JP2005247861A - 免疫増強特性を有するムチンペプチド - Google Patents
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Abstract
【解決手段】アミノ酸配列VSIGLSFPMLPを含む単離されたペプチドまたはポリペプチドあるいはそのアナログまたは誘導体であり、該ペプチドまたはポリペプチドは、哺乳動物に投与された場合、抗原に対する免疫応答を増強する特性を有する、ペプチドまたはポリペプチドであって、1つの実施形態において、11アミノ酸残基と200アミノ酸残基との間の長さであり、他の実施形態において、11アミノ酸残基と20アミノ酸残基との間の長さであり、別の実施形態において、上記アミノ酸配列を含む、ペプチドまたはポリペプチド。
【選択図】なし
Description
1.発明の分野
本発明は、免疫増強特性を有するムチンペプチド、このペプチドを含む薬学的組成物、および癌の処置方法または予防方法に関する。
MUC1遺伝子は、正常な上皮、および数種のヒト癌において発現し、乳癌では非常に高レベルで発現する(1)。この遺伝子の主な産物は、大きな、高度にグリコシル化された細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および72個のアミノ酸の細胞質の尾(tail)から構成される、多型1の膜貫通分子である(2)。この多型は、細胞外ドメインに存在する20個のアミノ酸縦列の繰り返しのユニット数のバリエーションに、主に由来する。分泌MUC1アイソフォーム(MUC1/sec)(3)はまた、イントロン2配列を含み、このイントロン内の終止コドンで早期に終結し、そして、それにより、膜貫通ドメインを欠くことが見い出されている。
(請求項2)11アミノ酸残基と200アミノ酸残基との間の長さである、請求項1に記載のペプチドまたはポリペプチド。
(請求項3)11アミノ酸残基と20アミノ酸残基との間の長さである、請求項1に記載のペプチドまたはポリペプチド。
(請求項4)VSIGLSFPMLP(配列番号1)を含む、請求項1に記載のペプチドまたはポリペプチド。
(請求項5)タンパク質キャリアに結合体化したアミノ酸配列VSIGLSFPMLP(配列番号1)を含む、少なくとも1コピーのペプチドまたはポリペプチドを含む、請求項1に記載の誘導体。
(請求項6)前記キャリアが、キーホールリンペットヘモシアニンである、請求項4に記載の誘導体。
(請求項7)請求項1に記載のペプチドまたはポリペプチドをコードする核酸あるいは該核酸と相補的な配列を有する核酸。
(請求項8)請求項1に記載のペプチドまたはポリペプチドあるいはそのアナログまたは誘導体と、薬学的に受容可能な賦形剤またはキャリアとを含む、薬学的組成物。
(請求項9)抗原をさらに含む、請求項8に記載の薬学的組成物。
(請求項10)前記抗原が腫瘍抗原である、請求項9に記載の薬学的組成物。
(請求項11)前記抗原が、前立腺特異的抗原、黒色腫関連抗原およびp53からなる群より選択される、請求項10に記載の薬学的組成物。
(請求項12)前記ペプチドが、VSIGLSFPMLP(配列番号1)である、請求項10に記載の薬学的組成物。
(請求項13)請求項7に記載の核酸を含む、ベクター。
(請求項14)請求項7に記載の核酸を含む、宿主細胞。
(請求項15)MUC1/secをコードする核酸を含む、請求項14に記載の宿主細胞。
(請求項16)DA−3細胞である、請求項15に記載の宿主細胞。
(請求項17)請求項1に記載のペプチドまたはポリペプチドあるいはそのアナログまたは誘導体と、抗原と薬学的に受容可能な賦形剤またはキャリアとを含む、ワクチン。
(請求項18)哺乳動物において癌を処置または予防するための方法であって、該方法は、安全かつ有効な量の請求項8または請求項9に記載の薬学的組成物を該動物に投与する工程を包含する、方法。
(請求項19)哺乳動物において抗原に対する免疫応答を誘導または増強するための方法であって、該方法は、安全かつ有効な量の請求項8または請求項9に記載の薬学的組成物を該動物に投与する工程を包含する、方法。
