JP2005220040A

JP2005220040A - 新規抗真菌物質ｆａ２００ｂ

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Publication number: JP2005220040A
Application number: JP2004027250A
Authority: JP
Inventors: Masaru Ishihara; 勝石原; Kenichi Kaida; 健一開田; Ryosuke Fudo; 亮介不藤; Atsushi Sumitomo; 敦住友; Hajime Kojika; 小鹿　　一
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 2004-02-03
Filing date: 2004-02-03
Publication date: 2005-08-18

Abstract

【課題】
強力な抗真菌活性を有し、動物・植物細胞に対する細胞毒性が低く、しかも、工業的大量生産の容易な新規抗真菌物質を見出すこと。
【解決手段】
下記の化学構造式で表されることを特徴とする新規抗真菌物質ＦＡ２００Ｂ又はその塩を提供する。
【化１】

新規抗真菌物質ＦＡ２００Ｂ又はその薬理学的に許容される塩は、農薬又は抗真菌薬として使用することができる。
【選択図】
なし

Description

本発明は新規抗真菌物質ＦＡ２００Ｂ、それを含む培養物及びそれを生産する微生物による製法並びにその用途に関する。更に詳しくは、本発明は新規抗真菌物質ＦＡ２００Ｂ及びこれを有効成分として含有する抗真菌薬に係わり、特に水生糸状菌に属する微生物を培養した培養物より抽出した新規抗真菌物質ＦＡ２００Ｂ及びこの化合物を有効成分とする農薬又は抗真菌薬に関する。

従来より、カンジダ属、アスペルギルス属、トリコフィートン属等の真菌類を病原体とする真菌症に対しては様々な抗真菌薬が用いられている。このような抗真菌薬としては現在アンホテリシン、ミコナゾ−ル、グリセオフルビン等が知られている。

しかし、既存の抗真菌薬には薬剤耐性の問題等もあり、各種糸状菌に対して効果を示す抗真菌薬の開発が求められている。農薬の分野においても真菌症は経済的にも重要な病害であり、上記の耐性の問題に加えて、毒性が低く環境中への残存性の低い新しい農薬が求められている。又、従来の抗真菌薬は抗真菌活性は有するものの、動物細胞等の真核細胞一般に対する細胞毒性が強い。従って、使用に際して十分な量を投与することができず、必ずしも十分な治療効果を上げることができない。このため強力な抗真菌活性を有するとともに、他の動物細胞等に対する細胞毒性の低い物質が要望されていた。

なお、水生糸状菌が産生する抗生物質については以下のような報告があるが（例えば、非特許文献１及び２参照）、これらの抗生物質は本発明の化合物とは基本骨格が異なり、細菌に対する効果はあるものの、真菌類に対してはほとんど効果が認められない。

Hyuncheolら、J. Nat. Prod. 2003年、第66巻、p.73-79 Chen Liら、J. Nat. Prod. 2003年、第66巻、p.1302-1306

本発明は上述した点に鑑みてなされたものであり、強力な抗真菌活性を有し、動物・植物細胞に対する細胞毒性が低く、しかも、工業的大量生産の容易な新規抗真菌物質ＦＡ２００Ｂ及びこれを有効成分とする農薬及び抗真菌薬を提供することを目的とする。しかしながら、本発明によって見出された化合物は新規化合物であるため、上記非特許文献等は本発明の技術的背景となる一般的技術水準を示すものに過ぎず、本発明が解決しようとする課題と直接関連するものではない。

本発明者は上記目的を達成するため、鋭意研究を続けた結果、ベヴェルヴィケラ（Beverwykella）に属する水生糸状菌を培養し、この培養物より抽出される新規物質が強い抗真菌作用を有することを発見し本発明を完成した。即ち、本発明は下記の化学構造式で表されることを特徴とする新規抗真菌物質ＦＡ２００Ｂ又はその塩である。

