BRPI0822570B1

BRPI0822570B1 - Processo in vitro para a determinação da concentração de hemoglobina em uma amostra de sangue diluída em uma só etapa

Info

Publication number: BRPI0822570B1
Application number: BRPI0822570-2A
Authority: BR
Inventors: Jair Ribeiro Chagas; Paulo Alberto Paes Gomes; Maurício Marques de Oliveira
Original assignee: Jair Ribeiro Chagas; Paulo Alberto Paes Gomes; Maurício Marques De Oliveira
Priority date: 2008-04-17
Filing date: 2008-11-28
Publication date: 2019-02-19
Also published as: BRPI0822570A2; US20110263031A1; WO2009127024A1; BRPI0802336A2

Abstract

processo in vitro para a determinação da concentração de hemoglobina em uma amostra de sangue diluída em uma só etapa a presente invenção se refere a um processo, equipamento portátil e dispositivo para a determinação fotométrica in vitro da concentração de hemoglobina em sangue diluído. a presente invenção viabiliza sua utilização em programas de prospecção de anemias a campo. a presente invenção compreende uma fonte de luz com comprimento de onda entre 500 e 550 nm, um microprocessador para acionamento automático da fonte de luz, aquisição do sinal obtido pelo foto-sensor 92), realização dos cálculos da concentração de hemoglobina e exibição dos resultados em um display de cristal líquido. o dispositivo compreende um frasco cilíndrico lacrado que é concomitantemente utilizado como embalagem para o reagente e como componente óptico do processo, permitindo a leitura fotométrica através de suas paredes.

Description

PROCESSO IN VITRO PARA A DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE

HEMOGLOBINA EM UMA AMOSTRA DE SANGUE DILUÍDA EM UMA SÓ

ETAPA [001] A presente invenção se refere a um processo, equipamento portátil e dispositivo para a determinação fotométrica in vitro da concentração de hemoglobina em sangue diluído. A presente invenção viabiliza sua utilização em programas de prospecção de anemias a campo.

INTRODUÇÃO [002] Os vertebrados, por possuírem massas corporais muito grandes, desenvolveram um sistema capaz de captar o oxigênio da atmosfera ou meio líquido e distribuí-lo por todo o seu corpo, assim como eliminar o principal catabólito do metabolismo aeróbico, o gás carbônico.

[003] A estratégia evolutiva que prevaleceu, foi a da incorporação de um carreador de oxigênio, a hemoglobina, uma molécula com afinidade seletiva pelo 02, presente no interior dos eritrócitos.

[004] A hemoglobina permite que o sangue transporte 50 vezes mais 02 que o plasma isolado. Por possuir afinidade variável ao 02, condicionada por diversos fatores fisiológicos, permite a ligação e liberação das moléculas de oxigênio nos sítios adequados.

[005] A hemoglobina é composta por duas cadeias protéicas, as globinas, e um núcleo prostético, o heme, que, por sua vez, é formado por duas protopofirinas e uma molécula de ferro.

[006] A anemia pode ser descrita como a diminuição do número de eritrócitos circulantes, do teor de hemoglobina

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2/20 no sangue ou ambos, com diversas etiologias, inclusive pela deficiência nutricional de ferro (Beutler, 2005).

[007] Existe consenso na comunidade científica de que a anemia por deficiência de ferro é o maior problema nutricional mundial, atingindo todas as classes de renda (Demayer EM, 1989).

[008] Em termos de diagnóstico clínico, a anemia é uma patoligia de difícil detecção, pois não existem sinais patognomônicos, que permitam um diagnóstico inequívoco. A base mínima de dados para a tomada de decisão do clínico deve incluir informações acerca da capacidade carreadora de oxigênio pelo sangue, o que é tradicoamlemnte realizado através do hemograma.

DESCRIÇÃO DO ESTADO DA TÉCNICA [009] As metodologias tradicionais e largamente difundidas para a determinação da capacidade carreadora de oxigênio pelo sangue são o eritrograma, hematócrito e a dosagem de hemoglogina. Nas duas primeiras metodologias, são realizadas medidas ou do número de eritrócitos ou de seu percentual relativo ao volume total de sangue, constituindo uma estimativa indireta da concentração de hemoglobina (Beutler, 2005). Na terceira, uma medida direta da molécula responsável pelo carreamento do 02 é realizada. Apesar de confiáveis, estes métodos exigem a realização de flebotomia para a coleta de sangue venoso e processamento da amostra em ambiente laboratorial, inviabilizando sua utilização em programas de prospecção de anemias a campo.

