JP2005097316A - 核酸固定化方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】 単純かつ有効な核酸の固定化方法、この固定化を利用する核酸の検出方法、この方法で使用するための試薬および対応する試薬キットを提供すること。
【解決手段】 核酸を捕獲プローブと一緒にハイブリダイズすることによる核酸固定化方法であって、捕獲プローブが形成されたハイブリッドの酵素的伸長および/または酵素的分解に対して保護されることを特徴とする核酸固定化方法、この固定化を利用する核酸の検出方法、この方法で使用するための試薬および対応する試薬キット。
【選択図】なし
【解決手段】 核酸を捕獲プローブと一緒にハイブリダイズすることによる核酸固定化方法であって、捕獲プローブが形成されたハイブリッドの酵素的伸長および/または酵素的分解に対して保護されることを特徴とする核酸固定化方法、この固定化を利用する核酸の検出方法、この方法で使用するための試薬および対応する試薬キット。
【選択図】なし
Description
本発明は、核酸の固定化方法、この固定化を利用する核酸の検出方法、この方法で使用するための試薬および対応する試薬キットに関する。
核酸を検出する場合、ホモジーニアス(homogeneous)アッセイ法とヘテロジーニアス(heterogeneous)アッセイ法とに区別される。ホモジーニアスアッセイ法では、検出プローブおよび検出されるべき核酸が溶液中でアッセイされ、一方、ヘテロジーニアスアッセイ法では、検出されるべき核酸が固定化される。この固定化は、共有結合を介して核酸を固相に直接結合させるか、または親和性対の一方に核酸を結合させ、この対の残りの方を固相に結合させることによって行われる。
結合は、固相に結合され、かつ、検出されるべき核酸と少なくとも一部相補的であるいわゆる捕獲プローブ(capture probe)に核酸をハイブリダイズさせて該核酸を固定化させることによっても行われうる。捕獲プローブは、いずれかの望ましい手段で固相に結合される。ヘテロジーニアス法の長所は、標識された試薬成分が検出されるべき核酸から容易に分離されうることである。
検出されるべき核酸が捕獲プローブを介して固定化される方法の例は、直接結合を開示している特許文献1および親和性対を介する結合を開示している特許文献2に開示されている。該特許文献に開示されているアッセイ方法の特徴は、検出されるべき核酸の、該検出されるべき核酸とハイブリダイズされうる捕獲プローブとのハイブリダイゼーションである。過剰の検出プローブを除去した後、捕獲プローブの標識化基を介して固相で、形成されたハイブリッドが検出される。
核酸診断薬に標的特異的増幅法を導入すると、他の場合にはめったに生じない核酸を多量に生じる可能性があった。増幅核酸中にジゴキシゲニン標識を取り込ませるこの種の方法は、特許文献3に開示されている。
EP−A−0 079 139
EP−A−0 192 168
WO 92/06216
本発明の目的は、特に単純かつ有効な固定化方法を提供することである。
本発明は、捕獲プローブが形成されたDNA/RNAハイブリッドの酵素的伸長および/または酵素的分解に対して保護されることを特徴とする、核酸を捕獲プローブとハイブリダイズさせることによる核酸固定化方法を提供するものである。
本発明は、また、この固定化方法による固定化およびこの目的に好適な試薬を利用する核酸の検出方法を提供するものである。
捕獲プローブは、他の核酸とハイブリダイズさせることができるか、あるいは、固定化される核酸である。固定化は、核酸を固相に結合させる手段である。これは、直接結合(固相の表面への捕獲プローブの共有結合)であっても、間接結合(イオン性、吸着性、または生物特異的結合)であってもよい。本発明では、好ましい核酸は、生物特異的対の相手で標識され、一方、固定化される核酸である。生物特異的対は、抗原/抗体、ハプテン/抗体、ビタミン/受容体、ホルモン/受容体、および糖/レクチンなどの組合せである。好ましい組合せは、ビオチン/アビジン、ビオチン/ストレプトアビジン、またはハプテン/抗体である。かかる標識核酸は、例えば、対応して標識された活性モノヌクレオシド誘導体を使用する化学的オリゴヌクレオチド合成によって、または、対応して標識されたモノヌクレオシド三リン酸の取込みを介する酵素合成によって、または完全に合成された核酸を化学的に修飾することによって製造されうる。
酵素的伸長は、生きている細胞中または活性酵素を含有するかかる細胞から誘導される流体中で生じるプロセスである。該プロセスは、核酸を伸長させるポリメラーゼなどの酵素によって引き起こされる。これらの伸長反応は、特に、対応する酵素を試料に添加して、増幅プロセスを行う場合、核酸の測定を有意に妨害する。
この伸長反応を抑制するために、本発明は、捕獲プローブを伸長に対して保護することを提案する。これは、伸長酵素の3'−または5'−末端への立体的接近を阻害する化学残基を結合させることによって行うことができる。これらの残基は、捕獲プローブの固定化核酸とのハイブリダイゼーションをしばしば阻害するか、または完全に予防するので、伸長が起こるヒドロキシル基を不活性基に置き換えるのが好ましい。
かかる基としては、例えば、水素またはC1〜C3アルキル基が挙げられ、好ましくは、水素である。したがって、それらの末端では、得られた捕獲プローブは、3'−または5'−デオキシリボヌクレオシド残基または2',3'−または2',5'−ジデオキシリボヌクレオシド残基を含有する。捕獲プローブの3'−末端は、保護されるべき好ましい末端である。
酵素的分解は、生物学的試料液における一般的な現象でもある。かかる分解は、DNAseまたはRNAseなどのエンド−またはエキソヌクレアーゼによって引き起こされる。これは、また、制限酵素も含む。例えば、RNAが固定化されるべき核酸として使用されるべきである場合、このRNAは、捕獲プローブとしてのDNAおよびRNAからなるハイブリッドが形成されるとすぐに、RNAseHによって分解させられる。これは、非修飾DNA捕獲プローブによる固定化が非常に無効果であるかまたは不可能であることを意味する。本発明は、捕獲プローブを修飾することによってこれを除外しようとするものであり、その結果、前記酵素は、もはや、捕獲プローブおよび検出されるべき核酸のハイブリッドを基質として認識しなくなった。
例えば2位での、捕獲プローブの糖残基の修飾は、非常に有効であることが証明された。RNAseHの存在下でのRNAの固定化についての特に好ましい組合せは、デオキシリボヌクレオチドの2'−ヒドロキシル基がO−アルキルまたはO−アルキレン基によって置き換えられているものである。特に好ましい組合せは、WO 91/15499に開示されている。
驚くべきことに、記載された指標を同時に使用することによって、RNA/DNA−ハイブリッドの酵素的分解および酵素的伸長に対して有効に核酸を保護することが可能である。修飾は、それらの効果および作用がお互いに負に影響しないように選択される。
捕獲プローブとしては、さらに修飾されていてもよいオリゴまたはポリヌクレオチドが挙げられる。しかしながら、この修飾は、ハイブリダイゼーションが固定化されるべき核酸と塩基対にさせることによって不可能になる可能性を排除しなければならない。
固定捕獲プローブは、固相に結合される核酸である。結合は、共有結合を形成することによって、または、パートナーの一方が捕獲プローブに結合し、他方が固相に結合する生物特異的結合を形成する2つのパートナー(例えば、ハプテン/抗体、ビタミン/レセプター、好ましくは、ビオチン/ストレプトアビジン)を介して生物特異的に行われうる。
固定化されうる捕獲プローブは、固相に結合していないが、前記固定捕獲プローブになりうる核酸である。これを行うためには、固定捕獲プローブは、固相との化学的反応能を有する残基(例えば、光活性化されうる残基)または生物特異的結合のパートナーを含有する。
可能な固相としては、キュベット、微量滴定プレートまたは粒子(例えば、プラスチック被覆磁気ビーズ)が挙げられる。
本発明の核酸固定化を行うためには、捕獲プローブを、固定化されるべき核酸を含有する試料と接触させる。ハイブリダイゼーションは、使用される核酸の長さおよび捕獲プローブに依存する条件下で行われる。当業者は、いくつかの実験で、例えば、融点を測定することによって、これらの条件を決定することができる。しかしながら、一般に、これらの条件は、捕獲プローブと同一の(非修飾の)ヌクレオチド配列を有する核酸に関する条件と異ならない。
使用される捕獲プローブが既に固定化された核酸である場合、捕獲プローブの核酸とのハイブリダイゼーションは、核酸の固定化と同時に起こる。所望により、固相で形成されたハイブリッドを、核酸を含有する液体から分離することができる。次いで、固相結合ハイブリッドを洗浄することができ、所望により、さらなる反応について利用可能である。
捕獲プローブが固定化されうるものである場合、ハイブリッド含有液体を、捕獲プローブ固定化能を有する固相と接触させる。これを行うためには、固相は、捕獲プローブを固定化させるために使用される基の結合相手を含有するのが好ましい。固定捕獲プローブを用いる場合、さらなるプロセシング工程が続く。
