JP2005278443A - Oligonucleotide and method for detecting neisseria gonorrhoeae - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、医療・診断分野において淋菌の核酸を検出・同定するためのオリゴヌクレオチド、及び該オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いたＬＡＭＰ法による淋菌の核酸を検出・同定する方法に関する。 The present invention relates to an oligonucleotide for detecting and identifying gonococcal nucleic acid in the medical / diagnosis field, and a method for detecting and identifying gonococcal nucleic acid by the LAMP method using the oligonucleotide as a primer.
淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）が原因とされる淋菌感染症は、日本国内おいても一般的に報告されるＳＴＤ（Ｓｅｘｕａｌｌｙ ｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｄ ｄｉｓｅａｓｅｓ）のひとつである。「性感染症／ＨＩＶ感染 その現状と検査・診断・治療（財団法人性の健康医学財団）」にその詳細が記載されている。 The gonococcal infection caused by Neisseria gonorrhoeae is one of STD (Sequentially Transmitted Diseases) generally reported in Japan. Details are described in "Sexual Infectious Diseases / HIV Infection, Current Situation and Examination / Diagnosis / Treatment (Gender Health Medical Foundation)".
淋菌の検査方法は、病原体を検出するグラム染色法や分離培養法、抗原を検出する酵素抗体法（ＥＩＡ法）、淋菌の遺伝子を増幅させて検出するＤＮＡプローブ法、Ｌｉｇａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＬＣＲ）法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:18 9-193）、Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＰＣＲ）法（Science 230:1350 (1985)）などがある。特に遺伝子を増幅させて検出する方法は、検出感度に優れ、比較的単時間検査できることが特徴である。 Aspergillus oryzae testing methods include Gram staining and separation culture methods for detecting pathogens, enzyme antibody method (EIA method) for detecting antigens, DNA probe method for detecting and detecting genes of Neisseria gonorrhoeae, and Ligase Chain Reaction (LCR) method (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:18 9-193), Polymerase Chin Reaction (PCR) method (Science 230: 1350 (1985)). In particular, the method of detecting by amplifying a gene is characterized by excellent detection sensitivity and a relatively single time test.
特開平１０−８４９８２号公報には淋菌の２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子特異的ヌクレオチド配列のプローブ、及び、プライマーを使った淋菌の検出方法が開示されている。また、日本特許第２５６１０５３号公報には、淋菌のシトシンＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＣＭＴ）遺伝子中の特異的配列をもって淋菌を検出する方法を報告している。特開平１１−１８７８５号公報においても淋菌のＮｇ−ＣＤＭＴ遺伝子（ＣＭＴと同一遺伝子）とハイブリダイズするプライマーにて、淋菌とナイセリア・サブフラバ又はナイセリア・シネレアとを判別するより淋菌に特異性の高いプライマーを使って淋菌検出する方法を示している。また、特表平１０−５００３１０号公報には淋菌またはトラコーマ・クラミジアの１６Ｓもしくは２３Ｓ ｒＲＮＡまたは前記ｒＲＮＡをコードする領域からのＤＮＡにハイブリダイズし得るペプチド核酸(PNA)プローブについて報告している。 Japanese Patent Laid-Open No. 10-84982 discloses a probe for a 23S rRNA gene-specific nucleotide sequence of Aspergillus and a method for detecting Aspergillus using a primer. Japanese Patent No. 2561053 reports a method for detecting gonococci with specific sequences in the cytosine DNA methyltransferase (CMT) gene of gonococci. In Japanese Patent Application Laid-Open No. 11-18785, a primer that hybridizes with the Ng-CDMT gene (the same gene as CMT) of Aspergillus oryzae and a primer that is more specific to Aspergillus than discriminate between Neisseria subflava or Neisseria cinerea. Shows how to detect Neisseria gonorrhoeae. JP-T-10-500310 reports a peptide nucleic acid (PNA) probe capable of hybridizing to 16S or 23S rRNA of Neisseria gonorrhoeae or Trachoma chlamydia or DNA from a region encoding the rRNA.
新しい核酸の増幅および検出方法として、Loop-Mediated Isothermal Amplification(LAMP)法が、Ｎｏｔｏｍｉらによって開発され、日本特許第３３１３３５８号公報、Nucleic Acids Research, 28, e63, 2000、Biochemical and Biophysical Research Communications, 290, 1195-1198, 2002、Clinical Chemistry, 47, No.9, 1742-1743,2001に報告されている。これは通常、１対のインナープライマーと１対のアウタープライマーを併せた２対計４種のプライマー、あるいは、これに１対のループプライマーを加えた３対計６種のプライマーと、鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼとを使って通常１０分〜６０分程度で鋳型となる核酸を増幅する方法である。ＬＡＭＰ反応の検出は、ＬＡＭＰ増幅産物をアガロースゲル電気泳動にかけてＬＡＭＰ反応に特徴的なラダーのバンドを確認する方法や、ＬＡＭＰ反応産物にエチジウムブロマイドやＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎＩ等の核酸インターカレーターを添加して検出する方法がある。また、ＬＡＭＰ反応時の生成物であるピロリン酸と反応バッファー中のマグネシウムイオンにて生じる沈殿物を検出する方法が国際公開ＷＯ０１／８３８１７号公報、およびBiochemical and Biophysical Research Communications, 289, 150-154, 2002に示されている。 As a new nucleic acid amplification and detection method, Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP) method was developed by Notomi et al., Japanese Patent No. 3313358, Nucleic Acids Research, 28, e63, 2000, Biochemical and Biophysical Research Communications, 290 , 1195-1198, 2002, Clinical Chemistry, 47, No. 9, 1742-1743, 2001. This usually consists of 2 pairs of 4 primers combined with 1 pair of inner primer and 1 pair of outer primer, or 3 pairs of 6 primers combined with 1 pair of loop primers and strand replacement type. This is a method of amplifying a nucleic acid serving as a template in about 10 to 60 minutes using a DNA polymerase. The LAMP reaction can be detected by subjecting the LAMP amplification product to agarose gel electrophoresis to confirm a ladder band characteristic of the LAMP reaction, or by adding a nucleic acid intercalator such as ethidium bromide or SYBR Green I to the LAMP reaction product. There is a way. In addition, a method for detecting a precipitate formed by pyrophosphoric acid, which is a product of the LAMP reaction, and magnesium ions in the reaction buffer is disclosed in International Publication WO 01/83817, and Biochemical and Biophysical Research Communications, 289, 150-154, Shown in 2002.