DESCRIÇÃO DOS MÉTODOS DE HEMOGLOBINOMETRIA [010] No início no século XX, diversos métodos qualitativos e quantitativos foram desenvolvidos para a

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3/20 dosagem de hemoglobina, utilizando ou a própria cor da hemoglobina, ou a de um produto resultante da reação desta com reagentes (Ackerman, PC, 1925; Dare, A, 1922) . Estes métodos tinham a desvantagem de ser pouco preciosos.

[011]

Os princípios estabelecidos e, até hoje

utilizados, consistem na lise dos eritrócitos e liberação de

seu conteúdo	de hemoglobina em uma solução na qual, é formado
um composto	colorido através de reações químicas, em
quantidade	diretamente proporcional ao conteúdo de
hemoglobina.	O método tradicional e considerado como padrão

ouro até os dias atuais é o da Cianometahemoglobina. Nele, a hemoglobina é transformada em um composto estável sob a ação do Cianeto de Potássio e Ferricianeto de Potássio. Este composto é, então, medido através da sua absorção de luz em um dado comprimento de onda (Beutler, 2005).

[012]	Uma vez que estes compostos possuem
toxicidade,	reagentes sem cianeto para a dosagem de
hemoglobina	foram desenvolvidos (Zandler, et al, 1982,

Benezra, J, 1989, Benezra J, 1995).

[013]

Nos laboratórios, para a medição fotométrica

da concentração de Hb com espectrofotômetros, são utilizadas amostras diferentes. A primeira amostra é uma substância conhecida de alta transmitância, normalmente água deionizada, e é chamada de Branco. A segunda é uma amostra com

concentração	de Hb, normalmente lOg/dL, chamada de Padrão.
A terceira	é a amostra da qual se pretende conhecer a
concentração	de Hb, chamada de Teste”.
[014]	São medidos os valores da intensidade de luz

sobre um foto-sensor ao se posicionar uma cubeta, com cada uma destas amostras, entre ele e uma fonte de luz. Chamamos

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4/20 estas intensidades de I_s, Ip e It. Depois são calculadas, automaticamente ou de forma manual, a Absorbância do Padrão e do Teste, definidas como:

Abs(P)LoglO (Is / Ip)

Abs(T)LoglO (Is / It) [015] Posteriormente é calculada a concentração de

Hemoglobina como:

[Hb] = 10*Abs(T)/Abs(P) em g/dL [016] Portanto, são necessárias três medidas e realização de cálculos para a obtenção do resultado final da amostra testada, normalmente em g/dL.

[017] Metodologia alternativas à fotometria também foram patenteadas, como, por exemplo, um ensaio eletroquímico (Greem, MJ, 1989).

[018] A partir de avanços da eletrônica, como o desenvolvimento de microprocessadores e LED's (Light Emitting Diodes) de comprimento de onda preciso, tornou-se possível a automação dos procedimentos, assim como o desenvolvimento de equipamentos portáteis (Loretz, TJ; 1982; Noller, HG, 1989).

[019] Isso, somado a resultados experimentais que validaram a utilização de sangue periférico na dosagem de hemoglobina, permitiu a realização de pesquisas de anemia a campo, um grande avanço em termos de saúde pública (Chen PP, 1992; Paiva AA et al, 2004).

020]

Dadas as características do espectro de absorção dos diferentes tipos de hemoglobina, diferentes comprimentos de onda foram utilizados para leituras fotométricas nos testes de hemoglobinometria, desde os 500nm (Pettersson, J, 2004), até 800nm (Ziegles, W, 1998; Ziegler,

W, 2000).

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5/20 [021] Em todo o mundo, as poucas alternativas comerciais de equipamentos portáteis para diagnóstico das anemias a campo ou se tratam de metodologias pouco precisas, ou são sistemas precisos e de alto custo (Lara AM, 2005).

[022] Diversas metodologias convivem no mercado mundial, adaptadas às condições de desenvolvimento econômico e social das diversas nações (PATH, 1997; Shepherd et al, 2001; Dykes, C, 2004; Pettersson, J, 2004).