固定化されるべき核酸は、望ましい種類および望ましい起源のものであり得る。これらは、天然試料、例えば、体液または培養試料中で生じる核酸であるが、天然試料をプロセシングすることによって得られた試料中で生じる核酸であってもよい。故に、それらは、修飾されていても非修飾であってもよい。修飾は、核酸の配列、長さ、および/または化学構造に関することができる。好ましい場合、核酸は、核酸のコピーまたは試料中に初めから含有されていた核酸配列である。さらにまた、好ましいコピーは、初期核酸の一部のin vitro増殖によって生じる増幅産物である。特に好ましい増幅産物は、初期核酸での核酸の酵素的伸長によって鋳型として形成されるものである。かかるin vitro増幅の例としては、PCR、LCRまたはプロモーター制御増幅が挙げられる。
他の好ましい具体例では、核酸は、検出可能な基を取り込むことによって修飾される。この取込みは、酵素的または化学的反応を介して行われうる。酵素的反応は、それらが前記増幅の間に生じるので特に好ましい。この場合、伸長のために検出可能な修飾モノヌクレオシド三リン酸を使用することが特に好都合であることが証明された。好ましい方法では、次いで、全ての取り込まれていない検出可能な基を分離する。固定化されるべき核酸が検出されうるように修飾される場合、固定化された後、公知の方法で固相で検出することができる。故に、検出工程は、固定化工程に続く。本発明の別の課題は、本発明の固定化工程に次ぐ固定ハイブリッドの検出を使用する核酸検出方法である。特に好ましい方法では、検出可能な基は、固定核酸で測定される。
検出可能な基は、直接または間接的に検出可能な基である。直接検出可能な基としては、例えば、放射性(32P)基、有色基または蛍光性基または金属原子が挙げられる。間接的に検出可能な基としては、例えば、抗体、抗原、ハプテンまたは酵素または酵素学的に活性な部分酵素などの免疫学的または酵素学的に有効な化合物が挙げられる。それらは、次反応または反応のシーケンスで検出可能である。ハプテンは、それらが一般にポリメラーゼの基質として標識ヌクレオシド三リン酸と一緒に良く供され、ハプテンまたはハプテン化ヌクレオシドに対する標識抗体との次反応が容易に行われうるので特に好ましい。かかるヌクレオシド三リン酸は、例えば、臭素−ヌクレオシド三リン酸またはジゴキシゲニン、ジゴキシン−またはフルオレセイン結合ヌクレオシド三リン酸である。EP−A−0 324 474に開示されているステロイドおよびその検出は、特に好適であることが証明された。
本発明の方法の第1の具体例では、検出されるべき核酸は、それにハイブリダイズされる検出プローブを介して検出される。この検出プローブは、検出されるべき核酸のセグメントにハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を有する。該セグメントは、捕獲プローブがハイブリダイズするものと異なる。結果は、捕獲プローブ、検出されるべき核酸および検出プローブからなる、いわゆるサンドイッチハイブリッドである。これら3つの核酸のハイブリダイゼーション配列は、主に、自由に選択され得る。好ましい方法では、サンドイッチ形成は、実質的に同時に生じる。特に好ましいサンドイッチ試験の具体例では、検出されるべき核酸を含有する試料に捕獲プローブを添加する。次いで、検出されるべき核酸またはその一部を増幅させ、次に、検出プローブの助けによって、ハイブリダイゼーション条件下で形成されたハイブリッドを検出する。捕獲プローブによくあることであるが、酵素的伸長/分解に対して検出プローブを同様に保護すること、および増幅の前または間にそれを添加することも可能である。
好ましい具体例では、検出されるべき核酸は、検出可能な標識ヌクレオチド、特に、モノヌクレオチドを酵素的に取り込みつつ、固相に固定化される捕獲プローブの存在下で増幅される。過剰のモノヌクレオチドの可能な分離後、取り込まれた検出可能なヌクレオチドの量を介して、固相に固定化された核酸を測定する。特に好ましい本発明に係る増幅は、EP−A−0 329 822に開示されている方法である。本発明方法の特に優れている点は、固定化されるべきRNA(転写物)が捕獲プローブおよびRNAのハイブリッドによって分解に対して保護されるように捕獲物を修飾することである。
固定化可能な捕獲プローブを使用する場合、本発明は、2つの具体例を有する。第1の具体例では、検出されるべき核酸を固定化可能な捕獲プローブおよび検出可能な標識モノヌクレオチドの存在下で増幅させる。全ての公知の増幅方法を使用することができる。好ましい方法は、サイクルの間に変性させる熱サイクルを用いるポリメラーゼ連鎖反応(EP−B−0 201 184)である:該増幅反応は、所望の容器中で行うことができる。次いで、反応混合物を、固相に固定化可能な捕獲プローブを固定化させることができる容器に移す。過剰のモノヌクレオシドを分離し、検出されるべき核酸の存在についての指標として固相の標識を使用するのが好ましい。
第2の好ましい具体例では、増幅反応は、すでに、固定化可能な核酸を内壁に結合させることができる容器中で生じる。これは、増幅混合物を別の容器中に移すことは、もはや必要ではないという点で優れている。熱循環的に制御された増幅反応、例えば、PCRまたはLCRを使用する場合、本発明は、同様のコーティングを有する熱安定容器を使用することを提案する。
該反応容器がすでにハイブリッドを検出するのに好適であることを条件とし、直接標識を使用する場合、該反応は、試薬を添加せずに、増幅の開始から検出の最後まで制御されうる。
現在公知の方法は、増幅法の後に、反応混合物がプローブを添加するための環境に曝露されなければならないという欠点(汚染)を有する。プローブが増幅試薬と一緒に添加される場合、該方法は、好都合には、あまりピペッティング工程を必要とせず、次に、反応容器を増幅および試薬(例えば、捕獲プローブ)の添加後に再度開放してはならない。この特徴は、標識を検出するために試薬の添加を必要としない直接標識を用いる方法について特に好都合である。かかる場合、例えば、エレクトロケミルミネセンス標識の場合、増幅の開始からアナライト依存性シグナルの測定まで試薬を添加しない。しかしながら、試薬の添加は、いつでも可能である。
本発明の他の課題は、修飾されて核酸および相補的核酸のハイブリッドにおける核酸の酵素的分解ならびに酵素的伸長に対して保護される核酸、さらにまた、核酸を固定化させるための捕獲プローブとしてのその使用である。好ましい方法では、これらの核酸は、核塩基(nucleobase)の位置で、特に、相補的核酸に対する水素結合能を有する機能性アミノ基で修飾される。それらは、天然核塩基に関しては修飾されない。
本発明の別の課題は、核酸を伸長させるための酵素を有する第1容器Aおよび本発明の捕獲プローブを有する第2容器Bからなる試薬キットを提供することである。
これまたは他の容器は、好ましくは、核酸の固定化および増幅または検出に必要な全ての他の試薬を含有する。かかる試薬は、バッファー、モノヌクレオシド三リン酸、標識化試薬などである。
特に好ましい容器Bは、本発明に従って修飾されている検出可能な検出プローブまたは検出可能なモノヌクレオシド三リン酸を特徴とする。さらにまた、容器Aは、核酸、特に、RNA/DNAハイブリッド中のRNAを分解する酵素を含有することができる。
本発明の課題は、特定のエレクトロケミルミネセンス標識モノヌクレオシド三リン酸を提供することでもある。
エレクトロケミルミネセンス特性を有する基は知られている。それらは、以下、エレクトロケミルミネセンス基Eと記す。Eの特に好ましいエレクトロケミルミネセンス性成分は、500g/molを超える原子量、好ましくは、550〜2000g/molを有する配位錯体Kである。好ましい金属イオンは、周期表のVIIbおよびVIIIb亜族のイオンであり、特に、Ru、Os、Reであり、特に好ましくは、ルテニウムである。
配位錯体における金属イオンの好適なリガンドは、特に、WO 92/10267またはEP−A−0 340 605に開示されているような有機リガンドまたは基である。
好適な有機リガンドは、窒素、酸素または硫黄などの、対応する金属原子に対して電子供与体として作用する原子を含有する炭化水素である。電子供与体は、金属イオンと錯体形成させるような幾何学的配置に配置されるのが好適である。ルテニウムの場合、ビピリジル残基が好ましいリガンドである。
さらにまた、リガンドの1つを介して、錯体をモノヌクレオシド三リン酸に結合させる。好ましい方法では、配位錯体とヌクレオシド三リン酸の原子との間にスペーサー基Aを配置させる。スペーサー基は、好ましくは、所望により鎖の側部に結合されるさらなる基を有する、3個、特に、5〜15個、より特に、4〜10個の原子からなる原子鎖である。この原子の鎖は、ヘテロ原子、例えば、−O−(酸素)またはNR2−基(ここで、Nは、窒素であり、R2は、水素またはC1〜C6アルキル基である)によって中断されていてもよい炭化水素鎖を含有するのが好ましい。この原子の鎖は、成分−(CR3 2−CR3 2−O)(ここで、R3は、水素またはC1〜C6アルキル基である)を1回含有するのが好ましい。スペーサー基は、1000g/mol未満の分子量を有するのが好ましい。
好ましくは、エレクトロケミルミネセンス基Eは、モノヌクレオチドの核塩基の原子Nに共有結合される。
結合のための好ましい部位は、ピリミジンのC5、C6、C4またはN4およびプリンのC8またはN6およびデアザプリンのC7である。
