega社製)にクローニングした。インサートの両端をpUC/M13フォワードプライマー（配列番号２８）及びリバースプライマー（配列番号２９）を用いてシークエンスし、ATCC13048株pta遺伝子の部分配列を決定した（N末側配列：配列番号４６、C末側配列：配列番号４７）。
(E) pta
PCR was carried out by PCR using TaKaRa Ex Taq (manufactured by Takara Bio Inc.) DNA polymerase, which was designed with reference to the pta gene sequence of E. coli, using the oligonucleotides of SEQ ID NOs: 44 and 45 as primers, ATCC13048 genomic DNA as a template, The DNA fragment of the region was amplified and cloned into pGEM-T Vector (Promega). Both ends of the insert were sequenced using pUC / M13 forward primer (SEQ ID NO: 28) and reverse primer (SEQ ID NO: 29), and a partial sequence of the pta gene of ATCC13048 strain was determined (N-terminal sequence: SEQ ID NO: 46, C-terminal) Side sequence: SEQ ID NO: 47).
（Ｆ）aldC
文献（Appl. Environ. Microbiol. 54 (1), 38-42 (1988)）に記載されているエンテロバクター・アエロゲネスのaldC遺伝子配列を参考にして設計した、配列番号４８及び４９のオリゴヌクレオチドをプライマーとし、ATCC13048ゲノムＤＮＡを鋳型とし、TaKaRa Ex
Taq(タカラバイオ社製)DNAポリメラーゼ用いたPCRにより、pta領域のDNA断片を増幅し、pT7Blue-2 (Novagen社製)にクローニングした。インサートの両端をpUC/M13フォワードプライマー（配列番号２８）及びT7プロモータープライマー（promoter Primer）リバースプライマー（配列番号５０）を用いてシークエンスし、ATCC13048株aldC遺伝子の部分配列を決定した（N末側配列：配列番号５１(塩基番号48〜50がスタートコドン) 、C末側配
列：配列番号５２（塩基番号５〜７がストップコドン）。
(F) aldC
Oligonucleotides of SEQ ID NOs: 48 and 49 designed with reference to the aldC gene sequence of Enterobacter aerogenes described in the literature (Appl. Environ. Microbiol. 54 (1), 38-42 (1988)) Using ATCC13048 genomic DNA as a template and TaKaRa Ex
The DNA fragment in the pta region was amplified by PCR using Taq (Takara Bio) DNA polymerase and cloned into pT7Blue-2 (Novagen). Both ends of the insert were sequenced using pUC / M13 forward primer (SEQ ID NO: 28) and T7 promoter primer (promoter Primer) reverse primer (SEQ ID NO: 50) to determine a partial sequence of ATCC13048 strain aldC gene (N-terminal sequence) : SEQ ID NO: 51 (base numbers 48 to 50 are start codons), C-terminal sequence: SEQ ID NO: 52 (base numbers 5 to 7 are stop codons).
〔実施例４〕λレッド法による遺伝子破壊株の構築
遺伝子の欠失は、DatsenkoとWannerによって開発された「Red-driven integration」と呼ばれる方法（Datsenko, K. A. and Wanner, B. L. 2000. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97: 6640-6645）とλファージ由来の切り出しシステム（Cho, E. H., Gumport, R. I.,
and Gardner, J. F. 2002. J. Bacteriol. 184: 5200-5203）を参考にして実施した。本手法により、目的とする遺伝子の一部を合成オリゴヌクレオチドの5’側に、抗生物質耐性遺伝子の一部を3’側にデザインした合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて得られたPCR産物を用いて、一段階で遺伝子破壊株を構築することができる。このPCR産物は、目的遺伝子の5’側の部分配列、抗生物質耐性遺伝子、及び目的遺伝子の3’側の部分配列からなる。さらにλファージ由来の切り出しシステムを組み合わせることにより、遺伝子破壊株に組み込んだ抗生物質耐性遺伝子を除去することが出来る。
[Example 4] Construction of gene-disrupted strain by λ red method The gene deletion is a method called “Red-driven integration” developed by Datsenko and Wanner (Datsenko, KA and Wanner, BL 2000. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97: 6640-6645) and λ phage-derived excision system (Cho, EH, Gumport, RI,
and Gardner, JF 2002. J. Bacteriol. 184: 5200-5203). Using this method, PCR products obtained by using a synthetic oligonucleotide designed as a primer with part of the gene of interest on the 5 'side of the synthetic oligonucleotide and part of the antibiotic resistance gene on the 3' side are used. Thus, a gene-disrupted strain can be constructed in one step. This PCR product consists of a partial sequence 5 ′ of the target gene, an antibiotic resistance gene, and a partial sequence 3 ′ of the target gene. Furthermore, by combining the excision system derived from λ phage, the antibiotic resistance gene incorporated into the gene-disrupted strain can be removed.
（１）目的遺伝子欠失用PCR産物の調製
抗生物質耐性遺伝子の両端にそれぞれλファージのattL及びattRの配列を付加し、更にその外側にそれぞれ目的遺伝子の上流50〜100bp、下流50〜100bpの配列を付加した遺伝子断片を以下のようにして得た。
(1) Preparation of PCR product for deletion of target gene AttL and attR sequences of λ phage are added to both ends of the antibiotic resistance gene, respectively, and further 50 to 100 bp downstream and 50 to 100 bp downstream of the target gene, respectively. The gene fragment to which the sequence was added was obtained as follows.
pMW118-attL-Km-attR又はpMW118-attL-Tc-attRを鋳型として、下記表に示すオリゴヌクレオチドをプライマーとし、TaKaRa Ex Taq DNAポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を用いて、PCRを行なった。得られたPCR反応液にDpnI制限酵素を添加し、反応液に含まれる鋳型DNAを切断後、目的PCR増幅断片をWizard PCR Prep DNA Purification System（Promega社製）を用いて精製した。 PCR was performed using TaKaRa Ex Taq DNA polymerase (manufactured by Takara Bio Inc.) using pMW118-attL-Km-attR or pMW118-attL-Tc-attR as a template and oligonucleotides shown in the following table as primers. DpnI restriction enzyme was added to the resulting PCR reaction solution to cleave the template DNA contained in the reaction solution, and the target PCR amplified fragment was purified using Wizard PCR Prep DNA Purification System (Promega).
（２）遺伝子破壊株の構築法
エンテロバクター・アエロゲネスATCC13048株、又は同株に由来する株の遺伝子破壊は、RSF-Red-TERプラスミドを用いて、以下のようにして行った。
(2) Construction Method of Gene Disrupted Strain Gene disruption of Enterobacter aerogenes ATCC13048 strain or a strain derived from the strain was performed as follows using RSF-Red-TER plasmid.