本発明の別の視点において、上記の新規抗真菌物質ＦＡ２００Ｂ又はその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有する農薬又は抗真菌薬が提供される。

また、本発明の異なる視点において、渓流中の落葉、又は落枝から分離され得るベヴェルヴィケラ(Beverwykella)属に属する水生糸状菌を培養物中で培養し、前記培養物より抽出することを特徴とする新規抗真菌物質ＦＡ２００Ｂ又はその塩の製造方法が提供される。

本発明の新規抗真菌物質ＦＡ２００Ｂは各種真菌類、例えば、フィトフィトーラ、アブシダ、リゾプス、トリコフィトン及びボトリシス等の糸状菌類のいずれに対しても抗菌活性を有する。従って、新規抗真菌物質ＦＡ２００Ｂは有効な農薬及び抗真菌薬として利用する事が可能である。即ち新規抗真菌物質ＦＡ２００Ｂを有効成分とする農薬及び真菌症治療薬として有用である。新規抗真菌物質ＦＡ２００Ｂは農薬として使用することができる。又、経口、非経口で投与する真菌症治療薬としても使用することができる。

このような本発明に係わる新規抗真菌物質ＦＡ２００Ｂを生産する生産菌としては、例えばベヴェルヴィケラプルモナリア（Bevwrwykella pulmonaria）ＮＢＲＣ６８００（NBRC6800）が挙げられる。本菌は独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジー本部生物遺伝資源部門遺伝資源保存課（ＮＢＲＣ）より購入した株である。本菌の菌学的特長は以下の文献に記載されている（Tubaki, K: Note on the Japanese Hypomycetes VI. Candelabrum and Beverwykella gen. Nov. Trans. Mycol. Soc. Jpn. 16:132-140(1975).）。

このような新規抗真菌物質ＦＡ２００Ｂの生産菌は一般的な糸状菌の培養方法である固体培養法で培養することができる。固体培養に用いられる培地としては一般的なオートミール培地が使用され、微生物の増殖を促進させるため炭素源および窒素源を適宜添加したオートミール培地が望ましい。例えば炭素源としてグルコースやシュークロースやデキストリンやスターチ等が用いられ、窒素源としては大豆粉、綿実粕、菜種油粕、酵母エキス、コーンスティープリカーなどの各種タンパク質やアミノ酸混合物などが適している。また培地は必要に応じて、炭酸カルシウム、リン酸ナトリウム、硫酸マグネシウム等の無機塩を含有することが可能である。培地のｐＨは５から９で培養することができるが、特にｐＨ７付近で培養することが好ましい。また生産物の収量を上げる目的で培地中に各種の吸着樹脂を添加して培養することも可能である。

生産菌は１０℃〜２８℃で培養することができるが、特に１５℃から２４℃で培養することが最も望ましい。培養時間は通常１０日〜４０日であるが、培養条件により適宜変更することが可能である。

培養により生成される新規抗真菌物質ＦＡ２００Ｂは、主として培養物中に蓄積される。この生産菌の培養液から新規抗真菌物質ＦＡ２００Ｂを得るためには微生物の代謝産物を採集するのに通常用いられる方法を用いることが可能である。例えば新規抗真菌物質ＦＡ２００Ｂと培養物中に含まれる他の物質との溶解度を利用する方法、イオン結合力との差を利用する方法、吸着親和力の差を利用する方法、分子量の差を利用する方法等を単独であるいは適宜組み合わせて、または反復して使用することができる。具体的には例えば新規抗真菌物質ＦＡ２００Ｂ生産菌の培養物及び菌体の抽出液をゲルろ過クロマトグラフィ−、吸着クロマトグラフィ−、液体クロマトグラフィ−等を組み合わせて用いて精製することにより新規抗真菌物質ＦＡ２００Ｂ及びその他の活性成分を含む画分が得られる。この画分を減圧濃縮して得られる固形物をさらに高速液体クロマトグラフィ−を用いて展開して精製することにより、新規抗真菌物質ＦＡ２００Ｂを得ることができる。
このようにして得られた新規抗真菌物質ＦＡ２００Ｂは以下のような理化学的性質を有する。