好ましいモノヌクレオシド三リン酸は、式I:
P−Z−B−E (I)
[式中、
Pは、トリホスファート基またはトリホスファートアナログ基であり、
Zは、糖または糖アナログ基であり、
Bは、核塩基または核塩基アナログ基であり、
Eは、エレクトロケミルミネセンス基である]
で示されるモノヌクレオシド三リン酸である。
P−Z−B−E (I)
[式中、
Pは、トリホスファート基またはトリホスファートアナログ基であり、
Zは、糖または糖アナログ基であり、
Bは、核塩基または核塩基アナログ基であり、
Eは、エレクトロケミルミネセンス基である]
で示されるモノヌクレオシド三リン酸である。
トリホスファート、糖、および核塩基は、天然モノヌクレオシド三リン酸中に含有される基である。アナログ基は、1個または数個の原子を置き換えることによって得られるこれらの基であり、式Iで示される化合物の特性、すなわち、核酸における取込みを実質的に阻害しないこれらの基である。
トリホスファートアナログは、例えば、1個または数個の酸素原子を硫黄原子と置き換えた基である。糖アナログは、環内酸素原子が−CR4 2−基(ここで、R4は、水素またはC1〜C6アルキル基である)によって置き換えられた基である。核塩基アナログは、例えば、デアザプリン、好ましくは、7−デアザプリンである。
好ましいモノヌクレオシド三リン酸は、式Ia:
[式中、
Xは、水素またはOR1−基であり、
R1は、C1〜C6アルキル基、C1〜C6アルキレン基または水素であり、
Bは、プリン、デアザプリンまたはピリミジン基であり、
Aは、スペーサー基であり、
Kは、エレクトロケミルミネセンス性配位錯体である]
で示される化合物またはそのアルカリおよびアルカリ土類塩である。
Xは、水素またはOR1−基であり、
R1は、C1〜C6アルキル基、C1〜C6アルキレン基または水素であり、
Bは、プリン、デアザプリンまたはピリミジン基であり、
Aは、スペーサー基であり、
Kは、エレクトロケミルミネセンス性配位錯体である]
で示される化合物またはそのアルカリおよびアルカリ土類塩である。
驚くべきことに、実験によって、前記金属錯体と同じくらい大きな基でさえ、核酸におけるモノヌクレオシド三リン酸の取込みを触媒する酵素による標識化されたモノヌクレオシド三リン酸の取込みを実質的に妨害しないことが判明した。取り込まれた標識モノヌクレオシド三リン酸の量は、エレクトロケミルミネセンスによる標識化された核酸の検出のために充分である。本発明の方法は、エレクトロケミルミネセンスを使用する従来技術方法と比較して非常に高度の感度を示す。
特に驚くべきことに、非常に高い動的測定範囲、すなわち、モノヌクレオシド三リン酸の所定濃度で測定されるべき核酸の最少の定量可能な量に対する最大の定量可能な量の比を示す。この比は、107の値を超えることもある。
別の方法で、モノヌクレオシド三リン酸を取り込むことができる。
1つの方法は、検出されるべき核酸にハイブリダイズされるオリゴヌクレオチド、いわゆるプライマーの伸長である。ポリメラーゼ、好ましくは、DNA−ポリメラーゼによって触媒される反応で、核酸のセグメントをプライマーの3'−末端に結合させる。このセグメントは、対応する検出されるべき核酸のセグメントと実質的に相補的である。この反応は、存在する核酸のセグメントを増幅させつつ、形成された伸長生成物を使用して循環的に行うことができる。かかる方法は、EP−A−0 201 184に開示されている。
別の可能性は、複製起源またはプロモーターを含有する核酸の複製または転写である。この場合、核酸は、プライマー伸長なしでモノヌクレオチドだけからなる。実施例は、WO 91/03573またはWO 91/02818から公知である。
取込みの間に、モノヌクレオチドの少なくとも1つのタイプ((d)ATP、(d)CTP、(d)GTP、またはdTTP/(d)UTP)は、反応混合物中で、部分的に、または、完全に、エレクトロケミルミネセンス性モノヌクレオシド三リン酸によって置き換えられる。好ましい方法では、モノヌクレオシド三リン酸の1つのタイプ(例えば、dUTP)の10〜50%が標識アナログ(例えば、ルテニウム錯体標識dUTP)によって置き換えられる。標識モノヌクレオシド三リン酸の好ましい濃度は、20〜70μMの範囲であり、特に好ましくは、25〜40μMの範囲である。取込み反応の全ての他の条件は、前記文献に開示されているものと実質的に異ならない。
それらの構造に依存して、エレクトロケミルミネセンス標識モノヌクレオシド三リン酸は、種々の方法で生成されうる。
基を核塩基に結合させるべきである場合、天然塩基のアミノ基を、求電子基、例えば、スペーサー基の活性エステル基と反応させうる。
これらのモノヌクレオシド三リン酸と、アミノ基を有するスペーサー基を塩基の一原子ですでに有している反応性エレクトロケミルミネセンス性化合物との反応が、特に好都合であることが証明された。例としては、5位においてアルキルアミノ基で置換されたモノヌクレオシド三リン酸が含有されることが挙げられる[プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユー・エス・エイ(Proc.Natl.Acad.Sci.,USA)、78、6633−37(1991)]。
反応性基を有するエレクトロケミルミネセンス性化合物は、例えば、イゲン・カンパニー(IGEN company)から購入することができる。アミドは、活性エステルおよびアミンからアミドを慣用的に形成することに適用される条件と同様の条件下で形成される。
以下に、添付図面について説明する。
「図1」は、増幅のためにPCRを使用する本発明の検出方法を示す流れ図である。
「図2」は、増幅のためにNASBAを使用する本発明の検出方法を示す流れ図である。
「図3」は、プローブを用いないPCR(黒い棒)と比較して、本発明のHpbadw21−DNA測定(プローブを用いるPCR)の結果を示すグラフである。
「図4」は、NASBA(プローブを用いる:黒い棒)を使用するリステリア(Listeria)測定のための同様のグラフである。
「図5」は、NASBAを用いる捕獲プローブの存在におけるエレクトロケミルミネセンス性標識を使用するHIV I測定の結果を示す。
「図6」は、ジゴキシゲニン標識モノヌクレオシドが転写物に取り込まれるNASBAを使用する核酸の増幅および検出のための反応スキームを示す流れ図である。
「図7」は、Ru(bpyr)3−AA−dUTPの構造を示す。
「図8」は、Ru(bpyr)3−DADOO−dUTPの構造を示す。
「図9」の(a)および(b)は、標識核酸の分子量の差異を示すためのアガロースゲルを用いたクロマトグラムの図面代用写真である。
「図10」は、ゲルにおけるビオチン標識プローブとのハイブリダゼーションによって取り込まれた種々の量の(bpyr)3−AA−dUTPまたはRu(bpyr)3−DADOO−dUTPを用いた増幅生成物の検出のためのクロマトグラムの図面代用写真である。
「図11」は、反応において使用されるルテニウム標識モノヌクレオシドの量に対するシグナルの高さの依存性を示すグラフである。
「図12」は、ルテニウム標識が取り込まれた場合の核酸の量依存性検出を示す別のグラフである。
「図13」は、本発明の別の具体例と比較するグラフである。縦縞の棒は、第2容器が捕獲プローブを特異的に結合するのに使用される具体例についての値を示しており、横縞の棒は、増幅および壁結合が単一の容器中で行われる例の値を示す。点を付した棒は、酵素反応の間に発生した溶液の色を検出するために反応混合物を検出容器に移した具体例に関する値を示す。
「図1」は、増幅のためにPCRを使用する本発明の検出方法を示す流れ図である。
「図2」は、増幅のためにNASBAを使用する本発明の検出方法を示す流れ図である。
「図3」は、プローブを用いないPCR(黒い棒)と比較して、本発明のHpbadw21−DNA測定(プローブを用いるPCR)の結果を示すグラフである。
「図4」は、NASBA(プローブを用いる:黒い棒)を使用するリステリア(Listeria)測定のための同様のグラフである。
「図5」は、NASBAを用いる捕獲プローブの存在におけるエレクトロケミルミネセンス性標識を使用するHIV I測定の結果を示す。
「図6」は、ジゴキシゲニン標識モノヌクレオシドが転写物に取り込まれるNASBAを使用する核酸の増幅および検出のための反応スキームを示す流れ図である。
「図7」は、Ru(bpyr)3−AA−dUTPの構造を示す。
「図8」は、Ru(bpyr)3−DADOO−dUTPの構造を示す。
「図9」の(a)および(b)は、標識核酸の分子量の差異を示すためのアガロースゲルを用いたクロマトグラムの図面代用写真である。
「図10」は、ゲルにおけるビオチン標識プローブとのハイブリダゼーションによって取り込まれた種々の量の(bpyr)3−AA−dUTPまたはRu(bpyr)3−DADOO−dUTPを用いた増幅生成物の検出のためのクロマトグラムの図面代用写真である。
「図11」は、反応において使用されるルテニウム標識モノヌクレオシドの量に対するシグナルの高さの依存性を示すグラフである。
「図12」は、ルテニウム標識が取り込まれた場合の核酸の量依存性検出を示す別のグラフである。