ＬＡＭＰ法の検出感度は、一般的にＰＣＲとほぼ同等か、より優れているとされている。これはターゲットなる核酸配列の６領域を標的とするオリゴヌクレオチドプライマーを使用するため、非特異な増幅を防ぐことができるからである。また、最も大きな特徴のひとつは、増幅反応が一定温度で進み、かつ短時間でその反応を検出することが出来る点である。つまり反応温度を２なし３温度で変化させるためのサーマルサイクラーを必要としないことである。 The detection sensitivity of the LAMP method is generally considered to be approximately the same as or better than that of PCR. This is because non-specific amplification can be prevented because oligonucleotide primers that target six regions of the target nucleic acid sequence are used. One of the most important features is that the amplification reaction proceeds at a constant temperature and can be detected in a short time. That is, a thermal cycler for changing the reaction temperature between 2 and 3 is not required.
本発明が解決しようとする課題は、高い検出感度、高い特異性、短時間での増幅・検出、を満たす淋菌検出用ＬＡＭＰ反応用のプライマー、およびそれを用いたＬＡＭＰ法による淋菌を迅速に検出する方法を提供することにある。 The problems to be solved by the present invention are: a primer for LAMP reaction for gonococcus detection that satisfies high detection sensitivity, high specificity, amplification and detection in a short time, and rapid detection of gonococci by LAMP method using the primer It is to provide a way to do.
本発明者は、上記課題を解決すべく種々検討した結果、迅速・特異的・高感度に淋菌を検出するためのＬＡＭＰ反応用のオリゴヌクレオチドプライマーと、それを用いたＬＡＭＰ法による淋菌を特異的に検出する方法の開発に成功し、本発明を完成するに至った。 As a result of various studies to solve the above-mentioned problems, the present inventor has specifically identified an oligonucleotide primer for LAMP reaction for detecting gonococci with rapid, specific and high sensitivity, and gonococci by LAMP method using the primer. The present inventors have succeeded in developing a method for detecting the light and completed the present invention.
すなわち、本発明は、以下の発明を提供する。
（１） 配列番号２９の塩基配列を５’側に、配列番号３０の塩基配列を３’側に有し、全長が３２から４８塩基である一本鎖オリゴヌクレオチド。
（２） 配列番号３１の塩基配列を５’側に、配列番号３２の塩基配列を３’側に有し、全長が３２から４８塩基である一本鎖オリゴヌクレオチド。
（３） 配列番号３３の塩基配列を５’側に、配列番号３４の塩基配列を３’側に有し、全長が３１から４７塩基である一本鎖オリゴヌクレオチド。
（４） 配列番号３５の塩基配列を５’側に、配列番号３６の塩基配列を３’側に有し、全長が３１から４７塩基である一本鎖オリゴヌクレオチド。
That is, the present invention provides the following inventions.
(1) A single-stranded oligonucleotide having the base sequence of SEQ ID NO: 29 on the 5 ′ side, the base sequence of SEQ ID NO: 30 on the 3 ′ side, and a total length of 32 to 48 bases.
(2) A single-stranded oligonucleotide having the base sequence of SEQ ID NO: 31 on the 5 ′ side, the base sequence of SEQ ID NO: 32 on the 3 ′ side, and a total length of 32 to 48 bases.
(3) A single-stranded oligonucleotide having the base sequence of SEQ ID NO: 33 on the 5 ′ side, the base sequence of SEQ ID NO: 34 on the 3 ′ side, and a total length of 31 to 47 bases.
(4) A single-stranded oligonucleotide having the base sequence of SEQ ID NO: 35 on the 5 ′ side, the base sequence of SEQ ID NO: 36 on the 3 ′ side, and a total length of 31 to 47 bases.
（５） 配列番号１から９の何れかに記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド。
（６） 配列番号１４から２８の何れかに記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド。
(5) An oligonucleotide having the base sequence described in any one of SEQ ID NOs: 1 to 9.
(6) An oligonucleotide having the base sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 14 to 28.
（７） ＬＡＭＰ法におけるインナープライマーとして（１）から（４）の何れかに記載のオリゴヌクレオチドのうち少なくとも一つを用いる、ＬＡＭＰ法にて淋菌の核酸を増幅する方法。
（８） ＬＡＭＰ法におけるインナープライマーとして（５）記載のオリゴヌクレオチドのうち少なくとも一つを用いる、ＬＡＭＰ法にて淋菌の核酸を増幅する方法。
(7) A method for amplifying gonococcal nucleic acid by the LAMP method using at least one of the oligonucleotides according to any one of (1) to (4) as an inner primer in the LAMP method.
(8) A method for amplifying gonococcal nucleic acid by the LAMP method using at least one of the oligonucleotides according to (5) as an inner primer in the LAMP method.
（９） ＬＡＭＰ法におけるアウタープライマーとして配列番号１０から１３に記載の塩基配列を有する少なくとも一つのオリゴヌクレオチドを用いる、ＬＡＭＰ法にて淋菌の核酸を増幅する方法。
（１０） ＬＡＭＰ法におけるループプライマーとして（６）記載のオリゴヌクレオチドのうち少なくとも一つを用いる、ＬＡＭＰ法にて淋菌の核酸を増幅する方法。
（１１） 試料中の淋菌を検出するために行う、（７）から（１０）の何れかに記載の方法。
(9) A method for amplifying gonococcal nucleic acid by the LAMP method, wherein at least one oligonucleotide having the base sequence of SEQ ID NOs: 10 to 13 is used as an outer primer in the LAMP method.
(10) A method for amplifying gonococcal nucleic acid by the LAMP method, wherein at least one of the oligonucleotides according to (6) is used as a loop primer in the LAMP method.
