JP2005274568A

JP2005274568A - 全ヘモグロビン測定のための分光分析方法および装置

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Publication number: JP2005274568A
Application number: JP2005068512A
Authority: JP
Inventors: James Samsoondar; ジェームスサムスーンダール，; Duncan Macintyre; ダンカンマッキンタイヤ，
Original assignee: Spectromedical Inc
Current assignee: Spectromedical Inc
Priority date: 2004-03-22
Filing date: 2005-03-11
Publication date: 2005-10-06

Abstract

【課題】全−Ｈｂを測定する改良された方法および装置を提供する。
【解決手段】試料の全−Ｈｂを測定する方法であって、Ｏｘｙ−Ｈｂ、”Ｏｘｙ−ＨｂプラスＤｅｏｘｙ−Ｈｂ”または”全−ＨｂマイナスＭｅｔ−Ｈｂ”に対する第１の一次検量解法およびＭｅｔ−Ｈｂ、Ｃａｒｂｏｘｙ−ＨｂまたはＳｕｌｆ−Ｈｂに対する第２の一次検量解法または第１と第２の一次検量解法を合算して得られる第３の一次検量解法を具備する分光測定器を使用して吸光度を収集する。続いて、Ｏｘｙ−Ｈｂ、”Ｏｘｙ−ＨｂプラスＤｅｏｘｙ−Ｈｂ”または”全−ＨｂマイナスＭｅｔ−Ｈｂ”に対する第１の値を予測しＭｅｔ−Ｈｂ、Ｃａｒｂｏｘｙ−ＨｂまたはＳｕｌｆ−Ｈｂに対する第２の値を予測して第１の値と第２の値を合計するか、または全−Ｈｂを予測する。試料は大気酸素に暴露されてから全−Ｈｂを予測する。
【選択図】図１

Description

この発明は、生体試料中の全ヘモグロビン（血色素）（Ｈｂ）の分光分析の分野に関する。本発明は生体試料中の全−Ｈｂを測定するための方法とその装置に関する。

血液全体（全血）の血清、血漿は臨床試験で日常的に試験される。日常的な臨床試験では、赤血球（ＲＢＣ）は遠心分離で血清から分離され、または遠心分離の前に赤血球と種々の血漿蛋白は凝固により血清から分離される。Ｈｂは、脂質粒子と同様の光散乱物質であり、それと胆汁色素ビリルビン（ＢＲ）および胆緑素ビリベルディン（ＢＶ）は典型的な血液成分であり、これらは血液検査における分光学的な検査や他の分析に干渉しそして影響する。このような干渉剤の存在は血清、血漿試験に影響し、それ自体が試料保全を危うくさせると言い得る。

ＣＯ−酸素測定法は全血中の主たるＨｂ種、例えばオキシ−ヘモグロビン（Ｏｘｙ−Ｈｂ）、デオキシ−ヘモグロビン（Ｄｅｏｘｙ−Ｈｂ）、メット−ヘモグロビン（Ｍｅｔ−Ｈｂ）、カルボキシ−ヘモグロビン（Ｃａｒｂｏｘｙ−Ｈｂ）およびサルフ−ヘモグロビン（Ｓｕｌｆ−Ｈｂ）を測定する技術である。ＣＯ−酸素測定法は、試料が酸素に触れるのを防ぎながら採血し、それによりＤｅｏｘｙ−ＨｂがＯｘｙ−Ｈｂに転換するのを最小限度に止める。さらに、この技術では赤血球は測定用キュベットで溶血して光学的に透明になる。全血試料を溶血する最も普通に使用される方法は、試料を超音波発生器の音波に当てる方法であり、化学溶血剤もまた使用される。最近のＣＯ−酸素測定法は検量線解法で異なる波長におけるＨｂ種の吸光係数を用いる方法である。溶血系が要求するのでＲＢＣ蛋白による光散乱効果を扱うようには設計されていない。例えばアメリカ特許第４９９７７６９号明細書のようなあるＣＯ−酸素測定法は、たとえば、キロミクロン（chylomicron）（赤血球はキロミクロンよりも１−２桁大きい）のような微粒子による光散乱を数学的に扱うが、溶血システムは依然として必要である。

試料中の全ヘモグロビン（Ｔｏｔ−Ｈｂ）を測定する最近の方法は、好ましくは試薬を利用し、これによると、Ｏｘｙ−Ｈｂ、Ｄｅｏｘｙ−Ｈｂ、Ｃａｒｂｏｘｙ−ＨｂおよびＭｅｔ−Ｈｂのような異なるＨｂ種を単一種に変換し、それから分光法により単一波長で測定して求める方法であり、たまに第２の波長による測定が行われる。試薬は通常、有害で（たとえば、青酸カリやアジド）、そして体液中のＨｂの測定には無試薬の方法が望まれる。ハーボエ（ハーボエ、Ｍ．，１９５９,近紫外線分光法による血漿中のヘモグロビンの測定方法、Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ，ｐｐ．６６−７０）とティエツ（臨床化学のティエツの教科書、第３版、１９９９，ｐｐ１６７４−１６７６；これはここに参考で組み入れられる）は、Ｈｂ測定に無試薬のスペクトル分析の例を示した。Ｈｂは非常に強い吸光信号を発するが、Ｈｂ種の吸光スペクトルはかなりの相違を示す。無試薬の分光方法はほとんどＯｘｙ−ＨｂとＤｅｏｘｙ−Ｈｂを含む試料に限られる。Ｄｅｏｘｙ−Ｈｂは通常、試料を大気酸素にしばらく曝してＯｘｙ−Ｈｂに変換される。双方の方法（ハーボエとティツエ）の最大の誤差の原因は、Ｍｅｔ−Ｈｂの存在である。アメリカ特許第６６８９６１２号明細書（サムスーンダー）では、溶血の指標として全−Ｈｂ、オキシ−ヘモグロビン（Ｏｘｙ−Ｈｂ）および“全−Ｈｂマイナスメット−ヘモグロビン（Ｍｅｔ−Ｈｂ）”を用いる方法が記載される。Ｍｅｔ−Ｈｂの吸収スペクトルは他のＨｂ種とは大きく相違するので、Ｈｂのために開発された検量線解法が“全−ＨｂマイナスＭｅｔ−Ｈｂ”を予測するのに良いであろう。しかし、アメリカ特許第６６８９６１２号明細書は、全血中の全−Ｈｂを測定する方法と装置を開示しない。

Ｍｅｔ−ＨｂはＨｂの酸化生成物であり、ヘモグロビン系血液置換体のＭｅｔ−Ｈｂ形もヘモグロビンベースの代用血液の酸化生成物である。自然のＨｂからのＭｅｔ−ＨｂまたはＨｂ系の代用血液は酸素と結合できないので、Ｍｅｔ−Ｈｂまたはヘモグロビンベースの代用血液のＭｅｔ−Ｈｂ形は機能的Ｈｂではない。

「発明の要約」
この発明は生体試料中の全ヘモグロビン（Ｈｂ）の分光分析の分野に関する。本発明は生体試料中の全−Ｈｂを測定する方法および装置を提供する。

本発明の目的は全−Ｈｂを測定する改良された方法および装置を提供する。

本発明は、試料中の全−Ｈｂを測定する方法（Ａ）を提供し、それは以下からなり、
ｉ）一つまたは一つ以上の第１または第２の分光分析装置を用いて試料の吸光度を測定し、該装置はＯｘｙ−Ｈｂ、“Ｏｘｙ−ＨｂプラスＤｅｏｘｙ−Ｈｂ”または“全−ＨｂマイナスＭｅｔ−Ｈｂ”のための第１の一次検量解法と、Ｍｅｔ−Ｈｂ、Ｃａｒｂｏｘｙ−ＨｂまたはＳｕｌｆ−Ｈｂのための一つまたは一つ以上の第２の一次検量解法を有するか、または第１の一次検量解法と第２の一次検量解法の項を加算することにより得られる第３の一次検量解法を有し、そして、
ｉｉ）次ぎのいずれかを予測し、
ａ）標準の一組の波長の一つまたは一つ以上の波長における試料の吸光度のある次数の導関数を第１の一次検量解法に適用することによりＯｘｙ−Ｈｂ、“Ｏｘｙ−ＨｂマイナスＤｅｏｘｙ−Ｈｂ”または“全−ＨｂマイナスＭｅｔ−Ｈｂ”の一つの第１の値を予測し、そして第２の一次検量解法に標準の一組の波長の一つまたは一つ以上の波長における吸光度のある次数の導関数を適用することにより試料中のＭｅｔ−Ｈｂ、Ｃａｒｂｏｘｙ−ＨｂまたはＳｕｌｆ−Ｈｂのうちの一つまたは一つ以上の一つまたは一つ以上の第２の値を予測し、そして前記第１の値と一つまたは一つ以上の前記第２の値を加算して全―Ｈｂの測定値を求める、または、
ｂ）標準の一組の波長の一つまたは一つ以上の波長における試料の吸光度のある次数の導関数に適用される第３の一次検量解法を使用する全―Ｈｂを予測する。

さらに、試料は、全血、血清、血漿、尿、滑液、リンパ液、唾液、糞便、または髄液の一つであり得るし、そして全―Ｈｂは溶血の指標として使用され得る。さらに、本発明は、試料は吸光度測定に先立ち、大気酸素に暴露され得ることを含む上記記載の方法に関する。さらに、試料中の赤血球は手付かずであり、吸光度測定前には溶血されない。また測定材料の吸光度係数検量解法には使用されない。

本発明は、また、上記記載の方法（Ａ）に関し、ここで、収集段階（段階ｉ）からなり、第1の一次検量解法および一つまたは一つ以上の第２の一次検量解法が生成され、それは標準の組の波長の一つまたは一つ以上の波長における吸光度のある次数の導関数を使い、Ｏｘｙ−Ｈｂ、“Ｏｘｙ−ＨｂプラスＤｅｏｘｙ−Ｈｂ”、“全−ＨｂマイナスＭｅｔ−Ｈｂ”、Ｍｅｔ−Ｈｂ、Ｃａｒｂｏｘｙ−Ｈｂ、またはＳｕｌｆ−Ｈｂの一つまたは一つ以上に対する公知の参照値を有する一つまたは一つ以上の一次検量解法の組を用いる一つまたは一つ以上の第１の装置から得られ、第１の一次検量解法はＯｘｙ−Ｈｂ、“Ｏｘｙ−ＨｂプラスＤｅｏｘｙ−Ｈｂ”、または“全−ＨｂマイナスＭｅｔ−Ｈｂ”の一つに対して発生され、標準の組の波長の一つまたは一つ以上の波長における吸光度のある次数の導関数、公知の参照値および統計処理を用い、一つまたは一つ以上の第２の一次検量解法は、Ｍｅｔ−Ｈｂ、Ｃａｒｂｏｘｙ−ＨｂまたはＳｕｌｆ−Ｈｂの一つまたは一つ以上に対して生成され、標準の組の波長の一つまたは一つ以上の波長における吸光度のある次数の導関数、公知の参照値および統計処理を用いる。さらに、標準の波長は約３００ｎｍから約２５０ｎｍの範囲から選択されることができるし、統計処理は、単純線形回帰、多重線形回帰、および多変数データ解析からなる群から選択され得る。統計処理が多変数データ解析ならば、それは、部分最小自乗法、主要構成要素解析、神経回路網および遺伝子解法からなる群から選択され得る。

本発明は上記記載の方法（Ａ）を含み、それは第１の一次検量解法と一つまたは一つ以上の第２の一次検量解法または第３の一次検量解法が共同して第２の装置にインストールされ、収集段階では（段階ｉ）、吸光度が第２の装置により測定されて吸光度測定がなされる。さらに、第１の一次検量解法と一つまたは一つ以上の第２の一次検量解法は、第１の解法の組とは区別される独自の検量材の小さな一組を使用してアップグレードされ得る。

本発明は上記した方法（Ａ）を提供し、それは、一つまたは一つ以上の装置が第２の装置であり、データ処理段階は収集段階（段階ｉ）に続き、そして予想段階（段階ｉｉ）の前に位置する。さらに、データの前処理段階は内挿（補間）吸光度の計算；吸光度の平滑化；吸光度の１次および高次導関数の計算；増大化散乱修正；データ変換；測光補正およびこれらの組合せからなる群から選択される処理である。

本発明は試料中の全−Ｈｂを測定する試薬を使用しない分光的方法（Ｂ）を提供し、それは以下からなり、
ｉ）全−Ｈｂのための一次検量解法からなる一つまたは一つ以上の分光装置を使用して試料の吸光度を値を求め、試料は大気酸素に暴露されており、そして
ｉｉ）一次検量解法を標準の波長の組の一つまたは一つ以上の波長における吸光度のある次数の導関数に適用することにより試料中の全−Ｈｂの値を予測して全−Ｈｂの測定をする。

さらに、データ前処理段階は、収集段階（段階ｉ）に続くものであり、そして予測段階（段階ｉｉ）の前に位置する。データ前処理段階は、内挿吸光度の計算；；吸光度の平滑化；吸光度の１次および高次導関数の計算；増大化散乱修正；データ変換；測光補正およびこれらの組合せからなる群から選択される処理である。試料は、全血、血清、血漿、尿、滑液、リンパ液、唾液、糞便、または髄液の一つであり得るし、そして全―Ｈｂは溶血の指標として使用され得る。さらに、試料中の赤血球は未変化のままであり、吸光度測定の前に溶血されない。また、測定される材料の吸光係数は検量解法には使用されない。

本発明は試料中の全−Ｈｂを測定する試薬を使用しない分光的方法（Ｂ）を提供し、それは、収集段階（段階ｉ）では、全−Ｈｂのために一次検量解法が一つまたは一つ以上の第１の装置から得られる標準の組の波長の一つまたは一つ以上の波長における吸光度のある次数の導関数、一次検量の組から得られる公知の参照値および統計処理を使用して生成され、検量の組の各試料は分光測定の前に大気酸素に暴露され、そして、一次検量の組は、Ｏｘｙ−Ｈｂ、Ｄｅｏｘｙ−Ｈｂ、およびＳｕｌｆ−Ｈｂの一つまたは一つ以上の約０％から約１００％の公知の参照値からなる。任意に、一次検量の組の試料は一つまたは一つ以上の干渉物質を含み、例示されるが限定されない、ビリルビン、ビリベルディン、例えばメチレンブルーのような染料、たとえば内部脂質（intralipid）のような光散乱物質であり、これらは患者の血液中に見られる。

さらに、一次検量解法は、第２の装置にインストールされて、これと共同し、収集段階（段階ｉ）では試料の吸光度は第２の装置で測定されて吸光度測定がされる。さらに、第１の一次検量解法は、吸光度測定に先立ち一次検量の組とは区別される独自の検量材の小さな組を使用して改良され得るし、そして波長の標準の組は約３００ｎｍから約２５００ｎｍの範囲からまたはこの範囲の任意から選択され得る。統計処理は、単純線形回帰、多重線形回帰、および多変数データ解析からなる群から選択され得る。統計処理が多変数データ解析ならば、それは、部分最小自乗法、主要構成要素解析、神経回路網および遺伝子解法からなる群から選択され得る。

本発明は試薬を使用しない分光的方法（Ｂ）を提供し、それはＭｅｔ−Ｈｂの形態を取る全−Ｈｂの割合を測定することは、試料中の一つまたは一つ以上のＨｂベースの代用血液の減成または減成の反対を測定する方法を提供する。

本発明は分光装置を提供し、それは以下からなり、
ａ）電磁波（ＥＭＲ）照射源；
ｂ）ＥＭＲ源と試料投入口の間に位置する第１の開口で、その間に光路が形成される；
ｃ）前記光路内に配置される試料容器を収納する装置内の前記試料投入口；
ｄ）光路内に位置する第２の開口で、試料投入口と一つまたは一つ以上の光検知器の間に位置し、それは分光装置と共同で作動する一つまたは一つ以上の光検知器であり；
そして次ぎのいずれかを有する、
ｅ）分光装置と連動する第１の一次検量解法であって、当該第１の一次検量解法は、Ｏｘｙ−Ｈｂ、“Ｏｘｙ−ＨｂプラスＤｅｏｘｙ−Ｈｂ”、“全−ＨｂマイナスＭｅｔ−Ｈｂ”、Ｍｅｔ−Ｈｂ、Ｃａｒｂｏｘｙ−ＨｂまたはＳｕｌｆ−Ｈｂの一つまたは一つ以上の公知の参照値を有する一つまたは一つ以上の検量の組を使用する一つまたは一つ以上の第１の装置により得られる標準の組の波長の一つまたは一つ以上の波長における吸光度のある次数の導関数および統計処理を使用してＯｘｙ−Ｈｂ、“Ｏｘｙ−ＨｂプラスＤｅｏｘｙ−Ｈｂ”または“全−ＨｂマイナスＭｅｔ−Ｈｂ”の一つに対して生成され、および前記分光装置と連動する一つまたは一つ以上の第２の一次検量解法であって、この一つまたは一つ以上の第２の一次検量解法は標準の組の波長の一つまたは一つ以上の波長における吸光度のある次数の導関数、公知の参照値および統計処理を使用してＭｅｔ−Ｈｂ、Ｃａｒｂｏｘｙ−ＨｂまたはＳｕｌｆ−Ｈｂの一つまたは一つ以上に対して生成され；または
ｆ）分光装置と連動する第３の一次検量解法であって、当該第３の一次検量解法は第１の一次検量解法の項と一つまたは一つ以上の第２の検量解法の項を加算して得られる。

本発明は分光装置を提供し、それは以下からなり、
ａ）電磁波（ＥＭＲ）照射源；
ｂ）ＥＭＲ源と試料投入口の間に位置する第１の開口で、その間に光路が形成される；
ｃ）前記光路内に配置される試料容器を収納する装置内の前記試料投入口；
ｄ）光路内に位置する第２の開口で、試料投入口と一つまたは一つ以上の光検知器の間に位置し、それは分光装置と共同で作動する一つまたは一つ以上の光検知器であり；
そして次ぎのいずれかを有する、
ｅ）分光装置と連動する一つまたは一つ以上の第１の一次検量解法であって、一つまたは一つ以上の第１の装置から得られる標準の波長の組の一つまたは一つ以上の波長における吸光度のある次数の導関数と統計処理を使用して全−Ｈｂに対する一次検量解法が生成され、ここで検量の組の各試料は分光測定の前に大気酸素に暴露され、そして検量の組はＯｘｙ−Ｈｂ、Ｄｅｏｘｙ−Ｈｂ、Ｍｅｔ−Ｈｂ、Ｃａｒｂｏｘｙ−ＨｂおよびＳｕｌｆ−Ｈｂの一つまたは一つ以上の約０から約１００％の公知の参照値からなる。

本発明は、一定の期間にわたって得られる試料中の一つまたは一つ以上のＨｂベースの代用血液の減成または減成の反対を観測する方法（Ｃ）を提供し、それは以下からなる；
ｉ）Ｍｅｔ−Ｈｂに対する第１の一次検量解法と一つまたは一つ以上のＨｂベースの血液成分に対する第２の検量解法を標準の組の一つまたは一つ以上の波長の吸光度のある次数の導関数に適用することによりＭｅｔ−Ｈｂの第１の濃度と一つまたは一つ以上の試料の一つのＨｂベースの血液成分の一つまたは一つ以上の第１の濃度を求める；
ｉｉ）Ｍｅｔ−Ｈｂに対する第１の一次検量解法と一つまたは一つ以上のＨｂベースの血液成分に対する第２の一次検量解法を標準の組の波長の一つまたは一つ以上の波長における試料の吸光度のある次数の導関数に適用することにより第２の時刻の一つまたは一つ以上の試料中のＭｅｔ−Ｈｂの第２の濃度および一つまたは一つ以上のＨｂベースの代用血液の第２の濃度を求める；そして
ｉｉｉ）Ｍｅｔ−Ｈｂの第１の濃度と一つまたは一つ以上のＨｂベースの代用血液の第１の濃度を用いてＭｅｔ−Ｈｂの形態にあるＨｂベースの代用血液の一つまたは一つ以上の第１の割合を計算し、そしてＭｅｔ−Ｈｂの第２の濃度と一つまたは一つ以上のＨｂベースの代用血液の第２の濃度を用いてＭｅｔ−Ｈｂの形態にあるＨｂベースの代用血液の一つまたは一つ以上の第２の割合を計算し；そして、
第１の割合と比較して第２の割合の増加は一つまたは一つ以上の代用血液の減成を意味し、第２の割合の減少は、第１の割合と比較すると、一つまたは一つ以上の代用血液の減成の反対を意味する。さらに、Ｍｅｔ−Ｈｂの形態にある全−Ｈｂの割合は、同一の患者から時系列的に収集された試料の一つ以上により測定されることができるし、そしてＭｅｔ−Ｈｂ値または割合の増加は代用血液の減成の指標であり、そしてＭｅｔ−Ｈｂ値または割合の減少は代用血液の減成の反対の指標である。

また本発明によれば、試料中のＨｂベースの代用血液の一つまたは一つ以上の減成を測定する方法（Ｄ）を提供し、それは以下からなり；
ｉ）Ｍｅｔ−Ｈｂに対する検量解法と一つまたは一つ以上のＨｂベースの代用血液の一つまたは一つ以上に対する検量解法からなる分光装置を使用して波長の標準の組の一つまたは一つ以上の波長における試料の吸光度を測定し；
ｉｉ）Ｍｅｔ−Ｈｂに対する検量解法を吸光度のある次数の導関数に適用することにより吸光度からＭｅｔ−Ｈｂの第１の濃度を計算し、そしてＨｂベースの代用血液に対する検量解法の一つまたは一つ以上を吸光度のある次数の導関数に適用することにより吸光度から一つまたはそれ以上のＨｂベースの代用血液のの第２の濃度を計算し；
ここで、Ｍｅｔ−Ｈｂの第１の濃度が一つまたは一つ以上のＨｂベースの代用血液の第２の濃度の３％に等しいかまたはそれより大きいならば、それは一つまたは一つ以上のＨｂベースの代用血液の減成を意味する。