(請求項20)前記抗原もまた、前記哺乳動物に投与される、請求項19に記載の方法。
(発明の要旨)
アミノ酸配列VSIGLSFPMLP(配列番号1)を含むペプチド、ならびにそのアナログおよびその誘導体は、インビボで免疫調節活性を示す。このようなペプチド、およびそれらをコードする核酸(例えば、RNA、DNA)は、当該分野で公知の体液の基準、または細胞の基準によりアッセイされる場合、被験体(動物またはヒト)において免疫応答を刺激するか、またはさもなければ増強するアジュバントとして使用され得る。例えば、抗体産生の増強、その可溶性免疫媒介物(例えば、サイトカイン)の分泌、抗原提示、エフェクター細胞の産生またはエフェクター細胞の機能(例えば、細胞傷害性)、免疫応答の他の公知の方法、またはこれらの組み合わせが、効力を示すのに使用され得る。特に、このペプチドまたは核酸は、ワクチンアジュバントとして使用されて、インビボで免疫応答を増強させ得、インビボおよび/もしくはインビトロでサイトカイン(1つ以上の細胞の亜集団(subpopulation)のマイトジェンとして)産生を誘導し得、または細胞傷害性を増強させ得る。本発明の1つの目的は、免疫調節および増強作用のための新規分子を提供することである。
(例えば、自然環境から取り出された天然に存在する物質)をいう。上記のベクター、組成物、または細胞が、この物質の元の環境に存在しない場合、このような物質は、ベクターの部分、または物質組成物の部分であり得るか、もしくは細胞内に含まれ得る。
(発明の詳細な説明)
規定された腫瘍抗原を使用して、乳癌に対する免疫応答を研究するために、本発明者らは、BALB/cマウス宿主の転移性傷害および死に導く乳癌細胞株であるDA−3細胞を、膜貫通MUC1アイソフォーム(DA−3/TM)、分泌型(DA−3/sec)、またはネオマイシンベクター単独(DA−3/neo)でトランスフェクトした。分泌型MUC1でトランスフェクトすることにより、DA−3細胞は、インタクトなBALB/cマウス中で増殖できなくなるが、一方これらはヌードBALB/c動物中では増殖する。DA―3/sec細胞のワクチン接種は、DA−3/TM細胞、またはDA−3/ne
o細胞を用いるチャレンジに対する保護、およびBALB/cマウスとまた同系の2つの関連しない腫瘍に対する保護を与える。分泌MUC1アイソフォームに存在する固有の11個のアミノ酸ペプチドは保護効果に関係し、そして免疫増強分子として作用すると思われる。
(マウスおよび腫瘍)
インタクトなBALC/cマウスを、University of Miami School of Medicineの本発明者らの実験室において、兄弟姉妹交配によって維持した。BALB/c nu+/nu+を、Taconic Labsから購入した。DA−3腫瘍細胞株を、BALB/cマウスと同系のインビボのD1−DMBA−3マウス乳腺腫瘍から得た(4)。DA−3細胞は、BALB/cマウスにおいて腫瘍を生成し、肺において転移性病変を引き起こす。この細胞株を、5% FCS(ウシ胎仔血清)、100Uペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン、5×10−5M 2−βメルカプトエタノール(2−BME)、2mM L−グルタミン、1%非必須アミノ酸、1%必須アミノ酸、および1%ピルビン酸ナトリウム(全て、GIBCO BRL,Gaithersburg,MDから購入)を補充したRPMI−1640培地において増殖させ、そして連続継代によって維持する。これらの細胞は、リムルスアメーバ様細胞溶解物(Pyrogent(登録商標)plus;Whittaker M.A.Bioproducts,Inc.,Walkersville,MD)を用いた慣用的アッセイによって確かめられるように、内毒素を有さない。