[023]	A	tabela 1,	abaixo, apresenta	um	quadro
comparativo	ent	re as	diversas tecnologias	para
hemoglobinometria.
Tabela	1 -	Comparação	entre os diversos	métodos de

hemoglobiometria

MÉTODO	PRINCÍPIO	AMOSTRA	EQUIPAMENTOS ADICIONAIS	ACURACIA	VANTAGENS	DESVANTAGENS
Sinais clínicos	Coloração	Não	Fonte luminosa	Sens i bi1id ade	Baixo custo	Baixa precisão
	de mucos as			7 fiOl	Equipament o	Não detecta
	e outros			(somente ein	mínimo	anemias
	sintomas			casos le		mcieradas
				anemi a
				severa) _r
				Especificidad
				e 701 - 1001
Papel de Filtro	Coirparação	1 got a de	papel filtro	Sensibilidade	Baixo custo	Baixa precisão
	da	sangue	escal a de	= fiOl	rápido,	condição de
	coloração		compa ração _r	(lOg/dL)	siirples,	iluminação
	de uma gota		lance ta.	Especificidad	portátil, sein	influencia o
	de s angue			e: «0%	reagentes, sen	re sultado
	coin padrão			(lOg/dL)	energia
					elétrica.
Sulfato de cobre	Conparação	1 got a de	Escal a de	Sensibilidade	Baixo custo	Baixa precisão
	da	sangue	pesagem	901 (lOg/dL)	interpretação	necessidade de
	gravidade		vidra rias		visual inais	regentes puros
	especifica		diversas, CuSoj.		precisa que	anticoagulante
	sangue X		analítico,		métodos	s soluções de
	CuSO <3		água destilada,		semelhantes	CuSOfl com
			capilar de		Não necessita	diversas
			vidro coin		eletricidade	con cent r a çõe s
			antic oagulante,
			lance ta.

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6/20

Hematócrito /	Relação	Tubo	Capilar de	Sensibilidade	Baixo custo,	Necessita
centrifuga	volume	capilar	vidro coin	í00% (lüg/dL)	rápido,	centrifuga,
	eritrócitoa	preenchido	antic oagul ante _r	Especificidad	simples, boa	ant i coagul an te
	X volume	com sangue	centrífuga _r	e: 60%	acurácia	s, energia
	total do		régua de	(lOg/dL)		elé trica
	sangue		referência
			lance ta
Comparador	Comparação	50 mL de	Coinpa. rador	Sensibilidade	Equipamento	Cus to
Lovibond	visual de	s angue	Lovibond, Tubos	601 (lOg/dL)	duráve1	raz oável_P
	sangue	venoso	de vidro,	Especificidad	simples	necessidade de
	diluído em		micropipeta,	e 60%	rápido,	uma amostra
	reagente		reagentes	(lOg/dL)	Acurácia	grande de
	com escala				razoável	sangue
	de cores
Fotômetro Grey	Cunha	5-10 mL de	Fotômetro Grey	Sebsibilidade	Baixo custo	Baixa
Wedge	óptica	sangue	Wedge, bastão	77,5%	portátil	precisão.
			com saponina,	(lOg/dL)	barato	difícil
			câmara de vidro	Espee cificida		ope ração
			padrão de	de: 961
			calibração de	(lOg/dL)
			detergente
Método de Sahli	Transformaç	2 0 mL de	Hemoblobinômet r	Sensibilidade	Baixo custo	Baixa
	ão Hb em	sangue	o e pipeta de	= 35%	não requer	precisão.
	Hematina		Sahli, pipeta	(lOg/dL)	energia	difícil
	ácida e		de vidro, ác.	Especificidad	elétri ca	realização
	comparação		Clorídrico 0,1	e 35%
	visual com		N e detergente	(lOg/dL)
	padrão
flemo-cue	Fotômetro	10 mL de	Fotômetro	Sensibilidade	Portátil	Alto custo do
	portátil_r	sangue	Hemocue,	85% (lOg/dL)	acurado,	equipamento e
	método da		cubet as	Especificidad	rápido e	cubetas
	azida		descartáveis,	e 94%	simples	sensível a
			cubeta padrão,	(lOg/dL)		umidade após
			baterias e			aberta a
			lance taas			embalagem,
						cubetas duram
						3 meses
Ci anome t ahein obl o g:	Transformaç	2 0 mL de	E spec trofotõme t	S ens i bi1id ade	Método com	Equipamentos
na	ão Hb	sangue	ro, cubetas,	100% (lüg/dL)	maior	caros, não são
	Hemoglobici		pipetas solução	Especificidad	acurácia,	portáteis,
	anida e		padrão, solução	e: 100%	amostras	requer
	leitura		de Drabkin	(lOg/dL)	estáveis	eletricidade,
	fotométrica		Lance tas			gera resíduos
						tóxicos

[024] A metodologia de medida utilizada em espectrofotômetros de bancada é complexa e envolve diversos passos, introduzindo erros e necessitando pessoal altamente treinado.

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7/20 [025] Segue posteriormente, uma listagem de documentos e publicações que suportam a descrição do estado da técnica da patente em questão:

- Ackerman, PC, inventor. Hemoglobinometer. United States Patent.US 1545113. 1925, Jul 7.

