JP2004538013A - 神経変性疾患の診療のための遺伝子組換えモデルの開発 - Google Patents
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Abstract
アルツハイマー病、パーキンソン病及びレヴィ小体病は、高齢者において最も一般的に見られる神経変性障害である。本発明は、上記の疾患において見られる、神経炎プラーク、レヴィ小体及び神経変性の形成を引き起こす二つの導入遺伝子、ヒトα−シヌクレイン及びヒトアミロイド前駆体タンパク質を含む遺伝子組換えマウスである。この遺伝子組換えマウスは、機能的及び病理学的アッセイの両者による、疾患の正確なモデルである。
Description
【技術分野】
【0001】
(発明の分野)
本発明は、神経変性疾患の研究において使用される遺伝子組換えマウスに関する。
【0002】
(政府の利害)
本発明は、助成金番号AG10869の下に、国立保健研究所からの政府援助でなされた。
【背景技術】
【0003】
(背景)
アルツハイマー病(AD)、パーキンソン病(PD)及びレヴィ小体病(LBD)は、高齢者において最も一般的に見られる神経変性障害である。それらの発生は増大し続け、重大な社会的な健康問題を引き起こしているが、今までのところこれらの病気は治癒も予防もできない。これらの疾患に対する遺伝要素はあるが、大部分の場合、突然変異なしで集団中で自然発生的に生じる。神経損傷は、脳で正常に発現したタンパク質からなるタンパク質凝集体の発生に起因する。本来は非毒性のタンパク質を、何がそれらの毒性状態へと変換させるのかは知られていない。
【0004】
近年の疫学的研究によれば、アルツハイマー病患者の約30%はPDをも有するとして、ADとPDとの密接な臨床的関係が証明されている。他の高齢集団と比べて、AD患者は大概、合併PDを発生させている。さらに痴呆になったPD患者は、通常古典的なADを発生させている。
【0005】
各々の神経変性疾患は、特定の脳領域及び細胞集団に偏りを有するらしく、明確な病理像をもたらすが、PD、AD及びLBDはまた、共通の特徴を共有する。家族性AD、ダウン症候群及び散発性ADの患者は、PDの典型的な神経病理学的特徴である、扁桃体上にレヴィ小体を増殖させる。さらに各々の疾患は、ニューロンの変性、ニューロン内のシナプス結合及び最終的には細胞死、神経伝達物質の減少、ならびにその前駆体は正常な中枢神経系機能に関与する異常折り畳み構造の蛋白質の異常な蓄積に関連する。
【0006】
生化学的研究から、AD、PD及びLBD間の関連性が確認されている。レヴィ小体の中心成分は、NACP(非アミロイド成分前駆体)としても知られている、α−シヌクレインである。NACとして知られている、NACPのタンパク質分解性フラグメントは、ADにおけるアミロイドプラークの重要な構成要素である。このことは、α−シヌクレインがADとPDの両方の病因にある役割を果たしていることを示唆している。
【0007】
これらの知見は、レヴィ小体病(LBD)と呼ばれる神経変性障害の新規な分類の進展に導いた。LBD患者は、痴呆、パーキンソン症候群、精神変化、アミロイドの沈着、線維状特徴を有するレヴィ小体(LB)の形成で特徴付けられる。LBはPD及びLBDの病態の特徴である。ADのある面を模倣するいくつかの動物モデル及びPDのある面を模倣する他の動物モデルが存在するが、LBDで見られるような、ADとPDの特徴を組み合わせたモデルは存在しない。
【0008】
ADの典型的な病態の特徴である神経炎プラークは、主として、アルツハイマーアミロイド前駆タンパク質(APP)の39〜43アミノ酸(aa)タンパク質分解性生成物であるAβ、及びNACPタンパク質の35aaタンパク質分解性フラグメントであるNACで構成されている。AβとNACの両者は、完全長cDNAが同定されクローン化されている、それらの完全長タンパク質のタンパク質分解性フラグメントとしてアミロイドプラーク中で最初に同定された。APPのクローン化(Kangら、1987年)は、結果として研究の急増につながり、その中でADにおける多数の変異が見出されており、K670N/M671L(スウェーデン変異)、V717I(ロンドン変異)、V717F(インディアナ変異)、プレセニリン1及びプレシニリン2を含む家族性型が関連付けられた。(注記:変異は、野生型アミノ酸、変異が見出されたアミノ酸の番号、及びタンパク質の変異型において見出されたアミノ酸で示される)。これらの変異は、APPのプロセッシングを、病原性を有する凝集体を形成する傾向があるAβ1−42タンパク質分解性フラグメント優先へと変更すると思われる。しかしながら、そのような変異では、病気が自然発生的に生じる大部分のアルツハイマー患者を説明することはできない。
【0009】
APPは正常な状態でシナプスにおいて多く発現され、種を超えてよく保存されており、神経の柔軟性、学習、及び記憶に関係している。APPは、完全長転写物から、エクソン7及び8(hAPP695)、エクソン8(hAPP751)または無エクソン(hAPP770)がスプライシングされた、3種の代替スプライシング変異型を有する。3種の型の比率は、脳の領域の間及び正常状態と病気の状態で異なるが、正常と異常の明確なパターンは決定されていない(Rockensteinら、1995年)。転写物の異なるスプライシングを調整するものが何であるかは知られていないが、証拠は、ニューロン中でのスプライシングはニューロンの分化及び活性に影響を及ぼす因子によって調整され得ることを示唆している。さらに、APPは正常な状態で、タンパク質分解性フラグメントAβ39−43にプロセッシングされる。疾患は、タンパク質分解性フラグメント、特に凝集体(すなわち、Aβ1−42)の形成を開始できるものの過剰産生に偏った、フラグメントの産生におけるアンバランスに起因する。
【0010】
α−シヌクレインは、β−及びγ−シヌクレインならびにシノレチンを含む大きなファミリーのタンパク質の一部である。APPと同様、α−シヌクレインは正常状態でシナプスで発現され、神経の柔軟性、学習、及び記憶においてある役割を果たすと考えられている。α−シヌクレインの凝集を促進する、ヒト(h)α−シヌクレインにおける変異が同定されており(A30P及びA53T)、そしてそれらはPDの常染色体の優性形の希少形に関係している。これらの変異が、α−シヌクレインの凝集する傾向を増大させるメカニズムは知られていない。
【0011】
集団中に多数の変異をAPP及びα−シヌクレインに見出すことができるという事実にも拘わらず、AD及びPDの多くのケースは自然発生的に生じる。これらの病気のうち最も多い散発性型は、それぞれ、Aβ及びα−シヌクレインの異常蓄積に関係している。しかしながら、これらタンパク質の過剰蓄積の理由は知られていない。Aβはニューロンから分泌され、細胞外アミロイドプラーク中に蓄積する。さらに、Aβはニューロン内部で検出される。α−シヌクレインは、レヴィ小体と呼ばれるニューロン内の封入体中に蓄積する。この二種のタンパク質は典型的には共に細胞外神経ADプラーク中で見出されるが、それらはまた時々細胞内封入体中で一緒に見出される。
