JP2005099040A - Vessel for immunoassay - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、抗原抗体反応を利用して抗体又は抗原を検出する免疫分析において、試薬及び／又は検体の保存、希釈、反応に用いる容器に関する。 The present invention relates to a container used for storage, dilution, and reaction of reagents and / or specimens in immunoassay for detecting antibodies or antigens using antigen-antibody reactions.
従来の免疫分析においては、使用する試薬又は検体の保存及び希釈にポリスチレン又はポリプロピレン製の容器が使用されているが、該試薬又は検体中の分子の該容器への非特異的吸着が存在するため、試薬又は検体の減少及び試薬又は検体溶液の濃度の変化が必ず発生してしまう。 In a conventional immunoassay, a container made of polystyrene or polypropylene is used for storing and diluting a reagent or specimen to be used, but there is nonspecific adsorption of molecules in the reagent or specimen to the container. The decrease in the reagent or specimen and the change in the concentration of the reagent or specimen solution will inevitably occur.
近年、免疫分析法の多様化に伴い、特に製薬メーカーの創薬部門に於いては天然の物質を抽出、精製して使用するケースが多く、そういった物質は総じて非常に微量で高価であり、物理吸着による保存又は希釈工程での試薬の減少は無視することが出来ない。 In recent years, with the diversification of immunoassay methods, especially in the drug discovery departments of pharmaceutical manufacturers, there are many cases where natural substances are extracted, purified, and used, and such substances are generally very small and expensive, The decrease in reagent during the storage or dilution process due to adsorption cannot be ignored.
検体を扱う際の容器類についても臨床診断に用いる血清、尿等の検体中のアルブミン、トランスフェリン、イムノグロブリンといった臨床上重要な蛋白質が、患者から採取して測定するまでに使用される容器類に吸着されており、採取の段階に於けるシリンジ、カップ類、保存の段階に於けるチューブ類、精製、濃縮、希釈の段階に於ける遠沈管、試験管等それぞれの段階で用いられる容器は殆どが表面処理を施していないポリプロピレン、ポリスチレンであるため、それぞれの段階における吸着が微量であったとしても、全工程で考えると採取時と比較すると、測定時の検体中の濃度変化は非常に大きいものであると予想される。
また、臨床検査薬メーカーに於いては、一般的に販売されている臨床検査用のキット価格の約８割が固相化試薬の価格で占められており、容器への吸着による試薬の減少を抑えることは、大幅なコストダウンにつながる。
Containers for handling specimens are also used for collection of clinically important proteins such as albumin, transferrin, and immunoglobulin in specimens such as serum and urine used for clinical diagnosis before collection and measurement. Most of the containers used in each stage are adsorbed, such as syringes and cups at the collection stage, tubes at the storage stage, centrifuge tubes and test tubes at the purification, concentration and dilution stages. Is a non-surface-treated polypropylene or polystyrene, so even if the amount of adsorption at each stage is very small, the concentration change in the sample at the time of measurement is very large compared to the time of collection when considered in all steps Expected to be.
In addition, about 80% of the clinical test kit price that is generally sold in clinical test drug manufacturers is occupied by the price of the solid phase reagent, and the decrease in the reagent due to adsorption to the container. Suppressing it leads to a significant cost reduction.
一方測定に使用する容器において、固相化法と呼ばれる免疫分析法では、容器表面に固相化させた蛋白を利用して分析を行うため容器表面に固相化試薬量を増やすため水酸基等の官能基を導入し親水−疎水のバランスを調節する事で飽和吸着量を増やす、いわゆる高吸着処理がなされたものが使用されている。
しかし、近年分析時間の短縮化、大量分析を目的に自動分析機（ロボット）による分析が開発され、特に製薬メーカーの創薬部門に於いて急速に普及しつつある。
On the other hand, in the container used for measurement, in the immunoassay method called the solid phase method, analysis is performed using the protein solid-phased on the surface of the container. A material that has been subjected to a so-called high adsorption treatment in which a saturated adsorption amount is increased by introducing a functional group and adjusting a hydrophilic-hydrophobic balance is used.
However, in recent years, analysis by an automatic analyzer (robot) has been developed for the purpose of shortening analysis time and mass analysis, and it is rapidly spreading especially in the drug discovery department of pharmaceutical manufacturers.
ここで、従来の固相化法による測定にあたっては、固相化されない余剰分子の排除の為の洗浄工程が必要であるが、洗浄液の分注−吸引を繰り返す洗浄工程は自動分析機にとっては困難な工程であるため、自動分析機に合わせた測定法として新たに洗浄工程による反応物と未反応物の分離を必要としない、いわゆる逐次添加法が開発されつつある。
逐次添加法においては、反応の際に分子の固相化は行わず、反応は溶液中で行われる。よって、前述のような高吸着処理表面を有する容器では不必要な吸着により溶液中の反応を阻害、又は効率を低下させてしまう。
Here, in the measurement by the conventional solid phase immobilization method, a washing step for eliminating the excess molecules that are not solid phased is necessary, but the washing step of repeating the dispensing and aspiration of the washing liquid is difficult for the automatic analyzer. Therefore, a so-called sequential addition method that does not require separation of reactants and unreacted substances by a washing step is being developed as a measurement method suitable for an automatic analyzer.
In the sequential addition method, the molecule is not solid-phased during the reaction, and the reaction is performed in a solution. Therefore, in the container having the high adsorption treatment surface as described above, the reaction in the solution is hindered or the efficiency is lowered due to unnecessary adsorption.