遺伝子を破壊する親株を20μg/mlクロラムフェニコールを含有するLB培地で終夜培養し、この培養液を20μg/ml クロラムフェニコールと1mM IPTG（イソプロピル-β-D-チオガラクトピラノサイド）を含有するLB培地50mLに1/100量接種し、3時間30℃で培養を行った。菌体を集菌し、氷冷した15%グリセロールで2回洗菌した後、最終的に0.2mLの15%グリセロールに懸濁したものをコンピテントセルとして用いた。このコンピテントセルに、上項で調製した目的遺伝子欠失用PCR産物を、GENE PULSER II（BioRad社製）を用いて、電場強度18kV/cm、コンデンサー容量25μF、抵抗値200Ωの条件で導入した。細胞懸濁液に、LB培地を添加し、37℃で2時間振盪培養を行った後、LB培地に抗生物質（50μg/mlのカナマイシン又は15μg/mlのテトラサイクリン）を加えた培地に塗布した。出現したコロニーを同培地で純化した後、PCRにより目的遺伝子が抗生物質耐性遺伝子と置換していることを
確認した。確認のPCRに用いたプライマー配列は以下のとおりである。
The parent strain that disrupts the gene was cultured overnight in LB medium containing 20 μg / ml chloramphenicol, and this culture was mixed with 20 μg / ml chloramphenicol and 1 mM IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside). 1/100 amount was inoculated into 50 mL of LB medium containing 1 and cultured at 30 ° C. for 3 hours. The cells were collected and washed twice with ice-cooled 15% glycerol, and finally suspended in 0.2 mL of 15% glycerol was used as a competent cell. The gene deletion PCR product prepared in the above section was introduced into this competent cell using GENE PULSER II (manufactured by BioRad) under the conditions of an electric field strength of 18 kV / cm, a capacitor capacity of 25 μF, and a resistance value of 200Ω. . LB medium was added to the cell suspension, and after shaking culture at 37 ° C. for 2 hours, the suspension was applied to a medium obtained by adding antibiotics (50 μg / ml kanamycin or 15 μg / ml tetracycline) to LB medium. After appearing colonies were purified with the same medium, it was confirmed by PCR that the target gene was replaced with an antibiotic resistance gene. The primer sequences used for confirmation PCR are as follows.
次に、前記のようにして得られた各組換え株からRSF-Red-TERプラスミドを脱落させるため、これらの株を10%シュークロース及び1mM IPTGを含むLB培地に塗布し、37℃で一晩培養した。出現したコロニーの中から、クロラムフェニコール耐性を欠失した株を、目的株として選択した。 Next, in order to remove the RSF-Red-TER plasmid from each of the recombinant strains obtained as described above, these strains were applied to an LB medium containing 10% sucrose and 1 mM IPTG, and incubated at 37 ° C. Cultured overnight. From the appearing colonies, a strain lacking chloramphenicol resistance was selected as a target strain.
上記のようして得られた遺伝子破壊株から抗生物質耐性遺伝子を除去する場合は、RSF-int-xisプラスミドを用いた。遺伝子破壊株にRSF-int-xisを電気パルス法で導入し、20μg/mlクロラムフェニコールを含有するLB培地に塗布後30℃で培養し、RSF-int-xis保持株を得た。得られたプラスミド保持株を、20μg/mlクロラムフェニコール及び1mM IPTGを含有するLB培地で純化し、シングルコロニーを複数得た。得られた株の中から、除去したい抗生物質耐性遺伝子に対応する抗生物質耐性が欠失した株を選択した。これらの株は抗生物質耐性遺伝子が除去された株である。次に、得られた株からRSF-int-xisプラスミドを脱落させるため、10%シュークロース及び1mM IPTGを添加したLB培地に塗布し、37℃で一晩培養した。出現したコロニーの中から、クロラムフェニコール耐性を欠失した株を、目的株として選択した。 When removing the antibiotic resistance gene from the gene-disrupted strain obtained as described above, RSF-int-xis plasmid was used. RSF-int-xis was introduced into the gene-disrupted strain by an electric pulse method, applied to an LB medium containing 20 μg / ml chloramphenicol, and cultured at 30 ° C. to obtain an RSF-int-xis-retaining strain. The obtained plasmid-carrying strain was purified with LB medium containing 20 μg / ml chloramphenicol and 1 mM IPTG to obtain a plurality of single colonies. From the obtained strains, a strain lacking antibiotic resistance corresponding to the antibiotic resistance gene to be removed was selected. These strains are strains from which the antibiotic resistance gene has been removed. Next, in order to remove the RSF-int-xis plasmid from the obtained strain, it was applied to LB medium supplemented with 10% sucrose and 1 mM IPTG, and cultured at 37 ° C. overnight. From the appearing colonies, a strain lacking chloramphenicol resistance was selected as a target strain.
（４）P1ファージを用いた遺伝子欠損の形質導入
エンテロバクター・アエロゲネスへのP1トランスダクションの適用が報告されている（Journal of bacteriology (1974) Vol. 118, p. 810-814）。本手法により、遺伝子破壊株から、遺伝子欠損の形質を他の株へ容易に移すことができる。
(4) Transduction of gene deletion using P1 phage Application of P1 transduction to Enterobacter aerogenes has been reported (Journal of bacteriology (1974) Vol. 118, p. 810-814). By this technique, a gene-deficient trait can be easily transferred from a gene-disrupted strain to another strain.
（ａ）P1感受性株の選択
P1感受性を付与する対象のレシピエントを、5 mMのCaCl2を添加したLB培地で37℃、一晩振とう培養した。この培養液を5 mMのCaCl2を添加したLB培地5mLに1/100量接種し、2時間37℃で振とう培養した。培養液0.5 mlに、P1cmCmファージライセートを50μl添加後、30℃で１時間静置し、20μg/mlクロラムフェニコールを含有するLB培地に塗布し30℃で一晩培養した。出現したコロニーを、20μg/mlクロラムフェニコールを含有するLB培地に接種し、30℃及び37℃で培養した。30℃では生育するが、37℃では生育しない株は、P1cmが溶源化した株である。
(A) Selection of P1-sensitive strains
Recipients of subjects who confer P1 sensitivity were cultured overnight at 37 ° C. in LB medium supplemented with 5 mM CaCl 2 . This culture solution was inoculated in an amount of 1/100 in 5 mL of LB medium supplemented with 5 mM CaCl 2 and cultured with shaking at 37 ° C. for 2 hours. After adding 50 μl of P1cmCm phage lysate to 0.5 ml of the culture solution, the plate was allowed to stand at 30 ° C. for 1 hour, coated on LB medium containing 20 μg / ml chloramphenicol, and cultured at 30 ° C. overnight. The emerged colonies were inoculated into LB medium containing 20 μg / ml chloramphenicol and cultured at 30 ° C. and 37 ° C. A strain that grows at 30 ° C. but does not grow at 37 ° C. is a strain in which P1 cm is a source.