【0012】
無毒性前駆体タンパク質の、それらのタンパク質分解性生成物へのプロセシングは、組織培養系中と精製タンパク質を用いての両方において、解析するために研究が行われている。α−シヌクレインの過剰発現により、凝集体が神経細胞培養において形成されうる。野生型APPの過剰発現は、培養において細胞外タンパク質凝集体の形成を引き起こさないが、APP変異の最も病原性のものであるスウェーデン変異の過剰発現は引き起こす。凝集体はまた、α−シヌクレインを過剰発現している細胞中で、細胞培養における酸化的ストレスに対応して形成され、それが病気の発生において重要であることを示唆している。さらに、精製Aβ及びNACペプチドは、単独であるいは混合されて、同一の温度及びpH条件下で、生体外で凝集体を形成することができる。
【0013】
AD、PD及びLBDの動物モデルを構築する試みは期待はずれであった。当初は、遺伝子組換えAPPを発現する動物は、広範なAD型神経病態を示さなかった(Kammesheidtら、1992年;Lambら、1993年;Muckeら、1994年;Higginsら、1995年;Andraaら、1996年)。これはおそらく、タンパク質の発現が低レベルであることが原因だろう。Gamesら(1995年)は、PDGF−βプロモータで駆動される変異型APP(V717F)が高レベルで発現するため、あるAD型病態を示す遺伝子組換えマウスを作成することができた。遺伝子組換え動物は、海馬、脳梁及び大脳皮質でのヒトAβの沈着を示したが、脳の他の領域では示さなかった。プラークは観察されたが、神経原線維変化はなかった。著者は、神経原線維変化は齧歯動物には存在しないので、そのような結果が予想されたと述べた。
【0014】
Thy1発現カセットの制御下で、スウェーデン型二重変異(670/671)、またはロンドン変異(V717I)と結合したスウェーデン型変異を発現する、遺伝子組換えマウスも作成された(Sturchler−Pierratら、1997年)。プラークの発生する年齢は、各々のマウス種において、6ヶ月から2年以上の間で変動し、タンパク質の発現レベルによく相関しているようだった。スウェーデン型及びインディアナ型変異の両方を有する動物において、病気に関連する病理的変化を誘起するには、より低い発現レベルが必要だった。しかしながらいずれの動物も、病気を完全かつ正確には現さなかった。神経変化、ジストロフィーのコリン作動性線維及び炎症を伴うプラーク形成が海馬及び新皮質で観察されたが、他の脳領域では観察されなかった。PrP−プロモータ下でAPPのスウェーデン型変異を発現する遺伝子組換えマウスを用いた別の研究において(Hsiaoら、1996年)、マウスは3ヶ月において正常な学習と記憶を有することが見出されたが、9ヶ月または10ヶ月までに障害が現れた。プラークは、これらの遺伝子組換えマウスにおいて皮質及び辺縁系領域で観察され、Aβ1−42 / 43の14倍の増加が観察された。
【0015】
Aβ1−42はADにおける強い原因因子の一つであることが知られているので、Muckeら(2000年)は、APPの毒性フラグメント、Aβ1−42のみを発現する遺伝子組換えマウスを作成した。Aβ1−42フラグメントの発現は細胞毒であったが、プラークは形成されず、ADの進行におけるAβ1−42に対するプラーク非依存的な役割を示唆している。
【0016】
さらに、APPを発現する遺伝子組換え動物は、学習欠損、障害のある挙動及び発作を含む種々の神経異常を示すことが見出された。再び、神経の機能不全の重篤さは、APPタンパク質の発現レベルと結びついているように思われた。相違は、また、プロモータ、ゲノムへの統合等における相違による、APPが発現される脳の領域に帰することができる。生理的な症状と同様に、これらの動物における神経機能不全は、AD、PD及びLBDにおいてみられるそれらのある面で、ただしすべてではないが、類似していた。この病気に対する動物モデルがないことは、明らかに努力不足のためではなく、むしろ病気の状態において生じるすべての変化を誘起ことができないためである。
【0017】
遺伝子組換え配列の発現効果は、また、変異遺伝子が発現されるマウスの系統に大きく依存した。例えば、異系交配遺伝子組換え系統においてプラークを産生するAPPの濃度は、近交系のFVB/NまたはC57BL/6Jマウスにおいて致命的であることが見出された(Carlsonら、1997年)。生存可能な十分低いレベルのAPP695を発現するFVB/Nマウスの系統は、主に大脳におけるグルコース利用の減少及び星状細胞増加症と共に、新奇恐怖症、損傷された空間的交互変化を含むCNS障害を発生させることが見出された(Hsiaoら、1995年)。同様の症候群が同一の種の非遺伝子組換えマウスの約20%で発生することが知られており、APPがその系統の中にすでに存在する傾向を促進することを示唆している。
【0018】
遺伝子組換えマウスの系統を交配して病気の症状を変化させることにより、ADのより正確なモデルを発生させる試みがなされた。APPを過剰発現する遺伝子組換えマウスにおける線維芽細胞増殖因子2遺伝子(FGF2)の過剰発現は、APPをより致命的なものとするが、見られる症状を変えることはない。Holtzmanら(2000年)は、APPのV717F変異型を発現する遺伝子組換えマウスと種々の形のアポリポタンパク質E(アポE)を発現するマウスとを交配することによって、多数の二遺伝子マウスを発生させた。アポEのε4対立遺伝子は、散発性AD及び遅発型家族性AD(FAD)に対して同定された最初の遺伝的危険因子であった(Strittmatterら、1993年)。その後、アポEのε3対立遺伝子は、その疾患に対するより弱い危険因子であることが見出された。マウスにおけるAPPのV717F変異型バージョンと共に、アポE変異型、特にε4対立遺伝子の発現は、細線維沈着、神経プラーク及び神経変性の発生を増大させた。ADの同様の病態的特徴は、APPのV717F変異型のみを発現するマウスにおいて、単純に老齢期に観察された。導入遺伝子の発現の組み合わせは、病気の観察された病態を変化させることはなく、単純に病態が観察される時間枠を変化させた。アポEノックアウトマウスにおけるAPPのV717F変異型バージョンの発現は、神経変性をもたらさなかった。この研究は、ADの病態におけるアポEの明確な役割を示しているが、一重の遺伝子組換えマウスよりもより正確なその病気のモデルは提供しなかった。
【0019】
PDGFβプロモータの制御下でα−シヌクレインを発現する遺伝子組換えマウスはまた、PD及びLBDのモデルとして使用されるために生み出されている(Masliahら、2000年)。α−シヌクレインのニューロンでの発現は、α−シヌクレインの進行性の蓄積及び新皮質、海馬及び黒質におけるニューロン中の封入の発生をもたらした。さらに、電子が密な核内沈着及び細胞質内封入が観察された。そのマウスは、基底核中のドーパミン作用性の末端欠損に関連する運動障害を示した。しかしながら、アミロイドプラーク、線維変化または細胞死は観察されなかった。