(11) The method according to any one of (7) to (10), which is performed to detect gonococci in a sample.
（１２） 配列番号１または２の何れかに記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、配列番号４または５の何れかに記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとからなる、ＬＡＭＰ法にて淋菌の核酸を増幅するためのインナープライマーとして使用するプライマーセット。
（１３） 配列番号３に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、配列番号６から９の何れかに記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとからなる、ＬＡＭＰ法にて淋菌の核酸を増幅するためのインナープライマーとして使用するプライマーセット。
(12) A nucleic acid of Aspergillus oryzae by the LAMP method, comprising an oligonucleotide having the base sequence described in either SEQ ID NO: 1 or 2 and an oligonucleotide having the base sequence described in SEQ ID NO: 4 or 5 Primer set used as an inner primer to amplify
(13) Amplifying a koji mold nucleic acid by the LAMP method, comprising an oligonucleotide having the base sequence described in SEQ ID NO: 3 and an oligonucleotide having the base sequence described in any of SEQ ID NOS: 6 to 9 Primer set used as an inner primer.
（１４） 配列番号１０に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、配列番号１２に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとからなる、ＬＡＭＰ法にて淋菌の核酸を増幅するためのアウタープライマーとして使用するプライマーセット。
（１５） 配列番号１１に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、配列番号１３に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとからなる、ＬＡＭＰ法にて淋菌の核酸を増幅するためのアウタープライマーとして使用するプライマーセット。
(14) Use as an outer primer for amplifying gonococcal nucleic acids by the LAMP method, which comprises an oligonucleotide having the base sequence described in SEQ ID NO: 10 and an oligonucleotide having the base sequence described in SEQ ID NO: 12 Primer set.
(15) Use as an outer primer for amplifying gonococcal nucleic acids by the LAMP method, which comprises an oligonucleotide having the base sequence set forth in SEQ ID NO: 11 and an oligonucleotide having the base sequence set forth in SEQ ID NO: 13. Primer set.
（１６） 配列番号１４から１６の何れかに記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、配列番号２１から２３の何れかに記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとからなる、ＬＡＭＰ法にて淋菌の核酸を増幅するためのループプライマーとして使用するプライマーセット。
（１７） 配列番号１７から２０の何れかに記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、配列番号２４から２８の何れかに記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとからなる、ＬＡＭＰ法にて淋菌の核酸を増幅するためのループプライマーとして使用するプライマーセット。
(16) A nucleic acid of Aspergillus oryzae by the LAMP method, comprising an oligonucleotide having the base sequence described in any of SEQ ID NOs: 14 to 16 and an oligonucleotide having the base sequence of any of SEQ ID NOs: 21 to 23 Primer set used as a loop primer to amplify
(17) A nucleic acid of Aspergillus oryzae by the LAMP method, comprising an oligonucleotide having the base sequence described in any of SEQ ID NOs: 17 to 20 and an oligonucleotide having the base sequence of any of SEQ ID NOs: 24 to 28 Primer set used as a loop primer to amplify
本発明は、医療・診断分野において、従来の淋菌検査方法と比較して、より迅速・より簡便・より高感度な方法として利用できる。 The present invention can be used as a more rapid, simpler, and more sensitive method in the medical / diagnosis field as compared with a conventional gonococcal examination method.
以下、本発明の実施の形態について更に詳しく述べる。
本明細書中において、核酸の塩基配列中のＡ、Ｇ、Ｔ、Ｃは、デオキシリボヌクレオチド中のアデニン塩基、グアニン塩基、チミン塩基、シトシン塩基を示す。
Hereinafter, embodiments of the present invention will be described in more detail.
In the present specification, A, G, T, and C in the nucleotide sequence of the nucleic acid indicate adenine base, guanine base, thymine base, and cytosine base in deoxyribonucleotide.
ＬＡＭＰ反応に用いるインナープライマーとはＦＩＰプライマーとＢＩＰプライマーとを示す。ＦＩＰプライマーは、５’側にターゲット核酸配列の表鎖に相同的なＦ１ｃと呼ばれる配列、３’側にターゲット核酸配列の裏鎖に相補的なＦ２と呼ばれる配列、とを有するオリゴヌクレオチドであり、ＢＩＰプライマーは、５’側にターゲット核酸配列の裏鎖に相同的なＢ１ｃと呼ばれる配列、３’側にターゲット核酸配列の表鎖に相補的なＢ２と呼ばれる配列、とを有するオリゴヌクレオチドである。アウタープライマーとは、Ｆ３プライマーとＢ３プライマーを示し、Ｆ３プライマーはターゲット核酸配列の裏鎖に相補的なオリゴヌクレオチド、Ｂ３プライマーはターゲット核酸の表鎖に相補的なオリゴヌクレオチドである。ループプライマーは、ＦＬプライマーとＢＬプライマーを示し、ＬＡＭＰによる核酸の増幅反応を促進する。ＦＬプライマーはＦ２配列に相補的なＦ２ｃ配列とＦ１ｃ配列の間の配列に相補的な配列、ＢＬプライマーはＢ２配列に相補的なＢ２ｃ配列とＢ１ｃ配列の間の配列に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドである。これらインナープライマー、アウタープライマー、および、ループプライマーの設計方法は、先の特許文献１、文献１〜３、および、Ｗｅｂサイトｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｉｋｅｎ．ｃｏ．ｊｐ／に公開されている。
The inner primer used for the LAMP reaction is an FIP primer and a BIP primer. The FIP primer is an oligonucleotide having a sequence called F1c homologous to the front strand of the target nucleic acid sequence on the 5 ′ side and a sequence called F2 complementary to the back strand of the target nucleic acid sequence on the 3 ′ side, The BIP primer is an oligonucleotide having a sequence called B1c homologous to the back strand of the target nucleic acid sequence on the 5 ′ side and a sequence called B2 complementary to the front strand of the target nucleic acid sequence on the 3 ′ side. The outer primer refers to an F3 primer and a B3 primer. The F3 primer is an oligonucleotide complementary to the back strand of the target nucleic acid sequence, and the B3 primer is an oligonucleotide complementary to the front strand of the target nucleic acid. The loop primer indicates an FL primer and a BL primer, and promotes a nucleic acid amplification reaction by LAMP. The FL primer is a sequence complementary to the sequence between the F2c sequence and the F1c sequence complementary to the F2 sequence, and the BL primer is an oligo having a sequence complementary to the sequence between the B2c sequence and the B1c sequence complementary to the B2 sequence. It is a nucleotide. The methods for designing these inner primer, outer primer, and loop primer are described in
具体的には、まず、標的核酸について、5'側からF3、F2、F1、B1c、B2c、B3cの６つの領域を規定し、この６つの領域の相補的な領域をF3c、F2c、F1c、B1、B2、B3と規定し、次の通り4種類のプライマーを設計する。 Specifically, first, for the target nucleic acid, six regions F3, F2, F1, B1c, B2c, and B3c are defined from the 5 ′ side, and complementary regions of these six regions are defined as F3c, F2c, F1c, Specify B1, B2, and B3, and design four types of primers as follows.