更に、近年の測定技術の進歩により従来の比色法による吸光度測定より高感度を持つ蛍光、発光法による評価技術が確立されてきており、今後そのような高感度の測定系に於いて、不必要な分子の容器への吸着が大きな問題となってくると予想される。
ところが、現在それらに使用されている容器としてはやはり吸着に対して考慮された物はなくポリスチレン又は、ポリプロピレンといった成形性、透明性、耐低温性のみを考慮した材料を特に吸着を抑えるための表面処理もせずに用いられており、試薬のロス及び感度の低下の問題を容器の特性の方向から解決するといったアプローチは全くなされていない。
Furthermore, due to recent advances in measurement technology, fluorescence and luminescence method evaluation techniques have been established that have higher sensitivity than conventional colorimetric absorbance measurements. Adsorption of the necessary molecules into the container is expected to become a major problem.
However, the containers currently used for them are still not considered for adsorption, and polystyrene or polypropylene, such as a material that only considers moldability, transparency, and low temperature resistance, is a surface for suppressing adsorption. It is used without treatment, and no approach has been made to solve the problem of reagent loss and sensitivity reduction from the direction of container characteristics.
しかし、現在までに免疫分析容器表面の非特異的吸着を制御する為にいくつかの技術が検討され実施されている。
例えば、最も一般的に行われている方法としては、測定系に対して不活性な蛋白質をコーティングするいわゆるブロッキングと呼ばれる方法であるが、この方法は基本的に蛋白質の非特異的吸着を利用しているため、コーティング毎にブロッキング効果がばらつきやすく、蛋白質の状態によっても効果は左右されやすい。又不活性な蛋白質は非特異的吸着をしているだけであるので簡単に溶液中に遊離してしまうため保存用には用いることは出来ない。特許文献１及び２には蛋白質を化学的に固定化する事で前述の様な遊離を無くす技術が開示されているが、蛋白質は乾燥、保存温度更に保存期間によって構造変化を起こす可能性が高いので実際の容器として汎用性は望めなかった。
However, several techniques have been studied and implemented so far to control non-specific adsorption on the surface of an immunoassay container.
For example, the most commonly performed method is a so-called blocking method in which a protein that is inactive to the measurement system is coated. This method basically utilizes non-specific adsorption of proteins. Therefore, the blocking effect tends to vary from coating to coating, and the effect is easily influenced by the state of the protein. Inactive proteins are only non-specifically adsorbed and thus easily released into the solution and cannot be used for storage. Patent Documents 1 and 2 disclose a technique for eliminating the above-mentioned liberation by chemically immobilizing proteins, but proteins are highly likely to undergo structural changes depending on drying, storage temperature and storage period. Therefore, versatility as an actual container could not be expected.
また、吸着した蛋白質はその高次構造が変化することにより二次的な吸着を誘引する。即ち遊離状態で不活性な蛋白質も、吸着若しくは化学的に結合した状態では高次構造の変化により完全な不活性状態を維持する事は出来ず、基材への直接的な吸着は妨げたとしても蛋白−蛋白間の二次的な吸着が発生する点に問題がある。
蛋白−蛋白間の二次的吸着は、蛋白質の種類によって異なるため、測定する系毎にブロッキングに用いる最適な蛋白質を選択する検討が必須であり、更に血清のような蛋白質の混合溶液を検体として用いた場合は、全ての蛋白に対して吸着を制御出来るようなブロッキング蛋白質は存在しない。
Since secondary adsorption between protein and protein varies depending on the type of protein, it is essential to select the optimal protein to be used for blocking for each system to be measured. In addition, a mixed solution of proteins such as serum is used as a sample. When used, there is no blocking protein that can control adsorption for all proteins.
そこで、本発明者は、容器の特性に着目し、鋭意検討した結果、分析に用いられる全ての分子について容器への飽和吸着量を一定値以下に制御すれば、保存、希釈及び反応時における試薬や検体の減少が無く、高感度の測定も可能であることを見出し、本発明を完成した。 Therefore, the present inventor paid attention to the characteristics of the container, and as a result of intensive studies, if the saturated adsorption amount to the container was controlled below a certain value for all molecules used in the analysis, the reagent during storage, dilution and reaction The present invention has been completed by finding that high-sensitivity measurement is possible without any decrease in the number of specimens.
すなわち、本発明は、分析に用いられる分子の飽和吸着量が１×１０-1pmol／cm2 以下である免疫分析用容器を提供するものである。 That is, the present invention provides an immunoassay container in which the amount of saturated adsorption of molecules used for analysis is 1 × 10 −1 pmol / cm 2 or less.
本発明の免疫分析用容器は、測定に使用する分子又は血清の吸着が１×１０-1pmol／cm2 以下である事により試薬の保存、希釈の際の吸着による損失が無く、液層反応系の容器として用いた場合測定分子の吸着による反応効率の低下若しくは不要分子の吸着による反応の阻害が無く高感度、高精度な測定を行うことが出来る。
又、血清を用いた臨床検査においては、血清成分の吸着による構造変化が起こらない為、より体内に近い条件での検査が可能になる。
The container for immunoassay of the present invention has no loss due to adsorption when storing or diluting reagents because the adsorption of molecules or serum used for measurement is 1 × 10 −1 pmol / cm 2 or less. When used as a system container, high-sensitivity and high-accuracy measurement can be carried out without a decrease in reaction efficiency due to adsorption of measurement molecules or inhibition of reaction due to adsorption of unnecessary molecules.
Also, in clinical tests using serum, structural changes due to adsorption of serum components do not occur, so tests under conditions closer to the body are possible.
従来、免疫分析用容器に用いられているポリスチレン又はポリプロピレン製の容器の分子、例えば蛋白吸着量は約１〜１０pmol／cm2 又はそれ以上であり、分析に用いる溶液中の分子、例えば蛋白は溶液の濃度及び容器との接触面積にもよるが、約２０％〜５０％が容器に吸着してしまっている。ここで、吸着した２０％〜５０％の分子が溶液中の反応に必須のものであれば、反応効率つまり測定感度は２０％〜５０％低下してしまうこととなり、該吸着した分子が吸着による構造変化のため不必要な反応を引き起こすような物質であれば、大きなノイズとなってしまう。 Conventionally, molecules of polystyrene or polypropylene containers used for containers for immunoanalysis, for example, protein adsorption amount is about 1 to 10 pmol / cm 2 or more, and molecules in solution used for analysis, for example, proteins are solutions. Depending on the concentration and the contact area with the container, about 20% to 50% is adsorbed to the container. Here, if 20% to 50% of the adsorbed molecules are essential for the reaction in the solution, the reaction efficiency, that is, the measurement sensitivity will be reduced by 20% to 50%. Any substance that causes an unnecessary reaction due to structural changes will result in significant noise.