【0020】
多数のα−シヌクレイン遺伝子組換えマウスが、同様に、生成されている。しかし、α−シヌクレインの野生型及び変異型(A30P及びA53T)の両方の使用はもとより、異なるプロモータ(例えば、PDGFβ、Thy−1)も使用したにもかかわらず、どのマウスもPDの完全に的確なモデルをもたらさない。種々のAPP遺伝子組換えマウスと同じく、使用したプロモータとゲノムへの導入遺伝子の挿入部位に依存して、タンパク質の発現量及び発現位置に相違が見られた。例えば、hα−シヌクレイン導入遺伝子からの発現がPDGFβプロモータにより駆動された場合には、hα−シヌクレインの発現パターンは、正常な脳または広汎性LBDにおいて見られるものと最も酷似していた。Thy−1プロモータを用いたhα−シヌクレインの発現は、PDにおいて見られる発現パターンに最も酷似したパターンで、導入遺伝子のより高い発現をもたらした。より高い発現は、より重篤な病態をもたらした。hα−シヌクレインの変異型バージョンを発現するマウスは、タンパク質の野生型バージョンを発現するものよりも早く病気の特徴を明らかに示した。さらに、神経機能不全は、タンパク質が発現される脳の領域に依存する。
【0021】
病気の状態は、しばしば、単一タンパク質または遺伝子内の単一変異の発現レベルにおける変化よりもむしろ、生物における多重変化の結果である。上記の遺伝子組換え動物の各々はAD、PD及び/またはLBDのある特徴を有しているが、それらはいずれもどの病気についても完全なモデルを与えることはできなかった。単一の動物で、ADの典型的な指標である神経原線維変化を有するものは見出されなかった。AD、PD及びLBDの病態と発生が重複していることを認識すると、病気の病態及び臨床的徴候のより完全なセットを示す動物モデルの必要性が強調される。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【0022】
(発明の要約)
本発明は、ヒトβ−アミロイドペプチドまたはhAPP及びhα−シヌクレインの発現用導入遺伝子を有する遺伝子組換えマウスモデルである。導入遺伝子は、遺伝子の野生型、変異型または切断型でありうる。導入遺伝子は、PDGF−β、Thy1及びプリオン(PrP)プロモータを含む多数のプロモータのいずれかの下で、発現されうる。SV40イントロンのようなイントロンは、導入遺伝子構築物またはプロモータに含まれていてもよく、Thy1プロモータの場合のように、プロモータのイントロンを用いてもよい。
【0023】
本発明のマウスは、α−シヌクレインまたはhAPPに対する単一遺伝子を有するマウスの交配によって生成される。出願人は、hα−シヌクレインを過剰発現する遺伝子組換えマウス系統(Masliahら、2000年)及び野生型または変異型のいずれかのhAPP(Muckeら、2000年)を多数生成して、AD、PD及びLBDにおけるアミロイド生成の生体内メカニズムを解明している。さらに、参照されるように、入手可能な多数の他のhAPP遺伝子組換えマウスが存在する。入手可能なマウスには、マウスまたはヒトThy1プロモータの制御下でAPPを発現するもの(Andraaら、1996年)、SV40イントロンを有するまたは有しないPDGF−βプロモータ(Gamesら、1995年)、及びPrP(Borcheltら、1996年;Hsiaら、1999年)プロモータが含まれる。それらマウスはよく研究され、導入遺伝子が発現される脳の領域及び時間枠について特徴が明らかにされている。二遺伝子マウスは、所望によりAD、PDまたはLBDによって最も達成される脳の領域においてhAPPまたはhα−シヌクレインのいずれかを過剰発現する2頭のマウスを交配することにより、容易に生成することができる。理想的には、交配されたマウスは、両方の導入遺伝子を発現する、どちらかの導入遺伝子を発現する、またはいずれの導入遺伝子をも発現しない同腹子を互いに比較できるように、導入遺伝子のただ一つのコピーを有する必要がある。導入遺伝子の過剰発現は、それらに限定されるものではないが、リボヌクレアーゼ保護アッセイ(RPA),ウエスタンブロット、免疫蛍光法、または他の分析法を含む当業者に周知の多数の方法のいずれかによって、検出することができ、そこにおいて、得られるシグナルは、非遺伝子組換え同腹子で見出されるマウスRNAまたはタンパク質とのバックグラウンド交差反応性を超えるものである。
【0024】
本発明の二遺伝子PDGF−β−α−シヌクレイン−PDGF−β−hAPPマウスは、年齢及び脳領域特異的な形で形態的にADにおいて見られる老年性プラークに類似の、細胞外アミロイドーシス及び神経原線維変化を示すことに加えて、適正にAβフラグメントにプロセッシングされたAPPを発現することが示されている。hα−シヌクレインの発現が、hAPPの発現を変えるようにはみえなかった。しかし、単一のhα−シヌクレインマウスに比べて、二遺伝子マウスにおいてhα−シヌクレインの広範な蓄積が存在した。
【0025】
PDGF−β−α−シヌクレイン−PDGF−β−hAPP二遺伝子マウスにおける機能的及び形態的な変化は、ADのレヴィ小体変異型に似ていた。二遺伝子マウスは、生理的かつ病理的特徴を生み出し、そして単一遺伝子組換えマウスに比べて、ヒトの病気状態により酷似して、運動機能を低下させた。両方の遺伝子の発現の組み合わせの効果は、相乗的である。それ以前には齧歯動物では観察されなかったがPD及びLBDの標準的な特徴である、線維α−シヌクレイン封入体の発生が見られた。シナプスの変性が単一遺伝子組換えマウスの両方で観察されていたが、二遺伝子マウスでは見られた、ニューロン細胞の死は観察されていなかった。二遺伝子マウスは、学習及び記憶において重篤な欠損を有し、運動欠損症が生じたとしても軽微なものを示すのみであるPDGF−β−α−シヌクレイン単一遺伝子組換えマウスより先に、運動欠陥が発生した。運動欠陥の発症は、PDGF−β−hAPPマウスで典型的に見られる12ヶ月ではなくて、二遺伝子マウスでは6ヶ月で始まった。二遺伝子マウスは、単一遺伝子組換え同腹子または非遺伝子組換え同腹子に比べて、コリン作動性ニューロン及びシナプス前末端の最も顕著な年齢依存性変性を示した。シナプス変性は単一遺伝子組換えマウスにおいて観察されたが、ニューロン細胞死は単一遺伝子組換え同腹子では観察されなかった。hAPP−α−シヌクレインマウスは同じく、大量のβ−アミロイドプラークを有し、そしてむしろより多数のα−シヌクレイン−免疫反応性ニューロン封入体を有した。超微細構造的に、これらの封入体は、しばしば、二重遺伝子組換えマウスにおいて線維状であるが、単一遺伝子組換えα−シヌクレインマウスでは不定形であった。これは、以前には、齧歯動物には存在しないと考えられていた線維状レヴィ小体様封入体の存在の最初の実証である。
【0026】