「図13」は、本発明の別の具体例と比較するグラフである。縦縞の棒は、第2容器が捕獲プローブを特異的に結合するのに使用される具体例についての値を示しており、横縞の棒は、増幅および壁結合が単一の容器中で行われる例の値を示す。点を付した棒は、酵素反応の間に発生した溶液の色を検出するために反応混合物を検出容器に移した具体例に関する値を示す。
以下の実施例において、本発明をさらに詳細に説明する。
捕獲プローブの直接および次なる使用を用いるHBVの検出
反応混合物あたり1ng〜100atgの濃度のHpbadw21をポリメラーゼ連鎖反応(PCR)(EP−A−0 200 362)についての標的として使用した。PCR混合物についての容量は100μlであった。
混合物は、以下の成分からなっていた:
反応混合物あたり1ng〜100atgの濃度のHpbadw21をポリメラーゼ連鎖反応(PCR)(EP−A−0 200 362)についての標的として使用した。PCR混合物についての容量は100μlであった。
混合物は、以下の成分からなっていた:
10 X PCRバッファー:100mM トリス(Tris)/HCl、500mM KCl、15mM MgCl2、1mg/mlゼラチン、pH9.0。
プライマー1:オリゴデオキシヌクレオチド、18mer、d(GGAGTGTGGATTCGCACT)(位置2267−2284;EMBL、サブタイプadw、配列番号1)。
プライマー2:オリゴデオキシヌクレオチド、18mer、d(TGAGATCTTCTGCGACGC)(位置2436c−2419c、EMBL、サブタイプadw、配列番号2)。
Hpbadw21:クローン化されたHBV−DNA;pUCBM20(ベーリンガー・マンハイム)においてクローン化され、直線化されたHBVadw−配列のヌクレオチド29−2606(EMBL)。
ビオチニル化された捕獲プローブ:d(AGCCTATAGACCACCAAATGCCCCTAT)5'−ビオチニル化(配列番号3)位置2290−2316;EMBL、サブタイプadw、参考文献:オノ(Ono)ら、(1983)、ニュークリイック・アシッズ・リサーチ(Nucl.Acids Res.)11。
プライマー1:オリゴデオキシヌクレオチド、18mer、d(GGAGTGTGGATTCGCACT)(位置2267−2284;EMBL、サブタイプadw、配列番号1)。
プライマー2:オリゴデオキシヌクレオチド、18mer、d(TGAGATCTTCTGCGACGC)(位置2436c−2419c、EMBL、サブタイプadw、配列番号2)。
Hpbadw21:クローン化されたHBV−DNA;pUCBM20(ベーリンガー・マンハイム)においてクローン化され、直線化されたHBVadw−配列のヌクレオチド29−2606(EMBL)。
ビオチニル化された捕獲プローブ:d(AGCCTATAGACCACCAAATGCCCCTAT)5'−ビオチニル化(配列番号3)位置2290−2316;EMBL、サブタイプadw、参考文献:オノ(Ono)ら、(1983)、ニュークリイック・アシッズ・リサーチ(Nucl.Acids Res.)11。
以下のサイクル条件下で、パーキン・エルマー・サーマル・サイクラー(Perkin Elmer Thermal Cycler)でPCR混合物を増幅させる:93℃で3分間;(94℃で1分間、50℃で1分間、70℃で2分間)×30;95℃で5分間、37℃で5分間。
ビオチン標識プローブは、反応混合物あたり100ngの濃度であった。PCRの間に、Bio−16−ddUTP(ベーリンガー・マンハイム、Cat.No.1427,598)を用いて、プローブをその3'−末端でブロックした(参考文献:シュミッツ,ゲー・ゲー(Schmitz,G.G.)ら、(1990)アナリティカル・バイオケミストリー(Anal.Biochem.)192、222)。
検出のためにストレプトアビジン被覆微量滴定プレートを使用した(ベーリンガー・マンハイム・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング、EP−A−0 269 092)。
1.プローブを用いないPCRに次ぐハイブリダイゼーションの検出
増幅工程の後に、PCR混合物20μlにビオチン標識捕獲プローブ40ngを添加した。この混合物を95℃まで5分間加熱し、次いで、氷上で冷却し、37℃で15分間インキュベートした。次いで、ハイブリダイゼーションバッファー(50mMリン酸塩バッファー、750mM NaCl、75mM クエン酸ナトリウム、0.05%BSA、pH6.8)180μlを添加し;次いで、この混合物をストレプトアビジン被覆(SA)微量滴定プレートのウエル中にピペットで移し、37℃で1時間インキュベートした。該混合物を0.9%NaClで3回洗浄した後、0.2U/ml抗ジゴキシゲニン−POD(ベーリンガー・マンハイム)を有するコンジュゲートバッファー(100mM トリスxHCl、0.9%NaCl、1%BSA、pH7.5)200μlをピペット操作によって添加し、37℃で20分間インキュベートした。再度3回洗浄した後、検出のためにABTSR(1.9mmol/l)200μlを使用し、吸光度をHg405nmで測定した。
増幅工程の後に、PCR混合物20μlにビオチン標識捕獲プローブ40ngを添加した。この混合物を95℃まで5分間加熱し、次いで、氷上で冷却し、37℃で15分間インキュベートした。次いで、ハイブリダイゼーションバッファー(50mMリン酸塩バッファー、750mM NaCl、75mM クエン酸ナトリウム、0.05%BSA、pH6.8)180μlを添加し;次いで、この混合物をストレプトアビジン被覆(SA)微量滴定プレートのウエル中にピペットで移し、37℃で1時間インキュベートした。該混合物を0.9%NaClで3回洗浄した後、0.2U/ml抗ジゴキシゲニン−POD(ベーリンガー・マンハイム)を有するコンジュゲートバッファー(100mM トリスxHCl、0.9%NaCl、1%BSA、pH7.5)200μlをピペット操作によって添加し、37℃で20分間インキュベートした。再度3回洗浄した後、検出のためにABTSR(1.9mmol/l)200μlを使用し、吸光度をHg405nmで測定した。
2.PCRの間に直接使用されるプローブを用いるPCRの検出(本発明によって提案された)
捕獲プローブ100ngの存在下で増幅を行った。
増幅後、PCR反応混合物20μlにハイブリダイゼーションバッファー180μlを直接添加し、前記1の記載に従って処理した。
結果を「図3」に示す。
捕獲プローブ100ngの存在下で増幅を行った。
増幅後、PCR反応混合物20μlにハイブリダイゼーションバッファー180μlを直接添加し、前記1の記載に従って処理した。
結果を「図3」に示す。
プローブを直接使用する場合およびしない場合のプロモーター制御増幅(NASBA)
使用するアナライトは、反応混合物あたり50ng〜5fgの濃度の単離した染色体リステリア(Listeria)単核細胞質遺伝子(monocytogene)DNA(WO 90/08197を参照)であった。NASBAは、EP−A−0 329 822に開示されている。
NASBAは、T7−RNAポリメラーゼプロモーター配列を使用して、二本鎖アナライトDNAを一本鎖DNAに変換させる反応の前に行われる(PreNASBA)。これは、通常、シークエナーゼ(SequenaseR)を使用することによって行われる。しかしながら、主に、DNAポリメラーゼが好適である。
使用するアナライトは、反応混合物あたり50ng〜5fgの濃度の単離した染色体リステリア(Listeria)単核細胞質遺伝子(monocytogene)DNA(WO 90/08197を参照)であった。NASBAは、EP−A−0 329 822に開示されている。
NASBAは、T7−RNAポリメラーゼプロモーター配列を使用して、二本鎖アナライトDNAを一本鎖DNAに変換させる反応の前に行われる(PreNASBA)。これは、通常、シークエナーゼ(SequenaseR)を使用することによって行われる。しかしながら、主に、DNAポリメラーゼが好適である。
この混合物を95℃まで5分間加熱し、次いで、氷上で冷却した。
10mMジチオトレイトール(DTT)に調節し;次いで、13 U T7−DNAポリメラーゼ(シークエナーゼ(SequenaseR)、ユナイテッド・ステイツ・バイオケミカルズ(United States Biochemicals)による)を添加した。次いで、該混合物を37℃で15分間インキュベートし、再度、95℃まで加熱し、再度、氷上で冷却した。
10mMジチオトレイトール(DTT)に調節し;次いで、13 U T7−DNAポリメラーゼ(シークエナーゼ(SequenaseR)、ユナイテッド・ステイツ・バイオケミカルズ(United States Biochemicals)による)を添加した。次いで、該混合物を37℃で15分間インキュベートし、再度、95℃まで加熱し、再度、氷上で冷却した。
IIA NASBA増幅:反応工程1
a.反応混合物の組成
NASBAについて使用した容量は、25μlであった(NASBA−Mix 23μl + PreNASBA−Mix 2μl、実施例2のパートIから)。
a.反応混合物の組成
NASBAについて使用した容量は、25μlであった(NASBA−Mix 23μl + PreNASBA−Mix 2μl、実施例2のパートIから)。