（１）FIPプライマー：標的核酸のF2領域を3'端に持ち、5'末端側に標的核酸のF1cと同じ配列を持つように設計する。
（２）F3プライマー：標的核酸のF3領域を持つように設計する。
（３）BIPプライマー：標的核酸のB2領域を3'端に持ち、5'末端側に標的核酸のB1cと同じ配列を持つように設計する。
（４）B3プライマー：標的核酸のB3領域を持つように設計する。
(1) FIP primer: designed to have the F2 region of the target nucleic acid at the 3 ′ end and the same sequence as F1c of the target nucleic acid at the 5 ′ end.
(2) F3 primer: designed to have the F3 region of the target nucleic acid.
(3) BIP primer: designed to have the B2 region of the target nucleic acid at the 3 ′ end and the same sequence as B1c of the target nucleic acid at the 5 ′ end.
(4) B3 primer: designed to have the B3 region of the target nucleic acid.
LAMP法においては、ダンベル構造の5’末端側のループの1本鎖部分（B1領域とB2領域の間、あるいは F1領域とF2領域の間）に相補的な配列を持つループプライマー（それぞれループプライマーB（本発明においてはＢＬプライマー）、ループプライマーF（本発明においてはＦＬプライマー））を用いることによりDNA合成の起点を増やすことが可能となる。ループプライマーを用いることにより、増幅時間は、ループプライマーを使用しない場合の1/3〜1/2となることが期待される。 In the LAMP method, a loop primer having a sequence complementary to the single-stranded portion (between the B1 region and B2 region or between the F1 region and F2 region) of the loop on the 5 ′ end side of the dumbbell structure (each loop primer) By using B (BL primer in the present invention) and loop primer F (FL primer in the present invention)), the starting point of DNA synthesis can be increased. By using the loop primer, the amplification time is expected to be 1/3 to 1/2 of that when the loop primer is not used.
ＬＡＭＰ反応の反応時間とはＬＡＭＰ反応産物がある一定に達する時間を言い、ここではＬＡＭＰ反応の濁度が０．１に達する時間を指標とした。よって、ＬＡＭＰ反応速度が速いとは濁度が０．１に達する時間が短いことを示す。ＬＡＭＰ反応産物の濁度が０．１の時、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ等の蛍光インターカレーターや電気泳動後のエチジウムブロマイド染色にて十分に検出できる量のＬＡＭＰ産物が形成されていることが判っている。 The reaction time of the LAMP reaction means the time when the LAMP reaction product reaches a certain level, and here, the time when the turbidity of the LAMP reaction reaches 0.1 is used as an index. Therefore, a fast LAMP reaction rate indicates that the time for the turbidity to reach 0.1 is short. It is known that when the turbidity of the LAMP reaction product is 0.1, an amount of the LAMP product that can be sufficiently detected by fluorescent intercalator such as SYBR Green I or ethidium bromide staining after electrophoresis is formed.
本発明では、核酸を増幅するＬＡＭＰ反応のターゲット配列として、淋菌のＯＲＦ１（Ｇｅｎｅｂａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． Ｓ８６１１３）遺伝子を選択した。ＯＲＦ1遺伝子は淋菌に極めて特異的な遺伝子とされており、淋菌の検出に有用であることが、先の特開平１１−１８７８５号公報に報告されており、この遺伝子にＬＡＭＰの増幅領域を設定し、プライマーの設計・改変を進めた。ＯＲＦ１遺伝子と、Ｍ．ＮｇｏＶＩＩ ｃｙｔｏｓｉｎｅ ｍｅｔｈｙｌａｓｅ （ｄｃｍＧ） ａｎｄ Ｒ．ＮｇｏＶＩＩ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ（ｄｃｒＧ）遺伝子（Ｇｅｎｅｂａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｕ４３７３６）、および特開平１１−１８７８５号公報に記載されているＮｇ−ＣＤＭＴ遺伝子は同一遺伝子と思われるが、それぞれ若干配列が異なっている。まず、配列番号３７および３８に記載の１対のＰＣＲ用プライマーにて、淋菌ゲノムＤＮＡ（ＡＴＣＣ７００８２５ＤをテンプレートしてＰＣＲを行い、その塩基配列を明らかにした（配列番号３９）。この配列を使い、ＬＡＭＰ反応用のプライマーの設計を進めた。 In the present invention, the ORF1 (Genebank accession No. S86113) gene of Aspergillus was selected as a target sequence for the LAMP reaction for amplifying nucleic acid. The ORF1 gene is considered to be a very specific gene for Neisseria gonorrhoeae, and it has been reported in Japanese Patent Application Laid-Open No. 11-18785 that it is useful for the detection of Neisseria gonorrhoeae. An LAMP amplification region is set in this gene. The design and modification of the primer was advanced. The ORF1 gene; NgoVII cytosine methylase (dcmG) and R.NgoVII. The NgoVII restriction endonuclease (dcrG) gene (Genebank accession No. U43736) and the Ng-CDMT gene described in JP-A No. 11-18785 are considered to be the same gene, but have slightly different sequences. First, PCR was carried out using a pair of PCR primers described in SEQ ID NOs: 37 and 38 using a template of Aspergillus genomic DNA (ATCC7000082D) as a template (SEQ ID NO: 39). The design of primers for LAMP reaction was advanced.
