JP2005137297A - Method for separating and purifying nucleic acid - Google Patents

Method for separating and purifying nucleic acid Download PDF

Info

Publication number
JP2005137297A
JP2005137297A JP2003378573A JP2003378573A JP2005137297A JP 2005137297 A JP2005137297 A JP 2005137297A JP 2003378573 A JP2003378573 A JP 2003378573A JP 2003378573 A JP2003378573 A JP 2003378573A JP 2005137297 A JP2005137297 A JP 2005137297A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
nucleic acid
porous membrane
separating
washing
adsorbing
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2003378573A
Other languages
Japanese (ja)
Inventor
Koji Muratani
浩二 村谷
Toshihiro Mori
寿弘 森
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Fujifilm Holdings Corp
Original Assignee
Fuji Photo Film Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Fuji Photo Film Co Ltd filed Critical Fuji Photo Film Co Ltd
Priority to JP2003378573A priority Critical patent/JP2005137297A/en
Publication of JP2005137297A publication Critical patent/JP2005137297A/en
Pending legal-status Critical Current

Links

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a ready and rapid method for separating and purifying a nucleic acid, having excellent separation performance, good washing efficiency, and excellent fitness to automation and miniaturization by using a porous membrane enabling the membrane substantially having the same separating function to be mass-produced. <P>SOLUTION: The method for separating and purifying the nucleic acid comprises (1) a step for passing a sample solution containing the nucleic acid through the nucleic acid-adsorbing porous membrane to adsorb the nucleic acid in the porous membrane, (2) a step for washing the porous membrane in the state in which the nucleic acid is adsorbed, and (3) a step for desorbing the nucleic acid from the porous membrane by passing a recovering solution through the porous membrane. The nucleic acid-adsorbing porous membrane is the porous membrane adsorbing the nucleic acid by an interaction substantially free from an ion bond, and the ionic strength of the washing liquid is 5-500 mmol/kg. <P>COPYRIGHT: (C)2005,JPO&NCIPI

Description

本発明は、核酸を分離精製する方法に関する。より詳細には、本発明は、核酸を分離精製するために、検体から核酸を含む試料溶液を得る方法に関する。さらに詳しくは、得られた核酸を含む試料溶液を用いて、少なくとも二個の開口を有する容器内に核酸吸着性多孔膜を収容した核酸分離精製カ−トリッジと圧力発生装置を用いて、核酸を含む検体から核酸を分離精製する方法に関する。   The present invention relates to a method for separating and purifying nucleic acid. More specifically, the present invention relates to a method for obtaining a sample solution containing a nucleic acid from a specimen in order to separate and purify the nucleic acid. More specifically, using the sample solution containing the obtained nucleic acid, the nucleic acid is purified using a nucleic acid separation and purification cartridge containing a nucleic acid-adsorbing porous membrane in a container having at least two openings and a pressure generator. The present invention relates to a method for separating and purifying nucleic acid from a contained sample.

核酸は、様々な分野で種々の形態で使用されている。例えば、組換え核酸技術の領域においては、核酸をプローブ、ゲノム核酸、およびプラスミド核酸の形状で用いることを要求する。   Nucleic acids are used in various forms in various fields. For example, in the area of recombinant nucleic acid technology, it is required to use nucleic acids in the form of probes, genomic nucleic acids, and plasmid nucleic acids.

診断分野においても、核酸は種々の方法で用いられている。例えば、核酸プローブは、ヒトの病原体の検出および診断に日常的に用いられている。同様に核酸は遺伝障害の検出に用いられている。核酸はまた食品汚染物質の検出にも用いられている。さらに、核酸は遺伝地図の作製からクローニングおよび組換え発現におよぶ種々の理由により、興味ある核酸の位置確認、同定および単離において日常的に用いられている。   In the diagnostic field, nucleic acids are used in various ways. For example, nucleic acid probes are routinely used for detection and diagnosis of human pathogens. Similarly, nucleic acids are used to detect genetic disorders. Nucleic acids are also used to detect food contaminants. In addition, nucleic acids are routinely used in the localization, identification and isolation of nucleic acids of interest for a variety of reasons ranging from genetic mapping to cloning and recombinant expression.

多くの場合、核酸は極めて少量でしか入手できず、そして単離および精製操作が煩雑で時間を要する。このしばしば時間を消費する煩雑な操作は核酸の損失に結びつきやすい。血清、尿およびバクテリアのカルチャーから得られた試料の核酸の精製においては、コンタミネーションおよび疑陽性の結果が生じるという危険性も加わる。   In many cases, nucleic acids are available only in very small amounts, and the isolation and purification operations are cumbersome and time consuming. This often time-consuming and cumbersome operation tends to lead to the loss of nucleic acids. The purification of sample nucleic acids from serum, urine and bacterial cultures also adds the risk of contamination and false positive results.

広く知られた精製方法の一つに、核酸を二酸化珪素、シリカポリマー、珪酸マグネシウム等の固相に吸着させ、引き続く洗浄、脱着等の操作によって精製する方法がある（例えば、特許文献１）。この方法は、分離性能としては優れているが、簡便性、迅速性、自動化および小型化適性においては十分でなく、同一性能の吸着媒体の工業的大量生産が困難であり、かつ取扱いが不便で、種々の形状に加工しがたい等の問題点がある。   As one of widely known purification methods, there is a method in which a nucleic acid is adsorbed on a solid phase such as silicon dioxide, silica polymer, magnesium silicate, etc., and purified by subsequent operations such as washing and desorption (for example, Patent Document 1). Although this method is excellent in separation performance, it is not sufficient in terms of simplicity, speed, automation, and suitability for miniaturization, industrial mass production of adsorption media having the same performance is difficult, and handling is inconvenient. There are problems such as difficulty in processing into various shapes.

また、特許文献２には、簡便かつ効率よく核酸を分離精製する方法の一つとして、固相に核酸を吸着させる溶液及び固相から核酸を脱着させる溶液をそれぞれ用いて、表面に水酸基を有する有機高分子から成る固相に核酸を吸着及び脱着させることによって、核酸を分離精製する方法が報告されている。   In Patent Document 2, as one method for separating and purifying nucleic acid easily and efficiently, a solution having a nucleic acid adsorbed on a solid phase and a solution desorbing nucleic acid from the solid phase are used, respectively, and has a hydroxyl group on the surface. A method for separating and purifying a nucleic acid by adsorbing and desorbing the nucleic acid on a solid phase composed of an organic polymer has been reported.

この出願の発明に関連する前記の先行技術には、次ぎの文献がある。
特公平７−５１０６５号公報 特開２００３−１２８６９１号公報 The above-mentioned prior art relating to the invention of this application includes the following documents.
Japanese Patent Publication No. 7-51065 JP 2003-128691 A

本発明の目的は、検体中の核酸を核酸吸着性の多孔膜に吸着させた後、洗浄等を経て脱着させて核酸を分離精製する方法を提供することである。より具体的には、分離性能に優れ、洗浄効率が良く、簡便で、迅速で、自動化および小型化適性に優れ、実質的に同一の分離性能を有するものを大量に生産可能である多孔膜を使用した核酸の分離精製方法を提供することである。   An object of the present invention is to provide a method for separating and purifying nucleic acid by adsorbing a nucleic acid in a specimen to a nucleic acid-adsorbing porous membrane and then desorbing the nucleic acid through washing or the like. More specifically, a porous membrane having excellent separation performance, good cleaning efficiency, simple, rapid, excellent in automation and miniaturization, and capable of mass production of substantially the same separation performance. It is to provide a method for separating and purifying the used nucleic acid.

本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、核酸を多孔性膜に吸着及び脱着させる過程を含む核酸の分離精製方法において、該多孔性膜として実質的にイオン結合が関与しない相互作用で核酸が吸着する多孔性膜を用い、且つ洗浄液のイオン強度を制御することによって、核酸を含む検体から核酸を収率よく、高純度で分離精製することができることを見出した。本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。   As a result of diligent studies to solve the above problems, the inventors of the present invention have substantially no ionic bond as the porous membrane in the method for separating and purifying nucleic acid including the process of adsorbing and desorbing the nucleic acid on the porous membrane. It has been found that by using a porous membrane that adsorbs nucleic acid by interaction and controlling the ionic strength of the washing solution, the nucleic acid can be separated and purified with high yield and high purity from a sample containing nucleic acid. The present invention has been completed based on these findings.

即ち、本発明によれば、（１）核酸を含む試料溶液を核酸吸着性多孔性膜に通過させて、該多孔性膜内に核酸を吸着させる工程、(2) 洗浄液を該核酸吸着性多孔性膜に通過させて、核酸が吸着した状態で該核酸吸着性多孔性膜を洗浄する工程、及び(3)回収液を、該核酸吸着性多孔性膜に通過させて、該多孔性膜内から核酸を脱着させる工程を含有する核酸の分離精製方法において、該核酸吸着性多孔性膜が実質的にイオン結合が関与しない相互作用で核酸が吸着する多孔性膜であり、且つ、該洗浄液のイオン強度は５〜５００ｍｍｏｌ／Ｋｇであることを特徴とする核酸の分離精製方法が提供される。
本発明の核酸の分離精製方法では、上記(1)、(2)及び(3)の各工程において、核酸を含む試料溶液、洗浄液又は回収液を、加圧状態で核酸吸着性多孔性膜に通過させることが好ましい。 That is, according to the present invention, (1) a step of allowing a sample solution containing a nucleic acid to pass through a nucleic acid-adsorbing porous membrane and adsorbing the nucleic acid in the porous membrane; A step of washing the nucleic acid-adsorbing porous membrane in a state in which the nucleic acid is adsorbed by passing through the porous membrane, and (3) passing the recovered liquid through the nucleic acid-adsorbing porous membrane In the method for separating and purifying nucleic acid comprising the step of desorbing nucleic acid from the nucleic acid, the nucleic acid-adsorbing porous membrane is a porous membrane that adsorbs nucleic acid by an interaction that does not substantially involve ionic bonds, and the washing solution A method for separating and purifying nucleic acid, characterized in that the ionic strength is 5 to 500 mmol / Kg.
In the method for separating and purifying nucleic acid of the present invention, in each of the above steps (1), (2) and (3), the sample solution, the washing solution or the recovery solution containing the nucleic acid is applied to the nucleic acid-adsorbing porous membrane under pressure. It is preferable to let it pass.

上記洗浄工程に用いる洗浄液は、好ましくはイオン強度が１０〜４００ｍｍｏｌ／Ｋｇであるであり、より好ましくは２０〜３００ｍｍｏｌ／Ｋｇである。洗浄液のイオン強度が低すぎると、多孔性膜内に残留する洗浄液の量が多く洗浄効率が低下して核酸の分離精製度が低下する。一方、イオン強度が高すぎても、多孔性膜に吸着した核酸由来の蛋白質やその分解物の洗浄液への溶解が進行しにくく核酸の分離精製度が低下する。上記の範囲のイオン強度を選択することにより、核酸の分離精製度を維持しつつ、洗浄を迅速化することができる。イオン強度の調整は、洗浄液中の塩類やイオン性界面活性剤の種類と濃度などの調節によって行うことができる。   The washing liquid used in the washing step preferably has an ionic strength of 10 to 400 mmol / Kg, and more preferably 20 to 300 mmol / Kg. If the ionic strength of the washing solution is too low, the amount of the washing solution remaining in the porous membrane is large, and the washing efficiency is lowered and the nucleic acid separation and purification degree is lowered. On the other hand, even if the ionic strength is too high, dissolution of the nucleic acid-derived protein adsorbed on the porous membrane and its degradation product in the washing solution is difficult to proceed, and the degree of separation and purification of the nucleic acid decreases. By selecting an ionic strength within the above range, washing can be speeded up while maintaining the degree of separation and purification of the nucleic acid. The ionic strength can be adjusted by adjusting the kind and concentration of salts and ionic surfactants in the cleaning liquid.

また、洗浄液のイオン強度が上記範囲であれば、多孔性膜内に残留する洗浄液の残液が少ないので洗浄効率が高く１回の洗浄ですませることが可能であり、この点でも核酸の分離精製操作を迅速化できる。また、洗浄工程と回収工程の間に乾燥工程を設ける必要もないので、この点からも簡易化と迅速化を促進させることができる。
さらに、洗浄液のイオン強度が上記範囲であれば、核酸含有検体中の細胞膜や細胞質を分解するタンパク分解酵素などの酵素の活性が維持されるので、洗浄液中にタンパク質分解酵素、核酸分解酵素、ＤＮＡ分解酵素などを含有させる態様にも好ましく適用できる。
洗浄液には、イオン強度調整と核酸分離能向上の目的の水溶性塩として、ハロゲン化物の塩が含まれていることも好ましく、ハロゲン化物の中でも核酸を吸着させたまま、不純物の溶解を促して核酸と不純物の分離性を高める点で塩化物が適している。
一方、水溶性塩のカチオン成分として好ましいのは、一価または二価のカチオンであり、特にカリウム塩又はナトリウム塩が好ましく、中でもナトリウム塩が適している。
塩の濃度は１０ｍｍｏｌ／Ｌ以上含まれているのが好ましい。特に塩化ナトリウムが２０ｍｍｏｌ／Ｌ以上含まれていることが目的の効果を発揮するのに好ましい。 If the ionic strength of the cleaning solution is within the above range, the remaining cleaning solution remaining in the porous membrane is small, so that the cleaning efficiency is high and it can be performed by one cleaning. Operation can be speeded up. Further, since there is no need to provide a drying step between the washing step and the recovery step, simplification and speeding up can be promoted from this point.
Furthermore, if the ionic strength of the washing solution is within the above range, the activity of enzymes such as proteolytic enzymes that degrade cell membranes and cytoplasm in the nucleic acid-containing specimen is maintained, so that proteases, nucleolytic enzymes, DNAs are contained in the washing solution. The present invention can also be preferably applied to an embodiment containing a degrading enzyme or the like.
It is also preferable that the washing solution contains a halide salt as a water-soluble salt for the purpose of adjusting ionic strength and improving nucleic acid separation ability, and promotes dissolution of impurities while adsorbing nucleic acid among halides. Chloride is suitable because it increases the separation between nucleic acids and impurities.
On the other hand, monovalent or divalent cations are preferable as the cation component of the water-soluble salt, and potassium salt or sodium salt is particularly preferable, and sodium salt is particularly suitable.
The salt concentration is preferably 10 mmol / L or more. In particular, it is preferable that sodium chloride is contained in an amount of 20 mmol / L or more in order to exhibit the intended effect.

本発明による簡易で迅速な核酸の分離精製方法は、核酸吸着性多孔膜として水酸基を有する有機材料の多孔性膜を用いる場合に洗浄が迅速に行われ、残液も少なく、特に本発明の効果が顕著となる。水酸基を有する有機材料の多孔性膜の中でも、多糖構造を有する多孔性膜が好ましく、とりわけ再生セルロ−スの多孔性膜が効果的である。多孔性膜の更なる詳細は後述する。   The simple and rapid method for separating and purifying nucleic acid according to the present invention is such that when a porous membrane made of an organic material having a hydroxyl group is used as the nucleic acid-adsorbing porous membrane, the washing is performed quickly and there is little residual liquid. Becomes prominent. Among the porous membranes of organic materials having a hydroxyl group, porous membranes having a polysaccharide structure are preferred, and a regenerated cellulose porous membrane is particularly effective. Further details of the porous membrane will be described later.

本発明の上記核酸分離精製方法は、核酸分離精製カ−トリッジ、試薬のキット及び核酸分離精製陽自動装置を用いることにより、とくに簡易,迅速に行なうことができる。   The nucleic acid separation and purification method of the present invention can be carried out particularly easily and rapidly by using a nucleic acid separation and purification cartridge, a reagent kit and a nucleic acid separation and purification positive automatic apparatus.

多孔性膜としてイオン結合が関与しない相互作用で核酸が吸着する多孔性膜を用い、且つ多孔膜に吸着した核酸の洗浄に規定範囲のイオン強度を有する洗浄液を用い、続いて回収する本発明の核酸の分離精製方法により、分離性能良く、簡便で、迅速に、かつ自動化可能に、核酸を含む検体から核酸を分離精製することができる。   As the porous membrane, a porous membrane that adsorbs nucleic acids by an interaction that does not involve ionic bonds is used, and a washing solution having a specified range of ionic strength is used to wash the nucleic acids adsorbed on the porous membrane, and subsequently recovered. According to the method for separating and purifying nucleic acid, it is possible to separate and purify nucleic acid from a sample containing nucleic acid with good separation performance, in a simple, rapid and automatable manner.