10 x NASBAバッファー:400nM トリス/HCl、500mM KCl、120mM MgCl2、pH8.5。
プライマー3:
配列番号4、PIII−領域(位置35−56)。下線部は、T7−RNA−ポリメラーゼプロモーター配列である。
プライマー4:d(GTAATCATCCGAAACCGCTCA)、配列番号5、PIII−領域(位置196c−216c)。
プライマー3:
プライマー4:d(GTAATCATCCGAAACCGCTCA)、配列番号5、PIII−領域(位置196c−216c)。
NASBA増幅を、40℃で1.5〜2時間生じさせた。
b)ハイブリダイゼーション
増幅後、NASBA混合物にビオチニル化プローブ200ngを添加し、95℃まで5分間加熱し、次いで、氷上で冷却した。次いで、該混合物を37℃で30分間インキュベートした。
増幅後、NASBA混合物にビオチニル化プローブ200ngを添加し、95℃まで5分間加熱し、次いで、氷上で冷却した。次いで、該混合物を37℃で30分間インキュベートした。
プローブ:d(CGTTTTACTTCTTGGACCG)、配列番号6、5'−末端で、ビオチナマイト(biotinamite)(アプライド・バイオシステムズ(Applied Biosystems))でビオチニル化した。PIII領域(位置162c−180c)。
c.微量滴定プレートにおける検出
ハイブリダイゼーション混合物5μlにハイブリダイゼーションバッファー(50mMリン酸塩バッファー、750mM NaCl、75mM クエン酸ナトリウム、0.05%BSA、pH6.8)195μlを添加した。次いで、該混合物を微量滴定プレートのウエル中にピペットで移し、37℃でさらに1時間インキュベートした。0.9%NaCl溶液で3回洗浄した後、37℃で20分間、コンジュゲートバッファー(100mMトリス−HCl、0.9 NaCl、1%BSA、pH7.5)中、0.2U/ml抗−ジゴキシゲニン−POD(ベーリンガー・マンハイム)200μlと一緒にインキュベートし続けた。該混合物を再度3回洗浄し、次いで、ABTSR(ベーリンガー・マンハイム)(1.9mmol/l)200μlを添加し、吸光度をHg405nmで測定した。
ハイブリダイゼーション混合物5μlにハイブリダイゼーションバッファー(50mMリン酸塩バッファー、750mM NaCl、75mM クエン酸ナトリウム、0.05%BSA、pH6.8)195μlを添加した。次いで、該混合物を微量滴定プレートのウエル中にピペットで移し、37℃でさらに1時間インキュベートした。0.9%NaCl溶液で3回洗浄した後、37℃で20分間、コンジュゲートバッファー(100mMトリス−HCl、0.9 NaCl、1%BSA、pH7.5)中、0.2U/ml抗−ジゴキシゲニン−POD(ベーリンガー・マンハイム)200μlと一緒にインキュベートし続けた。該混合物を再度3回洗浄し、次いで、ABTSR(ベーリンガー・マンハイム)(1.9mmol/l)200μlを添加し、吸光度をHg405nmで測定した。
IIB NASBA増幅:反応工程2
a.反応混合物の組成
NASBA反応混合物の組成は、IIAで使用したものと一致する。さらに、増幅の間に、捕獲プローブを混合物あたり140ngの濃度で直接添加した。
NASBA反応の間に、捕獲プローブの直接使用のために、5'−末端でビオチン標識化(アプライド・バイオシステムズ・インコーポレイテッド(Applied Biosystems Inc.)によるビオチンアミド)し、3'−末端で親水性リンカーでブロックした2'−O−アリルリボオリゴヌクレオチドを使用した。2'−O−アリル修飾オリゴヌクレオチドの「RNA鎖」は、RNA/DNAハイブリッド中でRNAseHによって分解されない(参考文献:イノウエ,エイチ(Inoue,H.)ら(1987)FEBS Lett.215、327−330)ので、これを捕獲プローブとして使用した。該オリゴヌクレオチドの3'−末端をブロックして、ポリメラーゼ反応の間に非特異的な伸長を回避する。
a.反応混合物の組成
NASBA反応混合物の組成は、IIAで使用したものと一致する。さらに、増幅の間に、捕獲プローブを混合物あたり140ngの濃度で直接添加した。
NASBA反応の間に、捕獲プローブの直接使用のために、5'−末端でビオチン標識化(アプライド・バイオシステムズ・インコーポレイテッド(Applied Biosystems Inc.)によるビオチンアミド)し、3'−末端で親水性リンカーでブロックした2'−O−アリルリボオリゴヌクレオチドを使用した。2'−O−アリル修飾オリゴヌクレオチドの「RNA鎖」は、RNA/DNAハイブリッド中でRNAseHによって分解されない(参考文献:イノウエ,エイチ(Inoue,H.)ら(1987)FEBS Lett.215、327−330)ので、これを捕獲プローブとして使用した。該オリゴヌクレオチドの3'−末端をブロックして、ポリメラーゼ反応の間に非特異的な伸長を回避する。
配列:5'−ビオチン−CGU UUU ACU UCU UGG ACC−G−3'−ブロック(配列番号7)
C=2'−O−アリルシチジン
G=2'−O−アリルグアノシン
A=2'−O−アリルアデノシン
U=2'=O=アリルウリジン
3'−ブロック:
C=2'−O−アリルシチジン
G=2'−O−アリルグアノシン
A=2'−O−アリルアデノシン
U=2'=O=アリルウリジン
3'−ブロック:
ファルマシア(Pharmacia)によるオリゴヌクレオチド合成器(ジーン・アセンブラー(Gene Assembler))を使用して、イリバレン(Iribarren)ら(参考文献:イリバレン,エイ・エム(Iribarren,A.M.)ら(1990)PNAS87、7747−7751)によるプロトコールに従って、ベーリンガー・マンハイム・バイオケミカルズ(Boehringer Mannheim Biochemicals)による2'−O−アリルヌクレオシドホスホラスアミダイトを用いて、この捕獲プローブを合成した。
b)ハイブリダイゼーション
適用しない。
適用しない。
c)MTP検出
この方法は、NASBA混合物5mlを用いてIcのために使用した方法と同一であった。
結果を「図4」に示す。
この方法は、NASBA混合物5mlを用いてIcのために使用した方法と同一であった。
結果を「図4」に示す。
NASBAを使用するHIV−1の検出
以下の実施例では、NASBA増幅系(EP−A−0 329 822)の助けによってHIV−1を検出した。ビオチン標識捕獲プローブの存在下でNASBAを行った。取り込まれた標識(ルテニウム標識UTP)を介して、増幅生成物を直接検出した。
以下の実施例では、NASBA増幅系(EP−A−0 329 822)の助けによってHIV−1を検出した。ビオチン標識捕獲プローブの存在下でNASBAを行った。取り込まれた標識(ルテニウム標識UTP)を介して、増幅生成物を直接検出した。
この試験は、AIDSまたはARC(AIDS症候群)に罹っている患者のHIV陽性血清を網羅した。マニアティス(Maniatis)ら[モレキュラー・クローニング:ア・ラボラトリー・マニュアル(Molecular Cloning: A laboratory manual)(コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリーズ(Cold Spring Harbor Lab.)、ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー、194−195、1982)]に従って、グアニジナム・ホット・フェノール法(Guanidinum Hot Phenol Method)の後に、RNAを単離し、RNA溶液のアリコット10μlを−70℃で貯蔵した。NASBA反応の前に、RNA溶液を1:10、1:100、1:1000、1:10000に希釈し、NASBA反応に各2μlを使用した。
NASBA反応および反応混合物の組成については、実施例2 IIbに言及されており、digUTPの代わりに30μMルテニウム標識UTP(=Ru(bpyr)3−AA−UTP)を使用した(合成の詳細については、実施例4を参照)。
使用したプライマーおよびプローブ:
OT188:
P1(配列番号8)
OT42: ACAGGAGCAGATGATACAGTATTAG
P2(配列番号9)
OT15: 5'−Bio−UGGAAGAAAUCUGUUGACUCAGAUUGGUUGC−ブロック−3'
試料(配列番号10)
OT188:
OT42: ACAGGAGCAGATGATACAGTATTAG
P2(配列番号9)
OT15: 5'−Bio−UGGAAGAAAUCUGUUGACUCAGAUUGGUUGC−ブロック−3'
試料(配列番号10)
配列OT188の下線部は、T7−RNA−ポリメラーゼプロモーターと一致する。
オリゴヌクレオチドOT15は、その3'−末端で2'−O−アリルリボオリゴヌクレオチドに対してブロックされ(実施例2 IIBを参照)、その5'−末端でビオチニル化されている。
参考文献:キエヴィッツ,ティ(Kievits,T.)ら(1991)、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・メソッズ(J.of Viol.Methods)273−286。