フォワード側のインナープライマーＦＩＰとして１４種、リバース側のインナープライマーＢＩＰとして１９種、フォワード側のアウタープライマーＦ３として４種、リバース側のアウタープライマーＢ３として４種オリゴヌクレオチドを設計し、淋菌のゲノムＤＮＡをテンプレートとしてＬＡＭＰ反応を行い反応の早いプライマーセットを選択した。その結果、増幅速度の速いＦＩＰプライマーとして配列番号１、２、３のオリゴヌクレオチドプライマー、ＢＩＰプライマーとして配列番号４〜９のオリゴヌクレオチドプライマー、およびこれらの組み合わせを含むプライマーミックスとして、表１記載のプライマーミックスＮＧ＃００５、ＮＧ＃０３１、ＮＧ＃０３３、ＮＧ＃０３５、表２記載のＮＧ＃１００、ＮＧ＃１０１、ＮＧ＃１０２、ＮＧ＃１０３のプライマーミックスを得た。次に、ＬＡＭＰ反応の反応速度を早めるため、インナープライマーおよびアウタープライマーに加えて最適なループプライマーを加えるべく、その検討を進めた。フォワード側のループプライマーとして配列番号１４〜２０のオリゴヌクレオチド、リバース側のループプライマーとして配列番号２１〜２８のオリゴヌクレオチドを組み合わせて表１および表２記載のプライマーミックスを添加してＬＡＭＰ反応を行い、反応速度の速いループプライマーを複数得ることができた。表１に記載したループプライマーを含む８種のプライマーミックスＮＧ＃００５−３３、ＮＧ＃０３１−３３、ＮＧ＃０３３−３３、ＮＧ＃０３５−３３、ＮＧ＃１００−３３、ＮＧ＃１０１−３３、ＮＧ＃１０２−３３、ＮＧ＃１０３−３３について検出感度および検出の特異性を検定した。その結果、ＮＧ＃００５−３３においては淋菌ゲノムＤＮＡ １ｐｇ（４３０菌体相当）であったが、ＮＧ＃０３１−３３、ＮＧ＃０３３−３３、ＮＧ＃０３５−３３、ＮＧ＃１００−３３、ＮＧ＃１０１−３３、ＮＧ＃１０２−３３、ＮＧ＃１０３−３３においては淋菌ゲノムＤＮＡ ０．１ｐｇ（４３菌体相当）を検出することができた。ＮＧ＃０３５−３３は、テンプレート量が１００ｐｇの際にはおよそ１３分で濁度が０．１に達しており、かつ、テンプレート量が０．１ｐｇのときでもおよそ３０分で濁度が０．１に達し、高感度かつ短時間に淋菌のゲノムＤＮＡを検出することができた。またこれら８種のプライマーミックスでは、テンプレートが２種の淋菌ゲノム（ＡＴＣＣ７００８２５およびＡＴＣＣ４３０７０）の時に増幅が起こるが、淋菌と同属のＮ．ｌａｃｔａｍｉｃａ（ＡＴＣＣ２３９７０）やＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（ＡＴＣＣ１３０９０）では増幅が起こらず、特異性が高いことが示された。これらの知見に基づいて、感度・特異性が高く、短時間に淋菌を検出することが可能なＬＡＭＰ反応用オリゴヌクレオチドプライマーとこれを用いた淋菌の検出法を完成するに至った。 14 types of oligonucleotides were designed as 14 types of forward inner primer FIP, 19 types of reverse inner primer BIP, 4 types of forward outer primer F3, and 4 types of reverse outer primer B3. A LAMP reaction was performed as a template, and a primer set with a fast reaction was selected. As a result, the primer described in Table 1 as a primer mix including the oligonucleotide primers of SEQ ID NOS: 1, 2, and 3 as FIP primers having a high amplification rate, the oligonucleotide primers of SEQ ID NOS: 4 to 9 as BIP primers, and combinations thereof. The primer mixes of mixes NG # 005, NG # 031, NG # 033, NG # 035, and NG # 100, NG # 101, NG # 102, and NG # 103 shown in Table 2 were obtained. Next, in order to increase the reaction rate of the LAMP reaction, the investigation was advanced to add an optimal loop primer in addition to the inner primer and the outer primer. The oligonucleotides of SEQ ID NOs: 14 to 20 as the forward loop primer, the oligonucleotides of SEQ ID NOs: 21 to 28 as the reverse loop primer are combined, and the primer mix described in Table 1 and Table 2 is added to perform the LAMP reaction, A plurality of loop primers having a high reaction rate could be obtained. 8 primer mixes including the loop primers listed in Table 1 NG # 005-33, NG # 031-33, NG # 033-33, NG # 035-33, NG # 100-33, NG # 101-33, Detection sensitivity and specificity of detection were tested for NG # 102-33 and NG # 103-33. As a result, in NG # 005-33, gonococcal genomic DNA was 1 pg (equivalent to 430 cells), but NG # 031-33, NG # 033-33, NG # 035-33, NG # 100-33, NG In # 101-33, NG # 102-33, and NG # 103-33, 0.1 pg of gonococcal genomic DNA (corresponding to 43 cells) could be detected. NG # 035-33 has a turbidity of 0.1 in about 13 minutes when the template amount is 100 pg, and the turbidity is about 0. 30 minutes even when the template amount is 0.1 pg. As a result, the gonococcal genomic DNA was detected with high sensitivity and in a short time. In these 8 primer mixes, amplification occurs when the templates are 2 types of Aspergillus genomes (ATCC7000082 and ATCC43070). lactamica (ATCC 23970) and N.I. meningitidis (ATCC13090) showed no amplification and high specificity. Based on these findings, the inventors have completed an oligonucleotide primer for LAMP reaction that has high sensitivity and specificity and can detect gonococci in a short time, and a method for detecting gonococci using the primer.