次に、P1Cmが脱落した株を得るために、P1cm溶源化株を30℃、LB液体培地で数時間振とう培養後、LB培地に塗布し、37℃で一晩培養した。出現したコロニーは、P1Cmが脱落した株であり、かつP1ファージ感受性の株である。以上のようにして、P1感受性株を作製した。 Next, in order to obtain a strain from which P1Cm had been removed, the P1cm lysate strain was cultured with shaking at 30 ° C. in an LB liquid medium for several hours, and then applied to the LB medium and cultured at 37 ° C. overnight. The emerged colony is a strain from which P1Cm has been lost and is a P1 phage sensitive strain. A P1-sensitive strain was produced as described above.
（ｂ）P1ライセートの回収
上記のようにして得られたP1Cmが溶源化した株を、30℃でLB液体培地で静置培養した。
この培養液をLB培地10mlに1/10量接種し、30℃で2時間振とう培養後、42℃で20分、45℃で5分、42℃で20分、及び37℃で2時間振とう培養した。培養液にクロロホルムを適当量添加し、激しく攪拌後、遠心して上清を回収した。得られた溶液を、P1ライセートと呼ぶ。
(B) Recovery of P1 lysate The strain obtained by lysing P1Cm obtained as described above was cultivated at 30 ° C. in an LB liquid medium.
（ｃ）P1トランスダクション
ドナー株である遺伝子破壊株から、上記のようにしてP1ライセートを調製した。次に、P1感受性になったレシピエント株を、5 mMのCaCl2を添加したLB培地で一晩37℃で振とう培養した。培養液1mlを遠心して菌体を回収し、1mlのMC バッファー（0.1M MgSO4, 0.005M CaCl2）に懸濁し、0.2 mlずつ分注した。P1ライセートを4通りの量（原液で20μl、2μl、100倍希釈液で20μl、2μl）で添加して、30℃で30分静置してファージを感染させた。30分後、0.4 mlの0.1 Mクエン酸バッファー（pH5.5、NaOHで調整）を添加して、0.1mlずつ選択培地に塗布した。出現したコロニーを同培地で純化した後、PCRにより目的形質が導入されていることを確認した。
(C) P1 transduction P1 lysate was prepared as described above from a gene-disrupted strain that was a donor strain. Next, the recipient strain that became P1 sensitive was cultured overnight at 37 ° C. in LB medium supplemented with 5 mM CaCl 2 . The cells were collected by centrifuging 1 ml of the culture solution, suspended in 1 ml MC buffer (0.1 M MgSO 4 , 0.005 M CaCl 2 ), and dispensed in 0.2 ml aliquots. P1 lysate was added in four amounts (20 μl, 2 μl in stock solution, 20 μl, 2 μl in 100-fold diluted solution), and allowed to stand at 30 ° C. for 30 minutes to infect phages. After 30 minutes, 0.4 ml of 0.1 M citrate buffer (pH 5.5, adjusted with NaOH) was added, and 0.1 ml was applied to the selective medium. After appearing colonies were purified with the same medium, it was confirmed that the target character was introduced by PCR.
（５）遺伝子破壊株の構築
以下の工程で、プラスミドは電気パルス法で導入した。
(5) Construction of gene disruption strain In the following steps, the plasmid was introduced by the electric pulse method.
（ａ）ATCC13048 (RSFPPG, pSTV28)
ATCC13048に、RSFPPG及びpSTV28を導入して、ATCC13048 (RSFPPG, pSTV28)株を得た。
(A) ATCC13048 (RSFPPG, pSTV28)
RSCCPG and pSTV28 were introduced into ATCC13048 to obtain ATCC13048 (RSFPPG, pSTV28) strain.
（ｂ）ATCC13048 (RSFPPG, pSTV-pck)
ATCC13048に、RSFPPG及びpSTV-pckを導入して、ATCC13048 (RSFPPG, pSTV-pck)株を得た。
(B) ATCC13048 (RSFPPG, pSTV-pck)
RSCCPG and pSTV-pck were introduced into ATCC13048 to obtain ATCC13048 (RSFPPG, pSTV-pck) strain.
（ｃ）ATCC13048 (RSFPPG)
ATCC13048にRSFPPGを導入して、ATCC13048 (RSFPPG)株を得た。
(C) ATCC13048 (RSFPPG)
RSFPPG was introduced into ATCC13048 to obtain ATCC13048 (RSFPPG) strain.
（ｄ）ATCC13048 mdh (RSFPPG)
ATCC13048株からλred法により、mdh遺伝子を欠損した株ATCC13048 mdhを作製し、得られた株にRSFPPGを導入して、ATCC13048 mdh (RSFPPG)株を得た。
(D) ATCC13048 mdh (RSFPPG)
A strain ATCC13048 mdh lacking the mdh gene was prepared from the ATCC13048 strain by the λred method, and RSFPPG was introduced into the resulting strain to obtain an ATCC13048 mdh (RSFPPG) strain.
（ｅ）ATCC13048 adhE (RSFPPG)
ATCC13048株からλred法により、sucAを欠損したATCC13048 sucA株を構築した。このATCC13048 sucA株からλred法により、adhEを欠損したATCC13048 sucA adhE株を構築した。得られた株をドナーとし、P1感受性のATCC13048株をレシピエントとするP1トランスダクションにより、adhEを欠損したATCC13048 adhE株を作製した。次に、ATCC13048 adhE株にRSFPPGを導入してATCC13048 adhE (RSFPPG)株を得た。
(E) ATCC13048 adhE (RSFPPG)
An ATCC13048 sucA strain lacking sucA was constructed from the ATCC13048 strain by the λred method. An ATCC13048 sucA adhE strain lacking adhE was constructed from this ATCC13048 sucA strain by λred method. The ATCC13048 adhE strain lacking adhE was produced by P1 transduction using the obtained strain as a donor and the P1-sensitive ATCC13048 strain as a recipient. Next, RSCCPG was introduced into ATCC13048 adhE strain to obtain ATCC13048 adhE (RSFPPG) strain.
（ｆ）ATCC13048 ldh (RSFPPG)
ATCC13048株からλred法により、ldh遺伝子を欠損した株ATCC13048 ldhを作製し、得られた株にRSFPPGを導入して、ATCC13048 ldh (RSFPPG)株を得た。
(F) ATCC13048 ldh (RSFPPG)
A strain ATCC13048 ldh lacking the ldh gene was prepared from the ATCC13048 strain by the λred method, and RSFPPG was introduced into the resulting strain to obtain an ATCC13048 ldh (RSFPPG) strain.