よって、分析に用いられる分子が全く吸着しない容器が最も理想的であるが、実質的には吸着量を現状の１／１０〜１／１００にする事で充分に効果が得られる。
つまり、溶液中の分子の吸着量は分子の種類及び温度、溶液濃度、溶媒のpH等によって変動するが、反応容器としては分析に用いられる分子の飽和吸着量が反応測定を行う濃度、温度、水素イオン濃度条件の下で１×１０-1pmol／cm2 以下であって、血清を使用する場合には通常１〜１０倍に希釈した血清を用いるため、該血清濃度に於いて血清中に含まれている分子の内、分析に関与及び／又は影響を与える分子の飽和吸着量について反応測定を行う温度、水素イオン濃度条件の下で常に１×１０-1pmol／cm2 以下であればよい。
Therefore, a container in which molecules used for analysis are not adsorbed at all is ideal, but a sufficient effect can be obtained by substantially reducing the adsorption amount to 1/10 to 1/100 of the current amount.
In other words, the amount of molecules adsorbed in the solution varies depending on the type and temperature of the molecules, the solution concentration, the pH of the solvent, etc., but as a reaction vessel, the saturated adsorption amount of the molecules used for the analysis is the concentration, temperature, Under the condition of hydrogen ion concentration, it is 1 × 10 −1 pmol / cm 2 or less. When using serum, serum diluted usually 1 to 10 times is used. If the saturation adsorption amount of molecules involved in and / or influence the analysis among the contained molecules is always 1 × 10 −1 pmol / cm 2 or less under the temperature and hydrogen ion concentration conditions Good.
同様に保存、希釈に用いる容器についても保存、希釈に使用する分子の飽和吸着量は保存容器から試薬を取り出す、又は希釈を行う濃度、温度、水素イオン濃度の下で常に１×１０-1pmol／cm2 以下であればよい。尚、試薬の保存は−８０℃といった低温で行われる場合も多いが、吸着は平衡反応であるため保存容器から試薬を取り出す際の濃度、温度、水素イオン濃度における飽和吸着量が１×１０-1pmol／cm2 以下であればよい。 Similarly, for containers used for storage and dilution, the saturated adsorption amount of molecules used for storage and dilution is always 1 × 10 −1 pmol under the concentration, temperature and hydrogen ion concentration at which the reagent is removed from the storage container or diluted. / Cm 2 or less is sufficient. In many cases, the reagent is stored at a low temperature of −80 ° C. However, since the adsorption is an equilibrium reaction, the saturated adsorption amount at the concentration, temperature, and hydrogen ion concentration when the reagent is removed from the storage container is 1 × 10 −3. It may be 1 pmol / cm 2 or less.
より好ましい飽和吸着量は１×１０-2pmol／cm2 以下であり、特に好ましくは１×１０-3pmol／cm2 以下である。
なお、ここで分析に用いられる分子としては、蛋白（酵素、生理活性蛋白、抗体など）、核酸、生理活性物質などが挙げられるが、蛋白が特に好ましい。また、飽和吸着量は、金コロイド標識免疫分析法によって測定することができる。
A more preferable saturated adsorption amount is 1 × 10 −2 pmol / cm 2 or less, and particularly preferably 1 × 10 −3 pmol / cm 2 or less.
In addition, as a molecule | numerator used for an analysis here, protein (an enzyme, bioactive protein, an antibody, etc.), a nucleic acid, a bioactive substance, etc. are mentioned, However, Protein is especially preferable. The saturated adsorption amount can be measured by colloidal gold labeled immunoassay.
本発明は蛋白が吸着しないという点で、前に述べた特徴以外に大きな効果を有する。通常、蛋白質は吸着を起こすと構造が変化してしまい、免疫分析に於いては目的とする蛋白が測定系に存在しているにも係わらず構造変化のために検出するための抗体に検知されない場合がある。また、臨床検査等に於いては生体内に存在する状態での血清を検査する必要があるにも係わらず、実際は吸着により構造変化を起こした状態での検査を余儀なくされている。本発明においては蛋白が吸着しない事により構造変化を起こすことなく、臨床検査に於いては血清をより生体内で存在している状態と近い状態で測定出来る。このメリットは免疫分析用容器としては非常に大きい。 The present invention has a great effect in addition to the features described above in that no protein is adsorbed. Normally, the structure of a protein changes when it is adsorbed. In immunoassay, the target protein is present in the measurement system, but it is not detected by the antibody for detection due to the structural change. There is a case. In addition, in clinical examinations and the like, it is necessary to examine serum in a state where it exists in a living body, but in actuality, examination in a state where structural changes have occurred due to adsorption is unavoidable. In the present invention, serum can be measured in a state closer to that in vivo in clinical tests without causing structural changes due to the absence of protein adsorption. This merit is very large as a container for immunoassay.
免疫分析用容器のうち、飽和吸着量を低下させることが必要なのは、試薬や検体と接触する部分であり、具体的には容器の内面である。従って、少なくとも容器の内面の飽和吸着量が１×１０-1pmol／cm2 以下であればよい。
容器の内面における分子の飽和吸着量を１×１０-1pmol／cm2 以下にするには、少なくとも容器の内面を高い親水性を有するポリマー又は高い疎水性を有するポリマーで成形するか、高い親水性を有するポリマー又は高い疎水性を有するポリマーで被覆するのが好ましい。このうち、少なくとも容器の内面を高い親水性を有するポリマー又は高い疎水性を有するポリマーで被覆するのがより好ましく、高い親水性を有するポリマーで被覆するのがさらに好ましく、超親水性ポリマーで被覆するのが特に好ましい。
Among the immunoanalytical containers, it is necessary to reduce the saturated adsorption amount at a portion that comes into contact with a reagent or a specimen, specifically, the inner surface of the container. Therefore, at least the saturated adsorption amount on the inner surface of the container should be 1 × 10 −1 pmol / cm 2 or less.