以上の通り、本発明で用いるインナープライマーとしては、
（１）配列番号２９の塩基配列を５’側に、配列番号３０の塩基配列を３’側に有し、全長が３２から４８塩基である一本鎖オリゴヌクレオチド；
（２）配列番号３１の塩基配列を５’側に、配列番号３２の塩基配列を３’側に有し、全長が３２から４８塩基である一本鎖オリゴヌクレオチド；
（３）配列番号３３の塩基配列を５’側に、配列番号３４の塩基配列を３’側に有し、全長が３１から４７塩基である一本鎖オリゴヌクレオチド；及び
（４）配列番号３５の塩基配列を５’側に、配列番号３６の塩基配列を３’側に有し、全長が３１から４７塩基である一本鎖オリゴヌクレオチド；
が挙げられる。上記オリゴヌクレオチドの具体例としては、配列番号１から９の何れかに記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。
As described above, as the inner primer used in the present invention,
(1) a single-stranded oligonucleotide having the base sequence of SEQ ID NO: 29 on the 5 ′ side, the base sequence of SEQ ID NO: 30 on the 3 ′ side, and a total length of 32 to 48 bases;
(2) a single-stranded oligonucleotide having the base sequence of SEQ ID NO: 31 on the 5 ′ side, the base sequence of SEQ ID NO: 32 on the 3 ′ side, and a total length of 32 to 48 bases;
(3) a single-stranded oligonucleotide having the base sequence of SEQ ID NO: 33 on the 5 ′ side, the base sequence of SEQ ID NO: 34 on the 3 ′ side, and a total length of 31 to 47 bases; and (4) SEQ ID NO: 35 A single-stranded oligonucleotide having a base sequence of SEQ ID NO: 36 on the 3 ′ side and a total length of 31 to 47 bases;
Is mentioned. Specific examples of the oligonucleotide include an oligonucleotide having the base sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 1 to 9.
また、本発明で用いるアウタープライマーとしては、F3として配列番号１０又は１１に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、B3として配列番号１２又は１３に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。
Moreover, as an outer primer used by this invention, the oligonucleotide which has the base sequence of
さらに、本発明で用いるループプライマーとしては、配列番号１４から２８の何れかに記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。 Furthermore, examples of the loop primer used in the present invention include an oligonucleotide having the base sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 14 to 28.
本発明においてインナープライマー、アウタープライマーまたはループプライマーとして用いる上記オリゴヌクレオチドは何れも、当業者に周知の方法である固相合成法により合成することができる。このような合成のための装置は、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓなどの業者から販売されている。 Any of the oligonucleotides used as the inner primer, outer primer or loop primer in the present invention can be synthesized by a solid phase synthesis method which is a method well known to those skilled in the art. Equipment for such synthesis is commercially available from vendors such as Applied Biosystems.
また、本発明のオリゴヌクレオチドとしては、本明細書の配列表の配列番号で示される特定の塩基配列を含む限り、オリゴヌクレオチドを構成するデオキシリボースや塩基について、その一部に他の分子が付加したり、その一部が他の分子で置換されるなどにより修飾されているものでもよい。例えば、本発明のオリゴヌクレオチドとしては、ＬＡＭＰ法で淋菌のＤＮＡを増幅した後、そのオリゴヌクレオチドの検出を簡略化するため、プライマーとするオリゴヌクレオチドの5’末端を蛍光色素であるフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）で標識したオリゴヌクレオチドや、プライマーとするオリゴヌクレオチドの5’末端にビオチンを結合し、アビジンと共有結合させたペルオキシダーゼを結合させ得るものでもよい。 Moreover, as long as it contains the specific base sequence shown by the sequence number of this specification as an oligonucleotide of this invention, another molecule is added to the deoxyribose and the base which comprise oligonucleotide. Or a part thereof may be modified by substitution with another molecule. For example, as the oligonucleotide of the present invention, the gonococcal DNA is amplified by the LAMP method, and then, in order to simplify the detection of the oligonucleotide, the 5 ′ end of the oligonucleotide used as a primer is a fluorescent dye, fluorescein isothiocyanate ( FITC) -labeled oligonucleotides or those capable of binding peroxidase covalently bound to avidin by binding biotin to the 5 ′ end of the oligonucleotide used as a primer.
本発明におけるＬＡＭＰ法では、標的遺伝子を含む試料、プライマー（FIP, F3, BIP, B3）、鎖置換型DNA Polymerase、dNTPs、及び反応緩衝液を含む反応液を調製し、６４〜６５℃で１０分から１時間程度インキュベーションすることにより、増幅産物あるいは増幅の有無を検出することができる。増幅産物の検出は簡易検出及びリアルタイム検出が可能であり、増幅する時間は、ループプライマーを利用することで更に短縮することができる。 In the LAMP method of the present invention, a sample containing a target gene, a primer (FIP, F3, BIP, B3), a strand displacement type DNA Polymerase, dNTPs, and a reaction solution containing a reaction buffer solution are prepared. By incubating for about 1 hour from minutes, the presence or absence of amplification product or amplification can be detected. Amplification products can be detected by simple detection or real-time detection, and the amplification time can be further shortened by using a loop primer.
