JP2005164348A - Method for observing interaction of biomolecules - Google Patents
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本発明は、表面に導入した非イオン性官能基にヘテロ二官能型親水性高分子を共有結合的に固定化し、親水性高分子を介して生体分子を表面に固定化することにより、生体分子の相互作用を観察する方法に関する The present invention relates to a biomolecule obtained by covalently immobilizing a heterobifunctional hydrophilic polymer to a nonionic functional group introduced on the surface and immobilizing the biomolecule on the surface via the hydrophilic polymer. How to observe the interaction
生体分子の生体内における機能を解析する手段として、生体分子の相互作用が調べられてきた。相互作用を調べる手段の一つとして、結合ペアの一方の分子（Ａ）を固体表面に固定化して、測定対象となる分子（Ｂ）との相互作用を解析する方法が一般的に用いられている。しかし、Ａを表面に固定化するために固体表面に結合している分子、もしくは固体表面そのものへの、Ｂの非特異吸着が存在する場合、結合を何らかの形で検出できたとしても、本当に特異的な結合であるかどうかの判断がつきにくい場合が多い。 Biomolecule interactions have been investigated as a means of analyzing the functions of biomolecules in vivo. As one of the means for examining the interaction, a method is generally used in which one molecule (A) of a binding pair is immobilized on a solid surface and the interaction with the molecule (B) to be measured is analyzed. Yes. However, if there is nonspecific adsorption of B to a molecule bound to the solid surface to immobilize A on the surface, or to the solid surface itself, even if the binding can be detected in some way, it is truly specific. In many cases, it is difficult to determine whether or not the connection is static.
Ｂが純粋な系である場合は、Ｂの非特異吸着のみを考慮に入れればよいが、Ｂが細胞破砕液もしくは細胞抽出液、血清などの体液成分に含まれている場合は、さまざまな物質が溶液中に含まれているため、Ｂ以外の物質が非特異的吸着した場合の悪影響も考えられる。 If B is a pure system, only non-specific adsorption of B may be taken into account, but if B is contained in body fluid components such as cell lysate, cell extract, or serum, various substances Is contained in the solution, there is a possibility of adverse effects when substances other than B adsorb nonspecifically.
従来の技術として非特異的吸着を抑える手段として牛血清アルブミン（ＢＳＡ）やミルクカゼインなどを固体表面に接触させ、ブロッキングする手段が考えられてきた。しかし、ブロッキングは単なる物理吸着であり、その表面への結合強度は弱い場合があり、徐々に剥がれて落ちていくことがある。また、ブロッキングによって、固定化されたＡが埋もれ、相互作用が検出されない場合もある。 As a conventional technique, a means for blocking bovine serum albumin (BSA), milk casein or the like in contact with a solid surface has been considered as a means for suppressing nonspecific adsorption. However, blocking is merely physical adsorption, and the bonding strength to the surface may be weak and may gradually peel off. Further, the immobilized A may be buried by blocking, and the interaction may not be detected.
そこで、Ａを固定化するための分子を親水性物質とし、ブロッキング操作をしなくても非特異的吸着を低減する手段が検討されてきた。例えば、核酸分子を共有結合で固定化する方法において、核酸分子を合成する際にポリエチレングリコールのスペーサーを設ける方法が示されている（例えば特許文献１参照）。ここでは目的配列と固定化用官能基の間にポリエチレングリコールのスペーサーを設けており、非特異的吸着を抑制する効果が期待できる。しかし、Ａを表面に固定化するために固体表面に結合している分子に対してＢの非特異的吸着は全く考慮に入れられていない。 Therefore, a means for reducing the nonspecific adsorption without using a blocking operation by using a molecule for immobilizing A as a hydrophilic substance has been studied. For example, in a method of immobilizing a nucleic acid molecule by a covalent bond, a method of providing a polyethylene glycol spacer when synthesizing a nucleic acid molecule is shown (for example, see Patent Document 1). Here, a polyethylene glycol spacer is provided between the target sequence and the immobilizing functional group, and an effect of suppressing nonspecific adsorption can be expected. However, no nonspecific adsorption of B is taken into account for molecules bound to the solid surface to immobilize A on the surface.
まず、この方法ではアルカンチオールの自己組織化表面を作製し、表面にアミノ基を導入する。このアミノ基は表面に密に充填されている。これにスクシンイミド基とマレイミド基を有する架橋剤を反応させ、最後に核酸分子を共有結合的に固定化させる。自己組織化表面によって導入したアミノ基の全てが、架橋剤のスクシンイミド基と反応することはできないため、固体表面にはアミノ基が多量に存在し、プラスの電荷を有している。これでは、Ｂがマイナス電荷を有する場合、もしくはＢの溶液にマイナス電荷を有する物質が含まれている場合、非特異的吸着が生じる結果となる。 First, in this method, a self-organized surface of alkanethiol is prepared, and an amino group is introduced on the surface. This amino group is closely packed on the surface. This is reacted with a crosslinking agent having a succinimide group and a maleimide group, and finally the nucleic acid molecule is covalently immobilized. Since all of the amino groups introduced by the self-assembled surface cannot react with the succinimide group of the cross-linking agent, a large amount of amino groups are present on the solid surface and have a positive charge. This results in non-specific adsorption when B has a negative charge or when the B solution contains a negative charge.
また、使用している架橋剤の主鎖はシクロヘキサン環であり、非常に疎水性が高い。この場合、Ｂが疎水性部位を有する物質である場合、もしくはＢの溶液中に疎水性物質を含む場合、非特異的吸着を生じる危険性がある。 The main chain of the crosslinking agent used is a cyclohexane ring, which is very hydrophobic. In this case, when B is a substance having a hydrophobic site, or when a hydrophobic substance is contained in the solution of B, there is a risk of causing nonspecific adsorption.
米国特許では表面に糖のハイドロゲルを形成し、ゲル内に官能基を設けることで非特異的吸着を抑制する方法が開示されている。非常に効果のある方法ではあるが、ゲルの内部と外部では対象物質の浸透、拡散速度が異なるため、リアルタイムに相互作用Ｋｉｎｅｔｉｃｓを厳密に測定する方法としては不適当である。また、糖は生体分子の一つであり、糖に相互作用する物質が試料中に含まれている場合は応用することはできない。（例えば、特許文献２参照）。 US Patent discloses a method for suppressing non-specific adsorption by forming a sugar hydrogel on the surface and providing a functional group in the gel. Although it is a very effective method, since the penetration and diffusion rates of the target substance are different between the inside and outside of the gel, it is unsuitable as a method for strictly measuring the interaction kinetics in real time. In addition, sugar is one of biomolecules, and cannot be applied when a substance that interacts with sugar is contained in the sample. (For example, refer to Patent Document 2).