In order to reduce the saturated adsorption amount of molecules on the inner surface of the container to 1 × 10 −1 pmol / cm 2 or less, at least the inner surface of the container is molded with a polymer having high hydrophilicity or a polymer having high hydrophobicity, or high hydrophilicity. It is preferable to coat with a polymer having a property or a polymer having a high hydrophobicity. Of these, at least the inner surface of the container is more preferably coated with a highly hydrophilic polymer or a highly hydrophobic polymer, more preferably with a highly hydrophilic polymer, and with a superhydrophilic polymer. Is particularly preferred.
高い疎水性を有するポリマーの例としては、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）等のフッ素樹脂又はケイ素樹脂等が挙げられる。また、疎水性ポリマーで被覆する手段としては、上記疎水性ポリマーを用いて被覆してもよいが、容器をフッ素化することにより表面にフッ素化ポリマーを形成させてもよい。 Examples of the polymer having high hydrophobicity include fluorine resins such as polytetrafluoroethylene (PTFE) or silicon resins. Further, as a means for coating with a hydrophobic polymer, the hydrophobic polymer may be used for coating, but the container may be fluorinated to form a fluorinated polymer on the surface.
高い親水性を有するポリマーとしては、カルボキシル基、水酸基などの親水基を有するポリマーであれば特に限定されないが、ポリメタクリル酸、（メタ）メタクリル酸−アルキルメタアクリレート共重合体、ポリヒドロキシアルキルメタクリレート（例えばポリヒドロキシエチルメタクリレート）、ヒドロキシアルキルメタクリレート−アルキルメタクリレート共重合体、ポリオキシアルキレン基含有メタクリレート重合体又はこれを含む共重合体、ポリビニルピロリドン、エチレン−ビニルアルコール共重合体、（２−メタクリロイルオキシエチルホスホコリン）重合体（ＭＰＣ）又はこれを含む共重合体（生体材料，Ｖｏｌ．９，Ｎｏ．６，１９９１）又はリン脂質・高分子複合体（特開平５−１６１４９１号公報及び特開平６−４６８３１号公報）などが挙げられる。これらの親水性ポリマーで容器を成形してもよく、これらの親水性ポリマーを被覆してもよい。 The polymer having high hydrophilicity is not particularly limited as long as it is a polymer having a hydrophilic group such as a carboxyl group or a hydroxyl group, but polymethacrylic acid, (meth) methacrylic acid-alkyl methacrylate copolymer, polyhydroxyalkyl methacrylate ( For example, polyhydroxyethyl methacrylate), hydroxyalkyl methacrylate-alkyl methacrylate copolymer, polyoxyalkylene group-containing methacrylate polymer or a copolymer containing the same, polyvinyl pyrrolidone, ethylene-vinyl alcohol copolymer, (2-methacryloyloxyethyl) Phosphocholine) polymer (MPC) or a copolymer (Biomaterial, Vol. 9, No. 6, 1991) or a phospholipid / polymer complex (Japanese Patent Laid-Open Nos. 5-161491 and 6-6-1) 46 31 No.), and the like. Containers may be formed with these hydrophilic polymers, and these hydrophilic polymers may be coated.
また、一度ポリスチレン等の成形に適した材料で成形した容器の表面に水酸基、カルボキシル基を導入して高い親水性を付与することで低吸着性とすることも出来る。例えば、成形性を重視してポリスチレン、ポリプロピレンの様に非特異的吸着の起こりやすい材料を使用する場合には、プラズマ暴露によるカルボキシル基、カルボニル基及び／又は水酸基の導入、透明性を重視してポリメチルメタクリレートを使用する場合であればアルカリによる表面部分加水分解でカルボキシル基を導入する等の表面改質により低吸着性の表面を実現することが出来る。 Moreover, it can also be made low adsorptive by introducing a hydroxyl group and a carboxyl group to the surface of a container once molded with a material suitable for molding such as polystyrene to impart high hydrophilicity. For example, when emphasizing moldability and using materials that tend to cause nonspecific adsorption, such as polystyrene and polypropylene, the introduction of carboxyl groups, carbonyl groups and / or hydroxyl groups by plasma exposure, and transparency are emphasized. If polymethyl methacrylate is used, a surface having low adsorptivity can be realized by surface modification such as introduction of a carboxyl group by surface partial hydrolysis with alkali.
親水性ポリマーを用いて容器内面を親水性表面とすることにより分子の吸着量を低下させる場合、該表面の水との接触角は、３０度以下（高い親水性）とするのが好ましく、１５度以下とするのがより好ましく、１度以下（超親水性）とするのが更に好ましい。 When reducing the amount of adsorbed molecules by making the inner surface of the container a hydrophilic surface using a hydrophilic polymer, the contact angle of the surface with water is preferably 30 degrees or less (high hydrophilicity), 15 It is more preferable that the temperature be 1 degree or less, and it is even more preferable to be 1 degree or less (super hydrophilicity).