本発明の核酸分離精製方法は、(1)核酸を含む試料溶液を核酸吸着性多孔性膜に通過させて、該多孔性膜内に核酸を吸着させる工程、(2)該核酸吸着性多孔性膜を、核酸が吸着した状態で、洗浄する工程、及び(3)回収液を、該核酸吸着性多孔性膜に通過させて、該多孔性膜内から核酸を脱着させる工程を少なくとも含むものである。
好ましくは、上記(1)、(2)及び(3)の各工程において、核酸を含む試料溶液、洗浄液又は回収液を、加圧状態で核酸吸着性多孔性膜に通過させるものであり、より好ましくは、上記(1)、(2)及び(3)の各工程において、少なくとも二個の開口を有する容器内に該核酸吸着性多孔性膜を収容した核酸分離精製カートリッジの一の開口に、核酸を含む試料溶液、洗浄液又は回収液を注入し、カートリッジの上記一の開口に結合された圧力差発生装置を用いてカートリッジ内を加圧状態にして、該注入した各液を通過させ、他の開口より排出させるものである。核酸を含む試料溶液、洗浄液又は回収液を加圧状態で上記多孔性膜に通過させることにより、装置をコンパクトに自動化することができ、好ましい。加圧は、好ましくは１０〜２００ｋｐａ、より好ましくは４０〜１００ｋｐａの程度で行われる。 The method for separating and purifying nucleic acid according to the present invention comprises (1) a step of allowing a sample solution containing nucleic acid to pass through a nucleic acid-adsorbing porous membrane, and adsorbing the nucleic acid in the porous membrane; (2) the nucleic acid-adsorbing porous It includes at least a step of washing the membrane in a state where nucleic acid is adsorbed, and (3) a step of passing the recovered liquid through the nucleic acid-adsorbing porous membrane to desorb the nucleic acid from the porous membrane.
Preferably, in each of the above steps (1), (2) and (3), the sample solution, the washing solution or the recovery solution containing the nucleic acid is passed through the nucleic acid-adsorbing porous membrane in a pressurized state. Preferably, in each step of the above (1), (2) and (3), in one opening of the nucleic acid separation and purification cartridge containing the nucleic acid-adsorbing porous membrane in a container having at least two openings, A sample solution, a washing solution or a recovery solution containing nucleic acid is injected, the inside of the cartridge is pressurized using a pressure difference generator connected to the one opening of the cartridge, and each injected solution is allowed to pass through. It is discharged from the opening. By passing a sample solution, a washing solution or a recovery solution containing nucleic acid through the porous membrane under pressure, the apparatus can be automated in a compact manner, which is preferable. The pressurization is preferably performed at a rate of 10 to 200 kpa, more preferably 40 to 100 kpa.

上記の核酸分離精製の工程では、最初の核酸を含む試料液を注入する工程から核酸分離精製カ−トリッジ外に核酸を得るまでの工程を１０分以内、好適な状況では核酸を含む試料２分以内で終了することが可能である。また、上記の核酸分離精製の工程では核酸を５０％以上、好適な状況では核酸を含む試料９０％以上の収率で得ることが可能である。   In the nucleic acid separation and purification step, the steps from injecting the sample solution containing the first nucleic acid to obtaining the nucleic acid outside the nucleic acid separation and purification cartridge are within 10 minutes, and in a suitable situation, the sample containing nucleic acid is 2 minutes. It is possible to finish within. In the nucleic acid separation and purification step, the nucleic acid can be obtained in a yield of 50% or more, and in a suitable situation, the sample containing the nucleic acid can be obtained in a yield of 90% or more.

また、上記の核酸分離精製の工程では、１ｋｂｐから２００ｋｂｐ、好ましくは２０ｋｂｐから１４０ｋｂｐと広範囲に及ぶ分子量の核酸を回収することができる。すなわち、従来行なわれているガラスフィルタ−を用いたスピンカラム法（キアゲン社）に比べて、長鎖の核酸を回収できる。   In the nucleic acid separation and purification step, nucleic acids having a molecular weight ranging from 1 kbp to 200 kbp, preferably from 20 kbp to 140 kbp can be recovered. That is, long-chain nucleic acids can be recovered as compared with the conventional spin column method (Qiagen) using a glass filter.

また、上記の核酸分精製の工程では、紫外可視分光光度計で求めた２６０ｎｍ及び２８０ｎｍの分光吸光度の吸光度比（２６０ｎｍ／２８０ｎｍ）が、ＤＮＡの場合は１．６〜２．０、ＲＮＡの場合は１．８〜２．２となる純度を持つ核酸を回収することができ、不純物混入量の少ない高純度の核酸を定常的に得ることができる。さらには、紫外可視分光光度計での吸光度比（２６０ｎｍ／２８０ｎｍ）がＤＮＡの場合は１．８付近、ＲＮＡの場合は２．０付近となる純度を持つ核酸を回収することができる。   In the nucleic acid fraction purification step, the absorbance ratio (260 nm / 280 nm) of the spectral absorbances at 260 nm and 280 nm determined with an ultraviolet-visible spectrophotometer is 1.6 to 2.0 in the case of DNA, and in the case of RNA. Can recover a nucleic acid having a purity of 1.8 to 2.2, and can constantly obtain a high-purity nucleic acid with a small amount of impurities. Furthermore, it is possible to recover a nucleic acid having a purity of about 1.8 when the absorbance ratio (260 nm / 280 nm) in the ultraviolet-visible spectrophotometer is about DNA and about 2.0 when RNA is used.

また、上記工程において、圧力差発生装置としては、注射器、ピペッタ、エバポレーター、あるいはペリスタポンプのような加圧が可能なポンプ、或いは、エバポレーター等の減圧可能なもの等が挙げられる。これらの内、手動操作には注射器が、自動操作にはポンプが適している。また、ピペッタは片手操作が容易にできるという利点を有する。好ましくは、圧力差発生装置は、核酸分離精製カ−トリッジの一の開口に着脱可能に結合されている。   In the above process, examples of the pressure difference generating device include a pump capable of pressurization such as a syringe, pipetter, evaporator, or peristaltic pump, or a device capable of depressurization such as an evaporator. Of these, a syringe is suitable for manual operation, and a pump is suitable for automatic operation. Also, the pipetter has the advantage that it can be easily operated by one hand. Preferably, the pressure difference generator is detachably coupled to one opening of the nucleic acid separation / purification cartridge.

本発明において使用できる検体に制限はないが、例えば診断分野においては、検体として採取された全血、血漿、血清、尿、便、***、唾液等の体液、あるいは植物（又はその一部）、動物（またはその一部）、細菌、ウイルスなど、あるいはそれらの溶解物およびホモジネートなどの生物材料から調製された溶液が対象となる。   There are no limitations on the specimens that can be used in the present invention. For example, in the diagnostic field, whole blood collected as specimens, plasma, serum, urine, feces, semen, saliva and other body fluids, or plants (or parts thereof), Of interest are solutions prepared from biological materials such as animals (or parts thereof), bacteria, viruses, etc., or lysates and homogenates thereof.

最初にこれらの検体について細胞膜および核膜等を溶解して核酸を可溶化する試薬を含む水溶液（核酸可溶化試薬）で処理する。これにより細胞膜および核膜が溶解されて、核酸が水溶液内に分散し、核酸を含む試料溶液を得る。   First, these specimens are treated with an aqueous solution (nucleic acid solubilizing reagent) containing a reagent for solubilizing nucleic acid by dissolving cell membranes and nuclear membranes. As a result, the cell membrane and the nuclear membrane are dissolved, and the nucleic acid is dispersed in the aqueous solution to obtain a sample solution containing the nucleic acid.

細胞膜および核膜を溶解して、核酸を可溶化するためには、例えば、対象となる試料が全血の場合、（1）赤血球の除去、（2）各種タンパク質の除去、及び（3）白血球の溶解及び核膜の溶解が必要となる。（1）赤血球の除去および（2）各種タンパク質の除去は、膜への非特異吸着および多孔性膜の目詰まりを防ぐために、（3）白血球の溶解及び核膜の溶解は、抽出の対象である核酸を可溶化させるためにそれぞれ必要となる。特に、（3）白血球の溶解及び核膜の溶解は重要な工程であり、本発明の方法では、この工程により核酸を可溶化することが必要である。   In order to solubilize cell membranes and nuclear membranes and solubilize nucleic acids, for example, when the sample of interest is whole blood, (1) removal of red blood cells, (2) removal of various proteins, and (3) white blood cells And dissolution of the nuclear membrane is required. (1) Removal of red blood cells and (2) removal of various proteins to prevent non-specific adsorption to the membrane and clogging of the porous membrane. (3) Lysis of leukocytes and lysis of the nuclear membrane are subject to extraction. Each is required to solubilize certain nucleic acids. In particular, (3) lysis of leukocytes and lysis of the nuclear membrane are important steps. In the method of the present invention, it is necessary to solubilize nucleic acids by this step.

核酸を含む検体は、単一の核酸を含む検体でもよいし、異なる複数種類の核酸を含む検体でもよい。回収する核酸の種類は、ＤＮＡやＲＮＡ等、特に制限されない。検体の数は一つでも複数であってもよい。回収する核酸の長さも特に限定されず、例えば、数ｂｐ〜数Ｍｂｐの任意の長さの核酸を使用することができる。取扱い上の観点からは、回収する核酸の長さは一般的には、数ｂｐ〜数百ｋｂｐ程度である。本発明の核酸分離精製方法は、従来の簡易的な核酸分離精製方法より比較的長い核酸を迅速に取り出すことができ、好ましくは５０ｋｂｐ以上、より好ましくは７０ｋｂｐ以上の核酸を回収することに用いることがでる。   The specimen containing the nucleic acid may be a specimen containing a single nucleic acid or a specimen containing a plurality of different types of nucleic acids. The type of nucleic acid to be collected is not particularly limited, such as DNA or RNA. The number of specimens may be one or more. The length of the nucleic acid to be recovered is not particularly limited, and for example, a nucleic acid having an arbitrary length of several bp to several Mbp can be used. From the viewpoint of handling, the length of the nucleic acid to be recovered is generally about several bp to several hundreds kbp. The nucleic acid separation and purification method of the present invention can be used to recover nucleic acids that are relatively longer than conventional simple nucleic acid separation and purification methods, and is preferably used to recover nucleic acids of 50 kbp or more, more preferably 70 kbp or more. I get out.

以下に、細胞膜および核膜を溶解し、核酸を可溶化して、検体から核酸を含む試料溶液を得る工程について説明する。本発明で、細胞膜および核膜を溶解して核酸を可溶化するには、核酸可溶化試薬を用いる。核酸可溶化試薬としては、カオトロピック塩、界面活性剤およびタンパク質分解酵素を含む溶液が挙げられる。   Hereinafter, a process of dissolving a cell membrane and a nuclear membrane, solubilizing a nucleic acid, and obtaining a sample solution containing the nucleic acid from a specimen will be described. In the present invention, a nucleic acid solubilizing reagent is used to solubilize nucleic acid by dissolving the cell membrane and the nuclear membrane. Examples of the nucleic acid solubilizing reagent include a solution containing a chaotropic salt, a surfactant, and a proteolytic enzyme.

細胞膜および核膜を溶解し、核酸を可溶化して、検体から核酸を含む試料溶液を得る方法としては、(Ｉ)細胞又はウイルスを含む検体を容器に注入する工程、(ＩＩ)上記容器に、カオトロピック塩と界面活性剤を含む核酸可溶化試薬溶液を添加し、検体と核酸可溶化試薬溶液を混合する工程、(ＩＩＩ)上記で得られた混合液をインキュベ−トする工程、(ＩＶ)インキュベ−トされた混合液に水溶性有機溶媒を添加する工程を含む方法を挙げることができる。   A method for obtaining a sample solution containing a nucleic acid from a specimen by dissolving a cell membrane and a nuclear membrane and solubilizing a nucleic acid includes: (I) a step of injecting a specimen containing cells or viruses into a container; A step of adding a nucleic acid solubilizing reagent solution containing a chaotropic salt and a surfactant and mixing the specimen and the nucleic acid solubilizing reagent solution, (III) a step of incubating the mixed solution obtained above, (IV) Examples thereof include a method including a step of adding a water-soluble organic solvent to the incubated mixed solution.

上記の細胞膜および核膜を溶解し、核酸を可溶化して、検体から核酸を含む試料溶液を得る工程において、検体をホモジナイズ処理することで、自動化処理適性が向上する。ホモジナイズ処理は、例えば、超音波処理、鋭利な突起物を用いる、高速攪拌処理を用いる、微細空隙から押し出す処理、ガラスビーズを用いる処理等で行うことができる。   In the step of dissolving the cell membrane and the nuclear membrane, solubilizing the nucleic acid, and obtaining a sample solution containing the nucleic acid from the specimen, homogenizing the specimen improves the suitability for automation. The homogenizing treatment can be performed by, for example, ultrasonic treatment, using sharp protrusions, using high-speed stirring treatment, processing for extruding from fine voids, processing using glass beads, or the like.

また、上記の細胞膜および核膜を溶解し、核酸を可溶化して、検体から核酸を含む試料溶液を得る工程において、タンパク質分解酵素を含む核酸可溶化試薬を使用することにより、核酸の回収量及び回収効率が向上し、必要な核酸を含む検体の微量化及び迅速化が可能となる。   Further, in the step of dissolving the cell membrane and the nuclear membrane and solubilizing the nucleic acid to obtain a sample solution containing the nucleic acid from the specimen, the amount of nucleic acid recovered can be obtained by using a nucleic acid solubilizing reagent containing a proteolytic enzyme. In addition, the recovery efficiency is improved, and it is possible to reduce the amount and speed of the specimen containing the necessary nucleic acid.

タンパク質分解酵素は、セリンプロテア−ゼ、システインプロテア−ゼ、金属プロテア−ゼなどから、少なくとも１つのタンパク質分解酵素を好ましく用いることができる。また、タンパク質分解酵素は、複数種以上のタンパク質分解酵素の混合物も好ましく用いることができる。
セリンプロテアーゼとしては、特に限定されず、例えばプロテアーゼＫなどを好ましく用いることができる。
システインプロテアーゼとしては、特に限定されず、例えばパパイン、カテプシン類などを好ましく用いることができる。
金属プロテアーゼとしては、特に限定されず、例えばカルボキシペプチターゼ等を好ましく用いることができる。
タンパク質分解酵素は、添加時の反応系全容積１ｍｌあたり好ましくは０．００１ＩＵ〜１０ＩＵ、より好ましくは０．０１ＩＵ〜１ＩＵの濃度で用いることができる。 As the proteolytic enzyme, at least one proteolytic enzyme can be preferably used from serine protease, cysteine protease, metal protease and the like. As the proteolytic enzyme, a mixture of a plurality of proteolytic enzymes can be preferably used.
The serine protease is not particularly limited, and for example, protease K can be preferably used.
The cysteine protease is not particularly limited, and for example, papain and cathepsins can be preferably used.
The metal protease is not particularly limited, and for example, carboxypeptidase can be preferably used.
The proteolytic enzyme can be used at a concentration of preferably 0.001 IU to 10 IU, more preferably 0.01 IU to 1 IU per 1 ml of the total volume of the reaction system at the time of addition.

また、タンパク質分解酵素は、核酸分解酵素を含まないタンパク質分解酵素を好ましく用いることができる。また、安定化剤を含んだタンパク質分解酵素を好ましく用いることができる。安定化剤としては、金属イオンを好ましく用いることができる。具体的には、マグネシウムイオンが好ましく、例えば塩化マグネシウムなどの形で添加することができる。タンパク質分解酵素の安定好ましく、例えば塩化マグネシウムなどの形で添加することができる。タンパク質分解酵素の安定化剤を含ませることにより、核酸の回収に必要なタンパク質分解酵素の微量化が可能となり、核酸の回収に必要なコストを低減することができる。タンパク質分解酵素の安定化剤は、反応系全量に対して好ましくは１〜１０００ｍＭ、より好ましくは１０〜１００ｍＭの濃度で含有することが好ましい。   As the proteolytic enzyme, a proteolytic enzyme that does not contain a nucleolytic enzyme can be preferably used. A proteolytic enzyme containing a stabilizer can be preferably used. As the stabilizer, metal ions can be preferably used. Specifically, magnesium ion is preferable, and it can be added in the form of, for example, magnesium chloride. Proteolytic enzyme is stable, and can be added, for example, in the form of magnesium chloride. By including a proteolytic enzyme stabilizer, the amount of proteolytic enzyme required for nucleic acid recovery can be reduced, and the cost required for nucleic acid recovery can be reduced. The proteolytic enzyme stabilizer is preferably contained at a concentration of 1 to 1000 mM, more preferably 10 to 100 mM, based on the total amount of the reaction system.

タンパク質分解酵素は、予めカオトロピック塩、界面活性剤等のその他の試薬とともに混合されて１つの試薬として核酸の回収に供されても良い。
また、タンパク質分解酵素は、カオトロピック塩、界面活性剤等のその他の試薬とは個別の２つ以上の試薬として供されても良い。後者の場合、タンパク質分解酵素を含む試薬を先に検体と混合した後に、カオトロピック塩、界面活性剤を含む試薬と混合される。また、カオトロピック塩、界面活性剤を含む試薬を先に混合した後に、タンパク分解酵素を混合してもよい。
また、タンパク質分解酵素を検体または、検体とカオトロピック塩、界面活性剤を含む試薬との混合液に、タンパク質分解酵素保存容器から直接目薬状に滴下させることもできる。この場合、操作を簡便にすることができる。 The proteolytic enzyme may be mixed with other reagents such as chaotropic salts and surfactants in advance and used for nucleic acid recovery as one reagent.
The proteolytic enzyme may be provided as two or more reagents separate from other reagents such as chaotropic salts and surfactants. In the latter case, a reagent containing a proteolytic enzyme is first mixed with a sample, and then mixed with a reagent containing a chaotropic salt and a surfactant. Moreover, after mixing the reagent containing a chaotropic salt and a surfactant previously, you may mix a proteolytic enzyme.
In addition, the proteolytic enzyme can be dropped directly into a specimen or a mixed solution of the specimen and a reagent containing a chaotropic salt and a surfactant directly from the proteolytic enzyme storage container. In this case, the operation can be simplified.

核酸可溶化試薬は、乾燥された状態で供給されることも好ましい。また、凍結乾燥のように乾燥された状態のタンパク質分解酵素を予め含む容器を用いることができる。上記の、乾燥された状態で供給される核酸可溶化試薬、および乾燥された状態のタンパク質分解酵素を予め含む容器の両方を用いて、核酸を含む試料溶液を得ることもできる。
上記の方法で核酸を含む試料溶液を得る場合、核酸可溶化試薬およびタンパク質分解酵素の保存安定性が良く、核酸収量を変えずに操作を簡便にすることができる。 It is also preferable that the nucleic acid solubilizing reagent is supplied in a dried state. Moreover, the container previously containing the proteolytic enzyme of the dried state like freeze-drying can be used. A sample solution containing nucleic acid can also be obtained by using both the nucleic acid solubilizing reagent supplied in a dried state and the container previously containing the proteolytic enzyme in a dried state.
When a sample solution containing nucleic acid is obtained by the above method, the storage stability of the nucleic acid solubilizing reagent and proteolytic enzyme is good, and the operation can be simplified without changing the nucleic acid yield.