H23と称されるモノクローナル抗体を使用して、MUC1/TMおよびMUC1/secの両方に共通する縦列反復配列を検出した。抗体1709(Aves Labs,Tigard,OR)を、マレイミド(malaimide)活性化キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)を用いてKLHに結合体化されたMUC1/sec特異的ペプチド(VSIGLSFMLP(配列番号:))を用いてニワトリを免疫することによって、調製した。遊離ペプチド濃度およびKLH1分子あたり少なくとも150のペプチド分子の結合体を、免疫のために使用した。前免疫IgY抗体を、免疫前に集められた卵から調製した。
MUC1アイソフォームを発現する安定なトランスフェクト体を、MUC1/TM cDNA、または分泌型MUC1/sec cDNAのいずれかを有し、ネオマイシンプラスミド(pSV2 neo)選択マーカーを有する発現プラスミドを、DA−3マウス乳腺腫瘍細胞へと同時トランスフェクトすることによって生成した。コントロールとして、細胞をまた、空のプラスミドでトランスフェクトし、そしてネオマイシン耐性について選択した。
親DA−3細胞、ネオマイシンコントロールおよびMUC1アイソフォームトランスフェクト細胞を、洗浄し、計数し、そして106の細胞を、同系のインタクトなBALB/cマウスまたはヌード(nu+/nu+)BALB/cマウスに、皮下(s.c.)注射した。腫瘍の増殖を、2〜3日毎にモニターし、そしてカリパスを用いて測定された場合に、10mmより大きい腫瘍を有するマウスを、腫瘍陽性としてスコアした。
BALB/cマウスを、2週間の間隔で2回または3回、生理食塩水溶液中の106のDA−3/sec腫瘍細胞でワクチン接種した。最後のワクチン投与から2週間後、この
動物を、トランスフェクトされないDA−3細胞またはネオマイシンベクター単独でトランスフェクトされたDA−3細胞もしくはMUC1膜貫通アイソフォームでトランスフェクトされたDA−3細胞を用いて、チャレンジした。いくつかの実験において、チャレンジをするために使用された腫瘍は、腎細胞癌、RENCA、または骨肉腫K7であった。106の腫瘍細胞を、106のDA−3/sec細胞と混合して、各チャレンジのために使用した。
DA−3乳腺腫瘍細胞を、材料および方法に記載されるように、ヒトMUC1の膜貫通アイソフォームおよび分泌アイソフォームの両方を用いてトランスフェクトした。トランスフェクションの成功を、MUC1縦列反復配列に特異的なH23抗体を使用して、このMUC1縦列反復の存在について細胞を染色することによって、証明した(5)。この得られた細胞株を、インビトロ実験において使用し、BALB/cマウスにおける腫瘍出現の発生数および時間を決定した。表1に示されるように、DA−3乳腺腫瘍細胞、DA−3/neo乳腺腫瘍細胞、およびDA−3/TM乳腺腫瘍細胞をマウスに移植することによって、7日までにほほ同じサイズの触知可能な腫瘍を生じ、そして15日までに実質的に全ての動物が、かなり大きな腫瘍を生じた。
トランスフェクションの工程によって、DA−3/sec細胞の基本的な増殖能力が選択的に損なわれたということは、この結果についてのありふれた説明であり得る。この可能性を試験するために、本発明者らは、これら4つの型のDA−3腫瘍細胞のインビトロ増殖特性を調査した。図2に示されるように、親細胞株および全ての種々のトランスフェクト体は、インビトロで類似した速度論で増殖した。実際には、DA−3/sec細胞は、他の細胞株より良好に増殖するように見え、このことはこれらの細胞のインビトロでの増殖能力が、トランスフェクション操作によって改変されなかったことを示す。
DA−3/sec細胞が、インビボでの全ての腫瘍形成能力を喪失したかどうかを決定するために、4つのDA−3細胞株の全てを、nu+/nu+BALB/cマウスに移植し、そして種々の時点における腫瘍出現の発生率および腫瘍の大きさを評価した。図3は、DA−3細胞、DA−3/neo細胞、およびDA−3/TM細胞が、BALB/cヌードマウスにおいて、移植後7日までに触知可能な腫瘍を生じ、これらの細胞は、インタクトなBALB/c動物の様式と類似する様式で増殖したことを示す。表1および図1の結果を対照的に、DA−3/sec腫瘍細胞は、全てのヌードマウスにおいて、14日までに腫瘍を生じ、そして25日までに、これらの全ての動物が腫瘍を有した。