JP2005110565A - Agent for keeping differentiation/pluripotency - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は細胞の分化多能性維持剤に関するものである。具体的には、胚性幹細胞や体性幹細胞の分化多能性を維持する剤を提供するものである。 The present invention relates to an agent for maintaining pluripotency of cells. Specifically, the present invention provides an agent that maintains the pluripotency of embryonic stem cells or somatic stem cells.
胚性幹（ＥＳ）細胞や体性幹細胞などの幹細胞は神経疾患、糖尿病、白血病などに対する移植療法の資源として期待されている。ES細胞は受精卵（胚盤胞）の内部細胞塊に由来し、分化多能性を有することから特に価値が高い。マウスＥＳ細胞は白血病阻害因子（LIF）により分化多能性を維持することができる。しかしヒトおよびサルのES細胞はLIF存在下でも、分化多能性を完全に維持しつつ増殖させることが難しい。LIFにかわるES細胞分化多能性維持物質が望まれている。一方体性幹細胞は受精卵を利用しないためES細胞のような倫理的問題が無いという長所を持つ。しかし体性幹細胞はES細胞に比して増殖が悪く、十分な細胞数を得ることが難しい。 Stem cells such as embryonic stem (ES) cells and somatic stem cells are expected as resources for transplantation therapy for neurological diseases, diabetes, leukemia and the like. ES cells are particularly valuable because they are derived from the inner cell mass of fertilized eggs (blastocysts) and have pluripotency. Mouse ES cells can maintain pluripotency by leukemia inhibitory factor (LIF). However, human and monkey ES cells are difficult to proliferate while maintaining full pluripotency even in the presence of LIF. An ES cell differentiation pluripotency maintenance substance that replaces LIF is desired. On the other hand, somatic stem cells do not use fertilized eggs, and thus have the advantage of not having ethical problems like ES cells. However, somatic stem cells do not proliferate better than ES cells, and it is difficult to obtain a sufficient number of cells.
本発明者は、ＥＳ細胞で特異的に発現する遺伝子群ECAT（ES cell associated transcript）を同定し、その機能を解析してきた（特許文献１）。これまでにECAT4（Nanog）はホメオボックス転写因子でありES細胞で過剰に発現させるとLIF非依存的に分化多能性を維持できることを明らかにしている（非特許文献１）。
本発明は、可逆的な分化多能性維持剤、特に胚性幹（ＥＳ）細胞や体性幹細胞の可逆的な分化多能性維持剤を提供することを目的とする。
ＥＳ細胞や体性幹細胞を分化多能性を維持しながら培養することは困難である。多能性維持に関連する遺伝子の遺伝子導入はリポフェクション法やレトロウイルスベクター法などの公知の方法により達成できるが、(i)高い導入効率を得ることが難しく、(ii)導入された遺伝子は染色体に取り込まれるが染色体のどこに組み込まれるか不明で、不可逆的であり癌化するリスクも高く、(iii)遺伝子導入により不可逆的に分化多能性を維持させると、その後に分化させて応用することが困難である。そのため、臨床応用等を考えると遺伝子導入法は現実的ではない。
そのため、本発明は、遺伝子導入によらない臨床応用可能な分化多能性維持剤を提供することを目的とする。
An object of the present invention is to provide a reversible differentiation pluripotency maintenance agent, particularly a reversible differentiation pluripotency maintenance agent for embryonic stem (ES) cells or somatic stem cells.
It is difficult to culture ES cells and somatic stem cells while maintaining pluripotency. Gene transfer of genes related to maintaining pluripotency can be achieved by known methods such as lipofection and retroviral vector methods, but (i) it is difficult to obtain high transfer efficiency, and (ii) the transferred gene is a chromosome. It is unclear where it is integrated into the chromosome, but it is irreversible and has a high risk of becoming cancerous. (Iii) If irreversibly maintaining pluripotency by gene transfer, then differentiate it and apply it Is difficult. Therefore, gene transfer methods are not realistic considering clinical applications.
Therefore, an object of the present invention is to provide a differentiation pluripotency maintenance agent that can be applied clinically without using gene transfer.
本発明者は、上記の問題点を解決すべく鋭意検討し、Nanog（ECAT4）タンパク質にTATペプチドを組み合わせた融合タンパク質を培地に添加することによって、融合タンパク質がRF8ES細胞に取り込まれ、LIFなしでも分化多能性を維持しつつ増殖することを見出した。更に、培地から融合蛋白質を除去すると、細胞は分化することも確認した。細胞内に取り込まれた蛋白質が分解されて反応は停止するため、本発明による細胞の分化多能性維持は可逆的である。
本発明は、以上のように、Nanogタンパク質を細胞に取り込ませることによって未分化能を保ったまま胚性幹細胞や体性幹細胞を簡便に培養することができ、細胞の分化多能性の維持を可逆的に調整させることができるという新たな知見に基づき完成するに至ったものである。
The present inventor has intensively studied to solve the above problems, and by adding a fusion protein in which a TAT peptide is combined with a Nanog (ECAT4) protein to the medium, the fusion protein is incorporated into RF8ES cells, and even without LIF. It was found that it proliferates while maintaining pluripotency. Furthermore, it was confirmed that when the fusion protein was removed from the medium, the cells differentiated. Since the protein taken up into the cell is degraded and the reaction is stopped, the maintenance of pluripotency of the cell according to the present invention is reversible.
As described above, the present invention can easily cultivate embryonic stem cells and somatic stem cells while maintaining the undifferentiated ability by incorporating the Nanog protein into the cells, and maintains the differentiation pluripotency of the cells. It has been completed based on the new knowledge that it can be reversibly adjusted.
即ち本発明の要旨は、以下のとおりである。
〔１〕タンパク質導入ドメインおよびNanogタンパク質を含んでいることを特徴とする融合タンパク質、
〔２〕Nanogタンパク質がヒト、マウスまたはサル由来のものである、上記〔１〕記載の融合タンパク質、
〔３〕タンパク質導入ドメインが、HIV TAT、アンテナペデイア・ホメオドメイン（Antonnapedia homeodomain）、HSV VP22またはそれらのフラグメントである、上記〔１〕または〔２〕記載の融合タンパク質、
〔４〕タンパク質導入ドメインが、線維芽細胞増殖因子（FGF）、肝細胞増殖因子（HGF）またはそれらのフラグメントである、上記〔１〕または〔２〕記載の融合タンパク質、
〔５〕上記〔１〕〜〔４〕いずれか記載の融合タンパク質をコードする塩基配列を含有するＤＮＡ、
〔６〕上記〔５〕記載のＤＮＡを含有する発現ベクター、
〔７〕上記〔６〕記載の発現ベクターを含有する細胞、
〔８〕上記〔７〕記載の細胞を、融合タンパク質の発現可能な条件下で培養することを特徴とする、上記〔１〕〜〔４〕いずれか記載の融合タンパク質の製造方法、
〔９〕ビスフォスフォネート化合物、グルコース−６−リン酸、またはP糖タンパク質に結合活性を持つ化合物とNanogタンパク質との化学的結合体、
〔１０〕上記〔１〕〜〔４〕いずれか記載の融合タンパク質または上記〔９〕記載の化学的結合体を有効成分として含有する分化多能性維持剤、
〔１１〕細胞が胚性幹細胞または体性幹細胞である、上記〔１０〕記載の分化多能性維持剤、
〔１２〕上記〔１〕〜〔４〕いずれか記載の融合タンパク質または上記〔９〕記載の結合体と細胞とを接触させる工程を含む、分化多能性維持方法、
〔１３〕細胞が胚性幹細胞または体性幹細胞である、上記〔１２〕記載の分化多能性維持方法、
〔１４〕ピノサイトーシスで上記〔１〕〜〔４〕いずれか記載の融合タンパク質または上記〔９〕記載の化学的結合体を細胞内に取り込ませる工程を含む、上記〔１２〕または〔１３〕記載の分化多能性維持方法、
〔１５〕上記〔１〕〜〔４〕いずれか記載の融合タンパク質または上記〔９〕の化学的結合体を含有する細胞。
That is, the gist of the present invention is as follows.