検体とカオトロピック塩および界面活性剤を含む核酸可溶化試薬溶液とを混合する方法は、特に限定されない。
混合する際、攪拌装置により３０から３０００ｒｐｍで１秒から３分間混合することが好ましい。これにより、分離精製される核酸収量を増加させることができる。または、転倒混和を５から３０回行うことで混合することも好ましい。また、ピペッティング操作を、１０から５０回行うことによっても混合することができる、この場合、簡便な操作で分離精製される核酸収量を増加させることができる。 The method for mixing the specimen with a nucleic acid solubilizing reagent solution containing a chaotropic salt and a surfactant is not particularly limited.
When mixing, it is preferable to mix at 30 to 3000 rpm for 1 second to 3 minutes with a stirrer. Thereby, the yield of nucleic acid to be separated and purified can be increased. Or it is also preferable to mix by inversion mixing 5 to 30 times. In addition, mixing can also be performed by performing pipetting operations 10 to 50 times. In this case, the yield of nucleic acid separated and purified by a simple operation can be increased.

検体とカオトロピック塩および界面活性剤を含む核酸可溶化試薬溶液との混合液を、タンパク質分解酵素の至適温度および反応時間でインキュベ−トすることにより、分離精製される核酸の収量を増加させることがきる。インキュベーション温度は、通常２０℃〜７０℃、好ましくはタンパク分解酵素の至適温度であり、インキュベーション時間は通常１〜９０分、好ましくはタンパク分解酵素の至適反応時間である。インキュベーション方法は特に限定されず、湯浴や加温器に入れることで行うことができる。   Increasing the yield of nucleic acid to be separated and purified by incubating a mixture of a sample and a nucleic acid solubilizing reagent solution containing a chaotropic salt and a surfactant at the optimal temperature and reaction time of the proteolytic enzyme I'm going. The incubation temperature is usually 20 ° C. to 70 ° C., preferably the optimum temperature for the proteolytic enzyme, and the incubation time is usually 1 to 90 minutes, preferably the optimum reaction time for the proteolytic enzyme. The incubation method is not particularly limited, and can be performed by putting it in a hot water bath or a warmer.

上記の細胞膜および核膜を溶解し、核酸を可溶化して、検体から核酸を含む試料溶液を得る工程において、界面活性剤とカオトロピック塩を含む核酸可溶化試薬溶液は、好ましくはｐＨ５〜１０、より好ましくはｐＨ６〜９、さらに好ましくはｐＨ７〜８のものが用いられる。   In the step of dissolving the cell membrane and the nuclear membrane and solubilizing the nucleic acid to obtain a sample solution containing the nucleic acid from the specimen, the nucleic acid solubilizing reagent solution containing the surfactant and the chaotropic salt is preferably pH 5 to 10, More preferably, those having a pH of 6 to 9, more preferably a pH of 7 to 8 are used.

また、上記の細胞膜および核膜を溶解し、核酸を可溶化して、検体から核酸を含む試料溶液を得る工程において、カオトロピック塩の核酸可溶化試薬溶液における濃度は、０．５ mol/L以上であることが好ましく、より好ましくは０．５mol/L〜７ mol/L、さらに好ましくは、２mol/L〜６ mol/Lである。上記カオトロピック塩としては、塩酸グアニジンが好ましいが、他のカオトロピック塩（イソチオシアン酸グアニジン、チオシアン酸グアニジン、尿素、イソチオシアン酸ナトリウム、ヨウ化カリウム、ヨウ化ナトリウム）を使用することもできる。また、これらの塩は単独または複数組み合わせて用いてもよい。   In the step of dissolving the cell membrane and the nuclear membrane and solubilizing the nucleic acid to obtain a sample solution containing the nucleic acid from the specimen, the concentration of the chaotropic salt in the nucleic acid solubilizing reagent solution is 0.5 mol / L or more. It is preferably 0.5 mol / L to 7 mol / L, and more preferably 2 mol / L to 6 mol / L. As the chaotropic salt, guanidine hydrochloride is preferable, but other chaotropic salts (guanidine isothiocyanate, guanidine thiocyanate, urea, sodium isothiocyanate, potassium iodide, sodium iodide) can also be used. These salts may be used alone or in combination.

また、上記の核酸可溶化試薬溶液は水溶性有機溶媒を含んでいても良い。この水溶性有機溶媒としてはアルコールが好ましい。アルコールは、1級アルコール、２級アルコール、３級アルコールのいずれでも良い。アルコールがメチルアルコール、エチルアルコール、プロピルアルコール及びその異性体、ブチルアルコール及びその異性体を好ましく用いることができる。これらの水溶性有機溶媒は単独または複数組み合わせて用いてもよい。これら水溶性有機溶媒の核酸可溶化試薬溶液における濃度は１〜２０％であることが好ましい。   The nucleic acid solubilizing reagent solution may contain a water-soluble organic solvent. As this water-soluble organic solvent, alcohol is preferred. The alcohol may be any of primary alcohol, secondary alcohol, and tertiary alcohol. As the alcohol, methyl alcohol, ethyl alcohol, propyl alcohol and its isomer, butyl alcohol and its isomer can be preferably used. These water-soluble organic solvents may be used alone or in combination. The concentration of these water-soluble organic solvents in the nucleic acid solubilizing reagent solution is preferably 1 to 20%.

また、上記の細胞膜および核膜を溶解し、核酸を可溶化して、検体から核酸を含む試料溶液を得る工程において、検体にカオトロピック塩およびタンパク質分解酵素とともに混合する界面活性剤は、例えば、ノニオン界面活性剤、カチオン界面活性剤、アニオン界面活性剤、両性界面活性剤である。
本発明においてはノニオン界面活性剤をこのましく用いることができる。ノニオン界面活性剤は、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル系界面活性剤、ポリオキシエチレンアルキルエーテル系界面活性剤、脂肪酸アルカノールアミドを用いることができるが、好ましくは、ポリオキシエチレンアルキルエーテル系界面活性剤を用いることができる、さらに好ましくは、ポリオキシエチレンアルキルエーテル系界面活性剤は、ＰＯＥデシルエ−テル、ＰＯＥラウリルエ−テル、ＰＯＥトリデシルエ−テル、ＰＯＥアルキレンデシルエ−テル、ＰＯＥソルビタンモノラウレ−ト、ＰＯＥソルビタンモノオレエ−ト、ＰＯＥソルビタンモノステアレ−ト、テトラオレイン酸ポリオキシエチレンソルビット、ＰＯＥアルキルアミン、ＰＯＥアセチレングリコ−ルから選択されるポリオキシエチレンアルキルエーテル系界面活性剤である。 In the step of dissolving the cell membrane and the nuclear membrane and solubilizing the nucleic acid to obtain a sample solution containing the nucleic acid from the specimen, the surfactant mixed with the chaotropic salt and the proteolytic enzyme in the specimen is, for example, nonionic A surfactant, a cationic surfactant, an anionic surfactant, and an amphoteric surfactant.
In the present invention, a nonionic surfactant can be preferably used. As the nonionic surfactant, a polyoxyethylene alkylphenyl ether surfactant, a polyoxyethylene alkyl ether surfactant, or a fatty acid alkanolamide can be used. Preferably, a polyoxyethylene alkyl ether surfactant is used. More preferably, the polyoxyethylene alkyl ether surfactant that can be used is POE decyl ether, POE lauryl ether, POE tridecyl ether, POE alkylene decyl ether, POE sorbitan monolaurate, Polyoxyethylene alkyl ether selected from POE sorbitan monooleate, POE sorbitan monostearate, polyoxyethylene sorbitol tetraoleate, POE alkylamine, POE acetylene glycol A surfactant.

また、カチオン界面活性剤も好ましく用いることができる。さらに好ましくは、カチオン界面活性剤は、セチルトリメチルアンモニウムプロミド、ドデシルトリメチルアンモニウムクロリド、テトラデシルトリメチルアンモニウムクロリド、セチルピリジニウムクロリドから選択されるカチオン界面活性剤である。これらの界面活性剤は、単独または複数組み合わせて用いてもよい。
これら界面活性剤の核酸可溶化試薬溶液における濃度は０．１〜２０質量％であることが好ましい。 A cationic surfactant can also be preferably used. More preferably, the cationic surfactant is a cationic surfactant selected from cetyltrimethylammonium promide, dodecyltrimethylammonium chloride, tetradecyltrimethylammonium chloride, cetylpyridinium chloride. These surfactants may be used alone or in combination.
The concentration of these surfactants in the nucleic acid solubilizing reagent solution is preferably 0.1 to 20% by mass.

ＤＮＡなどＲＮＡ以外の核酸を回収する場合、上記の細胞膜および核膜を溶解し、核酸を可溶化して、検体から核酸を含む試料溶液を得る工程において、核酸可溶化試薬溶液にＲＮＡ分解酵素を加えることが好ましい。この場合、回収された核酸に共存するＲＮＡによる干渉を軽減することができる。また、ＤＮＡ分解酵素阻害剤を加えることも好ましい。
一方、ＲＮＡなどＤＮＡ以外の核酸を回収する場合、核酸可溶化試薬溶液にＤＮＡ分解酵素を加えることが好ましい。この場合、回収された核酸に共存するＤＮＡによる干渉を軽減することができる。また、ＲＮＡ分解酵素阻害剤を加えることも好ましい。ＲＮＡ分解酵素阻害剤としては、ＲＮＡ分解酵素を特異的に阻害するものが好ましい。
ＲＮＡ分解酵素は特に限定されず、例えば、リボヌクレアーゼ Ｈ（ＲＮａｓｅ Ｈ）等のＲＮＡ特異的分解酵素を好ましく用いることができる。
ＤＮＡ分解酵素は特に限定されず、例えば、ＤＮａｓｅ Ｉ等のＤＮＡ特異的分解酵素を好ましく用いることができる。 When recovering nucleic acids other than RNA, such as DNA, in the step of dissolving the cell membrane and nuclear membrane and solubilizing the nucleic acid to obtain a sample solution containing the nucleic acid from the specimen, an RNase is added to the nucleic acid solubilizing reagent solution. It is preferable to add. In this case, interference by RNA coexisting with the recovered nucleic acid can be reduced. It is also preferable to add a DNA-degrading enzyme inhibitor.
On the other hand, when recovering nucleic acids other than DNA such as RNA, it is preferable to add a DNA degrading enzyme to the nucleic acid solubilizing reagent solution. In this case, interference by DNA coexisting with the recovered nucleic acid can be reduced. It is also preferable to add an RNase inhibitor. As the RNase inhibitor, those that specifically inhibit RNase are preferable.
The RNA degrading enzyme is not particularly limited, and for example, an RNA-specific degrading enzyme such as ribonuclease H (RNase H) can be preferably used.
The DNA degrading enzyme is not particularly limited, and for example, a DNA-specific degrading enzyme such as DNase I can be preferably used.

上記の細胞膜および核膜を溶解し、核酸を可溶化して、検体から核酸を含む試料溶液を得る工程において、インキュベ−トされた混合液に添加する水溶性有機溶媒は、アルコールを好ましく用いることができる。アルコールは、１級アルコール、２級アルコール、３級アルコールのいずれでもよく、メチルアルコール、エチルアルコール、プロピルアルコール、ブチルアルコール及びその異性体を好ましく用いることができる。これら水溶性有機溶媒の核酸可溶化試薬溶液における最終濃度は、５〜９０％であることが好ましい。   In the step of dissolving the cell membrane and the nuclear membrane and solubilizing the nucleic acid to obtain a sample solution containing the nucleic acid from the specimen, an alcohol is preferably used as the water-soluble organic solvent to be added to the incubated mixture. Can do. The alcohol may be any of primary alcohol, secondary alcohol, and tertiary alcohol, and methyl alcohol, ethyl alcohol, propyl alcohol, butyl alcohol and isomers thereof can be preferably used. The final concentration of these water-soluble organic solvents in the nucleic acid solubilizing reagent solution is preferably 5 to 90%.

上記の細胞膜および核膜を溶解し、核酸を可溶化して、検体から核酸を含む試料溶液を得る工程において、核酸を含む試料溶液には、消泡剤を含有させることも好ましい。上記消泡剤としては、シリコン系消泡剤とアルコール系消泡剤の２つの成分が好ましく挙げられ、また、アルコール系消泡剤としては、アセチレングリコール系界面活性剤が好ましい。   In the step of dissolving the cell membrane and the nuclear membrane and solubilizing the nucleic acid to obtain the sample solution containing the nucleic acid from the specimen, the sample solution containing the nucleic acid preferably contains an antifoaming agent. The antifoaming agent preferably includes two components, a silicon-based antifoaming agent and an alcohol-based antifoaming agent, and the alcohol-based antifoaming agent is preferably an acetylene glycol surfactant.

消泡剤の具体例としては、シリコン系消泡剤（例えば、シリコーンオイル、ジメチルポリシロキサン、シリコーンエマルジョン、変性ポリシロキサン、シリコーンコンパウンドなど）、アルコール系消泡剤（例えば、アセチレングリコール、ヘプタノール、エチルエキサノール、高級アルコール、ポリオキシアルキレングリコールなど）、エーテル系消泡剤（例えば、ヘプチルセロソルブ、ノニルセロソルブ−３−ヘプチルコルビトールなど）、油脂系消泡剤（例えば、動植物油など）、脂肪酸系消泡剤（例えば、ステアリン酸、オレイン酸、パルミチン酸など）、金属セッケン系消泡剤（例えば、ステアリン酸アルミ、ステアリン酸カルシウムなど）、脂肪酸エステル系消泡剤（例えば、天然ワックス、トリブチルホスフェートなど）、リン燐酸エステル系消泡剤（例えば、オクチルリン酸ナトリウムなど）、アミン系消泡剤（例えば、ジアミルアミンなど）、アミド系消泡剤（例えば、ステアリン酸アミドなど）、その他の消泡剤（例えば、硫酸第二鉄、ボーキサイトなど）などが挙げられる。特に好ましくは、消泡剤として、シリコン系消泡剤とアルコール系消泡剤の２つの成分を組み合わせて使用することができる。また、アルコール系消泡剤としては、アセチレングリコール系界面活性剤を使用することも好ましい。   Specific examples of antifoaming agents include silicon-based antifoaming agents (eg, silicone oil, dimethylpolysiloxane, silicone emulsion, modified polysiloxane, silicone compound, etc.), alcohol-based antifoaming agents (eg, acetylene glycol, heptanol, ethyl). Exanol, higher alcohol, polyoxyalkylene glycol, etc.), ether type antifoaming agents (eg, heptylcellosolve, nonylcellosolv-3-heptylcorbitol, etc.), oil-based antifoaming agents (eg, animal and vegetable oils, etc.), fatty acid type Antifoaming agents (eg, stearic acid, oleic acid, palmitic acid, etc.), metal soap antifoaming agents (eg, aluminum stearate, calcium stearate, etc.), fatty acid ester antifoaming agents (eg, natural wax, tributyl phosphate, etc.) ) Phosphate-based antifoaming agents (for example, sodium octyl phosphate), amine-based antifoaming agents (for example, diamylamine), amide-based antifoaming agents (for example, stearamide), and other antifoaming agents (for example, Ferric sulfate, bauxite, etc.). Particularly preferably, the antifoaming agent can be used in combination of two components, a silicon antifoaming agent and an alcohol antifoaming agent. Moreover, it is also preferable to use an acetylene glycol surfactant as the alcohol-based antifoaming agent.

また、上記の細胞膜および核膜を溶解し、核酸を可溶化して、検体から核酸を含む試料溶液を得る工程において、得られた核酸を含む試料溶液は、表面張力は５０ｍＰａ・ｍ以下であることが好ましく、また、粘度は、１〜１００００ｍＰａ・ｓであることが好ましく、比重は、０．８〜１．２であることが好ましい。   In the step of dissolving the cell membrane and the nuclear membrane and solubilizing the nucleic acid to obtain the sample solution containing the nucleic acid from the specimen, the sample solution containing the nucleic acid has a surface tension of 50 mPa · m or less. The viscosity is preferably 1 to 10,000 mPa · s, and the specific gravity is preferably 0.8 to 1.2.

以下に、本発明で用いる核酸吸着性多孔性膜および吸着工程について説明する。本発明の核酸吸着性多孔性膜は、溶液が内部を通過可能なものである。ここで「溶液が内部を通過可能」とは、膜の一方の面が接する空間と膜の他方の面が接する空間の間に圧力差を生じさせた場合に、高圧の空間側から低圧の空間側へと、膜の内部を溶液が通過することが可能であることを意味する。または、膜に遠心力を掛けた場合に、遠心力の方向に、膜の内部を溶液が通過することが可能であることを意味する。   Hereinafter, the nucleic acid-adsorbing porous membrane used in the present invention and the adsorption process will be described. The nucleic acid-adsorptive porous membrane of the present invention is a solution through which a solution can pass. Here, “solution can pass through” means that when a pressure difference is generated between the space where one surface of the membrane contacts and the space where the other surface of the membrane contacts, To the side, it means that the solution can pass through the inside of the membrane. Or, when a centrifugal force is applied to the membrane, it means that the solution can pass through the membrane in the direction of the centrifugal force.