（ｇ）ATCC13048 aldC (RSFPPG)
ATCC13048 sucA株からλred法によりaldCを欠損したATCC13048 sucA aldC株を得た。得られた株をドナーとし、P1感受性のATCC13048株をレシピエントとするP1トランスダクションにより、aldCを欠損したATCC13048 aldC株を作製した。次に、ATCC13048 aldC株にRSFPPGを導入してATCC13048 aldC (RSFPPG)株を得た。
(G) ATCC13048 aldC (RSFPPG)
The ATCC13048 sucA aldC strain lacking aldC was obtained from the ATCC13048 sucA strain by the λred method. The ATCC13048 aldC strain lacking aldC was prepared by P1 transduction using the obtained strain as a donor and the P1-sensitive ATCC13048 strain as a recipient. Next, RSCCPG was introduced into ATCC13048 aldC strain to obtain ATCC13048 aldC (RSFPPG) strain.
（ｈ）ATCC13048 pta (RSFPPG)
ATCC13048株からλred法により、pta遺伝子を欠損した株ATCC13048 ptaを作製し、得ら
れた株にRSFPPGを導入してATCC13048 pta (RSFPPG)株を得た。
(H) ATCC13048 pta (RSFPPG)
A strain ATCC13048 pta lacking the pta gene was prepared from the ATCC13048 strain by the λred method, and RSFPPG was introduced into the resulting strain to obtain an ATCC13048 pta (RSFPPG) strain.
（ｉ）ATCC13048 aldC ldh (RSFPPG)
ATCC13048 aldC株にP1トランスダクションによりldh欠損形質を導入することで、ATCC13048 aldC ldh株を作製した。ldh欠損形質のドナーには、（ｆ）で作製したATCC13048 ldh株を用いた。次に、ATCC13048 aldC ldh株にRSFPPGを導入してATCC13048 aldC ldh (RSFPPG)株を得た。
(I) ATCC13048 aldC ldh (RSFPPG)
The ATCC13048 aldC ldh strain was produced by introducing an ldh-deficient trait into the ATCC13048 aldC strain by P1 transduction. The ATCC13048 ldh strain prepared in (f) was used as a donor having an ldh-deficient character. Next, RSCCPG was introduced into ATCC13048 aldC ldh strain to obtain ATCC13048 aldC ldh (RSFPPG) strain.
（ｊ）ATCC13048 pta aldC ldh (RSFPPG)
ATCC13048 pta株にP1トランスダクションにより順次aldC、ldh欠損形質を導入して、ATCC13048 pta aldC ldh株を構築した。次に、同株にRSFPPGを導入してATCC13048 pta aldC
ldh (RSFPPG)株を得た。
(J) ATCC13048 pta aldC ldh (RSFPPG)
The ATCC13048 pta aldC ldh strain was constructed by sequentially introducing aldC and ldh-deficient traits into the ATCC 13048 pta strain by P1 transduction. Next, RSFPPG was introduced into the same stock and ATCC13048 pta aldC
The ldh (RSFPPG) strain was obtained.
（ｋ）ATCC13048 pta aldC ldh mdh (RSFPPG)
ATCC13048 pta aldC ldh株にP1トランスダクションによりmdh欠損を導入して、ATCC13048 pta aldC ldh mdh株を構築した。次に、同株にRSFPPGを導入してATCC13048 pta aldC ldh mdh (RSFPPG)株を得た。
(K) ATCC13048 pta aldC ldh mdh (RSFPPG)
The ATCC13048 pta aldC ldh mdh strain was constructed by introducing mdh deletion into the ATCC 13048 pta aldC ldh strain by P1 transduction. Next, RSFPPG was introduced into the same strain to obtain an ATCC 13048 ptald ldh mdh (RSFPPG) strain.
（ｌ）ATCC13048 pta aldC ldh adhE (RSFPPG)
ATCC13048 pta aldC ldh株にP1トランスダクションによりadhE欠損を導入して、ATCC13048 pta aldC ldh adhE株を構築した。次に、同株にRSFPPGを導入してATCC13048 pta aldC ldh adhE (RSFPPG)株を得た。
(L) ATCC13048 pta aldC ldh adhE (RSFPPG)
An ATCC13048 pta aldC ldh adhE strain was constructed by introducing an adhE deficiency into the ATCC 13048 pta aldC ldh strain by P1 transduction. Next, RSFPPG was introduced into the same strain to obtain an ATCC13048 ptalaldcldhade (RSFPPG) strain.
（ｍ）ATCC13048 P1s pta aldC ldh mdh (RSFPPG, pSTV-pck)
ATCC13048 pta aldC ldh mdh (RSFPPG)株にpSTV-pckを導入して、ATCC13048 pta aldC ldh mdh (RSFPPG , pSTV-pck)株を得た。
(M) ATCC13048 P1s pta aldC ldh mdh (RSFPPG, pSTV-pck)
PSTV-pck was introduced into the ATCC13048 ptaaldC ldh mdh (RSFPPG) strain to obtain the ATCC13048 ptaaldC ldh mdh (RSFPPG, pSTV-pck) strain.
（ｎ）ATCC13048 P1s pta aldC ldh mdh (RSFPPG, pSTV28)
ATCC13048 pta aldC ldh mdh (RSFPPG)株にpSTV28を導入して、ATCC13048 pta aldC ldh mdh (RSFPPG , pSTV28)株を得た。
(N) ATCC13048 P1s pta aldC ldh mdh (RSFPPG, pSTV28)
PSTV28 was introduced into ATCC13048 ptaaldC ldh mdh (RSFPPG) strain to obtain ATCC13048 ptaaldC ldh mdh (RSFPPG, pSTV28) strain.
（ｏ）ATCC13048 P1s pta aldC ldh adhE (RSFPPG, pSTV28)
ATCC13048 pta aldC ldh adhE (RSFPPG)株にpSTV28を導入して、ATCC13048 pta aldC ldh adhE (RSFPPG , pSTV28)株を得た。
(O) ATCC13048 P1s pta aldC ldh adhE (RSFPPG, pSTV28)
PSTV28 was introduced into the ATCC13048 ptaaldC ldh adhE (RSFPPG) strain to obtain the ATCC13048 ptaaldC ldh adhE (RSFPPG, pSTV28) strain.