好ましくは、試料は、一つまたは一つ以上のＨｂベースの代用血液を注入された患者から得られた全血試料、一つまたは一つ以上のＨｂベースの代用血液を注入された患者から得られた血清試料、一つまたは一つ以上のＨｂベースの代用血液を注入された患者から得られた血漿試料、および貯蔵の一つまたは一つ以上のＨｂベースの代用血液からなる群から選ばれる。

本発明は上記方法（Ｃ）または（Ｄ）のいずれかの方法に関し、測定または決定の段階（段階ｉ）では、分光装置は以下からなり、
ａ）光路を生成する一つまたは一つ以上の電磁波（ＥＭＲ）源；
ｂ）光路に直線状に整列する一つまたは一つ以上の光検知器；
ｃ）光路内に配置される試料容器を収納する試料投入口；
ｄ）分光装置と連動する一つまたは一つ以上の一次検量解法であって、一つまたは一つ以上の他の装置を使用して展開されてなるものか、または分光装置と連動する一つまたは一つ以上の改良された一次検量解法。

さらに、試料容器は、キュベット、試料タブ、ピペットチップ、管、標識試験管、未標識試験管、血液バッグ管、透明試料容器、半透明試料容器、および流下（flow-through）キュベットからなる群から選択され得る。

本発明は、分光的方法により、被検物質、たとえば全―Ｈｂを測定する方法を記述し、また、同時に、天然のＨｂまたはＨｂベースの代用血液からＭｅｔ−Ｈｂを測定する方法を記述する。これらの方法は、先行の技術よりもより正確である。被検物質の分析に使用される装置もまた記述される。

更に、本発明は、上記の、例示されるが限定されない、方法（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）または（Ｄ）に使用される吸光度の１次または２次導関数を規定して、キロミクロンやＲＢＣような粒子による散乱を防止する。しかし、０次に代表される吸光度のいかなる次数の導関数も本願発明の範囲内であると理解すべきである。

試料が全血ならば、本願発明は溶血システムまたは溶血剤を必要とせず、そして試料は空気に曝される。Ｄｅｏｘｙ−Ｈｂは大気酸素に暴露されると容易にＯｘｙ−Ｈｂに変化するのでＤｅｏｘｙ−Ｈｂの測定が要求されない場合空気に曝すのが好ましい。実例として、大気酸素に暴露された全血試料中の酸素と等価の分圧は約１５０ｍｍ水銀柱であり、すなわち、７６０ｍｍＨｇ（大気圧）の２０％であり、そして動脈血中の酸素分圧よりもはるかに大であって、それは健康な成人では８０−１００ｍｍＨｇである；動脈血の９５％Ｈｂ以上が、Ｏｘｙ−Ｈｂの形であるが、これはＭｅｔ−Ｈｂ、Ｃａｒｂｏｘｙ−ＨｂおよびＳｕｌｆ−Ｈｂが異常なレベルではない前提である。

本発明に使用される検量解法は、キロミクロンやＲＢＣ‘ｓのような高度に光散乱性の粒子の存在または不存在下に機能し得るのでＲＢＣ’ｓの溶解は必要とされない。これはＣＯ−酸素計とは対照的であり、そこではＲＢＣ‘ｓの溶解が必要であり、そして種々のＨｂ種に対する波長特性モル吸光係数が一次検量解法に使用されている。むしろ、本発明では、ＲＢＣ’ｓの溶解なしでそして種々のＨｂ種に対する波長特性モル吸光係数を使用せずに全−Ｈｂの測定が規定される。また血液試料が無酸素状態のままに保存される必要があるＣＯ−酸素計に使用される方法とは対照的に、本発明の方法は試料を大気酸素に曝してＯｘｙ−ＨｂとＤｅｏｘｙ−Ｈｂを一つに合算し種々のＨｂ種を測定する方法を提供する。全―Ｈｂを測定するかまたは計算した後、次ぎの種の一つまたはそれ以上が全−Ｈｂのパーセントの割合として決定されることができる：Ｏｘｙ−Ｈｂ、“Ｏｘｙ−ＨｂプラスＤｅｏｘｙ−Ｈｂ”、Ｍｅｔ−Ｈｂ、Ｃａｒｂｏｘｙ−ＨｂおよびＳｕｌｆ−Ｈｂ。

本発明の要約は必ずしも本発明の全ての特徴を記載しない。
図面の簡単な説明

本発明の特徴は添付の図面を参照してなされる次ぎの記載から更に明らかにされる：

図１は、ｘ−軸に６００−１０００ｎｍの範囲の波長とｙ軸に吸光係数の対数をプロットして４種の異なるヘモグロビンの吸収スペクトルを図示したものである。

図２は、ｘ−軸に５００−７００ｎｍの波長範囲と、ｙ軸に各種の同一濃度における吸光度（吸光係数に相当する）をプロットして４種の異なるヘモグロビンの吸収スペクトルを図示したものである。

図３は、同じ血だまりからの全Ｈｂの異なる濃度の吸収スペクトルを示す。全Ｈｂは部分的酸化されてＭｅｔ−Ｈｂとすることができ、それも示されている。

図４は、本発明に従い使用される試料タブの種々の態様を示す。反射モードで使用される試料タブの下には反射鏡が位置される。図４ａは分光装置における試料投入口と試料タブの斜視図を示す。図４ｂは投入口に挿入された試料タブの側面図である。

図５は、本発明に従い使用される試料タブの種々の態様を示す。試料タブは、透過モードでの使用が示される。図５ａは試料タブと投入口の斜視図を示す。図５ｂは試料投入口に挿入された試料タブの側面図を示す。

図６は、図５に示される本発明の装置のより詳細を示す。図６ａは試料投入口に挿入された試料タブの側面図を示す。図６ｂは試料投入口に挿入された試料タブの正面図を示す。

図７は、本発明で使用する試料タブの種々の代替態様を示す。図７ａは試料タブの斜視図を示す。図７ｂは試料タブの側面図を示す。

図８は、好ましい態様で使用される分光計６１４を示す（部分分解図による）。簡単のために、二つのホトダイオードだけが示される。

図９は、ｘ−軸に４８０−６４０ｎｍの範囲の波長とｙ軸に吸光係数をプロットして５種の異なるヘモグロビンの吸収スペクトルを図示したものである。

図１０は、メチレンブルーの吸収スペクトルを示す。
詳細な説明

本発明は生体試料における全ヘモグロビンの分光測定の分野に関する。本発明は生体試料の全−Ｈｂを測定するための装置とその方法を提供する。

以下の記載は好ましい態様である。

本発明は試料中の全−Ｈｂを測定する方法を提供する。この方法は以下からなり、
ｉ）Ｏｘｙ−Ｈｂ、“Ｏｘｙ−ＨｂプラスＤｅｏｘｙ−Ｈｂ”または“全−ＨｂマイナスＭｅｔ−Ｈｂ”の一つに対する第１の一次検量解法およびＭｅｔ−Ｈｂ、Ｃａｒｂｏｘｙ−ＨｂまたはＳｕｌｆ−Ｈｂの一つまたは一つ以上に対する第２の一次検量解法からなるか、または第１の一次検量解法の項と一つまたは一つ以上の第２の一次検量解法の項とを合算することにより得られる第３の一次検量解法からなる一つまたは一つ以上の第１または第２の分光装置を使用して吸光度を求める；そして
ｉｉ）次ぎのいずれかの値を予測する；
ａ）全−Ｈｂの測定のために、標準の組の波長の一つまたは一つ以上の波長における試料の吸光度のある次数の導関数に第１の一次検量解法を適用し、そして標準の組の波長の一つまたは一つ以上の波長における吸光度のある次数の導関数に対して第２の一次検量解法を適用することにより試料中のＭｅｔ−Ｈｂ，Ｃａｒｂｏｘｙ−Ｈｂ、またはＳｕｌｆ−Ｈｂの一つまたは一つ以上に対する一つまたは一つ以上の第２の値を予測し、そして第１の値と第２の値を合算して全―Ｈｂの測定をすることによる試料中のＯｘｙ−Ｈｂ、“Ｏｘｙ−ＨｂプラスＤｅｏｘｙ−Ｈｂ”または“全−ＨｂマイナスＭｅｔ−Ｈｂ”の一つに対する第１の値；または
ｂ）標準の波長の組の一つまたは一つ以上の波長における試料の吸光度のある次数の導関数に適用される第３の一次検量解法を使用する全―Ｈｂ。
追加的に、試料は吸光度測定に先立ち大気酸素に暴露されることができる。さらに：
−収集段階（上記段階ｉ））で第１の検量解法と一つまたは一つ以上の第２の検量解法が、標準の組の波長の一つまたは一つ以上における吸光度のある次数の導関数を使用して生成され、Ｏｘｙ−Ｈｂ、“Ｏｘｙ−ＨｂプラスＤｅｏｘｙ−Ｈｂ”、“全−ＨｂマイナスＭｅｔ−Ｈｂ”、Ｍｅｔ−Ｈｂ、Ｃａｒｂｏｘｙ−ＨｂまたはＳｕｌｆ−Ｈｂの一つまたは一つ以上に対する公知の参照値を有する一つまたは一つ以上の検量の組を使用する一つまたは一つ以上の第１の装置から得られ、
−標準の組の波長の一つまたは一つ以上の波長における吸光度のある次数の導関数、公知の参照値び統計処理を使用して第１の一次検量解法がＯｘｙ−Ｈｂ、“Ｏｘｙ−ＨｂプラスＤｅｏｘｙ−Ｈｂ”または“全−ＨｂマイナスＭｅｔ−Ｈｂ”の一つに対して生成され、そして
−標準の組の波長の一つまたは一つ以上の波長における吸光度のある次数の導関数、公知の参照値および統計処理を使用して一つまたは一つ以上の第２の一次検量解法がＭｅｔ−Ｈｂ、Ｃａｒｂｏｘｙ−Ｈｂまたは“Ｓｕｌｆ−Ｈｂの一つに対して生成される。

本発明はまた試料中の全−Ｈｂを測定する試薬を使用しない分光的方法を提供する。この方法は、以下からなり：
ｉ）全−Ｈｂに対する一次検量解法を具備する一つまたは一つ以上の分光装置を使用して試料の吸光度を求め、試料は大気酸素に暴露されており；そして
ｉｉ）全−Ｈｂの測定のために、標準の組の波長の一つまたは一つ以上の波長における試料の吸光度のある次数の導関数に一次検量解法を適用することにより全−Ｈｂに対する値を予測する。

本発明は分光装置を提供する。この装置は試料内の望みの被検物質の存在またはその濃度を測定するのに使用され、それは以下からなり：
ａ）たとえば約３００ｎｍから約２５００ｎｍの範囲の波長、またはこの間のいずれかの波長を発生する電磁波（ＥＭＲ）源；
ｂ）ＥＭＲ源と試料投入口の間に位置する第１の開口で、この間には光路が形成される；
ｃ）光路内に配置される試料容器を収納する装置の試料投入口；
ｄ）試料投入口と一つまたは一つ以上の光検知器の間に位置する第２の開口で、当該一つまたは一つ以上の光検知器は分光装置と共同で作動する；
ｅ）分光装置と共同で作動する一つまたは一つ以上の一次検量解法、当該一つまたは一つ以上の一次検量解法は、分光装置と共同で作動する一つまたは一つ以上の他の装置または一つまたは一つ以上の改良された一次検量解法を使用して展開される。

またここでは、一つまたは一つ以上の試料における一つまたは一つ以上のＨｂベースの代用血液の減成またはその反対をモニターする方法が開示される。この方法は、以下からなり；
ｉ）Ｍｅｔ−Ｈｂに対する検量解法を有する分光装置を使用して標準の組の波長の一つまたは一つ以上の波長における一つまたは一つ以上の試料を測定して吸光度を求め；
ｉｉ）検量解法を吸光度のある次数の導関数に適用することにより吸光度からＭｅｔ−Ｈｂの第１の濃度を求め；
ｉｉｉ）第２の時刻における一つまたは一つ以上の試料におけるＭｅｔ−Ｈｂの第２の濃度を求める；
ここで、一つまたは一つ以上の代用血液の減成は第１の濃度に比較する第２の濃度の増加により示され、そして一つまたは一つ以上の代用血液の減成の反対は第１濃度に比較する第２の濃度の減少により示される。

本発明はまた試料中の一つまたは一つ以上の代用血液の減成またはその反対をモニターする代替方法を提供し、それは以下からなり；
ｉ）Ｍｅｔ−Ｈｂに対する第１の検量解法と一つまたは一つ以上のＨｂベースの代用血液に対する第２の検量解法を標準の組の波長の一つまたは一つ以上の波長における吸光度のある次数の導関数に適用することによりＭｅｔ−Ｈｂの第１の濃度と一つまたは一つ以上の代用血液の第２の濃度を求め；
ｉｉ）段階（ｉ）で求めた第１の濃度と第２の濃度からＭｅｔ−Ｈｂの態様にある一つまたは一つ以上のＨｂベースの代用血液の割合を計算し；そして
ｉｉｉ）一つまたは一つ以上のＨｂベースの代用血液の減成の指標としてＭｅｔ−Ｈｂの割合を求めて、一つまたは一つ以上の代用血液の減成またはその反対をモニターする。たとえば、Ｍｅｔ−Ｈｂの第１の濃度が一つまたは一つ以上のＨｂベースの代用血液の第２の濃度の３%と等しいかまたは大であるならば、これは一つまたは一つ以上の代用血液の減成を示す。

Ｍｅｔ−Ｈｂの割合は任意にパーセントまたは分数として計算できる。Ｈｂベースの代用血液のＭｅｔ−Ｈｂ態様の絶対値変化は、Ｈｂベースの代用血液の減成またはその反対を監視するのに使用され得ることも理解されよう。

本明細書に使用される技術用語は明確化のために以下に定義される。

“被検物質”は、試料中の測定されるべき物質を意味する。測定されるべき被検物質が存在する試料の例は、例示されるが限定されない、たとえば全血、血清、血漿、尿、滑液および髄液、唾液、リンパ液、***および糞便などの生体試料またはミルク、チーズ、カテージチーズ（cottage cheese）、ヨーグルト、アイスクリーム、ワイン、他の飲料、半固体食料および軟質固形食料などの非生体試料である。

吸光度とは試料による光強度の減少を意味する。ベールの法則に従い吸光度＝Ｌｏｇ（１／光透過率）であり、これは非光拡散試料に適用される。測定されるパラメーターは試料を透過する光の量であり、透過光（トランスミッタンスまたはトランスミッション）はそれから吸光度の単位に変換される。試料が光拡散性でベールの法則が適用されると、装置は拡散による光の損失のために“真の吸光度”を識別できず、それゆえこの場合、用語“見かけ吸光度”を使用すべきである。試料が光拡散性がまたは非光拡散性かは常には明確でないので用語“吸光度”が使用されるとき、それは“真の吸光度”、“見かけ吸光度”のいずれか、またはその両方を意味すると理解されたい。吸光度について例示されるが、透過率の代りに反射率（またはレフレクション）が測定されるときは、吸光度はＬｏｇ（１／反射率）で置きかえることができ、反射率でも本発明の範囲内である。用語透過率とトランスミッションは時々互換性があるように使用されることを理解されたい。反射率とレフレクションも時々互換性があるように使用されることが理解されるべきである。

“実際の吸光度”または“測定吸光度”は、装置の波長検量表から選ばれる一つまたはそれ以上の波長において装置により提供される試料または検量材料の吸光度値、または吸光度測定値または単に吸光度を示す。

“較正内挿（補間）吸光度”は、特に内挿された吸光度に対して適用される測光補正後の内挿吸光度の値を意味する。

“血液バッグ管”は適当なポリマーまたはプラスチックからなり全血を収める第１のバッグと適当なポリマーまたはプラスチックからなり第１のバックから得られる血漿を収める第２のバッグを接続する管を意味する。管とバッグは透明かまた半透明で柔軟なポリマーまたはプラスチックからなる。

“代用血液”は、輸血のための全血または赤血球（ＲＢＣ‘ｓ）の代りに使用される物質を意味する。血液または赤血球のかわりに代用血液を使用するいくつかの利点は以下の通りであり；代用血液は全ての血液型に共通して適合し、それ故、交差適合試験が必要でない；血液の最高貯蔵期間が４２日間であるが、代用血液はより長い有効期限を有する；代用血液の精製処理は熱処理であり、有害ウィルスの危険を除去できる。

他のタイプの代用血液が報告されており、それは適当な界面活性剤にパーフルオロカーボンの微小ビーズを含む乳白色のエマルジョンを特徴とする。この“乳白色”の代用血液は“パーフルオロカーボン様”代用血液と称される。用語パーフルオロカーボン様代用血液は乳白色の全ての代用血液に適用されることを理解されたい。これらの代用血液に含まれるビーズのために、“パーフルオロカーボン様”代用血液は光拡散成分を含むという特徴がある。

“干渉剤”は、例えば血清または血漿などの試料中においてその存在が試料中の他の被検物質の存在の測定、定量化またはその両方を妨害する被検物質を意味する。

“検量解法移転”は、第１の装置から第２の装置へ検量解法を移転する方法を意味し、ここでは、検量解法は第２の装置と共同で作動され、それにより解法は試料中の関心ある測定される被検物質の濃度を予測することに第２の装置により適用される。第１の装置から第２の装置へ検量解法を移転する便宜のために、波長の標準の組が使用されるのが好ましい。検量解法移転の方法はアメリカ特許第６６５１０１５号明細書に開示される（サムスーンダー；この公報はここに参照されて組み込まれる）。第１の装置を検量するのに使用される方法、ここでは装置は少なくとも一つの被検物質の濃度を測定するのに使用されるが、一次検量と称される。一次検量は複雑な方法であり、“一次検量”の名称の基に記載される。その複雑さのために、各装置における一次検量の動作は実際的でもなく、望ましくもない。

本発明は、装置、たとえば第２の装置をあたかもそれが一次検量解法の方法で検量されるかのように機能させる単純な代替方法を提供する。第２の装置は第１の装置が検量されるのと同じ方法で検量される必要はなく、第２の装置を用いる第１解法を行う必要もない。第１と第２の装置は類似するのが好ましいが、しかし常にそうである必要はなく、第２の装置を使用することにより必要な測定の精度や型に依存する。

本発明者は一つまたはそれ以上の“第１の装置”を使用して展開される“一次検量解法”は“第２の装置”に移転されることができ、そして第２の装置は直接に検量解法移転に続いて使用される。追加すれば、第２の装置上の移転された検量解法は、望むならば、一次検量解法とは区別される独自の検量材料の小さな組を使用して改良され得る。好ましくは、独自の検量材料の小さな組は一次検量の組の試料に類似する。

“データ前処理”は、分光データの数学的処理を意味し、装置上の被検物質の測定を容易にし、この装置は第１、第２または両方の装置である。データ前処理の例は、いかなる意味でも限定するようには解釈されないが、以下の通りであり；
− 試料を透過するまたはそれから反射する電磁波照射（ＥＭＲ）の吸光度の計算；
― 内挿吸光度の計算；
― 吸光度の平滑化；吸光度の第１および高次導関数の計算；
― 乗法拡散補正
― データ変換；および
― 測光補正。
検量解法の展開の前にいずれか一つまたはそれ以上の形のデータ前処理が使用され、いずれか一つまたはそれ以上の型のデータ前処理が、検量解法を被検物質の濃度の計算に適用する前に、第２の装置からのデータに使用され得る。平滑化の非限定の例はデータ平均化である。

“データ変換”は、分光データまたは被検物質濃度データのいずれかに適用される数学的処理を意味する。データ変換の例は、いかなる意味でも限定するようには解釈されないが、分光データのフーリエ変換、および被検物質濃度の対数または真数計算である。サルビツキー−ゴーレイ法が適用されるときには（サルブッキーとゴーレイ１９６４、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．,３６：１６２７−１６３８）平滑化はまたデータ変換とも考えられることを理解されたい。

“吸光度の導関数”は、ある次数の吸光度の導関数を意味する。吸光度の０次の導関数は測定された吸光度である。特定の波長における吸光度の１次導関数はその波長における吸光スペクトルの勾配である；特定波長における吸光度の２次導関数はその波長の第１次導関数吸収スペクトルの勾配である。吸光度のより高次の導関数（３次、４次）は直近の下の次数（２次、３次など）の導関数吸収スペクトルの勾配を求めることにより同様に得られる。特定の波長における吸光度のある次数の導関数を計算する方法は当業者に周知である。

特定波長の吸光度の１次導関数の計算は関心ある波長を包含する二つの波長における吸光度の差をとるものである。他の吸光度の導関数を求める方法は数個の異なる波長における吸光度を使用し、そこでは平滑化で導関数方法を積分する。より高度に平滑化すると、吸収スペクトルまたは吸収スペクトルのその次数の導関数においてより大なる信号損失となることを理解されたい。吸光度導関数の計算に使用される波長の最低の数は二つの波長である。平滑化、データ変換、および吸光度のある次数の導関数計算はデータ前処理の非限定例示である。データ前処理の他の型は、上記したように、吸光度導関数の計算の前、または後で遂行され、例示するが限定されない、乗法拡散補正である。

“第１の装置”は一つまたは一つ以上の一次検量解法を展開するに使用される装置を意味する。一つまたは一つ以上の装置は一次検量解法を展開するのに使用される。

ＩＮＴＲＡＬＩＰＩＤ（商標）（内部脂質）（ＩＬ）は、血液中のキロミクロンを自然で模倣する脂質エマルジョンを意味する。ＩＬはこのようなエマルジョンの一例である。血清および血漿における混濁の第１原因は脂肪粒子、例えばキロミクロン、すなわちＩＬであるか、または他の脂質エマルジョンが血液中の濁度を模倣して使用される。用語“濁度の模倣材”は濁度を定量化するのに使用される被検物質を称するのに使用される。