また、親水性高分子を有するスペーサーの末端に生体分子を固定化するための官能基を有し、もう一方の末端に固体表面に直接結合できる官能基をもつ分子が設計され、相互作用観察に成功している。しかし、この物質単独が表面に密に充填するのは難しく、その他の親水性基末端物質と混合して表面に固定化される。非特異的吸着を抑制するために、親水性基末端物質を高い比率で混合する結果となり、表面に生体分子が固定化される密度は低くなるため、測定感度は低い問題点が生じる。また、設計された分子は一般的ではなく、入手困難であることも問題点である。（例えば、非特許文献１，２参照） In addition, a molecule with a functional group for immobilizing biomolecules at the end of a spacer with a hydrophilic polymer and a functional group that can be directly bonded to the solid surface at the other end is designed for interaction observation. Has succeeded. However, it is difficult for this substance alone to be densely packed on the surface, and it is mixed with other hydrophilic group terminal substances and immobilized on the surface. In order to suppress non-specific adsorption, hydrophilic group terminal substances are mixed at a high ratio, and the density at which biomolecules are immobilized on the surface is lowered, resulting in a problem of low measurement sensitivity. In addition, the designed molecules are not common and are difficult to obtain. (For example, see Non-Patent Documents 1 and 2)
米国特許５６２９２１３には金属基板にアニオン性の物質を導入し、ポリカチオンであるポリＬリジンを固定化し、その上に分子（Ｂ）に対して特異性のある物質を固定化し、表面プラズモン共鳴法によって検出する方法が開示されている。この方法では、金属基板に密にアニオン性物質が充填され、次にポリＬリジンを積層させることで、表面が強いプラス電荷を有する。実施例ではこの表面にストレプトアビジンを固定化し、ビオチン化抗体を固定化して、分子（Ｂ）を検出する。しかし、分子（Ｂ）が細胞抽出液もしくは体液に含まれる場合、細胞抽出液もしくは体液中に含まれるイオン性物質が、ポリＬリジン層、もしくは基板上に密に導入されたアニオン性物質に非特異的に吸着する恐れがある。この場合、細胞抽出液もしくは体液中の物質の検出することは困難である。（特許文献３参照） In US Pat. No. 5,629,213, an anionic substance is introduced into a metal substrate, poly-L-lysine, which is a polycation, is immobilized thereon, a substance specific to the molecule (B) is immobilized thereon, and surface plasmon resonance method Is disclosed. In this method, a metal substrate is densely filled with an anionic substance, and poly L lysine is then laminated so that the surface has a strong positive charge. In the example, streptavidin is immobilized on this surface, and a biotinylated antibody is immobilized, and the molecule (B) is detected. However, when the molecule (B) is contained in the cell extract or body fluid, the ionic substance contained in the cell extract or body fluid is not added to the poly-L lysine layer or the anionic substance densely introduced onto the substrate. There is a risk of specific adsorption. In this case, it is difficult to detect substances in the cell extract or body fluid. (See Patent Document 3)
特表２００２−５２０６２０にも抗体を基板に固定化したアレイが開示されている。ここには細胞抽出液を解析する概念も示されており、密に充填する単層（有機薄層）にポリマーを使用する概念も示されている。有機薄層は、表面上への分子の非特異的結合を減少させる官能基（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を保有し得るとの記述があるものの、非イオン性官能基を導入したのちにＰＥＧを固定化する具体的な方法は記載されていない。（特許文献４） JP 2002-520620 also discloses an array in which an antibody is immobilized on a substrate. Here, the concept of analyzing a cell extract is also shown, and the concept of using a polymer for a single layer (organic thin layer) that is densely packed is also shown. Although the organic thin layer is described as having a functional group (for example, polyethylene glycol (PEG)) that reduces nonspecific binding of molecules on the surface, the PEG is introduced after the introduction of the nonionic functional group. No specific method for immobilizing is described (Patent Document 4).
本発明は非イオン性官能基にヘテロ二官能型親水性高分子を架橋剤に用いて生体分子を固定化し、非特異的吸着を抑制することを可能とする。 The present invention makes it possible to immobilize a biomolecule by using a heterobifunctional hydrophilic polymer as a cross-linking agent in a nonionic functional group and suppress nonspecific adsorption.
本発明は、表面に導入した非イオン性官能基にヘテロ二官能型親水性高分子を共有結合的に固定化し、親水性高分子を介して生体分子を表面に固定化することにより、生体分子の相互作用を観察する方法を提供することにある。 The present invention relates to a biomolecule obtained by covalently immobilizing a heterobifunctional hydrophilic polymer to a nonionic functional group introduced on the surface and immobilizing the biomolecule on the surface via the hydrophilic polymer. It is to provide a method for observing the interaction.
本発明者らは鋭意検討した結果、以下に示す手段により、上記課題を解決できることを見出した。
１．表面に導入した非イオン性官能基に、ヘテロ二官能基型親水性高分子を共有結合的に結合し、該親水性高分子の末端と生体分子を直接的または間接的、化学的結合または物理的吸着により、生体分子を固体表面上に固定化し、固定化した生体分子と、生体分子あるいは生体分子集合体との相互作用を観察する方法
２．非イオン性官能基がヒドロキシ基、トシル基、トレシル基、スクシンイミド基、チオール基、アルデヒド基、ビニル基、イソシアネート基、エポキシ基から選ばれる一つである１記載の方法
３．ヘテロ二官能基型親水性高分子の分子量が１，０００以上、１０，０００以下である１もしくは２記載の方法
４．ヘテロ二官能基型親水性高分子の繰り返し単位がエチレングリコールである１〜３いずれか記載の方法
５．ヘテロ二官能基型親水性高分子の官能基がアミノ基、カルボキシル基、スルホン化スクシンイミド基、マレイミド基、チオール基、アルデヒド基、ビニル基、イソシアネート基、エポキシ基、ヒドラジド基、アジド基の群から選ばれる二つである１〜４いずれかに記載の方法
６．固体表面が平面基板である１〜５いずれかに記載の方法
７．固体表面が平面基板上の金薄層である１〜６いずれかに記載の方法
８．金−硫黄結合を利用して表面に非イオン性官能基を導入した金表面に、ヘテロ二官能性親水性高分子を用いて生体分子を固定化する１〜７いずれかに記載の方法
９．複数の生体分子をアレイ状に固定化する１〜８いずれかに記載の方法
１０．固定化する複数の生体分子が５種類以上である１〜９いずれかに記載の方法
１１．固定化する生体分子が抗体である１〜１０いずれかに記載の方法
１２．相互作用を表面プラズモン共鳴法によって観察する１〜１１いずれかに記載の方法
１３．相互作用を表面プラズモン共鳴イメージング法によって観察する１〜１２いずれか記載の方法
As a result of intensive studies, the present inventors have found that the above problems can be solved by the following means.