（ｐ）ATCC13048 P1s pta aldC ldh mdh (RSFPPG, pSTV28)
ATCC13048 pta aldC ldh adhE (RSFPPG)株にpSTV-pckを導入してATCC13048 pta aldC ldh adhE (RSFPPG , pSTV-pck)株を得た。
(P) ATCC13048 P1s pta aldC ldh mdh (RSFPPG, pSTV28)
PSTV-pck was introduced into the ATCC13048 ptaaldC ldh adhE (RSFPPG) strain to obtain an ATCC13048 ptaaldC ldh adhE (RSFPPG, pSTV-pck) strain.
（ｑ）ATCC13048 (RSFCPG)
ATCC13048株にRSFCPG(欧州特許出願公開第0952221号明細書)を導入して、ATCC13048 (RSFCPG)株を得た。
(Q) ATCC13048 (RSFCPG)
RSFCPG (European Patent Application Publication No. 0952221) was introduced into ATCC13048 strain to obtain ATCC13048 (RSFCPG) strain.
〔実施例５〕各遺伝子破壊株によるＬ−グルタミン酸生産
（Ａ）嫌気培養でのＬ−グルタミン酸生産の評価法
嫌気培養でのＬ−グルタミン酸生産は、以下のようにして評価した。
各菌株を適切な抗生物質（カナマイシンの場合は50μg/ml、テトラサイクリンの場合は15μg/ml、クロラムフェニコールの場合は20μg/ml）を含むLBプレートに均一に塗布し、37℃にて16時間培養した。その後、各プレートをアネロパック（三菱ガス化学株式会社製
嫌気性菌簡易培養用 品番A-04）に入れ、嫌気条件下、37℃で6時間培養を行った。得
られたプレートの菌体を、700μlの0.8%の食塩水に、51倍希釈でOD600=0.5〜1.5となる様に懸濁した。この菌体懸濁液100μlと、予め炭酸ガスを吹込むことにより培地に溶解している気体を炭酸ガスにて概ね置換した生産培地1mlを、1.5ml容のねじキャップ式マイクロチューブに分注して蓋を締め、嫌気条件下マイクロチューブシェイカーを用いて37℃において24時間又は48時間培養した。以下に生産培地の組成を示す。
[Example 5] L-glutamic acid production by each gene-disrupted strain (A) Evaluation method of L-glutamic acid production in anaerobic culture L-glutamic acid production in anaerobic culture was evaluated as follows.
Each strain is evenly applied to an LB plate containing appropriate antibiotics (50 μg / ml for kanamycin, 15 μg / ml for tetracycline, 20 μg / ml for chloramphenicol) and 16 ° C. at 16 ° C. Incubate for hours. Thereafter, each plate was put into an anero pack (manufactured by Mitsubishi Gas Chemical Co., Ltd., product number A-04 for anaerobic bacteria simple culture), and cultured at 37 ° C. for 6 hours under anaerobic conditions. The cells of the obtained plate were suspended in 700 μl of 0.8% saline so that OD 600 = 0.5 to 1.5 when diluted 51 times. Dispense 100 μl of this bacterial cell suspension and 1 ml of production medium in which the gas dissolved in the medium by blowing carbon dioxide gas in advance with carbon dioxide was dispensed into a 1.5 ml screw-cap type microtube. The lid was tightened, and the cells were cultured at 37 ° C. for 24 hours or 48 hours using a microtube shaker under anaerobic conditions. The composition of the production medium is shown below.
〔Ａ区〕
グルコース 20 g/L（最終濃度）
硫酸マグネシウム・七水和物 1 g/L
〔Ｂ区〕
硫酸アンモニウム 10 g/L
リン酸二水素カリウム 1 g/L
硫酸マンガン・五水和物 10 mg/L
硫酸鉄・七水和物 10 mg/L
Yeast Extract 2 g/L
ビオチン 1 mg/L
(KOHにてpH=6に調製)
〔Ｃ区〕
炭酸カルシウム（日本薬局方） 50 g/L
Ａ区、Ｂ区をそれぞれ115℃、10分オートクレーブ滅菌、Ｃ区を180℃ 3時間乾熱滅菌した後、放冷し、混合する。
[A ward]
Glucose 20 g / L (final concentration)
Magnesium sulfate heptahydrate 1 g / L
[B ward]
Ammonium sulfate 10 g / L
Potassium dihydrogen phosphate 1 g / L
Manganese sulfate pentahydrate 10 mg / L
Iron sulfate heptahydrate 10 mg / L
Yeast Extract 2 g / L
Biotin 1 mg / L
(Adjusted to pH = 6 with KOH)
[C ward]
Calcium carbonate (Japanese Pharmacopoeia) 50 g / L
The sections A and B are sterilized by autoclaving at 115 ° C. for 10 minutes, respectively, and the section C is sterilized by dry heat at 180 ° C. for 3 hours.
培養後、培地中に蓄積したＬ−グルタミン酸及び残糖の濃度をバイオテックアナライザー AS-310 (サクラエスアイ(株))により分析した。また、その他の有機酸量を液体クロマトグラフィーHPLCシステム（L-7100、L-7200、L-7300、L-7400、(株)日立ハイテクノロジーズ、カラムはURUTRON PS-80H（信和化工(株)））により分析した。エタノール及び2,3-ブタンジオールはガスクロマトグラフィー（島津製作所製）により測定した。菌体のODは、0.1Nの塩酸でサンプルを希釈し、培地中の炭酸カルシウムを溶解した後、スペクトロフォトメーターDU800 (Beckman Coulter)を用いて測定した。 After the cultivation, the concentrations of L-glutamic acid and residual sugar accumulated in the medium were analyzed by Biotech Analyzer AS-310 (Sakura Seye Co., Ltd.). In addition, liquid chromatographic HPLC systems (L-7100, L-7200, L-7300, L-7400, Hitachi High-Technologies Corporation, columns are URUTRON PS-80H (Shinwa Chemical Co., Ltd.)) ). Ethanol and 2,3-butanediol were measured by gas chromatography (manufactured by Shimadzu Corporation). The OD of the microbial cells was measured using a spectrophotometer DU800 (Beckman Coulter) after diluting the sample with 0.1N hydrochloric acid to dissolve calcium carbonate in the medium.
