JP2005221423A - 表面プラズモン共鳴抗体アレイセンサ作製用基板及びその作製方法 - Google Patents
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Abstract
【課題解決手段】
一級アミノ基を高密度に有する基材上の一級アミノ基、もしくは、繰返し構造中に有するポリマー化合物を平面状基材表面に導入した基材上のポリマー化合物の一級アミノ基に、抗体結合タンパク質もしくはペプチド主鎖のカルボキシル末端を結合させて、該タンパク質もしくはペプチドが高密度にかつ均一に配向した状態で整列固定化された基材を提供することにより、高密度に抗体が結合した抗体アレイセンサを作製する。
Description
そこで、本発明はこれまでのアレイセンサ、特に実用上有用な抗体アレイセンサにおける上記問題1.の単位面積あたりの結合量の向上、ならびに上記問題2.のタンパク質の固定化における結合機能阻害の克服に関して抜本的解決を与えることを目的としている。
(1)検出部表面上の特定領域に抗体結合性タンパク質あるいはペプチドを整列固定化させたことを特徴とする表面プラズモン共鳴抗体アレイセンサ作製用アレイ基板。
(2)検出部表面上の特定領域に抗体結合性タンパク質あるいはペプチド整列固定化させた基板を用いて、抗体タンパク質を整列固定化させたことを特徴とする表面プラズモン共鳴抗体アレイセンサ。
(3)抗体結合性タンパク質あるいはペプチドのカルボキシ末端をリンカー配列を介して、一級アミノ基を有するセンサ検出部上のリンカー分子とアミド結合で固定化することにより得られ、一般式(1)
NH2-R1-CO-NH-R2-CO-NH-Y-Z (1)
で表されることを特徴とする表面プラズモン共鳴抗体アレイセンサ作製用アレイ基板。
[上記式中、R1は、抗体結合性タンパク質もしくはペプチドのアミノ酸配列、R2は任意のリンカー配列のアミノ酸配列、Yはリンカー分子、Zはセンサ検出部表面基材を表す]
(4)上記(3)記載の一級アミノ基を有するリンカー分子が、
一般式(2)
(NH2-X)n (2)
で示される一級アミノ基を有するポリマー化合物を含む分子である(但し、式中Xは、ポリマー化合物の繰り返し単位の一級アミノ基以外の残基を表し、nは2以上の整数を表す。)ことを特徴とする表面プラズモン共鳴抗体アレイセンサ作製用アレイ基板。
(5)上記(4)の一般式(2)で表されるポリマー化合物が、ポリアリルアミンであることを特徴とする表面プラズモン共鳴抗体アレイセンサ作製用アレイ基板
(6)上記(4)の一般式(2)で表されるポリマー化合物が、ポリリジンであることを特徴とする表面プラズモン共鳴抗体アレイセンサ作製用アレイ基板。
(7)一級アミノ基を有する検出部表面上の特定領域に、一般式(3)
NH2-R1-COOH
(3)
〔式中、R1はタンパク質もしくはペプチドのアミノ酸配列を表す。〕
で示される抗体結合性タンパク質もしくはペプチドを整列固定化した上記(1)記載の表面プラズモン共鳴抗体アレイセンサ作製用アレイ基板を作成する方法であって、一級アミノ基を有する基材上に整列配置、吸着された、一般式(4)
NH2-R1-CO-NH-CH(CH2-SCN)-CO-NH-R2-COOH ・・・・ (4)
〔式中、R1は抗体結合性タンパク質もしくはペプチドのアミノ酸配列を表し、R2は中性付近で強く負に荷電しかつ一般式(3)で表されるタンパク質もしくはペプチドの等電点を酸性にし得るアミノ酸配列を表す。〕
で示されるタンパク質もしくはペプチドと、該センサ上のリンカー分子の一級アミノ基に、一般式(3)のタンパク質主鎖のカルボキシ末端をペプチド結合させたうえで、該抗体結合性タンパク質もしくはペプチドにより抗体分子を結合させてなることを特徴とする表面プラズモン共鳴抗体アレイセンサ作製用アレイ基板の作成方法。
(8)上記(7)の一級アミノ基を有するリンカー分子が、一般式(2)で示される一級アミノ基を有するポリマー化合物を含む分子であることを特徴とする表面プラズモン共鳴抗体アレイセンサ作製用アレイ基板。
(9)一般式(2)で表されるポリマー化合物が、ポリアリルアミンであることを特徴とする表面プラズモン共鳴抗体アレイセンサ作製用アレイ基板の作製方法。
