JP2005204539A - 造血幹細胞及び造血前駆細胞の増幅方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】組換えヒト血清アルブミンを含有してなる、造血細胞(造血幹細胞、造血前駆細胞)の増幅用組成物;基本培地および組換えヒト血清アルブミンを含有してなる、造血細胞の増幅用無血清培地;並びに、組換えヒト血清アルブミンを含有してなる無血清培地中で造血細胞を培養することを特徴とする、造血細胞の増幅方法、及び当該増幅方法により得られうる造血細胞培養物。
【選択図】なし
Description
例えば、特許文献1は組換えヒト血清アルブミンを含有する無血清培地を開示するが、造血細胞の増幅培養に関する記載はない。
また、特許文献2は、臍帯血から造血幹細胞を調製し、ヒト血清アルブミンを含有する無血清培地で培養することを開示している。また無血清培養された細胞は分化していない傾向があるとの記載もある。しかしながら、特許文献2は本来、好中球前駆細胞・巨核球前駆細胞の増殖に関するものである。
さらに、特許文献3は、臍帯血から調製されたCD34+細胞を、ヒト血清アルブミンを含有する無血清培地中で培養すること、及び当該培養によりCD34+細胞の増幅が実現されることを開示している。しかしながら、当該培養における組換えヒト血清アルブミンの使用は開示されていない。
(1)組換えヒト血清アルブミンを含有してなる、造血細胞の増幅用組成物。
(2)造血細胞が造血幹細胞である、上記(1)の組成物。
(3)造血幹細胞がCD34+/CD38−、CD34+/DR−、CD34+/CD90+、CD34+/CD117+、CD34+/CD123+、及びCD34+/CD133+からなる群より選ばれるものである、上記(2)の組成物。
(4)造血幹細胞がCD34+/CD38−/DR−である、上記(2)の組成物。
(5)造血細胞が造血前駆細胞である、上記(1)の組成物。
(6)基本培地および組換えヒト血清アルブミンを含有してなる、造血細胞の増幅用無血清培地。
(7)組換えヒト血清アルブミンを含有してなる無血清培地中で造血細胞を培養することを特徴とする、造血細胞の増幅方法。
(8)造血細胞を調製することをさらに含む、上記(7)の増幅方法。
(9)造血細胞が臍帯血由来のものである、上記(7)又は(8)の増幅方法。
(10)造血細胞が造血幹細胞である、上記(7)〜(9)のいずれかの増幅方法。
(11)増幅された造血幹細胞がCD34+/CD38−、CD34+/DR−、CD34+/CD90+、CD34+/CD117+、CD34+/CD123+、及びCD34+/CD133+からなる群より選ばれるものである、上記(10)の増幅方法。
(12)増幅された造血幹細胞がCD34+/CD38−/DR−である、上記(10)の増幅方法。
(13)造血細胞が造血前駆細胞である、上記(7)〜(9)のいずれかの増幅方法。
(14)上記(7)〜(13)のいずれかの方法により得られうる造血細胞培養物。
(15)血清成分を含有しない、上記(14)の培養物。
本発明の詳細については、以下の発明を実施するための最良の形態において説明する。
rHSAは、以下の通り調製した。先ず、rHSA産生酵母ピキア・パストリスの取得およびその培養については、特開平5−317079号公報に記載された方法に準じて行った。得られた培養液からrHSAを回収・精製するには、特開平8−116985号公報に記載された方法に準じて行った。次いで、精製されたrHSAを25%溶液に調製した。
HPLC分析:
rHSAをHPLCゲル濾過法により分析した。カラムはTSK gel G3000SW(東ソー)、展開液は0.1M KH2PO4/0.3M NaCl緩衝液、検出は波長280nmの吸光度を用いた。
酵母由来成分の分析:
HSA非産生酵母の上清として、上記の方法で粗精製したものをウサギに免疫し、得られた抗血清を用いて、精製されたrHSA含有組成物中に夾雑する酵母由来成分を検出した。測定は酵素免疫測定法(EIA法)により行なった。rHSA濃度として25%に調製したものを用いて測定した。
分子量:
前述のHPLCゲル濾過法と同様にして行なった。
等電点:
薄層ポリアクリルアミドゲルを用い、Allenらの方法(J.Chromatog.,146,p1,1978)に準じて測定した。
着色度:
波長280nm、350nm、450nmおよび500nmでの吸光度を測定し、A350/A280、A450/A280、A500/A280を各々算出した。
パイロジェン:
生化学工業のエンドスペシーを用いた。
αMEM、2w/v%rHSA、コレステロール(ICN Biomedical社)100μg/ml、レシチン(ICN Biomedical社)160mg/ml、インスリン(Sigma社)10mg/ml、ホロトランスフェリン(Sigma社)20mg/ml、トコフェロール(WAKO社)1mg/ml、アスコルビン酸(WAKO社)1mg/mlを配合し、完全無血清培地を調製した。コレステロールは難溶性のため、エタノールで溶解させた後、30〜40℃に設定したスターラで10分間攪拌し、エタノールを蒸発させた。その後、常温のスターラに移し、コレステロールの結晶が析出する前にrHSAをゆっくり滴下して抱合させた。この溶液に上記試薬を混合させた後、ボトルトップフィルターで濾過滅菌を行った。