“溶血の指標”は、赤血球（ＲＢＣ）の中に存在しＲＢＣを囲む血漿内には存在しない物質を意味する。溶血の指標の例は、限定されないが、全―Ｈｂ、Ｏｘｙ−Ｈｂ、“Ｏｘｙ−ＨｂプラスＤｅｏｘｙ−Ｈｂ”、または“全−ＨｂマイナスＭｅｔ−Ｈｂ”である。Ｏｘｙ−Ｈｂ割合が全−Ｈｂの約９５％である公知のＯｘｙ−Ｈｂ濃度の試料はＯｘｙ−Ｈｂ濃度と同じ値の全−Ｈｂ濃度を有すると考えることができる。同様に、約９５％Ｏｘｙ−Ｈｂの全−Ｈｂの公知濃度を有する試料は全−Ｈｂと同じ数値のＯｘｙ−Ｈｂ濃度を有すると考えられる。全−ＨｂまたはＯｘｙ−Ｈｂ濃度の近似の許容性は全−ＨｂまたはＯｘｙ−Ｈｂの予測値の要求される精度に依存する。同様に、Ｏｘｙ−Ｈｂ割合が“Ｏｘｙ−ＨｂプラスＤｅｏｘｙ−Ｈｂ”の約９５%である公知のＯｘｙ−Ｈｂ濃度の試料は、Ｏｘｙ−Ｈｂ濃度と同じ数値の“Ｏｘｙ−ＨｂプラスＤｅｏｘｙ−Ｈｂ”濃度を有すると考えられる。同様にして、約９５％Ｏｘｙ−Ｈｂからなる公知の“Ｏｘｙ−ＨｂプラスＤｅｏｘｙ−Ｈｂ”濃度の試料は“Ｏｘｙ−ＨｂプラスＤｅｏｘｙ−Ｈｂ”濃度と同じ数値のＯｘｙ−Ｈｂ濃度を有すると考えられる。全−Ｈｂ、“Ｏｘｙ−ＨｂプラスＤｅｏｘｙ−Ｈｂ”またはＯｘｙ−Ｈｂ濃度の近似の許容性は全−Ｈｂ、“Ｏｘｙ−ＨｂプラスＤｅｏｘｙ−Ｈｂ”またはＯｘｙ−Ｈｂの予測値の要求される精度に依存する。

“マッピング”は標準波長に内挿吸光度を関連付ける方法を意味する。線形内挿（補間）が好ましいが非線型内挿もまた本発明に含まれると考えられ、両者は当業者に周知である。

“多重散乱補正”（多重信号補正としても知られる）は、一組の試料から得られる分光データにおける光拡散効果のいくつかをある程度除去するに使用される数学的処理を意味する。この技術は各吸光スペクトルを回転させて可能な限り平均スペクトルに合致させる。この方法の詳細は以下に記載され：マルテン，Ｈとナエス，Ｔ（Multivariate Calibration、１９９３、John Wiley＆Son発行）；およびオスボーン,B.G.,フェーン,T&ヒンドル，P．H.ｚ（食餌と飲料に分析の応用における実際的なＮＩＲ分光分析、１９９３、Lomgman Scientific & Technical発行）、両者はここに参考として組み込まれる。一組の試料の平均スペクトルは一つまたは一つ以上の装置から得られる一つまたは一つ以上の資料吸光度測定値を加算後に得られることを理解されたい。

“測光補正”または“吸光度補正”は、試料が他の装置で試験されたかのように見せるために、一つの装置で試験された試料の吸光度に対して行われる補正を意味する。測光補正の量は、検量解法移転の方法の間における第１の装置と第２の装置の両方での一組の検量から得られる吸光度から得られる“ｙ＝ｍｘ＋ｃ”の形の線形回帰式における勾配（“ｍ”）とｙ軸切片（“ｃ”）から求める。測光補正後に得られる吸光度は補正済み吸光度または修正済み吸光度と称される。

“ピクセル分散”という用語は、通常はピクセル（画素）ごとにナノメートル（ｎｍ）で測定された、線形ダイオードアレイの２つの隣接するピクセルが囲む波長を意味する。たとえば、波長検量について６００ｎｍと９００ｎｍの２つのレーザーが使用され、これらがそれぞれピクセル２０とピクセル２２０に投射される場合、３００ｎｍ（すなわち９００ｎｍ−６００ｎｍ）が、２００ピクセル（すなわち２２０−２０ピクセル）で囲まれたことになる。したがってピクセル分散は、１ピクセルにつき１．５ｎｍと計算される（すなわち３００ｎｍを２００ピクセルで割る）。かわりに、所定のピクセル分散が使用され、そこでは単に公知波長の単一レーザーまたは公知波長のＥＭＲを発する狭バンドフィルターが波長をピクセルに帰属させるのに必要とされる。

“一次検量（カリブレーション）”という用語は、被検物質に関して第１の装置に対して、オプションとしては、複数の第１の装置に対して一次カリブレーションアルゴリズムを生成するために使用されるプロセスを意味する。典型的にはカリブレーションに使用されるサンプルセットは比較的大であり、サンプルは自然のサンプルであるか自然のサンプルに非常に近い。第１カリブレーションセットは、ロバストなカリブレーションアルゴリズム（複数可）を生成するために、サンプル内で期待されるすべての変動を含むべきである。さらに、装置間の変動も含むよりロバストなカリブレーションアルゴリズム（複数可）を生成するために、一次カリブレーションセットの１つまたは複数のサンプルを、１台または複数の第１の装置上で測定して組み合わせてもよい。このようなカリブレーションアルゴリズムは、１台または１台以上の同様な装置から得られた測定値の組み合わせを使用して生成される。

いかなる形の統計データ解析および任意にいかなる形のデータ前処理、例えば限定されないが、平滑化、吸光度の１次と高次導関数の計算、測光補正、吸光度の内挿（補間）、または多重散乱補正が使用され、これらは被検物質の予測の必要な精度に依存する。たとえば、一つ以上の第１の装置からのデータを含むことにより、正確性の低いレベルとそれ故精度の低いレベルが（劣悪な正確性は劣悪な精度につながる）、多くの第２の装置を通して得られる。もしも試料中の被検物質の存在に対しての有無を単純に応答することが必要とされる全てならば、このような形の一次検量は適当であり、そして本発明の範囲内である。

望むならば、一次検量の組の部分ではない小さな独自の試料の組が第２の装置で測定され、そしてデータは一次検量の組からの元のデータの全てまたはいくつかと組合さり、一つまたは一つ以上の“改良された一次検量解法”を展開する。好ましくは独自の試料の小さな組は一次検量の組の試料と類似する。吸光度の０次導関数（また生の吸光度とも称される）または吸光度のいかなる次数の導関数も検量工程に使用され、そして吸光度の２次導関数が好まれ、吸光度の１次導関数が更に好ましい。

“一次検量解法”とは、数式を意味し、これは例示されるが限定されない、線形結合のタイプＹ＝Ａ（ｘ）＋Ｂ（ｘ１）＋，，，，＋Ｃが例示され、ここでＹ（従属変数）は所与の被検物質の濃度であり、Ａ、Ｂ、およびＣは定数であり、ｘ、ｘ１，，，は特定波長における吸光度の値のある次数の導関数（独立変数）である。等式の右辺は式の“項目”の和となる。一つ以上の項目が加算されて、たとえば、いかなる意味でも限定されないが、以下の項を有する二つの式の項は、
Ｙ_１＝Ａ_１（ｘ）＋Ｂ_１（ｘ１）＋Ｃ_１および
Ｙ_２＝Ａ_２（ｘ）＋Ｂ_２（ｘ１）＋Ｃ_２、
は合算されて、単一の以下の式を生成する：
Ｙ_１＋Ｙ_２＝Ａ_１（ｘ）＋Ｂ_１（ｘ１）＋Ｃ_１＋Ａ_２（ｘ）＋Ｂ_２（ｘ１）＋Ｃ_２、
または
Ｙ_１＋Ｙ_２＝（Ａ_１＋Ａ_２）（ｘ）＋（Ｂ_１＋Ｂ_２）（ｘ１）＋（Ｃ_１＋Ｃ_２）。

非線形等式は本願の範囲（例えば式１６と１７、例５）であることを理解されたい。式は、試料の組の多重線形回帰式により好ましくは得られるが、しかし、他の統計処理、例えば例示されるが限定されない、単純線形回帰式、ＰＬＳ（部分最小自乗回帰式）およびＰＣＡ（主成分解析）がまた使用されることができ、そしてそれは本発明の範囲内である。一次検量に使用される試料の組は相対的に大であり（上記を参照）、そして試料は自然かまたは自然の試料に非常に近い。ロバストな（変動に鈍感な）検量解法（複数可）を展開するために一次検量の組は試料に期待される全ての変動性を含むべきである。使用され、他に定義されないならば、用語“検量解法”は、一次検量解法または一次検量解法の改良（たとえば、アップグレードされた一次検量解法）を意味し、ここで変更は被検物質の予想値の正確度を改良するかまたは第１の装置としては検量されていない他の装置上の一次検量解法の使用を容易にするものである。

一次検量解法は試行錯誤で開発され、測定されるべき被検物質に対する対波長の吸収またはモル吸光係数（時々単に吸収または吸光係数と称される）を使用することがない。例として、市販のＣＯ−酸素計は関連する各波長における各Ｈｂ種のモル吸光係数を使用して誘導される数種のＨｂに対する検量解法を含む。一次検量解法が試料中の被検物質の濃度を測定するために使用される装置にインストールされると、一次検量解法はインストールされた分光計と共動して作動する。上で注記したように、一次検量解法は、典型的には一つまたは一つ以上の第１の装置を使用して展開され、そして第２の装置での使用に第２の装置に移転される。さらに、分光装置と共同する一次検量解法はアップグレードされた一次検量解法であり、それは一つまたは一つ以上の第１の装置で展開されて第２の装置へ移転され、そして移転後、例えば一次検量解法の一部ではない独自の検量材の小さい組を使用して改良される。しかし、一次検量解法第１の装置から使用の第２の装置へ移転されて、一次検量解法の更なる変更や改良なしに、直接に使用されると理解されるべきである。分光装置と共同する一次検量解法はＲＯＭ、ＥＰＲＯＭ、マイクロコントローラー、マイクロプロセッサー、外付または内蔵記録機器、例示されるが限定されない、分光器のディスク、ＣＤ、メモリーステック、フラッシュメモリーカード、または類似の機器にインストールされる。

使用され、別に特定されない限り用語“検量解法”は、一次検量解法または改良された一次検量解法を意味し、ここで、変更は被検物質の予測値の正確性を改良するか、または第１の装置として検量されていない他の装置（例えば第２の装置）上で一次検量解法を使用するのを便利にすることである。

“一次検量の組“は、一次検量に使用される試料を意味する。

“一次検量波長”は、一次検量解法に使用される波長（複数可）を意味する。

“主たる検量波長”は、吸光度のある次数の導関数と被検物質の濃度との間に強い相関関係を示す一次検量解法の波長を意味する。主たる検量波長（複数可）は異なる組成の同じ被検物質で相違することがある。一次検量解法は任意で吸光度導関数と被検物質濃度との間に低い相関性を示す一つまたはそれ以上の他の波長を含む。これらの他の波長は、第２検量波長と称される。第２の検量波長は、主たる検量波長の吸収帯と重なる吸収帯を有する干渉材の存在下に特に一次検量解法にロバストネスを加え、それ故一次検量波長（複数可）における吸光性と被検物濃度との間の相関性に影響を与える。

約５から約４００ｎｍの範囲もしくはその範囲の一部、または約５から約２００ｎｍの範囲もしくはその範囲の一部の負の勾配で少なくとも主たる検量波長を含む連続する特別なセグメントは、“主たる検量セクション”と称される。一次検量解法の展開のために、いずれかの統計処理が使用され、これには例えば、いかなる意味でも限定されない例示であるが、単純線形回帰式、多重線形回帰式、および多変量データ解析が示される。多変数データ解析の例は、いかなる意味でも限定されないが、主成分解析（ＰＣＡ）、神経ネットワーク、および遺伝解法である。多変数解析が使用されて一次検量解法が展開されるときは、一次検量解法は、それぞれの波長における吸光度のある次数の導関数と被検物質濃度との間に高い相関関係が観測される多くの波長を含むことができると理解される。

“予測値”は、一次検量解法が試料の吸光度のある次数の導関数に適用されて得られる被検物の値を意味する。初めに示すように、一次検量解法はたとえば、従属変数としての被検物の予測値、および定数と一つまたはそれ以上の項の合算からなる等式である。他の項のそれぞれは、定数と独立変数の積である（例１から７を参照）。独立変数は特定波長における試料の吸光度の導関数である。予測値は、離散した濃度値として報告される必要は必ずしもなく、半定量または定性的な値（たとえば正／否）を含むことができる。

被検物の“参照値”は、試料に帰属される被検物の値を意味する。参照値は０または０以上の値であることができる。参照値は典型的には当業者に公知の方法により求められ、正確さは適宜の程度である。いかなる意味でも限定されないが例示すると、試料に加えられた被検物の公知の量が参照値として使用されるか、または溶血の指標の場合のように溶血の指標が測定される。溶血の指標では、好ましい指標は全−Ｈｂ、Ｏｘｙ−Ｈｂおよび“全−ＨｂマイナスＭｅｔ−Ｈｂ”である。

当業者に周知であるシアンメトヘモグロビン（ｃｙａｎＭｅｔ−Ｈｂ）法は、存在する全てのＨｂ種、すなわち、Ｏｘｙ−Ｈｂ、Ｄｅｏｘｙ−Ｈｂ、Ｃａｒｂｏｘｙ−ＨｂおよびＭｅｔ−Ｈｂを測定する。Ｏｘｙ−Ｈｂは公知の無試薬で分光的方法により測定されることができ、たとえば、ハーボエまたはティエツの方法である（ハーボエ、Ｍ．，１９５９,近紫外線分光法による血漿中のヘモグロビンの測定方法、Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ，ｐｐ．６６−７０）；臨床化学のティエツの教科書、第３版、１９９９，ｐｐ１６７４−１６７６；これはここに参考で組み入れられる）。試薬なしの分光装置で実際に測定されたＨｂ種は、被検物質の測定に使用される参照方法と一次検量解法の試料に含まれる物質の両方に依存する。Ｏｘｙ−Ｈｂ、Ｄｅｏｘｙ−Ｈｂ、Ｃａｒｂｏｘｙ−ＨｂおよびＭｅｔ−Ｈｂとして良く確定されない他のＨｂ種もまた存在し、そして他のＨｂ種は時間をかけて見出されることが期待される。上記リストのようによく確定されてはいないＨｂ種の例はＳｕｌｆ−Ｈｂである。胎児のＨｂは他のＨｂ種であり、成人のＨｂとは少し異なる吸収スペクトルを有する。

概算では、Ｏｘｙ−Ｈｂの割合が全−Ｈｂの約９５％である公知のＯｘｙ−Ｈｂの試料はＯｘｙ−Ｈｂ濃度と同じ数値の全−Ｈｂ濃度を有すると考えられる。同様に、約９５％Ｏｘｙ−Ｈｂの全−Ｈｂの公知濃度を有する試料は全−Ｈｂと同じ数値のＯｘｙ−Ｈｂ濃度を有すると考えられる。また、概算で、Ｏｘｙ−Ｈｂが試料中の“Ｏｘｙ−ＨｂプラスＤｅｏｘｙ−Ｈｂ”の約９５％、または“全−ＨｂマイナスＭｅｔ−Ｈｂ”の９５％を占めるならば、そして同様に、試料中の“Ｏｘｙ−ＨｂプラスＤｅｏｘｙ−Ｈｂ”または“全−ＨｂマイナスＭｅｔ−Ｈｂ”が９５％Ｏｘｙ−Ｈｂからなるならば、Ｏｘｙ−Ｈｂ、“Ｏｘｙ−ＨｂプラスＤｅｏｘｙ−Ｈｂ”、および“全−ＨｂマイナスＭｅｔ−Ｈｂ”の濃度は同じ値になると考えられる。

“試料”または“試料類”は、分光学的に測定され得る一つまたはそれ以上の特性を有する生体または非生体液、生物または非生物半固体、生物または非生物固体を意味する。試料は典型的には一つまたは一つ以上の被検物質からなる。試料の例には、例示するが限定されない、検量材、全血、血清、血漿、尿、滑液、リンパ液、***、糞便、髄液、乳製品、飲料、人体部分、たとえば限定されないが、爪、腕、耳たぶ、人体部分表面、または製薬タブレット等である。生体試料は人体に限られず、例示されるが限定されない動物の望みの種から得られることができる。

“試料容器”は、試料を保持できて、試料からのＥＭＲの吸収、反射または吸収と反射の両方の測定を可能とする透明または半透明の容器を意味する。試料容器の例は、例示されるが限定されない、試料タブ、ピペットチップ、管、キュベット、標識試験管、無標識試験管、血液バッグ管、透明試料容器、および半透明試料容器である。試料容器は分光装置の試料投入口に挿入される。

分光装置

キュベットでは、キュベットは流下キュベットとして設計され、それは試料が再使用可能なキュベット中に注入されることを要求すると理解される。しかし、流下キュベットは水洗系の要求のために好ましくないが、しかし流下キュベットは依然として本発明の範囲内であると考えられる。試料容器は任意に一つまたはそれ以上の試薬を含むことができる。人体部分では試料容器の代りにレセプターが必要である。

本発明は無試薬系に限定される必要はなく、また試料容器に一つまたはそれ以上の試薬の使用は無試薬系の向上とみなせる。リルジャらの米国特許第４０８８４４８号明細書では二つの面で区画されるキャビティを有するキュベットのサンプリング方法が開示され、所定の距離で離隔し、キャビティは試薬を含み、試料は任意に毛細管現象でキャビティ内へ吸い込まれる。このようなキュベットまたは類似のキュベットの使用は本発明の範囲にあるものと理解されたい。

“試料タブ”は試料容器を意味し、上面と下面を有する基板からなり、基板の少なくとも一部は、たとえば図７ａと７ｂ（７２０）に示される様にＥＭＲが透過することができるようになっている。ウエル（凹み）（７１４）は、例えば液体の試料の保持のために基板（７１８）の上面に配置され、ウエルは、基板上面上に延びる閉鎖された壁（７０６）で区画され、そしてカバープレート（７０２）は好ましくは基板に取り付けられ、たとえば基板に蝶番（たとえば、７１０）で取り付けられ、そして開位置と閉位置とを可動可能になっている。試料タブの閉鎖壁（７０６）には、一つまたはそれ以上のオーバーフロー用開口が設けられ、そしてそれは収容壁（７１２）により囲繞され、そうしてオーバーフロー環が閉鎖壁と収容壁間で区画されている。

カバープレートの少なくとも一部はＥＭＲが透過できるようになっており、それによりカバープレートが閉じられると、ＥＭＲを透過する基板の部分、ウエルおよびＥＭＲを透過するカバープレート部分を通る光路が形成される。または、ＥＭＲが試料タブの反対面で反射させ、そうして試料タブ中に存在する試料の通過距離を倍加するように構成することも可能である。

カバープレートは基板に蝶番で取り付けられるが、基板に固定したり、離しておくこともできる。さらに、試料タブは、対応する合わせ板と連動する留め部材を具備し、それによりカバープレートを基板に取り付けることができる。留め部材は、例示されるが限定されない、収容壁の外側部分に摩擦力で係止し得る円環を有するか、または摩擦力で係止してカバープレートを基板に取付得る一つまたはそれ以上のクリップを有する。環状ウエルとオーバーフロー環は例示されるが、ウエルとオーバーフロー部分の形状はいかなる形状でもよいと理解されたい。留め部材は基板、カバープレート、または基板とカバープレートの両者の上に位置することができる。同様に、留め部材を受ける連動する合わせ部材は基板、カバープレート、または基板とカバープレートの両者の上に位置することができる。

収容壁は、その上面にシール部材を具備する（７０８）。シール部材はＯ−リングかまたは収容壁と一体化した柔軟な材料からなる。本発明の好ましい態様では、試料ウエルは一つまたはそれ以上の開口または溝と過剰の試料を収集するオーバーフロー環を具備し、カバープレートが閉じる際に過剰の試料を押出す。好ましくは、カバープレートはタブに設置され、カバープレート蝶番に近い試料は最初にカバープレートに接触し、そしてカバープレートが閉まる際に過剰の試料は二つの溝を経てオーバーフロー環へと押出される。本発明の他の特徴は次ぎの詳細な説明から明らかとなる。しかし、試料タブの好ましい態様を示している詳細な説明と特定の例示は、説明の用のためにのみ供されると理解されたい。種々の設計の試料タブが米国特許出願第１０／０４２２５８号に記載されている（公開番号２００２−０１１０４９６Ａ１、サムスーンダー；この内容はここに参照として取り込まれる）。説明される試料タブは本発明の装置に使用されるものとして説明されるが、他の試料容器も使用され得ることを理解されたい。

例えば吸収スペクトルでの曲線の“平滑化”は、“連続スペクトル”を得るように数学的処理をデジタルデータに施し、そしてスペクトル上の“雑音”を減少させることを意味する。種々の程度の平滑化が曲線に適用される。しかし、被検物質の信号の損失は平滑化の結果として観察される。

“第２の装置”は、第１の装置のように機能することができる装置を意味し、第２の装置は検量される必要はないし、また第１の装置が検量されたと同じように検量（すなわち、一次検量）される必要はない。もし望むならば、一次検量の組とは区別される独自の試料の組は第２の装置で測定され、改良された一次検量解法で展開される。

“波長の標準の組”は装置に特有の波長検量表につく全ての装置に使用される一組の波長を意味し、測定されたまたは実際の吸光度から内挿吸光度を生成するのに使用される。装置で試験された試料の実際の吸光度は波長検量表からの波長で測定され、そして実際の吸光度は補間され、そして波長の標準の組へマップされる。第１の検量解法（複数可）は好ましくはマップされた吸光度に適用されるが、実際の吸光度に適用され、特に、波長検量表と波長の標準の組が同一の際に適用される。いかなる意味でも限定されないが、波長の標準の組は、４５０ｎｍから約３００ｎｍ、好ましくは約４５０ｎｍから１１００ｎｍで、増分は２ｎｍである。しかし他の波長範囲と増分が要求に応じて使用され、それは当業者に周知である。波長の標準の組の範囲と増分は試行錯誤で得られる。波長の標準の組みは、また第１と第２の装置の両者の波長検量表に共通な波長の組を確立することでも得られる。また波長の標準の組は第１と第２の装置の両者の波長検量表の波長に近似する組の波長を確立することによっても得られる。