TLC (silica gel plate): R_f = 0.21 [Hexane - EtOAc (1:2)].
Yellow powder.
Melting point: 84.8 - 87.3℃.
IR (KBr): 1741, 1722, 1678, 1645, 1454, 1375, 1327, 1237, 1182, 1122, 1090, 1022, 978, 908, 870 cm^-1.
UV (MeOH) λ max 223 (ε 22100), 333 (ε 21200) nm.
[α]_D ²⁷ + 136 (ｃ 0.24, CHCl₃).
HRESIMS (positive):
found m/z 423.1778 [M - CH₃COO] ⁺, calcd for C₂₅H₂₇O₆ 423.1802
found m/z 483.1987 [M + H] ⁺, calcd for C₂₇H₃₁O₈ 483.2014
found m/z 505.1841 [M + Na] ⁺, calcd for C₂₇H₃₀O₈Na 505.1833
found m/z 521.1561 [M + K] ⁺, calcd for C₂₇H₃₀O₈K 521.1572.
¹H NMR (CDCl₃, 600 MHz):δ 7.86 (s, 1H), 6.16 (s, 1H), 5.69 (q, J = 6.6 Hz, 1H), 5.53 (s, 1H), 5.29 (d, J = 11.0 Hz, 1H), 2.95 (qd, J = 7.2, 11.0 Hz, 1H), 2.52 (m, 2H), 2.50 (m, 2H), 2.13 (s, 3H), 2.07 (s, 3H), 2.06 (m, 2H), 1.63 (d, J = 6.6 Hz, 3H), 1.58 (s, 3H), 1.55 (s, 3H), 1.08 (d, J = 7.2 Hz, 3H).
¹³C NMR (CDCl₃, 150 MHz): δ 195.3 (s), 192.7 (s), 192.4 (s), 173.7 (s), 170.1 (s), 165.2 (s), 154.1 (d), 153.6 (s), 142.1 (s), 130.7 (s), 130.2 (s), 127.1 (d), 115.1 (s), 114.1 (d), 107.8 (d), 84.5 (s), 80.6 (d), 41.1 (d), 37.3 (t), 32.6 (t), 22.9 (q), 22.1 (q), 21.5 (t), 21.2 (q), 13.9 (q), 13.1 (q), 10.6 (q).

本発明の新規抗真菌物質ＦＡ２００Ｂを農薬として使用する場合は以下のような形態で使用することができ、通常、製剤分野で慣用される補助剤と一緒に使用される。ＦＡ２００Ｂは公知の方法で、例えば乳剤原液、噴霧可能なペースト、噴霧または希釈可能な溶液、希釈乳剤、水和剤、水溶剤、粉剤、粒剤、フロアブル剤、ドライフロアブル剤、燻煙剤、燻蒸剤、そして例えばポリマー物質によるカプセル剤に製剤される。

添加剤および担体としては、固形剤を目的とする場合は、大豆粉、小麦粉等の植物性粉末、珪藻土、燐灰石、石膏、タルク、ベントナイト、クレイ等の鉱物性微粉末、安息香酸ソーダ、尿素、芒硝等の有機及び無機化合物が使用される。

液体の剤型を目的とする場合は、植物油、鉱物油、ケロシン、キシレンおよびトルエンのような芳香族炭化水素、ホルムアミド、ジメチルホルムアミドのようなアミド類、ジメチルスルホキシドのようなスルホキシド類、メチルイソブチルケトンおよびアセトンのようなケトン類、トリクロルエチレン、水等を溶剤として使用する。これらの製剤において、均一なかつ安定な形態を取るために必要ならば界面活性剤を添加することもできる。このようにして得られた水和剤、乳剤、水溶液、フロアブル剤、ドライフロアブル剤は水で所定の濃度に希釈して懸濁液あるいは乳濁液として、粉剤、粒剤はそのまま、土壌または植物に散布する方法で使用される。