従って、DA−3/sec細胞を移植されたインタクトなBALB/cマウスにおいて腫瘍増殖が生じないことは、免疫学的に制御されるように見える。なぜなら、たとえ出現の時間がより遅くとも、ヌードマウスにおけるこの腫瘍の移植は、100%の腫瘍の獲得を生じるからである。これらの結果は、MUC1の分泌形態を保持する発現プラスミドで別々にトランスフェクトされた他の2つのDA−3腫瘍細胞を使用して、繰り返された。表2に見られるように、MUC1−sec遺伝子でトランスフェクトされた3つの別個のDA−3細胞はいずれも、インタクトなBALB/cマウスにおいて、増殖し得なかった。
本発明者らは、BALB/cマウスのDA−3/sec細胞での移植が、他のMUC1腫瘍細胞に対して保護を付与するかどうかを評価した。ムチンを発現しないDA−3細胞(DA−3/neo)もまた、本研究に含んだ。実験群は、1×106細胞のDA−3/TM細胞またはDA−3/neo細胞を単独またはDA−3/sec細胞と混合してチャレンジする前に、1週間の間隔で2回または3回の1×106のDA−3/sec細胞の注射を受けた。コントロールとして、ワクチン接種されない動物を、DA−3/neo細胞またはDA−3/TM細胞のいずれかを用いてチャレンジをした。DA−3 sec(106細胞)を混合されない2回の注射を受ける動物は、DA−3/TM細胞単独でチャレンジされた場合、腫瘍の出現のほんの短い遅延(すなわち、コントロール群における1週間での腫瘍を有する13/14匹の動物に比べて、2週間で13/22匹の腫瘍を有する動物)を引き起こした。チャレンジ前に106のDA−3/sec細胞の3回の注射を受けたマウスは、DA−3/TM細胞の増殖だけでなくDA−3/neo細胞の増殖も、ワクチン接種されなかったコントロール群に比べて、予想外に遅延した。注目すべきことに、チャレンジのために使用されたDA−3/TM腫瘍細胞が、移植の時にDA−3/sec細胞と混合された場合(図5)、コントロール群に比べて腫瘍出現の時間が遅延しただけでなく、ワクチン接種されたマウスの50%においてDA−3/TM腫瘍細胞を増殖させない実際の実質的な防御が存在した。さらに、この防御は、MUC1分子の認識に起因しないように見えた。なぜなら、同様の効果が、DA−3/sec細胞でワクチン接種され、かつDA−3/neo乳腺腫瘍細胞およびDA−3/sec乳腺腫瘍細胞の混合物を用いてチャレンジされた動物において見出され得るからである。
DA−3/sec細胞をワクチン接種することが、DA−3乳腺腫瘍バックグラウンドにおける腫瘍以外の腫瘍の増殖に対する防御を付与し得るかどうかを決定するために、さらなる研究を実施した。BALB/cマウスに同系である2つの無関係な腫瘍(すなわち、腎細胞癌株(RENCA)、および骨肉腫(K7細胞株))を、使用した。図7は、DA−3/sec細胞で2回、BALB/cマウスをワクチン接種し、その後RENCA細
胞とDA−3/sec細胞との混合物を用いてチャレンジすることによって、ワクチン接種されないコントロールに比べて、腫瘍の増殖が実質的に減少したことを示す。チャレンジ時におけるDA−3/secの添加は、DA−3/TM細胞実験およびDA−3/neo細胞実験の場合と同様、必要であった。なぜなら、混合されていないRENCA細胞の増殖が、損なわれなかったからである。同様の結果を、K7骨肉腫細胞を使用した実験において得た。図8に見られるように、K7細胞とDA3/sec細胞との混合物を移植されたワクチン接種されないマウスの80%は、チャレンジの21日後までに、腫瘍を出現した。しかし、106のDA−3/sec乳腺腫瘍細胞で2回ワクチン接種されたマウスは、腫瘍の出現がチャレンジの40日後までに遅延し、腫瘍の発達に対する防御を有した。実際、チャレンジの70日後、50%未満のワクチン接種されたマウスが、腫瘍を有した。