本発明の核酸吸着性多孔性膜は、イオン結合が関与しない相互作用で核酸が吸着する多孔性膜であることを特徴とし、これにより分離性能に優れ、しかも洗浄効率よく、核酸を単離精製することができる。特に洗浄液が水溶性塩を含んでいる場合、中でも水溶性塩と水溶性勇気溶剤とを含んでいる場合には、洗浄効果が優れていて高純度で核酸を回収することができる。さらに好ましくは核酸吸着性多孔性膜は、親水基を有する多孔性膜であり、多孔性膜を形成する材料自体が、親水性基を有する多孔性膜、または多孔性膜を形成する材料を処理またはコーティングすることによって親水基を導入した多孔性膜を意味する。多孔性膜を形成する材料は有機物、無機物のいずれでも良い。例えば、多孔性膜を形成する材料自体が親水基を有する有機材料である多孔性膜、親水基を持たない有機材料の多孔性膜を処理して親水基を導入した多孔性膜、親水基を持たない有機材料の多孔性膜に対し親水基を有する材料でコーティングして親水基を導入した多孔性膜、多孔性膜を形成する材料自体が親水基を有する無機材料である多孔性膜、親水基を持たない無機材料の多孔性膜を処理して親水基を導入した多孔性膜、親水基を持たない無機材料の多孔性膜に対し親水基を有する材料でコーティングして親水基を導入した多孔性膜などを、使用することができるが、加工の容易性から、多孔性膜を形成する材料は有機高分子などの有機材料を用いることが好ましい。   The nucleic acid-adsorbing porous membrane of the present invention is characterized in that it is a porous membrane that adsorbs nucleic acids through an interaction that does not involve ionic bonds, and thereby, isolation and purification of nucleic acids with excellent separation performance and high washing efficiency can do. In particular, when the washing solution contains a water-soluble salt, especially when it contains a water-soluble salt and a water-soluble courageous solvent, the washing effect is excellent and nucleic acid can be recovered with high purity. More preferably, the nucleic acid-adsorptive porous membrane is a porous membrane having a hydrophilic group, and the material forming the porous membrane itself treats the porous membrane having the hydrophilic group or the material forming the porous membrane. Or the porous membrane which introduce | transduced the hydrophilic group by coating is meant. The material for forming the porous film may be either organic or inorganic. For example, a porous film in which the material forming the porous film itself is an organic material having a hydrophilic group, a porous film in which a hydrophilic group is introduced by treating a porous film of an organic material having no hydrophilic group, A porous film in which a hydrophilic group is introduced by coating a porous film made of an organic material that does not have a hydrophilic group, a porous film in which the material forming the porous film itself is an inorganic material having a hydrophilic group, hydrophilic Porous membranes with hydrophilic groups introduced by treating porous membranes of inorganic materials that do not have groups, and inorganic groups without inorganic groups coated with materials having hydrophilic groups to introduce hydrophilic groups A porous film or the like can be used, but an organic material such as an organic polymer is preferably used as a material for forming the porous film from the viewpoint of ease of processing.

親水基とは、水との相互作用を持つことができる有極性の基（原子団）を指し、核酸の吸着に関与する全ての基（原子団）が当てはまる。親水基としては、水との相互作用の強さが中程度のものが良く、水酸基、カルボキシル基、シアノ基、オキシエチレン基などを挙げることができるが、好ましくは水酸基である。   The hydrophilic group refers to a polar group (atomic group) capable of interacting with water, and all groups (atomic groups) involved in nucleic acid adsorption are applicable. The hydrophilic group preferably has a moderate interaction strength with water, and examples thereof include a hydroxyl group, a carboxyl group, a cyano group, and an oxyethylene group, with a hydroxyl group being preferred.

親水基を有する多孔性膜としては、水酸基を有する有機材料の多孔性膜を挙げることができる。水酸基を有する有機材料としては、特開２００３−１２８６９１号公報に記載の、アセチルセルロースの表面鹸化物が挙げられる。アセチルセルロースしては、モノアセチルセルロース、ジアセチルセルロース、トリアセチルセルロースの何れでもよいが、特にはトリアセチルセルロースが好ましい。この場合、鹸化処理の程度（鹸化度）で固相表面の水酸基の量（密度）をコントロールすることができる。核酸の分離効率を挙げるためには、水酸基の量（密度）が多い方が好ましい。例えば、トリアセチルセルロースなどのアセチルセルロースの場合には、鹸化率が約５％以上であることが好ましく、１０％以上であることが更に好ましい。また、水酸基を有する有機高分子の表面積を大きくするために、アセチルセルロースの多孔性膜を鹸化処理する。
この鹸化処理の程度（鹸化度）と多孔性膜の孔径との組合せによりにより空間的な水酸基の量（密度）をコントロールすることができる。この場合、多孔性膜は、表裏対称性の多孔性膜であってもよいが、裏非対称性の多孔性膜を好ましく使用することができる。 Examples of the porous film having a hydrophilic group include a porous film made of an organic material having a hydroxyl group. Examples of the organic material having a hydroxyl group include surface saponified products of acetylcellulose described in JP-A No. 2003-128691. The acetyl cellulose may be any of monoacetyl cellulose, diacetyl cellulose, and triacetyl cellulose, but triacetyl cellulose is particularly preferable. In this case, the amount (density) of hydroxyl groups on the solid surface can be controlled by the degree of saponification treatment (saponification degree). In order to increase the nucleic acid separation efficiency, it is preferable that the amount (density) of hydroxyl groups is large. For example, in the case of acetylcellulose such as triacetylcellulose, the saponification rate is preferably about 5% or more, and more preferably 10% or more. In order to increase the surface area of the organic polymer having a hydroxyl group, the porous membrane of acetylcellulose is saponified.
The amount (density) of spatial hydroxyl groups can be controlled by a combination of the degree of saponification treatment (saponification degree) and the pore diameter of the porous membrane. In this case, the porous membrane may be a front-back symmetrical porous membrane, but a back-asymmetric porous membrane can be preferably used.

水酸基を有する有機材料の多孔性膜としては、ポリヒドロキシエチルアクリル酸、ポリヒドロキシエチルメタアクリル酸、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリオキシエチレン、アセチルセルロース、アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物などで、形成された多孔性膜を挙げることができるが、特に多糖構造を有する有機材料の多孔性膜を好ましく使用することができる。   As porous membranes of organic materials having hydroxyl groups, polyhydroxyethyl acrylic acid, polyhydroxyethyl methacrylic acid, polyvinyl alcohol, polyvinyl pyrrolidone, polyacrylic acid, polymethacrylic acid, polyoxyethylene, acetylcellulose, different acetyl values Examples of the porous film formed include a mixture of acetylcellulose, and a porous film of an organic material having a polysaccharide structure can be preferably used.

特に、水酸基を有する有機材料の多孔性膜としては、アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物から成る有機高分子の多孔性膜を好ましく使用することができる。アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物として、トリアセチルセルロースとジアセチルセルロースの混合物、トリアセチルセルロースとモノアセチルセルロースの混合物、トリアセチルセルロースとジアセチルセルロースとモノアセチルセルロースの混合物、ジアセチルセルロースとモノアセチルセルロースの混合物を好ましく使用する事ができる。特にトリアセチルセルロースとジアセチルセルロースの混合物を好ましく使用することができる。
トリアセチルセルロースとジアセチルセルロースの混合比（モル比）は、９９：１〜１：９９であることが好ましい。さらには、トリアセチルセルロースとジアセチルセルロースの混合比は、９０：１０〜５０：５０である事が好ましい。 In particular, as a porous film of an organic material having a hydroxyl group, an organic polymer porous film made of a mixture of acetylcelluloses having different acetyl values can be preferably used. As a mixture of acetyl cellulose having different acetyl values, a mixture of triacetyl cellulose and diacetyl cellulose, a mixture of triacetyl cellulose and monoacetyl cellulose, a mixture of triacetyl cellulose, diacetyl cellulose and monoacetyl cellulose, a mixture of diacetyl cellulose and monoacetyl cellulose Can be preferably used. In particular, a mixture of triacetyl cellulose and diacetyl cellulose can be preferably used.
The mixing ratio (molar ratio) of triacetyl cellulose and diacetyl cellulose is preferably 99: 1 to 1:99. Furthermore, the mixing ratio of triacetyl cellulose and diacetyl cellulose is preferably 90:10 to 50:50.

また、水酸基を有する有機材料の多孔性膜としては、アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物を鹸化処理した有機材料からなる多孔性膜を好ましく用いることができる。アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物を鹸化処理した有機材料としては、トリアセチルセルロースとジアセチルセルロースの混合物の鹸化物、トリアセチルセルロースとモノアセチルセルロースの混合物の鹸化物、トリアセチルセルロースとジアセチルセルロースとモノアセチルセルロースの混合物の鹸化物、ジアセチルセルロースとモノアセチルセルロースの混合物の鹸化物も好ましく使用する事ができる。特に、トリアセチルセルロースとジアセチルセルロースの混合物の鹸化物を好ましく使用することができる。
トリアセチルセルロースとジアセチルセルロースの混合比は、９９：１〜１：９９である事が好ましい。さらには、トリアセチルセルロースとジアセチルセルロースの混合比は、９０：１０〜５０：５０である事が好ましい。 Moreover, as the porous film of the organic material having a hydroxyl group, a porous film made of an organic material obtained by saponifying a mixture of acetyl cellulose having different acetyl values can be preferably used. Organic materials obtained by saponifying a mixture of acetyl celluloses having different acetyl values include saponified products of a mixture of triacetyl cellulose and diacetyl cellulose, saponified products of a mixture of triacetyl cellulose and monoacetyl cellulose, triacetyl cellulose, diacetyl cellulose and mono A saponified product of a mixture of acetylcellulose and a saponified product of a mixture of diacetylcellulose and monoacetylcellulose can also be preferably used. In particular, a saponified product of a mixture of triacetyl cellulose and diacetyl cellulose can be preferably used.
The mixing ratio of triacetyl cellulose and diacetyl cellulose is preferably 99: 1 to 1:99. Furthermore, the mixing ratio of triacetyl cellulose and diacetyl cellulose is preferably 90:10 to 50:50.

鹸化処理とは、アセチルセルロースを鹸化処理液(例えば水酸化ナトリウム水溶液)に接触させることを言う。これにより、鹸化処理液に接触したアセチルセルロースの部分に、再生セルロースとなり水酸基が導入される。
核酸の分離効率を上げるためには、導入される水酸基の数が多い方が好ましい。例えば、鹸化率が約５％以上であることが好ましい。さらには、鹸化率が約１０％以上であることが好ましい。
鹸化率を変えるには、水酸化ナトリウムの濃度を変えて鹸化処理を行えば良い。表面鹸化率は、ＮＭＲまたはＩＲにより、定めることができる。 The saponification treatment refers to bringing acetyl cellulose into contact with a saponification treatment solution (for example, sodium hydroxide aqueous solution). Thereby, it becomes a regenerated cellulose and a hydroxyl group is introduced into the portion of acetylcellulose that has come into contact with the saponification solution.
In order to increase the nucleic acid separation efficiency, it is preferable that the number of introduced hydroxyl groups is larger. For example, the saponification rate is preferably about 5% or more. Furthermore, the saponification rate is preferably about 10% or more.
In order to change the saponification rate, the saponification treatment may be performed by changing the concentration of sodium hydroxide. The surface saponification rate can be determined by NMR or IR.

また、水酸基を有する有機材料の多孔性膜としては、セルロースの多孔性膜を好ましく使用する事ができる。セルロースの多孔性膜としては、再生セルロースの多孔性膜を好ましく使用する事ができる。再生セルロースとは、アセチルセルロースの固体の表面または全体を、鹸化処理によりセルロース化したもので、本来のセルロースとは、結晶状態等の点で異なっている。   Moreover, as a porous film of an organic material having a hydroxyl group, a porous film of cellulose can be preferably used. As the porous membrane of cellulose, a porous membrane of regenerated cellulose can be preferably used. Regenerated cellulose is obtained by saponifying the solid surface or the whole of acetyl cellulose by saponification treatment, and is different from the original cellulose in terms of crystal state and the like.

親水基を持たない有機材料の多孔性膜に親水基を導入する方法として、ポリマー鎖内または側鎖に親水基を有すグラフトポリマー鎖を多孔性膜に結合することができる。
有機材料の多孔性膜にグラフトポリマー鎖を結合する方法としては、多孔性膜とグラフトポリマー鎖とを化学結合させる方法と、多孔性膜を起点として重合可能な二重結合を有する化合物を重合させグラフトポリマー鎖とする２つの方法がある。 As a method for introducing a hydrophilic group into a porous film made of an organic material having no hydrophilic group, a graft polymer chain having a hydrophilic group in a polymer chain or in a side chain can be bonded to the porous film.
As a method of bonding the graft polymer chain to the porous film of the organic material, a method of chemically bonding the porous film and the graft polymer chain, and a compound having a double bond that can be polymerized starting from the porous film are polymerized. There are two ways to make the graft polymer chain.

まず、多孔性膜とグラフトポリマー鎖とを化学結合にて付着させる方法においては、ポリマーの末端または側鎖に多孔性膜と反応する官能基を有するポリマーを使用し、この官能基と、多孔性膜の官能基とを化学反応させることでグラフトさせることができる。多孔性膜と反応する官能基としては、多孔性膜の官能基と反応し得るものであれば特に限定はないが、例えば、アルコキシシランのようなシランカップリング基、イソシアネート基、アミノ基、水酸基、カルボキシル基、スルホン酸基、リン酸基、エポキシ基、アリル基、メタクリロイル基、アクリロイル基等を挙げることができる。   First, in the method of attaching the porous membrane and the graft polymer chain by chemical bonding, a polymer having a functional group that reacts with the porous membrane is used at the terminal or side chain of the polymer, and this functional group and the porous It can be grafted by chemically reacting with a functional group of the membrane. The functional group that reacts with the porous membrane is not particularly limited as long as it can react with the functional group of the porous membrane. For example, a silane coupling group such as alkoxysilane, an isocyanate group, an amino group, and a hydroxyl group. And carboxyl group, sulfonic acid group, phosphoric acid group, epoxy group, allyl group, methacryloyl group, acryloyl group and the like.

ポリマーの末端、または側鎖に反応性官能基を有するポリマーとして特に有用な化合物は、トリアルコキシシリル基をポリマー末端に有するポリマー、アミノ基をポリマー末端に有するポリマー、カルボキシル基をポリマー末端に有するポリマー、エポキシ基をポリマー末端に有するポリマー、イソシアネート基をポリマー末端に有するポリマーが挙げられる。この時に使用されるポリマーとしては、核酸の吸着に関与する親水基を有するものであれば特に限定はないが、具体的には、ポリヒドロキシエチルアクリル酸、ポリヒドロキシエチルメタアクリル酸及びそれらの塩、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸及びそれらの塩、ポリオキシエチレンなどを挙げることができる。   Particularly useful compounds as a polymer having a reactive functional group at the end of the polymer or in the side chain are a polymer having a trialkoxysilyl group at the polymer end, a polymer having an amino group at the polymer end, and a polymer having a carboxyl group at the polymer end. , A polymer having an epoxy group at the polymer end, and a polymer having an isocyanate group at the polymer end. The polymer used at this time is not particularly limited as long as it has a hydrophilic group involved in nucleic acid adsorption. Specifically, polyhydroxyethylacrylic acid, polyhydroxyethylmethacrylic acid and salts thereof , Polyvinyl alcohol, polyvinyl pyrrolidone, polyacrylic acid, polymethacrylic acid and salts thereof, and polyoxyethylene.

多孔性膜を基点として重合可能な二重結合を有する化合物を重合させ、グラフトポリマー鎖を形成させる方法は、一般的には表面グラフト重合と呼ばれる。表面グラフト重合法とは、プラズマ照射、光照射、加熱などの方法で基材表面上に活性種を与え、多孔性膜と接するように配置された重合可能な二重結合を有する化合物を重合によって多孔性膜と結合させる方法を指す。
基材に結合しているグラフトポリマー鎖を形成するのに有用な化合物は、重合可能な二重結合を有しており、核酸の吸着に関与する親水基を有するという、２つの特性を兼ね備えていることが必要である。これらの化合物としては、分子内に二重結合を有していれば、親水基を有するポリマー、オリゴマー、モノマーのいずれの化合物をも用いることができる。特に有用な化合物は親水基を有するモノマーである。 A method of polymerizing a compound having a polymerizable double bond based on a porous membrane to form a graft polymer chain is generally called surface graft polymerization. The surface graft polymerization method is a method of polymerizing a compound having a polymerizable double bond disposed so as to be in contact with the porous film by giving active species on the surface of the substrate by a method such as plasma irradiation, light irradiation, and heating. It refers to the method of bonding with a porous membrane.
A compound useful for forming a graft polymer chain bound to a substrate has a double bond that can be polymerized and has a hydrophilic group that participates in nucleic acid adsorption. It is necessary to be. As these compounds, any polymer, oligomer, or monomer compound having a hydrophilic group can be used as long as it has a double bond in the molecule. Particularly useful compounds are monomers having hydrophilic groups.

特に有用な親水基を有するモノマーの具体例としては、次のモノマーを挙げることができる。例えば、２−ヒドロキシエチルアクリレート、２−ヒドロキシエチルメタクリレート、グリセロールモノメタクリレート等の水酸性基含有モノマーを特に好ましく用いることができる。また、アクリル酸、メタアクリル酸等のカルボキシル基含有モノマー、もしくはそのアルカリ金属塩及びアミン塩も好ましく用いることができる。   Specific examples of the particularly useful monomer having a hydrophilic group include the following monomers. For example, a hydroxyl group-containing monomer such as 2-hydroxyethyl acrylate, 2-hydroxyethyl methacrylate, and glycerol monomethacrylate can be particularly preferably used. Also, carboxyl group-containing monomers such as acrylic acid and methacrylic acid, or alkali metal salts and amine salts thereof can be preferably used.