“標準波長”は波長の標準の組の波長を意味する。

“貯蔵Ｈｂベースの代用血液”は、使用に供される製造されたＨｂベースの代用血液を意味し、たとえば、限定されないが、患者へ輸血される。Ｈｂベースの代用血液は品質管理材料として使用される。

“改良（アップグレード）一次検量解法”は、一次検量解法とは区別される独自の試料の組から誘導される検量解法を意味し、第２の装置で試験され、そしてデータは一次検量の組みからのいくつかまたは全ての元のデータと組み合わされ、一つまたは一つ以上の“改良一次検量解法”を展開する。

“波長検量”は分光器の線形ダイオードアレイ検知器、荷電結合検知器、または他の類似の機器の検量を意味し、波長は線形ダイオードアレイまたは荷電結合検知器の各画素（ピクセル）に帰属される。

“波長検量表”は、波長検量の結果である各画素（ピクセル）に対応するまたは帰属される実際の波長が与えられる表を意味する。

装置

本発明の装置は好ましくは次ぎの要素からなり：
― 試料照射のための一つまたは一つ以上の電磁波照射（ＥＭＲ）源。ＥＭＲの照射源は約３００ｎｍから約２５００ｎｍの範囲、またはその範囲の波長の一つまたは一つ以上の波長を有する特徴がある。好ましくは、波長は、約４５０ｎｍから約１１００ｎｍの範囲かまたはこの範囲の部分である；
― 試料を透過するかまたは反射されたＥＭＲを測定するための一つまたは一つ以上の光検知器；
― 一つまたはそれ以上の光検知器からの情報を処理するための電子盤で任意に一つまたは一つ以上の増幅器、アナログ／デジタル変換器およびマイクロコントローラーを具備する；
― 試料容器に配置するための装置の試料投入口；および
―分光器と連動する一つまたは一つ以上の一次検量解法であって、ここで一つまたは一つ以上の検量解法が一つまたは一つ以上の他の装置上に完全に展開された。分光器と連動する一つまたは一つ以上の改良された一次検量解法（以下の“検量解法移転”を参照）もまた本発明の装置内に使用され得る。

装置は例で示される様に透過モードまたは反射モードで作動し得る。

図４ａおよび４ｂを参照すると、分光器の試料接続器（４４４）が示される。明確にするために分光器の全体は示されない。二重方向の光ファイバー線束（４３０）が使用され、適宜の容器内に配置される試料にＥＭＲが透過され、試料は、例示されるが限定されない、試料タブ（４４２）へと配置され、それは試料投入口（４４０）内へ挿入される。束（４３０）内のいくつかのファイバーはＥＭＲが反射部材（４５０）で反射されて試料から戻るＥＭＲの一定部分を受ける。反射後集光されたＥＭＲは光検知器へと伝送される（以下の伝送モードと図６ａと６ｂに関する項で詳細に説明される）。伝送モードは、図５ａ、５ｂ、６ａおよび６ｂに示される。試料接続器（４４４）は分光器から独立させることができ、入射と集光ファイバーがＥＭＲ信号を外部装置からまたはそれへ伝送する。しかし、図６ａと６ｂに示されように、試料接続器は分光器と一体化され得る。

透過モードで使用される分光器の試料接続器（５４４）が図５ａと５ｂに示される。明確のために分光装置全体は図示されない。ＥＭＲ源は入射光ファイバー（５４８）を介して試料（たとえば５４２）に供与され、そしてＥＭＲは試料を透過して集光光ファイバー（５４６）に集光される。試料は適当な試料容器、たとえば試料タブ（５４２、５４２ｂ）を使用して試料投入口（４４０）内に配置される。入射光ファイバー５４６でありそして集光・光ファイバーは５４８であり得ると理解されたい。反射モードに関して上で示したように、試料接続器（５４４）は分光装置から独立し、そして入射と集光の光ファイバーは外部の機器からまたはそれへＥＭＲ信号を伝送する。しかし、試料接続器は分光装置と一体化も可能である（例えば図６ａと６ｂ）。

図６ａと６ｂには分光装置が示され、たとえばタングステンランプの所望のＥＭＲ源（６００）を具備する。ＥＭＲ源の減衰は分光計（６１４：検知器８６は図８の分光計内に示される）内の検知器の飽和を防止するために必要であり、それ故減衰器がＥＭＲ源と試料の間、または試料と検知器の間またはその両方に配置される。本例示では適当な径を有する開口またはチャンネル（６０２と６１２）であるが、チャンネルは適宜の長さと径の光ファイバー、または他の機器、例えばフィルターまたは当業者に周知の他の機器であることができ、それは試料投入口〈６０８〉に到達する入射ＥＭＲの量を調整するか、または、分光器（６１４）に到達するＥＭＲの発生量を調節するものである。

参照測定は試料測定の前後で行われるか、または参照測定は保存されて複数回再使用され得る。たとえば、参照測定はランプを点けて、投入口に投入されていても、また空の試料容器があっても得られる。参照測定にはいかなる参照部材も使用され得る。参照測定はランプ出力変動を補償するのに有用である。試料投入口〈６０８〉に不透明部材を挿入し、好ましくはランプを消して、暗黒電流測定を行う。“暗黒電流”は検知器がＥＭＲに曝されないときの検知器の反応を意味する。暗黒電流測定の減算は光学的に行われ、そして好ましい態様では暗黒電流測定は不要である。

例えば図８に示される分光計は回折格子（８０）を具備する。透過または反射格子のいずれも使用される。図８の例では、回折格子（８０）は反射格子である。格子は散乱素子であり、波長に従いＥＭＲ成分を分離する。好ましい態様では、分光器（６１４）の検知器はホトダイオードのアレイであるが（たとえば図８の８６；簡単のために二つのダイオードのみが当該図に示される）、しかしアレイ検知器の代りに単一検知器もまた使用される。ＬＥＤもＥＭＲ源として使用でき、ＬＥＤの使用では格子は必要でない。例えば、いかなる意味でも限定されないが、ＥＭＲ源（６００）が一つまたはそれ以上のＬＥＤのとき、単一検知器が使用され得る。

電力源は適当なものであり得て、例示されるが限定されない、図６の電力源は二つの電池からなる(６１６)。しかし装置はまた外部電源から電力供給され得て、たとえば壁のコンセントから交流電流を受電してもよい。

検知器から受ける電子信号は時間に比例し、検知器が光学信号を積分する。電子信号はアナログ電子増幅器(図示されない)で増幅されてアナログ−デジタル変換器またはＡＤＣ（これも図示されない）でデジタル信号に変換される。

再度図８を参照すると、本発明に従い使用され得る分光計が示される。試料(８４)からのＥＭＲは反射格子(８０)に入射し、そして波長成分に散乱する。拡散したＥＭＲはその後ダイオードアレイ（たとえば８６）に入射し、そうして各ダイオードが一ピクセルを表す。アレーは既知のピクセル分散を有し、それにより各ピクセルが波長に帰属される。ピクセルのアレーは波長範囲を表し、たとえば、波長範囲は約４５０ｎｍから約９００ｎｍであり、ピクセル当たり約３ナノメートルのピクセル分散である。適当な分光器の例は、ドイツ、ミクロパーツ社から入手され、２５６個のダイオードを具備する。簡単のために、二つのダイオード（８６）のみが図８に示される。いかなる数のダイオードも本願発明の範囲内であることを理解されたい。分光計の波長検量（および波長の標準の組）は詳細に米国特許第６６５１０１５号明細書（サムスーンダー；ここで参照として組み込まれる）に説明されている。いかなる分光器の使用も本発明の範囲内である。

図８に示されるように、ダイオードアレイ(８８)からの出力は電子盤（図６ａと６ｂに示される６１８）に接続される。電子盤（６１８）は増幅器、アナログ／デジタル変換器およびマイクロコントローラーを具備するが、これらは図６ａおよび６ｂに図示されない。

図６aと６ｂに示すように、試料タブ（６１０）は試料投入口(６０８)に挿入される。命令はキーボードまたはキーパッド（６０６）から入力され、データ、例えば結果は、例示されるが限定されない、モニターまたはスクリーン（６０４）上に表示される。一つまたは一つ以上のスイッチ、ボタン、またはキーの使用はキーボードやキーパッドに好ましく、ハンドヘルド機器であり、全て本発明の範囲内とするべきである。ホストコンピュータの使用は本発明の範囲内であると理解されたい。示されない通信ポートは光学ポートである。

室内光から試料投入口と検知器を遮蔽する適当な遮蔽材もまた望ましいが、遮蔽の範囲は被検物質またはパラメーター測定と暗黒電流測定の使用に依存する。装置はいかなる配置も可能であり、特に上面と下面にスイッチをつけることも可能であり、たとえばＥＭＲ源を試料の下に示し、図６ａと図６ｂにおける上部の代りとする。

吸光度はマイクロコントローラーで計算され、以下のようにそれは電子盤（６１８）にインストールされる：
吸光度i＝ｌｏｇ｛（ＲＬi−ＲＤi）／（ＳＬi−ＳＤi）｝＋ｌｏｇ（ＩＴＳ／ＩＴＲ）
ここで：
吸光度ｉ＝ピクセルでの吸光度；
ＲＬiは参照光＝ピクセルの読みである；
ＲＤiは参照暗黒＝参照ピクセルの読みである；
ＳＬiは試料光＝試料ピクセルの読みである；
ＳＤiは試料暗黒＝試料ピクセルの読みである；
ＩＴＳ＝試料測定の積分時間；
ＩＴＲ＝参照測定の積分値；そして
ｉ＝検知器アレーにおける特定のピクセル（波長）

本発明の方法は一つまたはそれ以上の被検物質に対して一つまたは一つ以上の検量解法が分光装置にインストールされる必要があり（これは検量解法移転を伴う）、例えば例示で限定されないが、一つまたは一つ以上の検量解法は電子盤（６１８）に一体化されるマイクロコントローラーにインストールされる。しかし、一つまたは一つ以上の検量解法は不揮発メモリーのいかなる形にもインストールされ得て、たとえば、これらは、例示されるがいかなる意味でも限定されない、ＲＯＭ、ＥＰＲＯＭ、ＥＥＰＲＯＭ（電子的に消去可能でプログラム可能な読取専用メモリ）、ＣＤ、ディスケット、またはメモリーカードである。

装置は試料投入口（たとえば５４０、図５）を具備し、これは試料容器（たとえば、５４２、図５）を収納するためであり、試験される。“試料投入口”は開口であって、それを通して試料容器が配置され、または試料容器が適合する溝、チャンネルまたは間隙である。投入口はいかなる方向にも取り付け可能であるが、しかし図５と６では水平な投入口であり、ＥＭＲは垂直方向に伝播する。代わりの配置では、分光装置は垂直試料投入口を具備し、試料容器、たとえばキュベットを収納する。この配置ではＥＭＲは試料を水平方向に通過する。

図５と６に示すように、試料投入口は、ＥＭＲが試料容器を覆うスロットの上面から入り透過ＥＭＲがスロットの底面で集光される、またはその反対に、入射ＥＭＲはスロットの底面から入り、上面から出ることが可能なように適合される。スロットはまた、試料容器を覆う投入口の上面からＥＭＲが入射し、透過ＥＭＲは図示のようにスロットの底面に位置する反射面または反射部材（たとえば４５０、図４ａと４ｂ）で反射される様に適合されるが、しかし反射部材は、もしもＥＭＲが底面から入るならばスロットの底面にも位置する。試料を透過したＥＭＲは試料容器上面または底面に位置する反射面で反射されることを理解されたい。

試料容器は任意に一つまたはそれ以上の試薬を含むことができるし、試料容器は適宜の容器であり得て、キュベットまたは試料タブが例示され、これらは任意に試薬を含むことができる。

試料タブ

試料容器の非限定例示は、試料タブである。試料投入口は適当な方向、たとえば水平方法で試料タブを収納するように設計される。全血は赤血球が沈殿するように静置されるので試料が全血のときは水平方向が好ましい。この場合、赤血球がＥＭＲの光路内に保持されるようにＥＭＲは垂直に伝播する。しかし、いかなる配置の試料投入口でも本発明の範囲内と考える。試料容器は毛細管現象で試料を吸い込むように設計されたキュベットであり得て、また任意に一つまたはそれ以上の試薬を含むことができる。

試料タブは試料ウエルとカバーを有する基板を具備し、基板の少なくとも一部とカバーの少なくとも一部は、ＥＭＲがそこを通過して透過できるように適合される。かわりに、試料タブは試料ウエルとカバーを有する基板を具備し、基板の少なくとも一部とカバーの少なくとも一部は試料からのＥＭＲを反射するように適合され、そして反射したＥＭＲは試料タブをぬける前に基板で試料を通過するように適合されるかまたは、カバーの少なくとも一部が試料からのＥＭＲを反射し、そして反射したＥＭＲは飼料タブをぬける前にカバーで試料を透過するように適合される。本発明の態様に従うと、試験する試料を保持する試料タブが提供される。試料タブは試料容器の例として示され、いかなる意味でも限定されるようには解釈されない。

使用に際しては、試料は基板と試料タブのカバープレートの間のウエルに保持され、電磁波照射は基板を通過し、ウエルの試料を通過し、そしてカバープレートを通過する。しかし、照射ビームが試料を透過し、基板またはカバープレートで反射されて、それにより照射ビームの光路長が倍加することは本発明の範囲内である。光路長を倍加させて、試料の減少容積が分析の間使用される。基板またはカバープレートのいずれかは反射面を有するかまたは、反射材料で構成され得る。かわりとして、試料タブは透明または半透明材料からなり、図４ａまたは４ｂに示される様になお、反射モードで使用され得る。この場合、試料投下口下部に配置された反射部材(４５０)は、例えば、例示されるが限定されない、セラミックコーティング、硫酸バリウム、商品名ＳＰＲＣＴＲＡＬＯＮ、商品名ＳＰＥＣＴＲＡＦＬＥＣＴまたは商品名ＤＵＲＡＦＬＥＣＴからなることができる。

図７ａと７ｂを参照すると、試料タブの具体的態様が示されるが、いかなる意味でも限定されない。試料タブ(７２０)は基板(７１８)、カバープレート（７０２）および閉鎖壁(７２０)で区画される試料ウエル（７１４）を具備する。試料ウエル（７１４）は希望のいかなる容積でもよく、例えば限定されないが、ウエルを満たす血液の一滴の容積でもよく、好ましくは僅かに過剰の容積である。たとえば、限定されないが、ウエルは図７ａおよび７ｂに示される様に円形であり、直径で約３ｍｍ、深さで約１ｍｍの大きさである。

カバープレート(７０２)が試料ウエル（７１４）と基板（７１８）を覆って閉鎖すると、オーバーフロー開口または溝(７１６)は過剰の試料を試料ウエル（７１４）から溢流させる。例えば、限定されない収容壁(７１２)の第２の壁は試料ウエル（７１４）からオーバーフロー環（壁７０６と壁７１２の間の環状溝）へと溢れる試料を保持するのに使用され、試料ウエルから液が漏洩するのが防止される、一方、試料はウエルを満たすに十分な量が確保される。この点から、収容壁（７１２）の垂直高さは試料ウエル（７１４）を区画する閉鎖壁(７０６)の高さと等しいかまたはそれ以上の高さである。カバープレ−ト(７０２)は、蝶番（７１０）または当業者に周知の適当な取付手段で基板に取り付けられる。しかし、蝶番で接続されないカバープレートもまた使用でき、そこではカバープレートは基板から留め金で留められる。ウエルの底面は基板上面と同じ面として示されるが、ウエルの底面は基板の上面または下面であり得る（すなわち、ウエルは基板の上に伸びてもよく、基板内に後退してもよい）。オーバーチャンネルの底面はまた、必要ならば基板上面の上でも下でもよい。

試料タブは公知の材料で製造され、例示されるが限定されない、透明または半透明な、ガラス、プラスチックまたはこれらの組合せ、または部分的な反射材で構成され得る。もしも基板とカバープレートが透明または半透明プラスチックとするならば、例示されるが限定されない、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリエチレン、またはポリスチレンであるが、ガラス板もまた使用され得る。基板またはカバープレートのいずれかが反射性とするならば、反射材は、例示されうが限定されない、セラミックコーティング、硫酸バリウム、商品名ＳＰＲＣＴＲＡＬＯＮ、商品名ＳＰＥＣＴＲＡＦＬＥＣＴまたは商品名ＤＵＲＡＦＬＥＣＴからなることができる。

任意に試料タブはカバープレート(７０２)を基板(７１８)に留めるために留め部材を具備できる。留め部材はカバープレート、基板または両方の部分である。さらに、留め部材はカバーを可逆的にまたは不可逆的に基板に固定する。公知のいかなる留め部材も本発明の基板に取り付けることができ、たとえば、例示されるが限定されない、米国特許願第１０／０４２２５８（公開番号第２００２−０１１０４９６Ａ１；サムスーンダー；この内容はここに参照として組み入れられる）で開示のものであり得る。収容壁の使用は試料が試料タブ内に保持されることを確実とし、試料間の汚染を減少させ、使用者間の感染の危険性を最小化する。さらに、試料タブのカバープレートを閉鎖位置に保持することにより、試料漏洩無しに使用後に容易に廃棄できるし、または試料タブは、たとえば分光装置内に取り付けられたキュベットホルダー内に垂直に保持されて使用され得る。

カバープレート(７０２)を基板(７１８)に固定させる留め部材（７０４）がまた示される。この例では、留め部材（７０４）は円環状リングからなり、収容壁(７１２)に摩擦力で係止することができ、そうして可逆的にカバープレート（７０２）をきばん（７１８）へ取り付けて、試料の試料タブから逃散するのを防止する。

カバープレートがウエルを覆い、基板につくと、収容壁(７１２)の上面(７０８)はカバープレートの下部面をシールするのが好ましい。しかし、収容壁を越えて漏洩が起こるならば、留め部材はまた試料タブ内に試料をシールするのにも使用される。

試料タブの他の態様からは、吸光度は透過率の代りに反射率から計算される。反射率の場合、基板の一部またはカバープレートの一部を反射面とするかまたは、反射材で構成される。このような反射材は、例えば、例示されるが限定されない、セラミックコーティング、硫酸バリウム、商品名ＳＰＲＣＴＲＡＬＯＮ、商品名ＳＰＥＣＴＲＡＦＬＥＣＴまたは商品名ＤＵＲＡＦＬＥＣＴからなることができる。
波長検量

分光計はピクセル数の代りに波長が検量解法に使用されるならば検量されねばならない。検量解法移転を容易にするために分光計の波長検量が必要である。波長検量のいくつかの方法が以下に示されるが、例示のみで、いかなる意味でも限定されない：
方法１：

既知波長のレーザーまたは既知波長のバンド−パスフィルターを通過させたＥＭＲを線形ダイオードアレイのピクセルに投射する。ＥＭＲはレーザーまたはバンド−パスフィルターに限定されず、他の単色ＥＭＲ源も使用されることを理解されたい。ＥＭＲは一つのピクセル以上に投射でき、ＥＭＲのピーク強度の相対位置は当業者に周知の方法で数学的に決定されることが理解される。さらに、ピーク強度はいかなる二つのピクセルの間に位置し得る。標的のピクセルは好ましくはスペクトルの一端に向かうものである。既知の波長の第２のレーザーまたは既知の波長のバンド−パスフィルターを通過するＥＭＲで、スペクトルの一端へ向かって好ましく投射されるものが使用され、それにビームが投射されるピクセルは同定される。ピクセルの数が知られているので、ピクセル分散が計算できる。二つの既知の波長とその対応ピクセルおよびピクセル分散から、波長検量表、すなわち、線形ダイオードアレイ中の各ピクセルに帰属する離散波長を与える表を生成できる。

一つまたはそれ以上の装置からの波長検量表からの波長における吸光度は、続いて波長の標準の組に補間されマッピングされる。標準波長のいずれかの側の二つの実際の波長における吸光度は補間され、標準波長における吸光度を生成する。この方法は、各標準波長に対して繰り返される。これは異なる装置から得られる波長を類似に見せる好ましい方法である。測光補正は部分的には波長精度に依存し、そして被検物質濃度の予測精度は装置の測光補正に依存する。この点に関し、正／否の回答が要求される回答の全てである被検物質の定性方法は同じ被検物質の定量方法と同じレベルの波長精度を要求しない。さらに、検量解法は、第１の装置と一つまたはそれ以上の類似の装置で測定された一つまたはそれ以上の一次検量材からのデータを含むことにより、よりロバスト性で展開され得る。

波長検量のこの方法では、吸光度は波長の標準の組へ補間されてマッピングされるので、第１波長は各装置の線形ダイオードアレイ同じピクセルに投射されるべきではない。第２のレーザーまたは第２バンド−パスフィルターの波長は、好ましくはＥＭＲのビームが線形ダイオードアレイの他の端へ向かって投射されるように選択される。結果としての端のピクセルでの吸光度に雑音が多いならば、ＥＭＲビームが線形ダイオードアレイの端のピクセルに近すぎて投射しないようにレーザーやバンド−パスフィルターを選択するのが好ましい。またバンドパスフィルターは、ナロウ・バンドパスフィルターであるのが好ましい。
方法２：

波長検量表を生成する第２の方法は各線形ダイオードアレイの同じピクセルに第１ビームを投射するものである。波長検量表生成のためにこの方法が使用されると、ピクセル拡散性が上で述べたように異なる波長の二つのビームを使用して、予定される。ピクセル拡散性は単一の分光計から求められるが、しかし好ましくは平均値は一つ以上の類似の分光計から得られる。同じピクセル拡散性が各装置で使用され、そして第１ビームが各線形ダイオードアレイ内の同じピクセル番号上に投射されるときは、各装置の波長検量表は同一であり、そしてそれ故、波長検量表は波長の標準の組として使用され得る。その結果、吸光度の波長の標準の組への補間とマッピングは自動的に除去される。第２のビームは波長精度を検証にするのに使用され得る。
方法３：

波長検量表を生成する第３の方法は、第１ビームが線形ダイオードアレイのいずれかのピクセル上に投射される点を除き第２の方法に似ている。第１ビームが投射されるピクセル番号が異なる装置で相違すると、異なる装置の波長検量表での特定波長に帰属されるピクセル番号は、相違する。この場合、以下のように、ソフトウエアにより波長の標準の組を生成するように使用され得る：
（ｉ）異なる装置の波長検量表に共通の波長の組を確立する。
（ｉｉ）波長の標準の組の波長範囲を選択し、波長範囲に波長の標準の組に属する波長を保有させる。