[1] A fusion protein comprising a protein transduction domain and a Nanog protein,
[2] The fusion protein according to [1] above, wherein the Nanog protein is derived from human, mouse or monkey,
[3] The fusion protein according to [1] or [2] above, wherein the protein transduction domain is HIV TAT, antenna pediatric homeodomain, HSV VP22 or a fragment thereof,
[4] The fusion protein according to [1] or [2] above, wherein the protein transduction domain is fibroblast growth factor (FGF), hepatocyte growth factor (HGF) or a fragment thereof,
[5] DNA containing a base sequence encoding the fusion protein according to any one of [1] to [4] above,
[6] An expression vector containing the DNA of [5] above,
[7] A cell containing the expression vector according to [6] above,
[8] The method for producing a fusion protein according to any one of [1] to [4] above, wherein the cell according to [7] is cultured under conditions capable of expressing the fusion protein,
[9] A chemical conjugate of Nanog protein and a compound having binding activity to a bisphosphonate compound, glucose-6-phosphate, or P-glycoprotein,
[10] A pluripotency maintenance agent containing the fusion protein according to any one of [1] to [4] or the chemical conjugate according to [9] as an active ingredient,
[11] The pluripotency maintenance agent according to [10] above, wherein the cell is an embryonic stem cell or a somatic stem cell,
[12] A method for maintaining pluripotency, comprising the step of contacting a cell with the fusion protein according to any one of [1] to [4] above or the conjugate according to [9] above,
[13] The method for maintaining pluripotency according to [12] above, wherein the cell is an embryonic stem cell or a somatic stem cell,
[14] The above [12] or [13], comprising the step of incorporating the fusion protein according to any one of [1] to [4] above or the chemical conjugate according to [9] above into cells by pinocytosis. The method for maintaining pluripotency as described,
[15] A cell containing the fusion protein according to any one of [1] to [4] or the chemical conjugate of [9] above.
本発明により、細胞、特に胚性幹細胞や体性幹細胞の分化多能性を簡便に維持することができる。本発明による分化多能性維持剤は、分化多能性を維持したまま培養することが困難な胚性幹細胞や体性幹細胞などに用いることができ、且つ可逆的に分化多能性を調整することができるため、遺伝子導入法に比べてより臨床応用が可能である。 According to the present invention, the differentiation pluripotency of cells, particularly embryonic stem cells and somatic stem cells, can be easily maintained. The agent for maintaining pluripotency according to the present invention can be used for embryonic stem cells or somatic stem cells that are difficult to culture while maintaining pluripotency, and reversibly adjusts pluripotency. Therefore, clinical application is possible compared with the gene transfer method.
本発明の「融合タンパク質」とは、タンパク質導入ドメインとNanogタンパク質を含んでいる融合タンパク質であり、細胞に取り込まれることにより細胞の分化多能性を維持するものであればよい。この融合タンパク質を細胞に取り込ませることにより、細胞、特に胚性幹細胞や体性幹細胞を、分化多能性を維持したまま培養することが可能となり、これら細胞の生産の効率性と経済性の向上が期待できる。
融合蛋白の２つのドメインの融合は、いずれの可能な位置でもよく、タンパク質導入ドメインがNanogタンパク質のＮ末端またはＣ末端に融合してもよく、あるいはNanogタンパク質の活性部位に融合してもよいが、好ましくは、タンパク質導入ドメインはNanogタンパク質のＮ末端に融合する。
タンパク質導入ドメインは、直接的な化学結合により、あるいはリンカー分子を介して、Nanogタンパク質に融合してもよい。かかる場合、リンカー分子は、２つのドメインを連結させることのできるいずれの２価の化学構造物であってもよい。本発明の好ましいリンカー分子は短いペプチド、例えば、１〜２０個のアミノ酸残基、好ましくは１〜１０個のアミノ酸残基を有するものである。
The “fusion protein” of the present invention is a fusion protein containing a protein transduction domain and a Nanog protein, and may be any one that maintains the differentiation pluripotency of a cell by being taken into the cell. By incorporating this fusion protein into cells, it becomes possible to culture cells, especially embryonic stem cells and somatic stem cells, while maintaining differentiation pluripotency, and improving the production efficiency and economy of these cells. Can be expected.
The fusion of the two domains of the fusion protein may be at any possible position, and the protein transduction domain may be fused to the N-terminus or C-terminus of the Nanog protein, or it may be fused to the active site of the Nanog protein. Preferably, the protein transduction domain is fused to the N-terminus of the Nanog protein.
The protein transduction domain may be fused to the Nanog protein by direct chemical bonding or via a linker molecule. In such a case, the linker molecule may be any divalent chemical structure capable of linking two domains. Preferred linker molecules of the invention are short peptides, such as those having 1-20 amino acid residues, preferably 1-10 amino acid residues.
本明細書において「分化多能性」とは、ES細胞が未分化状態のまま増殖し、且つマウス初期胚に移植することにより生殖系を含む全ての細胞へと分化可能であること、更に適切な誘導によりin vitroにおいても各種細胞へと分化可能であることをいう。
本明細書において「タンパク質」には、特定のアミノ酸配列（配列番号：２，４または６）で示されるタンパク質だけでなく、これらと生物学的機能が同等であることを限度として、その同族体（ホモログやスプライスバリアント）、変異体、誘導体などが包含される。ここでホモログとしては、ヒトのタンパク質に対応するマウスやラットなど他生物種のタンパク質が例示でき、これらはHomoloGene（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/HomoloGene/）により同定された遺伝子の塩基配列から演繹的に同定することができる。また変異体には、天然に存在するアレル変異体、天然に存在しない変異体、及び人為的に欠失、置換、付加および挿入されることによって改変されたアミノ酸配列を有する変異体が包含される。なお、上記変異体としては、変異のないタンパク質と、少なくとも70％、好ましくは80％、より好ましくは95％、さらにより好ましくは97％相同なものを挙げることができる。
As used herein, “pluripotency” means that ES cells proliferate in an undifferentiated state and can be differentiated into all cells including the reproductive system by transplanting to early mouse embryos. It can be differentiated into various cells even in vitro by simple induction.
As used herein, the term “protein” includes not only a protein represented by a specific amino acid sequence (SEQ ID NO: 2, 4 or 6), but also homologues thereof as long as their biological functions are equivalent. (Homologs and splice variants), mutants, derivatives and the like are included. Here, examples of homologs include proteins of other species such as mice and rats corresponding to human proteins, and these were identified by HomoloGene (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/HomoloGene/) It can be identified a priori from the base sequence of the gene. Variants also include naturally occurring allelic variants, non-naturally occurring variants, and variants having amino acid sequences modified by artificial deletions, substitutions, additions and insertions. . Examples of the mutant include those that are at least 70%, preferably 80%, more preferably 95%, and still more preferably 97% homologous to a protein having no mutation.
従って、本明細書において「Nanogタンパク質」は、特に言及しない限り、特定アミノ酸配列（配列番号２，４または６）で示されるNanogタンパク質やその同族体、変異体、誘導体などを包含する趣旨で用いられる。具体的には、配列番号:２に記載のアミノ酸配列を有するマウスNanog、配列番号：４に記載のアミノ酸配列を有するヒトNanog、配列番号:６に記載のアミノ酸配列を有するサルNanog、およびラットホモログなどが包含される。ここで配列番号２に示すタンパク質は、マウス由来のNanog遺伝子によってコードされるタンパク質である。配列番号４に示すタンパク質は、ヒト由来のNanog遺伝子によってコードされるタンパク質である。配列番号６に示すタンパク質は、サル由来のNanog遺伝子によってコードされるタンパク質である。 Accordingly, in the present specification, “Nanog protein” is used to encompass the Nanog protein represented by the specific amino acid sequence (SEQ ID NO: 2, 4 or 6), its homologues, mutants, derivatives and the like, unless otherwise specified. It is done. Specifically, mouse Nanog having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2, human Nanog having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4, monkey Nanog having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 6, and rat homolog Etc. are included. Here, the protein shown in SEQ ID NO: 2 is a protein encoded by a mouse-derived Nanog gene. The protein shown in SEQ ID NO: 4 is a protein encoded by a human-derived Nanog gene. The protein shown in SEQ ID NO: 6 is a protein encoded by the monkey-derived Nanog gene.