さらに、本発明は、α−シヌクレインとAPPとの組み合わせの、アミロイド生成及び神経変性に対する生体内での効果を評価する方法である。病気の発生及び進行におけるタンパク質の効果の評価は、機能的、病理的、または生化学的アッセイにより、理想的には、α−シヌクレインまたはhAPPのいずれかに対する単一の導入遺伝子のみを有するかあるいは導入遺伝子を有しない同腹子と比較して、評価しうる。二遺伝子α−シヌクレイン−hAPPマウスでの研究は、hα−シヌクレイン及びhAPP/Aβが脳の統合性及び機能に対して明確な、そして重複する病原性の効果を有することを示している。hα−シヌクレインは脳におけるAβ依存性の神経プラークの発生または全体としてのAβ含有量に影響を与えないが、特定の脳の領域において、hAPP/Aβ依存性の認識欠如及び神経変性を悪化させる。これらの知見は、hα−シヌクレインがプラーク非依存性メカニズムを通してAβの毒性を増強できることを示している。それらは、ADのレヴィ小体変異を持つ人々は、純粋なADを持つ人々よりも、急激な認知減退を有することが示唆される、臨床所見とよく相関している。hAPP/Aβの過剰発現は、今度は、遺伝子組換えマウスにおいてhα−シヌクレインのニューロン内蓄積を促進し、運動欠陥の発生を加速した。Aβとhα−シヌクレインとの間のこれら病原性相互作用の観点から、Aβまたはhα−シヌクレインの蓄積を阻止することを目的とする医薬は、以前に予期されていたよりも広いスペクトルの神経変性障害に利益をもたらすことになるであろう。さらに、二遺伝子マウスは患者に対して有用である介入の可能性についてのよりよい予見モデルを提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【0027】
(詳細な説明及び好ましい態様)
α−シヌクレインまたはAPPの変化した発現及びプロセッシングがAD、PD及びLBDのような神経変性障害をもたらすメカニズムは多少不明のままである。異常なタンパク質凝集がこれらの障害における共通の特徴であり、そして完全長α−シヌクレインまたはそのタンパク質フラグメントのいずれか及びAβがこれらのタンパク質凝集体の主な成分であることが一般に理解されている。多くの病的状態において、多重変化が完全な病状の発生に必要である。APPまたはα−シヌクレインのいずれかに単一の変異を持つ動物モデルは、AD、PDまたはLBDの正確なモデルをもたらしていない。しかしながら、二遺伝子PDGF−β−α−シヌクレイン−PDGF−β−hAPPマウスは、単一遺伝子組換え動物のいずれにおいても以前には観察されなかったこれらの病気の特徴を示す。両方のタンパク質を発現することによって、病気の正確なモデルが得られる。異なるレベルの各々のタンパク質を発現するマウスの使用により、病気の発生及び重篤度の割合が異なる種々のモデルを得ることができる。これらは、ヒトにおいて見られる差異の模倣であろう。
【0028】
hAPPまたはα−シヌクレインを発現する遺伝子組換えマウスは、低発現系統及び高発現系統の二つの一般的カテゴリーに分けることができる。この分類はさらに変異タンパク質よりも低毒性である野生型タンパク質を発現するマウスに再分割できる。例えば、APPを発現するすべてのマウスは、最終的には、いくらかのプラークといくらかの病気を発生するだろう。しかしながら、プラークの発生及び生じる病気の速度は、aa670/671でのスウェーデン二重変異を発現するマウスで最も速いだろう。aa717での単一変異でのhAPPの発現は、年齢が合致した動物においてより少ないプラークで病気をもたらすであろう。同様に、異なる変異及びプロモータは、α−シヌクレイン遺伝子組換えマウスにおいて病気の種々の重篤度を示すことになろう。Thy−1プロモータの制御下でhα−シヌクレインを発現するマウスは、視床、基底核、黒質及び脳幹を含む、脳全体にシナプス及びニューロン中にタンパク質を蓄積する。PDGF−βの制御下でα−シヌクレインを発現するマウスの1系統は、神経皮質のより深い層中のニューロンの封入体中と同様に、新皮質、辺縁系及び嗅覚部におけるシナプス中にタンパク質を蓄積する。他の系統は、多重系萎縮を模倣して、グリア細胞中でのα−シヌクレイン発現を示した。
【0029】
単一遺伝子組換えマウスにおいて見られなかった病態を生じさせるべくタンパク質が相乗的に働くためには、同一の脳領域でそれらのタンパク質を発現させるマウスの系統を番にする必要がある。Aβ1−42の産生は、明らかに、二遺伝子マウスにおけるLBD様状態の発生における駆動力である。hAPPの発現は、hα−シヌクレインの蓄積を増大させる。それはまた、病気の重篤度を増し、そしてhα−シヌクレイン遺伝子組換えマウスにおいて早い年齢での病気の発症をもたらす。明白な病気を持たないhα−シヌクレイン遺伝子組換えマウスは、APPのアミロイド生成バージョンを発現する遺伝子組換えマウスと交配すると、病気を発生させる。明白な病気を持たないhα−シヌクレインマウスとhAPPの非アミロイド生成バージョンを発現する遺伝子組換えマウスとの交配は、病気の発生プロセスを悪化させない。AD、PD及びLBDの自然発生形は、相対的に緩慢な発症を有し、低レベルの変異タンパク質発現を示唆しているので、有意な病気を示さない二つの系統の交配だけでは、ヒトでしばしば見られる病気の自然発生的発症に対するモデルを提供しない。同様に、α−シヌクレインよりも早期にAPPを発現する遺伝子組換え動物は、後で痴呆になるAD患者を模倣する。両方のタンパク質を低レベルで発現する遺伝子組換え動物は、AD、PD及びLBDでは遅い、それらの病気の自然発生的発症を模倣する。発現の脳領域はまた、特定の遺伝子組換え系統を交配するという動機を与える。例えば、LBDにおいて最も重篤にもたらされる脳の領域においてhAPPとhα−シヌクレインを発現するマウスは、LBDに対するモデルを与えるために交配させることができた。
【0030】
存在する遺伝子組換えマウスは、タンパク質発現のレベルと脳領域、症状の発生する年齢、神経障害及びバックグラウンド系統の効果等の基準に基づいて選択される。多数の表現型をもたらすことができるマウス胚に構築物を挿入することにより発生させられた遺伝子組換えマウスとは異なり、本発明のマウスは、周知の特徴を持つマウスの組み合わせによって生み出された二遺伝子マウスである。モデルは、上で列挙した中の基準に基づいて、対象の病気に最もよく適合するようにデザインされる。一つのタンパク質の発現は、他の発現によって妨害されない。hAPPの共発現によるα−シヌクレインの病態の悪化は知られていない。当業者は、対象の病気の状態を最も近く模倣する二遺伝子系統を作成するために、マウスの既知系統の組み合わせにおいて合理的な決定をなしうる。
【実施例1】
【0031】
遺伝子組換えα−シヌクレイン及びhAPPマウスの創出。遺伝子組換えマウスは、Lederらに発行された米国特許第4,736,866号に記載され、B.Hoganら(1986年)によって提供された、マイクロインジェクション法を用いて、当業界で日常的に作製されている。Jolicoeurに発行された米国特許第5,574,206号では特に、機能的HIV遺伝子を有する遺伝子組換えマウスの作成及びHIV介在疾病のモデリング及び研究におけるそれらの使用が記載されている。これらの文献は、ここに引用して援用する。
【実施例2】
【0032】