前記の親水性ポリマーのうち、ポリヒドロキシアルキルメタクリレート、ポリオキシＣ2−Ｃ4アルキレン基含有メタクリレート重合体又はこれを含む共重合体、（２−メタクリロイルオキシエチルホスホコリン）重合体又はこれを含む共重合体、リン脂質・高分子複合体、あるいはポリビニルピロリドンを用いると、得られた容器表面の水との接触角が１度以下の超親水性となり、蛋白の飽和吸着量が１×１０-3pmol／cm2 以下となるため、特に好ましい。 Among the hydrophilic polymers, polyhydroxyalkyl methacrylate, polyoxy C 2 -C 4 alkylene group-containing methacrylate polymer or a copolymer containing the same, (2-methacryloyloxyethylphosphocholine) polymer or a copolymer containing the same When a polymer, a phospholipid / polymer complex, or polyvinylpyrrolidone is used, the contact angle with water on the surface of the obtained container becomes superhydrophilic with 1 ° or less, and the saturated adsorption amount of protein is 1 × 10 −3 pmol. / Cm 2 or less, which is particularly preferable.
本発明の容器の形状としては従来用いられているサンプルチューブ、遠沈管、マルチウェルプレート、キュベット等特に限定するものではないが、サンプルの保存、希釈、反応、測定を１種類の容器で行う目的にはマルチウェルプレートの形状が好適である。 The shape of the container of the present invention is not particularly limited, such as a conventionally used sample tube, centrifuge tube, multiwell plate, cuvette, etc. The purpose of storing, diluting, reacting, and measuring a sample in one kind of container For this, the shape of a multiwell plate is suitable.
次に実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれに何ら限定されるものではない。 EXAMPLES Next, although an Example is given and this invention is demonstrated in detail, this invention is not limited to this at all.
（実施例１）
市販のポリプロピレン製９６穴プレート（住友ベークライト製ＭＳ−３３９６Ｐ）をγ線７０ｋＧｙでの処理を行い、基材表面に水酸基を生成させたものを実施例１とした。得られたプレートの蛋白飽和吸着量は４．６×１０-2pmol／cm2 であり、水との接触角は２７度であった。
(Example 1)
A commercially available 96-well plate made of polypropylene (MS-3396P manufactured by Sumitomo Bakelite) was treated with γ-rays of 70 kGy to produce hydroxyl groups on the surface of the substrate as Example 1. The protein saturated adsorption amount of the obtained plate was 4.6 × 10 −2 pmol / cm 2 , and the contact angle with water was 27 degrees.
（実施例２）
市販のポリプロピレン製９６穴プレート（住友ベークライト製ＭＳ−３３９６Ｐ）に市販のフッ素コート剤（住友３Ｍ製 スコッチガード）で表面をフッ素コートしたものを実施例２とした。得られたプレートの蛋白飽和吸着量は２．７×１０-2pmol／cm2 であり、水との接触角は１２６度であった。
(Example 2)
A commercially available 96-well plate made of polypropylene (MS-3396P made by Sumitomo Bakelite) was fluorine coated on the surface with a commercially available fluorine coating agent (Scotch guard made by Sumitomo 3M). The obtained plate had a saturated protein adsorption of 2.7 × 10 −2 pmol / cm 2 and a contact angle with water of 126 degrees.
（比較例１）
市販のポリプロピレン製９６穴プレート（住友ベークライト製 ＭＳ−３３９６Ｐ）を比較例として用いた。このプレートの蛋白飽和吸着量は３．７pmol／cm2 であり、水との接触角は９２度であった。
(Comparative Example 1)
A commercially available 96-well polypropylene plate (MS-3396P, manufactured by Sumitomo Bakelite) was used as a comparative example. The protein saturated adsorption amount of this plate was 3.7 pmol / cm 2 , and the contact angle with water was 92 degrees.
（保存容器としての蛋白回収率の比較）
非特異的吸着性を比較するため、酵素で標識した抗ウシアルブミン抗体（コスモバイオ製）を０．１ng／mL、１ng／mL、１０ng／mL、１００ng／mLの濃度系列で、各濃度を２４ウェルづつ分注し、−８０℃で４８時間保存、保存後の溶液中の蛋白濃度を基質溶液を用いて測定した。
結果は、図１の通りで、実施例１、実施例２のプレートとともに比較例１に比べ蛋白回収率が高い事を確認した。
(Comparison of protein recovery rate as storage container)
In order to compare nonspecific adsorptivity, an enzyme-labeled anti-bovine albumin antibody (manufactured by Cosmo Bio) was used in a concentration series of 0.1 ng / mL, 1 ng / mL, 10 ng / mL, and 100 ng / mL, and each concentration was 24. Each well was dispensed and stored at −80 ° C. for 48 hours, and the protein concentration in the solution after storage was measured using the substrate solution.
The results are as shown in FIG. 1 and confirmed that the protein recovery rate was higher than that of Comparative Example 1 together with the plates of Examples 1 and 2.
（溶液中の反応効率の比較）
溶液中の反応における反応効率を評価するために、実施例１、実施例２、比較例１を反応容器として用い、以下の検討を実施した。
ラットアルブミン（コスモバイオ製）のリン酸塩緩衝液（ダルベッコＰＢＳpH７．４）溶液を１０ng／mL、１ng／mL、０．１ng／mLの濃度系列で調整し、実施例１、実施例２、比較例１のプレートに各濃度４列（３２ウェル）づつ１００μl／ウェルで分注。
そこに、ペルオキシダーゼ標識抗ラットアルブミン抗体（コスモバイオ製）の１００ng／mLリン酸塩緩衝液（ダルベッコＰＢＳpH７．４）溶液を全てのウェルに１００μl／ウェルで分注。
３７℃で３０分反応させた後に、各ウェルの溶液を予め抗ラットアルブミン抗体を固相化しておいたＥＬＩＳＡ用９６穴プレートに移し替えた後再び３７℃で３０分反応させた。
(Comparison of reaction efficiency in solution)
In order to evaluate the reaction efficiency in the reaction in the solution, Example 1, Example 2, and Comparative Example 1 were used as reaction containers, and the following examination was performed.
Rat albumin (manufactured by Cosmo Bio) was adjusted to a phosphate buffer solution (Dulbecco PBS pH 7.4) in a concentration series of 10 ng / mL, 1 ng / mL, and 0.1 ng / mL. Dispense 4 rows (32 wells) at 100 μl / well into the plate of Example 1.