（Ｂ）Ｌ−グルタミン酸生産に対するRSFPPG導入の効果
ATCC13048株、及び、ATCC13048株にRSFCPG又はRSFPPGを導入した株の嫌気条件下でのＬ−グルタミン酸生産を、上記の方法で評価した。消費糖当たりのＬ−グルタミン酸蓄積量の重量収率（以下、同様）を、表３に示す。野性株ATCC13048、及び、RSFCPGプラスミドによりNADHによる阻害を受けるクエン酸シンターゼ(gltA)、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ(gdh)、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ(ppc)を強化した株(ATCC13048 (PSFCPG))はＬ−グルタミン酸をほとんど蓄積しないが、RSFPPGプラスミドによりNADHによる阻害を受けないクエン酸シンターゼ(prpC)、gdh、及びppcを強化した株(ATCC13048 (PSFPPG))は、Ｌ−グルタミン酸を蓄積した。
(B) Effect of RSFPPG introduction on L-glutamic acid production
L-glutamic acid production under anaerobic conditions of ATCC13048 strain and strains in which RSFCPG or RSFPPG was introduced into ATCC13048 strain was evaluated by the above method. Table 3 shows the weight yield of L-glutamic acid accumulation per consumed sugar (hereinafter the same). Wild strain ATCC13048 and strains (ATCC13048 (PSFCPG)) enhanced with citrate synthase (gltA), glutamate dehydrogenase (gdh), and phosphoenolpyruvate carboxylase (ppc) that are inhibited by NADH by the RSFCPG plasmid contain L-glutamic acid. A strain enriched with citrate synthase (prpC), gdh, and ppc (ATCC13048 (PSFPPG)), which hardly accumulates but is not inhibited by NADH by the RSFPPG plasmid, accumulated L-glutamic acid.
（Ｃ）Ｌ−グルタミン酸生産に対する各遺伝子欠損の効果
RSFPPGを保持し、各種遺伝子を欠損した株の嫌気条件下でのＬ−グルタミン酸蓄積を上
記の方法で評価した。結果を表４に示す。対照に比べて、特にmdh又はptaを欠損した株は有意にＬ−グルタミン酸蓄積が向上した。
(C) Effect of each gene deficiency on L-glutamic acid production
L-glutamic acid accumulation under anaerobic conditions of strains retaining RSFPPG and lacking various genes was evaluated by the above method. The results are shown in Table 4. Compared to the control, L-glutamic acid accumulation was significantly improved in strains lacking mdh or pta.
（Ｄ）Ｌ−グルタミン酸生産に対する遺伝子欠損の組合わせの効果
次に、複数の遺伝子を欠損した株の嫌気条件下でのＬ−グルタミン酸蓄積を、上記の方法で評価した。結果を表５に示す。対照に比べて、pta、aldC、及びldhを同時に欠損させた株、又はpta、aldC、ldh、mdhを同時に欠損した株では、有意にＬ−グルタミン酸蓄積が向上した。
(D) Effect of a combination of gene deletions on L-glutamic acid production Next, accumulation of L-glutamate under anaerobic conditions in a strain lacking a plurality of genes was evaluated by the above method. The results are shown in Table 5. L-glutamic acid accumulation was significantly improved in the strain in which pta, aldC and ldh were simultaneously deleted, or in the strain in which pta, aldC, ldh and mdh were simultaneously deleted, as compared with the control.
ATCC13048 pta aldC ldh mdh (RSFPPG)の培養終了後（18.6mgの糖を消費した）の培地中の成分量を、表６に示す。主に、Ｌ−グルタミン酸、エタノール及び蟻酸を生成していることが分かった。 Table 6 shows the amounts of components in the medium after completion of the culture of ATCC13048 pta aldC ldh mdh (RSFPPG) (18.6 mg of sugar was consumed). It was found that L-glutamic acid, ethanol and formic acid were mainly produced.
（Ｅ）pck増強のＬ−グルタミン酸生産に対する効果
次に、pckを増強株の嫌気条件下でのＬ−グルタミン酸蓄積を、上記の方法で評価した。結果を表７に示す。対照に比べて、pck増強株では有意にＬ−グルタミン酸蓄積が向上した。
(E) Effect of enhancing pck on L-glutamic acid production Next, accumulation of L-glutamic acid under anaerobic conditions of a pck-enhancing strain was evaluated by the above method. The results are shown in Table 7. L-glutamic acid accumulation was significantly improved in the pck enhanced strain compared to the control.
（Ｆ）遺伝子欠損株におけるpck増強のＬ−グルタミン酸生産に対する効果
次に、各種遺伝子を欠損し、pckが増強された株の、嫌気条件下でのＬ−グルタミン酸蓄積を上記の方法で評価した。結果を表７に示す。対照に比べて、pck増強株では有意にＬ−グルタミン酸蓄積が向上した。
(F) Effect of pck enhancement on L-glutamate production in gene-deficient strains Next, the accumulation of L-glutamate under anaerobic conditions in strains lacking various genes and enhanced pck was evaluated by the above method. The results are shown in Table 7. L-glutamic acid accumulation was significantly improved in the pck enhanced strain compared to the control.
〔配列表の説明〕
配列番号１：cat遺伝子増幅用プライマー
配列番号２：cat遺伝子増幅用プライマー
配列番号３：sacB遺伝子増幅用プライマー
配列番号４：sacB遺伝子増幅用プライマー
配列番号５：PｌａｃＵＶ５プロモーターを含むDNA断片増幅用プライマー
配列番号６：PｌａｃＵＶ５プロモーターを含むDNA断片増幅用プライマー
配列番号７：λRedαβγ遺伝子及びtL3を含むDNA断片増幅用プライマー
配列番号８：λRedαβγ遺伝子及びtL3を含むDNA断片増幅用プライマー
配列番号９：PｌａｃＵＶ５プロモーターおよびTrrnBを含むDNA断片増幅用プライマー
配列番号10：PｌａｃＵＶ５プロモーターおよびTrrnBを含むDNA断片増幅用プライマー
配列番号11：attL増幅用プライマー
配列番号12：attL増幅用プライマー
配列番号13：intxis領域増幅用プライマーintxis_f
配列番号14：intxis領域増幅用プライマーintxis_R
配列番号15：gltA遺伝子のORF以外の部分を増幅するためのプライマー
配列番号16：gltA遺伝子のORF以外の部分を増幅するためのプライマー
配列番号17：prpC遺伝子増幅用プライマー
配列番号18：prpC遺伝子増幅用プライマー
配列番号19：スレオニンプロモーター増幅用プライマー
配列番号20：スレオニンプロモーター増幅用プライマー
配列番号21：スレオニンプロモーター遺伝子断片
配列番号22：Actinobacillus succinogenes pckA遺伝子増幅用プライマー
配列番号23：Actinobacillus succinogenes pckA遺伝子増幅用プライマー
配列番号24：Actinobacillus succinogenes ATCC55618 pckA塩基配列
配列番号25：Actinobacillus succinogenes ATCC55618 pckAがコードするアミノ酸配列 配列番号26：Enterobacter aerogens adhE遺伝子増幅用プライマー
配列番号27：Enterobacter aerogens adhE遺伝子増幅用プライマー
配列番号28：pUC/M13フォワードプライマー
配列番号29：pUC/M13リバースプライマー
配列番号30：Enterobacter aerogens ATCC13048 adhE遺伝子5'末端側部分配列
配列番号31：Enterobacter aerogens ATCC13048 adhE遺伝子3'末端側部分配列
配列番号32：Enterobacter aerogens sucA遺伝子増幅用プライマー
配列番号33：Enterobacter aerogens sucA遺伝子増幅用プライマー