hα−シヌクレイン及びhAPPの生体内での共発現。hα−シヌクレイン(Masliahら、2000年)またはFAD−変異hAPP(Muckeら、2000年)のニューロン発現がPDGFβ鎖プロモータにより導かれる遺伝子組換えマウスは記載されている。さらに、本出願に記載のものを含めて多数の他のAPPマウスが記載されているが、それらに限定されるものではない。高レベルのニューロン性hα−シヌクレイン(系統D)またはAβ(系統J9)産生系統が選択された。これらの系統からの異型接合hα−シヌクレインと異型接合hAPPマウスの間での交配は、4群の同腹子:hα−シヌクレインマウス(n=26)、hAPPマウス(n=32)、hα−シヌクレイン/hAPPマウス(n=21)、及び非遺伝子組換え対照(n=31)を与えた。脳での導入遺伝子由来のmRNAのレベルは、単一遺伝子組換えマウス及び二重遺伝子組換えマウスにおいて同様であり、hα−シヌクレイン及びhAPPの共発現は導入遺伝子発現を変えないことを示した(図2)。タンパク質レベルにおいて、hα−シヌクレインの発現は、二重遺伝子組換えマウスでのhAPP発現に影響を与えなかった。しかしながら、脳のhα−シヌクレインレベルは、hα−シヌクレインマウスよりもhα−シヌクレイン/hAPPマウスにおいてより高い傾向があり、Aβのhα−シヌクレイン蓄積への効果を反映していると思われる。
【実施例3】
【0033】
二遺伝子マウスにおけるヒトα−シヌクレインの過剰発現はアルツハイマー病様の神経病態を悪化させる。α−シヌクレインとNACの両方はアルツハイマー病の生体外モデルにおいて形成されるプラークの統合成分であることが立証されている。これらの分子が生体内で、特にPDAPP二遺伝子マウスモデルで、アミロイド生成にどのように寄与しているかを確定するために、得られた二遺伝子マウスからの脳切片をギ酸で処理し、α−シヌクレイン及びNACに対する抗体で免疫染色した。結果の解析から、アルツハイマー病の生体外モデルとして、PDAPP二遺伝子マウスにおいて、NACがアミロイドコアに存在し、一方α−シヌクレインはジストロフィーの神経突起で見出されることが確認される。さらに、α−シヌクレインを過剰発現するPDAPP二遺伝子マウスの神経病理学的検討から、アミロイド沈着の増加を伴う新皮質及び海馬における広範囲にわたる星状グリオーシスが解明され、α−シヌクレインの発現増加がアミロイド生成に関連する神経変性状態の病原性に重要な役割を果たすことが再度確認された。したがって、α−シヌクレインは生体内プラーク形成にきわめて重要であり、それ自体で、アルツハイマー病及びアミロイド生成を含んでいる他の神経変性状態の生体内治療に有用な抗アミロイド生成化合物の設計に対する合理的なターゲットを構成することが、最終的に実証された。
【実施例4】
【0034】
hα−シヌクレイン/hAPPマウスにおける神経欠損。運動欠陥は回転棒試験で評価された(図1)。以前の観察と一致して、hα−シヌクレインマウスは年齢依存性運動欠陥を生じた。月齢6ヶ月で、hα−シヌクレイン/hAPPマウスは既に非遺伝子組換え対照に対して欠損を示したが(反復測定ANOVAによると、P<0.03)、hα−シヌクレインマウスは依然として正常に実行した。月齢12ヶ月で、hα−シヌクレインマウスとhα−シヌクレイン/hAPPマウスの両方が、非遺伝子組換え対照(反復測定ANOVAによると、P<0.001)に比較して、この試験で欠損を示した。hAPPマウスは、いずれの年齢でも、有意な運動欠陥を有しなかった。運動欠陥の重篤度は、6月齢のhα−シヌクレイン/hAPPマウスと12月齢のhα−シヌクレインマウス及びhα−シヌクレイン/hAPPマウスで同様であり、hAPP/Aβがhα−シヌクレイン依存性運動欠陥の発生を促進することを示唆している。
【0035】
PDGF−hAPPマウスは、以前から認知欠損を発生することが示されている。hα−シヌクレイン及びhAPP/Aβの空間学習及び記憶に対する効果を確定するために、マウスを水迷路試験(Morris、1984年)で評価した。目標のプラットフォームが目に見えるセッションでは、すべての群のマウスは等しくうまくプラットフォームを探し出すことができ、hα−シヌクレイン/hAPPの運動欠陥は、水迷路試験において正常な動作を妨げないことを示していた。プラットフォームが隠されたセッションでは、マウスは、迷路外の見える手掛かりとプラットフォームとの空間的関係の記憶を用い、沈んだプラットフォームを探し出さなければならない。これらのセッションでは、hα−シヌクレイン/hAPPマウスは、最も有意な学習欠損を示し、一方、hα−シヌクレインマウスと非遺伝子組換え対照は正常に実行した。hAPPマウスは、隠されたプラットフォームのセッションで、hα−シヌクレイン/hAPPマウスよりも良好に実行する傾向があったが、その差は、統計的に有意ではなかった。その間にプラットフォームを移動する精査試験は、空間記憶保持力の推定尺度を提供する。精査試験では、hα−シヌクレイン/hAPPマウス及びhAPPマウスは、非遺伝子組換え対照よりも目的の象限への有意により少ない実行を示して記憶保持力の障害を示唆したが、一方、hα−シヌクレインマウスに障害性はなかった。
【0036】
これらの結果は、hα−シヌクレイン/hAPPマウスの運動欠陥は主にhα−シヌクレインにより引き起こされるが、空間学習及び記憶における欠損は、主にhAPP/Aβにより引き起こされることを示している。hα−シヌクレイン及びhAPPの同様の効果は、同じく運動欠陥及び認知欠損が組み合わさった、レヴィ小体病の原因となるだろう。
【実施例5】
【0037】
年齢依存性神経変性。マイネルト基底核におけるコリン作動性ニューロンの変性は、齧歯動物における水迷路試験での重大な獲得欠損をもたらす。それはまた、AD及びレヴィ小体病における認知減退の潜在的に重要な決定因子である。コリンアセチルトランスフェラーゼ(ChAT)は、アセチルコリンの合成に介在し、コリン作動性ニューロンのマーカーとして役立つ。遺伝子組換えモデル(n=12〜13頭/遺伝子型、月齢範囲:4〜20ヶ月)の基底核中のChAT免疫反応性ニューロンの密度を測定した。hα−シヌクレイン/hAPPマウスでは、単純な回帰分析から、加齢とコリン作動性ニューロンの数との間の高い有意な逆相関関係が見出された(R=0.828、P=0.0005)。そのような相関関係への傾向は、hα−シヌクレインマウス(R=0.538、P=0.071)及びhAPPマウス(R=0.511、P=0.089)においても存在するが、非遺伝子組換え対照(R=0.127、P=0.695)においては存在しない。コリン作動性ニューロンの最大の損失は、hα−シヌクレイン/hAPPマウスにおいて観察され、その一方では、より穏やかな損失が加齢hAPPマウスで見出された。これらの結果は、コリン作動性欠損はADのレヴィ小体変異型を持つヒトの場合に、純粋なADを持つ場合よりも重篤であるという所見と一致する。hα−シヌクレイン/hAPPマウス及びhAPPマウスは同様に、尾状核/被殻でのコリン作動性ニューロンの有意な損失を有し、これはレヴィ小体を持つまたは持たないAD患者の尾状核でのChAT活性の減少と一致する。