Nanogタンパク質には、配列番号２，４または６に示す各アミノ酸配列を有するタンパク質のみならず、その相同物も包含される。該相同物としては、上記各アミノ酸配列において、1もしくは複数(通常数個)のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、且つもとの各アミノ酸配列のNanogタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質を挙げることができる。
ここで実質的に同質の活性とは、該タンパク質を発現させた細胞、または該タンパク質を取り込んだ細胞が分化多能性を維持するという性質を示す。具体的には、例えば、マウスES細胞であれば、LIFなしでも該タンパク質を発現させた細胞または該タンパク質を取り込んだ細胞の分化多能性が維持されるという性質を示す。このようなNanogタンパク質の性質は、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法により容易に測定することができる。例えば、細胞をマウス初期胚に移植することによりキメラマウスを作ることができるか、細胞をヌードマウスに移植すると各種細胞を含む奇形腫を形成するか、細胞をin vitroで分化誘導すると各種細胞に分化することができるか等を調べることにより、分化多能性を測定することができる。
The Nanog protein includes not only a protein having each amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, 4 or 6, but also homologues thereof. The homologue consists of an amino acid sequence in which one or more (usually several) amino acids are deleted, substituted or added in each of the amino acid sequences described above, and substantially the same as the Nanog protein of each original amino acid sequence. Mention may be made of proteins having the same quality of activity.
Here, the substantially homogeneous activity indicates a property that cells expressing the protein or cells incorporating the protein maintain differentiation pluripotency. Specifically, for example, mouse ES cells exhibit the property that the differentiation pluripotency of cells expressing the protein or cells incorporating the protein is maintained without LIF. Such properties of Nanog protein can be easily measured by a method known per se or a method analogous thereto. For example, chimeric mice can be made by transplanting cells into early mouse embryos, teratomas containing various cells can be formed when cells are transplanted into nude mice, or differentiation into cells can be induced by in vitro differentiation. The pluripotency can be measured by examining whether differentiation is possible.
なお、タンパク質におけるアミノ酸の変異数および変異部位は、その活性が保持される限り制限はない。活性を消失することなくアミノ酸残基が、どのように、何個置換、挿入あるいは欠失されればよいかを決定する指標は、当業者に周知のコンピュータプログラム、例えばDNA Star softwareを用いて見出すことができる。例えば変異数は、典型的には、全アミノ酸の10％以内であり、好ましくは全アミノ酸の5％以内であり、さらに好ましくは全アミノ酸の1％以内である。また置換されるアミノ酸は、置換後に得られるタンパク質がNanogタンパク質の活性を保持している限り、特に制限されない。この置換されるアミノ酸は、タンパク質の構造保持の観点から、アミノ酸の極性、電荷、可溶性、疎水性、親水性、両親媒性などにおいて置換前のアミノ酸と似た性質を有するアミノ酸であることが好ましい。例えば、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Met、PheおよびTrpは互いに非極性アミノ酸に分類されるアミノ酸であり、Gly、Ser、Thr、Cys、Tyr、AsnおよびGlnは互いに非荷電性アミノ酸に分類されるアミノ酸であり、AspおよびGluは互いに酸性アミノ酸に分類されるアミノ酸であり、またLys、ArgおよびHisは互いに塩基性アミノ酸に分類されるアミノ酸である。ゆえに、これらを指標として同群に属するアミノ酸を適宜選択することができる。
Nanogタンパク質は、天然物（例えばＥＳ細胞株）から自体公知のタンパク質の精製方法によって製造することもできるし、また後述するNanogタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有する形質転換体を培養することによっても製造することができる。
The number of amino acid mutations and mutation sites in the protein are not limited as long as the activity is maintained. Indicators that determine how many amino acid residues need to be substituted, inserted or deleted without loss of activity are found using computer programs well known to those skilled in the art, such as DNA Star software be able to. For example, the number of mutations is typically within 10% of all amino acids, preferably within 5% of all amino acids, and more preferably within 1% of all amino acids. The amino acid to be substituted is not particularly limited as long as the protein obtained after substitution retains the activity of Nanog protein. The amino acid to be substituted is preferably an amino acid having properties similar to the amino acid before substitution in terms of amino acid polarity, charge, solubility, hydrophobicity, hydrophilicity, amphiphilicity, etc. from the viewpoint of maintaining the structure of the protein. . For example, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Met, Phe and Trp are amino acids classified as nonpolar amino acids, and Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn and Gln are mutually uncharged amino acids. Asp and Glu are amino acids that are classified as acidic amino acids, and Lys, Arg, and His are amino acids that are classified as basic amino acids. Therefore, amino acids belonging to the same group can be appropriately selected using these as indices.
Nanog protein can be produced from a natural product (for example, ES cell line) by a known protein purification method, or by culturing a transformant containing a polynucleotide encoding Nanog protein described later. Can be manufactured.
本発明において「タンパク質導入ドメイン」とは、タンパク質を導入することができる、またはタンパク質導入を補助することのできるものであればよく、何ら限定されない。例えば、公知であるHIV TAT、アンテナペデイア・ホメオドメイン（Antonnapedia homeodomain）、HSV VP22またはそれらのフラグメント、cell penetrating peptides （CPP）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、またはそれらのフラグメント等を挙げることができる。
タンパク質導入ドメインにTAT、アンテナペデイア・ホメオドメイン（Antonnapedia homeodomain）、HSV VP22またはそれらのフラグメントを用いることによって、広範囲な細胞にERasを細胞内に取り込ませることができる。また、目的細胞において特異的に発現するレセプターと結合する物質をタンパク質導入ドメインとして用いることにより組織あるいは細胞特異的な取り込みが可能となるため、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）あるいはそれらのフラグメントなどをタンパク質導入ドメインとして用いることにより、対応するレセプターが発現した組織あるいは細胞特異的にERasを細胞内に取り込ませることができる。
In the present invention, the “protein introduction domain” is not particularly limited as long as it is capable of introducing a protein or assisting protein introduction. For example, the known HIV TAT, Antennapedia homeodomain, HSV VP22 or fragments thereof, cell penetrating peptides (CPP), fibroblast growth factor (FGF), hepatocyte growth factor (HGF), Or the fragment etc. can be mentioned.
By using TAT, an antenna pediatric homeodomain, HSV VP22, or a fragment thereof as a protein transduction domain, ERas can be incorporated into a wide range of cells. In addition, tissue or cell-specific uptake can be achieved by using a substance that binds to a receptor specifically expressed in the target cell as a protein transduction domain, so that fibroblast growth factor (FGF), hepatocyte growth factor ( By using HGF) or a fragment thereof as a protein transduction domain, ERas can be incorporated into cells in a tissue-specific or cell-specific manner in which the corresponding receptor is expressed.