1. A heterobifunctional hydrophilic polymer is covalently bonded to a nonionic functional group introduced on the surface, and the end of the hydrophilic polymer and a biomolecule are directly or indirectly bonded chemically or physically. 1. Method for observing the interaction between an immobilized biomolecule and a biomolecule or an assembly of biomolecules by immobilizing the biomolecule on the solid surface by mechanical adsorption 2. The method according to 1, wherein the nonionic functional group is one selected from a hydroxy group, a tosyl group, a tresyl group, a succinimide group, a thiol group, an aldehyde group, a vinyl group, an isocyanate group, and an epoxy group. 3. The method according to 1 or 2, wherein the heterobifunctional hydrophilic polymer has a molecular weight of 1,000 or more and 10,000 or less. 4. The method according to any one of 1 to 3, wherein the repeating unit of the heterobifunctional type hydrophilic polymer is ethylene glycol. The functional group of the heterobifunctional hydrophilic polymer is selected from the group consisting of amino group, carboxyl group, sulfonated succinimide group, maleimide group, thiol group, aldehyde group, vinyl group, isocyanate group, epoxy group, hydrazide group, and azide group. 5. The method according to any one of 1 to 4, which is two selected. 6. The method according to any one of 1 to 5, wherein the solid surface is a flat substrate. 7. The method according to any one of 1 to 6, wherein the solid surface is a thin gold layer on a flat substrate. 8. The method according to any one of 1 to 7, wherein a biomolecule is immobilized using a heterobifunctional hydrophilic polymer on a gold surface into which a nonionic functional group has been introduced on the surface using a gold-sulfur bond. 9. The method according to any one of 1 to 8, wherein a plurality of biomolecules are immobilized in an array. 10. The method according to any one of 1 to 9, wherein the number of biomolecules to be immobilized is 5 or more. 11. The method according to any one of 1 to 10, wherein the biomolecule to be immobilized is an antibody. 12. The method according to any one of 1 to 11, wherein the interaction is observed by a surface plasmon resonance method. The method according to any one of 1 to 12, wherein the interaction is observed by a surface plasmon resonance imaging method
本発明により、表面に導入した非イオン性官能基にヘテロ二官能型親水性高分子を共有結合的に固定化し、親水性高分子を介して生体分子を表面に固定化することで、生体分子の相互作用を観察する方法を提供する。 According to the present invention, a heterobifunctional hydrophilic polymer is covalently immobilized on a nonionic functional group introduced on the surface, and the biomolecule is immobilized on the surface via the hydrophilic polymer. Provides a method of observing the interaction.
以下に本発明を詳細に説明する。本発明は、表面に導入した非イオン性官能基にヘテロ二官能型親水性高分子を架橋剤に用いて生体分子の固定化し、分子間の相互作用を観察する方法を開示している。 The present invention is described in detail below. The present invention discloses a method of immobilizing a biomolecule using a heterobifunctional hydrophilic polymer as a crosslinking agent on a nonionic functional group introduced on the surface and observing the interaction between the molecules.
生体分子間の相互作用を解析する方法として、結合ペアの一方の分子（Ａ）を固体表面に固定化して、測定対象となる分子（Ｂ）との相互作用を解析する方法が一般的に用いられている。しかし、分子（Ａ）を表面に固定化するために固体表面に結合している分子、もしくは固体表面そのものへの、分子（Ｂ）の非特異吸着が存在する場合、結合を何らかの形で検出できたとしても、本当に特異的な結合であるかどうかの判断がつきにくい場合が多い。 As a method for analyzing the interaction between biomolecules, a method of immobilizing one molecule (A) of a binding pair on a solid surface and analyzing the interaction with the molecule (B) to be measured is generally used. It has been. However, if there is non-specific adsorption of the molecule (B) to the molecule bound to the solid surface to immobilize the molecule (A) on the surface or to the solid surface itself, the binding can be detected in some form. Even so, it is often difficult to determine whether the binding is really specific.
本発明は、分子（Ａ）を表面に固定化するために固体表面に導入される官能基は非イオン性である。表面に導入される官能基としてヒドロキシ基、トシル基、トレシル基、スクシンイミド基、チオール基、アルデヒド基、ビニル基、イソシアネート基、エポキシ基などが挙げられる。これらは非イオン性であるため、表面に未反応のまま残ったとしても、表面への静電的な非特異的吸着の恐れがない。 In the present invention, the functional group introduced into the solid surface for immobilizing the molecule (A) on the surface is nonionic. Examples of the functional group introduced on the surface include a hydroxy group, a tosyl group, a tresyl group, a succinimide group, a thiol group, an aldehyde group, a vinyl group, an isocyanate group, and an epoxy group. Since they are nonionic, there is no fear of electrostatic nonspecific adsorption to the surface even if they remain unreacted on the surface.
上記に挙げた非イオン性官能基にも、他の官能基に対して結合反応の活性の高いものがあるが、共有結合によるブロッキングも容易であるため、大きな問題とはならない。これに対し、イオン性官能基を表面に多数有する場合は、ブロッキングが困難である場合が多く好ましくない。従って、固体表面に密に導入される官能基がイオン性であると、未反応のイオン性官能基と分子（Ｂ）の非特異的に吸着、もしくは分子（Ｂ）を含む溶液中の物質が吸着した場合、測定に影響を与えることがあり好ましくない。 Some of the nonionic functional groups listed above have high binding reaction activity with respect to other functional groups, but they are not a big problem because they are easily blocked by covalent bonds. On the other hand, when a large number of ionic functional groups are present on the surface, blocking is often difficult, which is not preferable. Therefore, if the functional group that is densely introduced into the solid surface is ionic, non-reactive ionic functional groups and molecules (B) are adsorbed nonspecifically, or the substance in the solution containing the molecules (B) Adsorption is not preferable because it may affect the measurement.