【0038】
ADまたはADのレヴィ小体変異型を持つ人々は、典型的に新皮質中の有意なシナプス損失をも生じ、それがシナプトフィシンの免疫反応性の低下に反映する。4〜20ヶ月齢のマウス(n=15〜19/遺伝子型)の新皮質中の、定められたシグナル強度のシナプトフィシン免疫活性シナプス前終末(SIPT)を測定した。hAPPマウス(R=0.744、P=0.0006)及びhα−シヌクレイン/hAPPマウス(R=0.524、P=0.021)において、加齢と新皮質SIPTレベルとの間に有意な逆相関関係があったが、hα−シヌクレインマウス(R=0.479、P=0.071)または非遺伝子組換え対照(R=0.151、P=0.564)においてはなかった。月齢20ヶ月では、新皮質におけるSIPTレベル(占有面積%、平均±SD、n=3〜4頭/遺伝子型)は、非遺伝子組換え対照(25.6±0.9)において最も高く、hα−シヌクレイン/hAPPマウス(18.3±4.8、チューキー・クレーマー検定でp<0.05)において最も低く、hAPPマウス(20.9±1.7)及びhα−シヌクレインマウス(23±0.9)に対する値は中間に位置した。対照的に、尾部/被殻でのSIPTレベルは、20ヶ月齢(平均±SD、n=3〜4頭/遺伝子型)では、非遺伝子組換えマウス(27.1±1.5)及びhAPPマウス(25.1±3.6)において正常であるが、hα−シヌクレインマウス(21.0±0.9)及びhα−シヌクレイン/hAPPマウス(20.1±1.7)(チューキー・クレーマー検定で非遺伝子組換え対照に対してP<0.05)において減少した。
【0039】
これらの結果は、hα−シヌクレイン/hAPPマウスにおけるコリン作動性ニューロンの年齢依存性の損失は、基底核においていくつかの付加的効果を有するhα−シヌクレインと共に、主にhAPP/Aβに依存することを示唆している。これらのマウスの新皮質でのSIPTの年齢依存性の損失は、hα−シヌクレインの少しの寄与と共に、主としてhAPP/Aβにもよるものであるのに対して、基底核におけるSIPTの損失は、ほとんど全くhα−シヌクレインによるものである。
【実施例6】
【0040】
Aβはhα−シヌクレインの蓄積を助長する。ニューロン内でのhα−シヌクレインの蓄積は、ADのレヴィ小体変異型を含む、レヴィ小体病の特徴である。hα−シヌクレイン単一遺伝子組換えマウスのニューロン中におけるhα−シヌクレインの年齢依存性蓄積は、既に観察されている(Masliah、2000年)。月齢4〜20ヶ月の間で、新皮質中でのニューロンの封入体の数は、hα−シヌクレイン/hAPPマウスにおいて、年齢が合致するhα−シヌクレインマウスよりも平均して1.6倍高かった(mm2あたり15.3±1.1対9.5±0.9、平均±SEM、不対両側スチューデントt検定でP=0.0002、n=28〜32頭/遺伝子型)。これは12月齢のマウスで例証される。封入体の数は、hα−シヌクレインマウス及びhα−シヌクレイン/hAPPマウスの両方で加齢と共に増加した。これらの結果は、hAPP/Aβがニューロンでのhα−シヌクレインの蓄積を促進することを示している。
【0041】
超構造解析により、hα−シヌクレインマウスにおけるすべてのニューロン内封入体は非晶質で電子稠密なのに対し、hα−シヌクレイン/hAPPにおけるニューロン内封入体の多くは線維状で、典型的に線維状要素を含むヒトの病気でのレヴィ小体との類似性が増していた。ニューロン細胞質中の線維状の封入体は、hα−シヌクレイン/hAPPマウスの脳切片が抗hα−シヌクレインまたは抗Aβを用いた免疫金電子顕微鏡による分析において、金粒子で装飾された。これらの結果は、Aβが直接的な相互作用によって、hα−シヌクレインの生体内線維化を促進することを示唆している。さらに、この可能性を支持して、Aβ−免疫反応性顆粒状沈着物が、hα−シヌクレイン/hAPPマウスにおけるhα−シヌクレイン−陽性ニューロン内封入体中で共焦点顕微鏡分析により検出された。
【0042】
hα−シヌクレイン/hAPPマウスにおいて観察された変化が本当にAβとhα−シヌクレインとの間の病原性相互作用から生じたものであるかどうかをさらに評価するために、生体内分析を二つの生体外モデルに拡張した。無細胞系では、新たに溶解した場合と想定される凝集した(加齢)場合の両方のヒトAβ1−42が、以前の観察と一致して、hα−シヌクレインの高分子量ポリマーの生成を強く促進した。対照的に、より線維質の少ないAβ1−40はhα−シヌクレインの生体外での凝集に影響を及ぼさなかった。明らかに、Aβ1−42とAβ1−40はまた、培養培地に加えたときに、ニューロンの細胞培養において、α−シヌクレインの細胞内蓄積に対するそれらの効果が異なっていた。Aβ1−42はα−シヌクレインの細胞内蓄積を強く増大させたが、Aβ1−40は増大させなかった。
【0043】
小胞体及び中間コンパートメント内でのAβ1−42の過剰産生は、その蓄積を促進するhα−シヌクレインのプロセッシングを妨害しうる。しかしながら、細胞培養データは、Aβ1−42への細胞外暴露は、hα−シヌクレインの細胞内蓄積を誘起するのに十分なのに対し、Aβ1−40への暴露はそうではないことを示している。この意味において、細胞の細胞外Aβ1−42へのインキュベーションは、リソソーム膜の完全性を乱すのに対し、Aβ1−40への細胞のインキュベーションではそうならないことは興味深い。また、溶解性hα−シヌクレインと平面状脂質二重層との会合は、広範な二重層の崩壊をもたらす。Aβ1−42とhα−シヌクレインとの組み合わせ作用は、エンドソーム−リソソーム膜の漏れを招き、細胞基質でのAβ1−42とhα−シヌクレインとの間での直接的な相互作用を可能にする。そのような相互作用は、hα−シヌクレインの細胞内蓄積を促進する。Aβ1−42のhα−シヌクレインに対するこの効果には、おそらく、これらの分子間の直接的な線維質相互作用で、あるいはフリーラジカルによって仲介される。Aβは酸化的ストレスを与え、研究により、hα−シヌクレインの酸化的架橋がレヴィ小体の形成に寄与することを示された(Hashimotoら、1999年;Leeら、2000年)。
【0044】
hα−シヌクレイン−関連病態におけるhAPP/Aβの顕著な効果とは対照的に、hα−シヌクレイン発現は、Aβからプラークへの細胞外沈着、あるいは8−、12−及び20−月齢のhα−シヌクレイン/hAPPマウスにおけるプラーク関連神経突起ジストロフィーの発生を、年齢が合致したhAPPマウス(1遺伝型及び月齢あたり、n=3〜4頭)と比べて有意には変えなかった。12月齢のhAPP及びhα−シヌクレイン/hAPPマウスは、ELISA(mg/g脳半球、平均±SD,n=4〜11頭/遺伝子型)により測定では、類似の大脳レベルのAβ1−40(4.3±0.88対4.6±0.6)及びAβ1−42(248±48対275±41)を有していた。
【実施例7】
【0045】