Then, a 100 ng / mL phosphate buffer solution (Dulbecco PBS pH 7.4) solution of peroxidase-labeled anti-rat albumin antibody (manufactured by Cosmo Bio) was dispensed to all wells at 100 μl / well.
After reacting at 37 ° C. for 30 minutes, the solution in each well was transferred to a 96-well plate for ELISA in which an anti-rat albumin antibody was immobilized in advance, and then reacted again at 37 ° C. for 30 minutes.
反応後、洗浄液（ダルベッコＰＢＳpH７．４＋０．０５％Tween・２０）にて未反応の標識抗ラットアルブミン抗体を洗浄した後、市販のペルオキシダーゼ用発色キット（住友ベークライト製 ＭＬ−１１２０Ｔ）を用いて発色、プレートリーダーにより４５０nmの吸光度を測定した。
結果は図２の通りで、比較例１においては低濃度領域での吸光度が低く吸着により溶液中での反応が阻害されているといえるが、実施例においては１、２共に低濃度領域でのアルブミン濃度に対する吸光度値に直線性が得られ、溶液中での抗原−抗体反応が効率よく行われていることが解る。
After the reaction, the unreacted labeled anti-rat albumin antibody was washed with a washing solution (Dulbecco PBS pH 7.4 + 0.05% Tween · 20), and then developed using a commercially available color kit for peroxidase (ML-1120T manufactured by Sumitomo Bakelite). Absorbance at 450 nm was measured with a plate reader.
The results are as shown in FIG. 2. In Comparative Example 1, it can be said that the absorbance in the low concentration region is low and the reaction in the solution is inhibited by adsorption. It is understood that linearity is obtained in the absorbance value with respect to the albumin concentration, and the antigen-antibody reaction in the solution is efficiently performed.
（実施例３）
市販のポリスチレン製チューブ（栄研チューブ ＲＩＡ用３号 ７０−１２４５８）の表面にポリ−ヒドロキシエチルメタクリレート（ＳＩＧＭＡ製 Ｐ−３９３２）をコーティングしたものを実施例１とした。チューブの蛋白飽和吸着量は９．１×１０-4pmol／cm2 であり、水との接触角は０度であった。
(Example 3)
Example 1 was obtained by coating the surface of a commercially available polystyrene tube (Eiken tube RIA No. 3 70-12458) with poly-hydroxyethyl methacrylate (P-3932 made by SIGMA). The protein saturated adsorption amount of the tube was 9.1 × 10 −4 pmol / cm 2 , and the contact angle with water was 0 degree.
（実施例４）
ポリテトラフルオロエチレンを切削し、実施例１で用いたチューブと同じ内径、容積のチューブを作製し実施例２とした。チューブの蛋白飽和吸着量は７．２×１０-3pmol／cm2 であり、水との接触角は１２６度であった。
Example 4
Polytetrafluoroethylene was cut, and a tube having the same inner diameter and volume as the tube used in Example 1 was produced as Example 2. The protein saturated adsorption amount of the tube was 7.2 × 10 −3 pmol / cm 2 , and the contact angle with water was 126 degrees.
（比較例２）
市販のポリスチレン製チューブ（栄研チューブ ＲＩＡ用３号 ７０−１２４５８）を比較例２として用いた。チューブの蛋白飽和吸着量は８．１pmol／cm2 であり、水との接触角は８５度であった。
(Comparative Example 2)
A commercially available polystyrene tube (Eiken tube RIA No. 3 70-12458) was used as Comparative Example 2. The protein saturated adsorption amount of the tube was 8.1 pmol / cm 2 , and the contact angle with water was 85 degrees.
（測定感度の比較）
溶液中の反応における測定感度を評価するために、実施例３、４及び比較例２を反応容器として用い、反応担体としてＥＬＩＳＡボールを用いた測定を実施した。
予め、０．１２５、０．２５０、０．５００μｇ／mLの濃度系列で調整したビオチンヒドラジド（Dojindo製）のリン酸緩衝液（pH７．４）溶液を用いてＥＬＩＳＡボール（住友ベークライト製 アミノ基ボール）にビオチンヒドラジドをグルタルアルデヒドを介して共有結合により固相化し、３段階のビオチンヒドラジド固相化密度のＥＬＩＳＡボールを作製した。
尚、ＥＬＩＳＡボールの固相化されたビオチンヒドラジド以外の箇所については、スキムミルクにてブロッキングを行い吸着を防止した。
(Comparison of measurement sensitivity)
In order to evaluate the measurement sensitivity in the reaction in the solution, Examples 3 and 4 and Comparative Example 2 were used as reaction containers, and measurement was performed using an ELISA ball as a reaction carrier.
An ELISA ball (amino group ball manufactured by Sumitomo Bakelite) using a phosphate buffer solution (pH 7.4) of biotin hydrazide (manufactured by Dojindo) previously adjusted in a concentration series of 0.125, 0.250, 0.500 μg / mL. The biotin hydrazide was solid-phased by covalent bonding via glutaraldehyde to prepare an ELISA ball having a three-stage biotin hydrazide solid-phase density.
The portions other than the biotin hydrazide immobilized on the ELISA balls were blocked with skim milk to prevent adsorption.