αMEM、2w/v%rHSA、コレステロール(ICN Biomedical社)100μg/ml、レシチン(ICN Biomedical社)160mg/ml、インスリン(Sigma社)10mg/ml、ホロトランスフェリン(Sigma社)20mg/ml、トコフェロール(WAKO社)1mg/ml、アスコルビン酸(WAKO社)1mg/ml、SCF100ng/ml、TPO10ng/ml、FL100ng/ml、IL6 100ng/ml、sIL6R100ng/mlを配合し、完全無血清培地を調製した。
CD34+細胞の培養細胞の増幅率を、血清培地、無血清培地において培養7日目、14日目でそれぞれ解析した。CD34+細胞の増幅率は、FACS解析に基づく、0日目のCD34+/CD45+細胞数に対する7日目又は14日目のCD34+/CD45+細胞数の倍率である。CD34+/CD38−細胞、CD34+/CD38−/DR−細胞の各増幅率は、それぞれ、FACS解析に基づく、0日目のCD34+/CD38−細胞、CD34+/CD38−/DR−細胞数に対する7日目又は14日目のCD34+/CD38−細胞、CD34+/CD38−/DR−細胞数の倍率である。なお、用いた培地、CD34+細胞、培養条件は下記の通りである。結果を表2に示す。
血清培地としては、αMEM(最小基本培地α)に10%または20%FCS(ウシ胎児血清、JRH社)、及び5種のサイトカイン(SCF 100ng/ml、TPO 10ng/ml、FL 100ng/ml、IL6 100ng/ml、sIL6R 100ng/ml)を添加したものを、無血清培地としては、実施例2で調製したものを用いた。
CD34 + 細胞:
臍帯血よりマグネット・イムノビーズ法(AutoMACS)を用いてCD34+細胞を分離後、液体窒素で凍結保存したものを解凍して用いた。用いたCD34+細胞の純度は、95%以上であった。
培養条件:
上記の通り調製された血清培地、無血清培地の各1mlにCD34+細胞1×104個を播き、5%CO2インキュベータで7日間又は14日間培養した。培養には24穴プレートを用いた。
CD34+細胞の培養細胞のコロニー形成能を、血清培地、無血清培地において培養7日目、14日目でそれぞれ解析した。用いた培地、CD34+細胞、培養条件は実験例1と同様であった。コロニー形成能は、コロニーアッセイにより評価した。具体的には、メチルセルロース培地(MethoCult社)を用いて培養前と培養7日目、14日目にコロニーアッセイを行った。培養前、培養7日目については細胞密度250個/ディッシュ、14日目については500個/ディッシュで細胞を播き、14日間培養した後、コロニー数をカウントした。なお、総コロニー数の増幅率は、単位当たりの総コロニー数と培養総細胞数よりコロニー形成細胞数を算出し倍率に換算した。CFU−GM、BFU−E、CFU−Mixの増幅率については、それぞれ、単位当たりのCFU−GM、BFU−E、CFU−Mixコロニー形成率と総細胞数よりコロニー形成細胞数を算出し倍率に換算した。結果を表3に示す。
以上より、rHSA含有無血清培地は、総細胞、CFU−GMの増幅率では血清培地に劣るものの、BFU−E、CFU−Mixの選択的な増幅において血清培地よりも優れる傾向が認められた。
CD34+細胞の培養14日目の細胞を、既報に従いメイギムザ(May Giemsa)、ペルオキシダーゼ (Perocidase)、エステラーゼ (Esterase) の3種類の染色により形態学的に解析した。ギムザ染色による培養細胞の形態分類を表4に、同染色による分類一覧を表5に、ペルオキシダーゼによる培養細胞の形態分類を表6に、エステラーゼ染色による培養細胞の形態分類を表7にそれぞれ示す。
以上より、rHSA含有無血清培培地で培養されるCD34+細胞は、血清培地で培養されるCD34+細胞よりも未熟性が維持されることが明らかとなった。
CD34+細胞の培養細胞の表面抗原を、血清培地、無血清培地において培養14日目でそれぞれ解析した。用いた培地、CD34+細胞、培養条件は実験例1と同様であった。表面抗原は、培養細胞を常法により3色染色し、次いでFACSキャリバーを用いて解析した。表面抗原の解析として、CD34+/CD38−/DR−の陽性率の解析、造血前駆細胞の性質の解析、Lineage解析を行った。本解析に用いた抗体は以下のマーカーに対する抗体である。
・CD34+/CD38−/DR−細胞の陽性率:CD34、CD38、HLA−DR
・Lineage解析:CD13(骨髄系マーカー)、CD14(単球及びマクロファージ系のマーカー)、CD41(巨核球系マーカー)、CD19(B細胞系マーカー)、CD3(T細胞系マーカー)、グリコホリン(赤血球系マーカー)
・造血前駆細胞の性質の解析:CD90、CD117、CD38、HLA−DR、CD123、CD133