分泌形態MUC1がなぜ防御を与えるかについての可能性のある手掛かりは、MUC1膜貫通アイソフォームおよびMUC1分泌アイソフォームの構造の分析から得られた。MUC1/TMアイソフォームおよびMUC1/SECアイソフォーム由来のcDNAの模式図を、図9に示す。これらのcDNAを、図の左側でその5’末端から描く。縦列反復アレイを、縦縞領域によって示し、シグナルペプチド、膜貫通ドメイン、および細胞質ドメインをコードする領域は、それぞれSP、TM、およびCYTによって示され、そして2つの形態において同じ濃淡を有する。MUC1/secアイソフォームの末端のアミノ酸配列は、VSIGLSFPMLPである(3)。重要なことには、これら11アミノ酸の高ストリンジェンシーでのBLASTP1.4.11(6)分析は、任意の公知のタンパク質配列との同一性を有さないヒトLy49Eリガンドと、約50%の同一性を明らかにした。低ストリンジェンシーでは、2つのEchinococcus種由来のグルタチオンS−トランスフェラーゼが、Mycobacterium lepraeの推定タンパク質MLCB4.30および2つの植物種のEFハンドタンパク質(EF hand protein)に対して、いくらかの親和性を示した。このペプチドは、その親水性特性に起因して、高度に抗原性でありそうである。分泌型MUC1アイソフォームでトランスフェクトされたDA−3細胞中のこのペプチドの存在を確かめるために、KLHに結合した独特の11アミノ酸ペプチドに対するニワトリIgY抗体を調製した。この試薬を利用する直接的ELISAを、DA−3/sec培養物の上清中のこのペプチドを検出するために開発した。簡単には、1mlあたり0.2〜10.0μgのタンパク質または無血清培地からの組織培養物上清を含むコーティング緩衝液50μlを、4℃で一晩プレートした。ブロッキング緩衝液を37℃で1時間加え、プレートを3回洗浄し、一次抗体を1時間または一晩インキュベートし;3回洗浄し;二次抗体を(必要な場合1時間)加え、3回洗浄し;可視化溶液を加え;インキュベートし、そして読み取った。既知濃度の精製ペプチドのポジティブコントロールを、全てのアッセイにおいて使用した。試験された全ての培養物は、この分子について陽性であった(データ示さず)。
このペプチドを用いたワクチン接種の潜在的な有利な効果を評価するための実験を、実施した(図10)。DA−3/TM細胞またはDA−3/neo細胞(106細胞)での注射を受けたコントロールマウスは、アジュバント単独の存在下または非存在下に関わらず、100%の腫瘍増殖を生じた。実験マウスは、アジュバントの存在下でKLH結合した独特なペプチドでの注射を、8日間隔で2回受けた。第2の注射の8日後、この動物に、KLH結合ペプチドと腫瘍細胞との混合物を用いて、チャレンジした。DA−3/TM細胞と混合されたペプチドを用いたチャレンジによって、12匹のマウスのうちたった7匹で腫瘍増殖を生じ、さらなる動物が、4週間で腫瘍を発生した。KLH結合ペプチドとDA−3/neo細胞との混合物でワクチン接種されたマウスのチャレンジは、より多くの防御さえももたらし、ほんの40%の動物が腫瘍を生じ、その上、さらに1匹のマウス
が、1ヶ月遅れて腫瘍増殖を示した。重要なことには、生存動物は、DA−3/TM細胞またはDA−3/neo細胞いずれかでの最初のチャレンジの6ヶ月後に、腫瘍の徴候を示さなかった。
さらなる研究において、ペプチドワクチン接種の効果を、2つの他の腫瘍において評価した。図11Aにおいて、このプロトコルが、RENCA細胞がBALB/cマウスに移植された場合、わずかな防御および腫瘍出現の遅延のみを提供することが見られ得る。重要なことには、KLH結合免疫強化ペプチドが、別のマウス株(C57/BL6マウス)でのワクチン接種プロトコルで使用され、非常に侵襲性のLewis肺癌腫でチャレンジされた場合、図11Bにみられるように、防御効果がまた、観察された。
DA−3/sec細胞と混合されたより少数のチャレンジ細胞が、腫瘍増殖に対する防御を提供するためにDA−3/sec細胞に前もってさらす必要性を取り除くかどうかを決定するために、5×105のDA−3/TM細胞を、同量のDA−3/sec細胞と混合し、そしてマウスに投与した。図12に示されるように、この処置によって、いすれのあらかじめのワクチン接種がなくとも、腫瘍発生に対して60%の防御が提供された。