親水基を持たない有機材料の多孔性膜に親水基を導入する別の方法として、親水基を有する材料をコーテイングすることができる。コーテイングに使用する材料は、核酸の吸着に関与する親水基を有するものであれば特に限定はないが、作業の容易さから有機材料のポリマーが好ましい。ポリマーとしては、ポリヒドロキシエチルアクリル酸、ポリヒドロキシエチルメタアクリル酸及びそれらの塩、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸及びそれらの塩、ポリオキシエチレン、アセチルセルロース、アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物などを挙げることができるが、多糖構造を有するポリマーが好ましい。   As another method for introducing a hydrophilic group into a porous film made of an organic material having no hydrophilic group, a material having a hydrophilic group can be coated. The material used for coating is not particularly limited as long as it has a hydrophilic group involved in nucleic acid adsorption, but an organic material polymer is preferable from the viewpoint of ease of work. Examples of polymers include polyhydroxyethyl acrylic acid, polyhydroxyethyl methacrylic acid and salts thereof, polyvinyl alcohol, polyvinyl pyrrolidone, polyacrylic acid, polymethacrylic acid and salts thereof, polyoxyethylene, acetylcellulose, and different acetyl values. Examples thereof include a mixture of acetylcellulose, and a polymer having a polysaccharide structure is preferable.

また、親水基を持たない有機材料の多孔性膜に、アセチルセルロースまたは、アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物をコーティングした後に、コーティングしたアセチルセルロースまたは、アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物を鹸化処理することもできる。この場合、鹸化率が約５％以上であることが好ましい。さらには、鹸化率が約１０％以上であることが好ましい。   In addition, after coating a porous film of an organic material having no hydrophilic group with acetyl cellulose or a mixture of acetyl celluloses having different acetyl values, the coated acetyl cellulose or a mixture of acetyl celluloses having different acetyl values is saponified. You can also. In this case, the saponification rate is preferably about 5% or more. Furthermore, the saponification rate is preferably about 10% or more.

親水基を有する無機材料である多孔性膜としては、シリカ化合物を含有する多孔性膜を挙げることができる。シリカ化合物を含有する多孔性膜としては、ガラスフィルターを挙げることができる。また、特許公報第３０５８３４２号に記載されているような、多孔質のシリカ薄膜を挙げることができる。この多孔質のシリカ薄膜とは、二分子膜形成能を有するカチオン型の両親媒性物質の展開液を基板上に展開した後、基板上の液膜から溶媒を除去することによって両親媒性物質の多層二分子膜薄膜を調整し、シリカ化合物を含有する溶液に多層二分子膜薄膜を接触させ、次いで前記多層二分子膜薄膜を抽出除去することで作製することができる。   Examples of the porous film that is an inorganic material having a hydrophilic group include a porous film containing a silica compound. A glass filter can be mentioned as a porous film containing a silica compound. Further, a porous silica thin film as described in Japanese Patent Publication No. 3058342 can be given. This porous silica thin film is an amphiphilic substance by spreading a developing solution of a cationic type amphiphilic substance having a bilayer-forming ability on a substrate and then removing the solvent from the liquid film on the substrate. This multilayer bilayer thin film can be prepared by bringing the multilayer bilayer thin film into contact with a solution containing a silica compound, and then extracting and removing the multilayer bilayer thin film.

親水基を持たない無機材料の多孔性膜に親水基を導入する方法としては、多孔性膜とグラフトポリマー鎖とを化学結合させる方法と、分子内に二重結合を有している親水基を有するモノマーを使用して、多孔性膜を起点として、グラフトポリマー鎖を重合する２つの方法がある。
多孔性膜とグラフトポリマー鎖とを化学結合にて付着させる場合は、グラフトポリマー鎖の末端の官能基と反応する官能基を無機材料に導入し、そこにグラフトポリマーを化学結合させる。また、分子内に二重結合を有している親水基を有するモノマーを使用して、多孔性膜を起点として、グラフトポリマー鎖を重合する場合は、二重結合を有する化合物を重合する際の起点となる官能基を無機材料に導入する。
親水性基を持つグラフトポリマー、および分子内に二重結合を有している親水基を有するモノマーとしては、上記、親水基を持たない有機材料の多孔性膜とグラフトポリマー鎖とを化学結合させる方法において、記載した親水性基を持つグラフトポリマー、および分子内に二重結合を有している親水基を有するモノマーを好ましく使用することができる。 As a method for introducing a hydrophilic group into a porous membrane of an inorganic material having no hydrophilic group, a method of chemically bonding the porous membrane and a graft polymer chain, and a hydrophilic group having a double bond in the molecule are used. There are two methods for polymerizing a graft polymer chain using a monomer having a porous membrane as a starting point.
When the porous membrane and the graft polymer chain are attached by chemical bonding, a functional group that reacts with the functional group at the terminal of the graft polymer chain is introduced into the inorganic material, and the graft polymer is chemically bonded thereto. In addition, when a graft polymer chain is polymerized starting from a porous membrane using a monomer having a hydrophilic group having a double bond in the molecule, a compound having a double bond is polymerized. The starting functional group is introduced into the inorganic material.
As a graft polymer having a hydrophilic group and a monomer having a hydrophilic group having a double bond in the molecule, the porous film of the organic material having no hydrophilic group is chemically bonded to the graft polymer chain. In the method, the described graft polymers having hydrophilic groups and monomers having a hydrophilic group having a double bond in the molecule can be preferably used.

親水基を持たない無機材料の多孔性膜に親水基を導入する別の方法として、親水基を有する材料をコーテイングすることができる。コーテイングに使用する材料は、核酸の吸着に関与する親水基を有するものであれば特に限定はないが、作業の容易さから有機材料のポリマーが好ましい。ポリマーとしては、ポリヒドロキシエチルアクリル酸、ポリヒドロキシエチルメタアクリル酸及びそれらの塩、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸及びそれらの塩、ポリオキシエチレン、アセチルセルロース、アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物などを挙げることができる。   As another method for introducing a hydrophilic group into a porous film of an inorganic material having no hydrophilic group, a material having a hydrophilic group can be coated. The material used for coating is not particularly limited as long as it has a hydrophilic group involved in nucleic acid adsorption, but an organic material polymer is preferable from the viewpoint of ease of work. Examples of polymers include polyhydroxyethyl acrylic acid, polyhydroxyethyl methacrylic acid and salts thereof, polyvinyl alcohol, polyvinyl pyrrolidone, polyacrylic acid, polymethacrylic acid and salts thereof, polyoxyethylene, acetylcellulose, and different acetyl values. Examples thereof include a mixture of acetylcellulose.

また、親水基を持たない無機材料の多孔性膜に、アセチルセルロースまたは、アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物をコーテイングした後に、コ−ティングしたアセチルセルロ−スまたは、アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物を鹸化処理することもできる。この場合、鹸化率が約５％以上であることが好ましい。さらには、鹸化率が約１０％以上であることが好ましい。   In addition, after coating acetyl cellulose or a mixture of acetyl celluloses having different acetyl values on a porous film of an inorganic material having no hydrophilic group, the coated acetyl cellulose or a mixture of acetyl celluloses having different acetyl values is coated. Can also be saponified. In this case, the saponification rate is preferably about 5% or more. Furthermore, the saponification rate is preferably about 10% or more.

親水基を持たない無機材料の多孔性膜としては、アルミニウム等の金属、ガラス、セメント、陶磁器等のセラミックス、もしくはニューセラミックス、シリコン、活性炭等を加工して作製した多孔性膜を挙げることができる。   Examples of the porous film made of an inorganic material having no hydrophilic group include a porous film produced by processing a metal such as aluminum, ceramics such as glass, cement and ceramics, or new ceramics, silicon and activated carbon. .

上記の、溶液が内部を通過可能な核酸吸着性多孔性膜としては、厚さが１０μｍ〜５００μｍである多孔性膜を用いることができる。さらに好ましくは、厚さが５０μｍ〜２５０μｍである多孔性膜を用いることができる。   As the nucleic acid-adsorbing porous membrane through which the solution can pass, a porous membrane having a thickness of 10 μm to 500 μm can be used. More preferably, a porous film having a thickness of 50 μm to 250 μm can be used.

また、溶液が内部を通過可能な核酸吸着性多孔性膜としては、最小孔径が０．２２μｍ以上である多孔性膜を用いることができる。さらに好ましくは、最小孔径が０．５μｍ以上である多孔性膜を用いることができる。また、溶液が内部を通過可能な核酸吸着性多孔性膜としては、最大孔径と最小孔径の比が２以上である多孔性膜を用いることができる。さらに好ましくは、最大孔径と最小孔径の比が５以上である多孔性膜を用いることができる。   In addition, as the nucleic acid-adsorbing porous membrane through which the solution can pass, a porous membrane having a minimum pore diameter of 0.22 μm or more can be used. More preferably, a porous membrane having a minimum pore diameter of 0.5 μm or more can be used. As the nucleic acid-adsorbing porous membrane through which the solution can pass, a porous membrane having a ratio of the maximum pore diameter to the minimum pore diameter of 2 or more can be used. More preferably, a porous membrane having a ratio of the maximum pore diameter to the minimum pore diameter of 5 or more can be used.

また、溶液が内部を通過可能な核酸吸着性多孔性膜としては、空隙率が５０〜９５％である多孔性膜を用いることができる。さらに好ましくは、空隙率が６５〜８０％である多孔性膜を用いることができる。また、溶液が内部を通過可能な核酸吸着性多孔性膜としては、バブルポイントが、０．１〜１０ｋｇｆ／ｃｍ2である多孔性膜を用いることができる。さらに好ましくは、バブルポイントが、０．２〜４ｋｇｆ／ｃｍ2である多孔性膜を用いることができる。 Moreover, as the nucleic acid-adsorptive porous membrane through which the solution can pass, a porous membrane having a porosity of 50 to 95% can be used. More preferably, a porous film having a porosity of 65 to 80% can be used. As the nucleic acid-adsorbing porous membrane through which the solution can pass, a porous membrane having a bubble point of 0.1 to 10 kgf / cm 2 can be used. More preferably, a porous film having a bubble point of 0.2 to 4 kgf / cm 2 can be used.

また、溶液が内部を通過可能な核酸吸着性多孔性膜としては、圧力損失が、０．１〜１００ｋＰａである多孔性膜を用いる事ができる。さらに好ましくは、圧力損失が、０．５〜５０ｋＰａである多孔性膜を用いる事ができる。ここで、圧力損失とは、膜の厚さ１００μｍあたり、水を通過させるのに必要な最低圧力である。   As the nucleic acid-adsorbing porous membrane through which the solution can pass, a porous membrane having a pressure loss of 0.1 to 100 kPa can be used. More preferably, a porous membrane having a pressure loss of 0.5 to 50 kPa can be used. Here, the pressure loss is the minimum pressure required to pass water per 100 μm thickness of the membrane.

また、溶液が内部を通過可能な核酸吸着性多孔性膜としては、また、２５℃で１ｋｇ／ｃｍ2の圧力で水を通過させたときの透水量が、膜１ｃｍ2あたり１分間で１〜５０００ｍＬである多孔性膜を用いることができる。さらに好ましくは、２５℃で１ｋｇ／ｃｍ2の圧力で水を通過させたときの透水量が、膜１ｃｍ2あたり１分間で５〜１０００ｍＬである多孔性膜を用いることができる Moreover, as a nucleic acid-adsorptive porous membrane through which the solution can pass, the water permeation amount when passing water at a pressure of 1 kg / cm 2 at 25 ° C. is 1 to 1 per 1 cm 2 of the membrane. A porous membrane that is 5000 mL can be used. More preferably, a porous membrane having a water permeability of 5 to 1000 mL per minute per 1 cm 2 of membrane when water is passed at 25 ° C. and a pressure of 1 kg / cm 2 can be used.

また、溶液が内部を通過可能な核酸吸着性多孔性膜としては、多孔性膜1ｍｇあたりの核酸の吸着量が０．１μｇ以上である多孔性膜を好ましく使用することができる。さらに好ましくは、多孔性膜1ｍｇあたりの核酸の吸着量が０．９μｇ以上である多孔性膜を用いることができる。   Further, as the nucleic acid-adsorbing porous membrane through which the solution can pass, a porous membrane in which the nucleic acid adsorption amount per 1 mg of the porous membrane is 0.1 μg or more can be preferably used. More preferably, a porous membrane having a nucleic acid adsorption amount of 0.9 μg or more per 1 mg of the porous membrane can be used.

また、溶液が内部を通過可能な核酸吸着性多孔性膜としては、一辺が５ｍｍの正方形の多孔性膜をトリフルオロ酢酸５ｍＬに浸漬したときに、１時間以内では溶解しないが４８時間以内に溶解するセルロース誘導体からなる多孔性膜を好ましく使用することができる。また、一辺が５ｍｍの正方形の多孔質膜をトリフルオロ酢酸５ｍＬに浸漬したときに１時間以内に溶解するが、ジクロロメタン５ｍＬに浸漬したときには２４時間以内に溶解しないセルロース誘導体からなる多孔性膜を好ましく使用することができる。   Moreover, as a nucleic acid-adsorbing porous membrane through which the solution can pass, when a square porous membrane with a side of 5 mm is immersed in 5 mL of trifluoroacetic acid, it does not dissolve within 1 hour but dissolves within 48 hours. A porous membrane made of a cellulose derivative can be preferably used. Further, a porous membrane made of a cellulose derivative that dissolves within 1 hour when immersed in 5 mL of trifluoroacetic acid, but does not dissolve within 24 hours when immersed in 5 mL of dichloromethane is preferable. Can be used.

核酸吸着性多孔性膜中を、核酸を含む試料溶液を通過させる場合、試料溶液を一方の面から他方の面へと通過させることが好ましい。核酸吸着性多孔性膜中を、核酸を含む試料溶液を通過させる場合、試料溶液を核酸吸着性多孔性膜の孔径が大きい側から小さい側に通過させることが好ましい。   When passing a sample solution containing nucleic acid through the nucleic acid-adsorbing porous membrane, it is preferable to pass the sample solution from one surface to the other surface. When passing a sample solution containing nucleic acid through the nucleic acid-adsorbing porous membrane, it is preferable to pass the sample solution from the side having the larger pore diameter of the nucleic acid-adsorbing porous membrane to the smaller side.

核酸を含む試料溶液を核酸吸着性多孔性膜を通過させる場合の流速は、膜の面積ｃｍ2あたり、２〜１５００μＬ/secであることが好ましい。さらに、膜の面積ｃｍ2あたり、５〜７００μＬ/secであることが好ましい。 The flow rate when the sample solution containing nucleic acid is passed through the nucleic acid-adsorbing porous membrane is preferably 2 to 1500 μL / sec per cm 2 of the membrane area. Furthermore, it is preferable that it is 5-700 microliters / sec per area cm < 2 > of a film | membrane.

また、使用する溶液が内部を通過可能な核酸吸着性多孔性膜は、１枚であってもよいが、複数枚を使用することもできる。複数枚の核酸吸着性多孔性膜は、同一のものであっても、異なるものであって良い。   Further, the number of nucleic acid-adsorbing porous membranes through which the solution to be used can pass may be one, but a plurality of nucleic acid-adsorbing porous membranes can also be used. The plurality of nucleic acid-adsorbing porous membranes may be the same or different.

少なくとも二個の開口を有する容器内に、上記のような溶液が内部を通過可能な核酸吸着性多孔性膜を収容した核酸分離精製カートリッジを好ましく使用することができる。また、少なくとも二個の開口を有する容器内に、上記のような溶液が内部を通過可能な核酸吸着性多孔性膜を複数枚収容した核酸分離精製カートリッジを好ましく使用することができる。この場合、少なくとも二個の開口を有する容器内に収容される複数枚の核酸吸着性多孔性膜は、同一のものであっても、異なるものであって良い。   A cartridge for separating and purifying nucleic acid containing a nucleic acid-adsorbing porous membrane through which the above solution can pass inside in a container having at least two openings can be preferably used. In addition, a nucleic acid separation and purification cartridge in which a plurality of nucleic acid-adsorbing porous membranes through which the above solution can pass is contained in a container having at least two openings. In this case, the plurality of nucleic acid-adsorbing porous membranes accommodated in a container having at least two openings may be the same or different.

複数枚の核酸吸着性多孔性膜は、無機材料の核酸吸着性多孔性膜と有機材料の核酸吸着性多孔性膜との組合せであっても良い。例えば、ガラスフイルターと再生セルロースの多孔性膜との組合せを挙げることができる。また、複数枚の核酸吸着性多孔性膜は、無機材料の核酸吸着性多孔性膜と有機材料の核酸非吸着性多孔性膜との組合せであってもよい、例えば、ガラスフイルターと、ナイロンまたはポリスルホンの多孔性膜との組合せを挙げることができる。   The plurality of nucleic acid-adsorptive porous membranes may be a combination of an inorganic material nucleic acid-adsorptive porous membrane and an organic material nucleic acid-adsorptive porous membrane. For example, a combination of a glass filter and a porous membrane of regenerated cellulose can be mentioned. The plurality of nucleic acid-adsorptive porous membranes may be a combination of an inorganic material nucleic acid-adsorptive porous membrane and an organic material non-nucleic acid-adsorptive porous membrane, for example, glass filter, nylon or A combination with a porous membrane of polysulfone can be mentioned.

核酸分離精製カートリッジは、少なくとも二個の開口を有する容器内に、上記のような溶液が内部を通過可能な核酸吸着性多孔性膜を収容する以外、その他の部材を収容していないことが好ましい。上記の容器の材料としては、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリ塩化ビニルなどのプラスチックを使用することができる。また、生分解性の材料も好ましく使用することができる。また、上記の容器は透明であっても、着色してあっても良い。   It is preferable that the nucleic acid separation and purification cartridge does not contain other members in a container having at least two openings other than containing a nucleic acid-adsorbing porous membrane through which the above solution can pass. . As a material for the container, plastics such as polypropylene, polystyrene, polycarbonate, and polyvinyl chloride can be used. Biodegradable materials can also be preferably used. In addition, the container may be transparent or colored.