配列番号34：Enterobacter aerogens ATCC13048 sucA遺伝子5'末端側部分配列
配列番号35：Enterobacter aerogens ATCC13048 sucA遺伝子3'末端側部分配列
配列番号36：Enterobacter aerogens mdh遺伝子増幅用プライマー
配列番号37：Enterobacter aerogens mdh遺伝子増幅用プライマー
配列番号38：Enterobacter aerogens ATCC13048 mdh遺伝子5'末端側部分配列
配列番号39：Enterobacter aerogens ATCC13048 mdh遺伝子3'末端側部分配列
配列番号40：Enterobacter aerogens ldhA遺伝子増幅用プライマー
配列番号41：Enterobacter aerogens ldhA遺伝子増幅用プライマー
配列番号42：Enterobacter aerogens ATCC13048 ldhA遺伝子5'末端側部分配列
配列番号43：Enterobacter aerogens ATCC13048 ldhA遺伝子3'末端側部分配列
配列番号44：Enterobacter aerogens pta遺伝子増幅用プライマー
配列番号45：Enterobacter aerogens pta遺伝子増幅用プライマー
配列番号46：Enterobacter aerogens ATCC13048 pta遺伝子5'末端側部分配列
配列番号47：Enterobacter aerogens ATCC13048 pta遺伝子3'末端側部分配列
配列番号48：Enterobacter aerogens aldC遺伝子増幅用プライマー
配列番号49：Enterobacter aerogens aldC遺伝子増幅用プライマー
配列番号50：T7プロモータープライマー
配列番号51：Enterobacter aerogens ATCC13048 aldC遺伝子5'末端側部分配列
配列番号52：Enterobacter aerogens ATCC13048 aldC遺伝子3'末端側部分配列
配列番号53：adhE遺伝子破壊用断片増幅用プライマー
配列番号54：adhE遺伝子破壊用断片増幅用プライマー
配列番号55：mdh遺伝子破壊用断片増幅用プライマー
配列番号56：mdh遺伝子破壊用断片増幅用プライマー
配列番号57：pta遺伝子破壊用断片増幅用プライマー
配列番号58：pta遺伝子破壊用断片増幅用プライマー
配列番号59：ldh遺伝子破壊用断片増幅用プライマー
配列番号60：ldh遺伝子破壊用断片増幅用プライマー
配列番号61：sucA遺伝子破壊用断片増幅用プライマー
配列番号62：sucA遺伝子破壊用断片増幅用プライマー
配列番号63：aldC遺伝子破壊用断片増幅用プライマー
配列番号64：aldC遺伝子破壊用断片増幅用プライマー
配列番号65：adhE遺伝子欠失確認用プライマー
配列番号66：adhE遺伝子欠失確認用プライマー
配列番号67：mdh遺伝子遺伝子欠失確認用プライマー
配列番号68：mdh遺伝子遺伝子欠失確認用プライマー
配列番号69：pta遺伝子遺伝子欠失確認用プライマー
配列番号70：pta遺伝子遺伝子欠失確認用プライマー
配列番号71：ldh遺伝子遺伝子欠失確認用プライマー
配列番号72：ldh遺伝子遺伝子欠失確認用プライマー
配列番号73：sucA遺伝子遺伝子欠失確認用プライマー
配列番号74：sucA遺伝子遺伝子欠失確認用プライマー
配列番号75：Escherichia coli W3110 prpC塩基配列
配列番号76：Escherichia coli W3110 prpCがコードするアミノ酸配列
配列番号77：Actinobacillus succinogenes ATCC55618 pckA塩基配列
配列番号78：Actinobacillus succinogenes ATCC55618 pckAがコードするアミノ酸配列
配列番号79：Haemophilus influenzae 86-028NP pckA塩基配列
配列番号80：Haemophilus influenzae 86-028NP pckAがコードするアミノ酸配列
配列番号81：Pasteurella multocida subsp. multocida str. PM70 pckA遺伝子
配列番号82：Pasteurella multocida subsp. multocida str. PM70 pckAがコードするアミノ酸配列
配列番号83：Mannheimia succiniciproducens MBEL55E pckA塩基配列
配列番号84：Mannheimia succiniciproducens MBEL55E pckAがコードするアミノ酸配列
配列番号85：Yersinia pseudotuberculosis IP 32953 pckA塩基配列
配列番号86：Yersinia pseudotuberculosis IP 32953 pckAがコードするアミノ酸配列
配列番号87：Vibrio cholerae 623-39 pckA塩基配列
配列番号88：Vibrio cholerae 623-39 pckAがコードするアミノ酸配列
配列番号89：PEPCKコンセンサス（共通）配列
[Explanation of Sequence Listing]
SEQ ID NO: 1: Primer for cat gene amplification SEQ ID NO: 2: Primer for cat gene amplification SEQ ID NO: 3: Primer for amplification of sacB gene SEQ ID NO: 4: Primer for amplification of sacB gene SEQ ID NO: 5: Primer sequence for amplification of DNA fragment containing PlacUV5 promoter No. 6: Primer for DNA fragment amplification containing PlacUV5 promoter SEQ ID NO: 7: Primer for DNA fragment amplification containing λRedαβγ gene and tL3 SEQ ID NO: 8: Primer for DNA fragment amplification containing λRedαβγ gene and tL3 SEQ ID NO: 9: PlacUV5 promoter and TrrnB Primer for DNA fragment amplification containing: SEQ ID NO: 10: Primer for DNA fragment amplification containing PlacUV5 promoter and TrrnB SEQ ID NO: 11: Primer for attL amplification SEQ ID NO: 12: Primer for attL amplification SEQ ID NO: 13: Primer for intxis region amplification intxis_f
SEQ ID NO: 14: primer for intxis region amplification intxis_R
SEQ ID NO: 15: Primer for amplifying a portion other than the ORF of the gltA gene SEQ ID NO: 16: Primer for amplifying the portion other than the ORF of the gltA gene SEQ ID NO: 17: Primer sequence for prpC gene amplification SEQ ID NO: 18: Amplification of the prpC gene Primer SEQ ID NO: 19: Primer for threonine promoter amplification SEQ ID NO: 20: Primer for threonine promoter amplification SEQ ID NO: 21: Threonine promoter gene fragment SEQ ID NO: 22: Primer primer for Actinobacillus succinogenes pckA gene amplification SEQ ID NO: 23: Primer for Actinobacillus succinogenes pckA gene amplification SEQ ID NO: 24: Actinobacillus succinogenes ATCC55618 pckA nucleotide sequence SEQ ID NO: 25: Actinobacillus succinogenes ATCC55618 pckA encoded amino acid sequence SEQ ID NO: 26: Enterobacter aerogens adhE gene amplification primer SEQ ID NO: 27: Enterobacter aerogens adhE gene amplification primer SEQ ID NO: 28 pUC / M13 forward primer SEQ ID NO: 29: pUC / M13 reverse primer SEQ ID NO: 30: Enterobacter aerogens ATCC13048 adhE gene 5 ′ end partial sequence SEQ ID NO: 31: Enterobacter aerogens ATCC13048 adhE gene 3 ′ end partial sequence SEQ ID NO: 32: Enterobacter aerogens sucA gene amplification primer SEQ ID NO: 33: Enterobacter aerogens sucA gene amplification primer SEQ ID NO: 34: Enterobacter aerogens ATCC13048 sucA gene 5 'terminal partial sequence SEQ ID NO: 35: Enterobacter aerogens ATCC13048 sucA gene 3' terminal partial sequence SEQ ID NO: 36: Primer for amplifying Enterobacter aerogens mdh gene SEQ ID NO: 37: Primer for amplifying