「HIV TAT、アンテナペデイア・ホメオドメイン（Antonnapedia homeodomain）、HSV VP22」には、HIV由来のTAT（Green and Loewnstein, Cell, 56(6): 1179-88 (1988); Frankel and Pabo, Cell, 55(6): 1189-93 (1988)）、ショウジョウバエ由来のアンテナペディア蛋白（Vives et al., J. Biol. Chem, 272(25): 16010-7 (1997)）、HSV由来のVP22（Elliott and O'Hare, Cell, 88(2): 223-33 (1997)）のみならず、その機能が同等であることを限度として、その同族体（ホモログやスプライスバリアント）、変異体などが包含される。なお、変異体としては、変異のないタンパク質と、少なくとも70％、好ましくは80％、より好ましくは95％、さらにより好ましくは97％相同なものを挙げることができる。
「HIV TAT、アンテナペデイア・ホメオドメイン、HSV VP22のフラグメント」とは、前記のHIV TAT、アンテナペデイア・ホメオドメインおよびHSV VP22のいずれかのフラグメントであり、タンパク質導入機能またはタンパク質導入を補助する機能を有するものであり、且つ融合タンパク質が活性を示すことができるものであればよい。好ましくは、HIV TATのフラグメントを挙げることができる。フラグメントの長さはタンパク質導入またはタンパク質導入を補助する機能を有すれば何ら限定はされない。HIV TAT、アンテナペデイア・ホメオドメインおよびHSV VP22のフラグメントとしては、細胞膜を貫通する能力を有する蛋白トランスダクションドメイン（以下、「ＰＴＤ」という）が同定されており、本明細書のフラグメントにはこれらＰＴＤも包含される。異種蛋白とＰＴＤを融合することにより、培養細胞中にトランスデュースすることができることは公知であり、その作製方法も知られている（Fawell et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91(2): 664-8 (1994); Elliott and O'Hare (1997), Phelan et al., Nature Biotech. 16: 440-443 (1998)およびDilber et al., Gene Ther., 6(1): 12-21 (1999)、特許番号第2702285号）。また、HIV TAT蛋白由来の１１アミノ酸のＰＴＤに融合したβ−ガラクトシダーゼ蛋白が生きたマウスのすべての組織に浸潤してすべての単一細胞に到達できることも報告されている（Schwarze et al., Science, 285(5433): 1569-72 (1999)）。
HIV TATのフラグメントとしては、具体的には、前記の公知文献等に記載されているものを挙げることができるが、好ましくは特許番号第2702285号に記載のHIV TATフラグメントであり、更に好ましくは配列番号：１１で示されるHIV TATペプチドである。
"HIV TAT, Antonnapedia homeodomain, HSV VP22" includes HIV-derived TAT (Green and Loewnstein, Cell, 56 (6): 1179-88 (1988); Frankel and Pabo, Cell, 55 (6): 1189-93 (1988)), Drosophila-derived antennapedia protein (Vives et al., J. Biol. Chem, 272 (25): 16010-7 (1997)), HSV-derived VP22 (Elliott and O'Hare, Cell, 88 (2): 223-33 (1997)), as well as their homologues (homologs and splice variants), mutants, etc., as long as their functions are equivalent. The Examples of mutants include those that are at least 70%, preferably 80%, more preferably 95%, and still more preferably 97% homologous to a protein without mutation.
"HIV TAT, antenna pediae homeodomain, fragment of HSV VP22" is any fragment of HIV TAT, antenna pediae homeodomain and HSV VP22 mentioned above, and assists protein introduction function or protein introduction What is necessary is just to have a function and the fusion protein can show activity. Preferably, a fragment of HIV TAT can be mentioned. The length of the fragment is not limited in any way as long as it has a function of assisting protein introduction or protein introduction. Protein transduction domains (hereinafter referred to as “PTDs”) having the ability to penetrate the cell membrane have been identified as fragments of HIV TAT, antenna pedia homeodomain and HSV VP22. A PTD is also included. It is known that it can be transduced into cultured cells by fusing a heterologous protein and PTD, and its production method is also known (Fawell et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91). (2): 664-8 (1994); Elliott and O'Hare (1997), Phelan et al., Nature Biotech. 16: 440-443 (1998) and Dilber et al., Gene Ther., 6 (1) : 12-21 (1999), Patent No. 2702285). It has also been reported that β-galactosidase protein fused to 11 amino acid PTD derived from HIV TAT protein can invade all tissues of living mice and reach all single cells (Schwarze et al., Science , 285 (5433): 1569-72 (1999)).
Specific examples of the HIV TAT fragment include those described in the above-mentioned known literatures, preferably the HIV TAT fragment described in Patent No. 2702285, more preferably the sequence. It is the HIV TAT peptide shown by number: 11.
「線維芽細胞増殖因子（FGF）、肝細胞増殖因子（HGF）またはそれらのフラグメント」とは、公知のFGFタンパク質、公知のHGFタンパク質またはそれらのフラグメントであり、対応するレセプター発現細胞にタンパク質を導入する機能またはタンパク質導入を補助する機能を有するものであればよく、何ら限定されない。線維芽細胞増殖因子（FGF）のフラグメントとの結合体が細胞内に取り込まれることは公知である（Rojas, M. et al., Nat. Biotechnol., 16: 370-375 (1998)、Lin, Y. Z. et al., J. Biol. Chem. 270: 14255-14258(1995)）。従って、これらに報告されているFGFフラグメントをもちいるのが好ましい。 “Fibroblast growth factor (FGF), hepatocyte growth factor (HGF) or a fragment thereof” is a known FGF protein, a known HGF protein or a fragment thereof, and the protein is introduced into the corresponding receptor-expressing cell. Any function may be used as long as it has a function of assisting protein introduction or a function to assist protein introduction. It is known that a conjugate with a fragment of fibroblast growth factor (FGF) is taken up into cells (Rojas, M. et al., Nat. Biotechnol., 16: 370-375 (1998), Lin, YZ et al., J. Biol. Chem. 270: 14255-14258 (1995)). Therefore, it is preferable to use the FGF fragment reported in them.
本発明の融合タンパク質をコードする塩基配列を含有するDNAは、前記Nanogタンパク質をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドとタンパク質導入ドメインをコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有する。
本発明の融合タンパク質をコードする塩基配列を含有するDNAは、種々の細胞や組織、例えばＥＳ細胞由来のcDNA、ゲノムDNA、または合成DNAのいずれであっても、組み合わせであっても良い。具体的には、例えば
(a)配列番号：２記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドと配列番号：１１記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含有するDNA、
(b)配列番号：４記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドと配列番号：１１記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含有するDNA、
(c)配列番号：６記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドと配列番号：１１記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含有するDNA、
(d)配列番号：１記載の塩基配列と配列番号：９または１０記載の塩基配列を含有するDNA、
(e)配列番号：３記載の塩基配列と配列番号：９または１０記載の塩基配列を含有するDNA、
(f)配列番号：５記載の塩基配列と配列番号：９または１０記載の塩基配列を含有するDNA、
(g)配列番号：１記載の塩基配列の第190番目のヌクレオチドから第1104番目のヌクレオチドで示される塩基配列と配列番号：９または１０記載の塩基配列を含有するDNA、
(h)配列番号：３記載の塩基配列の第217番目のヌクレオチドから第1131番目のヌクレオチドで示される塩基配列と配列番号：９または１０記載の塩基配列を含有するDNA、
(i)配列番号：５記載の塩基配列の第894番目のヌクレオチドから第1691番目のヌクレオチドで示される塩基配列と配列番号：９または１０記載の塩基配列を含有するDNA、
(j)配列番号：８記載のアミノ酸配列をコードするDNA、
(k)配列番号：７記載の塩基配列を含有するDNA、
(l)配列番号：７記載の塩基配列からなるDNA、
または、これら(a)〜(l)のDNAと実質的に同一の塩基配列を含有するDNAが挙げられる。
A DNA containing a base sequence encoding the fusion protein of the present invention contains a polynucleotide comprising a base sequence encoding the Nanog protein and a polynucleotide comprising a base sequence encoding a protein transduction domain.
The DNA containing the base sequence encoding the fusion protein of the present invention may be any of various cells and tissues, for example, ES cell-derived cDNA, genomic DNA, or synthetic DNA, or a combination thereof. Specifically, for example
(a) DNA containing a polynucleotide encoding the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2 and a polynucleotide encoding the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 11;
(b) a DNA containing a polynucleotide encoding the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4 and a polynucleotide encoding the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 11;
(c) DNA containing a polynucleotide encoding the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 6 and a polynucleotide encoding the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 11;
(d) DNA containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 9 or 10,
(e) DNA containing the base sequence set forth in SEQ ID NO: 3 and the base sequence set forth in SEQ ID NO: 9 or 10;
(f) a DNA comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 5 and the base sequence set forth in SEQ ID NO: 9 or 10;
(g) a DNA comprising the nucleotide sequence represented by nucleotides 190 to 1104 of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 9 or 10,
(h) a DNA comprising the base sequence represented by the 217th nucleotide to the 1131st nucleotide of the base sequence described in SEQ ID NO: 3 and the base sequence described in SEQ ID NO: 9 or 10,
(i) a DNA comprising the base sequence represented by the 894th nucleotide to the 1691st nucleotide of the base sequence described in SEQ ID NO: 5 and the base sequence described in SEQ ID NO: 9 or 10,
(j) DNA encoding the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 8;
(k) DNA containing the base sequence set forth in SEQ ID NO: 7;
(l) DNA consisting of the base sequence described in SEQ ID NO: 7,
Alternatively, DNAs containing substantially the same base sequence as those of (a) to (l) can be mentioned.