参考文献:キエヴィッツ,ティ(Kievits,T.)ら(1991)、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・メソッズ(J.of Viol.Methods)273−286。
増幅生成物の検出
反応後、NASBA反応混合物5μlにリン酸塩バッファー(62mM リン酸ナトリウム、0.94M NaCl、94mM クエン酸ナトリウム、pH7)20μl中の磁気ビーズ(ダイナビーズ(DynabeadsR) M−280、ストレプトアビジン、ダイナル(Dynal))10μg(2×106ビーズ)を添加し、37℃で30分間インキュベートした。次いで、磁石を使用して試料カップの底にビーズを集めた。毎回リン酸塩バッファー100μlを用いて2回洗浄した。次いで、ビーズを該リン酸バッファー100μlに懸濁させ、ECLアッセイバッファー(0.2M KH2PO4、0.05M NaCl、0.1Mトリプロピルアミン、pH7.5;参考文献:ジェイ・ケイ・リランド(J.K.Leland)ら(1990)、ジャーナル・オブ・エレクトロケミカル・ソサイエティ(J.Electrochem.Soc.)、137:3127−33)250μlを添加した。940Vの光電子増倍管電圧を用いてECLアナライザー(オリゲン(Origen)1.0;イゲン・インコーポレイテッド(Igen Inc.)によって製造された)で測定を行った。測定時間は、2V/秒のランプで2秒間であった。各試料についての全測定サイクルは、2分であった。
結果を「図5」に示す。
反応後、NASBA反応混合物5μlにリン酸塩バッファー(62mM リン酸ナトリウム、0.94M NaCl、94mM クエン酸ナトリウム、pH7)20μl中の磁気ビーズ(ダイナビーズ(DynabeadsR) M−280、ストレプトアビジン、ダイナル(Dynal))10μg(2×106ビーズ)を添加し、37℃で30分間インキュベートした。次いで、磁石を使用して試料カップの底にビーズを集めた。毎回リン酸塩バッファー100μlを用いて2回洗浄した。次いで、ビーズを該リン酸バッファー100μlに懸濁させ、ECLアッセイバッファー(0.2M KH2PO4、0.05M NaCl、0.1Mトリプロピルアミン、pH7.5;参考文献:ジェイ・ケイ・リランド(J.K.Leland)ら(1990)、ジャーナル・オブ・エレクトロケミカル・ソサイエティ(J.Electrochem.Soc.)、137:3127−33)250μlを添加した。940Vの光電子増倍管電圧を用いてECLアナライザー(オリゲン(Origen)1.0;イゲン・インコーポレイテッド(Igen Inc.)によって製造された)で測定を行った。測定時間は、2V/秒のランプで2秒間であった。各試料についての全測定サイクルは、2分であった。
結果を「図5」に示す。
Ru(bpyr)3-AA−UTPの合成
オリゲン(OrigenR)標識(イゲン・インコーポレイテッド)=[4−(N−スクシンイミジルオキシカルボニルプロピル)−4'−メチル−2,2'−ビピリジン−ビス(2,2'−ビピリジン)]−ルテニウム(II)−ジヘキサフルオロホスファート
AA−UTP=5−(3−アミノアリル)−ウリジン三リン酸は、ランガー(Langer)ら[プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユー・エス・エイ(Proc.Natl.Acad.Sci.,USA)、78、6633−37、1981]に従って製造した。
DMSO=ジメチルスルホキシド
オリゲン(OrigenR)標識(イゲン・インコーポレイテッド)=[4−(N−スクシンイミジルオキシカルボニルプロピル)−4'−メチル−2,2'−ビピリジン−ビス(2,2'−ビピリジン)]−ルテニウム(II)−ジヘキサフルオロホスファート
AA−UTP=5−(3−アミノアリル)−ウリジン三リン酸は、ランガー(Langer)ら[プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユー・エス・エイ(Proc.Natl.Acad.Sci.,USA)、78、6633−37、1981]に従って製造した。
DMSO=ジメチルスルホキシド
AA−UTP(リチウム塩)5.5mg(0.01mmol)を0.1Mホウ酸ナトリウムバッファー(pH8.5)2mlに溶解させた。これは、DMSO 1.5mlにオリゲン(OrigenR)標識15.8mg(0.015mmol)の溶液を添加し、室温で一晩撹拌して行った。次いで、イオン交換クロマトグラフィー(セファデックス(Sephadex)DEA、Cl型;勾配液:0〜0.4M LiCl)によって、Ru(bpyr)3−AA−UTP生成物を精製した。収量:7mg(理論値の46%)。
Ru(bpyr)3−AA−dUTPおよびRu(bpyr)3−DADOO−dUTPの合成
ランガー(Langer)ら(1981)プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユー・エス・エイ(Proc.Natl.Acad.Sci.,USA)、78:6633−37に従って、5−(3−アミノアリル)−dUTP(=AAdUTP)を製造した;5−水銀−dUTPをN−アリル−N'−(8−アミノ−3,5−ジオキサ−オクチル)尿素と反応させることによって、DADOO−dUTPを得た。
ランガー(Langer)ら(1981)プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユー・エス・エイ(Proc.Natl.Acad.Sci.,USA)、78:6633−37に従って、5−(3−アミノアリル)−dUTP(=AAdUTP)を製造した;5−水銀−dUTPをN−アリル−N'−(8−アミノ−3,5−ジオキサ−オクチル)尿素と反応させることによって、DADOO−dUTPを得た。
Ru(bpyr)3−AA−dUTP(「図7」)の合成
0.1Mホウ酸ナトリウムバッファーにAAdUTP 3.2mgを溶解させ、オリゲン(OrigenR)標識5.6mgのDMSO 560μl中溶液と一緒にRTで一晩撹拌した。
該反応をTLCおよびペーパー電気泳動を介して制御し、次いで、イオン交換クロマトグラフィーによって、生成物を精製した。
収量:3.8mg(理論値の48%)。
[M+H]+:1180.1
0.1Mホウ酸ナトリウムバッファーにAAdUTP 3.2mgを溶解させ、オリゲン(OrigenR)標識5.6mgのDMSO 560μl中溶液と一緒にRTで一晩撹拌した。
該反応をTLCおよびペーパー電気泳動を介して制御し、次いで、イオン交換クロマトグラフィーによって、生成物を精製した。
収量:3.8mg(理論値の48%)。
[M+H]+:1180.1
Ru(bpyr)3−DADOO−dUTP(「図8」)の合成
a.N−アリル−N'−(8−アミノ−3,5−ジオキサオクチル)尿素の合成
ジアミノジオキサオクタン(メルク(Merck))15g(0.1mol)をジイソプロピルエーテル500ml中で−40℃に冷却した。アリルイソシアナート(フルカ(Fluka))5.5g(0.06mol)をゆっくりと滴下した。−40℃で30分間撹拌した後、該混合物をRTにし、蒸留によってジイソプロピルエーテルを除去した。残留物を酢酸エステル600mlと一緒に1時間撹拌し、沈殿物を濾過によって取り出し、酢酸エステルで3回洗浄した。合わせた酢酸エステルフラクションを濃縮し、得られた生成物を、9:1〜8:2の酢酸エステル/メタノール溶媒勾配液を用いてフラッシュクロマトグラフィーに付して精製した。
収量:4.5g(理論値の29%)、無色の液体。
a.N−アリル−N'−(8−アミノ−3,5−ジオキサオクチル)尿素の合成
ジアミノジオキサオクタン(メルク(Merck))15g(0.1mol)をジイソプロピルエーテル500ml中で−40℃に冷却した。アリルイソシアナート(フルカ(Fluka))5.5g(0.06mol)をゆっくりと滴下した。−40℃で30分間撹拌した後、該混合物をRTにし、蒸留によってジイソプロピルエーテルを除去した。残留物を酢酸エステル600mlと一緒に1時間撹拌し、沈殿物を濾過によって取り出し、酢酸エステルで3回洗浄した。合わせた酢酸エステルフラクションを濃縮し、得られた生成物を、9:1〜8:2の酢酸エステル/メタノール溶媒勾配液を用いてフラッシュクロマトグラフィーに付して精製した。
収量:4.5g(理論値の29%)、無色の液体。
b.5−水銀−dUTPとの反応
ベルグストローム(Bergstrom)ら(1977)、J.Carbohydr.Nucleosides,Nucleotides、4:257に従って、5−水銀−dUTP(=HgdUTP)を製造した。
酢酸ナトリウムバッファー(pH5)20mlにHgdUTP 370mg(0.54mmol)およびK2PdCl4 113mgを溶解させた。次いで、N−アリル−N'−(8−アミノ−3,5−ジオキサオクチル)尿素0.5g(2.16mmol)を滴下し、RTで一晩撹拌した。濾過によって沈殿物を除去し、濾液を濃縮し、0〜0.3M LiClのバッファー勾配液を用いてイオン交換クロマトグラフィー(DEAE−セファデックス−CL−型)によって精製した。次いで、生成物をアセトン/エタノール(2:1)から2回沈殿させ、該沈殿物を濾過によって取り出し、洗浄し、次いで、乾燥させた。DADOO−dUTP 60mg(理論値の15.7%)を得た。