表面に官能基を導入する方法は特に限定されるものではないが、例えば固体基板が金属である場合、金属結合性官能基を片末端に、非イオン性官能基をもう一つの末端に有するアルカン物質を用いて表面に官能基を導入することができる。より具体的には金表面にアルカンチオールの自己組織化表面を形成させ、非イオン性官能基を導入することが可能である。また、ガラス基板の場合、シランカップリング剤を用いて官能基を容易に導入することができる。 The method for introducing a functional group on the surface is not particularly limited. For example, when the solid substrate is a metal, an alkane having a metal-binding functional group at one end and a nonionic functional group at the other end. Functional groups can be introduced on the surface using substances. More specifically, it is possible to introduce a nonionic functional group by forming a self-organized surface of alkanethiol on the gold surface. In the case of a glass substrate, a functional group can be easily introduced using a silane coupling agent.
本発明では非イオン性官能基にヘテロ二官能型親水性高分子を共有結合的に結合させる。該高分子は非特異的吸着を抑制するために親水性である必要がある。ここで言う親水性とは高分子が水溶性もしくは水に対して膨潤する性質を有することを意味し、高分子とはモノマーの繰り返し単位が３以上の物質と定義する。高分子の分子量は十分なスペーサーとして機能させるために１，０００以上が好ましい。しかし、架橋剤は一定のモル濃度が必要であり、分子量が大きすぎると、固定化に必要な架橋剤のグラム数が増大するため、分子量は１０，０００以下が好ましい。 In the present invention, a heterobifunctional hydrophilic polymer is covalently bonded to a nonionic functional group. The polymer needs to be hydrophilic in order to suppress nonspecific adsorption. The term “hydrophilic” as used herein means that the polymer has water solubility or a property of swelling with water, and the polymer is defined as a substance having 3 or more monomer repeating units. The molecular weight of the polymer is preferably 1,000 or more in order to function as a sufficient spacer. However, the cross-linking agent requires a certain molar concentration, and if the molecular weight is too large, the number of grams of the cross-linking agent required for immobilization increases, and therefore the molecular weight is preferably 10,000 or less.
高分子の材料は特に限定されるものではないが、親水性であることと鎖のフレキシビリティから、エチレングリコールを繰り返し単位にもつ、ポリエチレングリコールが好ましい。 The polymer material is not particularly limited, but polyethylene glycol having ethylene glycol as a repeating unit is preferable from the viewpoint of hydrophilicity and chain flexibility.
表面に存在する官能基に対して、架橋剤の片末端の官能基が反応するが、もう一方の末端に存在する官能基は反応せずに残るのが好ましい。架橋剤の両末端が表面の官能基と反応するのであれば、ループを表面に形成し、生体分子を固定化するための官能基をもたなくなるので好ましくない。架橋剤の片方の末端が表面に反応して固定化された後に、反対側の末端に存在する別の官能基を利用して、生体分子を固定化する。従って、二つの異なる官能基を有するヘテロ二官能型の高分子であることが好ましい。 The functional group at one end of the crosslinking agent reacts with the functional group present on the surface, but the functional group present at the other end preferably remains unreacted. If both ends of the cross-linking agent react with a functional group on the surface, a loop is formed on the surface and there is no functional group for immobilizing a biomolecule. After one end of the cross-linking agent reacts and is immobilized on the surface, the biomolecule is immobilized using another functional group present at the opposite end. Accordingly, a heterobifunctional polymer having two different functional groups is preferable.
高分子の末端の官能基としてアミノ基、カルボキシル基、スクシンイミド基、スルホン化スクシンイミド基、マレイミド基、チオール基、アルデヒド基、ビニル基、イソシアネート基、エポキシ基、ヒドラジド基、アジド基などが挙げることができる。その中で反応する対象官能基が異なる組合せとして、アミノ基とカルボキシル基、アミノ基とマレイミド基が反応性の面で好ましい。 Examples of functional groups at the end of the polymer include amino groups, carboxyl groups, succinimide groups, sulfonated succinimide groups, maleimide groups, thiol groups, aldehyde groups, vinyl groups, isocyanate groups, epoxy groups, hydrazide groups, and azide groups. it can. Among them, amino groups and carboxyl groups, and amino groups and maleimide groups are preferable in terms of reactivity, as the target functional groups that react with each other.
固体表面の非イオン性官能基にヘテロ二官能型親水性高分子が共有結合的に固定化されたのちに、該高分子の片末端の官能基を利用して分子（Ａ）が表面に固定化される。高分子の片末端と分子（Ａ）の結合は特に限定されるものではなく、共有結合、キレート結合、イオン結合、水素結合などが挙げられる。 After the heterobifunctional hydrophilic polymer is covalently immobilized on the nonionic functional group on the solid surface, the molecule (A) is immobilized on the surface using the functional group at one end of the polymer. It becomes. The bond between one end of the polymer and the molecule (A) is not particularly limited, and examples thereof include a covalent bond, a chelate bond, an ionic bond, and a hydrogen bond.
本発明のヘテロ二官能基型親水性高分子を用いた後に、生体分子に結合する官能基、物質を導入することも、本発明に含まれる。例えば、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）基を含む物質をヘテロ二官能型高分子によって固定化した後に、ヒスチジンタグ蛋白をニッケルキレート結合で表面に導入する方法や、ビオチンあるいはストレプトアビジンをヘテロ二官能基型架橋剤によって導入した後に、ビオチン化生体分子を表面に導入する方法などが考えられる。 Introducing functional groups and substances that bind to biomolecules after using the heterobifunctional type hydrophilic polymer of the present invention is also included in the present invention. For example, a substance containing a nitrilotriacetic acid (NTA) group is immobilized by a heterobifunctional polymer, and then a histidine tag protein is introduced to the surface with a nickel chelate bond, or biotin or streptavidin is heterobifunctional. A method of introducing a biotinylated biomolecule onto the surface after introduction by a crosslinking agent is conceivable.