これら配列番号：１，３または５に記載の塩基配列を含有するポリヌクレオチドは、本明細書の配列表の配列番号：１，３または５に開示されている塩基配列の適当な部分をハイブリダイゼーションのプローブあるいはPCRのプライマーに用いて、例えばES細胞由来のcDNAライブラリーをスクリーニングすることなどによりクローニングすることができる。該クローニングは、例えばMolecular Cloning 2nd Edt. Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)等の基本書に従い、当業者ならば容易に行うことができる。 These polynucleotides containing the nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 1, 3 or 5 are hybridized with an appropriate part of the nucleotide sequence disclosed in SEQ ID NO: 1, 3 or 5 in the sequence listing of the present specification. For example, screening of an ES cell-derived cDNA library can be used. The cloning can be easily performed by those skilled in the art according to a basic book such as Molecular Cloning 2nd Edt. Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989).
また前記(a)〜(l)のいずれかのDNAと実質的に同一の塩基配列を含有するDNAとは、具体的には、
(m) 前記(a)〜(l)のいずれかのDNAの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA、
(n) 前記(a)〜(l)のいずれかのDNAとの配列同一性を示す塩基配列を含有するDNA、
(o) 前記(a)〜(l)のいずれかのDNAによりコードされるタンパク質において1若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするDNA、
などが挙げられる。
In addition, the DNA containing substantially the same base sequence as any of the DNAs of the above (a) to (l), specifically,
(m) DNA that hybridizes under stringent conditions to the complementary strand of the DNA of any one of (a) to (l) above,
(n) DNA containing a base sequence showing sequence identity with any of the DNAs of (a) to (l) above,
(o) a DNA encoding a protein containing an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted and / or added in the protein encoded by the DNA of any one of (a) to (l),
Etc.
ここで前記(a)〜(l)のいずれかのDNAの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAとは、例えば前記(a)〜(l)のいずれかのDNAの塩基配列と約４０％以上、好ましくは約６０％以上、より好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％以上、さらに好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の配列同一性を有する塩基配列を含有するDNAが挙げられる。具体的には、前記(a)〜(l)のいずれかのDNAの部分配列などが挙げられる。
ハイブリダイゼーションは、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えばMolecular Cloning 2nd Edt. Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)等の基本書に記載の方法に従って行うことができる。また市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行うことができる。
「ストリンジェントな条件」とは、例えば、６×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣは、３３３ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ、３３３ｍＭ ＮａＣｌを示す）、０.５％ＳＤＳおよび５０％ホルムアミドを含む溶液中で４２℃にてハイブリダイズさせる条件、または６×ＳＳＣを含む（５０％ホルムアミドは含まない）溶液中で６５℃にてハイブリダイズさせる条件などが挙げられる。またハイブリダイゼーション後の洗浄の条件としては、０.１×ＳＳＣ、０.５％ＳＤＳの溶液中で６８℃にて洗浄するような条件が挙げられる。
Here, the DNA that hybridizes under stringent conditions to the complementary strand of the DNA of any one of the above (a) to (l) is, for example, the base of the DNA of any of the above (a) to (l) About 40% or more, preferably about 60% or more, more preferably about 70% or more, more preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more, and most preferably about 95% or more of the sequence. Examples thereof include DNA containing the nucleotide sequence. Specifically, a partial sequence of the DNA of any one of (a) to (l) above can be mentioned.
Hybridization can be performed according to a method known per se or a method analogous thereto, for example, a method described in a basic book such as Molecular Cloning 2nd Edt. Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989). Moreover, when using a commercially available library, it can carry out according to the method as described in an attached instruction manual.
“Stringent conditions” means, for example, hybridization at 42 ° C. in a solution containing 6 × SSC (20 × SSC represents 333 mM Sodium citrate, 333 mM NaCl), 0.5% SDS and 50% formamide. And conditions for hybridization at 65 ° C. in a solution containing 6 × SSC (not containing 50% formamide). The washing conditions after hybridization include washing conditions at 68 ° C. in a 0.1 × SSC, 0.5% SDS solution.
前記(a)〜(l)のいずれかのDNAとの配列同一性を示す塩基配列を含有するDNAとは、例えば前記(a)〜(l)のいずれかのDNAの塩基配列と約４０％以上、好ましくは約６０％以上、より好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％以上、さらに好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の配列同一性を示す塩基配列を含有するDNAが挙げられる。具体的には、前記(a)〜(l)のいずれかのDNAの部分配列などが挙げられる。このような配列同一性を有するDNAは、前述のハイブリダイゼーション反応やＰＣＲ反応により、または後述するDNAの改変（欠失、付加、置換）反応により作製することができる。 The DNA containing a base sequence showing sequence identity with any of the DNAs of (a) to (l) is, for example, about 40% of the base sequence of the DNA of any of the above (a) to (l) Or more, preferably about 60% or more, more preferably about 70% or more, more preferably about 80% or more, still more preferably about 90% or more, most preferably about 95% or more. DNA to do. Specifically, a partial sequence of the DNA of any one of (a) to (l) above can be mentioned. DNA having such sequence identity can be prepared by the aforementioned hybridization reaction or PCR reaction, or by a DNA modification (deletion, addition, substitution) reaction described later.
前記(a)〜(l)のいずれかのDNAによりコードされるタンパク質において1若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするDNAとは、人為的に作製したいわゆる改変タンパク質や、生体内に存在するアレル変異対等のタンパク質をコードするDNAを意味する。
ここでタンパク質におけるアミノ酸の変異数や変異部位は、本発明のDNAによりコードされるタンパク質の活性（分化多能性維持活性）が保持される限り制限はない。このように活性を喪失することなくアミノ酸残基が、どのように、何個欠失、置換及び／又は付加されればよいかを決定する指標は、当業者に周知のコンピュータプログラム、例えばDNA Star softwareを用いて見出すことができる。例えば変異数は、典型的には、全アミノ酸の１０％以内であり、好ましくは全アミノ酸の５％以内であり、さらに好ましくは全アミノ酸の１％以内である。また置換されるアミノ酸は、タンパク質の構造保持の観点から、残基の極性、電荷、可溶性、疎水性、親水性並びに両親媒性など、置換前のアミノ酸と似た性質を有するアミノ酸であることが好ましい。例えば、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Met、Phe及びTrpは互いに非極性アミノ酸に分類されるアミノ酸であり、Gly、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn及びGlnは互いに非荷電性アミノ酸に分類されるアミノ酸であり、Asp及びGluは互いに酸性アミノ酸に分類されるアミノ酸であり、またLys、Arg及びHisは互いに塩基性アミノ酸に分類されるアミノ酸である。ゆえに、これらを指標として同群に属するアミノ酸を適宜選択することができる。
DNA encoding a protein containing an amino acid sequence in which one or more amino acids have been deleted, substituted and / or added in the protein encoded by any of the DNAs of (a) to (l) above is artificially Means a DNA encoding a so-called modified protein or a protein such as an allelic variant present in the living body.
Here, the number of amino acid mutations and mutation sites in the protein are not limited as long as the activity of the protein encoded by the DNA of the present invention (the differentiation pluripotency maintenance activity) is retained. Indicators that determine how many amino acid residues need to be deleted, substituted and / or added without loss of activity in this way are computer programs well known to those skilled in the art, such as DNA Star. Can be found using software. For example, the number of mutations is typically within 10% of all amino acids, preferably within 5% of all amino acids, and more preferably within 1% of all amino acids. In addition, from the viewpoint of maintaining the structure of the protein, the amino acid to be substituted may be an amino acid having properties similar to the amino acid before substitution, such as residue polarity, charge, solubility, hydrophobicity, hydrophilicity, and amphiphilicity. preferable. For example, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Met, Phe and Trp are amino acids classified as nonpolar amino acids, and Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn and Gln are mutually uncharged amino acids. Asp and Glu are amino acids that are classified as acidic amino acids, and Lys, Arg, and His are amino acids that are classified as basic amino acids. Therefore, amino acids belonging to the same group can be appropriately selected using these as indices.