- Benezra, J et al. inventores; Bayer Coporation, cessionário. Cyanide-Free Hemoglobin Reagent. Unites States Patent US5468640. 1995, Nov 21.

- Benezra, J et al. inventores; Technicon Instruments Corporation, cessionário. Cyanide-Free Hemoglobin Reagent. Unites States Patent US4853338. 1989, Aug l.

- Beutler, E. Et al.{org.). Williams Hematology. 7 ed. London: McGrall-Hill, 2005. 1856 p.

- Chen PP, Short TG, Leung DHY, Oh TE. A clinical evaluation of the HemoCue haemoglobinometer using capillary, venous and arterial samples. Anaesth Intensiva Care l992; 20:497-503.

- Dare A, inventor. Hemoglobinometer and Illuminating Device Therefor. United States Pantent US 1414261 1922, Abr 25.

- Demayer EM. Preventing and controlling iron deficiency anaemia through primary health care - a guide for health administrators and programme managers. Geneva: World Health Organization, 1989.

- Dykes, C. et al. Inventores. Disposable Fluid Sample Collection Device. Unites States PCT/US04/036909. 2004, Nov 5.

- Greem, MJ et al. Inventores; Medisense Inc, cessionário. Electrochemical Assay for Hemoglobin. United States Patent US 4876205. 1989, Oct 24.

- Kitawaki et al. inventores. Blood Processing Method, Blood Processing Device, Method of Measuring Hemoglobins and

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8/20

Device for Measuring Hemoglobins. United States Patent US

4876205. 1989, Oct 24.

- Kitawaki et al. inventores. Blood Processing Method, Blood Processing Device, Method of Measuring Hemoglobins and Device for Measuring Hemoglobina. United States Patent US 2005/00l4275Al. 2005, Jan 20.

- Lara AM, Mundy C, Kandulu J, Chisuwo L, Bates I. Evaluation and costs of different haemoglobin methods for use in district hospitals in Malawi J. Clin. Pathol. 2005;58;56-60.

- Loretz, TJ, inventor; Buffalo Medical Specialties Mfg, cessionário. Blood Diagnostic Spectrophotomether United States Patent US4357105. 1982, Nov 2.

- Noller; HG, inventor. Light Emitting Diode Spectrophotometer. United States Patent US 4857735. 1989, Aug 15.

- Paiva AA, Rondó PHC, Si1va SSB, Latorre MRDO Comparison between the HemoCue® and an automated counter for measuring hemoglobin. Rev Saúde Publica 2004, 38(4), 585-7.

- PATH, Anemia Detection Methods in Low-Resources Settings: A Manual For Health Workers. US Agency for International Development. Washington, USA. 1997.

- Pettersson, J & Svensson, J, inventores; Hemocue, AB, cessionário. Analysis Method and System Therefor. United Sates Patent US 6831733. 2004, Dec 14.

- Shalel, S; Streichman, S; Marmur, A. The Mechanis of Hemolysis by Surfactants: Effect of Solution Composition. J. of Coll and Interfac Sci. 252, 66-76, 2002.

- Shepherd et al inventores; Board of Regents, The University of Texas System, cessionário. Method and Apparatus for Direct Spectrophotometric Measurements in unalterd Whole Blood. United States Patent US 6262798. 2001, Jul 17.

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- Williamson, A. et al. Inventores. Capillary Microcuvette. World Intellectual Property Organization WO 96/33399. 1996, Oct 24.

- Zander, R et al. inventores. Process and Reagent for Determination of the Hemoglobin Content of Blood. United States Patent US 4341527. 1982, Jul 27.

- Ziegler, W, inventor; AVL Medical Instruments AG, cessionário. Method and Apparatus for Optically Determining Total Hemoglobin Concentration. United States Patent US 6103197. 2000, Aug l5.

- Ziegler, W, inventor; AVL Medical-Instruments AG, cessionário. Method for Optically Determining Total Hemoglobin Concentration. United States Patent US 5773301. 1998, Jun 30.

- Zijlistra, W.G.; Buursma, A.; Van Assendelft, O. W. Visible and Near Infrared Absorption Spectra of Human and Animal Haemoglobin: Determination and Application. lst ed. Leiden: Brill Ac Publi, 2000. 368 p.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DOS DESENHOS [026] A figura 1 apresenta os resultados do teste de linearidade dos equipamentos da presente invenção.

[027] A Figura 2A apresenta um gráfico com os resultados obtidos com três tipos de equipamentos (A, B e C} em relação aos padrões comerciais de hemoglobina com 10 g/dL.

[028] A figura 2B apresenta um gráfico com os resultados obtidos com três tipos de equipamentos (A, B e C) em relação aos padrões comerciais de hemoglobina com 5 g/dL.