(10)一般式(2)で表されるポリマー化合物が、ポリリジンであることを特徴とする表面プラズモン共鳴抗体アレイセンサ作製用アレイ基板の作製方法。
(11)酸・アルカリ・塩溶液等を用いた抗体分子の脱着再生操作を施すことにより繰り返し同質の測定を可能としたことを特徴とする上記(2)記載の表面プラズモン共鳴抗体アレイセンサを用いた抗原分子の測定方法。
(12)上記(2)記載の表面センサを検出部に用いること、ならびに上記(11)項記載の繰り返し再生操作を適用することを特徴とし、試料測定回ごとに検出部表面の自動的再生処理を行う自動送液装置、および検出により生成される測定データの自動的収集ならびにデータ処理を可能にするデータ処理装置を一体として備えた表面プラズモン共鳴抗体アレイセンサの自動測定システム。
本発明は、非標識分子検出が可能な表面プラズモン共鳴アレイセンサの検出部金属表面のリンカー分子の一級アミノ基に抗体結合性タンパク質を吸着させ、また、さらに該一級アミノ基に該タンパク質主鎖のカルボキシ末端を、シアノシステイン残基を介したアミド結合形成反応を利用して結合させることにより、該基材上に該タンパク質を整列固定化して、抗体結合性タンパク質を抗体捕捉用足場分子とした抗体捕捉用アレイセンサ基材を調製したのち、複数かつ任意の抗体分子を該基材上のそれぞれの特定微小領域に配された抗体結合性タンパク質により捕捉させ、抗体アレイセンサを構築するものである。
本発明においては、アレイセンサ基材上の極めて小さな領域において、高密度かつその機能を保持したまま均一な配向状態で固定化でき、しかるにその高密度かつ均一配向した抗体結合性タンパク質により捕捉された抗体分子もまた、該蛋白質−抗体分子間の結合が、抗体分子の抗原結合機能を司る部位ではなく定常領域と呼ばれる結合機能とは無関係の部位にて確実に達成できることから、均一な配向をもって高密度にアレイセンサ上の特定領域に固定化できる。
すなわち、このような高度に均一な配向と高い密度を同時に達成できる本発明により、固定化された抗体分子は個々の分子が最大限に抗原結合機能を発揮することができ、単位面積あたりの分子数が増大するため、表面プラズモン共鳴アレイセンサでの感度不足が改善し、かつ再現性の高い測定が可能となる。
本発明の上記課題を達成するためには、まずアレイセンサ基材として、負に帯電した抗体結合タンパク質をイオン相互作用により吸着できるに十分な一級アミノ基を露出した表面構造が要求される。この性能を満たす基材の構成としては、表面プラズモン共鳴アレイセンサが元来備える検出部の金属(主に金)表面の上に一級アミノ基をバルク水側に露出し、かつ金属とも共有結合で結合できる二価性の低分子化合物であるリンカー分子の介在が望ましい。このようなリンカー分子は既によく研究され、また市販化もされているが、以下の一般式で示される。
X-A-Y (4)
[上式(4)中のXはチオール(HS-)、ジスルフィド(Y-A-SS-, Y’-A’-SS-)、スルフィド(Y-A-S-,Y’-A’-S-)、セレノール(HSe-)、ジセレナイド(Y-A-SeSe-,Y’-A’-SeSe-)、セレナイド(Y-A-Se-,Y’-A’-Se-)等があげられ、これらの例では硫黄原子あるいはセレン原子と金との間で自発的共有結合が形成される。Aは飽和炭化水素鎖((CH2)n)やエチレングリコール重合体((CH2-CH2-O-)n)を表す(nはそれぞれ2以上の整数)が、部分的に不飽和結合(2重結合等)が挿入されることがある。Yはここでは一級アミノ基である。なお、Y’はYに適合する残基である場合もあるが、それ以外の親水基でもよい。後者の場合、結合反応には関与しない。]
一級アミノ基を繰返し構造中に有するポリマー化合物としては、例えば、ポリアルキレン鎖、ポリアミド鎖、ポリエステル鎖、ポリスチレン鎖等を有するもの等が挙げられ、以下の一般式で表される繰り返し構造を有する。
(X-NH2)n (5)
〔 上記式(5)中、Xは、例えば、ポリアルキレン鎖、ポリアミド鎖、ポリエステル鎖、ポリスチレン鎖等を構成するモノマー残基を表す。また、NH2基は、該モノマー残基中に含まれる基であってもよいし、これらポリマー化合物の主鎖から分枝した側鎖中に含まれる基であってもよい。nは2以上の整数を指す。〕