核酸分離精製カートリッジとして、個々の核酸分離精製カートリッジを識別する手段を備えている核酸分離精製カートリッジを使用することができる。個々の核酸分離精製カートリッジを識別する手段としては、バーコード、磁気テープなどが挙げられる。   As the nucleic acid separation / purification cartridge, a nucleic acid separation / purification cartridge provided with means for identifying individual nucleic acid separation / purification cartridges can be used. Examples of means for identifying individual nucleic acid separation and purification cartridges include bar codes and magnetic tapes.

また、少なくとも二個の開口を有する容器内から核酸吸着性多孔性膜を容易に取り出すことが可能になっている構造を有した核酸分離精製カートリッジを使用することもできる。   In addition, a nucleic acid separation and purification cartridge having a structure capable of easily taking out the nucleic acid-adsorbing porous membrane from a container having at least two openings can be used.

上記に記載した、各々の溶液が内部を通過可能な核酸吸着性多孔性膜を収容する核酸分離精製カートリッジを用いて、以下の工程で核酸を分離精製することができる。すなわち、(a)核酸を含む試料溶液を、少なくとも二個の開口を有する容器内に、溶液が内部を通過可能な、核酸吸着性多孔性膜を収容した核酸分離精製カートリッジの一の開口に注入する工程、(b)核酸分離精製カートリッジの他の開口に結合された圧力差発生装置を用いて核酸分離精製カートリッジト内を減圧状態にし、注入した核酸を含む試料溶液を、核酸吸着性多孔性膜を通過させ、核酸分離精製カートリッジの上記他の開口より排出することによって、核酸吸着性多孔性膜内に核酸を吸着させる工程、(c)核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に洗浄液を注入する工程、(d)核酸分離精製カートリッジの上記他の開口に結合された圧力差発生装置を用いて核酸分離精製カートリッジ内を減圧状態にし、注入した洗浄液を、核酸吸着性多孔性膜を通過させ、上記他の開口より排出することによって、核酸吸着性多孔性膜を、核酸が吸着した状態で、洗浄する工程、(e)核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に回収液を注入する工程、(f)核酸分離精製カートリッジの上記他の開口に結合された圧力差発生装置を用いて核酸分離精製カートリッジ内を減圧状態にし、又は核酸分離精製カートリッジに遠心力を作用させ、注入した回収液を、核酸吸着性多孔性膜を通過させ、上記他の開口より排出することによって、核酸吸着性多孔性膜内から核酸を脱着させ、核酸分離精製カートリッジ容器外に排出する工程を行なうことができる。   Using the nucleic acid separation / purification cartridge containing the nucleic acid-adsorbing porous membrane through which each solution can pass, the nucleic acid can be separated and purified in the following steps. That is, (a) a sample solution containing nucleic acid is injected into one opening of a nucleic acid separation and purification cartridge containing a nucleic acid-adsorbing porous membrane that allows the solution to pass through a container having at least two openings. (B) using a pressure difference generator connected to the other opening of the cartridge for separating and purifying nucleic acid to reduce the pressure in the cartridge for separating and purifying the sample solution containing the injected nucleic acid. A step of adsorbing nucleic acid in the nucleic acid-adsorptive porous membrane by passing through the membrane and discharging from the other opening of the nucleic acid separation-purification cartridge; (c) injecting a washing solution into the one opening of the nucleic acid separation-purification cartridge (D) using a pressure difference generator connected to the other opening of the nucleic acid separation / purification cartridge to reduce the pressure in the nucleic acid separation / purification cartridge, A step of washing the nucleic acid-adsorbing porous membrane in a state in which the nucleic acid is adsorbed by passing through the functional membrane and discharging from the other opening, (e) the recovered liquid in the one opening of the nucleic acid separation and purification cartridge (F) The nucleic acid separation / purification cartridge is depressurized using a pressure difference generator coupled to the other opening of the nucleic acid separation / purification cartridge, or centrifugal force is applied to the nucleic acid separation / purification cartridge, Passing the injected recovery liquid through the nucleic acid-adsorbing porous membrane and discharging it from the other opening, thereby desorbing the nucleic acid from the nucleic acid-adsorbing porous membrane and discharging it out of the cartridge for nucleic acid separation and purification; Can be done.

また、別の核酸分離精製工程としては、(a)核酸を含む試料溶液を、少なくとも二個の開口を有する容器内に、溶液が内部を通過可能な、核酸吸着性多孔性膜を収容した核酸分離精製カートリッジの一の開口に注入する工程、(b)核酸分離精製カートリッジに遠心力を作用させ、注入した核酸を含む試料溶液を、核酸吸着性多孔性膜を通過させ、核酸分離精製カートリッジの他の開口より排出することによって、核酸吸着性多孔性膜内に核酸を吸着させる工程、(c)核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に洗浄液を注入する工程、(d)核酸分離精製カートリッジに遠心力を作用させ、注入した洗浄液を、核酸吸着性多孔性膜を通過させ、他の開口より排出することによって、核酸吸着性多孔性膜を、核酸が吸着した状態で、洗浄する工程、(e)核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に回収液を注入する工程、(f)核酸分離精製カートリッジに遠心力を作用させ、注入した回収液を、核酸吸着性多孔性膜を通過させ、他の開口より排出することによって、核酸吸着性多孔性膜内から核酸を脱着させ、核酸分離精製カートリッジ容器外に排出する工程を行うこともできる。   As another nucleic acid separation and purification step, (a) a nucleic acid containing a nucleic acid-adsorbing porous membrane in which a solution containing a nucleic acid can be passed through a sample solution containing the nucleic acid in a container having at least two openings. A step of injecting into one opening of the separation and purification cartridge, (b) applying a centrifugal force to the nucleic acid separation and purification cartridge, passing the sample solution containing the injected nucleic acid through the nucleic acid-adsorbing porous membrane, and A step of adsorbing nucleic acid in the nucleic acid-adsorbing porous membrane by discharging from another opening, (c) a step of injecting a washing solution into the one opening of the nucleic acid separation / purification cartridge, (d) A step of washing the nucleic acid-adsorbing porous membrane with nucleic acid adsorbed by applying centrifugal force and passing the injected cleaning solution through the nucleic acid-adsorbing porous membrane and discharging it from the other openings. e) Nucleic acid A step of injecting the recovered liquid into the one opening of the separation / purification cartridge; (f) applying centrifugal force to the nucleic acid separation and purification cartridge, and passing the injected recovered liquid through the nucleic acid-adsorbing porous membrane; By discharging, the step of desorbing the nucleic acid from the nucleic acid-adsorbing porous membrane and discharging it out of the cartridge for separating and purifying nucleic acid can be performed.

以下、洗浄工程について説明する。洗浄を行うことにより、核酸の回収量及び純度が向上し、必要な核酸を含む検体の量を微量とすることができる。また、洗浄や回収操作を自動化することによって、操作が簡便かつ迅速に行うことが可能になる。洗浄工程は、迅速化のためには1回の洗浄で済ませることができる。また純度がより重要な場合には複数回洗浄を繰返してもよい。   Hereinafter, the cleaning process will be described. By performing the washing, the amount and purity of the nucleic acid recovered can be improved, and the amount of the specimen containing the necessary nucleic acid can be made very small. Further, by automating the cleaning and recovery operation, the operation can be performed easily and quickly. The cleaning process can be completed only once for speeding up. If the purity is more important, the washing may be repeated a plurality of times.

洗浄工程において、洗浄液は、チューブ、ピペット、又は自動注入装置、もしくはこれらと同じ機能をもつ供給手段を使用して、核酸吸着性多孔性膜を収容した核酸分離精製カートリッジへ供給される。供給された洗浄液は、核酸分離精製カートリッジの一の開口（核酸を含む試料溶液を注入した開口）から供給され、該開口に結合された圧力差発生装置（例えばスポイド、注射器、ポンプ、パワーピペットなど）を用いて核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態にして核酸吸着性多孔性膜を通過させ、一の開口と異なる開口より排出させることができる。また、洗浄液を一の開口から供給し、同じ一の開口より排出させることもできる。さらには、核酸分離精製カートリッジの核酸を含む試料溶液を供給した一の開口と異なる開口より洗浄液を供給し、排出させることも可能である。しかしながら、核酸分離精製カートリッジの一の開口から供給し、核酸吸着性多孔性膜を通過させ、一の開口と異なる開口より排出さる方法が洗浄効率が優れてより好ましい。
特に好ましい態様は、試料溶液を注入した一の開口から洗浄液も供給し、核酸吸着性多孔性膜を通過させ、一の開口と異なる開口より排出さる方法と、試料溶液を注入した一の開口と異なる開口から洗浄液を供給し、核酸吸着性多孔性膜を通過させ、一の開口より排出さる方法である。
洗浄工程における洗浄液の液量は、２μｌ/ｍｍ2以上が好ましい。洗浄液量が多量であれば洗浄効果は向上するが、操作性を保ち、試料の流出を抑止するためには、２００μｌ/ｍｍ2以下が好ましい。 In the washing step, the washing solution is supplied to the nucleic acid separation / purification cartridge containing the nucleic acid-adsorbing porous membrane using a tube, pipette, automatic injection device, or supply means having the same function. The supplied washing solution is supplied from one opening of the cartridge for separating and purifying nucleic acid (opening into which a sample solution containing nucleic acid is injected), and a pressure difference generator (for example, a spoid, a syringe, a pump, a power pipette, etc.) coupled to the opening. ), The inside of the cartridge for separating and purifying nucleic acid is pressurized and allowed to pass through the porous nucleic acid adsorbing porous membrane and discharged from an opening different from the one opening. Also, the cleaning liquid can be supplied from one opening and discharged from the same opening. Furthermore, it is also possible to supply and discharge the cleaning liquid from an opening different from the one opening to which the sample solution containing the nucleic acid in the cartridge for nucleic acid separation and purification is supplied. However, a method of supplying from one opening of the nucleic acid separation and purification cartridge, passing through the nucleic acid-adsorptive porous membrane, and discharging from an opening different from the one opening is more preferable because of excellent cleaning efficiency.
In a particularly preferred embodiment, a cleaning solution is also supplied from one opening into which the sample solution is injected, passed through the nucleic acid-adsorbing porous membrane, and discharged from an opening different from the one opening, and one opening into which the sample solution is injected. In this method, a cleaning solution is supplied from different openings, passed through the nucleic acid-adsorbing porous membrane, and discharged from one opening.
The amount of the cleaning liquid in the cleaning process is preferably 2 μl / mm 2 or more. If the amount of the cleaning liquid is large, the cleaning effect is improved, but 200 μl / mm 2 or less is preferable in order to maintain the operability and suppress the outflow of the sample.

洗浄工程において、洗浄液を核酸吸着性多孔性膜を通過させる場合の流速は、膜の単位面積（ｃｍ2）あたり、２〜１５００μＬ/secであることが好ましく、５〜７００μＬ/secであることがより好ましい。通過速度を下げて時間を掛ければ洗浄がそれだけ十分に行なわれることになるが、核酸の分離精製操作の迅速化も重要であるので上記した範囲が選択される。 In the washing step, the flow rate when the washing solution is passed through the nucleic acid-adsorbing porous membrane is preferably 2 to 1500 μL / sec, preferably 5 to 700 μL / sec, per unit area (cm 2 ) of the membrane. More preferred. If the passage speed is lowered and time is taken, the washing is sufficiently performed. However, since the speed of the separation and purification operation of the nucleic acid is important, the above range is selected.

洗浄工程において、洗浄液の液温は４〜７０℃であることが好ましい。さらには、洗浄液の液温を室温とすることがより好ましい。
また洗浄工程において、その核酸分離精製カートリッジを器械的な振動や超音波による攪拌を与えながら、または遠心分離により洗浄することもできる。 In the washing step, the temperature of the washing solution is preferably 4 to 70 ° C. Furthermore, it is more preferable that the temperature of the cleaning liquid is room temperature.
In the washing step, the cartridge for separating and purifying nucleic acid can be washed while being subjected to mechanical vibration, stirring by ultrasonic waves, or by centrifugation.

洗浄工程において、洗浄液には、一般的には核酸分解酵素のような酵素を含ませないが、タンパク質等の夾雑物質を分解する酵素を含ませることができる。また、場合によってはＤＮＡ分解酵素、ＲＮＡ分解酵素などを含ませることもできる。ＤＮＡ分解酵素を含む洗浄液は、検体中のＲＮＡのみを選択的に回収する場合に好ましく用いられる。逆に、ＲＮＡ分解酵素を含む洗浄液は、検体中のＤＮＡのみを選択的に回収する場合に好ましく用いられる。   In the washing step, the washing solution generally does not contain an enzyme such as a nucleolytic enzyme, but can contain an enzyme that degrades contaminants such as proteins. In some cases, a DNA degrading enzyme, an RNA degrading enzyme, or the like can be included. A washing solution containing a DNA-degrading enzyme is preferably used when only RNA in a specimen is selectively recovered. Conversely, a washing solution containing an RNase is preferably used when only DNA in a specimen is selectively recovered.

洗浄工程において、洗浄液として、水溶性有機溶媒及び/または水溶性塩を含んでいる溶液を用いることができる。洗浄液は、核酸吸着性多孔性膜に核酸と共に吸着した試料溶液中の不純物を洗い流す機能を有する必要がある。そのためには、核酸吸着性多孔性膜から核酸は脱着させないが不純物は脱着させる組成であることが必要である。この目的には、アルコール等の水溶性有機溶媒が核酸が難溶性であるので、核酸を保持したまま核酸以外の成分を脱着させるのに適している。また、水溶性塩を添加することにより、核酸の吸着効果が高まるので、不要成分の選択的除去作用が向上する。   In the washing step, a solution containing a water-soluble organic solvent and / or a water-soluble salt can be used as the washing liquid. The washing liquid needs to have a function of washing out impurities in the sample solution adsorbed together with the nucleic acid on the nucleic acid adsorbing porous membrane. For this purpose, it is necessary to have a composition in which nucleic acids are not desorbed from the nucleic acid-adsorbing porous membrane but impurities are desorbed. For this purpose, since a water-soluble organic solvent such as alcohol is hardly soluble in nucleic acid, it is suitable for desorbing components other than nucleic acid while retaining the nucleic acid. In addition, by adding a water-soluble salt, the effect of adsorbing nucleic acids is enhanced, so that the selective removal of unnecessary components is improved.

洗浄液に含まれる水溶性有機溶媒としては、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ｎ−イソプロパノール、ブタノール、アセトンなどを用いることができ、中でもエタノ―ルを用いることが好ましい。洗浄液中に含まれる水溶性有機溶媒の量は、２０〜１００重量％であることが好ましく、４０〜８０重量％であることがより好ましい。   As the water-soluble organic solvent contained in the cleaning liquid, methanol, ethanol, isopropanol, n-isopropanol, butanol, acetone and the like can be used, and ethanol is particularly preferable. The amount of the water-soluble organic solvent contained in the cleaning liquid is preferably 20 to 100% by weight, and more preferably 40 to 80% by weight.

本発明の核酸の分離精製方法の特徴は、前記したように核酸吸着性多孔性膜が実質的にイオン結合が関与しない相互作用で核酸が吸着する多孔性膜であることと同時に、洗浄液のイオン強度は５〜５００ｍｍｏｌ／Ｋｇであるが、好ましいイオン強度は１０〜４００ｍｍｏｌ／Ｋｇであり、より好ましくは２０〜３００ｍｍｏｌ／Ｋｇである。洗浄液のイオン強度が低いと、多孔性膜内に残留する洗浄液の量が多く洗浄効率が低下し、イオン強度が高いと、多孔性膜に吸着した核酸由来の蛋白質やその分解物の洗浄液への溶解が進行しにくく、いずれの場合も核酸の分離精製度が低下する。上記の範囲のイオン強度を選択することにより、核酸の分離精製度を維持しつつ、洗浄を迅速化することができる。
イオン強度の調整は、洗浄液中の塩類やイオン性界面活性剤の種類と濃度などの調節によって行うことができる。
イオン強度調整と核酸分離能向上の目的の水溶性塩として、ハロゲン化物の塩が含まれていることも好ましく、とくに塩化物が適している。また、少量でイオン強度を高めるためには硫酸塩やリン酸塩を用いてもよい。
一方、水溶性塩のカチオン成分として好ましいのは、一価または二価のカチオンであり、特にカリウム塩又はナトリウム塩が好ましく、中でもナトリウム塩が適している。また、少量でイオン強度を高めるためにはマグネシウム塩を用いてもよい。
塩の濃度は１０ｍｍｏｌ／Ｌ以上含まれているのが好ましい。特に塩化ナトリウムが２０ｍｍｏｌ／Ｌ以上含まれていることが目的の効果を発揮するのに好ましい。
本発明の上記（１）〜（１４）に記載の核酸分離精製方法を行うために、核酸分離精製カ−トリッジ、試薬のキット及び核酸分離精製陽自動装置を用いて簡易,迅速に行なうことができる。 As described above, the nucleic acid separation and purification method of the present invention is characterized in that the nucleic acid-adsorbing porous membrane is a porous membrane that adsorbs nucleic acids by an interaction that does not substantially involve ionic bonds, and at the same time, the ions of the washing solution The strength is 5 to 500 mmol / Kg, but the preferred ionic strength is 10 to 400 mmol / Kg, more preferably 20 to 300 mmol / Kg. If the ionic strength of the cleaning liquid is low, the amount of the cleaning liquid remaining in the porous membrane is large and the cleaning efficiency is lowered.If the ionic strength is high, the nucleic acid-derived protein adsorbed on the porous membrane and its degradation products are introduced into the cleaning liquid. Lysis is difficult to proceed, and in either case, the degree of separation and purification of the nucleic acid is reduced. By selecting an ionic strength within the above range, washing can be speeded up while maintaining the degree of separation and purification of the nucleic acid.
The ionic strength can be adjusted by adjusting the kind and concentration of salts and ionic surfactants in the cleaning liquid.
It is preferable that a salt of a halide is contained as a water-soluble salt for the purpose of adjusting ionic strength and improving nucleic acid separation ability, and chloride is particularly suitable. Moreover, in order to increase the ionic strength with a small amount, sulfate or phosphate may be used.
On the other hand, monovalent or divalent cations are preferable as the cation component of the water-soluble salt, and potassium salt or sodium salt is particularly preferable, and sodium salt is particularly suitable. In order to increase the ionic strength with a small amount, a magnesium salt may be used.
The salt concentration is preferably 10 mmol / L or more. In particular, it is preferable that sodium chloride is contained in an amount of 20 mmol / L or more in order to exhibit the intended effect.
In order to carry out the method for separating and purifying nucleic acid according to the above (1) to (14) of the present invention, it can be carried out simply and rapidly using a nucleic acid separation and purification cartridge, a reagent kit and a nucleic acid separation and purification positive automatic apparatus. it can.