エフェクター細胞がDA−3/sec腫瘍細胞増殖に対して観察された防御に関与するかどうかを決定するために、この細胞を獲得する2週間前に、DA−3/sec腫瘍細胞の接種を受けたマウス由来の脾臓細胞を使用して、51Cr標識化細胞に対する細胞傷害性アッセイを実施した。10×106の脾細胞を、2×105〜2×106のマイトマイシンC(MMC)処理したDA−3/sec細胞の存在下で、5日間培養した。DA−3/secで感作された脾細胞は、DA−3/sec細胞に対して強い細胞溶解活性を示した(図13)。DA−3/secで感作された脾細胞は、DA−3/TM標的、DA−3/neo標的およびDA−3標的に対して、低いレベルの細胞傷害性を有した。これらの結果は、リンパ球の集団が、DA−3/secを用いた刺激の際にインビトロで広がることを示唆し、この刺激は、DA−3/sec標的に対して、強力なエフェクター機能を有する。
免疫系の細胞は、多数の殺傷機構を有し、この殺傷機構には、Fas−Fasリガンド相互作用(7)およびパーフォリン−グランザイム媒介性殺傷(8)が挙げられる。DA−3/sec感作脾細胞を、抗Fas抗体またはコンカナマイシン(Concanamycin)A(CMA)(パーフォリン媒介性殺傷をブロックするH+ ATPアーゼのブロックを介する小胞酸性化のインヒビター(9))で処理した。CMAは、用量依存様式で、DA−3/sec標的の殺傷を効率的にブロックした(図14)のに対して、細胞傷害性に対する効果は、抗Fas抗体の添加では観察されなかった(図15)。これらの結果は、Fas/FasLが、DA−3/sec細胞の細胞傷害性において役割を果たさないが、Fas/FasLが、パーフォリン−グランザイム経路を介して媒介されることを示す。
インビボでのDA−3/sec細胞への曝露によって、YAC−1標的細胞(古典的なマウスNK標的細胞)(10)に対してより高いNK活性を生じるかどうかを決定するために、正常な脾細胞を、溶解を誘導するその能力に関して、DA−3/sec細胞にインビボで3日間または10日間曝された脾細胞と比較する実験を実施した。図16に見られるように、アッセイ3日前にDA−3/sec細胞を注射されたBALB/cマウス由来
の脾臓細胞は、正常なマウス由来の脾臓細胞と比較して、いくらかより高いレベルのYAC−1細胞に対する溶解活性を有する。この強化されたNK反応性は、試験10日前にDA−3/sec細胞でワクチン接種されたマウスにおいて、より明白である。
本発明者らの実験室における他の予備的な研究によって、ヒトMUC1分泌形態によってトランスフェクトされたDA−3細胞が、インビボおよびインビトロの両方で、エフェクター細胞をDA−3/sec細胞に対して応答するように刺激するが、膜貫通形態は刺激しないことが示唆された。上に挙げられたように、MUC1/secタンパク質のC末端上には、独特な11アミノ酸ペプチドが存在するが、MUC1/TMタンパク質上には存在しない。このペプチド(「免疫強化ペプチド」、すなわちIEPと称される)に対応する合成ペプチドが作製され、このペプチドは、それがワクチン接種プロトコルで使用される場合、DA3、DA−3/neo、DA3−TM、K7骨肉種、RENCA、およびLewis肺癌腫細胞に対する防御効果を有することが見出された。本発明者らは、細胞傷害性に対するこのペプチドの潜在的な効果を調査した。本発明者らは、このペプチドを、なお別の腫瘍モデル(すなわち、D1−DMBA−3乳腺腫瘍保有マウス)で試験した。このDA−3細胞株は、もともとこの腫瘍から得られ、本発明者らの実験室で同系のBALB/cマウスにおいてインビボで、慣用的に経代される。図17において、正常なマウスまたはD1−DMBA−3腫瘍保有マウスのいずれかから得た脾細胞へのインビトロでのMUC1/secの独特なペプチドの5日間の添加によって、DA−3/sec腫瘍標的に対する有意なレベルの細胞傷害性が生じたことが見られ得る。重要なことには、上記のプロトコルに類似するワクチン接種プロトコルは、D1−DMBA−3腫瘍の増殖に対する有意な防御を与えた。