本発明において固定化に供される抗体結合性タンパク質もしくはペプチドとしては、抗体分子に対して結合能を有するものであれば何でも用いることができる。
抗体分子に結合能を有するタンパク質としては、
NH2-R1-COOH (6)
[上記式中、R1は、抗体分子に結合能を有するタンパク質もしくはペプチドのアミノ酸配列を表す]
で表すことができる。
一般式(7)
NH2-R1-CO-NH-R2-CO-NH-CH(CH2-SH)-CO-NH-R3-COOH (7)
で示される固定化用のタンパク質を作製する必要がある。これらの一般式中、R3は、中性付近で強く負に荷電し、且つNH2-R1-CO-NH-R2-CO-NH-CH(CH2-SH)-CO-NH-R3-COOHの等電点を酸性にできる任意のアミノ酸残基の連鎖を表す。R1は、上述の抗体分子に結合能を有するタンパク質もしくはペプチドのアミノ酸配列である。R2は、上記一般式(1)で示される固定化しようとするタンパク質と金属表面上の両親媒性のリンカー分子との間を延長するリンカーペプチドとなる。R2のアミノ酸配列は任意でありその種類、数ともに限られないが、例えばGly-Gly-Gly-Gly等を用いることができる。このような融合タンパク質は、上記一般式(6)で示されるタンパク質をコードする遺伝子と
一般式(8)
NH2-R2-CO-NH-CH(CH2-SH)-CO-NH-R3-COOH (8)
[上記式中、R2およびR3は上記の意味を有する。]
で示されるペプチド配列をコードする遺伝子とを結合することにより、一般式(7) NH2-R1-CO-NH-R2-CO-NH-CH(CH2-SH)-CO-NH-R3-COOHで示される融合タンパク質をコードする遺伝子を作製し、これを大腸菌などの宿主生物で発現させ、その後、発現したタンパク質を分離精製することにより得ることができる。
37-45 (1992)参照)を利用することにより、実施することができる。あるいは、上記融合タンパク質は、遺伝子工学的手法と慣用のタンパク質合成技術との組み合わせ、または、蛋白合成技術のみによっても作製することができる。
上記一般式(7)および(8)におけるR3としては、アスパラギン酸やグルタミン酸を多く含む配列が好適である。好ましくは、上記一般式(7)および(8)の物質の等電点を4から5の間の値になるように、アスパラギン酸やグルタミン酸を多く含む配列をデザインすればよい。そのような配列のうち好適な列としてアラニル-ポリアスパラギン酸をあげることができる。シアノシステイン残基の次のアミノ酸残基をアラニンにすることにより、シアノシステイン残基を介したアミド結合形成反応が生じやすいことと、アミノ酸側鎖の中でアスパラギン酸のカルボキシル基が最も酸性であるからである。
Staphylococcus aureus由来のプロテインAは、アミノ酸配列が著しく類似したA,B,C,D,Eと名付けられた5つのドメインとそれに付随した配列により構成されている。それらの各々のドメインは、57アミノ酸で構成されるが、それぞれ単独でも安定な構造をとり、例えば大腸菌において大量発現させることができる。また、各ドメインは、単独で抗体分子との結合能を発揮できる。その結合の強さは、天然由来のプロテインA全体部分よりも弱まるが、ドメインを2つ連結したものでは、天然由来のプロテインA全体部分とほぼ同程度である。そこで、プロテインAのドメインに着目して、単独ドメイン(これをモノマーと称する)とドメインを2つ連結したもの(これをダイマーと称する)の2種類について、固定化に供するための配列を設計した。
配列番号1
Ala Asp Asn Asn Phe Asn Lys
Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg
Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu
Ala Lys Lys Leu Asn Glu Ser Gln Ala Pro Lys Gly Gly Gly Gly Cys Ala Asp Asp Asp
Asp Asp Asp
配列表2
Ala Asp Asn Asn Phe Asn Lys
Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg
Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ser Glu
Ala Lys Lys Leu Asn Glu Ser Gln Ala Pro Lys Ala Asp Asn Asn Phe Asn Lys Glu Gln
Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Gly
Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ser Glu Ala Lys
Lys Leu Asn Glu Ser Gln Ala Pro Lys Gly Gly Gly Gly Cys Ala Asp Asp Asp Asp Asp
Asp
配列番号3
Ala Asp Asn Asn Phe Asn Lys
Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg
Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu
Ala Lys Lys Leu Asn Glu Ser Gln Ala Pro Lys
配列番号4
Ala Asp Asn Asn Phe Asn Lys
Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg
Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ser Glu
Ala Lys Lys Leu Asn Glu Ser Gln Ala Pro Lys Ala Asp Asn Asn Phe Asn Lys Glu Gln
Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Gly
Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ser Glu Ala Lys
Lys Leu Asn Glu Ser Gln Ala Pro Lys Gly Gly Gly Gly Cys Ala Asp Asp Asp Asp Asp
Asp
配列番号5
Gly Gly Gly Gly
Cys Ala Asp Asp Asp Asp Asp Asp
配列番号1及び配列番号2に示すタンパク質をコードする配列の例として、それぞれ配列番号6及び配列番号7に示す塩基配列があげることができる。
配列番号6
ATGGCTGATAACAATTTCAACAAAGAACAACAAAATGCTTTCTATGAAATCTTGAATATGCCTAACTTAAACGAAGAACAACGCAATGGTTTCATCCAAAGCTTAAAAGATGACCCAAGCCAAAGTGCTAACCTATTGTCAGAAGCTAAAAAGTTAAATGAATCTCAAGCACCGAAAGGTGGCGGTGGCTGCGCTGATGACGATGACGATGACTAA
配列番号7
ATGGCTGATAACAATTTCAACAAAGAACAACAAAATGCTTTCTATGAAATCTTGAATATGCCTAACTTAAACGAAGAACAACGCAATGGTTTCATCCAAAGCTTAAAAGATGACCCAAGCCAAAGTGCTAACCTATTGTCAGAAGCTAAAAAGTTAAATGAATCTCAAGCACCGAAAGCTGATAACAATTTCAACAAAGAACAACAAAATGCTTTCTATGAAATCTTGAATATGCCTAACTTAAACGAAGAACAACGCAATGGTTTCATCCAAAGCTTAAAAGATGACCCAAGCCAAAGTGCTAACCTATTGTCAGAAGCTAAAAAGTTAAATGAATCTCAAGCACCGAAAGGTGGCGGTGGCTGCGCTGATGACGATGACGATGACTAA
アミノ酸をコードする塩基配列は縮退しており、複数のコドンがある1つのアミノ酸残基に対応することから、配列表1及び配列表2に示すタンパク質をコードする配列は、配列表6及び配列表7に限定されず、可能なコドンの組み合わせの数だけ存在する。