なお、CD34+/CD38−/DR−細胞の陽性率の解析は、FACSを用いて以下の通りに行なった。先ず、前方散乱光 (Forward Scatter; FS) と側方散乱光 (Side Scatter; SS) のscatter gramから得られる細胞集団にgatingした(R1)。次いでSSとCD34+領域にgatingした(R2)。さらにR1かつR2のゲート内の細胞をCD38とHLA−DRで展開した(34 gating)。次いで、34 gating CD38−/DR−の平均値(n=5)を算出した。
CD34+/CD38−/DR−細胞の陽性率についての結果を表8に、Lineage解析についての結果を表9に、造血幹細胞の性質の解析についての結果を表10に示す。
以上より、rHSA含有無血清培地は、血清培地よりも、CD34+細胞のCD34+/CD38−/DR−細胞への選択的な増幅に優れること、CD34+細胞の増幅に際して単球系細胞への分化を抑制すること、造血幹細胞の未分化増幅に優れることが明らかとなった。
実験例2において培養細胞のコロニー形成率が無血清培地で優れていたことから、無血清培養は分化能より自己複製能を持つ造血前駆細胞をより選択的に増幅させると推察された。この一因としてFCS中に分化を促進するサイトカインが含まれることが考えられたので培養液中のサイトカイン含有量、及び培養14日目の培養上清中のサイトカイン含有量をELISA法で測定した。測定はG−CSF、GM−CSF、TGF−β1、TGF−β2、IL3、EPOについて行った。培養液中のサイトカイン含有量についての結果を表11に、培養上清中のサイトカイン含有量についての結果を表12に示す。
以上より、本発明の無血清培培地は、自己複製能を有する造血幹細胞、造血前駆細胞の増幅に有用であることが明らかとなった。
6.1.血漿由来HSA含有無血清培地の調製
培養方法、培地の組成、表面抗原解析方法、コロニーアッセイ法は実験例1と同じである。血漿由来HSA添加培地は、αMEM、2w/v%ヒト血漿由来HSA(三菱ウェルファーマ製)、コレステロール(ICN Biomedical社製)100μg/ml、レシチン(ICN Biomedical社製)160mg/ml、インスリン(Sigma社製)10mg/ml、SCF100ng/ml、TPO10ng/ml、FL100ng/ml、IL6 100ng/ml、sIL6R100ng/mlを配合し、無血清培地を調製した。
CD34+細胞を104個ずつ播いた。血漿由来HSA、rHSA含有無血清培地にビタミンE、ビタミンCをそれぞれ添加した。培養14日目の総培養細胞数を測定した。結果を表13に示す。
実験例2と同様に14日間培養した後、培養7日目、14日目のコロニー形成能を解析した。培養7日目におけるコロニー形成能を表14に、培養14日目におけるコロニー形成能を表15にそれぞれ示す。
上記と同様にしてFACSを用いて解析した。14日間培養し、CD34、CD38の両抗原について解析した。結果を表16に示す。
以上より、rHSAは、血漿由来HSAよりもCFU−GM、BFU−E、CFU−Mixの増幅に優れること、並びに、血漿由来HSAよりもCD34+/CD38−細胞の増幅に優れることが明らかとなった。
Claims (15)
- 組換えヒト血清アルブミンを含有してなる、造血細胞の増幅用組成物。
- 造血細胞が造血幹細胞である、請求項1記載の組成物。
- 造血幹細胞がCD34+/CD38−、CD34+/DR−、CD34+/CD90+、CD34+/CD117+、CD34+/CD123+、及びCD34+/CD133+からなる群より選ばれるものである、請求項2記載の組成物。
- 造血幹細胞がCD34+/CD38−/DR−である、請求項2記載の組成物。
- 造血細胞が造血前駆細胞である、請求項1記載の組成物。
- 基本培地および組換えヒト血清アルブミンを含有してなる、造血細胞の増幅用無血清培地。
- 組換えヒト血清アルブミンを含有してなる無血清培地中で造血細胞を培養することを特徴とする、造血細胞の増幅方法。
- 造血細胞を調製することをさらに含む、請求項7記載の増幅方法。
- 造血細胞が臍帯血由来のものである、請求項7又は8の増幅方法。
- 造血細胞が造血幹細胞である、請求項7〜9のいずれか1項記載の増幅方法。
- 増幅された造血幹細胞がCD34+/CD38−、CD34+/DR−、CD34+/CD90+、CD34+/CD117+、CD34+/CD123+、及びCD34+/CD133+からなる群より選ばれるものである、請求項10記載の増幅方法。
- 増幅された造血幹細胞がCD34+/CD38−/DR−である、請求項10記載の増幅方法。
- 造血細胞が造血前駆細胞である、請求項7〜9のいずれか1項記載の増幅方法。
- 請求項7〜13のいずれか1項記載の方法により得られうる造血細胞培養物。
- 血清成分を含有しない、請求項14記載の培養物。
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