本発明の新規抗真菌物質ＦＡ２００Ｂを含む農薬中の有効成分含有量および施用量は、剤型や、施用の対象とするダニまたは病原菌の種類、それらの予想される発生時期および期間等の条件に応じて、広範囲に変えることができる。通常、ＦＡ２００Ｂを含む農薬中のＦＡ２００Ｂ含有量は０．０１〜５０％（重量）、好ましくは０．１〜１０％（重量）であるが、場合によってはＦＡ２００Ｂのみでもよい。さらに、施用時にこれを水等で希釈する場合、例えば殺ダニ剤もしくは殺菌剤として施用する際の濃度は０．００１〜０．５％（重量）、好ましくは０．０１〜０．０５％（重量）が望ましい。また、ＦＡ２００Ｂの施用量は、１回１０ａあたり１０〜５０００ｇ、好ましくは１００〜５００ｇが望ましい。しかしながら特別の場合は、これらの範囲を越えるか、または下回ることが可能である。例えば、他の農薬等と混合して施用し、共力効果等が認められる場合には、さらに低薬量で使用できる。

本発明の新規抗真菌物質ＦＡ２００Ｂを医薬品、例えば、真菌感染症治療用の抗真菌薬として使用するには、種々の投与形態に合わせて、本発明化合物を公知の医薬品担体と組み合わせて製剤化すれば良い。このような投与形態としては皮下注射、静脈内注射、筋肉内注射、座薬等による非経口投与あるいは錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤等による経口投与の全身投与の他、軟膏剤、ローション剤、膣座薬等の局所投与の形態を例示することができる。投与量は医薬品の投与方法によるが、１００００μＭ／ｋｇ／日〜０．０１μＭ／ｋｇ／日、望ましくは１０００μＭ／ｋｇ／日〜１．０μＭ／ｋｇ／日である。

また新規抗真菌物質ＦＡ２００Ｂは、薬理学的に許容される塩として調製することができ、また薬剤上必要な、賦形剤、結合剤、防腐剤、緩衝剤、酸化防止剤、香料等を用いて調製することが可能である。

次に実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明はもちろん、これらの方法に限定されるものではなく、培養器の種類、培養条件、採取、精製、試験方法等は大幅に変え得るものであることはいうまでもない。

１．新規抗真菌物質ＦＡ２００Ｂの製造
ディフコ製麦芽エキス寒天培地中にベヴェルヴィケラプルモナリア（Beverwykella pulmonaria ）ＮＢＲＣ６８００（NBRC6800）を接種し、２０℃で２０日間培養を行なった。一方、１リッター容のルー型フラスコ４瓶を準備し、各ルー型フラスコに対しフレーク状オートミール（日本食品製造合資株式会社製）を２０ｇ張り込み、これに下記組成の液体培地２８ｍｌを添加後、定法どおり過熱滅菌処理を施し抗真菌物質ＦＡ２００Ｂ生産用固体培地を調製した。

液体培地組成ｇ／ｌ
グルコース２
フルクトース５
シュークロース８
ＮＺアミン（和光純薬工業株式会社）２
ＭｇＳＯ_４・４Ｈ_２Ｏ０．５
ＫＣｌ０．５
ＺｎＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ０．５
ＫＨ_２ＰＯ_４１
（ｐＨ６．０）

次に、２０℃で２０日間培養を行なって得られた麦芽エキス寒天培地からアガーピースを種菌として切り出し、これを上記ルー型フラスコ培地に接種し、２０℃、１４日間ルー型フラスコを用いた固体静置培養を行った。