実施例３、４及び比較例２のチューブ各３本に該３段階のビオチンヒドラジド固相化密度のＥＬＩＳＡボールを入れ、ペルオキシダーゼ標識アビジン（Cappel社製）の１μｇ／mLリン酸緩衝液（pH７．４）溶液を５００mL／チューブで分注し、室温で３０分反応させた。
反応後、洗浄液（リン酸緩衝液pH７．４＋０．０５％Tween・２０）で洗浄し、未反応のペルオキシダーゼ標識アビジンを洗浄した後、市販のペルオキシダーゼ用発色キット（住友ベークライト製 ＭＬ−１１２０Ｔ）を用いて発色、プレートリーダーにより４５０nmの吸光度を測定した。
結果は表１の通りで、実施例においてはＥＬＩＳＡボール表面に導入されたビオチンヒドラジド密度に応じて吸光度も直線的に変化しているのに比べ、比較例においては、全ての密度で吸光度に殆ど変化は見られない。
つまり、実施例に於いては、ＥＬＩＳＡボール表面に導入されたビオチンヒドラジドに対してのみペルオキシダーゼ標識アビジンが反応しており、その結果吸光度はビオチンヒドラジド密度と比例しているが、比較例に於いては、吸着によりチューブに残留したペルオキシダーゼ標識アビジンが、バックグラウンドとなって感度が低下したためと考えられる。
In each of the three tubes of Examples 3 and 4 and Comparative Example 2, the three-stage biotin hydrazide immobilized density ELISA balls were placed, and 1 μg / mL phosphate buffer (pH 7.) of peroxidase-labeled avidin (manufactured by Cappel). 4) The solution was dispensed at 500 mL / tube and reacted at room temperature for 30 minutes.
After the reaction, the plate is washed with a washing solution (phosphate buffer pH 7.4 + 0.05% Tween · 20), unreacted peroxidase-labeled avidin is washed, and then a commercially available color kit for peroxidase (ML-1120T manufactured by Sumitomo Bakelite) is used. The color was developed, and the absorbance at 450 nm was measured with a plate reader.
The results are as shown in Table 1. In the comparative example, the absorbance changes linearly according to the density of biotin hydrazide introduced on the surface of the ELISA ball. There is no change.
That is, in the examples, peroxidase-labeled avidin reacts only with biotin hydrazide introduced on the ELISA ball surface, and as a result, the absorbance is proportional to the biotin hydrazide density. This is probably because peroxidase-labeled avidin remaining in the tube by adsorption became background and the sensitivity decreased.
（保存容器としての蛋白回収率の比較）
非特異的吸着性を比較するため、酵素で標識した抗ウシアルブミン抗体（コスモバイオ製）を０．１ng／mL、１ng／mL、１０ng／mL、１００ng／mLの濃度系列で、各濃度を２４ウェルづつ分注し、−８０℃で４８時間保存し、保存後の溶液中の蛋白濃度を基質溶液を用いて測定した。
結果は、表２の通りで、実施例３及び４のプレートとともに比較例２に比べ蛋白回収率が高い事を確認した。
(Comparison of protein recovery rate as storage container)
In order to compare nonspecific adsorptivity, an enzyme-labeled anti-bovine albumin antibody (manufactured by Cosmo Bio) was used in a concentration series of 0.1 ng / mL, 1 ng / mL, 10 ng / mL, and 100 ng / mL, and each concentration was 24. Each well was dispensed and stored at −80 ° C. for 48 hours, and the protein concentration in the stored solution was measured using the substrate solution.
The results are shown in Table 2. It was confirmed that the protein recovery rate was higher than that of Comparative Example 2 together with the plates of Examples 3 and 4.
（実施例５）
市販のポリスチレン製チューブ（栄研チューブ ＲＩＡ用３号 ７０−１２４５８）の表面にポリ−ヒドロキシエチルメタクリレート（ＳＩＧＭＡ製Ｐ−３９３２）の２．０wt／vol％メタノール溶液を２．５mLづつ分注し、溶液を排出後、残留した溶液が底面に溜まらないように裏返した状態で、室温で２４時間乾燥させる事でポリ−ヒドロキシエチルメタクリレートを表面にコーティングしたチューブを作製した。得られたチューブの蛋白飽和吸着量は８．７×１０-4pmol／cm2 であり、水との接触角は０度であった。
(Example 5)
Dispense 2.5 mL of a 2.0 wt / vol% methanol solution of poly-hydroxyethyl methacrylate (SIGMA P-3932) onto the surface of a commercially available polystyrene tube (Eiken tube RIA No. 3 70-12458), After discharging the solution, the tube was coated with poly-hydroxyethyl methacrylate on the surface by drying for 24 hours at room temperature with the remaining solution turned upside down so as not to accumulate on the bottom surface. The amount of protein saturated adsorption of the obtained tube was 8.7 × 10 −4 pmol / cm 2 , and the contact angle with water was 0 degree.
（実施例６）
市販のポリスチレン製チューブ（栄研チューブ ＲＩＡ用３号 ７０−１２４５８）の表面にＭＰＣポリマーの０．５wt／vol％エタノール溶液を２．５mLづつ分注し、室温で１０分間放置した後に溶液を排出し、残留した溶液が底面に溜まらないように裏返した状態で、室温で一晩乾燥させてＭＰＣポリマーを表面にコーティングしたチューブを作製した。得られたチューブの蛋白飽和吸着量は６．５×１０-4pmol／cm2 であり、水との接触角は０度であった。
(Example 6)
Dispense 2.5 mL of 0.5 wt / vol% ethanol solution of MPC polymer onto the surface of a commercially available polystyrene tube (Eiken tube RIA No.3 70-12458), leave it at room temperature for 10 minutes, and discharge the solution. Then, in a state where the remaining solution was turned over so that it did not accumulate on the bottom surface, the tube was dried overnight at room temperature to produce a tube coated with MPC polymer on the surface. The amount of protein saturated adsorption of the obtained tube was 6.5 × 10 −4 pmol / cm 2 , and the contact angle with water was 0 degree.
尚、ＭＰＣポリマーの合成は、「リン脂質類似構造を有するハイドロゲル膜からの薬物放出高分子論文集，４６，５９１−５９５（１９８９）」の内容に従いＭＰＣとＢＭＡ（ブチルメタクリレート）比＝３／７の共重合体を作製し使用した。 The MPC polymer was synthesized according to the content of “Papers of Drug Release Polymers from Hydrogel Membranes Having a Phospholipid-like Structure, 46, 591-595 (1989)” ratio of MPC to BMA (butyl methacrylate) = 3 / A copolymer of 7 was prepared and used.