上記第３の方法で述べられた異なる装置から得られる波長検量表は異なる装置からのピクセル番号は同じ波長に帰属されないものであることを理解されたい。第１のピクセルはピクセル番号の近似であり、そしてまた異なる装置からの第１ピクセルは同じピクセルであることの近似であり、また許容される近似は一次検量解法に要求される予測精度に依存することを理解されたい。換言すると、第１ピクセルの同定は誤りであり得る。誤って同定されたピクセルが＋／− Ｎピクセルに等しいかまたは少ないならば、ここでＮは波長範囲を包含するピクセルの数であり、誤った同定でも許容される。たとえば、ピクセル拡散性が２ｎｍであり、許容誤差が＋／−１０ｎｍであるならば、そうすると、誤って同定されたピクセルはビームが投射された実際のピクセルの各側でわずか５ピクセル離れているのみに違いない。誤差の異なるレベルは、典型的には、限定されないが、＋／−２ｎｍから＋／―２０ｎｍであり、より好ましくは＋／―２ｎｍから＋／―１０ｎｍである。波長検量方法の選択は一次検量解法の予測精度に依存する。
検量解法移転

本発明の他の面は検量解法移転である。例えば、図６ａと６ｂに示される電子盤（６１８）のマイクロコントローラーにインストールされる、分光装置と連動する一つまたは一つ以上の検量解法は、試料中の一つまたは一つ以上の被検物質の存在または濃度を求めるのに使用される。一つまたは一つ以上の検量解法は、不揮発メモリー、たとえば、いかなる意味でも限定されないが、ＲＯＭ、ＥＰＲＯＭ、ＥＥＰＲＯＭ（電子的に消去可能でプログラム可能な読取専用メモリ）、ＣＤ、デスケット、またはメモリカードにインストールされ得ることを理解されたい。一つまたは一つ以上の検量解法は、あらかじめ、検量解法の過程で一つまたはそれ以上の第一装置上で展開されており、そして一つまたは一つ以上の検量解法は、第２装置と称される他の装置へ移転される。検量解法移転は、米国特許第６６５１０１５号、６７１１５１６号および６４７０２７９号明細書において説明される（サムスーンダー；これらはここに参照として組み入れられる）。

好ましい態様では、一次検量解法は、一つまたは一つ以上の他の装置上に完全に展開され、そして本発明の装置に単純にインストールされる；一次検量解法の定数または係数の較正は好ましい態様では行わない。しかし、検量解法は一次検量の組に使用されるものとは別個の独自の試料の組を使用して誘導され、第二装置上で_試験され、データは一次検量の組みからの生のデータのいくつかまたは全てと組み合わさって、一つまたは一つ以上の“改良検量解法”を展開することを理解されたい。一つまたは一つ以上の改良された一次検量解法の使用はまた本発明の範囲内であると理解されたい。改良された一次検量解法はまた米国特許第６６５１０１５号明細書（サムスーンダー；ここに参照として組み入れられる）で説明される。

被検物質濃度の予測値の精度を向上するには、第２の装置で実際の波長で測定された吸光度が標準波長の組の波長でマッピングされ、標準波長を包含する実際の波長での吸光度を補間することによる。吸光度のマッピングと吸光度の補間（内挿）はまた米国特許第６６５１０１５号明細書（サムスーンダー；ここに参照として組み入れられる）で説明される。

検量解法移転の後、“測光補正“または吸光度補正が行われ得て、試験される被検物質の要求精度に依存する。測光補正または吸光度補正は、また米国特許第６６５１０１５号明細書（サムスーンダー；ここに参照として組み入れられる）で説明される。

用語吸光度計と吸光光度計は互換性をもって使用され、発明者はいかなる区別もつけない。

体液中のヘモグロビン

溶血の指標としてのＨｂの測定の精度は、複数の要因に依存し、それは例示されるが限定されない：
１）溶血の指標として選択されたＨｂ種；
２）一次検量解法を展開するに使用された一次検量の組における各試料の成分；および
３）溶血の指標のための参照値に含まれるＨｂ種。
米国特許第６２６８９１０Ｂ１号明細書、米国特許第５８４６４９２Ｂ１号明細書、国際公開第９８／３９６３４号明細書、および国際公開第９７／４７９７２号明細書はＨｂに対する検量解法を説明し、そこではＨｂは溶血の指標として使用される。しかし、Ｈｂ種（複数可）が溶血の指標として使用されること、また全−Ｈｂが溶血の指標として使用されることの示唆は、どの文献にも示されない。

一次検量解法は被検物質の参照値の正確な見積を使用して特定の被検物質に対して展開されるのだが、試料中に存在する他の被検物質はまたは物質は被検物質の予測値に誤差を導入することを当業者は理解されたい。これは特に溶血の指標の予測値に適用し、そこではＨｂは数種のＨｂ種として存在し、これらのＨｂ種は一次検量解法において計算される必要がある。たとえば、溶血の指標は全−Ｈｂであり、標準方法を使用して行われる参照測定は、例えば、限定されないが、全−Ｈｂ測定のためのｃｙａｎＭｅｔ−Ｈｂ法である（ティエツ（臨床化学のティエツの教科書、第３版、１９９９，ｐｐ１６７４−１６７６）。もしも一次検量解法試料に存在する全−Ｈｂが適当なＨｂ種の変形で構成されないならば、高い割合のＭｅｔ−Ｈｂの使用に対して予測される全−Ｈｂは有意に過小評価され得る。

溶血の指標の測定に必要な精度は溶血の指標の適用に依存する。溶血はＲＢＣ内に含まれる物質を血清または血漿内に放出するので、赤血球（ＲＢＣ）内に存在するいかなる物質も、そしてＲＢＣを囲む血漿内に存在しない、いかなる物質も溶血の指標として使用され得る。ＨｂはＲＢＣ内に含まれる物質の例示であり、もし溶血が起こると血清と血漿内にのみ存在する。

たとえば使用が乱暴に扱われると溶血は生体外で起こり得るし、またたとえば脆弱なＲＢＣ膜の患者または人口心臓弁の患者では生体内で溶血は起こり得る。それゆえ、溶血の指標を正確に測定するには、以下を求めることが望ましい：
１）生体外と生体内の溶血の全ての組合せ；
２）真の溶血のレベル、たとえば生体外溶血によりカリウムのような物質の濃度が血清または血漿中にどの程度人工的に高まったかを理解する（ＲＢＣ中のカリウムの濃度は血漿中よりも２５倍濃いのでカリウムは溶血ＲＢＣから放出される物質の他の例である）；および
３）ヘモグロビン放出による血清または血漿の吸光度の増加とどのようにまたどの程度Ｈｂにより人工的に増加する吸光度が他の被検物質に分光的に影響するかを理解する努力をする。

全−Ｈｂは鋭敏な溶血の指標であり、そして溶血の程度のよい推測を与える。動脈血の通常のＨｂの組成は、約９５％Ｏｘｙ−Ｈｂ、約１％Ｍｅｔ−Ｈｂ、約２％Ｃａｒｂｏｘｙ−Ｈｂおよび約２％Ｄｅｏｘｙ−Ｈｂであり、これはＣＯ−酸素計で動脈血試料を測定した値である。ＣＯ−酸素計はよく知られており、全血中のヘモグロビン種の測定をする：Ｏｘｙ−Ｈｂ、Ｄｅｏｘｙ−Ｈｂ（または還元−Ｈｂ）、Ｍｅｔ−ＨｂおよびＣａｒｂｏｘｙ−Ｈｂ。溶血時多くの血清および血漿中に見られるＨｂ種の割合は、動脈血で記載したものに類似しているが、血清や血漿は通常静脈血から得られる。Ｈｂ酸素飽和と称される全−ＨｂのＯｘｙ−Ｈｂのパーセントは静脈血のそれと比較すると通常は動脈血ではかなり高いのだが（静脈血のＤｅｏｘｙ−Ｈｂの増加のため）、静脈血試料（血清または血漿）におけるＯｘｙ−Ｈｂの増加レベルは試料の空気への暴露によるものであり、それは２０％の酸素を含む（すなわち、１５２ｍｍＨｇの酸素分圧で、７６０ｍｍＨｇの２０％）。それ故、Ｏｘｙ−Ｈｂは、特に通常のＨｂ種を有する血液試料における溶血の他の鋭敏な指標である。

試料内のＭｅｔ−Ｈｂの増加は図３に示されるが、しかしＭｅｔ−Ｈｂ型である全−Ｈｂの割合は知られていない。図３に示されるＭｅｔ−ＨｂはＨｂの自然酸化により生成したものである。同じ血液提供者により溶血酵素が提供され、その吸収スペクトルが図３に示され、そして新鮮な溶血酵素で、異なる日に得られたものは区別不能である。この議論は血清または血漿の溶血をより目的とするが、同じ議論が全血を含む全ての体液に適用され得る。

同じ波長領域のＭｅｔ−Ｈｂの吸光度（それはかなり低い）を比較すると、Ｏｘｙ−Ｈｂ、Ｄｅｏｘｙ−ＨｂおよびＣａｒｂｏｘｙ−Ｈｂの吸収スペクトル（特に吸収スペクトルの勾配で、それは吸光度の１次導関数である）は約５７６ｎｍから７００ｎｍの範囲（図２に示される様に、特に約５９０ｎｍから約６１０ｎｍ）で非常に似ている。Ｍｅｔ−Ｈｂはまた約６３２ｎｍに特性ピークを示す。それゆえ、もしも全−Ｈｂに対する検量解法が、約９５%Ｏｘｙ−Ｈｂからなる全−Ｈｂの予測である参照値を使用して展開されるならば、試料中のＤｅｏｘｙ−ＨｂとＣａｒｂｏｘｙ−Ｈｂの大量が全−Ｈｂの測定に含まれる。しかし、Ｍｅｔ−Ｈｂの吸光度は５７６ｎｍから７００ｎｍでは低く、それにより全−Ｈｂの参照測定に比較して全−Ｈｂを有意に過小評価することになる。この場合、溶血指標として全−Ｈｂの検量から誘導される予測値は”全−ＨｂマイナスＭｅｔ−Ｈｂ”をより反映することになる。この試料では溶血の指標はより適切に”全−ＨｂマイナスＭｅｔ−Ｈｂ”と称される。

図１と図２で示される４種のＨｂ種に加えて、第５のＨｂ種、Ｓｕｌｆ−ヘモグロビン（Ｓｕｌｆ−Ｈｂ）が図９に示される（Clin.Chem.News １９９０；１６（１）page１１−１２を参照）。Ｓｕｌｆ−Ｈｂは緑色で硫黄を含み鉄は第二鉄の形態にある。Ｍｅｔ−Ｈｂも第二鉄を含むが、しかしＯｘｙ−Ｈｂ、Ｄｅｏｘｙ−ＨｂおよびＣａｒｂｏｘｙ−Ｈｂの鉄は第一鉄の形である。Ｓｕｌｆ−Ｈｂの大きな吸収は、それは約６２０ｎｍのピークだが、Ｓｕｌｆ−Ｈｂを予測する検量解法を得るのに使用され得る。ある種の薬、例示されるがいかなる意味でも限定されない、スルファミド、アセトアニリド、フェナゾピリジン、ダプソンおよびメトクロロプラミドはＳｕｌｆ−Ｈｂの蓄積に関連する（Ｗｕら．Clin.Chem. １９９７；４３（１）page１６２−１６６）。

Ｏｘｙ−Ｈｂが全てのＨｂ種の約９５%である例では、Ｏｘｙ−Ｈｂの参照値は全−Ｈｂの予測値として使用され得る。Ｏｘｙ−Ｈｂの割合が全−Ｈｂの約９５%である既知のＯｘｙ−Ｈｂ濃度の試料はＯｘｙ−Ｈｂ濃度と同じ数値の全−Ｈｂ濃度を有すると考えられる。同様に、約９５％Ｏｘｙ−Ｈｂからなる既知の全−Ｈｂ濃度の試料は、全−Ｈｂ濃度と同じ数値のＯｘｙ−Ｈｂ濃度を有すると考えられる。”Ｏｘｙ−ＨｂプラスＤｅｏｘｙ−Ｈｂ”の割合が全−Ｈｂの約９５%である既知の”Ｏｘｙ−ＨｂプラスＤｅｏｘｙ−Ｈｂ”濃度の試料は、”Ｏｘｙ−ＨｂプラスＤｅｏｘｙ−Ｈｂ”濃度と同じ数値の全−Ｈｂ濃度を有すると考えられる。同様に約９５％の”Ｏｘｙ−ＨｂプラスＤｅｏｘｙ−Ｈｂ”からなる既知の全−Ｈｂ濃度の試料は全−Ｈｂ濃度と同じ数値の”Ｏｘｙ−ＨｂプラスＤｅｏｘｙ−Ｈｂ”濃度を有すると考えられる。用語“Ｏｘｙ−Ｈｂ”と”Ｏｘｙ−ＨｂプラスＤｅｏｘｙ−Ｈｂ”は、試料が大気酸素に暴露されるならば交換可能であり、それはＨｂは酸素を急速に吸収しＯｘｙ−Ｈｂに変換するからである。Ｏｘｙ−Ｈｂまたは”Ｏｘｙ−ＨｂプラスＤｅｏｘｙ−Ｈｂ”の予想値はＭｅｔ−Ｈｂにより有意に影響されないであろうし、影響されるならば、しかしＯｘｙ−Ｈｂまたは”Ｏｘｙ−ＨｂプラスＤｅｏｘｙ−Ｈｂ”の予測値は溶血または全−Ｈｂの信頼される算出にならないであろう、これは大部分のＭｅｔ−Ｈｂが測定されないからである。

上で議論されたＨｂ測定方法はＨｂで汚染された体液または血清または血漿の溶血に関するが、全血中のＨｂの測定は本発明の範囲内であると理解されたい。全血のＨｂと血清または血漿のＨｂとの相違は単にＨｂ濃度とＲＢＣの光拡散効果である。ＩＮＴＲＡＬＩＰＩＤ粒子が血清または血漿中のＨｂのために一次検量の組の複数の試料に加えられて、典型的にはＲＢＣと関連する光拡散効果を増加させる。体液は人体に限られず、他の種、例えば動物からの体液が本発明の範囲に含まれると理解されたい。

それ故、本発明の方法の一つの態様は、大量のＭｅｔ−Ｈｂの存在下全−Ｈｂの過小評価を克服することにあり、それは以下の通りである：
方法1：Ｍｅｔ−Ｈｂを一次検量の組へ加えて、そして検量解法の展開のための全−Ｈｂの参照値にＭｅｔ−Ｈｂを含ませる；または
方法２：Ｍｅｔ−Ｈｂを一次検量の組へ加えて、そして一次検量解法の展開の間、Ｈｂの参照地にＭｅｔ−Ｈｂを含ませない。

方法１では、全−Ｈｂの検量解法は予測全−Ｈｂの結果にＭｅｔ−Ｈｂを部分的に含むことができる。

方法２では、検量解法は”全−ＨｂマイナスＭｅｔ−Ｈｂ”を予測しそして試料中のいかなるＭｅｔ−Ｈｂも無視される。

再度方法２を参照すると、別個の検量解法が試料中のＭｅｔ−Ｈｂの測定のためにＭｅｔ−Ｈｂに対して展開され、予測値を超えるＭｅｔ−Ｈｂで試料をフラッグ付けする、または予測Ｍｅｔ−Ｈｂは上述の”全−ＨｂマイナスＭｅｔ−Ｈｂ”に、全−Ｈｂ測定のために加えられる。上述の方法２は、Ｍｅｔ−Ｈｂの存在下に全−Ｈｂを得る正確な方法である。

“全−ＨｂマイナスＭｅｔ−Ｈｂ”のための一次検量解法は、Ｏｘｙ−Ｈｂ、Ｄｅｏｘｙ−Ｈｂ、Ｃａｒｂｏｘｙ−Ｈｂ、Ｍｅｔ−ＨｂおよびＳｕｌｆ−Ｈｂの一つまたは一つ以上の種々の量を含む一次検量の組の試料を使用して展開される。Ｏｘｙ−Ｈｂ、Ｄｅｏｘｙ−Ｈｂ、Ｃａｒｂｏｘｙ−ＨｂおよびＳｕｌｆ−Ｈｂの量が合計されて参照値で全−Ｈｂ濃度（実際は、”全−ＨｂマイナスＭｅｔ−Ｈｂ”）になるならば好ましい。溶血の指標に用いられる物質の名前は通常は参照値に含まれる物質類のそれと同じである。しかし、参照値に含まれる実際の物質類は一次検量材の組成に依存することを理解されたい。さらにまた、いくつかの一次検量試料は一つまたは一つ以上の成分の量がゼロであり、量がゼロの試料はまだ、成分を有する試料と考えられ、しかし成分の濃度はゼロｇ／Ｌである（量を規定する単位に関係ない）ことも理解されたい。

方法１を使用して得られた評価全−Ｈｂの正確性が特定の応用で認められるならば方法１は使用され得ることを理解されたい。

本発明の態様では、”全−ＨｂマイナスＭｅｔ−Ｈｂ”への一次検量解法の項とＭｅｔ−Ｈｂへの一次検量解法の項は合算されて単一の検量解法の一組の項を生成し、それは訂正全−Ｈｂを予測する。

しかし本発明の他の態様では、溶血の指標はＯｘｙ−Ｈｂであり、訂正全−Ｈｂ値はＯｘｙ−ＨｂとＭｅｔ−Ｈｂの予測値を加えることにより得られることができる。使用される一次検量解法に依存するが、もしも試料中に存在すれば、Ｄｅｏｘｙ−Ｈｂおよび／またはＣａｒｂｏｘｙ−Ｈｂの有意な割合はＯｘｙ−Ｈｂとして測定され得ることを当業者は理解されたい。

上で注意したように、血液提供者が最近一酸化炭素に暴露されるかまたはメトヘモグロビン血症の患者でない限り、溶血試料または全血試料ではＨｂの約９５%が通常はＯｘｙ−Ｈｂ状態である。一酸化炭素の暴露（主に煙の吸入による）はＣａｒｂｏｘｙ−Ｈｂの増大をもたらし、そしてメトヘモグロビン血症はＭｅｔ−Ｈｂの増大となる。Ｈｂ分子のヘム部分における鉄の酸化は生体内で起こる通常のプロセスである。酵素は常に働き逆転させてＭｅｔ−Ｈｂの蓄積を防止する（たとえば、ＮＡＤＨメトヘモグロビン還元酵素、およびＭｅｔ−Ｈｂ還元酵素系）。メトヘモグロビン血症はこの酸化過程を逆転するに要する酵素が欠乏する症例である。酸化過程を逆転させる酵素の欠乏はまたＨｂの全血中のＭｅｔ−Ｈｂへの自然の酸化、または時間経過後の溶血血清または血漿をもたらし、試料を暗黒色にする。

図３は溶血試料の時間変化を示す。暗黒色化に伴う約６３２ｎｍの吸収ピークはＨｂのＭｅｔ−Ｈｂへの転換を示す。Ｍｅｔ−Ｈｂの蓄積はＨｂベースの代用血液を輸血された患者の血清または血漿に生じる。溶血血清もしくは血漿中の、またはＨｂベースの代用血液を輸血された患者からの血清または血漿中のＭｅｔ−Ｈｂの検量解法は、それ故、約６３０ｎｍの極大吸収のピークの負の勾配好ましくは使用して展開され得る。例６（式２２）はＭｅｔ−Ｈｂの一次検量解法の例を与え、それは一次検量波長として６４５ｎｍを用いる。

ここに述べるＭｅｔ−Ｈｂの測定はＨｂのＭｅｔ−Ｈｂへの酸化を測定するために、またＨｂベースの代用血液のＭｅｔ−Ｈｂ型への酸化を測定するために、血清、血漿、尿、髄液、リンパ液および滑液の溶血の指標を測定するのに使用される。また、ここに述べるＭｅｔ−Ｈｂの測定はＨｂベースの代用血液を輸血されたまたはされない患者の全血中のＨｂを測定するのに使用される。

本発明の他の面は、修正全−Ｈｂを測定する方法を提供し、それは次ぎの一次検量解法を使用する：
１．Ｏｘｙ−Ｈｂまたは”Ｏｘｙ−ＨｂプラスＤｅｏｘｙ−Ｈｂ”を予測するための一次検量解法；
２．Ｍｅｔ−Ｈｂを予測するための一次検量解法；および
３．Ｃａｒｂｏｘｙ−Ｈｂを予測するための一次検量解法。

全−Ｈｂは、上記一次検量解法を使用して求められるＯｘｙ−Ｈｂまたは”Ｏｘｙ−ＨｂプラスＤｅｏｘｙ−Ｈｂ”を各Ｍｅｔ−ＨｂおよびＣａｒｂｏｘｙ−Ｈｂの予測値に加えることにより測定され得る。

代りに、Ｏｘｙ−Ｈｂまたは”Ｏｘｙ−ＨｂプラスＤｅｏｘｙ−Ｈｂ”に上で同定された一次検量解法の項と、Ｍｅｔ−ＨｂおよびＣａｒｂｏｘｙ−Ｈｂの一次検量解法の項が合算されて単一の検量解法の一つの組を生成し、それは全体のヘモグロビンを予測する。全−Ｈｂを予測する単一の検量解法の使用は修正全−Ｈｂを求めるのに使用される。使用される試料が好気性試料ならば、Ｏｘｙ−ＨｂとＤｅｏｘｙ−Ｈｂのための別個の検量解法を展開する必要はない。たとえば、もしも試料が静脈血（これは動脈血または毛細管血と比較するとより高い割合のＤｅｏｘｙ−Ｈｂを有する）ならば、大気酸素は多くのＤｅｏｘｙ−ＨｂをＯｘｙ−Ｈｂに急速に変換する。好ましくは試料は全血であるが、他の試料、例えば血清や血漿の使用も本発明の範囲内と考えるべきである。試料が全血のときは、試料は好ましくは針で指して得られる。赤血球の溶解（LYSIS）は必要ではない、何故ならば検量解法類は、キロミクロンまたはより重要だがＲＢＣのような高度に光拡散性粒子の存在することでまたは存在すること無しで作用することができるからである。