このNK細胞アッセイにおいて、このペプチドが免疫細胞を刺激する能力を、試験した。このアッセイは、DA−3/sec腫瘍がヌードマウス中での増殖の初期段階の間に抑制されるという観察に基づいて選択され、この観察は、生得的な免疫成分が、DA−3/secに対する即座の反応に関与し得ることを示唆した。従って、免疫強化ペプチド(IEP)の免疫調節活性を試験するために、BALB/c脾細胞を、10μgのIEPを用いて、30〜45分間前処理し、その後クロム標識YAC−1標的またはクロム標識EL−4標的を、以前に記載される(11)ように4時間のアッセイに添加した。図18に見られるように、ペプチド添加によって、古典的なマウスNK標的細胞(YAC−1)に対する正常な脾細胞からの、細胞傷害性レベルの上昇を生じた。さらに、EL−4標的細胞(これは、正常な脾臓細胞によるNK型の細胞傷害性に対して感受性ではない)は、免疫強化ペプチドに前もって曝露された場合、これらのエフェクターによって容易に溶解可能であった。他の実験において、本発明者らは、正常なBALB/cマウスまたはC57 BL/6(B6)マウス由来の脾臓エフェクター細胞を活性化して、MUC1/sec独特ペプチドへの前もっての曝露によって、DA−3/sec標的細胞を殺傷し得た(図19)。
観察された細胞傷害性が、この独特の11アミノ酸ペプチドの腫瘍細胞に対する直接の毒性効果に起因することを議論し得る。この可能性を試験するために、本発明者らは、高レベルのIEPを、いくつかの腫瘍標的にインビトロで加え、4日後の培養物中での細胞生存性を決定した。表3に見られるように、細胞がインビボで曝されるペプチドレベル、すなわちエフェクター細胞媒介性細胞傷害性アッセイにおけるペプチドレベルよりもずっと高いペプチドレベルでのそのような処置によって、腫瘍細胞に対する増殖の阻害も細胞殺傷活性も引き起こされなかった。
24日後の培養物中の総細胞
(結論)
本明細書中に開示されるデータによって、MUC1遺伝子の新規分泌型アイソフォーム(MUC1/sec)のトランスフェクションが、BALB/cマウスにおいて、侵襲性の免疫原性を確立された腫瘍細胞株の増殖が防止することが示される。ワクチン接種プロトコルで使用される場合、このMUC1/secは、非特異的な様式で、同系腫瘍に対する防御を提供し得る。MUC1/sec分子に存在する独特の11アミノ酸ペプチドは、この防御効果に関与し、そしてワクチン接種プロトコルで使用される場合、このペプチドは、種々の腫瘍細胞株に対して効果的に作用し得る。このデータはまた、生来の免疫系および/または適応性免疫系のエフェクター細胞による細胞傷害性が、この観察された結果に関与することを示唆する。このペプチドの効果は、所定の型の腫瘍またはマウス株に限定されないので、このペプチドは、単独での使用および/または種々の広範な腫瘍に対する他の免疫調節分子と組合わせての使用が可能であるはずである。このペプチドを注射された動物において、毒性は検出されなかった。このIEPの広い範囲の作用によって、腫瘍に対してだけでなく、HIV、B型肝炎およびC型肝炎のようなウイルス性または細菌性の疾患、ならびに他の微生物感染(例えば、結核)に対してのこの薬剤の使用もまた可能になり得、ここで免疫応答の強化は、曝露された個体において陽性の効果を有し得る、
本発明の好ましい実施形態を記載することにおいて、特定の用語を明瞭さのために使用する。しかし、本発明は、そのように選択された特定の用語に限定されることを意図しない。各特定の要素が、全ての技術的等価物を含み、類似する目的を達成するために同様の様式で影響を作用することが理解されるべきである。
Claims (1)
- アミノ酸配列VSIGLSFPMLP(配列番号1)を含む単離されたペプチドまたはポリペプチドあるいはそのアナログまたは誘導体であって、該ペプチドまたはポリペプチドは、哺乳動物に投与された場合、抗原に対する免疫応答を増強する特性を有する、ペプチドまたはポリペプチド。
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