洗浄液は、カオトロッピク物質を含んでいないことが好ましい。それによって、洗浄工程に引き続く回収工程にカオトロピック物質が混入する可能性を減らすことができる。回収工程時に、カオトロピック物質が混入すると、しばしばＰＣＲ反応等の酵素反応を阻害するので、後の酵素反応等を考慮すると洗浄液にカオトロッピク物質を含まないことが理想的である。また、カオトロピック物質は、腐食性で有害であるので、この点でもカオトロピック物質を用いないで済むことは、実験者にとっても試験操作の安全上極めて有利である。
ここで、カオトロピック物質とは、前記したように尿素、グアニジン塩、イソチアン酸ナトリウム、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリウムなどである。 It is preferable that the cleaning liquid does not contain a chaotropic substance. Thereby, the possibility that the chaotropic substance is mixed in the recovery process subsequent to the cleaning process can be reduced. When a chaotropic substance is mixed during the recovery step, an enzyme reaction such as a PCR reaction is often inhibited. Therefore, it is ideal that the washing liquid does not contain a chaotropic substance in consideration of the subsequent enzyme reaction or the like. In addition, since chaotropic substances are corrosive and harmful, it is extremely advantageous for the experimenter from the viewpoint of safety of the test operation that the chaotropic substances need not be used.
Here, the chaotropic substance is urea, guanidine salt, sodium isothiocyanate, sodium iodide, potassium iodide or the like as described above.

従来、核酸分離精製工程における洗浄工程の際、洗浄液がカ−トリジなどの容器に対する濡れ性が低いため、しばしば洗浄液が容器中に残留することになり、洗浄工程に続く回収工程への洗浄液の混入して核酸の純度の低下や次工程における反応性の低下などの原因となっている。したがって、カ−トリッジなどの容器を用いて核酸の吸着及び脱着を行う場合、吸着、洗浄時に用いる液、特に洗浄液が、次の工程に影響を及ぼさないように、カートリッジ内に洗浄残液が残留しないことは重要である。   Conventionally, during the washing process in the nucleic acid separation and purification process, since the washing liquid has low wettability with respect to a container such as a cartridge, the washing liquid often remains in the container, and the washing liquid is mixed into the recovery process following the washing process. This causes a decrease in the purity of the nucleic acid and a decrease in reactivity in the next step. Therefore, when nucleic acid is adsorbed and desorbed using a container such as a cartridge, washing residual liquid remains in the cartridge so that the liquid used for adsorption and washing, particularly the washing liquid, does not affect the next step. It is important not to.

したがって、洗浄工程における洗浄液が次工程の回収液に混入することを防止して、洗浄液のカ−トリッジ内への残留を最小限に留めるため、洗浄液の表面張力を３５ｍPa・ｍ以下にすることが好ましい。表面張力を低くすれば洗浄液とカートリッジの濡れ性が向上し、残留する液量を抑えることができる。洗浄液の表面張力の下限に付いては特に規定する必要はないが、１５ｍPa・ｍ以下にしても更なる効果は得られない。   Therefore, in order to prevent the cleaning liquid in the cleaning process from being mixed into the recovered liquid in the next process and to keep the cleaning liquid remaining in the cartridge to a minimum, the surface tension of the cleaning liquid should be 35 mPa · m or less. preferable. If the surface tension is lowered, the wettability between the cleaning liquid and the cartridge is improved, and the remaining liquid volume can be suppressed. There is no need to specify the lower limit of the surface tension of the cleaning liquid, but even if it is 15 mPa · m or less, no further effect can be obtained.

本発明に係る核酸吸着性多孔性膜を利用して洗浄工程を簡素化することができる。(1)洗浄液が核酸吸着性多孔性膜を通過する回数を1回でよい、(2)洗浄工程を室温でできる。(3)洗浄後、直ちに回収液をカートリッジに注入することができる。前記（１）、（２）、（３）のすべてを用いることが操作の簡易・迅速化の点で優れているが、いずれか1つもしくは２つでも効果は認められる。従来法においては、洗浄液中に含まれる有機溶媒を迅速に取り除くため、しばしば乾燥工程を必要としたが、本発明に係る核酸吸着性多孔性膜は薄膜であるためにこれを省略できるからである。   The washing process can be simplified by using the nucleic acid-adsorbing porous membrane according to the present invention. (1) The number of times that the washing solution passes through the nucleic acid-adsorbing porous membrane may be one, and (2) the washing step can be performed at room temperature. (3) The recovered liquid can be poured into the cartridge immediately after washing. The use of all of (1), (2), and (3) is excellent in terms of easy and quick operation, but the effect is recognized with either one or two. In the conventional method, in order to quickly remove the organic solvent contained in the cleaning solution, a drying step is often required. However, since the nucleic acid-adsorptive porous membrane according to the present invention is a thin film, it can be omitted. .

従来、核酸分離精製工程において、洗浄工程の際、しばしば洗浄液が飛散し他に付着することによって、試料のコンタミネーション（汚染）が起きることが問題となっている。洗浄工程におけるこの種のコンタミネーションは、二個の開口を有する容器内に核酸吸着性多性孔膜を収容した核酸分離精製カートリッジと廃液容器の形状とを工夫することによって抑止することができる。   Conventionally, in the nucleic acid separation and purification process, there is a problem that contamination of the sample occurs due to the washing liquid often scattering and adhering to the other during the washing process. This kind of contamination in the washing process can be suppressed by devising the shape of the waste liquid container and the nucleic acid separation and purification cartridge in which the nucleic acid-adsorbing polyporous membrane is housed in a container having two openings.

以下に核酸吸着性多性孔膜から核酸を脱着させて回収する工程について示す。回収工程において、回収液は、チューブ、ピペット、又は自動注入装置、もしくはこれらと同じ機能をもつ供給手段を使用して、核酸吸着性多孔性膜を装着した核酸分離精製カートリッジへ供給される。回収液は、核酸分離精製カートリッジの一の開口（核酸を含む試料溶液を注入した開口）から供給され、該開口に結合された圧力差発生装置（例えばスポイド、注射器、ポンプ、パワーピペットなど）を用いて核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態にして核酸吸着性多孔性膜を通過させ、一の開口と異なる開口より排出させることができる。また、回収液を一の開口から供給し、同じ一の開口より排出させることもできる。さらには、核酸分離精製カートリッジの核酸を含む試料溶液を供給した一の開口と異なる開口より回収液を供給し、排出させることも可能である。しかしながら、核酸分離精製カートリッジの一の開口から供給し、核酸吸着性多孔性膜を通過させ、一の開口と異なる開口より排出さる方法が回収効率が優れてより好ましい。   The process of desorbing and recovering nucleic acid from the nucleic acid adsorbing polyporous membrane is shown below. In the recovery step, the recovery liquid is supplied to the nucleic acid separation / purification cartridge equipped with the nucleic acid-adsorbing porous membrane using a tube, pipette, automatic injection device, or supply means having the same function. The recovery liquid is supplied from one opening of the cartridge for separating and purifying nucleic acid (opening into which a sample solution containing nucleic acid is injected), and a pressure difference generator (for example, a spoid, a syringe, a pump, a power pipette, etc.) coupled to the opening is connected to the recovery liquid. By using it, the inside of the cartridge for separating and purifying nucleic acid can be pressurized and passed through the nucleic acid-adsorbing porous membrane and discharged from an opening different from the one opening. Further, the recovery liquid can be supplied from one opening and discharged from the same opening. Furthermore, it is also possible to supply and discharge the recovery liquid from an opening different from the one opening to which the sample solution containing the nucleic acid in the nucleic acid separation and purification cartridge is supplied. However, a method in which the nucleic acid separation and purification cartridge is supplied from one opening, passed through the nucleic acid-adsorbing porous membrane, and discharged from an opening different from the one opening is more preferable because of excellent recovery efficiency.

検体から調整した核酸を含む試料溶液の体積に対して、回収液の体積を調整して核酸の脱着を行うことができる。分離精製された核酸を含む回収液量は、そのとき使用する検体量による。一般的によく使われる回収液量は数１０から数１００μｌであるが、検体量が極微量である時や、逆に大量の核酸を分離精製したい場合には回収液量は１μｌから数１０ｍｌの範囲で変える事ができる。   Nucleic acid can be desorbed by adjusting the volume of the recovered liquid relative to the volume of the sample solution containing the nucleic acid prepared from the specimen. The amount of the recovered liquid containing the separated and purified nucleic acid depends on the amount of sample used at that time. In general, the amount of the recovered liquid is several tens to several hundreds of μl. However, when the amount of the sample is extremely small, or when it is desired to separate and purify a large amount of nucleic acid, the amount of the recovered liquid is 1 μl to several tens of ml. You can change the range.

回収液のｐＨは、ｐＨ２〜１１であることが好ましい。さらには、ｐＨ５〜９であることが好ましい。また特にイオン強度と塩濃度は吸着核酸の溶出に効果を及ぼす。回収液は、２９０ｍｍｏｌ／Ｌ以下のイオン強度であることが好ましく、さらには、９０ｍｍｏｌ／Ｌ以下の塩濃度であることが好ましい。こうすることで、核酸の回収率が向上し、より多くの核酸を回収できることができる。しかしながら、本発明では、回収液として単に水（蒸留水、純水など）を用いることを妨げない。回収される核酸は１本鎖でもよく、２本鎖でも良い。   The pH of the recovery liquid is preferably pH 2-11. Furthermore, it is preferable that it is pH 5-9. In particular, ionic strength and salt concentration have an effect on the elution of adsorbed nucleic acids. The recovered liquid preferably has an ionic strength of 290 mmol / L or less, and more preferably has a salt concentration of 90 mmol / L or less. By doing so, the recovery rate of nucleic acids can be improved, and more nucleic acids can be recovered. However, in the present invention, it is not prohibited to simply use water (distilled water, pure water, etc.) as the recovered liquid. The recovered nucleic acid may be single-stranded or double-stranded.

回収液の体積を当初の核酸を含む試料溶液の体積と比較して少なくすることによって、濃縮された核酸を含む回収液を得ることができる。好ましくは、(回収液体積)：(試料溶液体積)＝１：１００〜９９：１００、更に好ましくは、(回収液体積)：(試料溶液体積)＝１：１０〜９：１０にすることができる。これにより核酸分離精製後工程において濃縮のための操作をすることなく、簡単に核酸を濃縮できる。これらの方法により検体よりも核酸が濃縮されている核酸溶液を得る方法を提供できる。   By reducing the volume of the recovery solution compared to the volume of the sample solution containing the original nucleic acid, a recovery solution containing concentrated nucleic acid can be obtained. Preferably, (collected liquid volume) :( sample solution volume) = 1: 100 to 99: 100, more preferably (collected liquid volume) :( sample solution volume) = 1: 10 to 9:10. it can. Thus, the nucleic acid can be easily concentrated without performing an operation for concentration in the step after the separation and purification of the nucleic acid. By these methods, it is possible to provide a method for obtaining a nucleic acid solution in which the nucleic acid is more concentrated than the specimen.

また別の方法としては、回収液の体積を当初の核酸を含む試料溶液よりも多い条件で核酸の脱着を行うことにより、希望の濃度の核酸を含む回収液を得ることができ、次工程（ＰＣＲなど）に適した濃度の核酸を含む回収液を得ることができる。好ましくは、(回収液体積)：(試料溶液体積)＝１：１〜５０：１、更に好ましくは、 (回収液体積)：(試料溶液体積)＝１：１〜５：１にすることができる。これにより核酸分離精製後に濃度調整をする煩雑さがなくなるというメリットを得られる。更に、十分量の回収液を使用することにより、多孔性膜からの核酸回収率の増加を図ることができる。   As another method, nucleic acid is desorbed under the condition that the volume of the recovery solution is larger than that of the sample solution containing the initial nucleic acid, thereby obtaining a recovery solution containing the nucleic acid of a desired concentration. A recovery solution containing nucleic acid at a concentration suitable for PCR and the like can be obtained. Preferably, (recovered liquid volume) :( sample solution volume) = 1: 1 to 50: 1, more preferably (recovered liquid volume) :( sample solution volume) = 1: 1 to 5: 1. it can. As a result, there is an advantage that there is no need to adjust the concentration after separation and purification of nucleic acid. Furthermore, by using a sufficient amount of the recovery liquid, it is possible to increase the nucleic acid recovery rate from the porous membrane.

また、目的に応じて回収液の温度を変化させることで簡便に核酸を回収することができる。例えば、回収液の温度を０〜１０℃にして多孔性膜からの核酸の脱着を行うことで、酵素による分解を防止する何らかの試薬や特別な操作を加えることなく核酸分解酵素の働きを抑制して、核酸の分解を防ぎ、簡便に、効率よく核酸溶液を得ることができる。   In addition, nucleic acids can be easily recovered by changing the temperature of the recovery solution according to the purpose. For example, by desorbing nucleic acids from the porous membrane at a temperature of the recovered solution of 0 to 10 ° C., the function of the nucleolytic enzyme is suppressed without adding any reagent or special operation to prevent degradation by the enzyme. Thus, nucleic acid solution can be easily and efficiently obtained by preventing nucleic acid degradation.

また、回収液の温度を１０〜３５℃とした場合、一般的な室温で核酸の回収を実施することが出来、複雑な工程を必要とせずに核酸を脱着させて分離精製することができる。   In addition, when the temperature of the recovered solution is 10 to 35 ° C., the nucleic acid can be recovered at a general room temperature, and the nucleic acid can be desorbed and separated and purified without requiring a complicated process.

また別の方法としては、回収液の温度を高温、例えば３５〜７０℃することで、多孔性膜からの核酸の脱着を煩雑な操作を経ず簡便に高い回収率で実施することができる。   As another method, the temperature of the recovery liquid is set to a high temperature, for example, 35 to 70 ° C., so that desorption of nucleic acids from the porous membrane can be easily performed at a high recovery rate without complicated operations.

回収液の注入回数は限定されるものではなく、１回でも複数回でもよい。通常、迅速、簡便に核酸を分離精製する場合は、１回の回収で実施するが、大量の核酸を回収する場合等複数回にわたり回収液を注入する事がある。   The number of injections of the recovery liquid is not limited and may be one time or multiple times. Usually, when the nucleic acid is separated and purified quickly and easily, it is carried out by one collection, but the collection liquid may be injected several times, such as when collecting a large amount of nucleic acid.

回収工程においては、核酸の回収液をその後の後工程に使用できる組成にしておくことが可能である。分離精製された核酸は、しばしばＰＣＲ(ポリメラ−ゼチェインリアクション)法により増幅される。この場合、分離精製された核酸溶液はＰＣＲ法に適したバッファ−液で希釈する必要がある。本方法による回収工程において、回収液にＰＣＲ法に適したバッファ−液を用いることで、その後のＰＣＲ工程へ簡便、迅速に移行することができる。   In the recovery step, the nucleic acid recovery solution can be made into a composition that can be used in the subsequent subsequent steps. The separated and purified nucleic acid is often amplified by a PCR (polymerase chain reaction) method. In this case, the separated and purified nucleic acid solution needs to be diluted with a buffer solution suitable for the PCR method. In the recovery step according to this method, a buffer solution suitable for the PCR method is used as the recovery solution, so that the subsequent PCR step can be easily and rapidly transferred.

また、回収工程において、核酸の回収液に回収した核酸の分解を防ぐための安定化剤を添加しておくことも可能である。安定化剤としては、抗菌剤、抗カヒ゛剤や核酸分解抑制剤などを添加することができる。核酸分解酵素の阻害剤としてはＥＤＴＡなどが上げられる。また別の実施態様として、回収容器にあらかじめ安定化剤を添加しておくこともできる。   In the recovery step, a stabilizer for preventing degradation of the recovered nucleic acid can be added to the nucleic acid recovery solution. As a stabilizer, an antibacterial agent, an anti-fouling agent, a nucleic acid degradation inhibitor and the like can be added. Examples of the nucleolytic enzyme inhibitor include EDTA. As another embodiment, a stabilizer may be added to the collection container in advance.

また、回収工程で用いられる回収容器には特に限定はないが、２６０ｎｍの吸収が無い素材で作製された回収容器を用いることができる。この場合、回収した核酸溶液の濃度を、他の容器に移し替えずに測定できる。２６０nmに吸収のない素材は、例えば石英ガラス等が上げられるが，それに限定されるものではない。   The collection container used in the collection process is not particularly limited, but a collection container made of a material that does not absorb 260 nm can be used. In this case, the concentration of the recovered nucleic acid solution can be measured without transferring to another container. A material that does not absorb at 260 nm is, for example, quartz glass, but is not limited thereto.