[029] A figura 3A demonstra a linearidade das medidas obtidas pelo equipamento B desenvolvido com padrão

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10/20 comercial de hemoglobina, nas concentrações de O; 2,5; 5;

7,5; 10; 12,5; 15; 17,5; 20; 22,5 e 25 g/dL.

[030] A figura 3B. demonstra a linearidade das -medidas obtidas pelo equipamento C, objeto da presente invenção, desenvolvido com padrão comercial de hemoglogina, nas concentrações O; 2,5; 5; 7,5; 10; 12,5; 15; 17,5; 20;

22,5 e 25 g/dL.

[031] A figura 4 apresenta gráficos de comparação do desvio percentual do valor -da medida de hemoglobina em sangue periférico obtido pelos hemoglobinômetro portáteis C e B, respectivamente, com sangue venoso obtido do mesmo paciente e medido no analisador A.

[032] A figura 5 apresenta gráficos de comparação da hemoglobinometria com o uso de soluções lisantes alternativas com a solução de Drabkin, em diferentes diluições de sangue.

[033] A figura 6A demonstra a linearidade do equipamento calibrado para trabalhar com 3,0 ml de água destilada deionizada e os resultados da regressão Linear, utilizando-se padrão comercial de hemoglobina.

[034] A figura 6B demonstra a linearidade do equipamento calibrado para trabalhar com 3,0 ml de água destilada deionizada e os resultados da regressão Linear, utilizando-se amostras de sangue de ratos Wistar.

[035] A figura 6 é um diagrama de blocos do programa embarcado no equipamento da presente invenção.

[036] A figura 7 é uma vista em perspectiva explodida do equipamento da presente invenção.

[037] A figura 8 é um esquema elétrico do equipamento da presente invenção.

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[038]	A figura	9	apresenta	o sistema	óptico	do
equipamento	da presente	invenção.
[039]	A figura	10	apresenta	o suporte	de amostras
da presente	invenção.
[040]	A figura	11	apresenta	a tampa do	suporte	de
amostras da	figura 10.

OBJETIVOS DA INVENÇÃO [041] O processo desenvolvido apresenta vantagens sobre os equipamentos de bancada, pois não são necessárias as medidas branco e padrão, podendo ser realizado em uma só etapa, sendo, também, diferente das soluções apresentadas por outros equipamentos portáteis.

[042] tabela apresenta as medidas de 10 amostras diferentes de um padrão de hemoglobina comercial com lOg/dL em 4 unidades do equipamento desenvolvido.

Tabela 2

Resultados de medidas de amostras de padrão

Amostra	1	2	3	4
1	10,3	10,0	9, 9	9, 8
2	10,1	10,0	9, 9	9, 9
3	10,0	10,0	9, 8	10,0
4	10,1	10,1	9, 9	10,0
5	10,4	10,0	9, 9	9, 9
6	10,3	10,1	10,1	10,1
7	9, 8	10,0	9, 9	9, 9
8	10,1	10,0	10,0	9, 9
9	10,0	10,0	10,0	10,0
10	9,5	9, 9	9, 8	9, 8
[043]	Após Análise	de variância pode-se	conclu

que ir não há diferença estatisticamente significativa entre as

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12/20 médias (p = 0,13358) em torno de 10 g/dL nos 4 equipamentos, concluindo-se que os mesmos realizam medidas equivalentes.

[044] A partir dos dados acima podemos estimar a precisão e a exatidão intracorrida de cada equipamento, na concentração de 10 g/dL. Segundo o Guia para Validação de Métodos Analíticos e Bioanalíticos da ANVISA, a precisão pode ser expressa como o desvio padrão relativo (DPR) ou como coeficiente de variação (CV%):

DPR = 100* DP / CMD

Exatidão = 100* CMD / CT

Onde:

DPR é o Desvio Padrão Relativo

DP é o Desvio Padrão

CMD é a Concentração Média Determinada

CT é a Concentração Teórica (ou Nominal)

Para os equipamentos testados obtivemos:

Tabela 3

Precisão e Exatidão dos Equipamentos

Média	10, 06	10, 01	9, 92	9, 93
DP	0,26	0,06	0, 09	0, 09
DPR	2, 6	0, 6	0,9	1,0
Exatidão	100,6	100,1	99,2	99,3

[045]

Os Testes de Linearidade dos equipamentos foram realizados utilizando como amostras soluções de padrão em reagente de Drabkin com concentrações de hemoglobina equivalentes a 2,5; 5,0; 7,5; 10,0; 12,5; 15; 17,5 e 20 g/dL. A figura 3 apresenta os resultados e a tabela 4, os parâmetros da regressão linear.