この改変タンパク質をコードするDNAは、例えば、Molecular Cloning 2nd Edt. Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)等の基本書に記載の種々の方法、例えば部位特異的変異誘発やＰＣＲ法等によって製造することができる。また市販のキットを用いて、Gapped duplex法やKunkel法などの公知の方法に従って製造することもできる。 The DNA encoding this modified protein can be produced by various methods described in basic books such as Molecular Cloning 2nd Edt. Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), such as site-directed mutagenesis and PCR. it can. Moreover, it can also manufacture in accordance with well-known methods, such as Gapped duplex method and Kunkel method, using a commercially available kit.
以上のような、前記(a)〜(l)のいずれかのDNAと実質的に同一の塩基配列を含有する本発明のDNAは、当該DNAによりコードされるタンパク質が、細胞内への導入が可能であり、導入された後は、配列番号：２，４または６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質であることが好ましい。ここで実質的に同質の活性とは、本発明のDNAによりコードされるタンパク質を発現させた細胞、あるいは当該タンパク質を取り込んだ細胞の分化多能性が維持されるという性質を指す。具体的には、例えばマウスのES細胞であれば、LIFなしでも当該タンパク質を発現させた細胞または当該タンパク質を取り込んだ細胞の分化多能性が維持されるという性質を示す。該活性およびその測定法については、公知の方法にて実施することができる。 As described above, the DNA of the present invention containing substantially the same base sequence as the DNA of any one of the above (a) to (l), the protein encoded by the DNA can be introduced into cells. It is possible that after introduction, a protein having substantially the same quality of activity as the protein consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2, 4 or 6 is preferable. Here, substantially the same quality of activity refers to the property that the differentiation pluripotency of a cell expressing a protein encoded by the DNA of the present invention or a cell incorporating the protein is maintained. Specifically, for example, mouse ES cells show the property that the pluripotency of cells expressing the protein or cells incorporating the protein is maintained without LIF. About this activity and its measuring method, it can implement by a well-known method.
本発明のDNAは、１本鎖および２本鎖のいずれの形態もとることができる。本発明のDNAが２本鎖の場合、前記本発明のDNAを発現ベクターに挿入することにより、本発明のタンパク質を発現するための組換え発現ベクターを作製することができる。 The DNA of the present invention can be in either single-stranded or double-stranded form. When the DNA of the present invention is double-stranded, a recombinant expression vector for expressing the protein of the present invention can be prepared by inserting the DNA of the present invention into an expression vector.
ここで用いる発現ベクターとしては、用いる宿主や目的等に応じて適宜選択することができ、プラスミド、ファージベクター、ウイルスベクター等が挙げられる。
例えば、宿主が大腸菌の場合、ベクターとしては、pUC118、pUC119、pBR322、pCR3等のプラスミドベクター、λZAPII、λgt11などのファージベクターが挙げられる。宿主が酵母の場合、ベクターとしては、pYES2、pYEUra3などが挙げられる。宿主が昆虫細胞の場合には、pAcSGHisNT-Aなどが挙げられる。宿主が動物細胞の場合には、pCEP4、pKCR、pCDM8、pGL2、pcDNA3.1、pRc/RSV、pRc/CMVなどのプラスミドベクターや、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクターなどのウイルスベクターが挙げられる。
The expression vector used here can be appropriately selected according to the host to be used, the purpose, etc., and includes plasmids, phage vectors, virus vectors and the like.
For example, when the host is Escherichia coli, examples of the vector include plasmid vectors such as pUC118, pUC119, pBR322, and pCR3, and phage vectors such as λZAPII and λgt11. When the host is yeast, examples of the vector include pYES2, pYEUra3 and the like. When the host is an insect cell, pAcSGHisNT-A and the like can be mentioned. When the host is an animal cell, plasmid vectors such as pCEP4, pKCR, pCDM8, pGL2, pcDNA3.1, pRc / RSV, pRc / CMV, and viral vectors such as retrovirus vectors, adenovirus vectors, and adeno-associated virus vectors Is mentioned.
前記ベクターは、発現誘導可能なプロモーター、シグナル配列をコードする遺伝子、選択用マーカー遺伝子、ターミネーターなどの因子を適宜有していても良い。
また、単離精製が容易になるように、チオレドキシン、Hisタグ、あるいはGST（グルタチオンS-トランスフェラーゼ）等との融合タンパク質として発現する配列が付加されていても良い。この場合、宿主細胞内で機能する適切なプロモーター（lac、tac、trc、trp、CMV、SV40初期プロモーターなど）を有するGST融合タンパクベクター（pGEX4Tなど）や、Myc、Hisなどのタグ配列を有するベクター（pcDNA3.1/Myc-Hisなど）、さらにはチオレドキシンおよびHisタグとの融合タンパク質を発現するベクター（pET32a）などを用いることができる。
The vector may appropriately have factors such as a promoter capable of inducing expression, a gene encoding a signal sequence, a selection marker gene, and a terminator.
Further, a sequence expressed as a fusion protein with thioredoxin, His tag, GST (glutathione S-transferase) or the like may be added so that isolation and purification can be facilitated. In this case, a GST fusion protein vector (such as pGEX4T) that has an appropriate promoter (such as lac, tac, trc, trp, CMV, or SV40 early promoter) that functions in the host cell, or a vector that has a tag sequence such as Myc or His. (PcDNA3.1 / Myc-His, etc.), and a vector (pET32a) that expresses a fusion protein with thioredoxin and His tag can be used.
前記で作製された発現ベクターで宿主を形質転換することにより、当該発現ベクターを含有する形質転換細胞を作製することができる。
ここで用いられる宿主としては、大腸菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞などが挙げられる。大腸菌としては、E.coli K-12系統のHB101株、C600株、JM109株、DH5α株、AD494(DE3)株などが挙げられる。また酵母としては、サッカロミセス・セルビジエなどが挙げられる。動物細胞としては、L929細胞、BALB/c3T3細胞、C127細胞、CHO細胞、COS細胞、Vero細胞、Hela細胞、293-EBNA細胞などが挙げられる。昆虫細胞としてはsf9などが挙げられる。
By transforming the host with the expression vector prepared above, a transformed cell containing the expression vector can be prepared.
Examples of the host used here include Escherichia coli, yeast, insect cells, animal cells and the like. Examples of E. coli include HB101 strain, C600 strain, JM109 strain, DH5α strain, AD494 (DE3) strain and the like of E. coli K-12 strain. Examples of yeast include Saccharomyces cerevisiae. Examples of animal cells include L929 cells, BALB / c3T3 cells, C127 cells, CHO cells, COS cells, Vero cells, Hela cells, and 293-EBNA cells. Insect cells include sf9.
宿主細胞への発現ベクターの導入方法としては、前記宿主細胞に適合した通常の導入方法を用いれば良い。具体的にはリン酸カルシウム法、DEAE-デキストラン法、エレクトロポレーション法、遺伝子導入用リピッド（Lipofectamine、Lipofectin; Gibco-BRL社）を用いる方法などが挙げられる。導入後、選択マーカーを含む通常の培地にて培養することにより、前記発現ベクターが宿主細胞中に導入された形質転換細胞を選択することができる。 As a method for introducing the expression vector into the host cell, a normal method suitable for the host cell may be used. Specific examples include a calcium phosphate method, a DEAE-dextran method, an electroporation method, and a method using a lipid for gene transfer (Lipofectamine, Lipofectin; Gibco-BRL). After the introduction, a transformed cell in which the expression vector is introduced into the host cell can be selected by culturing in a normal medium containing a selection marker.
以上のようにして得られた形質転換細胞を好適な条件下で培養し続けることにより、本発明のタンパク質を製造することができる。得られたタンパク質は、一般的な生化学的精製手段により、さらに単離・精製することができる。ここで精製手段としては、塩析、イオン交換クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー等が挙げられる。また本発明のタンパク質を、前述のチオレドキシンやHisタグ、GST等との融合タンパク質として発現させた場合は、これら融合タンパク質やタグの性質を利用した精製法により単離・精製することができる。
なお、実施例に示すように、これらの融合タンパク質は、試験管内で合成、精製することもできる。
The protein of the present invention can be produced by continuing to culture the transformed cells obtained as described above under suitable conditions. The obtained protein can be further isolated and purified by general biochemical purification means. Examples of the purification means include salting out, ion exchange chromatography, adsorption chromatography, affinity chromatography, gel filtration chromatography and the like. In addition, when the protein of the present invention is expressed as a fusion protein with the aforementioned thioredoxin, His tag, GST or the like, it can be isolated and purified by a purification method utilizing the properties of these fusion protein and tag.