脳半球からあるいは切開した脳領域からの全RNAを単離し、その後、溶液ハイブリダイゼーションRNアーゼ保護アッセイで分析し、そしてアクリルアミド/尿素/トリス/ホウ酸塩/EDTAゲル上で分離した(図2)。レーンUは、α−シヌクレイン遺伝子(α−syn)、Aβ前駆体遺伝子(APP)及びアクチン(actin)の未消化転写物を表す。図の右手側の注記は、消化試料のサイズを示す。試料レーンは、3つの別々のマウスの分析を表し、それぞれ、非Tg、非遺伝子組換えマウス(すなわち、対照);Thy1−hAPPtg、マウス(m)Thy−1遺伝子の調節制御下でヒト(h)APP751cDNAを発現する遺伝子組換えマウス;Thy1−α−syn’tg、マウス(m)Thy−1遺伝子の調節制御下でヒトα−シヌクレインを発現する遺伝子組換えマウス;ならびに二重tg、マウス(m)Thy−1遺伝子の調節制御下でヒト(h)APP751及びα−シヌクレイン遺伝子の両方を含む遺伝子組換えマウスである。
【実施例8】
【0046】
hα−シヌクレインまたはPDAPP−J9Mtgマウスとmα−またはmβ−シヌクレインKOマウスとの交雑育種。二遺伝子マウスにおいてα−シヌクレインの欠失がAβ沈着の抑制をもたらす一方、β−シヌクレインの欠失がAβ沈着を刺激することをさらに確認するために、α−シヌクレインまたはβ−シヌクレインの欠失をコードする遺伝子を有するノックアウト(KO)マウス(Lexicon Genetics Inc.,The Woodlands,テキサス州)を異型接合PDAPP−J9Mtgマウスと交配した。以下の系統が作成された:1)(PDAPP−/−;mα−syn+/+)、2)(PDAPP−/−;mα−syn+/−)、3)(PDAPP+/−;mα−syn+/+)、4)(PDAPP+/−;mα−syn+/−)、及び5)(PDAPP−/−;mα−syn−/−)。マウス遺伝子型は末端DNAを用いてPCRにより決定した。続いて、その(PDAPP+/−;mα−syn+/−)を交雑させ、以下の子孫を産出した:1)(PDAPP+/+;mα−syn+/+)、2)(PDAPP+/+;mα−syn+/−)、及び3)(PDAPP+/+;mα−syn−/−)。同じ交配プロトコルを、二遺伝子hα−シヌクレインまたはPDAPP−J9M及びmβ−シヌクレインKOマウス作成のために続けた。
【0047】
アミロイド沈着に対するα−シヌクレインとβ−シヌクレインの影響は、先の実施例で用いた同一の回転棒及び神経病理学的分析を用いて、同型接合KOマウス(PDAPP+/+;mα−syn−/−)及びシヌクレインについて半接合のマウス(PDAPP+/+;mα−syn+/−)の両方で評価した。
【実施例9】
【0048】
hα−シヌクレインまたはPDAPP−J9Mtgマウスとhβ−シヌクレインを過剰発現するマウスとの交雑育種。その内容をここに引用して援用する、標準的な交雑育種プロトコル(Muckeら、1995年)に従い、高発現異型接合β−シヌクレインマウスを異型接合α−シヌクレインまたはPDAPP−J9Mtgマウスと交配して、1)非tg同腹子(PDAPP−/−;hα−またはβsyn−/−)、2)二遺伝子(PDAPP+/−及びhβ−シヌクレイン+/−)、3)二遺伝子(hα−シヌクレイン+/−及びhβ−シヌクレイン+/−)、4)単一tg hAPP、及び5)単一tg hα−シヌクレインまたはβ−シヌクレインの発生がもたらされた。マウスの遺伝子型は末端DNAを用いてPCRにより決定した。
【0049】
回転棒に処されたとき、α−シヌクレインtgマウスの原系統は運動欠陥を示したため、二遺伝子交配体は同様の方法で評価した。回転棒行動の解析から、β−シヌクレインの過剰発現は、α−シヌクレインtgマウスにおける運動欠陥を減少させることが明らかとなった。続いての神経病理学的解析から、β−シヌクレインの過剰発現は、ニューロンの封入体の減少をもたらすことが示された。β−シヌクレインの過剰発現は、また、α−シヌクレインtgマウスにおけるニューロン損失の減少をもたらすことが示された。これらの結果はさらに、β−シヌクレインは生体内で活性であること、ならびにそれは抗パーキンソン及び抗アルツハイマー治療薬として可能性のある物質を構成することを確認するものである。
【0050】
hα−シヌクレイン/hAPP二遺伝子マウスは、認知及び運動変性、コリン作動性ニューロン及びSIPTの損失、広範なアミロイドプラーク、ならびにhα−シヌクレイン免疫反応性ニューロン内線維状封入体を有する。これらすべての特徴は、ADのレヴィ小体変異型においても見出される。集合的には、レヴィ小体病は、ADのみを除いて第2位の、一般的な神経変性疾患である。それらは、PD,広汎性レヴィ小体病、及びADのレヴィ小体変異型を含む、異種構造群の病気を含んでなる。レヴィ小体病の患者は、典型的には、レヴィ小体、パーキンソン症候群及び認知損傷を有する。ADを持つ患者の約25%が、明らかなパーキンソン症候群を発生し、そしてhα−シヌクレイン免疫反応性レヴィ小体様封入体が、早発性ADと関連するダウン症候群におけると同様に、散発性AD及びFADの大部分の場合に発生する。また、レヴィ小体はhAPPを含む。これらの関連性は、hAPP/Aβがレヴィ小体の形成及びレヴィ小体病の発生において、ある役割を果たしていることを示している。
【0051】
hAPP/hα−シヌクレインマウスでの研究は、hα−シヌクレイン及びhAPP/Abが、脳の完全性及び機能に対して、集中的であるだけでなく明確な、病原性効果を持つことを示している。hα−シヌクレインはAβ依存性の神経炎プラークの発生または脳におけるAβ含有量全体には影響を与えないが、hAPP/Aβ依存性認知欠損及び特定の脳領域において神経変性を悪化させた。これらの知見は、hα−シヌクレインがプラーク非依存性メカニズムを通して、Aβの毒性を増強することを示している。これらのデータは、ADのレヴィ小体変異型をもつ人々は純粋なADをもつ人々よりも急速に認知減退を示すということを示唆する臨床所見を説明するものである。hAPP/Aβの過剰発現は次に、遺伝子組換えマウスにおいてhα−シヌクレインのニューロン内蓄積を促進し、運動欠陥の発生を加速した。これらの効果は、Aβまたは他のhAPP産物により仲介されることが最もありうることであり、生体外での研究は、Aβがその犯人であることを示している。Aβとhα−シヌクレインの間のこれら病原性相互作用の観点から、Abまたはhα−シヌクレインの蓄積の阻止を目的とする薬剤が、以前に予期されていたよりも広範囲の神経変性疾患に利益をもたらすであろう。
【0052】
(参照文献)
Andraa,K.,Abramowski,D.,Duke,M.,Probst,A.,Wiederhold,K.−H.,Buurki,K.,Goedert,M.,Sommer,B.及びStaufenbiel,M.1996年,Neurobiol.Aging 17,183−190.
Borchelt DR,Davis J,Fischer M,Lee MK,Slunt HH,Ratovitsky T,Regard J,Copeland NG,Jenkins NA,Sisodia SS,Price DL.1996年,遺伝子組換えマウスの脳及び心臓において外来遺伝子を発現するベクター。Genet.Anal.13:159−63.