Tabela 4- Parâmetros da Regressão Linear (Y = aX -ι

ό)

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Equipamento	a	b	c
1	0,96	0, 31	0,9998
2	0,96	0, 27	0,9998
3	0,97	0, 22	0,9998
4	0,95	0, 45	0,9997
[046] Uma	comparação	das	medidas de padrões

comerciais de hemoglobina de 10 e 5 g/dL, foi realizada em três equipamentos:

[047] Analisador hematológico de bancada Celm*, modelo CC 530/550, considerado como padrão-ouro (identificado como equipamento A);

[048]	Hemoglobinômetro	portátil	Hemocue* 201
identificado	como equipamento B)	r
[049]	Hemoglobinômetro	Agabê (identificado como

equipamento C), objeto deste pedido de patente.

[050] Podemos observar a semelhança de exatidão e precisão entre os equipamentos testados na tabela 5 e nas figuras 2A e 2B.

Tabela 5 - Comparação entre equipamentos A, B e C com padrões comerciais de hemoglobina com 10 e 5 g/dL.

Média

DP

DPR

Exatidão

Média

DP

DPR

A	B	C
	lOg/dL
9,88	9, 15	10, 01
0,06	0, 05	0,06
0,64	0, 58	0,57
98, 8	91,5	100, 1
	5g/dL
4,98	4, 67	5,16
0,08	0, 05	0,11
1,58	1, 03	2,08

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Exatidão 99,6 93,4 103,2 [051] 0 processo da presente invenção também apresenta vantagens ao utilizar uma ampola/cubeta, pois se trata de uma solução de envase há muito conhecida e eficiente, associada a uma utilização totalmente inédita, como componente óptico (cubeta) do sistema. Isto elimina a etapa de pipetagem da solução reagente, evitando uma possível fonte de erro que poderia influir no resultado final e facilitando a realização a campo. A tabela 6 e a figura 3 demonstram a linearidade das medidas obtidas pelo equipamento desenvolvido com padrão comercial de hemoglobina, nas concentrações de O;

5; 7,5; 10;	12,5; 15; 17	,5;	20; 22,5 e	25 g/dL.
Tabela 6 -	Parâmetros	da	Regressão	Linear
	a		b	c
Equipamento	B 0,9		0,13	0,9958
Equipamento	C 1, 02		0,29	0,9977

[052] Na figura 4 apresentamos a comparação de hemoglobinormetrias realizadas com 3 amostras de sangue do mesmo paciente, duas de sangue periférico, analisadas no equipamento desenvolvido (C) e no hemoglobinômetro B; e outra de sangue venoso, analisada pelo Analisador hematológico A. Os gráficos representam o desvio percentual dos resultados obtidos através dos dois equipamentos portáteis (B e C) , quando comparados ao equipamento de bancada (A), considerado como referência.

[053] O processo proposto apresenta inovação ao permitir tanto a utilização da solução de Drabkin Modificada, quanto a utilização de diversas soluções lisantes, como água destilada deionizada, n-dodecil Sulfato de Sódio a 0,5%

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15/20 (SDS), Uréia a 1% e uréia 1% em solução fisiológica com resultados satisfatórios quando comparados ao padrão ouro, o método da cianometahemoglobina (Figura 7).

[054] Soluções lisantes alternativas (Zijlistra, 2000), que apresentam vantagens de custo, estabilidade a fotodegradação e condições ambientais, além da redução de riscos ambientais e toxicológicos, podem ser utilizadas no equipamento desenvolvido.

[055] A água destilada é a opção com o menor impacto ambiental e ocupacional, devendo ser utilizadas na proporção > 300:1 para que a lise dos eritrócitos seja completa. Na figura 6A podemos observar a curva de linearidade do equipamento desenvolvido utilizando-se diluições do padrão comercial de hemoglobina. (2,5; 5; 7,5; 10; 12,5; 15; 17,5; 20; 22,5 e 25 g/dL) em água e em líquido de Drabkin. Na figura 6B apresentamos a linearidade dos testes realizados com diluições de sangue de ratos da linhagem Wistar em água e em líquido de Drabkin.

[056] Espectrofotômetros de bancada são equipamentos frágeis e de alto custo, fatos que, somados à baixa portabilidade, impedem sua utilização a campo, em campanhas de prospecção de anemias. O equipamento desenvolvido apresenta robustez, portabilidade e simplicidade de operação compatíveis com sua utilização a campo.