ベルグストローム(Bergstrom)ら(1977)、J.Carbohydr.Nucleosides,Nucleotides、4:257に従って、5−水銀−dUTP(=HgdUTP)を製造した。
酢酸ナトリウムバッファー(pH5)20mlにHgdUTP 370mg(0.54mmol)およびK2PdCl4 113mgを溶解させた。次いで、N−アリル−N'−(8−アミノ−3,5−ジオキサオクチル)尿素0.5g(2.16mmol)を滴下し、RTで一晩撹拌した。濾過によって沈殿物を除去し、濾液を濃縮し、0〜0.3M LiClのバッファー勾配液を用いてイオン交換クロマトグラフィー(DEAE−セファデックス−CL−型)によって精製した。次いで、生成物をアセトン/エタノール(2:1)から2回沈殿させ、該沈殿物を濾過によって取り出し、洗浄し、次いで、乾燥させた。DADOO−dUTP 60mg(理論値の15.7%)を得た。
c.DADOO−dUTPをオリゲン(OrigenR)標識と反応させることによって、Ru(bpyr)3−AA−dUTPについての記載に従って、合成を行った。
PCR増幅およびRu(bpyr)3−AA−dUTPおよびRu(bpyr)3−DADOO−dUTPによるHBV−DNAの標識
Hpbadw21 1ngを増幅させた;PCR反応混合物の容量は、100μlであった(PCR Mix 80μl、試料20μl)。
Hpbadw21 1ngを増幅させた;PCR反応混合物の容量は、100μlであった(PCR Mix 80μl、試料20μl)。
PCR Mixは、以下の組成を有した:
10 x PCR−バッファー:100mM トリス/HCl、500mM KCl、15mM MgCl2、100mg/mlゼラチン、pH9.0
プライマー1:オリゴデオキシヌクレオチド、18mer、
d(GGAGTGTGGATTCGCACT)配列番号1、
(位置2267−2284;EMBL、サブタイプadw)
プライマー2:オリゴデオキシヌクレオチド、18mer、
d(TGAGATCTTCTGCGACGC)配列番号2、
(位置2436C−2419C;EMBL;サブタイプadw)
Hpbadw21: pUC BM20(ベーリンガー・マンハイム)中でクローン化され、直線化されたadw21
プライマー1:オリゴデオキシヌクレオチド、18mer、
d(GGAGTGTGGATTCGCACT)配列番号1、
(位置2267−2284;EMBL、サブタイプadw)
プライマー2:オリゴデオキシヌクレオチド、18mer、
d(TGAGATCTTCTGCGACGC)配列番号2、
(位置2436C−2419C;EMBL;サブタイプadw)
Hpbadw21: pUC BM20(ベーリンガー・マンハイム)中でクローン化され、直線化されたadw21
94℃で60秒、50℃で60秒、および70℃で120秒を30サイクル用いて、パーキン・エルマー・サーマル・サイクラー(Perkin Elmer Thermal Cycler)において、PCR反応混合物を増幅させた。
Ru(bpyr)3−AA−dUTPおよびRu(bpyr)3−DADOO−dUTP濃度を、66μM、30μM、10μM、1μMおよび0.1μM〜0.01μMで変化させ、増幅混合物中の合計Ru(bpyr)3−dUTP/dTTP濃度200μMを有するようにdTTP濃度を増加させた。
Ru(bpyr)3−AA−dUTPおよびRu(bpyr)3−DADOO−dUTP濃度を、66μM、30μM、10μM、1μMおよび0.1μM〜0.01μMで変化させ、増幅混合物中の合計Ru(bpyr)3−dUTP/dTTP濃度200μMを有するようにdTTP濃度を増加させた。
比較するために、種々の濃度のジゴキシゲニン−11−dUTP(ベーリンガー・マンハイム、Cat.No.1039 088)を取り込んだ同一のPCR反応混合物を試験し、修飾ヌクレオチドを取り込んでいないPCR反応混合物も試験した。
1%アガロースゲル上に種々のPCR反応混合物を各10μl適用し、臭化エチジウムによって、増幅生成物を肉眼で見ることができるようにした(「図9」)。そのより高い分子量のために、取り込まれたRu(bpyr)3−DADOO−dUTP(=長いスペーサー)を有する増幅生成物は、ゲル上で、Ru(bpyr)3−AA−dUTP生成物(=短いスペーサー)よりも遅い。しかしながら、これは、より高濃度の修飾ヌクレオチドが存在し、かくして、増幅反応の間に、対応して多量の標識が取り込まれる場合にだけ生じる。結果は、非修飾生成物と比較して分子量が増加する。
ビオチニル化オリゴヌクレオチドプローブとのフィルターハイブリダイゼーション
ビオチニル化捕獲プローブ:
ビオチナミダイト(アプライド・バイオシステムズ(Applied Biosystems))でビオチニル化されたd(AGA CCA CCA AAT GCC CCT AT)配列番号11は、HBVadw−配列の位置2297−2316と一致する;EMBL配列データバンク。参考文献:オノ(Ono)ら(1983)、ヌークリイック・アシッズ・リサーチ(Nucl.Acids Res.)、11:1747−1757。
ビオチニル化捕獲プローブ:
ビオチナミダイト(アプライド・バイオシステムズ(Applied Biosystems))でビオチニル化されたd(AGA CCA CCA AAT GCC CCT AT)配列番号11は、HBVadw−配列の位置2297−2316と一致する;EMBL配列データバンク。参考文献:オノ(Ono)ら(1983)、ヌークリイック・アシッズ・リサーチ(Nucl.Acids Res.)、11:1747−1757。
1%アガロースゲル上に、PCR反応混合物1〜6、1/1〜6/1および1/3〜2/3 10μlを適用し、次いで、ナイロン膜上にブロットし、シー・エイチ・ケスラー(CH.Kessler)ら(1980)「ノン−レイディオオクティブ・ラベリング・アンド・ディテクション・オブ・ヌークリイック・アシッズ」(Non-radioactive labelling and detection of nucleic acids)、Bio.Chem.Hoppe−Seyler、371:917−927に従って、前記ビオチニル化オリゴヌクレオチドプローブ100ngと一緒に45℃で一晩ハイブリダイズさせた。ストレプトアビジンおよびアルカリホスファターゼ(ベーリンガー・マンハイム、Cat.No.1093 266)、NBT/X−ホスファート(ベーリンガー・マンハイム、Cat.No.1383 213および760 986)からなるコンジュゲートを用いて、ビオチンを検出した。「図10」に示すとおり、所望の増幅生成物は、増幅生成物に対して特異的なオリゴヌクレオチドプローブを使用するハイブリダイゼーションによって全てのPCR反応混合物において検出される。
ハイブリダイゼーションおよび検出
8.1 2段アッセイ
混合物1、4および6ならびに1/1、4/1および6/1 10μlを0.05M NaOHで1:10に希釈した。5分後、この混合物100μlを、既に濃度94ng/mlのビオチニル化オリゴヌクレオチドプローブを含有しているハイブリダイゼーションバッファー(62.5mMリン酸ナトリウム、0.94M NaCl、94mMクエン酸ナトリウム、pH=6.5)400μlで中和した。同時に、PCR反応混合物1、4および6ならびに1/1、4/1および6/1を100℃まで加熱し、次いで、氷上で冷却することによって熱変性に付した。37℃で1時間、ハイブリダイズさせた後、ストレプトアビジン被覆磁気粒子(ダイナビーズ(DynabeadsR)M−280、ストレプトアビジン、ダイナル(Dynal))のハイブリダイゼーションバッファー(濃度600μg/ml)中懸濁液50μlを添加し、37℃でさらに1時間インキュベートした。次いで、磁石を用いて、磁気ビーズを試料カップの底に集め、上澄み液をデカントし、ビーズを、再度、毎回リン酸塩バッファー(50mMリン酸ナトリウムバッファー、pH7.4)500μlで2回洗浄した。最後に、ビーズをリン酸塩バッファー200μl中に懸濁させ、次いで、ECLアッセイバッファー500μlを添加し(ブラックバーン(Blackburn)ら(1991)、Clin.Chem.37:1534−1539を参照)、次いで、ECLアナライザー(オリゲン(OrigenR)1.0、イゲン(IGEN)、アメリカ合衆国ロックヴィル)上で測定した。
8.1 2段アッセイ
混合物1、4および6ならびに1/1、4/1および6/1 10μlを0.05M NaOHで1:10に希釈した。5分後、この混合物100μlを、既に濃度94ng/mlのビオチニル化オリゴヌクレオチドプローブを含有しているハイブリダイゼーションバッファー(62.5mMリン酸ナトリウム、0.94M NaCl、94mMクエン酸ナトリウム、pH=6.5)400μlで中和した。同時に、PCR反応混合物1、4および6ならびに1/1、4/1および6/1を100℃まで加熱し、次いで、氷上で冷却することによって熱変性に付した。37℃で1時間、ハイブリダイズさせた後、ストレプトアビジン被覆磁気粒子(ダイナビーズ(DynabeadsR)M−280、ストレプトアビジン、ダイナル(Dynal))のハイブリダイゼーションバッファー(濃度600μg/ml)中懸濁液50μlを添加し、37℃でさらに1時間インキュベートした。次いで、磁石を用いて、磁気ビーズを試料カップの底に集め、上澄み液をデカントし、ビーズを、再度、毎回リン酸塩バッファー(50mMリン酸ナトリウムバッファー、pH7.4)500μlで2回洗浄した。最後に、ビーズをリン酸塩バッファー200μl中に懸濁させ、次いで、ECLアッセイバッファー500μlを添加し(ブラックバーン(Blackburn)ら(1991)、Clin.Chem.37:1534−1539を参照)、次いで、ECLアナライザー(オリゲン(OrigenR)1.0、イゲン(IGEN)、アメリカ合衆国ロックヴィル)上で測定した。