本発明によって分子（Ａ）が親水性高分子を介して表面に固定化されることで、非特異的な結合が抑制される。しかし、本発明の効果は、非特異的結合の抑制だけにとどまらないと予想される。基板からスペースをとって分子（Ａ）が固定化されるためにスペーサーとして機能し、基板による影響、例えば立体障害による影響を軽減することができると期待される。また、ポリエチレングリコールなどに代表されるようなフレキシブルな高分子鎖を採用することで、固定化した分子（Ａ）にモビリティを与え、より溶液に近い状態で、相互作用を解析することが可能になると予想される。 By the present invention, the molecule (A) is immobilized on the surface via the hydrophilic polymer, so that nonspecific binding is suppressed. However, the effect of the present invention is not limited to the suppression of non-specific binding. Since the molecule (A) is immobilized by taking a space from the substrate, it functions as a spacer, and it is expected that the influence of the substrate, for example, the influence of steric hindrance can be reduced. In addition, by adopting a flexible polymer chain as typified by polyethylene glycol, it is possible to give mobility to the immobilized molecule (A) and analyze the interaction in a state closer to the solution. It is expected to be.
生体分子を固定化する固体表面としては、相互作用解析に適した平面基板が好ましい。平面基板には、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法による相互作用解析が可能な金薄層が非常に好ましい。金薄層表面が好ましい理由はもう一つあり、金−硫黄結合を利用して、表面に官能基を導入できることが挙げられる。すなわち、チオール基あるいはジスルフィド基と反応の起点となる官能基の両方をもつ物質を用いることで、表面に官能基を導入できる。導入した官能基にヘテロ二官能基型架橋剤を反応させて、本発明を達成することができる。 As the solid surface for immobilizing biomolecules, a flat substrate suitable for interaction analysis is preferable. For the planar substrate, a thin gold layer capable of analyzing the interaction by the surface plasmon resonance (SPR) method is very preferable. There is another reason why the surface of the gold thin layer is preferable, and it is possible to introduce a functional group on the surface using a gold-sulfur bond. That is, a functional group can be introduced on the surface by using a substance having both a thiol group or a disulfide group and a functional group serving as a starting point for the reaction. The present invention can be achieved by reacting the introduced functional group with a heterobifunctional type crosslinking agent.
また、固定化する物質は複数である方が、ハイスループットな解析ができるために好ましく、３種類以上の異なる生体分子を同時に解析できるのが好ましい。複数の物質を固定化するためにはアレイ状に物質を固定化するのが好ましく、それぞれの固定化部位にて相互作用を解析することが可能となる。固定化される生体分子は特に限定されるものではなく、核酸、タンパク質、ペプチド、糖鎖などが挙げられる。中でも安定であることと、多くの種類を容易に確保するという点で抗体が好ましい。 In addition, a plurality of substances to be immobilized are preferable because high-throughput analysis is possible, and it is preferable that three or more different biomolecules can be analyzed simultaneously. In order to immobilize a plurality of substances, it is preferable to immobilize the substances in an array, and the interaction can be analyzed at each immobilization site. The biomolecule to be immobilized is not particularly limited, and examples thereof include nucleic acids, proteins, peptides, sugar chains and the like. Among these, antibodies are preferable in that they are stable and many types can be easily secured.
本発明の基板は電荷の影響が軽減されており、かつ親水性高分子を介して分子（Ａ）を固定化することができるため、非特異的吸着を抑制する効果を有する。従って、本方法は生体分子間の相互作用解析における生体分子の固定化方法として適している。相互作用解析の方法としてはＳＰＲ法が好ましく、アレイの解析が可能なＳＰＲイメージング法が特に好ましい。ＳＰＲ法はラベルフリーな相互作用解析方法であり、タンパク質が固定化生体分子に結合する解析に非常に適している。なぜならば、タンパク質はラベル操作によって活性を失う可能性があるためである。 The substrate of the present invention has an effect of suppressing non-specific adsorption because the influence of electric charge is reduced and the molecule (A) can be immobilized via a hydrophilic polymer. Therefore, this method is suitable as a method for immobilizing biomolecules in the interaction analysis between biomolecules. As an interaction analysis method, an SPR method is preferable, and an SPR imaging method capable of analyzing an array is particularly preferable. The SPR method is a label-free interaction analysis method and is very suitable for analysis in which proteins bind to immobilized biomolecules. This is because the protein may lose its activity by labeling.
分子（Ｂ）は特に限定されるものではないが、上記のようにタンパク質の場合に、本発明は適している。（Ｂ）が含まれる溶液も特に限定されるものではないが、緩衝液、細胞抽出液、血清・血漿などの体液などが挙げられる。本発明は非特異的吸着が少ない利点を有するため、細胞抽出液や血清中の物質の解析に応用可能である。細胞抽出液には、細胞破砕液、またそれらを希釈した液も含まれる。体液には生体から得られる液体成分すべてを含み、血液成分、***などが挙げられる。
将来的には抗体を固定化したアレイを用いて、細胞内や血液内に存在する物質の解析に応用することが可能と期待できる。
The molecule (B) is not particularly limited, but the present invention is suitable for a protein as described above. The solution containing (B) is not particularly limited, and examples thereof include buffer solutions, cell extracts, and body fluids such as serum and plasma. Since the present invention has an advantage of less nonspecific adsorption, it can be applied to analysis of substances in cell extracts and serum. The cell extract includes a cell disruption solution and a solution obtained by diluting them. Body fluid includes all liquid components obtained from living organisms, and examples include blood components and semen.
In the future, it can be expected that it can be applied to the analysis of substances present in cells and blood using an array in which antibodies are immobilized.
表面プラズモン共鳴におけるシグナルの評価方法は特に限定されるものではないが、ランニングバッファを基準として、細胞抽出液や体液を流しいれる前後のシグナル差の結果（前後変化）を取ることが考えられる。また、細胞抽出液や体液を流しれた直後からの途中の変化（流入中変化）も取ることができる。非特異的な吸着が多い場合は、細胞抽出液・体液中の核酸や脂質などによる非特異的吸着が非常に速い速度で完了したのちに、流入中の変化を観察する手段が有効な場合がある。 The signal evaluation method in the surface plasmon resonance is not particularly limited, but it is conceivable to take the result of signal difference (before and after change) before and after flowing the cell extract or body fluid on the basis of the running buffer. Further, it is possible to take a change (change during inflow) immediately after flowing the cell extract or body fluid. If there is a lot of nonspecific adsorption, it may be effective to observe changes during inflow after nonspecific adsorption by nucleic acids or lipids in cell extracts and body fluids is completed at a very fast rate. is there.