[057] Outros equipamentos portáteis possuem soluções eficientes, porém seus projetos apresentam grande sofisticação. Nossa solução integra componentes eletrônicos, peças mecânicas e um microprocessador sob a forma de um fotômetro de comprimento de onda fixo projetado de forma a possibilitar uma produção simplificada e com baixo custo.

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16/20 [058] Alguns equipamentos portáteis são associados a dispositivos de coleta da amostra, reação química e leitura fotométrica, as microcubetas (Williamson, 1996; Kitaivaki, 2005). Trata-se de uma solução eficiente, apresentando, porém, alto custo e baixo prazo de validade quando da abertura da embalagem.

[059] Apesar da utilização das ampolas consistir estado da técnica em termos de envase de medicamentos, sua utilização é inédita como componente óptico ou cubeta. Graças ao desenho do suporte desenvolvido no equipamento, interferências devidas tanto à luz espúria, quanto por distorções do feixe de luz causadas pela geometria curva das paredes da ampola foram reduzidas, deforma a não influir no resultado da leitura. A geometria cilíndrica escolhida traz vantagens em termos industriais, facilitando e reduzindo o custo de produção tanto do suporte de amostras, quanto da ampola/cubeta.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO [060] Inicialmente, o programa embarcado no software faz diversas checagens como: a tensão na bateria, o sinal no escuro (LED desligado) e a saída da eletrônica analógica com o LED ligado. Se todas as medidas estão dentro das faixas especificadas, o programa pede ao usuário para posicionar a ampola-cubeta com a amostra teste no suporte e apertar enter. O sinal adquirido é então processado e os cálculos realizados. O resultado é apresentado na tela de cristal líquido. Se o usuário desejar continuar fazendo testes, basta apertar enter novamente e o programa volta ao segundo bloco.

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17/20 [061] O programa gravado no micro-processador PIC pode ser melhor compreendido analisando-se o diagrama em blocos da figura 6.

[062] O seguinte processo foi criado para se obter o valor da concentração de hemoglobina em uma amostra:

[063] Realizamos, inicialmente, a medida da intensidade de luz no sensor com o suporte de cubetas vazio. Chamamos esta intensidade de Íon. Definimos uma nova função absorbância que chamamos de Ab que utiliza o valor de Íon como referência, ou seja, Ab (X) vale Log10 (Íon/Ix). Realizando-se as medidas de intensidade das amostras Branco (Ib), Padrão (Ip) e Teste (IT), e calculando-se a Ab destas amostras, poderíamos obter o valor da concentração de hemoglobina como 10*{Ab(T) - Ab(B)} / {Ab(P) - Ab(B)}. Ab(B) e Ab(P) não devem se modificar com o passar do tempo, mesmo se a intensidade de luz emitida pelo Led variar. Logo podemos medir experimentalmente o valor destas constantes utilizando várias amostras de Branco e Padrão e introduzir a media destes valores como constantes no cálculo, Ab(B) como Cl e [(Ab(P) - Ab(B)] como C2. Assim, podemos calcular [Hb] medindo-se simplesmente os valores de Íon, que é feito automaticamente e IT que é feito inserindo-se a cubeta com a amostra e apertando-se apenas uma tecla. A concentração de hemoglobina da amostra é então calculada como 10* [Ab(T) - Cl] / C2.

[064] A leitura fotométrica é realizada entre 500 e

550nm; preferencialmente entre 520 e 540nm e, mais preferencialmente, em 525nm. Na faixa de leitura em que é realizado o exame, as características de absortividade molar das diversas variantes da hemoglobina são semelhantes,

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18/20 permitindo que leituras com exatidão e precisão suficientes sejam efetuadas.

[065] Como reagente e diluidor da amostra, podemos utilizar no processo qualquer solução lisante que não afete o perfil de absorção da hemoglobina, inclusive a solução de Drabkin, previamente envasada na ampola/cubeta.

[066] O equipamento, mostrado na figura 7, é composto por uma fonte de luz (1) (LED com comprimento de onda entre 500nm e 550nm), um foto-sensor de silício (2), um suporte para amostras (3), um circuito eletrônico analógico (figura 10) para amplificação e filtragem do sinal do sensor e um microprocessador para realização do auto-teste, acendimento do LED, cálculos e controle de uma tela de cristal líquido. Os componentes estão arranjados em uma caixa de acondicionamento de polímero.

[067] O LED é montado em um suporte do LED (1) e o sensor é montado em um suporte do sensor (2), sendo que a 1inha imaginária que os une horizontalmente, pass pelo centro do suporte de amostras (3), no qual é introduzida a ampolacubeta (4) cilíndrica que é simultaneamente um frasco para o envase do reagente e componente óptico (cubeta).