As shown in the examples, these fusion proteins can be synthesized and purified in vitro.
本発明の「化学的結合体」とは、Nanogタンパク質を、ビスフォスフォネート化合物、グルコース−６−リン酸、またはP糖タンパク質に結合活性を持つ化合物と化学的に結合して得られる化学的結合体のことである。
「ビスフォスフォネート化合物」とは、例えば、エチドロネート、アレンドロネート、リセドロネート、インカドロネート、パミドロネート等の公知の化合物を挙げることができる。ビスフォスフォネート化合物は骨芽細胞に選択的に取り込まれるため、この公知の性質を利用したビスフォスフォネート化合物との結合体が報告されている（Calcif. Tissue Int., 59: 168-173 (1996)、Bioorg. Med. Chem. Lett., 4: 1375-1380(1995)）。そのため、Nanogタンパク質にビスフォスフォネート化合物を化学的に結合させた化学的結合体は骨芽細胞に将来分化していく間質系幹細胞特異的に取り込まれる。
The “chemical conjugate” of the present invention is a chemical compound obtained by chemically binding Nanog protein to a compound having binding activity to a bisphosphonate compound, glucose-6-phosphate, or P-glycoprotein. It is a conjugate.
Examples of the “bisphosphonate compound” include known compounds such as etidronate, alendronate, risedronate, incadronate, and pamidronate. Since bisphosphonate compounds are selectively taken up into osteoblasts, conjugates with bisphosphonate compounds using this known property have been reported (Calcif. Tissue Int., 59: 168-173). (1996), Bioorg. Med. Chem. Lett., 4: 1375-1380 (1995)). Therefore, a chemical conjugate in which a bisphosphonate compound is chemically bound to Nanog protein is specifically taken up by stromal stem cells that will be differentiated into osteoblasts in the future.
グルコース−６−リン酸は公知の物質であり、Nanogタンパク質と化学的に結合させることによって化学的結合体は肝細胞および膵細胞に将来分化していく前駆細胞特異的に取り込まれる。
P糖タンパク質に結合活性を持つ化合物とは、例えばＢＣＲＰインヒビターを挙げることができる。具体的には、例えば、ＢＣＲＰインヒビターであるGF120918などを挙げることができる。P糖タンパク質に結合活性を持つ化合物とNanogタンパク質を化学的に結合させることにより、化学的結合体はSP細胞と呼ばれる各種体性幹細胞特異的に取り込まれる。
Glucose-6-phosphate is a known substance, and by chemically binding to Nanog protein, the chemical conjugate is specifically taken up by progenitor cells that will differentiate into hepatocytes and pancreatic cells in the future.
Examples of the compound having binding activity to P-glycoprotein include BCRP inhibitors. Specific examples include GF120918, which is a BCRP inhibitor. By chemically binding a compound having binding activity to P-glycoprotein and Nanog protein, the chemical conjugate is specifically taken up by various somatic stem cells called SP cells.
Nanogタンパク質は前記のように作製することができる。精製されたNanogタンパク質とこれらの物質の化学的結合体は、アミノ基を持つリンカーをつけることで酸アミド結合など公知の方法に従って化学的に結合させることによって作製することができる。 Nanog protein can be made as described above. A purified Nanog protein and a chemical conjugate of these substances can be prepared by attaching them with a linker having an amino group and chemically binding them according to a known method such as acid amide bond.
本発明の「分化多能性維持剤」とは、上記の本発明の融合タンパク質あるいは化学的結合体のうち少なくとも1つを含有する剤のことであり、細胞に取り込まれることにより、細胞の分化多能性を維持する剤をいう。具体的には、例えば、マウスのＥＳ細胞に用いることにより、ＬＩＦなしの条件においても細胞が分化多能性を維持することができる剤をいう。
ここで細胞は、特に限定されないが、哺乳動物細胞を挙げることができる。哺乳動物細胞とは、ヒト、サル、ラットやマウス等の哺乳動物の組織・臓器細胞またはこれら由来の細胞であって、個体の細胞、個体から取り出した初代細胞、または培養細胞のいずれでもよい。好ましくは、市販の培養細胞（ATCC社など）、胚性幹（ＥＳ）細胞や体性幹細胞などの幹細胞を挙げることができ、より好ましくは胚性幹細胞や体性幹細胞である。本発明の分化多能性維持剤は、胚性幹細胞や体性幹細胞の維持培養を容易とすることによって細胞移植療法において十分な細胞数を確保することに貢献し、遺伝子改変動物の作製も容易とする。また本発明の分化多能性維持剤は体内における体性幹細胞を増加させることなどにも有用である。
The “pluripotency maintenance agent” of the present invention is an agent containing at least one of the fusion protein or the chemical conjugate of the present invention described above. An agent that maintains pluripotency. Specifically, for example, it refers to an agent that can be used for mouse ES cells so that the cells can maintain pluripotency even under conditions without LIF.
Here, the cells are not particularly limited, but may include mammalian cells. Mammalian cells are tissue / organ cells of mammals such as humans, monkeys, rats and mice, or cells derived therefrom, and may be any of individual cells, primary cells taken out from individuals, or cultured cells. Preferred examples include commercially available cultured cells (such as ATCC), stem cells such as embryonic stem (ES) cells and somatic stem cells, and more preferred are embryonic stem cells and somatic stem cells. The pluripotency maintenance agent of the present invention contributes to securing a sufficient number of cells in cell transplantation therapy by facilitating maintenance culture of embryonic stem cells and somatic stem cells, and facilitates the production of genetically modified animals. And The pluripotency maintenance agent of the present invention is also useful for increasing somatic stem cells in the body.
本発明の分化多能性維持剤を作用させるには、当該剤を直接体内に導入するin vivo法、ヒトからある種の細胞を採取し、体外で該細胞に添加してその細胞を体内に戻すex vivo法、および培養細胞に添加するin vitro法がある。
投与方法としては、ex vivo法またはin vitro法であれば、細胞を培養している培養液中に添加、あるいは細胞に直接添加することができる。添加量は、細胞の種類、細胞数等により適宜調整することができるが、細胞毒性が認められず分化多能性維持活性が認められればよい。製剤中の本発明の融合タンパク質または結合体の添加量は、通常培地に0.0001μM〜1000μM、好ましくは0.0001μM〜10μM、より好ましくは0.0001μM〜1μMであり、これを1〜数日に1回添加するのが好ましい。
また、in vivo法の投与方法としては、皮下投与、皮内投与、筋肉内投与、静脈内投与などが挙げられる。製剤中の本発明の融合タンパク質または結合体の投与量は、治療目的の疾患、患者の年齢、体重などにより適宜調整することができるが、通常0.0001ｍｇ〜1000ｍｇ、好ましくは0.001ｍｇ〜100ｍｇ、より好ましくは0.01ｍｇ〜10ｍｇであり、これを1〜数日に1回投与するのが好ましい。
In order to cause the pluripotency maintenance agent of the present invention to act, an in vivo method in which the agent is directly introduced into the body, a certain type of cell is collected from a human, added to the cell outside the body, and the cell is incorporated into the body. There are ex vivo methods of returning and in vitro methods of adding to cultured cells.
As an administration method, if it is an ex vivo method or an in vitro method, it can be added to a culture medium in which cells are cultured or added directly to cells. The amount added can be appropriately adjusted depending on the cell type, the number of cells, etc., but it is sufficient that no cytotoxicity is observed and pluripotency maintenance activity is recognized. The addition amount of the fusion protein or conjugate of the present invention in the preparation is usually 0.0001 μM to 1000 μM, preferably 0.0001 μM to 10 μM, more preferably 0.0001 μM to 1 μM in a normal medium, and this is once a few days. It is preferable to add.