[実施例１]
（１）核酸精製カートリッジの作製
内径７ｍｍ、核酸吸着性多孔膜を収容する部分を持つ核酸分離精製カートリッジ用容器をハイインパクトポリスチレンで作製した。
（２）核酸吸着性多孔膜として、トリアセチルセルロ−スの多孔膜（膜厚＝７０μｍ、平均孔径＝１．２μｍ）を鹸化処理した多孔膜（鹸化率２０％）を使用し、これを上記核酸分離精製カートリッジ用容器の核酸吸着性多孔膜を収容する部分に収容した。 [Example 1]
(1) Production of Nucleic Acid Purification Cartridge A nucleic acid separation and purification cartridge container having an inner diameter of 7 mm and a portion for accommodating a nucleic acid-adsorbing porous membrane was produced from high impact polystyrene.
(2) As a nucleic acid-adsorbing porous membrane, a porous membrane (saponification rate 20%) obtained by saponifying a porous membrane of triacetyl cellulose (film thickness = 70 μm, average pore size = 1.2 μm) is used. It accommodated in the part which accommodates the nucleic acid adsorptive porous membrane of the container for nucleic acid separation and purification cartridges.

（３）核酸可溶化試薬及び洗浄液の調製
表１に示す処方のＲＮＡ可溶化試薬溶液及び洗浄液を調製した。 (3) Preparation of Nucleic Acid Solubilizing Reagent and Washing Solution RNA solubilizing reagent solution and washing solution having the formulation shown in Table 1 were prepared.

（４）核酸分離精製操作
ガン化人骨髄細胞（ＨＬ６０）培養液から細胞中の核酸の分離精製操作を下記の手順で行なった。すなわち、この培養液２００μｌに核酸可溶化試薬溶液２００μｌとプロテアーゼＫ（ＳＩＧＭＡ製）溶液２０μｌを添加して６０℃で１０分間インキュベートした。インキュベートしたのち、エタノ−ル２００μｌを添加して攪拌し、攪拌後、この細胞培養試料を上記核酸吸着性多孔膜を備えた核酸分離精製カートリッジの一の開口に注入し、続いて上記一の開口に圧力発生装置（パワーピペット）を結合し、核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態にし、注入した該ＲＮＡを含む試料溶液を、上記核酸吸着性多孔膜に通過させることにより、上記核酸吸着性多孔膜に接触させ、核酸分離精製カートリッジの他の開口より排出する。続いて、上記核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に洗浄液を５００μＬ注入し、上記核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に圧力発生装置を結合し、核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態にし、注入した洗浄液を、上記核酸吸着性多孔膜に通過させ、他の開口より排出した。続いて、上記核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に回収液として水を２００μＬ注入し、上記核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に圧力発生装置を結合して、核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態にし、注入した回収液を、上記核酸吸着性多孔膜に通過させ、他の開口より排出し、この液を回収した。 (4) Nucleic Acid Separation / Purification Operation Separation / purification operation of nucleic acid in cells was performed from the culture solution of cancerous human bone marrow cells (HL60) by the following procedure. That is, 200 μl of a nucleic acid solubilizing reagent solution and 20 μl of protease K (manufactured by SIGMA) solution were added to 200 μl of this culture solution and incubated at 60 ° C. for 10 minutes. After the incubation, 200 μl of ethanol was added and stirred. After stirring, the cell culture sample was injected into one opening of the nucleic acid separation / purification cartridge equipped with the nucleic acid-adsorbing porous membrane, and then the one opening. A pressure generator (power pipette) is connected to the pressure sensor, the inside of the nucleic acid separation / purification cartridge is pressurized, and the sample solution containing the injected RNA is passed through the nucleic acid-adsorbing porous membrane. It is brought into contact with the membrane and discharged from the other opening of the nucleic acid separation and purification cartridge. Subsequently, 500 μL of the washing solution is injected into the one opening of the nucleic acid separation and purification cartridge, a pressure generator is connected to the one opening of the nucleic acid separation and purification cartridge, and the inside of the nucleic acid separation and purification cartridge is pressurized and injected. The washed liquid was passed through the nucleic acid-adsorptive porous membrane and discharged from another opening. Subsequently, 200 μL of water as a recovery solution is injected into the one opening of the nucleic acid separation and purification cartridge, and a pressure generator is connected to the one opening of the nucleic acid separation and purification cartridge to pressurize the inside of the nucleic acid separation and purification cartridge. The collected recovery liquid was put into a state and allowed to pass through the nucleic acid-adsorptive porous membrane, discharged from the other openings, and this liquid was recovered.

（５）実験結果
回収液を用いてアガロ−スゲル電気泳動を行った。その結果を図１に示す。図１は、実施例で回収された核酸試料とサイズマーカーλＨＩＮＤIIIを電気泳動して得られた図である（条件：ライフテクノロジー製、１質量％アガロース、１００V,３０分）。分子量の差異によって泳動分離したフラグメントは臭化エチルによって染色され、紫外線光で撮影されて泳動図が得られた。図１の結果からわかるように、部分鹸化アセチルセルロ−スからなる核酸吸着性多孔膜を備えた核酸分離精製カートリッジと、表１記載のイオン強度が調整された洗浄液と、加圧装置を用いて、核酸を回収効率よく分離精製できる。 (5) Experimental results Agarose gel electrophoresis was performed using the collected liquid. The result is shown in FIG. FIG. 1 is a diagram obtained by electrophoresis of a nucleic acid sample collected in Example and a size marker λHINDIII (condition: manufactured by Life Technologies, 1 mass% agarose, 100 V, 30 minutes). Fragments separated by electrophoresis due to the difference in molecular weight were stained with ethyl bromide and photographed with ultraviolet light to obtain an electrophoretogram. As can be seen from the results in FIG. 1, a nucleic acid separation / purification cartridge provided with a nucleic acid-adsorbing porous membrane made of partially saponified acetylcellulose, a cleaning solution with adjusted ionic strength as shown in Table 1, and a pressurizing device were used. The nucleic acid can be separated and purified efficiently.

また、実施例1で得られた核酸の精製度を２６０ｎｍと２８０ｎｍの分光吸光度の比（A260/A280と記す）で示す。   Further, the degree of purification of the nucleic acid obtained in Example 1 is shown by the ratio of spectral absorbance at 260 nm and 280 nm (denoted as A260 / A280).

（表２）
A260/A280
実施例1 1.826

表に示された核酸の精製度は、きわめて高いものであり、約５分の簡易な操作と装置とによって高純度核酸試料を得ることができた。 (Table 2)
A260 / A280
Example 1 1.826

The purity of the nucleic acids shown in the table was extremely high, and a high-purity nucleic acid sample could be obtained with a simple operation and apparatus of about 5 minutes.

［実施例２〜７、比較例１〜４］
以下の実施例２〜７、比較例１〜４においては、実施例１に使用した洗浄液 の処方中のＮａＣｌを表３のように変更し、これらの洗浄液を使用した以外は 、実施例１と全く同じ操作を行なった。 [Examples 2-7, Comparative Examples 1-4]
In the following Examples 2 to 7 and Comparative Examples 1 to 4, the NaCl in the formulation of the cleaning liquid used in Example 1 was changed as shown in Table 3 except that these cleaning liquids were used. The exact same operation was performed.

実施例１と同じ方法で評価した核酸の分離精製結果は、実施例２〜６は、実質的に同等でかつ実施例１の結果とも同等の純度であった。
一方、比較例１及び比較例２〜４では、純度の低下が認められ、特にイオン強度が高い比較例２では分離精製が不十分であった。
したがって、本発明の方法では、簡易かつ迅速に核酸の精製を可能とするために、洗浄液のイオン強度が５〜５００ｍｍｏｌ／Ｋｇであることが好ましく、この範囲よりイオン強度が高くても低くても核酸の精製度はおとることが判った。 The results of separation and purification of nucleic acids evaluated by the same method as in Example 1 were substantially the same in Examples 2 to 6 and the same purity as the result in Example 1.
On the other hand, in Comparative Example 1 and Comparative Examples 2 to 4, a decrease in purity was observed, and in Comparative Example 2 having particularly high ionic strength, separation and purification were insufficient.
Therefore, in the method of the present invention, the ionic strength of the washing solution is preferably 5 to 500 mmol / Kg in order to enable simple and rapid purification of the nucleic acid, and the ionic strength is higher or lower than this range. It was found that the nucleic acid was purified.

実施例で回収された核酸試料とサイズマーカーλＨＩＮＤIIIを電気泳動して得られた図である。It is the figure obtained by electrophoresis of the nucleic acid sample collect | recovered in the Example and size marker (lambda) HINDIII.

Claims (14)

(1)核酸を含む試料溶液を核酸吸着性多孔性膜に通過させて、該多孔性膜内に核酸を吸着させる工程、
(2) 洗浄液を該核酸吸着性多孔性膜に通過させて、核酸が吸着した状態で該核酸吸着性多孔性膜を洗浄する工程、及び
(3)回収液を、該核酸吸着性多孔性膜に通過させて、該多孔性膜内から核酸を脱着させる工程
を含有する核酸の分離精製方法において、該核酸吸着性多孔性膜がイオン結合が実質的に関与しない相互作用で核酸が吸着する多孔性膜であり、且つ、該洗浄液のイオン強度は５〜５００ｍｍｏｌ／Ｋｇであることを特徴とする核酸の分離精製方法。 (1) passing a sample solution containing nucleic acid through a nucleic acid-adsorbing porous membrane and adsorbing the nucleic acid in the porous membrane;
(2) passing a washing solution through the nucleic acid-adsorptive porous membrane to wash the nucleic acid-adsorptive porous membrane with the nucleic acid adsorbed thereon; and
(3) In the method for separating and purifying nucleic acid, comprising the step of passing the recovered liquid through the nucleic acid-adsorbing porous membrane and desorbing the nucleic acid from the porous membrane, the nucleic acid-adsorbing porous membrane is ion-bonded A method for separating and purifying nucleic acid, wherein the nucleic acid is adsorbed by an interaction that is substantially not involved, and the ionic strength of the washing liquid is 5 to 500 mmol / Kg. 上記(1)、(2)及び(3)の各工程において、核酸を含む試料溶液、洗浄液又は回収液を、加圧状態で核酸吸着性多孔性膜に通過させることを特徴とする請求項１記載の核酸の分離精製方法。   2. In each of the steps (1), (2) and (3), a sample solution, a washing solution or a recovery solution containing a nucleic acid is passed through a nucleic acid-adsorbing porous membrane under pressure. The method for separating and purifying the nucleic acid as described. 上記(1)、(2)及び(3)の各工程において、少なくとも二個の開口を有する容器内に該核酸吸着性多孔性膜を収容した核酸分離精製カートリッジの一の開口に、核酸を含む試料溶液、洗浄液又は回収液を注入し、カートリッジの上記一の開口に結合された圧力差発生装置を用いてカートリッジ内を加圧状態にして、該注入した各液を通過させ、他の開口より排出させることを特徴とする請求項１記載の核酸の分離精製方法。   In each of the above steps (1), (2) and (3), the nucleic acid is contained in one opening of the nucleic acid separation / purification cartridge containing the nucleic acid-adsorbing porous membrane in a container having at least two openings. A sample solution, a cleaning solution or a recovery solution is injected, and the inside of the cartridge is pressurized using a pressure difference generating device coupled to the one opening of the cartridge, and each injected solution is allowed to pass through the other opening. The method for separating and purifying nucleic acid according to claim 1, wherein the nucleic acid is discharged. 核酸が吸着した核酸吸着性多孔性膜に洗浄液を通過させて、該核酸吸着性多孔性膜を洗浄する回数が１回であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の核酸の分離精製方法。   The nucleic acid according to any one of claims 1 to 3, wherein the washing solution is passed through the nucleic acid-adsorbing porous membrane to which the nucleic acid has been adsorbed to wash the nucleic acid-adsorbing porous membrane once. Separation and purification method. 該洗浄工程が、核酸を含む試料溶液を注入した一の開口と同一の開口より洗浄液を注入して洗浄が行なわれる洗浄工程であることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の核酸の分離精製方法。   5. The cleaning process according to claim 1, wherein the cleaning process is a cleaning process in which a cleaning liquid is injected from the same opening as the one opening into which the sample solution containing the nucleic acid is injected. A method for separating and purifying nucleic acids. 該洗浄工程が、核酸を含む試料溶液を注入した一の開口と同一の開口より洗浄液を排出して洗浄が行なわれる洗浄工程であることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の核酸の分離精製方法。   5. The cleaning step according to claim 1, wherein the cleaning step is a cleaning step in which the cleaning liquid is discharged from the same opening as the one opening into which the sample solution containing nucleic acid is injected. A method for separating and purifying nucleic acids. 該洗浄工程と回収工程の間に、核酸を吸着した多孔性膜を乾燥させる工程を含まないことを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の核酸の分離精製方法。   The method for separating and purifying nucleic acid according to any one of claims 1 to 6, wherein a step of drying the porous membrane adsorbed with nucleic acid is not included between the washing step and the recovery step. 上記洗浄液が、タンパク質及びタンパク質由来の夾雑物質を分解する酵素を含む洗浄液であることを特徴とする請求項１該洗浄工程が、核酸を含む試料溶液を注入した一の開口と同一の開口より洗浄液を注入して洗浄が行なわれる洗浄工程であることを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載の核酸の分離精製方法。   2. The cleaning liquid according to claim 1, wherein the cleaning liquid is a cleaning liquid containing an enzyme that decomposes protein and a protein-derived contaminant. The method for separating and purifying nucleic acid according to any one of claims 1 to 7, wherein the method is a washing step in which washing is performed by injecting. 上記洗浄液が、核酸分解酵素を含む洗浄液であることを特徴とする請求項１〜８のいずれかに記載の核酸の分離精製方法。   The method for separating and purifying nucleic acid according to any one of claims 1 to 8, wherein the washing solution is a washing solution containing a nucleolytic enzyme. 上記洗浄液が、ＤＮＡ分解酵素を含むことを特徴とする請求項９に記載の核酸の分離精製方法。   The method for separating and purifying nucleic acid according to claim 9, wherein the washing solution contains a DNA degrading enzyme. 上記洗浄液が、ＲＮＡ分解酵素を含むことを特徴とする請求項９に記載の核酸の分離精製方法。   The method for separating and purifying nucleic acid according to claim 9, wherein the washing solution contains an RNase. 核酸吸着性多孔性膜が、水酸基を有する有機高分子材料の多孔性膜であることを特徴とする請求項１〜１１のいずれかに記載の核酸の分離精製方法。   The method for separating and purifying nucleic acid according to any one of claims 1 to 11, wherein the nucleic acid-adsorbing porous membrane is a porous membrane of an organic polymer material having a hydroxyl group. 核酸吸着性多孔性膜が、多糖構造を有する多孔性膜であることを特徴とする請求項１２に記載の核酸の分離精製方法。   The method for separating and purifying nucleic acid according to claim 12, wherein the nucleic acid-adsorbing porous membrane is a porous membrane having a polysaccharide structure. 核酸吸着性多孔性膜が、再生セルロースの多孔性膜であることを特徴とする請求項１２又は１３に記載の核酸の分離精製方法。   The method for separating and purifying nucleic acid according to claim 12 or 13, wherein the nucleic acid-adsorbing porous membrane is a porous membrane of regenerated cellulose.
JP2003378573A 2003-11-07 2003-11-07 Method for separating and purifying nucleic acid Pending JP2005137297A (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2003378573A JP2005137297A (en) 2003-11-07 2003-11-07 Method for separating and purifying nucleic acid

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2003378573A JP2005137297A (en) 2003-11-07 2003-11-07 Method for separating and purifying nucleic acid

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2005137297A true JP2005137297A (en) 2005-06-02

Family

ID=34688918

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2003378573A Pending JP2005137297A (en) 2003-11-07 2003-11-07 Method for separating and purifying nucleic acid

Country Status (1)

Country Link
JP (1) JP2005137297A (en)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP4956727B2 (en) RNA separation and purification method
JP4810164B2 (en) Nucleic acid separation and purification method
JP2005154416A (en) Method for separating and purifying nucleic acid, cartridge for separating and purifying nucleic acid and kit for separating and purifying nucleic acid
JP4568614B2 (en) Nucleic acid separation and purification method
JP2008220380A (en) Method of isolating and purifying nucleic acid
JP2006238854A (en) Method for isolating and refining nucleic acid
JP2005154299A (en) Method for separating and purifying nucleic acid
JP2005151977A (en) Method for isolating and purifying nucleic acid
JP2006271201A (en) Method for selectively separating and purifying rna
JP4825528B2 (en) Nucleic acid separation and purification method
JP2005137297A (en) Method for separating and purifying nucleic acid
JP4284250B2 (en) Nucleic acid separation and purification method
JP2005137298A (en) Method for separating and purifying nucleic acid
JP2005168449A (en) Method for separation and purification of nucleic acid and cartridge and waste liquid container therefor
JP2005118019A (en) Method for separating and purifying nucleic acid
JP2005118020A (en) Method for separation and purification of nucleic acid
JP2005168450A (en) Method for separation and purification of nucleic acid
JP2005162659A (en) Method for separating and purifying nucleic acid
JP2005176678A (en) Method for separating and purifying nucleic acid
US20070175826A1 (en) Method for separating and purifying nucleic acid
JP2005176716A (en) Method for separating and purifying nucleic acid
JP2005118018A (en) Method for separating and purifying nucleic acid
JP2005185161A (en) Method for separating and purifying nucleic acid
JP2005143417A (en) Method for separating and refining nucleic acid
JP4825527B2 (en) Nucleic acid separation and purification method

Legal Events

Date Code Title Description
RD04 Notification of resignation of power of attorney

Effective date: 20060327

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424