JP2005000174A - オリゴヌクレオチドおよびdna分子のヌクレオチド配列の決定方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 次のステップ:
(a) エキソヌクレアーゼ活性の低いDNAポリメラーゼの存在下でプライマーオリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせた未知配列の核酸分子を少なくとも1つ含むテンプレート系を準備すること、
(b) 該テンプレート系と1種のデオキシリボヌクレオチドとを、該プライマーの3'末端への、蛍光成分を有する少なくとも1個のデオキシリボヌクレオチドの取込みによる該プライマーの伸長を可能にして伸長プライマーを形成させる条件下で接触させること、
(c) 蛍光成分から発生した蛍光シグナルを検出することにより該プライマーの伸長が起こったかを検出すること、およびさらに該蛍光成分を除去することなく蛍光シグナルを破壊すること、
(d) 該プライマーに取り込まれたデオキシリボヌクレオチドの数を検出すること、
(e) 取り込まれなかったデオキシリボヌクレオチドを除去すること、および
(f) ステップ(a)から(e)を繰り返して該核酸分子のヌクレオチド配列を決定すること、
を含んでなるDNA配列決定法。
【選択図】 なし
Description
において条件、[Pol] > 50nM + [DNA]、を満たすことが必要である。
dNMP取込み後に切り離し、過酸化水素と下流で反応させるカタラーゼ分子で各dNTPにタグを付す場合、ヌクレオチドの各取込みは、約25kcal/mol×N(Nはカタラーゼにより分解される過酸化水素分子数である)の熱を発生するだろう。過酸化水素の分解熱は、ヌクレオチド取込みに必要な熱よりもすでに約6〜8倍大きい(すなわち、3.5〜4kcal/mol)。約100〜150個の過酸化水素分子の分解について、1塩基の取込み当り発生する熱量は、増幅されていない反応のものの1000倍近い。同様に、酵素結合型免疫吸着アッセイ(ELISA)において一般的に用いられているような有色生成物を生成する酵素を、切り離し可能なタグとして取り込ませてもよい。例えば、酵素アルカリホスファターゼは、無色のp−ニトロフェニルリン酸を有色生成物(p−ニトロフェノール)に変換させ、酵素西洋ワサビペルオキシダーゼは無色のo−フェニレンジアミン塩酸塩を褐色生成物に変換させる。これらの酵素を抗体などのタンパク質に連結させる化学は当業者に公知であり、ポリメラーゼ酵素の活性部位から間隔を置いて酵素を保持するリンカーアームを介して、前記酵素をヌクレオチド塩基に連結させるのに適用させることができる。
Claims (9)
- 次のステップ:
(a) エキソヌクレアーゼ活性の低いDNAポリメラーゼの存在下でプライマーオリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせた未知配列の核酸分子を少なくとも1つ含むテンプレート系を準備すること、
(b) 該テンプレート系と1種のデオキシリボヌクレオチドとを、該プライマーの3'末端への、蛍光成分を有する少なくとも1個のデオキシリボヌクレオチドの取込みによる該プライマーの伸長を可能にして伸長プライマーを形成させる条件下で接触させること、
(c) 蛍光成分から発生した蛍光シグナルを検出することにより該プライマーの伸長が起こったかを検出すること、およびさらに該蛍光成分を除去することなく蛍光シグナルを破壊すること、
(d) 該プライマーに取り込まれたデオキシリボヌクレオチドの数を検出すること、
(e) 取り込まれなかったデオキシリボヌクレオチドを除去すること、および
(f) ステップ(a)から(e)を繰り返して該核酸分子のヌクレオチド配列を決定すること、
を含んでなるDNA配列決定法。 - 次のステップ:
(a) エキソヌクレアーゼ活性の低いDNAポリメラーゼの存在下でプライマーオリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせた未知配列の核酸分子を少なくとも1つ含むテンプレート系を準備すること、
(b) 該テンプレート系と1種のデオキシリボヌクレオチドとを、該プライマーの3'末端への少なくとも1個のデオキシリボヌクレオチドの取込みによる該プライマーの伸長を可能にして伸長プライマーを形成させる条件下で接触させること、
(c) 取り込まれなかったデオキシリボヌクレオチドの濃度の変化を検出することにより該プライマーの伸長が起こったかを検出すること、
(d) 該プライマーに取り込まれたデオキシリボヌクレオチドの数を検出すること、
(e) 取り込まれなかったデオキシリボヌクレオチドを除去すること、および
(f) ステップ(a)から(e)を繰り返して該核酸分子のヌクレオチド配列を決定すること、
を含んでなるDNA配列決定法。 - 次のステップ:
(a) エキソヌクレアーゼ活性の低いDNAポリメラーゼの存在下でプライマーオリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせた未知配列の核酸分子を少なくとも1つ含むテンプレート系を準備すること、
(b) 該テンプレート系と1種のデオキシリボヌクレオチドとを、該プライマーの3'末端への、発熱可能な少なくとも1個のデオキシリボヌクレオチドの取込みによる該プライマーの伸長を可能にして伸長プライマーを形成させる条件下で接触させること、
(c) 発熱可能なデオキシリボヌクレオチドを取り込むことにより発生した熱を検出することによって該プライマーの伸長が起こったかを検出すること、
(d) 該プライマーに取り込まれたデオキシリボヌクレオチドの数を検出すること、
(e) 取り込まれなかったデオキシリボヌクレオチドを除去すること、および
(f) ステップ(a)から(e)を繰り返して該核酸分子のヌクレオチド配列を決定すること、
を含んでなるDNA配列決定法。 - 発生した熱を検出するためにサーモパイルを用いる、請求項3記載の方法。
- 発生した熱を検出するためにサーミスターを用いる、請求項3記載の方法。
- 次のステップ:
(a) バッファー、およびエキソヌクレアーゼ活性の低いDNAポリメラーゼの存在下でプライマーオリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせた未知配列の核酸分子を少なくとも1つ含むテンプレート系を準備すること、
(b) 該テンプレート系と1種のデオキシリボヌクレオチドとを、該プライマーの3'末端への、バッファーにより吸収される熱を発生可能な少なくとも1個のデオキシリボヌクレオチドの取込みによる該プライマーの伸長を可能にして伸長プライマーを形成させる条件下で接触させること、
(c) バッファーの屈折率を測定することによって該プライマーの伸長が起こったかを検出すること、
(d) 該プライマーに取り込まれたデオキシリボヌクレオチドの数を検出すること、
(e) 取り込まれなかったデオキシリボヌクレオチドを除去すること、および
(f) ステップ(a)から(e)を繰り返して該核酸分子のヌクレオチド配列を決定すること、
を含んでなるDNA配列決定法。 - 次のステップ:
(a) エキソヌクレアーゼ活性の低いDNAポリメラーゼの存在下でプライマーオリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせた未知配列の核酸分子を少なくとも1つ含むテンプレート系を準備すること、
(b) 該テンプレート系と1種のデオキシリボヌクレオチドとを、該プライマーの3'末端への少なくとも1個のデオキシリボヌクレオチドの取込みによる該プライマーの伸長を可能にして伸長プライマーを形成させる条件下で接触させること、
(c) 該プライマーの3'末端へのデオキシリボヌクレオチドの付加により放出されるピロリン酸の濃度を検出することによって、該プライマーの伸長が起こったかを検出することであって、ピロリン酸濃度は、ピロリン酸を加水分解し、該ピロリン酸の加水分解により生じた熱を測定することによって検出される、
(d) 該プライマーに取り込まれたデオキシリボヌクレオチドの数を検出すること、
(e) 取り込まれなかったデオキシリボヌクレオチドを除去すること、および
(f) ステップ(a)から(e)を繰り返して該核酸分子のヌクレオチド配列を決定すること、
を含んでなるDNA配列決定法。 - 次のステップ:
(a) エキソヌクレアーゼ活性の低いDNAポリメラーゼの存在下でプライマーオリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせた未知配列の核酸分子を少なくとも1つ含むテンプレート系を準備することであって、該DNAポリメラーゼが、アミノ酸残基Asp112のAlaによる置換およびGlu114のAlaによる置換を有するT4 DNAポリメラーゼである、
(b) 該テンプレート系と1種のデオキシリボヌクレオチドとを、該プライマーの3'末端への少なくとも1個のデオキシリボヌクレオチドの取込みによる該プライマーの伸長を可能にして伸長プライマーを形成させる条件下で接触させること、
(c) 該プライマーの伸長が起こったかを検出すること、
(d) 該プライマーに取り込まれたデオキシリボヌクレオチドの数を検出すること、
(e) 取り込まれなかったデオキシリボヌクレオチドを除去すること、および
(f) ステップ(a)から(e)を繰り返して該核酸分子のヌクレオチド配列を決定すること、
を含んでなるDNA配列決定法。 - DNAポリメラーゼが、アミノ酸残基Ile417のValによる置換を有するT4 DNAポリメラーゼをさらに含む、請求項6記載の方法。
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