940Vの光電子増倍管電圧で測定を行った。測定時間は、2V/秒のランプ圧で2秒であった。各試料についての完全な測定サイクルは、2分であった。
8.2 1段アッセイ
この第2の、より簡単なアッセイ法では、PCR反応混合物の変性およびビオチニル化捕獲プローブとのハイブリダイゼーションは、2段階アッセイについて前記したとおり行った。37℃で2時間のハイブリダイゼーション後、この溶液中にさらなる磁気ビーズ50μlをピペットで移し、次いで、「結合/遊離」の分離なしでECLアナライザーで直接測定した。測定したブランクは、ハイブリダイゼーションブッファー中のRu(bpyr)3−AA−dUTPの対応する濃度であった。
光電子倍増管の電圧は、800Vであり、他のすべての測定条件は、前記条件と同じであった。
「図11」に、増幅混合物中の種々の濃度のRu(bpyr)3−AA−dUTPおよびRu(bpyr)3−DADOO−dUTPに依存して測定されたELCピーク度を示す。
この第2の、より簡単なアッセイ法では、PCR反応混合物の変性およびビオチニル化捕獲プローブとのハイブリダイゼーションは、2段階アッセイについて前記したとおり行った。37℃で2時間のハイブリダイゼーション後、この溶液中にさらなる磁気ビーズ50μlをピペットで移し、次いで、「結合/遊離」の分離なしでECLアナライザーで直接測定した。測定したブランクは、ハイブリダイゼーションブッファー中のRu(bpyr)3−AA−dUTPの対応する濃度であった。
光電子倍増管の電圧は、800Vであり、他のすべての測定条件は、前記条件と同じであった。
「図11」に、増幅混合物中の種々の濃度のRu(bpyr)3−AA−dUTPおよびRu(bpyr)3−DADOO−dUTPに依存して測定されたELCピーク度を示す。
HBVプラスミド−DNAの検出
標的は、Hpbadw 21に対してであった。以下の濃度:1ng、1pg、100fg、1fg、200agを用いた。PCRにおいて最終濃度10μM Ru(bpyr)3−AA−dUTP/190μl dTTPを使用した後、および30μM Ru(bpyr)3−AA−dUTP/170μl dTTPを使用した後、実施例2の条件に従って、増幅を行った。ビオチニル化捕獲プローブ(配列番号3)とハイブリダイズさせ、「結合/遊離」分離せずに「一段アッセイ」に従ってSA磁気ビーズに結合させた後、該増幅生成物をオリゲン(OrigenR)1.0アナライザーで測定した。使用した光電子倍増管電圧は、900Vであり、他のすべての条件は、4.2項に記載した条件と同じであった。
「図12」に、種々の標的濃度に依存して測定されたELCピーク度を示す。
標的は、Hpbadw 21に対してであった。以下の濃度:1ng、1pg、100fg、1fg、200agを用いた。PCRにおいて最終濃度10μM Ru(bpyr)3−AA−dUTP/190μl dTTPを使用した後、および30μM Ru(bpyr)3−AA−dUTP/170μl dTTPを使用した後、実施例2の条件に従って、増幅を行った。ビオチニル化捕獲プローブ(配列番号3)とハイブリダイズさせ、「結合/遊離」分離せずに「一段アッセイ」に従ってSA磁気ビーズに結合させた後、該増幅生成物をオリゲン(OrigenR)1.0アナライザーで測定した。使用した光電子倍増管電圧は、900Vであり、他のすべての条件は、4.2項に記載した条件と同じであった。
「図12」に、種々の標的濃度に依存して測定されたELCピーク度を示す。
熱安定性SAで被覆した微量滴定プレートにおけるthrePCRの間に間接的にプローブを使用するHBVの検出
実施例1の記載に従って、PCR混合物を調製した。しかしながら、混合物の体積を50μlに減少させ、シグマ(Sigma)鉱油(シグマ・ミネラル・オイル(Sigma Mineral Oil)、淡白色油M−3516)30μlで覆った。プライマー、ビオチニル化捕獲プローブIIおよび鋳型ならびに使用濃度は、同一であった。当該工程を開始する前に、熱安定性ストレプトアビジン(SA)で被覆したテクネプレート(Techne plate)(Cat.No.140800)においてPCRを行った。増幅のために、MW−2 Techne−Cyclerを使用した。サイクル条件は、実施例1において使用した条件と同一であった。PCR後、該混合物を37℃で30分間放置した。次いで、3回洗浄し(実施例1を参照)、プレートを、各ウエルについてコンジュゲートバッファー(実施例1を参照)100μlと一緒にインキュベートした。次いで、3回洗浄し、次に、ABTSR溶液(実施例1を参照)100mlと反応させた。測定した吸光度を「図13」に示す。右側(SA−MTP PCR)の棒は、種々の濃度についての吸光度を示す。
実施例1の記載に従って、PCR混合物を調製した。しかしながら、混合物の体積を50μlに減少させ、シグマ(Sigma)鉱油(シグマ・ミネラル・オイル(Sigma Mineral Oil)、淡白色油M−3516)30μlで覆った。プライマー、ビオチニル化捕獲プローブIIおよび鋳型ならびに使用濃度は、同一であった。当該工程を開始する前に、熱安定性ストレプトアビジン(SA)で被覆したテクネプレート(Techne plate)(Cat.No.140800)においてPCRを行った。増幅のために、MW−2 Techne−Cyclerを使用した。サイクル条件は、実施例1において使用した条件と同一であった。PCR後、該混合物を37℃で30分間放置した。次いで、3回洗浄し(実施例1を参照)、プレートを、各ウエルについてコンジュゲートバッファー(実施例1を参照)100μlと一緒にインキュベートした。次いで、3回洗浄し、次に、ABTSR溶液(実施例1を参照)100mlと反応させた。測定した吸光度を「図13」に示す。右側(SA−MTP PCR)の棒は、種々の濃度についての吸光度を示す。
熱安定性SAで被覆した微量滴定プレートにおけるthrePCRの間に間接的にプローブを使用するHBVの検出
PCR Cycler9600について使用した容器は、0.5ml容のパーキン・エルマー(Perkin Elmer)カップ(Cat.No.:N801.0537)であった。EP−B−0 331 127に従って、カップの内側を熱安定性ストレプトアビジンで被覆した。実施例10と同様に、反応混合物を調製した。しかしながら、反応混合物の容量は、100μlであり、PCRは、油で覆わなかった。該カップにコンジュゲートバッファーおよびABTSRを200μl/カップ添加した。ABTSRと一緒に15分間インキュベートした後、該混合物をヌンクプレート(Nunc plate)(Cat.No.:838713)中に移し、測定器で測定した。測定した吸光度を「図13」に示す(中央の棒)。
PCR Cycler9600について使用した容器は、0.5ml容のパーキン・エルマー(Perkin Elmer)カップ(Cat.No.:N801.0537)であった。EP−B−0 331 127に従って、カップの内側を熱安定性ストレプトアビジンで被覆した。実施例10と同様に、反応混合物を調製した。しかしながら、反応混合物の容量は、100μlであり、PCRは、油で覆わなかった。該カップにコンジュゲートバッファーおよびABTSRを200μl/カップ添加した。ABTSRと一緒に15分間インキュベートした後、該混合物をヌンクプレート(Nunc plate)(Cat.No.:838713)中に移し、測定器で測定した。測定した吸光度を「図13」に示す(中央の棒)。
熱安定性ストレプトアビジンでのテクネプレートおよびEP−カップの被覆
EP−B−0 331 127に従って被覆を行った。
EP−B−0 331 127に従って被覆を行った。
本発明の核酸固定化方法を使用すると、簡単で有効な固定化を行うことができた。
配列番号1:Synthetic DNA;配列番号2:Synthetic DNA;配列番号3:Synthetic DNA;配列番号4:Synthetic DNA;配列番号5:Synthetic DNA;配列番号6:Synthetic DNA;配列番号7:Synthetic DNA;配列番号8:Synthetic DNA;配列番号9:Synthetic DNA;配列番号10:Synthetic DNA;配列番号11:Synthetic DNA
Claims (2)
- 式I:
P−Z−B−E (I)
[式中、
Pは、トリホスファート基またはトリホスファートアナログ基であり、
Zは、糖または糖アナログ基であり、
Bは、核塩基または核塩基アナログ基であり、
Eは、エレクトロケミルミネッセンス基である]
で示されるモノヌクレオシド三リン酸。
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