以下に実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。
［実施例］
厚さ２ｍｍ、１８ｍｍ×１８ｍｍのＳＦ１５製透明ガラス基板上にクロム３ｎｍを蒸着した後、金を４５ｎｍ蒸着した。蒸着の厚みは水晶発振子にてモニターした。金が表面に蒸着された基板を８−Ｈｙｄｒｏｘｙ−１−Ｏｃｔａｎｅｔｈｉｏｌ（８−ＨＯＴ，同仁化学研究所製）の１ｍＭエタノール溶液に１６時間浸漬し、８−ＨＯＴの自己組織化表面を形成させた。この操作により基板表面に非イオン性のヒドロキシ基が導入できる。
EXAMPLES The present invention will be specifically described below with reference to examples, but the present invention is not limited to the examples.
[Example]
After vapor-depositing 3 nm of chromium on a transparent glass substrate made of SF15 having a thickness of 2 mm and 18 mm × 18 mm, gold was vapor-deposited by 45 nm. The thickness of the deposition was monitored with a crystal oscillator. The substrate on which gold was deposited was immersed in a 1 mM ethanol solution of 8-Hydroxy-1-Octanethiol (8-HOT, manufactured by Dojindo Laboratories) for 16 hours to form a self-organized surface of 8-HOT. By this operation, a nonionic hydroxy group can be introduced on the substrate surface.
Ｔｏｓｙｌ Ｃｈｌｏｒｉｄｅ（東京化成製）０．５ｇを５ｍｌの無水アセトンに溶解し、１ｍｌのピリジンを加えて中和した。この溶液中に上記のヒドロキシ基表面の金基板を１０分間浸漬し、ヒドロキシ基をトシル化した。トシル化した表面に分子量３，４００の末端にアミノ基とカルボシキル基を有するヘテロ二官能型ポリエチレングリコール（ＮＨ2−ＰＥＧ−ＣＯＯＨ，Ｎｅｋｔａｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ社製）をリン酸緩衝液（２０ｍＭ リン酸、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．２）に１０ｍｇ／ｍｌで溶解し、金表面に２時間反応させた。表面に形成したトシル基とＮＨ2−ＰＥＧ−ＣＯＯＨのアミノ基が反応し、カルボキシル基は未反応のまま残るため、ＰＥＧを介してカルボキシル基を表面に導入することができた。 0.5 g of Tosyl Chloride (manufactured by Tokyo Chemical Industry) was dissolved in 5 ml of anhydrous acetone, and neutralized by adding 1 ml of pyridine. The gold substrate on the surface of the hydroxy group was immersed in this solution for 10 minutes to tosylate the hydroxy group. A heterobifunctional polyethylene glycol (NH 2 -PEG-COOH, manufactured by Nektar Therapeutics) having an amino group and a carboxyl group at the end of a molecular weight of 3,400 on a tosylated surface is mixed with a phosphate buffer (20 mM phosphate, 150 mM NaCl). , PH 7.2) at 10 mg / ml and reacted on the gold surface for 2 hours. Since the tosyl group formed on the surface reacted with the amino group of NH 2 -PEG-COOH and the carboxyl group remained unreacted, the carboxyl group could be introduced to the surface via PEG.
０．２Ｍ水溶性カルボジイミド（ＥＤＣ：ナカライテスク社製）、０．０５Ｍ Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ナカライテスク社製）のリン酸緩衝液の溶液に金基板を一時間浸漬し、カルボキシル基をスクシンイミド化した。 The gold substrate was immersed in a phosphate buffer solution of 0.2M water-soluble carbodiimide (EDC: manufactured by Nacalai Tesque) and 0.05M N-hydroxysuccinimide (manufactured by Nacalai Tesque) for 1 hour to succinimidize the carboxyl group. .
得られたスクシンイミド化表面にＭｕｌｔｉＳＰＲｉｎｔｅｒ自動スポッター（東洋紡績社製）を用いて、抗アクチン抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ社製）、抗ＫＯＤ抗体（東洋紡績社製）、抗ストレプトアビジン抗体（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を２００μｇ／ｍｌの濃度でスポットし、２時間反応させてアレイを作製した。スポットの大きさは直径約５００μｍである。以上の表面反応の化学式を図１に示す。 An anti-actin antibody (manufactured by Santa Cruz), anti-KOD antibody (manufactured by Toyobo), anti-streptavidin antibody (manufactured by Vector Laboratories) using a MultiSPRinter automatic spotter (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) on the obtained succinimidized surface ) Was spotted at a concentration of 200 μg / ml and reacted for 2 hours to prepare an array. The spot size is about 500 μm in diameter. The chemical formula of the above surface reaction is shown in FIG.
抗体を固定化した表面をリン酸緩衝液で洗浄した後、未反応のスクシンイミド基をブロックするため濃度１０ｍｇ／ｍｌのｍＰＥＧ−ＮＨ2（Ｎｅｋｔａｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ社製）のリン酸緩衝液溶液に金スライドを１５時間浸漬し、リン酸緩衝液で洗浄して抗体アレイを得た。 After washing the surface on which the antibody is immobilized with a phosphate buffer, a gold slide is placed on a phosphate buffer solution of mPEG-NH 2 (manufactured by Nektar Therapeutics) at a concentration of 10 mg / ml to block unreacted succinimide groups. It was immersed for 15 hours and washed with a phosphate buffer to obtain an antibody array.
測定対象物質としては細胞抽出液内に豊富に存在するアクチンを選択した。細胞としてはマウスのＴｈｙｍｕｓ（胸腺）を用いた。マウスから胸腺を摘出し、哺乳類細胞溶解試薬ＣｅｌＬｙｔｉｃ Ｍ（ＳＩＧＭＡ社製）を用い、Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ阻害剤を加え、機械的に破砕し、遠心してその上清を採取した。最後に０．４５μｍのフィルターで濾過し、Ｔｈｙｍｕｓ抽出液とした。 As a substance to be measured, actin abundant in the cell extract was selected. As a cell, mouse Thymus (thymus) was used. The thymus was excised from the mouse, and a proteinase inhibitor was added using a mammalian cell lysis reagent CelLytic M (manufactured by SIGMA), mechanically disrupted, and centrifuged to collect the supernatant. Finally, it was filtered through a 0.45 μm filter to obtain a Thymus extract.