（比較例３）
市販のポリスチレン製チューブ（栄研チューブ ＲＩＡ用３号 ７０−１２４５８）をそのままで用いた。
(Comparative Example 3)
A commercially available polystyrene tube (Eiken Tube RIA No. 3 70-12458) was used as it was.
（測定感度の比較）
溶液中の反応における測定感度を評価するために、実施例５、実施例６及び比較例３の各チューブを反応容器として用い、反応担体としてＥＬＩＳＡボール（住友ベークライト製 アミノ基ボール）を用いた測定を実施した。
(Comparison of measurement sensitivity)
In order to evaluate the measurement sensitivity in the reaction in the solution, each tube of Example 5, Example 6 and Comparative Example 3 was used as a reaction vessel, and measurement was performed using an ELISA ball (amino group ball manufactured by Sumitomo Bakelite) as a reaction carrier. Carried out.
予め、０．１２５、０．２５０、０．５００μｇ／mLの濃度系列で調整したビオチンヒドラジド（Dojindo製）のリン酸緩衝液（pH７．４）溶液を用いてＥＬＩＳＡボールにビオチンヒドラジドをグルタルアルデヒドを介して共有結合により固相化し、３段階のビオチンヒドラジド固相化密度のＥＬＩＳＡボールを作製した。
尚、ＥＬＩＳＡボールの固相化されたビオチンヒドラジド以外の箇所については、スキムミルクにてブロッキングを行い吸着を防止した。
Use biotin hydrazide (manufactured by Dojindo) adjusted in a concentration series of 0.125, 0.250, and 0.500 μg / mL in a phosphate buffer (pH 7.4) solution, and then add biotin hydrazide to glutaraldehyde in an ELISA ball. Then, it was immobilized by covalent bonding to produce an ELISA ball having a three-stage biotin hydrazide solid phase density.
The portions other than the biotin hydrazide immobilized on the ELISA balls were blocked with skim milk to prevent adsorption.
実施例５、実施例６及び比較例３のチューブ３本に３段階のビオチンヒドラジド固相化密度のＥＬＩＳＡボールを入れ、ペルオキシダーゼ標識アビジン（Cappel社製）の１μｇ／mLリン酸緩衝液（pH７．４）溶液を５００mL／チューブで分注し、室温で３０分反応させた。 Three steps of biotin hydrazide immobilized density ELISA balls were placed in three tubes of Example 5, Example 6 and Comparative Example 3, and 1 μg / mL phosphate buffer (pH 7.) of peroxidase-labeled avidin (manufactured by Cappel). 4) The solution was dispensed at 500 mL / tube and reacted at room temperature for 30 minutes.
反応後、洗浄液（リン酸緩衝液pH７．４＋０．０５％Tween・２０）で洗浄し、未反応のペルオキシダーゼ標識アビジンを洗浄した後、市販のペルオキシダーゼ用発色キット（住友ベークライト製 ＭＬ−１１２０Ｔ）を用いて発色、プレートリーダーにより４５０nmの吸光度を測定した。 After the reaction, the plate is washed with a washing solution (phosphate buffer pH 7.4 + 0.05% Tween · 20) to wash unreacted peroxidase-labeled avidin, and then a commercially available peroxidase coloring kit (ML-1120T manufactured by Sumitomo Bakelite) is used. The color was developed, and the absorbance at 450 nm was measured with a plate reader.
結果は表３の通りで、実施例においてはＥＬＩＳＡボール表面に導入されたビオチンヒドラジド密度に応じて吸光度も直線的に変化しているのに比べ、比較例においては、全ての密度で吸光度に殆ど変化は見られない。
つまり、実施例では、ＥＬＩＳＡボール表面に導入されたビオチンヒドラジドに対してのみペルオキシダーゼ標識アビジンが反応しており、その結果吸光度はビオチンヒドラジド密度と比例しているが、比較例では、吸着によりチューブに残留したペルオキシダーゼ標識アビジンが、バックグラウンドとなって感度が低下したためと考えられる。
The results are as shown in Table 3. In the examples, the absorbance also changes linearly according to the density of biotin hydrazide introduced on the ELISA ball surface. There is no change.
That is, in the examples, peroxidase-labeled avidin reacts only with biotin hydrazide introduced on the ELISA ball surface, and as a result, the absorbance is proportional to the biotin hydrazide density. This is probably because the remaining peroxidase-labeled avidin became a background and the sensitivity decreased.
（保存容器としての蛋白回収率の比較）
非特異的吸着性を比較するため、酵素で標識した抗ウシアルブミン抗体（コスモバイオ製）を０．１ng／mL、１ng／mL、１０ng／mL、１００ng／mLの濃度系列で、各濃度を２４ウェルづつ分注し、−８０℃で４８時間保存し、保存後の溶液中の蛋白濃度を基質溶液を用いて測定した。
結果は、表４の通りで、実施例５及び実施例６のプレートとともに比較例３に比べ蛋白回収率が高いことを確認した。
(Comparison of protein recovery rate as storage container)
In order to compare nonspecific adsorptivity, an enzyme-labeled anti-bovine albumin antibody (manufactured by Cosmo Bio) was used in a concentration series of 0.1 ng / mL, 1 ng / mL, 10 ng / mL, and 100 ng / mL. Each well was dispensed and stored at −80 ° C. for 48 hours, and the protein concentration in the stored solution was measured using the substrate solution.
The results are as shown in Table 4. It was confirmed that the protein recovery rate was higher than that of Comparative Example 3 together with the plates of Example 5 and Example 6.
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2004
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| WO2017204187A1 (en) * | 2016-05-24 | 2017-11-30 | 公益財団法人がん研究会 | Method of recovering extracellular vesicles and container for extracellular vesicles |
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