本発明の方法の一つの他の面は次ぎの一次検量解法を使用して修正全−Ｈｂを測定する他の方法を提供するにある：
１．Ｏｘｙ−Ｈｂまたは”Ｏｘｙ−ＨｂプラスＤｅｏｘｙ−Ｈｂ”を予測する一次検量解法；
２．Ｍｅｔ−Ｈｂを予測する一次検量解法；
３．Ｃａｒｂｏｘｙ−Ｈｂを予測する一次検量解法；
４．Ｓｕｌｆ−Ｈｂを予測する一次検量解法。

全−Ｈｂは、上記定義の一次検量解法を使用して、Ｏｘｙ−Ｈｂまたは”Ｏｘｙ−ＨｂプラスＤｅｏｘｙ−Ｈｂ”の予測値とＭｅｔ−Ｈｂ、Ｃａｒｂｏｘｙ−ＨｂおよびＳｕｌｆ−Ｈｂの予測値のそれぞれを加えることにより測定されることができる。かわりに、Ｏｘｙ−Ｈｂまたは”Ｏｘｙ−ＨｂプラスＤｅｏｘｙ−Ｈｂ”の一次検量解法の項と、Ｍｅｔ−Ｈｂ、Ｃａｒｂｏｘｙ−ＨｂおよびＳｕｌｆ−Ｈｂの一次検量解法の項を合算して検量解法の単一の式を生成させると、それは全体のヘモグロビン（全−Ｈｂ）を予測する。全−Ｈｂを予測する単一の検量解法の使用は修正全−Ｈｂを求めるのに使用される。

もしも試料が好気性試料ならば、上で示したように、大気酸素は急速に大部分のＤｅｏｘｙ−ＨｂをＯｘｙ−Ｈｂへ変換するのでＯｘｙ−ＨｂとＤｅｏｘｙ−Ｈｂに対する別個の検量解法を展開する必要はない。好ましくは試料は、全血であるが、他の試料、たとえば、血清および血漿の使用は本発明の範囲内と考えるべきである。試料が全血のときは、好ましくは試料は針を刺して得られる。

検量解法はキロミクロンまたはより重要にはＲＢＣのような高度に拡散性粒子の存在でまたは存在しないことで作用し得るので、ＲＢＣの溶解は必要ない。これは、ＣＯ−酸素計とは逆であり、そこではＲＢＣの溶解が必要であり、種々のＨｂ種の波長特定モル吸光係数が一次検量解法に使用される。むしろ、本発明では、ＲＢＣの溶解無しで、そして種々のＨｂ種の波長特性モル吸光係数を使用すること無しで全−Ｈｂを測定する方法が提供される。自然溶解、生体内溶血、または測定に先立つ試料の処理状況に依存して、ＲＢＣは血液試料中で部分的に溶解され得る。

また、血液試料が無酸素環境に留まることを必要とするＣＯ−酸素計の方法とは反対に、本発明は試料を大気酸素に曝してＯｘｙ−ＨｂとＤｅｏｘｙ−Ｈｂを一つに組合せることにより種々のＨｂ種を測定する方法を提供する。全−Ｈｂが測定されるかまたは計算された後に次ぎの種の一つまたはそれ以上が全−Ｈｂのパーセントの割合として求められ得る：Ｏｘｙ−Ｈｂ、”Ｏｘｙ−ＨｂプラスＤｅｏｘｙ−Ｈｂ”、Ｍｅｔ−Ｈｂ、Ｃａｒｂｏｘｙ−ＨｂおよびＳｕｌｆ−Ｈｂ。ここに記載される方法は発見される他のＨｂ種にも適用され得る。
ヘモグロビンの酸化

Ｈｂ分子のヘム部分にある鉄の酸化は通常は生体内で起こる過程である。酵素が常に働いて、酸化を逆転させて、Ｍｅｔ−Ｈｂの蓄積を防止する。メトヘモグロビン血症は酸化反応を逆に進行させるに必要な酵素、例えばＮＡＤＨメトヘモグロビン還元酵素が不足する症例である。Ｍｅｔ−Ｈｂ還元酵素系は幼児では未開発であり、メトヘモグロビン血症は幼児の間にはより流行する。幼児と新生児の間にメトヘモグロビン血症がより起こりやすい他の理由はある幼児での胃腸系の未発達のためである。未発達の胃腸系では、胃酸分泌が不足するので細菌が繁殖し得る。硝酸塩は、通常胃腸系の細菌により亜硝酸塩に変換され、亜硝酸塩は順にＨｂに反応してＭｅｔ−Ｈｂを生成する。

溶血血清中にＭｅｔ−Ｈｂ還元酵素が不足することは時間経過でＨｂのＭｅｔ−Ｈｂへの自然酸化をもたらし、試料を暗黒色に変化させる。図３を参照すると、暗黒色への変色を伴いＨｂのＭｅｔ−Ｈｂへの変換を意味する約６３２ｎｍの吸収ピークが観測される。Ｍｅｔ−Ｈｂ還元酵素が不足しない患者にまたＭｅｔ−Ｈｂの蓄積が起こる。これらの患者では、Ｍｅｔ−Ｈｂの蓄積はある種の医薬、化学品の服用により誘発され、これらは例えば例示されるが限定されない、ダプソン、クロロキン、フェナゾピリジン、フェナセチン、硝酸塩、亜硝酸塩、フェノール類およびアニリンである。高レベルのＭｅｔ−Ｈｂの患者は原因の如何を問わずＭｅｔ−Ｈｂの増加、または処理後のＭｅｔ−Ｈｂの減少、または増加と減少の両方を監視する必要がある。

通常人では、ＣＯ−酸素計で測定して、動脈血中のＨｂ（全−Ｈｂの％）の組成は、約９５％Ｏｘｙ−Ｈｂ、約２％Ｄｅｏｘｙ−Ｈｂ、約２%Ｃａｒｂｏｘｙ−Ｈｂ、および約１％Ｍｅｔ−Ｈｂである。非常な喫煙家では、％Ｃａｒｂｏｘｙ−Ｈｂは約１０％である。Ｈｂ組成はＨｂ種の測定に使用されるＣＯ−酸素計に依存することを理解されたい。より新規なＣＯ−酸素計はより多くの波長で操作されるので、より信頼されると推測され、異なる数値を与える傾向がある。より多くの波長は干渉性物質、例えばバリウム、混濁、および胎児ヘモグロビンなどを補償することを助ける。ＣＯ−酸素計はある人には％Ｈｂ種を測定するための参照機器として考えられているが、しかしＣＯ−酸素計を使用する方法は血液試料中のＨｂ種の％を測定するための真の参照方法ではない。

全−ＨｂとＭｅｔ−Ｈｂは針で刺して得られる血液試料で測定され、％Ｍｅｔ−Ｈｂが計算される。％Ｍｅｔ−Ｈｂの測定のための検量解法は試料の異なる二つの波長、たとえば約６３０ｎｍと約５６０ｎｍにおける吸光度の比をとることにより実験的に展開される。図２を参照すると、約６３０ｎｍにおける吸光度は示される他の種のそれぞれの同じ量に対するよりもＭｅｔ−Ｈｂに対する方が大である；約５６０ｎｍでは反対がそうであることに注意される。これらの波長は使用され得る単なる例示であり、いかなる意味でも限定されない。

さらに、５６０ｎｍと９４０ｎｍでの吸光度の比は％Ｍｅｔ−Ｈｂの検量解法の一つ以上の比の項目であり得る。単一の項としての吸光度の比の使用、または検量解法における一つの単一の項の和を使用することは好ましい。しかし検量解法の解を求めるのに、統計処理をすることは本発明の範囲内と考えられる。Ｍｅｔ−Ｈｂの存在のために全−Ｈｂ（血清および血漿中の溶血の指標として使用されるもの）の測定を修正する方法は、米国特許第６６８９６１２号明細書（サムスーンダー；これはここに参照として組み込まれる）に開示される。Ｍｅｔ−Ｈｂの検量のための、Ｍｅｔ−Ｈｂ存在のために全−Ｈｂを修正するための、およびＭｅｔ−Ｈｂ存在のために全−Ｈｂにフラッギングするために記載される方法はまた全血のためにも使用され得る。

ヘモグロビン−ベースの代用血液の減成および減成の反対

輸血は人命救助行為であり、外傷を受けた後または手術中の重大な出血により行なう。全血（“全血”は血液の細胞性または非細胞性成分の組合せを意味する）の代りに代用血液または赤血球を使う利点は以下の通りである：
ａ）代用血液は全ての血液型に共通して適合すると期待され、それ故交差試験は必要ない；
ｂ）血液の最大貯蔵日数は４２日間であり、一方、代用血液はより長い貯蔵期間を有する；および
ｃ）代用血液の精製工程は熱処理であり、有害な細菌の危険を最小化する。

開発中の多くの代用血液はヒトのＨｂ、牛のＨｂまたは遺伝子組換え技術（組替えＨｂ）によるものである。ヘモグロビンは４個の蛋白サブユニットからなり、それは同じポリペプチド鎖の二つのペアである。各サブユニットは分子量約１６０００であり、ヘム（鉄−ポルフィリン）基と酸素摂取部位を含む裂片を有する。サブユニットは共有結合による結合はしていないで、赤血球膜をサブユニットに止める。ヘモグロビン分子は大きすぎるので腎臓を通過できないが、しかしサブユニットは十分小さくて腎臓に引っかかって腎臓障害を起こす。

Ｈｂベースの代用血液では、安定のために、Ｈｂのサブユニットは互いに化学的に架橋されるかまたは巨大ポリマーとなり、またはＨｂ分子は他のＨｂ分子と結合してポリ−Ｈｂの形となる。Ｈｂサブユニットは分子間または分子内で架橋され得る。ヘム基を囲む蛋白またはポリマーに拘わりなく、Ｈｂベースの代用血液の吸収スペクトルはほとんど通常のＨｂと同一であるが、しかし、一定の波長で微妙な違いが存在する。Ｈｂベースの代用血液はＭｅｔ−Ｈｂへの調節不能な自然な酸化から保護されない、何故ならば、それらはもはや赤血球膜の中に収納されておらず、その中ではＨｂは通常Ｍｅｔ−Ｈｂ還元酵素と接触している。代用血液の詳細は、“代用血液：原理、方法、製品および臨床試験”（１９９８、T.M.S.Chang、Karger Landes Systems発行）の第１巻と２巻にある。Ｈｂベースの代用血液のどれも本発明の範囲内と考えられることを理解されたい。

Ｍｅｔ−Ｈｂ還元酵素が無いことにより、Ｈｂベースの代用血液を輸血された患者の血漿中にはＭｅｔ−Ｈｂの蓄積が起こる。Ｈｂベースの代用血液のそのＭｅｔ−Ｈｂ型への減成（酸化による）を監視するための、または例えば一つまたはそれ以上の治療薬の服用による減成の反対を監視するための、またはＮＡＤＨメトヘモグロビン還元酵素または他の還元剤をＨｂベースの代用血液に封入することにより自然な酸化の進行が遅延するのを監視するには、Ｍｅｔ−Ｈｂの全−Ｈｂに対する比を測定または計算するのが有用である。この例では、二つの血液被検物質はＨｂベースの代用血液とＨｂベースの代用血液のＭｅｔ−Ｈｂ形である。Ｈｂベースの代用血液の一つまたはそれ以上の型を輸血された患者では、全−Ｈｂは一つまたはそれ以上のＨｂベースの代用血液と内因性のＨｂの両方を含み、Ｍｅｔ−Ｈｂは一つまたはそれ以上のＨｂベースの代用血液のＭｅｔ−Ｈｂ形と内因性のＭｅｔ−Ｈｂの両方を含むことを理解されたい。

Ｈｂベースの代用血液の減性を監視する方法は、検量解法をＭｅｔ−ＨｂとＨｂベースの代用血液について解くことを要する。一つまたはそれ以上の波長において試料で吸収されたＥＭＲを処理する統計処理を使用して検量解法は展開され得る。それぞれの検量解法を一つまたはそれ以上の波長に試料の吸光度を適用することにより一つまたはそれ以上のＨｂベースの代用血液とＭｅｔ−Ｈｂの濃度が求められる。Ｍｅｔ−Ｈｂに対する検量解法とＨｂベースの代用血液に対する他の検量解法を使用することにより、Ｍｅｔ−ＨｂはＨｂベースの代用血液全体に対する割合、分数、パーセントとして得られ得る。代りに、Ｍｅｔ−Ｈｂ形のＨｂベースの代用血液の全体の割合、分数、パーセントについて検量解法は展開され得る。

時間経過して収集された単一の血液試料または一つ以上の血液試料は、Ｈｂベースの代用血液の減成状態またはＨｂベースの代用血液の減成の反対を調べるために使用され得る。時間経過をして収集された一つ以上の血液試料が好ましい。割合（たとえば％Ｍｅｔ−Ｈｂ）と同様Ｍｅｔ−Ｈｂの濃度がＨｂベースの代用血液の減成または減成の反対を監視するのに使用される。例として、限定されないが、単一の試料が使用される場合、少なくとも約３％のＭｅｔ−Ｈｂが代用血液の減成の指標となる。それ故、３%またはそれ以上のＭｅｔ−Ｈｂを有する試料はＨｂベースの代用血液の減成を示していると同定され得る。好ましくは一つ以上の血液試料が時間をかけて収集され、そしてＭｅｔ−Ｈｂ濃度の増加、または％Ｍｅｔ−Ｈｂの増加は代用血液の減成の指標となる。さらに、Ｍｅｔ−Ｈｂ濃度の減少または％Ｍｅｔ−Ｈｂにおける減少は代用血液における減成の反対の指標である。

それ故、本発明は試料中の一つまたは一つ以上の代用血液の減成または減成の反対を監視する方法を提供しそれは以下からなる：
ｉ）Ｍｅｔ−Ｈｂに対する第１の検量解法と一つまたは一つ以上のＨｂベースの代用血液に対する第２の検量解法を波長の標準の組の一つまたは一つ以上の波長に試料の吸光度のある次数の導関数を適用することにより、Ｍｅｔ−Ｈｂの第１の濃度および試料における一つまたは一つ以上のＨｂベースの代用血液の第１の濃度を求める；
ｉｉ）Ｍｅｔ−Ｈｂに対する第１の検量解法と一つまたは一つ以上のＨｂベースの代用血液に対する第２の検量解法を波長の標準の組の一つまたは一つ以上の波長に試料の吸光度のある次数の導関数を適用することにより、Ｍｅｔ−Ｈｂの第２の濃度および試料における第２の時間の一つまたは一つ以上のＨｂベースの代用血液の第２の濃度を求める；
ｉｉｉ）Ｍｅｔ−Ｈｂの第１の濃度と一つまたは一つ以上のＨｂベースの代用血液の第１の濃度を使用して、Ｍｅｔ−Ｈｂ形にある一つまたは一つ以上のＨｂベースの代用血液の第１の割合を計算し、そしてＭｅｔ−Ｈｂの第２の濃度と一つまたは一つ以上のＨｂベースの代用血液の第２の濃度を使用してＭｅｔ−Ｈｂの形にある一つまたは一つ以上のＨｂベースの代用血液の第２の割合を計算する；

ここで、第２の割合の増加は、第１の割合と比較すると、一つまたは一つ以上の代用血液の減成の指標であり、第２の割合における減少は、第１の割合と比較すると、一つまたは一つ以上のＨｂベースの代用血液の減成の反対の指標であり、そうして一つまたは一つ以上のＨｂベースの代用血液の減成または減成の反対が監視される。Ｍｅｔ−Ｈｂの形にあるＨｂベースの代用血液の割合を使用する代りに、時間を経過したＭｅｔ−Ｈｂの絶対量の増加（例えばグラム／リッター）が一つまたは一つ以上のＨｂベースの代用血液の減成の指標として使用され、そして時間を経過したＭｅｔ−Ｈｂの絶対量の減少は一つまたは一つ以上のＨｂベースの代用血液の減成の反対の指標として使用し得る。

また、試料中の一つまたは一つ以上のＨｂベースの代用血液の減成を調べる本発明の方法は、以下からなる：
ｉ）Ｍｅｔ−Ｈｂに対する検量解法および一つまたは一つ以上のＨｂベースの代用血液に対する一つまたは一つ以上の検量解法を具備する分光装置を使用して、波長の標準の組の一つまたは一つ以上の波長における吸光度を測定し；
ｉｉ）；Ｍｅｔ−Ｈｂに対する検量解法を吸光度のある次数の導関数に適用して吸光度からＭｅｔ−Ｈｂの第１濃度を計算し、そして一つまたは一つ以上のＨｂベースの代用血液に対する一つまたは一つ以上の検量解法を吸光度のある次数の導関数に適用して、吸光度から一つまたは一つ以上のＨｂベースの代用血液の第２濃度を計算する；

ここで、第１濃度と第２濃度から計算してＭｅｔ−Ｈｂの濃度が一つまたは一つ以上のＨｂベースの代用血液の濃度の３%と等しいかまたはそれ以上であるならば、これは一つまたは一つ以上のＨｂベースの代用血液の減成を意味する。

米国特許願第１０／１３６３２９号（米国特許出願公開第２００３−０１３８９６０Ａ１号；サムスーンダー；これはここに参照として組み入れる）は、Ｍｅｔ−Ｈｂ形またはＨｂベースの代用血液の誘導体の生成を監視することによりＨｂベースの代用血液の減成を監視する方法を記載する。その適用として試料は、代用血液を輸血された患者からの全血、血清、血漿、または人体の一部を教示する。同じ方法が貯蔵されたＨｂベースの代用血液の減成の監視方法に使用され得る。“貯蔵Ｈｂベースの代用血液”は製造されて使用に供されるＨｂベースの代用血液を意味し、例えば、例示されるが限定されない、患者の輸血用のものである。Ｍｅｔ−Ｈｂの存在で全−Ｈｂ（血清および血漿における溶血の指標として使用される）の測定を修正する方法は、米国特許第６６８９６１２号明細書に開示される（サムスーンダー；これはここに参照として組み入れる）。

上記の記載はクレームされた本発明をどのようにも限定させる意図はない。本発明は以下の例で更に説明される。
例：一次検量

一次検量の組と称する試料の比較的大なる組の吸光度の測定を必要とするので装置の一次検量は面倒で時間を要するものである。一次検量の組の使用は実際のものかまたは実際のものに非常に近いものであるべきである。好ましくは、試料は試料に期待される全ての吸光度変化を含み、試料の変化は一次検量解法に内蔵される。容器はまた変化に対応し、一つ以上の容器の組合せを使用して一つまたは一つ以上の１次検量解法を展開することが可能であり、容器の変化は１次検量解法に内蔵される。しかし、特別の型の容器に特定される一次検量解法の展開が好ましい。検量解法が遂行される装置は“第１の装置”と称される。一次検量工程を行なう第２の装置自身なしで第１の検量解法かまたは一次検量解法の変形を使用する他の装置は、“第２装置”と称される。

一次検量解法は以下のようにして得られる：一次検量解法が展開される所定の被検物質の濃度範囲をカバーする複数の試料に対して吸収スペクトルが得られる。試料に期待される全ての吸光度変化を試料は含むことが好ましく、試料の変化は１次検量解法に内蔵される。

また試料は前処理されないことが好ましい。前処理の例は、いかなる意味でも限定されないが、化学的手段または市販のＣＯ−酸素計で使用される鹸化による全血中のＲＢＣの溶解である。

光拡散粒子または物質は、試料に吸光度変化を生起する。さらに、治療に使用される染料も吸光度変化を起こし、一次検量の組に含まれる。もしも含まれないと、試験した試料に応じて、光拡散粒子、光拡散物質、染料は予想される被検物質に誤差を生じさせる。例として、それは例示されるが限定されないが、メチレンブルーはメトヘモグロビン血症の緊急治療として使用される。メチレンブルーの吸収は図１０に示され、干渉材とみなされ、一次検量の組に入れられる。追加すると、光拡散物質は、例示されるが限定されない、イントラリピッド（Intralipid）は経静脈栄養を受けている患者からの血液試料中に存在し得る。再度だが、イントラリピッドのような光拡散物質干渉剤とみなされ、一次検量解法の組に含ませる。一次検量の組の中に干渉染料または他の干渉物質を含ませることは本発明の範囲内と考えるべきである。一次検量解法は、望むならば、例７でメチレンブルーについて示される様に、染料またはイントラリピッドに対して展開され得る。

多重線形回帰式は、それから、独立変数として特定の波長における吸光度の０次の導関数を有する線形結合と独立変数としての被検物質の濃度を展開させて遂行される。他の統計処理、例えば、一つの波長を使用する単純線形回帰式、部分最小自乗法（ＰＬＳ）および主成分解析（ＰＣＡ）がまた使用され得る。このようにして得られる式が一次検量解法である。

０次の吸光度（また生の吸光度と称される）またはどの次数の吸光度も、検量過程で使用され、２次導関数が好ましく、１次導関数が更に好ましい。一つの例外は、濁度の模擬であり（たとえばＩＬ）、そこでは吸光度の０次導関数と吸光度の１次導関数の両方が好ましい。脂質エマルジョンに関しては、例ＩＬで、再現性よく光を減衰する容器の試料で、吸光度の０次導関数が吸光度の１次導関数に対して好まれる、それは結果としての一次検量解法がより広い被検物質をカバーし、すなわち、予測値と脂質エマルジョン、例えばＩＬの実際の濃度の間の関係が線形である。たとえば、血液バック管の試料には、それはブラックライティングを含むかまたは含まないが、米国特許第６２６８９１０号明細書に開示されるように、吸光度の第１次導関数が好ましい。

一次検量解法を解くのに使用するソフトウエアは例示されるが限定されない、以下のものを含む：
― 吸光度の導関数をマクロで解くためにＭＳエクセル（商品名）が使用され得る；
― スタットビユー（商品名）が、“段階的多重線形回帰式”と称される方法により解法を生成するのに使用される。段階的線形回帰式では、全ての波長に対する吸光度の導関数測定がスタットビュー（商品名）プログラムについて表される；吸光度の導関数が検量フィットに所定レベルの有意差で貢献する波長のみが解法に選択される。