配列番号8
GGATCCTTGACAATATCTTAACTATCTGTTATAATATATTGACCAGGTTAACTAACTAAGCAGCAAAAGGAGGAACGACTATGGCTGATAACAATTTCAACAAAGAACAACAAAATGCTTTCTATGAAATCTTGAATATGCCTAACTTAAACGAAGAACAACGCAATGGTTTCATCCAAAGCTTAAAAGATGACCCAAGCCAAAGTGCTAACCTATTGTCAGAAGCTAAAAAGTTAAATGAATCTCAAGCACCGAAAGGTGGCGGTGGCTGCGCTGATGACGATGACGATGACTAAGAATTC
配列番号9
GGATCCTTGACAATATCTTAACTATCTGTTATAATATATTGACCAGGTTAACTAACTAAGCAGCAAAAGGAGGAACGACTATGGCTGATAACAATTTCAACAAAGAACAACAAAATGCTTTCTATGAAATCTTGAATATGCCTAACTTAAACGAAGAACAACGCAATGGTTTCATCCAAAGCTTAAAAGATGACCCAAGCCAAAGTGCTAACCTATTGTCAGAAGCTAAAAAGTTAAATGAATCTCAAGCACCGAAAGCTGATAACAATTTCAACAAAGAACAACAAAATGCTTTCTATGAAATCTTGAATATGCCTAACTTAAACGAAGAACAACGCAATGGTTTCATCCAAAGCTTAAAAGATGACCCAAGCCAAAGTGCTAACCTATTGTCAGAAGCTAAAAAGTTAAATGAATCTCAAGCACCGAAAGGTGGCGGTGGCTGCGCTGATGACGATGACGATGACTAAGAATTC
配列番号10
TTGACAATATCTTAACTATCTGTTATAATATATTGACCAGGTTAACTAACTAAGCAGCAAAAGGAGGAACGACT
に示す配列を開始コドンの上流に結合させると共に、5’末端に制限酵素BamHIの認識切断配列、及び、3’末端に制限酵素EcoRIの認識切断配列を結合させ、ベクターDNAに導入できるようにした配列である。
配列番号8及び配列番号9に示す配列は、いくつかの断片を化学合成した後、PCR法もしくはDNAリガーゼなどの酵素を用いることにより、人工合成することができる。
次に、本発明においては、上記のようにして調製した固定化用抗体結合性タンパク質をタンパク質アレイ用基材に配置、吸着させるが、その方法には特に制限はなく、基材上の特定の領域にタンパク質溶液をスポットできる方法であればいかなる方法も用い得る。例えば、ピン等の針状物、インクジェット、キャピラリー等を用いる方法があるが、いずれの方法を用いてもよい。また、ピッキングロボットを用いることも可能である。以下に一例として、キャピラリーを用いてスポットする方法について詳述する。
別法として説明するように、上記スポットしたタンパク質を吸着固定化させることによりそのままタンパク質アレイとしてもよいが、この段階ではあくまでも静電相互作用等非共有結合によりタンパク質が基材に結合しており、結合強度が低いので、タンパク質を強固に固定化するためには、更に、タンパク質のカルボキシ末端のカルボキシル基と基材上のポリマーの一級アミノ基との間にアミド結合を形成させる。その反応を起こさせるためには、固定化用タンパク質のカルボキシ末端に導入したシステイン残基のスルフヒドリル基をシアノ化しシアノシステインに変換する必要がある。
NH2-R1-CO-NH- R2-CO-NH-CH(CH2-SCN)-CO-NH-R3-COOH ・・・(9)
[上記式中、R1、R2、R3は一般式(7)のR1、R2、R3とそれぞれ同じであり、R1は任意のアミノ酸配列を、、R2はリンカーペプチドを、R3は中性付近で強く負に荷電しかつ一般式(7)の化合物の等電点を酸性にし得るアミノ酸配列を表す。]
NTCBを用いたシアノ化は、pH7.0の10mM燐酸緩衝液中で効率よく行うことができる。このシアノ化反応の後、溶媒を弱アルカリにすることにより、固定化反応が進行する。即ち、シアノシステイン残基直前のアミノ酸残基のカルボキシル基と担体の一級アミノ基との間にアミド結合が形成される。このことは、緩衝液をpH9.5の10mM硼酸緩衝液に換えること等で可能である。