抗体アレイを形成させた金チップをＭｕｌｔｉＳＰＲｉｎｔｅｒ ＳＰＲイメージング機器（東洋紡績社製）にセットし、リン酸緩衝液をフローセル内に流した。ＳＰＲからのシグナルが安定したのを確認した後に、Ｔｈｙｍｕｓ抽出液をリン酸緩衝液で１０倍希釈した液を約１５分間ＳＰＲ装置に流しいれ、次にリン酸緩衝液を流しいれて洗浄した。その際のシグナル変化を図２に示す。抗アクチン抗体を固定化したスポットにおいてＳＰＲのシグナルが大きく増大する結果が得られた。その他のスポットにおいても、シグナルの増大がみられたが、その程度は少ない。Ｔｈｙｍｕｓ抽出液の１０倍希釈液（１０×Ｔｈｙｍｕｓ）を流しいれている間にシグナルが増大するのは、細胞抽出液中の成分によるバルク効果によるものが大きい。リン酸緩衝液で流して洗浄した後でも、全てのスポットで多少なりともシグナルは増大している。このシグナルの差が非特異的吸着によるものであり、完全に非特異吸着を抑制することはできない。 The gold chip on which the antibody array was formed was set in a MultiSPRinter SPR imaging device (manufactured by Toyobo Co., Ltd.), and a phosphate buffer was flowed into the flow cell. After confirming that the signal from the SPR was stabilized, a solution obtained by diluting the Thymus extract 10-fold with a phosphate buffer was poured into the SPR apparatus for about 15 minutes, and then washed with a phosphate buffer. The signal change at that time is shown in FIG. As a result, the SPR signal was greatly increased in the spot where the anti-actin antibody was immobilized. An increase in signal was also observed at other spots, but the level was small. The increase in signal while flowing a 10-fold diluted solution of Thymus extract (10 × Thymus) is largely due to the bulk effect of the components in the cell extract. Even after rinsing with phosphate buffer, the signal is somewhat increased in all spots. This difference in signal is due to non-specific adsorption, and non-specific adsorption cannot be completely suppressed.
しかし、本実施例において抗アクチン抗体への細胞抽出液中に存在するアクチンが特異的に吸着するのを検出できていると考える。リン酸緩衝液を流している状態を基準とし、１０×Ｔｈｙｍｕｓを流す前後のシグナル差の結果（前後変化）を表１に示す。また、１０×Ｔｈｙｍｕｓを流しいれ始めてから１分後と１５分後のシグナルの差（流入中変化）についても表１に示す。前後変化にせよ、流入中変化にせよ、抗アクチン抗体におけるシグナル変化は、他の抗体に比べて非常に大きい。 However, in this example, it is considered that the specific adsorption of actin present in the cell extract to the anti-actin antibody can be detected. Table 1 shows the signal difference results (before and after change) before and after flowing 10 × Thymus, based on the condition in which the phosphate buffer is flowing. Table 1 also shows the difference in signal (change during inflow) after 1 minute and 15 minutes after starting to flow 10 × Thymus. The signal change in the anti-actin antibody is very large compared to the other antibodies, whether it is a back-and-forth change or a change during inflow.
続けて、この抗体アレイに、１００ｎｇ／ｍｌの濃度でＫＯＤ（東洋紡績社製）を添加した１０×Ｔｈｙｍｕｓを流した時のＳＰＲシグナル変化を図７に示す。抗ＫＯＤ抗体におけるシグナルの上昇が非常に大きく、ＫＯＤを検出できていると言える。さらに、続けて１００ｎｇ／ｍｌの濃度でストレプトアビジン（ＳＡ：Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を添加した１０×Ｔｈｙｍｕｓを流した時のＳＰＲシグナル変化を図８に示す。抗ＳＡ抗体におけるシグナルの上昇が非常に大きく、ＳＡを検出できていると言える。このように細胞抽出液中の物質を検出することが可能であった。 Next, FIG. 7 shows changes in SPR signal when 10 × Thymus added with KOD (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) at a concentration of 100 ng / ml was passed through this antibody array. It can be said that the signal rise in the anti-KOD antibody is very large and KOD can be detected. Furthermore, FIG. 8 shows changes in SPR signal when 10 × Thymus added with streptavidin (SA: Vector Laboratories) at a concentration of 100 ng / ml was passed. It can be said that the signal rise in the anti-SA antibody is very large and SA can be detected. Thus, it was possible to detect the substance in a cell extract.
［比較例］
厚さ２ｍｍ、１８ｍｍ×１８ｍｍのＳＦ１５製透明ガラス基板上にクロム３ｎｍを蒸着した後、金を４５ｎｍ蒸着した。蒸着の厚みは水晶発振子にてモニターした。金が表面に蒸着された基板を７−Ｃａｒｂｏｘｙ−１−Ｈｅｐｔａｎｅｔｈｉｏｌ（７−ＣＨＴ，同仁化学研究所製）の１ｍＭエタノール溶液に１６時間浸漬し、７−ＣＨＴの自己組織化表面を形成させた。この操作により基板表面にマイナスの電荷を持ったカルボキシル基が導入される。
[Comparative example]
After vapor-depositing 3 nm of chromium on a transparent glass substrate made of SF15 having a thickness of 2 mm and 18 mm × 18 mm, gold was vapor-deposited by 45 nm. The thickness of the deposition was monitored with a crystal oscillator. The substrate on which gold was deposited was immersed in a 1 mM ethanol solution of 7-Carboxy-1-Heptanethiol (7-CHT, manufactured by Dojindo Laboratories) for 16 hours to form a 7-CHT self-assembled surface. By this operation, a carboxyl group having a negative charge is introduced to the substrate surface.
０．２Ｍ水溶性カルボジイミド（ＥＤＣ：ナカライテスク社製）、０．０５Ｍ Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ナカライテスク社製）のリン酸緩衝液の溶液に金基板を一時間浸漬し、カルボキシル基をスクシンイミド化した。 The gold substrate was immersed in a phosphate buffer solution of 0.2M water-soluble carbodiimide (EDC: manufactured by Nacalai Tesque) and 0.05M N-hydroxysuccinimide (manufactured by Nacalai Tesque) for 1 hour to succinimidize the carboxyl group. .