Examples of the administration method of the in vivo method include subcutaneous administration, intradermal administration, intramuscular administration, intravenous administration and the like. The dose of the fusion protein or conjugate of the present invention in the preparation can be appropriately adjusted depending on the disease to be treated, the age, weight, etc. of the patient, but is usually 0.0001 mg to 1000 mg, preferably 0.001 mg to 100 mg. Preferably it is 0.01 mg-10 mg, and it is preferable to administer this once to several days.
分化多能性維持剤の有効成分である本発明の融合タンパク質または結合体は、そのままもしくは自体公知の薬学的に許容される担体(賦形剤、増量剤、結合剤、滑沢剤などが含まれる)、慣用の添加剤などと混合して試薬あるいは医薬組成物として調製することができ、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）または培地等を含むものであってもよい。当該医薬組成物は、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤、注射剤、点滴剤、外用剤、坐剤などに調整することができる。 The fusion protein or conjugate of the present invention, which is an active ingredient of a pluripotency maintenance agent, includes a pharmaceutically acceptable carrier (excipient, extender, binder, lubricant, etc.) as it is or as it is known per se. And can be prepared as a reagent or a pharmaceutical composition by mixing with conventional additives and the like, and may contain physiological saline, phosphate buffered saline (PBS), culture medium, or the like. The pharmaceutical composition can be adjusted to tablets, pills, capsules, powders, granules, syrups, injections, drops, external preparations, suppositories, and the like.
本発明の「分化多能性維持方法」とは、本発明の融合タンパク質あるいは化学的結合体のいずれかを細胞に接触させることにより、分化多能性を維持する方法である。具体的には、例えば、本発明の分化多能性維持剤を細胞培養培地中に添加して細胞に接触させ、細胞に取り込ませることによって分化多能性を維持する方法のことである。本発明の分化多能性維持方法は、本発明の融合タンパク質あるいは化学的結合体のいずれかを細胞と接触させた後に、細胞のピノサイトーシス（飲作用）により取り込まれ、細胞の分化多能性が維持される方法であってもよい。細胞のピノサイトーシスを利用した取り込み（導入）は、例えば、市販のキットであるInflux(登録商標) Pinocytic Cell-Loading Reagent(Molecular Probe社)を用いることによって実施することができる。 The “differentiation pluripotency maintenance method” of the present invention is a method of maintaining differentiation pluripotency by contacting a cell with either the fusion protein or the chemical conjugate of the present invention. Specifically, it is a method of maintaining differentiation pluripotency by adding the differentiation pluripotency maintenance agent of this invention in a cell culture medium, making it contact with a cell, and making it take in a cell, for example. In the method for maintaining pluripotency of the present invention, either the fusion protein or the chemical conjugate of the present invention is brought into contact with a cell and then taken up by cell pinocytosis (phagocytosis). It may be a method in which sex is maintained. Uptake (introduction) using cell pinocytosis can be performed, for example, by using a commercially available kit, Influx (registered trademark) Pinocytic Cell-Loading Reagent (Molecular Probe).
細胞は、特に限定されないが、哺乳動物細胞を挙げることができる。哺乳動物細胞とは、ヒト、サル、ラットやマウス等の哺乳動物の組織・臓器細胞またはこれら由来の細胞であって、個体の細胞、個体から取り出した初代細胞、または培養細胞のいずれでもよい。好ましくは、市販の培養細胞（ATCC社など）、胚性幹細胞や体性幹細胞などの幹細胞を挙げることができ、より好ましくは胚性幹細胞や体性幹細胞である。
前記の分化多能性維持剤あるいは分化多能性維持方法により、本発明の融合タンパク質あるいは化学的結合体を含有する細胞を作製することができる。
Although a cell is not specifically limited, A mammalian cell can be mentioned. Mammalian cells are tissue / organ cells of mammals such as humans, monkeys, rats and mice, or cells derived therefrom, and may be any of individual cells, primary cells taken out from individuals, or cultured cells. Preferred examples include commercially available cultured cells (such as ATCC) and stem cells such as embryonic stem cells and somatic stem cells, and embryonic stem cells and somatic stem cells are more preferred.
Cells containing the fusion protein or chemical conjugate of the present invention can be produced by the differentiation pluripotency maintenance agent or the differentiation pluripotency maintenance method.
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention concretely, this invention is not limited at all by these Examples.
（１）TAT-Nanog発現ベクターの構築
オリゴDNA TAT-S（配列番号９）とTAT-AS（配列番号１０）を９４度で１分間変成の後、徐々に室温に戻し２本鎖DNAを作製した。これをpCDNA3.1のHindIII/BamHI部位にライゲーションした（pCDNA3.1-TAT）。このpCDNA3.1-TATのBamHI/EcoRV部位にGateway rfB Casetteを挿入してpCDNA3.1-TAT-GWを作製した。pCDNA3.1-TAT-GWとpEnter-mNanogでLR組み換え反応（Invitrogen社）を行い、pCDNA3.1-TAT-Nanog（図１）を作製した。TAT-NanogのDNA配列は配列番号７に、アミノ酸配列は配列番号８で示されている。
（２）TAT-Nanog蛋白質の合成と精製
融合タンパク質の合成と精製はPureGeneシステムを用いてin vitroにおいて行った。
（３）TAT-Nanog蛋白質による分化多能性維持
マウス由来のRF8ES細胞は15%の胎児血清と１０００U/μｌのLIFを含むDMEM培地で培養すると長期間にわたり未分化状態を保つ。LIFを除去すると細胞は分化し、大型で扁平の細胞へと変化する。LIFのかわりにTAT-Nanogタンパク質を培地に加えると、LIFなしで未分化状態が保たれた（図２）。
(1) Construction of TAT-Nanog expression vector Oligo DNA TAT-S (SEQ ID NO: 9) and TAT-AS (SEQ ID NO: 10) were denatured at 94 ° C for 1 minute and then gradually returned to room temperature to prepare double-stranded DNA. did. This was ligated to the HindIII / BamHI site of pCDNA3.1 (pCDNA3.1-TAT). Gateway rfB Casette was inserted into the BamHI / EcoRV site of this pCDNA3.1-TAT to prepare pCDNA3.1-TAT-GW. LR recombination reaction (Invitrogen) was performed with pCDNA3.1-TAT-GW and pEnter-mNanog to prepare pCDNA3.1-TAT-Nanog (FIG. 1). The DNA sequence of TAT-Nanog is shown in SEQ ID NO: 7, and the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 8.
(2) Synthesis and purification of TAT-Nanog protein The fusion protein was synthesized and purified in vitro using the PureGene system.
(3) RF8ES cells derived from TAT-Nanog protein-maintained pluripotent mice remain undifferentiated for a long period of time when cultured in DMEM medium containing 15% fetal serum and 1000 U / μl LIF. When LIF is removed, the cells differentiate and turn into large, flat cells. When TAT-Nanog protein was added to the medium instead of LIF, the undifferentiated state was maintained without LIF (FIG. 2).
本発明により、細胞、特に胚性幹細胞や体性幹細胞の分化多能性を維持することができる融合タンパク質、または化学的結合体を提供することができる。本発明の分化多能性維持剤は、分化多能性を可逆的に調整をすることができるため、遺伝子導入法に比べてより臨床応用が可能である。 According to the present invention, a fusion protein or chemical conjugate capable of maintaining the pluripotency of cells, particularly embryonic stem cells and somatic stem cells, can be provided. Since the differentiation pluripotency maintenance agent of this invention can adjust differentiation pluripotency reversibly, clinical application is possible compared with the gene transfer method.
配列表配列番号９で示される塩基配列はオリゴDNA TAT-S、配列番号１０で示される塩基配列はオリゴDNA TAT-AS、配列番号１１で示されるアミノ酸配列はTATペプチドである。 The base sequence shown in SEQ ID NO: 9 is oligo DNA TAT-S, the base sequence shown in SEQ ID NO: 10 is oligo DNA TAT-AS, and the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 11 is TAT peptide.
Claims (14)
A cell containing the fusion protein according to any one of claims 1 to 4 or the chemical conjugate according to claim 9.
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