本実施例においては、一級アミンを表面に露出している表面プラズモン共鳴アレイセンサとして、東洋紡製の機器、Multi SPRinterに付属するNH2−チップあるいはCOOH−チップを利用し、これを該機器に装着して検討した。これらのチップではそれぞれ、チップ上の金属表面を98カ所の微小領域に分割し、該領域にアミノ基あるいはカルボキシル基を末端に有し、反対側の末端にチオール基を有するポリエチレングリコール(PEG)分子により、単層の安定なSAM表面を用意している。一級アミノ基を繰り返し構造中に有するポリマー化合物として、シグマ−アルドリッチで市販しているポリ−L−リジンを用いた。
〔1〕COOH−チップを用いた比較実験のための抗体分子直接非配向固定化により構築した従来型アレイセンサの作製
COOH−チップ上に0.2 M EDC (N-ethyl-N’-[3-(dimethylamino)propyl]carbodiimide)
/ 0.05 M NHS (N-Hydroxysuccinimide)の混和水溶液を全体を覆うように滴下して1時間静置し、表面カルボン酸を活性化させた。純水にて表面をすすいだ後、HEPES緩衝液(0.05 M HEPES (pH 7.4) + 0.2 M NaCl)に溶解させた100 μg/mL 抗ヒツジIgG抗体ウサギ由来抗体を滴下して2時間作用させた。純水にて表面をすすいだ後、1.0 M エタノールアミン塩酸塩水溶液(pH 8.5)を30分作用させ、未反応カルボン酸活性化体を不活性化した。
COOH−チップ上に0.2 M EDC (N-ethyl-N’-[3-(dimethylamino)propyl]carbodiimide)
/ 0.05 M NHS (N-Hydroxysuccinimide)の混和水溶液を、全体を覆うように滴下して1時間静置し、表面カルボン酸を活性化させた。純水にて表面をすすいだ後、1 %のポリ−L−リジン(分子量:15万〜30万)を含む水溶液を、東洋紡製のピン型自動スポッティング装置を用いて、表面プラズモン共鳴アレイセンサの微小領域にスポッティングし、密閉した容器の中で湿度を80%に保つことにより、2時間静置した。1.0
M KClにて表面を5回洗浄した後、1.0 M エタノールアミン塩酸塩水溶液(pH 8.5)を30分作用させ、未反応カルボン酸活性化体を不活性化した。このように構築したポリマー修飾済のSPRセンサチップをMulti
SPRinterのフローセルに装着し、10 μg/mLの末端に負に荷電するアミノ酸とシステイン残基を加えた組換えプロテインA分子をフローセル中に1時間通液循環させ、イオン的相互作用によるタンパク質末端とポリマー中の一級アミノ基との結合を促進した。この後5
mM NTCB溶液(pH 7.0)を1時間通液循環させてプロテインA中のシステイン残基をシアノ化した後、10 mM 硼酸緩衝液(pH 9.5)を1時間通液循環させてシアノ化システイン残基を介したプロテインAタンパク質のC末端の主鎖固定化反応を促進させた。最後に1.0
M KClにて表面を5回洗浄して共有結合が形成できなかった未反応タンパク質を洗い流してアレイセンサ基材を作製した。この基材をフローセル内にとどめたまま、10 μg/mL
抗ヒツジIgG抗体ウサギ由来抗体を通液循環させて、表面のプロテインA分子に結合させることにより、本発明による表面プラズモン共鳴抗体アレイセンサを完成させた。
上記〔1〕、〔2〕でそれぞれ作成した従来法ならびに本発明による表面プラズモン共鳴抗体アレイセンサを比較するため、2つのアレイセンサを別途フローセルに納め、10 μg/mL抗ウシ・アルブミンヒツジ抗体(フナコシ)を通液循環により作用させて反応を観測した(図1)。図から明快なように、従来型の固定化法(非配向)にて抗体分子を固定化させた表面(図中曲線A)では、検出限界に近い小さなシグナルしか観測できなったが、本発明によるアレイセンサ(図中曲線B)では、配向制御固定化法による実効感度の向上を反映して遙かに大きなシグナルが観測されており、本発明による表面プラズモン共鳴アレイセンサ構築技術の妥当性を示している。