得られたスクシンイミド化表面にＭｕｌｔｉＳＰＲｉｎｔｅｒ自動スポッター（東洋紡績社製）を用いて、抗アクチン抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ社製）、抗ＫＯＤ抗体（東洋紡績社製）、抗ストレプトアビジン抗体（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を２００μｇ／ｍｌの濃度でスポットし、２時間反応させてアレイを作製した。スポットの大きさは直径約５００μｍである。以上の表面反応の化学式を図５に示す。 An anti-actin antibody (manufactured by Santa Cruz), anti-KOD antibody (manufactured by Toyobo), anti-streptavidin antibody (manufactured by Vector Laboratories) using a MultiSPRinter automatic spotter (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) on the obtained succinimidized surface ) Was spotted at a concentration of 200 μg / ml and reacted for 2 hours to prepare an array. The spot size is about 500 μm in diameter. The chemical formula of the above surface reaction is shown in FIG.
抗体を固定化した表面をリン酸緩衝液で洗浄した後、未反応のスクシンイミド基をブロックするため濃度１０ｍｇ／ｍｌのｍＰＥＧ−ＮＨ2（Ｎｅｋｔａｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ社製）のリン酸緩衝液溶液に金スライドを１５時間浸漬し、リン酸緩衝液で洗浄して抗体アレイを得た。この場合、自己組織化表面形成によって密に表面に導入されたカルボキシル基が未反応のまま残るため、基板にマイナス電荷が残る。 After washing the surface on which the antibody is immobilized with a phosphate buffer, a gold slide is placed on a phosphate buffer solution of mPEG-NH 2 (manufactured by Nektar Therapeutics) at a concentration of 10 mg / ml to block unreacted succinimide groups. It was immersed for 15 hours and washed with a phosphate buffer to obtain an antibody array. In this case, since the carboxyl groups densely introduced to the surface by the self-assembled surface formation remain unreacted, a negative charge remains on the substrate.
抗体アレイを形成させた金チップをＭｕｌｔｉＳＰＲｉｎｔｅｒ ＳＰＲイメージング機器（東洋紡績社製）にセットし、リン酸緩衝液をフローセル内に流した。ＳＰＲからのシグナルが安定したのを確認した後に、Ｔｈｙｍｕｓ抽出液をリン酸緩衝液で１０倍希釈した液を約１５分間ＳＰＲ装置に流しいれ、次にリン酸緩衝液を流しいれて洗浄した。その際のシグナル変化を図６に示す。抗アクチン抗体を固定化したスポットにおいてＳＰＲのシグナルが大きく増大する結果が得られたものの、その他のスポットにおいても、シグナルの増大がみられ、その区別はつきにくい。リン酸緩衝液を流している状態を基準とし、１０×Ｔｈｙｍｕｓを流す前後のシグナル差の結果（前後変化）を表１に示す。また、１０×Ｔｈｙｍｕｓを流しいれ始めてから１分後と１５分後のシグナルの差（流入中変化）についても表１に示す。抗アクチン抗体におけるシグナル変化は、他の抗体に比べて大きいものの、差が小さく検出できたかどうか判断がつきにくい。アクチン以外の抗体におけるシグナル増大は、基板の荷電による非特異的吸着であると考えることができる。 The gold chip on which the antibody array was formed was set in a MultiSPRinter SPR imaging device (manufactured by Toyobo Co., Ltd.), and a phosphate buffer was flowed into the flow cell. After confirming that the signal from the SPR was stabilized, a solution obtained by diluting the Thymus extract 10-fold with a phosphate buffer was poured into the SPR apparatus for about 15 minutes, and then washed with a phosphate buffer. The signal change at that time is shown in FIG. Although a result of a large increase in the SPR signal was obtained at the spot on which the anti-actin antibody was immobilized, an increase in the signal was also observed at other spots, and it was difficult to distinguish them. Table 1 shows the signal difference results (before and after change) before and after flowing 10 × Thymus, based on the condition in which the phosphate buffer is flowing. Table 1 also shows the difference in signal (change during inflow) after 1 minute and 15 minutes after starting to flow 10 × Thymus. Although the signal change in the anti-actin antibody is larger than that of the other antibodies, it is difficult to judge whether the difference is small. The increase in signal in antibodies other than actin can be considered as non-specific adsorption due to substrate charging.
続けて、この抗体アレイに、１００ｎｇ／ｍｌの濃度でＫＯＤ（東洋紡績社製）を添加した１０×Ｔｈｙｍｕｓを流した時のＳＰＲシグナル変化を図７に示す。抗ＫＯＤ抗体におけるシグナルの上昇は大きく、ＫＯＤを検出できていると言えるが、実施例と比べてシグナル増大は小さい。さらに、続けて１００ｎｇ／ｍｌの濃度でストレプトアビジン（ＳＡ：Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を添加した１０×Ｔｈｙｍｕｓを流した時のＳＰＲシグナル変化を図８に示す。抗ＳＡ抗体におけるシグナルについても、実施例と比べると小さいと結果であった。非特異吸着によって固定化した抗体が十分に機能しなくなっていると思われる。 Next, FIG. 7 shows changes in SPR signal when 10 × Thymus added with KOD (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) at a concentration of 100 ng / ml was passed through this antibody array. Although the signal rise in the anti-KOD antibody is large and it can be said that KOD can be detected, the signal increase is small compared to the Examples. Furthermore, FIG. 8 shows changes in SPR signal when 10 × Thymus added with streptavidin (SA: Vector Laboratories) at a concentration of 100 ng / ml was passed. The signal for the anti-SA antibody was also small when compared to the examples. The antibody immobilized by non-specific adsorption seems not to function sufficiently.
本発明により、表面に導入した非イオン性官能基にヘテロ二官能型親水性高分子を共有結合的に固定化し、親水性高分子を介して生体分子を表面に固定化することで、非特異吸着がなく精密な生体分子の相互作用を観察する方法を提供し、産業界に貢献すること大である。 According to the present invention, a heterobifunctional hydrophilic polymer is covalently immobilized on a nonionic functional group introduced on the surface, and a biomolecule is immobilized on the surface via the hydrophilic polymer, thereby making it non-specific. It is important to contribute to the industry by providing a method for observing precise biomolecule interactions without adsorption.
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