しかし、他のソフトウエアも使用できることを理解されたい。例示されるが限定されない、例えば単純線形回帰式、多重線形回帰式、および多変数データ解析など、どの統計処理も検量解法の準備に使用できることも理解されたい。

多変数データ解析の例は、いかなる意味でも限定されないが、原理的成分解析（ＰＣＡ）、原理的成分回帰式（ＰＣＲ）、部分最小自乗法（ＰＬＳ）、神経網および遺伝解法である。一次検量解法を解くのに使用されるソフトウエアツールは、例示されるが限定されない、次ぎのものである：
― マットラブ（商品名）は吸光度を平滑化し吸光度のある次数の導関数を得るためのプログラムを生成するのに使用される。
― ピロッテ（商品名）は、全ての波長の測定をするか、または吸収スペクトルの部分を選択してＰＬＳかまたはＰＣＡにより検量解法を生成するのに使用される。
― 検量解法は神経網および遺伝解法の技術を含むが、他の統計処理も本発明の範囲内と考えられる。
他のソフトウエアも使用し得ると考えられる。血液分析に関し、一次検量解法の多くの例本発明に組み入れられた文献に示される。一次検量解法は、単一の波長の項から、最も単純なケースでは、多くの波長を用いる多重項までを含み得る。一次検量解法は、単純線形回帰式、多重線形回帰式、多変数解析またはこれらの組み合わせの工程で得られることができる。多変数解析のいくつかの例は、ＰＬＳ、ＰＣＡ、遺伝解法、および神経網である。

吸光度のある次数の導関数が使用されることを理解されたい、そして一次検量解法のロバストネスは一次検量の組に干渉剤、それは実際の試料で遭遇すると期待される、を組み入れることに依存している。

第２の装置における試料中の被検物質濃度の測定は、平滑化、吸光度の１次と高次導関数の計算、吸光度の補間、多重化分散補正またはデータ変換などのデータ前処理を使用することを伴う。一次検量解法の解に先立ち、類似のデータ前処理もまた使用され得る。測光補正は、被検物質濃度の予測値の必要な精度に依存して第２装置でまた使用され得る。

一次検量解法の解のいかなる他の方法といかなるデータ変換も本願発明の範囲内である。データ変換の例は、例示されるが限定されない、被検物質濃度の対数または真数計算、フーリエ変換でありこれらは当業者に周知である（例えば、オスボーンＢ．Ｇ．，フェーン、Ｔ&ヒンドル，Ｐ．Ｈ．，“食餌、飲料分析への応用の実際的なＮＩＲ吸収スペクトル”、１９９３、Longmann Scientific & Techhnical発行、これは、ここに参照として組み入れられる）。

一次検量解法は、ロバストネスで変化することができ、これは一次検量材の構造に依存する。所定の被検物質に対して一次検量解法が一旦得られると、試料中の被検物質濃度（すなわち、予測値）は波長の標準の組の一つまたは一つ以上の波長における試料の吸光度を得て、被検物質に対する一次検量解法を波長の標準の組の一つまたは一つ以上の波長における吸光度のある次数の導関数へ適用することにより求められる。いかなる数の被検物質に対する一次検量解法が装置にインストールすることができ、そして被検物質の濃度を得るためにいくつかの吸光度データに適用される。さらに、一つ以上の一次検量解法が一つの被検物質に対してインストールされ得る。多重一次検量解法の使用が使用されて、より高いまたはより低い被検物質濃度となる分光装置の分析範囲を広げる。

一次検量解法の解

以下の例の大部分は血漿中の被検物質を示す。しかし、検量解法の解の類似の方法は本願発明の範囲内であると理解されたく、これは他の型の使用の被検物質に対するものであり、この試料は例示されるが限定されない、検量材、全血、血清、血漿、尿、滑液、リンパ液、***、糞便、乳製品、飲料、人体の部分で、限定されないが、指、爪、耳たぶ、または医薬剤などである。

試料中の一つまたは一つ以上の被検物質に対する一次検量解法は試行錯誤で解かれて、市販のＣＯ−酸素計で使用される吸光係数を使用しない。

ＣＯ−酸素計は、一つ以上の検量解法が一つ以上の被検物質（たとえば、Ｏｘｙ−Ｈｂ、Ｄｅｏｘｙ−Ｈｂ、Ｃａｒｂｏｘｙ−Ｈｂ、Ｍｅｔ−Ｈｂ）を予測するのに使用され、Ｏｘｙ−Ｈｂ、Ｄｅｏｘｙ−Ｈｂ、Ｃａｒｂｏｘｙ−Ｈｂ、Ｍｅｔ−Ｈｂのそれぞれに対するは長吸光係数が検量解法で使用される。ＣＯ−酸素計では、全−ＨｂはＨｂ種の濃度を合計して計算されるが、ＣＯ−酸素計は全−Ｈｂ検量材で再検量される。再検量の工程の間、ＣＯ−酸素計の検量解法の係数は変更される。いくつかのＣＯ−酸素計は、Ｓｕｌｆ−Ｈｂの測定ができ、例えば、ロッシュダイゴニシスから得られるＡＶＬＯＭＮＩである。より多くのＨｂ種を測定するほど、予測全−Ｈｂはより正確になり、特に不良ヘモグロビンの試料ではそうである。

不溶解ＲＢＣの光拡散効果のために本発明では波長特性吸光係数は使う必要はない。不溶解ＲＢＣの拡散効果は、もし試料が不溶解ＲＢＣを含むならば、本発明の検量解法に組み込まれる。しかし、本発明の検量解法はいくつかまたは全てのＲＢＣの溶解を受ける全血試料における被検物質の値を予測するのに使用されることを理解されたい。この場合、溶解ＲＢＣからなる検量の組を使用して一つまたは一つ以上の適当な検量解法が解かれる。それ故、本願発明はＲＢＣを溶解せずに、そして試料に存在し得る種々のＨｂ種の波長特定モル吸光係数を使用することなしに、全−Ｈｂを求める方法を提供する。

本発明の一つの面では、Ｄｅｏｘｙ−Ｈｂは試料を大気酸素に曝すことによりＯｘｙ−Ｈｂに変換され、それによりＯｘｙ−ＨｂとＤｅｏｘｙ−Ｈｂを区別する必要がない。既知の”Ｏｘｙ−ＨｂプラスＤｅｏｘｙ−Ｈｂ”濃度の試料は、ここで”Ｏｘｙ−ＨｂプラスＤｅｏｘｙ−Ｈｂ”の割合は全−Ｈｂの約９５％である、”Ｏｘｙ−ＨｂプラスＤｅｏｘｙ−Ｈｂ”濃度と同じ数値の全−Ｈｂ濃度を有すると考えられる。同様に、約９５％”Ｏｘｙ−ＨｂプラスＤｅｏｘｙ−Ｈｂ”を含む既知の全−Ｈｂ濃度の試料は全−Ｈｂ濃度と同じ数値の”Ｏｘｙ−ＨｂプラスＤｅｏｘｙ−Ｈｂ”濃度を有すると考えられる。

試料が大気酸素に暴露されるとＤｅｏｘｙ−Ｈｂは急速に酸素を吸収してＯｘｙ−Ｈｂへ変換されるので、用語“Ｏｘｙ−Ｈｂ”と”Ｏｘｙ−ＨｂプラスＤｅｏｘｙ−Ｈｂ”は互換性がある。それ故、参照値は、Ｏｘｙ−Ｈｂまたは”Ｏｘｙ−ＨｂプラスＤｅｏｘｙ−Ｈｂ”と標識されていても、Ｏｘｙ−Ｈｂまたは”Ｏｘｙ−ＨｂプラスＤｅｏｘｙ−Ｈｂ”のいずれかの測定となることを理解されたい。

ヘモグロビンに対する一次検量解法を用意するために、目視では干渉剤がない６０個の血清試料が使用まで冷蔵または冷凍保存された。十分な数がロバストな解法（複数可）を与えるに使用される限りもっと多くのまたはもっと少ない試料が使用され得る。ヘモグロビン（Ｈｂ）、イントラリピッド（ＩＬ）、ビリルビン（ＢＲ）およびビリベルディン（ＢＶ）が通常の血清に加えられて、それぞれ最終的濃度、０−６．１ｇ／Ｌ、０−５．１ｇ／Ｌ、０−４２．７ｇ／Ｌ、および０―４．４ｇ／Ｌが得られた。貯蔵Ｈｂは、血液試料から血漿（全ての干渉剤を含まない）を置き換えて、水で容量を倍にし、３回凍結・解凍のサイクルを繰り返して細胞を溶解させて用意した。各サイクルの間、血液は冷凍庫で４５―６０分間放置され、その後取り出されて室温で３０―４５分間揺らし台に置かれた。

１００００ｘｇで１０分間遠心分離をすることによりＲＢＣ残渣と未溶解ＲＢＣを除いた後、溶解物のＨｂ含量はＯｘｙ−Ｈｂを測定する分光方法で測定され、その方法は、ティチェ（臨床化学のティチェ教科書、第３版、１９９９、第１６７４−１６７６頁）に記載される。Ｈｂの信頼される測定はどれも使用され得る。典型的なヘモグロビン溶解物は約１００ｇ／ＬＨｂを含む。ＣＯ−酸素計はＨｂの９５%以上がＯｘｙ−Ｈｂ状態にあることを示唆する。貯蔵ＢＶは、ビリベルディン・２塩化水素（シグマから得られる）を初めに、５０%メタノール−５０%水に溶解させ、そして更に燐酸塩緩衝塩水（ＰＢＳ）で希釈することにより用意された。ＴＲＡＶＡＭＵＬＳＩＯＮ（商品名）（クリテック−ネッスル＆バクスターから好ましく入手される）として知られる貯蔵ＩＬは、１０%の濃度を有する。貯蔵ＢＲは、ジタロ―ビリルビン（アメリカ、ユタ州、ローガンのポルフィリンプロダク社）の干渉剤を含まない血清に溶解させて５００ｍｇ／Ｌ濃度とした。吸収スペクトルデータは異なるポリプロピレン投与チップを使用して６０試料について記録された。６０試料のうち、奇数番は検量の組で使用され、偶数番は確認の組として使用される。これらの一次検量の組はＭｅｔ−ＨｂまたはＭＢを含まない、それ故、これらの物質はＨｂ測定における不正確さに寄与する。よりロバストな一次検量解法を得るためにＭｅｔ−ＨｂとＭＢは一次検量の組の吸収変化に含められる。ＲＢＣは溶解されるが、ＥＭＲの散乱は、イントラリピッド（商品名、ＩＬ）の形でキロミクロン粒子を試料に加えることにより再導入された。

一次検量解法の例示の要約は、例示されるがいかなる意味でも限定されない、ここで説明された方法を使用して表１に説明される。異なる物質、または試料容器等を使用して、そしてここに説明された方法を使用して、他の一次検量解法が容易に得られることを理解されたい。

表１：例１から７で示される一次検量解法に使用される波長、被検物質に従って配列されている。

また、表１の最高と最低の波長は、５０４ｎｍと１０３８ｎｍであるが、しかし約３００ｎｍから約２５００ｎｍの範囲内の検量波長または、その範囲の波長が本発明の範囲内であることを理解されたい。

例１：Ｈｂに対する検量解法

本発明で説明される方法を使用するＨｂに対する一次検量解法の例が以下で与えられる。解法は、それらが得られる条件が異なると、異なることを理解されたい。以下の例は従属変数として“ｇ／ＬＨｂ”を示すが、従属変数はＨｂに関係する溶血の指標、たとえば、全−Ｈｂ、Ｏｘｙ−Ｈｂおよび”全−ＨｂマイナスＭｅｔ−Ｈｂ”であることを理解されたい。溶血の真の指標は溶血の指標を測定するのに使用される参照方法と一次検量の組に含まれる物質の両方に依存する。本発明の他の面では、溶血の指標の修正をする方法が記載され、修正が溶血の指標に行なわれるか、または溶血の指標の値がフラッグ付けされて潜在的な誤差を示すかは、溶血の指標の必要な精度に依存する。全血のＨｂの測定は本発明の範囲内であると考えられることを理解されたい。

式１（使い捨てポリプロピレン投与チップを使用して得られる）
ｇ／Ｌ＝―１６．８（１ｓｔＤＡ５８４）＋７９．４７（１ｓｔＤＡ５９９）−６０．９５（１ｓｔＤＡ６１７）＋２７
ここで、（１ｓｔＤＡ）は特定された波長でナノメートル表記の波長での測定による吸光度の１次導関数である。

式２（１２ｍｍポリプロピレン管を使用して得られる）
ｇ／Ｌ＝１１３．２７（１ｓｔＤＡ６００）―１８２．９４（１ｓｔＤＡ６１８）−０．１３
ここで、（１ｓｔＤＡ）は特定された波長でナノメートル表記の波長での測定による吸光度の１次導関数である。

Ｈｂの一次検量解法の他の例は、米国特許第６２６８９１０号明細書、米国特許第５８４６４９２号明細書、国際公開第９８／３９６３４号明細書および国際公開第９７／４７９７２号明細書に記載される。

式３（血液バック管を使用して得られる）
ｇ／Ｌ＝４５．６８（１ｓｔＤＡ５９１）―４７．４８（１ｓｔＤＡ６５３）−０．４２
ここで、（１ｓｔＤＡ）は特定された波長でナノメートル表記の波長での測定による吸光度の１次導関数である。

式４（使い捨てプラスチック投与チップを使用して得られる）
ｇ／Ｌ＝１５．８９（１ｓｔＤＡ６００）―１５．８８（１ｓｔＤＡ６１８）−０．２１
ここで、（１ｓｔＤＡ）は特定された波長でナノメートル表記の波長での測定による吸光度の１次導関数である。

式５（使い捨てプラスチック投与チップを使用して得られる）
ｇ／Ｌ＝３０．７２（１ｓｔＤＡ５５８）―１７．４０（１ｓｔＤＡ５７０）＋１７１．１４（１ｓｔＤＡ７３０）−０．７２
ここで、（１ｓｔＤＡ）は特定された波長でナノメートル表記の波長での測定による吸光度の１次導関数である。

式６（半透明ピペットチップを使用して得られる）
（ｇ／Ｌ）Ｈｂ＝３０．１４（１ｓｔＤＡ５９１）―２７．９８（６１０）
ここで、（１ｓｔＤＡ）は特定された波長でナノメートル表記の波長での測定による吸光度の１次導関数である。

例２：Ｈｂベースの代用血液に対する検量解法

次ぎはＨｂベースの代用血液の一次検量解法の例であり、国際公開第９８／３９６３４号明細書に記載される。

式７（使い捨てポリプロピレン投与チップを使用して得られる）
ｇ／ＬＨｂベースの代用血液＝２３．９７（１ｓｔＤＡ５４１）―７６．０１（１ｓｔＤＡ５５８）＋１３０．８４（１ｓｔＤＡ６００）−１１３．６１（１ｓｔＤＡ６１６）＋０．３０
ここで、（１ｓｔＤＡ）は特定された波長でナノメートル表記の波長での測定による吸光度の１次導関数である。

例３：ビリベルディンの検量解法

次のビリベルディンの一次検量解法の例は、米国特許第６２６８９１０号明細書、米国特許第５８４６４９２号明細書および国際公開第９７／４７９７２号明細書に記載される。

式８（血液バッグ管を使用して得られる）
ｍｇ／ＬＢＶ＝−４５．４０（１ｓｔＤＡ６４９）＋３２３．１５（１ｓｔＤＡ７３１）−４９３．７９（１ｓｔＤＡ９０７）−１．１４
ここで、（１ｓｔＤＡ）は特定された波長でナノメートル表記の波長での測定による吸光度の１次導関数である。

式９（使い捨てプラスチック投与チップを使用して得られる）
ｍｇ／ＬＢＶ＝９８．０７（１ｓｔＤＡ７２４）−１２２．７３（１ｓｔＤＡ８０３nm）＋０．０７
ここで、（１ｓｔＤＡ）は特定された波長でナノメートル表記の波長での測定による吸光度の１次導関数である。

式１０（半透明ピペットチップを使用して得られる）
ｍｇ／ＬＢＶ＝１６０．２９（１ｓｔＤＡ７１８）−２０６．１５（１ｓｔＤＡ７８１）＋１．４２
ここで、（１ｓｔＤＡ）は特定された波長でナノメートル表記の波長での測定による吸光度の１次導関数である。
例４：ビリルビンの検量解法

Ｈｂ＞４ｇ／ＬまたはＩＬ＜４ｇ／Ｌのいずれかのため、吸光度は領域約５２４ｎｍ、ＢＲ検量の第１波長である装置の限界に接近するために、Ｈｂ検量のために使用される試料の組は、典型的にはＢＲ検量に使用されない。代わりに、６０個の試料の別個の組が用意され、試験された。当業者は容易に理解するように、一次検量解法に使用される試料の組は、血清または血漿のような実際の患者の試料で遭遇する大部分の変化を含むに十分な大きさであるべきである。試料には予めＨｂ、ＩＬ、ＢＲおよびＢＶを通常の血清に加えて、それぞれ最終濃度を、０−２．６ｇ／Ｌ、０−３．６ｇ／Ｌ、０−３７ｍｇ／Ｌ、および０−４．４ｍｇ／Ｌとした。異なるポリプロピレン製投与チップを使用して吸収スペクトルデータは６０個の試料について記録された。６０試料のうち、奇数番号は検量の組に使用され、そして偶数番号は確認のために使用された。貯蔵緩衝材は、Ｈｂについて上で述べたように準備され、そしてＢＲ濃度は係数１．２３により調整された。係数１．２３は、実際の黄疸にかかった血清と血漿試料を使用して確認の組から得られた回帰線の勾配から以前に求めた。Ｍｅｔ−ＨｂとＭＢはＢＲ予測を妨害するとは期待されないが、しかし、もしもこれらが一次検量の組の吸光度変化に含まれるならば、これらはよりロバストな、一次検量解法を創出する助けは、なし得る。

式１１（使い捨てポリプロピレン投与チップを使用して得られる）
ｍｇ／ＬＢＲ＝２９３．１（１ｓｔＤＡ５２４）＋３２７．８（１ｓｔＤＡ５８７）−４５１．７（１ｓｔＤＡ６０２）−７．５
ここで、（１ｓｔＤＡ）は特定された波長でナノメートル表記の波長での測定による吸光度の１次導関数である。

式１２（１２ｍｍ使い捨てポリプロピレン管を使用して得られる）
ｍｇ／ＬＢＲ＝４０６．０４（１ｓｔＤＡ５３４）＋１８３．９４（１ｓｔＤＡ５８６）−２．２７
ここで、（１ｓｔＤＡ）は特定された波長でナノメートル表記の波長での測定による吸光度の１次導関数である。

次のビリルビンの一次検量解法の例は、米国特許第６２６８９１０号明細書、米国特許第５８４６４９２号明細書および国際公開第９７／４７９７２号明細書に記載される。

式１３（血液バッグ管を使用して得られる）
ｍｇ／ＬＢＲ＝−４３．０３（１ｓｔＤＡ５０４）＋２５２．１１（１ｓｔＤＡ５１８）＋２４０．０３（１ｓｔＤＡ５７７）−２．８９
ここで、（１ｓｔＤＡ）は特定された波長でナノメートル表記の波長での測定による吸光度の１次導関数である。

式１４（使い捨てプラスチック投与チップを使用して得られる）
ｍｇ／ＬＢＲ＝−２４．８８（１ｓｔＤＡ４９５）＋２０１．６１（１ｓｔＤＡ５１２）＋４４．９８（１ｓｔＤＡ５７８）−６．４８
ここで、（１ｓｔＤＡ）は特定された波長でナノメートル表記の波長での測定による吸光度の１次導関数である。

式１５（半透明ピペットチップを使用して得られる）
ｍｇ／ＬＢＲ＝１４２．０９（１ｓｔＤＡ５１１）＋８９．９（１ｓｔＤＡ５５４）−４．４７
ここで、（１ｓｔＤＡ）は特定された波長でナノメートル表記の波長での測定による吸光度の１次導関数である。

例５；濁度の検量解法

血清と血清の混濁は主に脂肪粒子、特にキロミクロンの存在による。イントラリピッド（商品名）（ＩＬ）は自然発生のキロミクロンを模擬する脂質エマルジョンであり、それ故、血清や血漿中の混濁を模擬するのに好ましく使用される。

Ｈｂの貯蔵溶液は、未溶解ＲＢＣとＲＢＣ断片により有意な光拡散を示すので（脂質粒子のように）、ＨｂとＢＲ検量に使用した試料はＩＬ検量には好ましくは使用しない。溶血物の遠心分離は未溶解ＲＢＣとＲＢＣ断片の全てを除去することができなかった。

４０個のＰＢＳ（リン酸塩緩衝塩水）の試料に、１０％イントラリピッド（商品名）を加えて、濃度０−２０ｇ／Ｌを得た。吸収スペクトルのデータは、異なるポリプロピレン製投与チップを使用して４０試料について記録した。４０試料のうち、奇数番号は検量の組に使用され、偶数番号は確認の組に使用された。ＩＬのために使用される適当な波長は、約７００ｎｍから約１１００ｎｍの範囲である。

濁度は、ＩＬ濃度に相当する項で測定される。

式１６（使い捨てポリプロピレン投与チップを使用して得られる）
ｌｎ（ｇ／ＬＩＬ）＝１．８６７（Ａ７００）−０．４４７（Ａ７００）^２＋０．０４１（Ａ７００）^３−１．３３
ここで、（Ａ）は特定された波長でのナノメートル表記の生の吸光度である。

式１７（１２ｍｍ使い捨てポリプロピレン管を使用して得られる）
ｇ／ＬＩＬ＝２．７２（Ａ８７２）−３．８８（Ａ８７２）^２＋１．７０（Ａ８７２）^３−１．３３
ここで、（Ａ）は特定された波長でのナノメートル表記の生の吸光度である。