ＬＡＭＰ法は、具体的には以下の通り行なうことができる。即ち、インナープライマー（ＦＩＰプライマーおよびＢＩＰプライマー）、ループプライマー（ＦＬプライマーおよびＢＬプライマー）及びアウタープライマー（Ｆ３プライマーおよびＢ３プライマー）を含むプライマーセットを作製し、これを適当なマイクロチューブに添加し、氷上に置く。ＬＡＭＰ反応液としては、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、１０ｍＭ ＫＣｌ、８ｍＭ ＭｇＳＯ4、１０ｍＭ（ＮＨ4）2ＳＯ4、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、０．８Ｍ Ｂｅｔａｉｎｅ、 ２．８ｍＭ ｄＧＴＰ、２．８ｍＭ ｄＣＴＰ、２．８ｍＭ ｄＡＴＰ、２．８ｍＭ ｄＴＴＰ、所定量の試料（即ち、淋菌ゲノムＤＮＡを含む試料）を添加し、全容量を適量に調整し、氷上に置く。これに、Ｂｓｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｌａｒｇｅ Ｆｒａｇｍｅｎｔ（ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢｉｏＬａｂｓ）を添加して全容量を調整し、混和した後、例えば、６４℃にて１５分から１時間反応させることによりＬＡＭＰ反応を行なう。
Specifically, the LAMP method can be performed as follows. That is, a primer set including an inner primer (FIP primer and BIP primer), a loop primer (FL primer and BL primer) and an outer primer (F3 primer and B3 primer) is prepared, and this is added to an appropriate microtube, on ice Put on. As the LAMP reaction solution, 20 mM Tris · HCl (pH 8.8), 10 mM KCl, 8 mM MgSO 4 , 10 mM (NH 4 ) 2 SO 4 , 0.1
ＬＡＭＰ反応におけるインナープライマーの濃度は、ＬＡＭＰ反応が進む限り特に限定されないが、一般的にはプライマーの各々につき、１０〜７０ｐｍｏｌ／２５μｌ、好ましくは３０〜５０ｐｍｏｌ／２５μｌ、例えば４０ｐｍｏｌ／２５μｌとすることができる。 The concentration of the inner primer in the LAMP reaction is not particularly limited as long as the LAMP reaction proceeds, but generally it is 10 to 70 pmol / 25 μl, preferably 30 to 50 pmol / 25 μl, for example 40 pmol / 25 μl for each primer. it can.
ＬＡＭＰ反応におけるループプライマーの量は、ＬＡＭＰ反応が進む限り特に限定されないが、一般的にはプライマーの各々につき、１０〜１５０ｐｍｏｌ／２５μｌ、好ましくは１０〜１００ｐｍｏｌ／２５μｌ、例えば２０、４０または６０ｐｍｏｌ／２５μｌとすることができる。 The amount of the loop primer in the LAMP reaction is not particularly limited as long as the LAMP reaction proceeds, but generally 10 to 150 pmol / 25 μl, preferably 10 to 100 pmol / 25 μl, for example 20, 40 or 60 pmol / 25 μl, for each primer. It can be.
ＬＡＭＰ反応におけるアウタープライマーの量は、ＬＡＭＰ反応が進む限り特に限定されないが、一般的にはプライマーの各々につき、２〜２０ｐｍｏｌ／２５μｌ、好ましくは２〜１０ｐｍｏｌ／２５μｌ、例えば５ｐｍｏｌ／２５μｌとすることができる。 The amount of the outer primer in the LAMP reaction is not particularly limited as long as the LAMP reaction proceeds, but generally 2 to 20 pmol / 25 μl, preferably 2 to 10 pmol / 25 μl, for example, 5 pmol / 25 μl, for each primer. it can.
ＬＡＭＰ反応による増幅反応の過程では、副産物としてピロリン酸マグネシウムが産生される。この副産物は、増幅産物と比例して産生されることから、増幅産物量が非常に多いLAMP法では白濁として観察することができる。即ち、ＬＡＭＰ法ではこの白濁の有無で標的遺伝子の有無を確認することができる。また、ＬＡＭＰ反応とその後の反応産物の検出は、ＬＡＭＰ反応専用リアルタイム濁度測定装置ＬＡ―２００（テラメックス社）などの市販の装置を用いて行なうことができる。 In the course of the amplification reaction by the LAMP reaction, magnesium pyrophosphate is produced as a by-product. Since this by-product is produced in proportion to the amplification product, it can be observed as white turbidity in the LAMP method with a very large amount of amplification product. That is, in the LAMP method, the presence or absence of the target gene can be confirmed by the presence or absence of this cloudiness. In addition, the LAMP reaction and the subsequent detection of the reaction product can be performed using a commercially available apparatus such as a LAMP reaction-dedicated real-time turbidity measurement apparatus LA-200 (Teramex).
あるいは、蛍光インターカレーター（例えば、エチジウムブロマイド等）の存在下で増幅させた増幅産物の入ったチューブにＵＶランプを照射することにより、鋳型DNA（標的遺伝子）が存在する場合には、蛍光強度が上がり、肉眼でも増幅の有無、いわゆる標的遺伝子の有無を確認することができる。 Alternatively, when template DNA (target gene) is present by irradiating a tube containing an amplification product amplified in the presence of a fluorescent intercalator (for example, ethidium bromide), the fluorescence intensity is increased. The presence or absence of amplification, the presence or absence of a so-called target gene can be confirmed with the naked eye.
上記以外としては、ＬＡＭＰ反応後、反応産物を電気泳動により分離し、エチジウムブロマイドあるいはサイバーグリーンで核酸染色を行い、増幅されたヌクレオチド配列の塩基長が、上述の標的配列の塩基長と等しければ検体中に検出対象の淋菌が存在すると判定できる。増幅されたヌクレオチド配列の検出には、クロマトグラフィーを使用することもできる。
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
Other than the above, after the LAMP reaction, the reaction products are separated by electrophoresis, and nucleic acid staining is performed with ethidium bromide or cyber green. If the base length of the amplified nucleotide sequence is equal to the base length of the target sequence described above, It can be determined that the koji mold to be detected exists. Chromatography can also be used to detect the amplified nucleotide sequence.
The following examples further illustrate the present invention, but the present invention is not limited to the examples.