Claims (12)
- 検出部表面上の特定領域に抗体結合性タンパク質あるいはペプチドを整列固定化させたことを特徴とする表面プラズモン共鳴抗体アレイセンサ作製用アレイ基板。
- 請求項1記載の表面プラズモン共鳴抗体アレイセンサ作製用アレイ基板上の抗体結合性タンパク質あるいはペプチドを介して、抗体タンパク質を整列固定化させたことを特徴とする表面プラズモン共鳴抗体アレイセンサ。
- 抗体結合性タンパク質あるいはペプチドのカルボキシ末端をリンカー配列を介して、一級アミノ基を有するセンサ検出部上のリンカー分子とアミド結合で固定化することにより得られ、一般式(1)
NH2-R1-CO-NH-R2-CO-NH-Y-Z
(1)
で表されることを特徴とする請求項1記載の表面プラズモン共鳴抗体アレイセンサ作製用アレイ基板。
[上記式中、R1は、抗体結合性タンパク質もしくはペプチドのアミノ酸配列、R2は任意のリンカー配列のアミノ酸配列、Yはリンカー分子、Zはセンサ検出部表面基材を表す] - 請求項3の一級アミノ基を有するリンカー分子が、
一般式(2)
(NH2-X)n (2)
で示される一級アミノ基を有するポリマー化合物である(但し、式中Xは、ポリマー化合物の繰り返し単位の一級アミノ基以外の残基を示し、nは2以上の整数を表す。)ことを特徴とする請求項3に記載の表面プラズモン共鳴抗体アレイセンサ作製用アレイ基板。 - 請求項4の一般式(2)で表されるポリマー化合物が、ポリアリルアミンであることを特徴とする請求項4に記載の表面プラズモン共鳴抗体アレイセンサ作製用アレイ基板。
- 請求項4の一般式(2)で表されるポリマー化合物が、ポリリジンであることを特徴とする請求項4に記載の表面プラズモン共鳴抗体アレイセンサ作製用アレイ基板。
- 一級アミノ基を有する検出部表面上の特定領域に、一般式(3)
NH2-R1-COOH
(3)
〔式中、R1はタンパク質もしくはペプチドのアミノ酸配列を表す。〕
で示される抗体結合性タンパク質もしくはペプチドを整列固定化した表面プラズモン共鳴抗体アレイセンサ作製用アレイ基板を作成する方法であって、一級アミノ基を有する基材上に整列配置、吸着された、一般式(4)
NH2-R1-CO-NH-CH(CH2-SCN)-CO-NH-R2-COOH ・・・・ (4)
〔式中、R1は抗体結合性タンパク質もしくはペプチドのアミノ酸配列を表し、R2は中性付近で強く負に荷電しかつ一般式(3)で表されるタンパク質もしくはペプチドの等電点を酸性にし得るアミノ酸配列を表す。〕
で示されるタンパク質もしくはペプチドと、該センサ上のリンカー分子の一級アミノ基に、一般式(3)のタンパク質主鎖のカルボキシ末端をペプチド結合させたうえで、該抗体結合性タンパク質もしくはペプチド結合させてなることを特徴とする、表面プラズモン共鳴抗体アレイセンサ作製用アレイ基板の作製方法。 - 請求項7の一級アミノ基を有するリンカー分子が、
一般式(2)で示される一級アミノ基を有するポリマー化合物を含む分子であることを特徴とする請求項7記載の表面プラズモン共鳴抗体アレイセンサ作製用アレイ基板の作製方法。 - 請求項7の一般式(2)で表されるポリマー化合物が、ポリアリルアミンであることを特徴とする請求項7記載の表面プラズモン共鳴抗体アレイセンサ作製用アレイ基板の作製方法。
- 請求項7の一般式(2)で表されるポリマー化合物が、ポリリジンであることを特徴とする請求項7記載の表面プラズモン共鳴抗体アレイセンサ作製用アレイ基板の作製方法。
- 酸・アルカリ・塩溶液等を用いた抗体分子の脱着再生操作を施すことにより繰り返し同質の測定を可能としたことを特徴とする、請求項2に記載の表面プラズモン共鳴抗体アレイセンサを用いた抗原分子の測定方法。
- 請求項2の表面センサを検出部に用いること、ならびに請求項11記載の繰り返し再生操作を適用することを特徴とし、試料測定回ごとに検出部表面の自動的再生処理を行う自動送液装置、および検出により生成される測定データの自動的収集ならびにデータ処理を可能にするデータ処理装置を一体として備えた表面プラズモン共鳴抗体アレイセンサの自動測定システム。
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