次のＩＬの一次検量解法の例は、米国特許第６２６８９１０号明細書、米国特許第５８４６４９２号明細書および国際公開第９７／４７９７２号明細書に記載される。

式１８（血液バッグ管を使用して得られる）
ｇ／ＬＩＬ＝４３２．４２（１ｓｔＤＡ９８８）＋４０．４０（１ｓｔＤＡ１０３８）＋０．０４
ここで、（１ｓｔＤＡ）は特定された波長でナノメートル表記の波長での測定による吸光度の１次導関数である。

式１９（血液バッグ管を使用して得られる）
ｇ／ＬＢＲ＝３０５．７８（１ｓｔＤＡ８７４）＋１．１２
ここで、（１ｓｔＤＡ）は特定された波長でナノメートル表記の波長での測定による吸光度の１次導関数である。

式２０（使い捨てプラスチックチップを使用して得られる）
ｇ／ＬＩＬ＝２５２．１６（１ｓｔＤＡ９７４）＋０．２４
ここで、（１ｓｔＤＡ）は特定された波長でナノメートル表記の波長での測定による吸光度の１次導関数である。

式２１（半透明ピペットチップを使用して得られる）
ｇ／ＬＩＬ＝２９６．０１（Ａ９００）−０．０４
ここで、ここで、（Ａ）は特定された波長でのナノメートル表記の生の吸光度である。
例６：Ｍｅｔ−ヘモグロビンの検量解法

約９５％Ｏｘｙ−Ｈｂ、Ｍｅｔ−Ｈｂ、ＭＢ、ＢＶおよびＩＬを含む新鮮な溶血物からなる２９個の試料を使用して、テフロン（商品名）の試料ホルダーを使用する装置が検量された。ＢＲはＭｅｔ−ＨｂまたはＭＢのいずれかを検量するのに使用される波長では光を吸収しないので、ＢＲは試料に添加されなかった。Ｍｅｔ−Ｈｂはシグマ社からリンパ液化した形で購入され、リン酸塩緩衝塩水に再度変換された。上で述べたように、ここに記載される一次検量解法は、一次検量解法を解くのに伴う例示の作業である。

式２２（テフロン製の試料ホルダーを使用して得られる）
ｇ／ＬＭｅｔ−Ｈｂ＝６９．８８（１ｓｔＤＡ６４５）＋５３．１５（１ｓｔＤＡ６６９）−１．１７
ここで、（１ｓｔＤＡ）は特定された波長でナノメートル表記の波長での測定による吸光度の１次導関数である。

例７：メチレンブルーに対する検量解法

式２３（テフロン製の試料ホルダーを使用して得られる）
ｍｇ／ＬＭＢ＝１６２．５３（１ｓｔＤＡ７０２）−１１２．５８（１ｓｔＤＡ７５９）−１．１７
ここで、（１ｓｔＤＡ）は特定された波長でナノメートル表記の波長での測定による吸光度の１次導関数である。

次のＭＢの一次検量解法の例は、米国特許第６２６８９１０号明細書に記載される。

式２４（血液バッグ管を使用して得られる）
ｍｇ／ＬＭＢ＝５６．０４（１ｓｔＤＡ６７７）＋２６７．２１（１ｓｔＤＡ９５３）＋４．４９
ここで、（１ｓｔＤＡ）は特定された波長でナノメートル表記の波長での測定による吸光度の１次導関数である。

ここに参照される一次検量解法は、段階的な多重線形回帰式の過程で得られる非限定の例示である。一次検量解法は、波長の標準の組の一つまたは一つ以上の波長における検量された試料の吸光度のある次数の導関数、および単純線形回帰式、多重線形回帰および多変数解析からなる群から選ばれる統計処理を使用して解かれ、ここで、多変数解析は部分最小自乗法、主成分解析、神経網、遺伝解法なる群から選ばれる。たとえば、ＩＬのために示されるように（例５、式１８−２０）如何なる次数の吸光度の導関数も使用し得ることを理解されたい。一次検量解法のロバストネスは一次検量波長の近傍で光を吸収するか拡散する一次検量の組における物質の混入に依存する。さらに、全−ＨｂとＭｅｔ−Ｈｂに対する類似の検量解法は全血の全−ＨｂおよびＭｅｔ−Ｈｂのために解かれ、それは上で述べたと同様の方法を使用し、血漿中の検量解法を解くことによる。

一次検量解法はまた以下のようにしても得られ得る：吸収スペクトルが複数の試料（一次検量の組）で得られ、それは一次検量解法が解かれる所定の被検物質の濃度範囲をカバーする。一次検量の組の試料は試料において期待される全ての吸光度変化を含み、ここで試料変化は一次検量解法に組み込まれる。多重線形回帰式は、ついで、独立変数としての特定波長における吸光度のある次数の導関数および従属変数としての被検物質の濃度を有する線形結合を解くために操作される。たとえば、ただ一つの波長を用いる単純線形回帰式、部分最小自乗法（ＰＬＳ）、主成分解析、神経網、遺伝解析などの他の統計処理が使用され得る。このようにして得られた式が一次検量解法である。

全−Ｈｂの場合は、独立変数の全−Ｈｂは全−Ｈｂを正確に測定し（すなわち、全てのＨｂ種が計上される）、そして一次検量の組は好ましくはＨｂ濃度範囲、すなわち、ゼロｇ／Ｌから分析範囲または動的範囲の上限値まで、たとえば、約０％から約１００％の全−Ｈｂまでの範囲、またはそのなかのいずれかの範囲を含む方法により測定されるべきである。追加すれば、試料のＨｂは好ましくは全てのＨｂ種からなり、緩衝材も同様であるが、例示であり、如何なる意味でも限定されず、一次検量の組の中のビリルビン、ビリベルディン、およびメチレンブルーなどである。一次検量の組のいずれの試料も全てのＨｂ種または全ての干渉物質を含む必要はない。各Ｈｂ種の値の範囲は全−Ｈｂの０％から１００％にわたることができる。本発明の一つの面では、丁度ここで述べた一次検量の組を使用して単一の検量解法が全−Ｈｂに対して解かれる。

本発明の他の面では、丁度記載した一次検量の組の試料は、大気酸素に暴露され、Ｄｅｏｘｙ−ＨｂはＯｘｙ−Ｈｂへ変化し、大部分のＤｅｏｘｙ−Ｈｂ種を取り除く。このような条件下で，パーセントＯｘｙ−Ｈｂと、パーセント ”Ｏｘｙ−ＨｂプラスＤｅｏｘｙ−Ｈｂ”は、略等しく、そして用語Ｏｘｙ−Ｈｂと”Ｏｘｙ−ＨｂプラスＤｅｏｘｙ−Ｈｂ”は同じＨｂ種を参照する。それ故、一次検量解法はＯｘｙ−Ｈｂと”Ｏｘｙ−ＨｂプラスＤｅｏｘｙ−Ｈｂ”について解く。

一次検量の組の試料は好ましくは自然のものであるが（手を加えていない）、いくつかの被検物質は、所要の濃度を得るために添加される必要がある。Ｈｂ種の場合では、高濃度なＭｅｔ−Ｈｂ、Ｃａｒｂｏｘｙ−ＨｂおよびＳｕｌｆ−Ｈｂの試料を得るのは困難である。Ｍｅｔ−Ｈｂ、Ｃａｒｂｏｘｙ−ＨｂおよびＳｕｌｆ−Ｈｂの一つまたはそれ以上の濃度を高めるのが必要なときは、化学処理をすることができ、たとえば、例示されるが限定されない：
− 亜硝酸ナトリウム処理でＨｂをＭｅｔ−Ｈｂへ変換させる；
− 一酸化炭素処理でＨｂをＣａｒｂｏｘｙ−Ｈｂへ変換させる；および
− 硫化水素処理でＨｂをＳｕｌｆ−Ｈｂへ変換させる。
上記の一つまたはそれ以上の処理の後、一つまたはそれ以上の全−Ｈｂ、Ｏｘｙ−Ｈｂ、Ｄｅｏｘｙ−Ｈｂ、Ｍｅｔ−Ｈｂ、Ｃａｒｂｏｘｙ−ＨｂおよびＳｕｌｆ−ＨｂはＣＯ−酸素計で測定される（例えば、如何なる意味でも限定されないが、ロシェダイアグノシシ社から入手されるＡＶＬＯＭＮＩ）。
処理の前後で、試料、好ましくは同じ提供者からのものであり、は適宜の割合で混合され、被検物質の所望の濃度範囲が得られ、これにはＲＢＣ濃度の範囲が含まれる。好ましくは、パックされたＲＢＣと血漿が地方の病院の血液銀行から得られ、ＲＢＣと血漿は異なる割合で混合されて所望の全−Ｈｂ濃度範囲が得られる。適合性あるＲＢＣと血漿を使用することにより（血液型に関して）異なる提供者からのＲＢＣと血漿でも使用され得る。

試料（検量の組）は、種々の量で、一つまたはそれ以上の干渉材、例えば、例示されるが如何なる意味でも限定されない、ビリルビン、ビリベルディンおよびメチレンブルーを添加され得る。干渉材の添加はよりロバストな（変動を受けない）一次検量解法の解を与える。一次検量の組はまた、Ｄｅｏｘｙ−Ｈｂの濃度を最小化するために大気酸素に曝される。未知の被検物質の予測に使用される将来の試料がまた大気酸素に暴露されるものであるならば、これは好ましいものである。たとえば、全−Ｈｂの測定方法では、好ましい試料は針で刺した毛細管全血試料であり、これはスペクトル測定に先立ち大気酸素に曝されている。Ｈｂ種の濃度同様、全−Ｈｂは、またはそれぞれのＨｂ種（Ｄｅｏｘｙ−Ｈｂ種を除く）の形にある全−Ｈｂの割合は、ここに説明した方法を使用して報告され得る。Ｄｅｏｘｙ−Ｈｂの濃度は”Ｏｘｙ−ＨｂプラスＤｅｏｘｙ−Ｈｂ”の測定に含まれる。

全ての引用は、ここに参照として組み込まれる。

本発明はひとつまたはそれ以上の具体的態様で記述された。しかし、請求の範囲で規定される発明の範囲から逸脱することなしに多くの変形、変更がなされ得ることは当業者に明らかである。

ｘ−軸に６００−１０００ｎｍの範囲の波長とｙ軸に吸光係数の対数をプロットして４種の異なるヘモグロビンの吸収スペクトルを図示する。ｘ−軸に５００−７００ｎｍの波長範囲と、ｙ軸に各種の同一濃度における吸光度（吸光係数に相当する）をプロットして４種の異なるヘモグロビンの吸収スペクトルを図示する。同じ血だまりからの全Ｈｂの異なる濃度の吸収スペクトルを示す。全Ｈｂは部分的酸化されてＭｅｔ−Ｈｂとすることができ、それも図示される。分光装置における試料投入口と試料タブの斜視図を示し、本発明に従い使用される試料タブの種々の態様を示す。反射モードで使用される試料タブの下には反射鏡が配置される。投入口に挿入された試料タブの側面図であり、本発明に従い使用される試料タブの種々の態様を示す。反射モードで使用される試料タブの下には反射鏡が配置される。試料タブと投入口の斜視図を示し、本発明に従い使用される試料タブの種々の態様を示す。試料タブは、透過モードでの使用が示される。試料投入口に挿入された試料タブの側面図を示し、本発明に従い使用される試料タブの種々の態様を示す。試料タブは、透過モードでの使用が示される。図５に示される本発明の装置のより詳細を示し、試料投入口に挿入された試料タブの側面図を示す。図５に示される本発明の装置のより詳細を示し、試料投入口に挿入された試料タブの正面図を示す。本発明で使用する試料タブの種々の代替態様を示し、試料タブの斜視図を示す。本発明で使用する試料タブの種々の代替態様を示し、試料タブの側面図を示す。好ましい態様で使用される分光計６１４を示す（部分分解図による）。簡単のために、二つのホトダイオードだけが示される。ｘ−軸に４８０−６４０ｎｍの範囲の波長とｙ軸に吸光係数をプロットして５種の異なるヘモグロビンの吸収スペクトルを図示する。メチレンブルーの吸収スペクトルを示す。

Claims

試料の全−Ｈｂを測定する方法であって、以下からなり、
ｉ）一つまたは一つ以上の第１または第２の分光装置を使用して試料の吸光度を収集し、該装置はＯｘｙ−Ｈｂ、”Ｏｘｙ−ＨｂプラスＤｅｏｘｙ−Ｈｂ”、または”全−ＨｂマイナスＭｅｔ−Ｈｂ”の一つに対する第１の一次検量解法およびＭｅｔ−Ｈｂ、Ｃａｒｂｏｘｙ−ＨｂまたはＳｕｌｆ−Ｈｂの一つまたは一つ以上に対する一つまたは一つ以上の第２の一次検量解法を備えるか、または第１の一次検量解法の項と一つまたは一つ以上の第２の一次検量解法の項を合算することにより得られる第３の一次検量解法を備え；そして
ｉｉ）次のいずれかを予測し：
ａ）波長の標準の組の一つまたはそれ以上の波長における試料の吸光度のある次数の導関数に第１の一次検量解法を適用することにより試料中のＯｘｙ−Ｈｂ、”Ｏｘｙ−ＨｂプラスＤｅｏｘｙ−Ｈｂ”または”全−ＨｂマイナスＭｅｔ−Ｈｂ”の一つに対する第１の値を予測し、そして標準の組の波長の一つまたは一つ以上の波長における吸光度のある次数の導関数に第２の一次検量解法を適用することによりＭｅｔ−Ｈｂ、Ｃａｒｂｏｘｙ−ＨｂまたはＳｕｌｆ−Ｈｂの一つまたは一つ以上に対する第２の値を予測し、そして第１の値と一つまたは一つ以上の第２の値を足して全−Ｈｂの測定をなす；または
ｂ）波長の標準の組の一つまたは一つ以上の波長における試料の吸光度のある次数の導関数に適用される第３の一次検量解法を使用して全−Ｈｂを予測する；
または
ｉｉｉ）全−Ｈｂに対する一次検量解法を備える一つまたは一つ以上の第１または第２の分光装置を使用して試料の吸光度測定を行い、試料は大気酸素に暴露されたものであり；そして
ｉｖ）一次検量解法を、波長の標準の組の一つまたは一つ以上の波長における吸光度のある次数の導関数に適用することにより全−Ｈｂに対する値を予測して、全−Ｈｂの測定をなす。
収集の段階（段階ｉ））において、波長の標準の組の一つまたは一つ以上の波長における吸光度のある次数の導関数を使用して第１の一次検量解法と一つまたは一つ以上の第２の一次検量解法を生成し、Ｏｘｙ−Ｈｂ、”Ｏｘｙ−ＨｂプラスＤｅｏｘｙ−Ｈｂ”、”全−ＨｂマイナスＭｅｔ−Ｈｂ”、Ｍｅｔ−Ｈｂ、Ｃａｒｂｏｘｙ−Ｈｂ、Ｓｕｌｆ−Ｈｂの一つまたは一つ以上に対する既知の参照値を有する一つまたは一つ以上の一次検量の組を使用する一つまたは一つ以上の装置から得られ、波長の標準の組の一つまたは一つ以上の波長における吸光度のある次数の導関数、既知の参照値および統計処理を使用して第１の一次検量解法はＯｘｙ−Ｈｂ−、”Ｏｘｙ−ＨｂプラスＤｅｏｘｙ−Ｈｂ”または”全−ＨｂマイナスＭｅｔ−Ｈｂ”の一つに対して生成され、そして、波長の標準の組の一つまたは一つ以上の波長の吸光度のある次数の導関数、既知の参照値および統計処理を使用して一つまたは一つ以上の第２の一次検量解法はＭｅｔ−Ｈｂ，Ｃａｒｂｏｘｙ−ＨｂまたはＳｕｌｆ−Ｈｂに対して生成されることを特徴とする請求項１の方法。
第１の一次検量解法と一つまたは一つ以上の第２の一次検量解法、または第３の一次検量解法が第２の装置にインストールされて、連動し、収集の段階（段階ｉ）では、試料の吸光度は第２の装置で測定されて吸光度測定がされることを特徴とする請求項１の方法。
一次検量の組とは区別される独自の検量材の小さな組を使用して第１の一次検量解法と一つまたは一つ以上の第２の一次検量解法がアップグレードされる請求項３の方法。
一つまたは一つ以上の装置が第２の装置であり、データ前処理の段階が、収集段階（段階ｉ）に続き、そして予測段階（段階ｉｉ）に先行するか、またはデータ収集段階（段階ｉｉｉ）に続いて、そして予測段階（ｉｖ）の前である請求項１の方法。
データ前処理が、補間吸光度計算、吸光度平滑化、吸光度の１次または高次導関数の計算、乗法分散補正、データ変換、測光補正およびこれらの組合せからなる群から選ばれる処理である請求項５に記載の方法。
ｉ）もしも試料中のＯｘｙ−Ｈｂの濃度が”Ｏｘｙ−ＨｂプラスＤｅｏｘｙ−Ｈｂ”の濃度の９５%を占めるならばＯｘｙ−Ｈｂ、”Ｏｘｙ−ＨｂプラスＤｅｏｘｙ−Ｈｂ”および”全−ＨｂマイナスＭｅｔ−Ｈｂ”の濃度は均等であるとみなされる；または
ｉｉ）もしも試料中の”Ｏｘｙ−ＨｂプラスＤｅｏｘｙ−Ｈｂ”の濃度または”全−ＨｂマイナスＭｅｔ−Ｈｂ”の濃度が９５％Ｏｘｙ−Ｈｂからなるならば、Ｏｘｙ−Ｈｂ、”Ｏｘｙ−ＨｂプラスＤｅｏｘｙ−Ｈｂ”および”全−ＨｂマイナスＭｅｔ−Ｈｂ”の濃度は均等であるとみなされることを特徴とする請求項２の方法。
波長の標準の組が約３００ｎｍから約２５００ｎｍから選択される請求項２記載の方法。
一つまたは一つ以上の検量の組の試料がＯｘｙ−Ｈｂ、”Ｏｘｙ−ＨｂプラスＤｅｏｘｙ−Ｈｂ”、”全−ＨｂマイナスＭｅｔ−Ｈｂ”、Ｃａｒｂｏｘｙ−Ｈｂ、Ｍｅｔ−ＨｂおよびＳｕｌｆ−Ｈｂの一つまたは一つ以上の０％から１００％またはこの中のいずれかの値からなることを特徴とする請求項２の方法。
統計処理が、単純線形回帰式、多重線形回帰式および多変数解析からなる群から選ばれる請求項２の方法。
多変数解析が、部分最小自乗法、主成分解析法、神経網、および遺伝解法からなる群から選ばれる請求項１０の方法。
試料が、全血、血清、血漿、尿、滑液、リンパ液、唾液、糞便または髄液の一つである請求項１の方法。
全−Ｈｂが溶血の指標として使用される請求項１２の方法。
吸光度測定に先立ち、試料が大気酸素に暴露される請求項１の方法。
全血中に存在する赤血球が吸光度測定に先立ち溶解されない請求項１２の方法。
全−Ｈｂは内因性Ｈｂと外因性Ｈｂの組合せであり、そして外因性Ｈｂは一つまたは一つ以上のＨｂベースの代用血液であり、Ｍｅｔ−Ｈｂは内因性Ｍｅｔ−Ｈｂと外因性Ｍｅｔ−Ｈｂの組合せであり、外因性Ｍｅｔ−Ｈｂは一つまたは一つ以上のＨｂベースの代用血液のＭｅｔ−Ｈｂ形である請求項１の方法。
Ｍｅｔ−Ｈｂの量またはＭｅｔ−Ｈｂの形にある全−Ｈｂの割合を測定して、試料中の一つまたは一つ以上のＨｂベースの代用血液の減成または減成の反対を監視する方法を与える請求項１７の方法。
Ｍｅｔ−Ｈｂ形にある全−Ｈｂの割合が、さらに同じ患者から時間を経過して逐次に採取される一つ以上の試料で測定され、そしてＭｅｔ−Ｈｂの量の増加またはＭｅｔ−Ｈｂ形にある全−Ｈｂの割合が代用血液の減成の指標であり、そしてＭｅｔ−Ｈｂの量の減少またはＭｅｔ−Ｈｂの形にある全−Ｈｂの割合が代用血液の減成の反対の指標である請求項１７の方法。
波長の標準の組が約３００ｎｍから約２５００ｎｍの範囲またはその範囲のいずれかの部分から選択される請求項１７の方法。
獲得の段階（段階ｉｉｉ））で、既知の参照値を有する一次検量の組および統計処理を使用する一つまたは一つ以上の第１の装置から得られる波長の標準の組の一つまたは一つ以上の波長における吸光度のある次数の導関数を使用して全−Ｈｂに対する一次検量解法が生成され、ここで、検量の組の各試料は分光測定の前に大気酸素に暴露され、そして既知の参照値がＯｘｙ−Ｈｂ、Ｄｅｏｘｙ−Ｈｂ、Ｍｅｔ−Ｈｂ、Ｃａｒｂｏｘｙ−ＨｂおよびＳｕｌｆ−Ｈｂの一つまたは一つ以上約０％から約１００％からの値、またはこの範囲のいずれかの値である請求項１の方法。
一次検量の組が更に一つまたは一つ以上の干渉物質のゼロの値またはゼロを超える値を含む一つまたは一つ以上の試料を含む請求項２０の方法。
一次検量解法が第２の装置にインストールされて連動し、獲得の段階（段階ｉｉｉ））では、試料の吸光度が第２の装置で行なわれて吸光度測定がなされる請求項１９の方法。
第１の一次検量解法が吸光度測定値の獲得の前に一時検量の組とは別個の独自の検量材料の小さな組を使用してアップグレードされる請求項１９の方法。
統計処理が、単純線形回帰式、多重線形回帰式、および多変数解析からなる群から選ばれる請求項１９の方法。
多変数解析が、部分最小自乗法、主成分解析、神経網および遺伝解析からなる群から選ばれる請求項２４の方法。
予測の段階（段階ｉｉ）ではＯｘｙ−Ｈｂまたは”Ｏｘｙ−ＨｂプラスＤｅｏｘｙ−Ｈｂ”の一つまたはＭｅｔ−Ｈｂ、Ｃａｒｂｏｘｙ−ＨｂまたはＳｕｌｆ−Ｈｂの一つまたは一つ以上が、それぞれ全−Ｈｂの割合として測定される請求項１の方法。