[068] A fonte de luz (1) tem comprimento de onda preferencialmente entre 520 e 540nm e mais preferencialmente de 525nm.

[069] O suporte de amostras (3) cilíndrico tem diâmetro entre 8 e 20 mm, preferencialmente entre 10 e 14 mm e mais preferencialmente de 12,9 mm.

[070] A figura 9 apresenta o sistema óptico do equipamento. O diâmetro dos túneis do LED e do Fotoseensor (X e Y, respectivamente), tem diâmetro entre 0,2 mm e 5 mm,

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19/20 preferencialmente entre l mm e 3 mm e mais preferencialmente de 2 mm. Esta medida foi obtida empiricamente em ensaios, visando reduzir tanto a distorção do feixe luminoso, causada pela geometria curva das paredes da ampola/cubeta, quanto a detecção de luz espúria proveniente da porção superior da cavidade do suporte de amostras.

[071] O túnel do LED (B), com l,8 mm de comprimento, realiza a colimação do feixe de luz emitido pelo LED, focalizando-o sobre a abertura do túnel do fotossensor (B), com 4,55 mm de comprimento (figura 12).

[072] A distância W desde o centro dos túneis, até a borda superior do suporte de amostras, com 17 mm, foi determinada de forma a minimizar a interferência da luz espúria. Todo o conjunto é fechado por uma tampa.

[073] O sinal gerado pelo sensor é processado em um circuito eletrônico baseado em um chip com 4 amplificadores operacionais alimentado por fonte simples. O circuito é alimentado por uma bateria recarregável de 9 volts ligada^a um regulador (figura 8).

[074] O sinal oriundo da eletrônica analógica entra no microprocessador da família PIC por uma porta definida como conversor analógico digital. No micro-processador são realizados os cálculos e o resultado da concentração de hemoglobina, em gramas por decilitro (g/dL), é apresentado na tela de cristal líquido (figura 8).

[075] O dispositivo para a determinação da concentração de hemoglobina em uma amostra de sangue diluído da presente invenção é composto por uma ampola-cubeta (4) cilíndrica que é, simultaneamente, um dispositivo para o envase do reagente e componente óptico do sistema (cubeta),

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20/20 permitindo a leitura fotométrica através de suas paredes, sendo constituída por qualquer material que possua características ópticas, químicas e mecânicas que permitam sua-utilização, tal como: polímeros ou vidro neutro ou borossilicao.

[076] A ampola-cubeta (4) apresenta diâmetro entre 8 e 20 mm, preferencialmente entre 10 e 13 mm e, mais preferencialmente, com 12,9 mm.

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Claims

REIVINDICAÇÕES

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1 . Processo in vitro para a determinação da concentração de hemoglobina em uma amostra de sangue diluída em uma só etapa compreendendo: - Uma função absorbância é definida utilizando-se a

medida da intensidade de luz dentro de um suporte de amostras a medida da intensidade de luz dentro de um suporte de amostras vazio como: Absorbância (X) vale LoglO (intensidade luminosa suporte de amostras vazio/Intensidade luminosa de X) ;

caracterizado pelo fato de compreender ainda as seguintes etapas:

Constantes obtidas experimentalmente através de medidas de absorbância média de amostras branco e padrão, denominadas Cl e C2, respectivamente, são introduzidas no processamento, permitindo a obtenção da concentração de

hemoglobina de uma dada amostra em uma só etapa manual, medindo-se a intensidade de luz no sensor com a amostra posicionada dentro de um frasco, que é concomitantemente a

embalagem do reagente e um componente óptico;

- A intensidade de luz no sensor com o suporte de cubetas vazio, necessária ao cálculo, é obtida automaticamente, no inicio do processo de medição;

- A concentração de hemoglobina da amostra é, então, calculada como: 10* [Ab (T) - Cl] / C2, em que Cl = Ab(B) e C2 = (Ab (P) - Ab (B)
2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que, a amostra é introduzida em frasco cilíndrico lacrado que é concomitantemente utilizado como embalagem para o reagente e como componente óptico do

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2/2 processo, permitindo a leitura fotométrica através de suas paredes.
3. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que, as medidas fotométricas são realizadas entre 500 e 550nm.
4. Processo, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que, as medias fotométricas são realizadas preferencialmente entre 520 e 540nm.
5. Processo, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que, as medidas fotométricas são realizadas preferencialmente em 525nm.
6. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que, o diluente é composto por uma solução hemolizante.
7. Processo, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que, preferencialmente, a solução hemolizante é uma Solução de Drabkin Modificada.
8. Processo, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que, preferencialmente, a solução hemolizante é água destilada deionizada em proporção maior ou igual a 300:1.