Enterobacter aerogens mdh gene SEQ ID NO: 38: Enterobacter aerogens ATCC13048 mdh gene 5 'terminal partial sequence SEQ ID NO: 39: Enterobacter aerogens ATCC13048 mdh gene 3' terminal partial sequence SEQ ID NO: 40: Enterobacter aerogens ldhA gene amplification primer SEQ ID NO: 41: Enteroba cter aerogens ldhA gene amplification primer SEQ ID NO: 42: Enterobacter aerogens ATCC13048 ldhA gene 5 ′ end partial sequence SEQ ID NO: 43: Enterobacter aerogens ATCC13048 ldhA gene 3 ′ end partial sequence SEQ ID NO: 44: Enterobacter aerogens pta gene amplification primer sequence number 45: Enterobacter aerogens pta gene amplification primer SEQ ID NO: 46: Enterobacter aerogens ATCC13048 pta gene 5 'end partial sequence SEQ ID NO: 47: Enterobacter aerogens ATCC13048 pta gene 3' end partial sequence SEQ ID NO: 48: Enterobacter aerogens aldC gene amplification primer SEQ ID NO: 49: Primer for amplifying Enterobacter aerogens aldC gene SEQ ID NO: 50: T7 promoter primer SEQ ID NO: 51: Enterobacter aerogens ATCC13048 aldC gene 5 'terminal partial sequence SEQ ID NO: 52: Enterobacter aerogens ATCC13048 aldC gene 3' terminal partial sequence SEQ ID NO: 53: Primer for fragment amplification for adhE gene disruption SEQ ID NO: 54: a dhE gene disruption fragment amplification primer SEQ ID NO: 55: mdh gene disruption fragment amplification primer SEQ ID NO: 56: mdh gene disruption fragment amplification primer SEQ ID NO: 57: pta gene disruption fragment amplification primer SEQ ID NO: 58: pta gene Fragment amplification primer SEQ ID NO: 59: ldh gene disruption fragment amplification primer SEQ ID NO: 60: ldh gene disruption fragment amplification primer SEQ ID NO: 61: sucA gene disruption fragment amplification primer SEQ ID NO: 62: sucA gene disruption Fragment amplification primer SEQ ID NO: 63: aldC gene disruption fragment amplification primer SEQ ID NO: 64: aldC gene disruption fragment amplification primer SEQ ID NO: 65: adhE gene deletion confirmation primer SEQ ID NO: 66: adhE gene deletion confirmation primer SEQ ID NO: 67: mdh gene gene deletion confirmation primer SEQ ID NO: 68: mdh gene gene deletion confirmation primer sequence number Number 69: pta gene gene deletion confirmation primer SEQ ID NO: 70: pta gene gene deletion confirmation primer SEQ ID NO: 71: ldh gene gene deletion confirmation primer SEQ ID NO: 72: ldh gene gene deletion confirmation primer SEQ ID NO: 73 : SucA gene gene deletion confirmation primer SEQ ID NO: 74: sucA gene gene deletion confirmation primer SEQ ID NO: 75: Escherichia coli W3110 prpC nucleotide sequence SEQ ID NO: 76: Escherichia coli W3110 prpC encoded amino acid sequence SEQ ID NO: 77: Actinobacillus succinogenes ATCC55618 pckA nucleotide sequence SEQ ID NO: 78: Actinobacillus succinogenes ATCC55618 amino acid sequence encoded by pckA
SEQ ID NO: 79: Haemophilus influenzae 86-028NP pckA nucleotide sequence SEQ ID NO: 80: Amino acid sequence encoded by Haemophilus influenzae 86-028NP pckA SEQ ID NO: 81: Pasteurella multocida subsp. Multocida str. PM70 pckA gene SEQ ID NO: 82: Pasteurella multocida subsp. Multocida amino acid sequence encoded by str. PM70 pckA SEQ ID NO: 83: Mannheimia succiniciproducens MBEL55E pckA nucleotide sequence SEQ ID NO: 84: amino acid sequence encoded by Mannheimia succiniciproducens MBEL55E pckA SEQ ID NO: 85: Yersinia pseudotuberculosis IP 32953 pckA nucleotide sequence SEQ ID NO: 86: Yersinia pseudotubculosis 32953 Amino acid sequence encoded by pckA SEQ ID NO: 87: Vibrio cholerae 623-39 pckA nucleotide sequence SEQ ID NO: 88: Amino acid sequence encoded by Vibrio cholerae 623-39 pckA SEQ ID NO: 89: PEPCK consensus (common) sequence
Claims (10)
（Ａ）配列番号７６に示すアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｂ）配列番号７６に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を有し、かつ、クエン酸シンターゼ活性を有するタンパク質。 The method according to claim 2, wherein the methyl citrate synthase is a protein described in (A) or (B) below.
(A) A protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 76.
(B) A protein having an amino acid sequence including substitution, deletion, insertion, or addition of one or several amino acids and having citrate synthase activity in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 76.
（ａ）配列番号７５の塩基配列を含むＤＮＡ、または
（ｂ）配列番号７５の塩基配列または同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、クエン酸シンターゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。 The method according to claim 2, wherein the prpC gene is the DNA described in (a) or (b) below.
It hybridizes under stringent conditions with (a) DNA comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 75, or (b) the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 75 or a probe that can be prepared from the nucleotide sequence, and has citrate synthase activity DNA encoding a protein having the same.
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