［実施例１］プライマーの検定
ＬＡＭＰ反応プライマーとして用いるオリゴヌクレオチドは化学的に合成した。インナープライマーとして４０ｐｍｏｌのＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマー、アウタープライマーとして５ｐｍｏｌのＦ３プライマー、Ｂ３プライマー、ループプライマーとして２０ｐｍｏｌのＦＬプライマー、ＢＬプライマーを含むプライマーミックス（表１）を調製し、０．２ｍｌマイクロチューブ（栄研化学）に添加し、氷上に置いた。ＬＡＭＰ反応液として、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、１０ｍＭ ＫＣｌ、８ｍＭ ＭｇＳＯ4、１０ｍＭ （ＮＨ4）2ＳＯ4、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０、０．８Ｍ Ｂｅｔａｉｎｅ、 ２．８ｍＭ ｄＧＴＰ、２．８ｍＭ ｄＣＴＰ、２．８ｍＭ ｄＡＴＰ、２．８ｍＭ ｄＴＴＰ、１００ｐｇ Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ（ＡＴＣＣ７００８２５）ゲノムＤＮＡを添加し、全容量を２４μｌとし氷上に置いた。これに、８ｕｎｉｔｓ／μｌのＢｓｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｌａｒｇｅ Ｆｒａｇｍｅｎｔ（ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢｉｏＬａｂｓ）１μｌを添加して全容量を２５μｌとし、ゆっくり混和した後、速やかにＬＡＭＰ反応専用リアルタイム濁度測定装置ＬＡ―２００（テラメックス社）にセットして６４℃にて６０分間反応させ、ＬＡＭＰ増幅反応液の濁度を測定した。ＬＡＭＰ反応の指標として濁度が０．１に達した時間を抽出し、その結果を表３に示した。ループプライマーの添加によって増幅に要する時間を大幅に短縮することができ、ＮＧ＃０３５−３３においては１５分にて濁度が０．１に達した。
Example 1 Primer Assay Oligonucleotides used as LAMP reaction primers were chemically synthesized. Prepare a primer mix (Table 1) containing 40 pmol FIP primer, BIP primer as inner primer, 5 pmol F3 primer, B3 primer as outer primer, 20 pmol FL primer as loop primer, and BL primer (Table 1). Eiken Chemical) and placed on ice. As a LAMP reaction solution, 20 mM Tris · HCl (pH 8.8), 10 mM KCl, 8 mM MgSO 4 , 10 mM (NH 4 ) 2 SO 4 , 0.1
［実施例２］プライマーの検定
表２記載のプライマーミックスについて実施例１と同様にプライマーの検定を行った。その結果を表４及び５に示す。
Example 2 Primer Assay Primer assays described in Table 2 were conducted in the same manner as in Example 1. The results are shown in Tables 4 and 5.
［実施例３］検出感度の検定
表１記載のプライマーミックスＮＧ＃００５−３３、ＮＧ＃０３１−３３、ＮＧ＃０３３−３３、ＮＧ＃０３５−３３、ＮＧ＃００５−３３、および、表２記載のプライマーミックスＮＧ＃１００−３３、ＮＧ＃１０１−３３、ＮＧ＃１０２−３３、ＮＧ＃１０３−３３の検出感度を調べた。テンプレートとして、１００ｐｇ〜０．１ｐｇのＮ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ（ＡＴＣＣ７００８２５）ゲノムＤＮＡを用い、その他の条件は実施例１と同様にして行った。その結果を表６に示す。ＮＧ＃０３５−３３が最も反応速度が速く、淋菌ゲノムＤＮＡ １００ｐｇ（４３０００分子相当）をテンプレートとした時は１３分で濁度が０．１に到達した。淋菌ゲノムＤＮＡ ０．１ｐｇ（４３分子相当）をテンプレートとした時でも２１分で濁度が０．１に達し、検出限界が０．１また検出限界げゲノムＤＮＡ ０．１ｐｇ（４３分子）であった。
[Example 3] Detection sensitivity detection Primer mixes listed in Table 1 NG # 005-33, NG # 031-33, NG # 033-33, NG # 035-33, NG # 005-33, and Table 2 Of the primer mixes NG # 100-33, NG # 101-33, NG # 102-33, and NG # 103-33. As a template, Ng of 100 pg to 0.1 pg. gonorhoeae (ATCC7000082) genomic DNA was used and the other conditions were the same as in Example 1. The results are shown in Table 6. NG # 035-33 had the fastest reaction rate, and the turbidity reached 0.1 in 13 minutes when 100 pg (corresponding to 43000 molecules) of Aspergillus genomic DNA was used as a template. Even when using 0.1 pg of Aspergillus genomic DNA (equivalent to 43 molecules) as a template, the turbidity reached 0.1 in 21 minutes, the detection limit was 0.1, and the detection limit was 0.1 pg (43 molecules). It was.
［実施例４］特異性（交差性）の検定
表１記載のプライマーミックスＮＧ＃００５−３３、ＮＧ＃０３１−３３、ＮＧ＃０３３−３３、ＮＧ＃０３５−３３、ＮＧ＃００５−３３、および、表２記載のプライマーミックスＮＧ＃１００−３３、ＮＧ＃１０１−３３、ＮＧ＃１０２−３３、ＮＧ＃１０３−３３の淋菌特異性を調べた。ＬＡＭＰ反応液は実施例１と同様にして調製し、ＬＡＭＰ反応のテンプレートして、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ （ＡＴＣＣ７００８２５）、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ（ＡＴＣＣ４３０７０）、Ｎ．ｌａｃｔａｍｉｃａ（ＡＴＣＣ２３９７０）、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（ＡＴＣＣ１３０９０）のゲノムＤＮＡ 各１００ｐｇを使いＬＡＭＰ反応を行った。その結果を図１から図８に示す。いずれのプライマーミックスとも、淋菌のゲノムＤＮＡ（ＮＧ１およびＮＧ２）をテンプレートした時のみ増幅が進み、特異性が高いことが示された。
[Example 4] Specificity (crossing) assay Primer mixes NG # 005-33, NG # 031-33, NG # 033-33, NG # 035-33, NG # 005-33, and Table 1 The gonococcal specificity of primer mixes NG # 100-33, NG # 101-33, NG # 102-33, and NG # 103-33 shown in Table 2 was examined. A LAMP reaction solution was prepared in the same manner as in Example 1. gonorrhoeae (ATCC 7000825), N.M. gonorrhoeae (ATCC 43070), N.M. lactamica (ATCC 23970), N.L. LAMP reaction was performed using 100 pg of genomic DNA of meningitidis (ATCC13090). The results are shown in FIGS. In any of the primer mixes, amplification progressed only when gonococcal genomic DNA (NG1 and NG2) was used as a template, indicating high specificity.
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2004
- 2004-03-29 JP JP2004094741A patent/JP2005278443A/en not_active Withdrawn
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