上記固体培養物ルー型培養瓶４本分をアセトン抽出した（１２５ｍｌ×４）。抽出液を濃縮した水懸濁液（３０ｍｌ）を１Ｎ塩酸でｐＨ３に調整し酢酸エチルで抽出（３×３０ｍＬ）した。酢酸エチル層９０ｍｌを純水（３×９０ｍｌ）で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムを添加、一晩脱水した。酢酸エチル層（４７０ｍｇ）をメタノールに溶解しＯＤＳカラム（ジーエルサイエンス製中圧カラム（３００ｍｍ×１５ｍｍｉｄ）にのせ、ＣＨ_３ＣＮ：Ｈ_２Ｏ＝３０：７０〜１００：０までステップワイズで溶出し、Phytophythora capsici NBRC8386に対する抗菌活性画分を濃縮した。活性画分をＨＰＬＣ（資生堂製ＣＡＰＣＥＬＬＰＡＫＣ１８ＵＧ１２０２５０×１５ｍｍｉｄ，ＣＨ_３ＣＮ：Ｈ_２Ｏ＝５０：５０，８．０ｍｌ／ｍｉｎ，２１０ｎｍ）で溶出した。得られたクロマトグラムを図１に示す。図１に示すリテンションタイム１０．６分に活性ピークを有する画分（RT=10.6分のピーク）を分取し、濃縮した後、凍結乾燥してＦＡ２００Ｂを得た（２３ｍｇ）。

２．抗真菌活性試験
新規抗真菌物質ＦＡ２００Ｂの抗真菌活性を常法のペーパーディスク法を用いて求めた。新規抗真菌物質ＦＡ２００Ｂを少量のメタノ−ルで溶解した後、検定培地（グリセロール；２％、ペプトン（ディフコ社）；０．５％、酵母エキス（ディフコ社）；０．５％、燐酸カリウム；２５ｍＭ、ｐＨ＝６．５）で等倍希釈系列を作製した。その溶液に表１記載の各々の被検菌を接種（約１０^４個胞子／ｍｌ）し、２５℃で２日間培養して、生育阻害の認められない最小濃度（ＭＩＣ）を求めた。

結果を表１に示す。

使用培地
真菌、酵母：Yeast Nitrogen broth(Difco社製) + 0.5% glucose
細菌：Muller-Hinton broth(Difco社製) + 0.5% glucose

表１から明らかなように新規抗真菌物質ＦＡ２００Ｂは優れた抗真菌活性を有することがわかった。

なお、このような抗真菌活性は本発明の新規物質ＦＡ２００Ｂに固有の性質であるから、特許請求の範囲及び明細書における「新規抗真菌物質ＦＡ２００Ｂ」なる記載は、本発明により見出された「化合物ＦＡ２００Ｂ」そのものを意味しているに他ならず、本発明の新規物質ＦＡ２００Ｂの範囲を何ら限定するものではない。

以上の説明から明らかなように、本発明によれば抗真菌効果に優れた新規抗真菌物質ＦＡ２００Ｂが提供される。またこれらの新規抗真菌物質を製造するための本発明の方法は、通常の微生物培養法を用いることができ、抽出、精製にも特別の方法を用いないので工業的な大量生産が可能である。従って、医薬、製薬産業上極めて有用である。

本発明の新規抗真菌物質ＦＡ２００Ｂの分取クロマトグラムである。

Claims

下記の化学構造式で表されることを特徴とする新規抗真菌物質ＦＡ２００Ｂ又はその塩。
請求項１記載の新規抗真菌物質ＦＡ２００Ｂ又はその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有することを特徴とする農薬又は抗真菌薬。
渓流中の落葉、又は落枝から分離されうるベヴェルヴィケラ(Beverwykella)属に属する水生糸状菌を培養物中で培養し、前記培養物より抽出することを特徴とする請求項１に記載の新規抗真菌物質ＦＡ２００Ｂ又はその塩の製造方法。