Carlson,G.A.,Borchelt,D.R.,Dake,A.,Turner,S.,Danielson,V.,Coffin,J.D.,Eckman,C.,Meiners,J.,Nilsen,S.P.,Younkin,S.G.及びHsiao,1997年,Hum.Mol.Gen.6:1951−9.
Games,D.,Adams,D.,Alessandrini,R.,Barbour,R.,Berthelette,P.,ら,1995年,Nature(London)373,523−528.
Giasson,B.I.,Duda,J.E.,Murray,I.V.,Chen,Q.,Souza,J.M.,Hurtig,H.I.,Ischiropoulos,H.,Trojanowski,J.Q.,Lee,V.M.2000年,シヌクレイノパシー病変における選択的アルファ−シヌクレインニトロ化による神経変性にリンクした酸化的損傷.Science 290:985−9.
Hashimoto,M.,Hsu,L.J.,Xia,Y.,Takeda,A.,Sisk,A.,Sundsmo,M.及びMasliah,E.1999年,酸化的ストレスは生体外でNACP/α−シヌクレインのアミロイド様凝集体形成を誘起する.Neuroreport 10:717−21.
Higgins,L.S.,Rodems,J.M.,Catalano,R.,Quon,D.及びCordell,B.1995年,Proc.Natl. Acad.Sci.USA 92,4402−4406.
Hogan,B.ら、1986年,マウス胚の操作:実験室マニュアル,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,ニューヨーク、アメリカ.
Holtzman,D.M.,Bales,K.R.,Tenkova,T.,Fagan,A.M.,Parsadanian,M.,Sartorius,L.J.,Mackey,B.M.,Olney,J.,McKeel,D.,Wozniak,D.及びPaul,S.M.2000年,アルツハイマー病のマウスモデルにおけるアポリポタンパク質Eイソ型依存性アミロイド沈着及び神経突起変性.97:2892−7.
Hsia,A.Y.,Masliah,E.,McConlogue,L.,Yu,G.−Q.,Tatsuno,G.,Hu,K.,Kholodenko,D.,Malenka,R.C.,Nicoll,R.A.及びMucke,L.1999年,アルツハイマー病マウスモデルにおけるプラーク非依存性神経回路破壊.Proc Natl.Acad.Sci.USA 96:3228−33.
Hsiao KK,Borchelt DR,Olson K,Johannsdottir R,Kitt C,Yunis W,Xu S,Eckman C,Younkin S,Price D,ら.1995年,アルツハイマーアミロイド前駆体タンパク質を過剰発現する遺伝子組換えFVB/Nマウスにおける年齢関連性CNS障害及び早期死亡ron 15:1203−18.
Hsiao,K.,Chapman,P.,Nilsen,S.,Eckman,C.,Harigaya,Y.,Younkin,S.,Yang,F.及びCole,G.1996年,Science 274,99−102
Kammesheidt,A.,Boyce,F.M.,Spanoyannis,A.F.,Cummings,B.J.,Ortegon,M.,Cotman,C.,Vaught,J.L.及びNeve,R.L.1992年,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89,10857−10861.
Kang J,Lemaire HG,Unterbeck A,Salbaum JM,Masters CL,Grzeschik KH,Multhaup G,Beyreuther K,Muller−Hill B.1987年,アルツハイマー病のアミロイドA4タンパク質の前駆体は細胞表面受容体に似る.Nature 325:733−6.
Lamb,B.T.,Sisodia,S.S.,Lawler,A.M.,Slunt,H.H.,Kitt,C.A.,Kearns,W.G.,Pearson,P.L.,Price,D.L.及びGearhart,J.D.1993年,Nat.Genet.5,22−30.
Masliah,E.,Rockenstein,E.M.,Veinbergs,I.,Mallory,M.,Hashimoto,M.,Takeda,A.,Sagara,Y.,Sisk,A.,Mucke,L.2000年,アルファ−シヌクレインマウスにおけるドーパミン作動性損失及び封入体形成:神経変性障害のための意味.Science 287:1265−9.
Morris R.1984年,ラットにおける空間学習の研究のための、水迷路法の開発.J. Neurosci.Meth.11:47−60.
Mucke,L.,Masliah,E.,Johnson,W.B.,Ruppe,M.D.,Alford,M.,Rockenstein,E.M.,Forss−Petter,S.,Pietropaolo,M.,Mallory,M.及びAbraham,C.R.1994年,Brain Res.666,151−167.
Mucke,L.,Abraham,c.R.,ruppe,M.D.,Rockenstein,E.M.,Toggas,S.M.,Mallory.M., Alford,M.及びMasliah,E.1995年,ヒトアミロイド前駆体タンパク質(hAPP)のニューロン過剰発現によるHIV−1 gp120誘起脳損傷からの保護作用.J.Exp.Med 181:1551−56.
Mucke,L.,Masliah.E.,Yu,G.−Q.,Mallory,M.,Rockenstein,E.M.,Tatsuno,G.,Hu,K.,Kholodenko,D.,Johnson−Wood,K.及びMcConlogue,L.2000年,J.Neurosci.20:4050−8.
Quon,D.,Wang,Y.,Catalano,R.,Scardina,J.M.,Murakami,K.及びCordell,B.1991年,Nature(London)352:239−241.
Rockenstein EM,McConlogue L,Tan H,Power M,Masliah E,Mucke L,1995年,J.Biol.Chem.270:28257−28267.
Strittmatter,W.J.,Saunders,A.M.,Schmechel,D.,Pericak−Vance,M.,Enghild,J.,Salvesen,G.S.及びRoses,A.D.1993年,アポリポタンパク質E:β−アミロイドへの高結合活性結合、及び遅発性家族性アルツハイマー病における4型対立遺伝子の頻度の増大.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:1977−81.
Sturchler−Pierrat,C.,Ambramowski,D.,Duke,M.,Wiederhold,K.H.,ら.1997年,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:13287−92.
(実施例3中)Muckeら.1995年,J.Exp.Med.181:1551−6.
【図面の簡単な説明】
【0053】
【図1】回転棒におけるhSYN及びhAPPtgマウスでの運動欠陥の性質決定。非遺伝子組換え同腹子に比べて、単一tghSYNマウスは有意な運動欠陥を示した。同様に、二遺伝子hSYN/hAPPマウスは、単一tghSYNマウスと同様に、機能障害のレベルを示した。hAPPのみを発現するマウスは、非tg対照と違いがなかった。1遺伝子型あたりN=6〜8。月齢12ヶ月。
【図2】遺伝子組換え及び非遺伝子組換えマウスの脳からの全RNAのRNアーゼ保護アッセイ。レーンUは、未消化転写物を示す。図の右手側の注記は、消化試料のサイズを示す。試料レーンは、3つの別々のマウスの分析を表し、それぞれ、非Tg、非遺伝子組換えマウス(すなわち、対照);Thy1−hAPPtg、遺伝子組換えマウス;Thy1−α−syn’tg、遺伝子組換えマウス;ならびに二重tg、ヒト(h)APP751及びα−シヌクレイン遺伝子の両方を含む遺伝子組換えマウスである。
【0001】
(発明の分野)
本発明は、神経変性疾患の研究において使用される遺伝子組換えマウスに関する。
【0002】
(政府の利害)
本発明は、助成金番号AG10869の下に、国立保健研究所からの政府援助でなされた。
【背景技術】
【0003】
(背景)
アルツハイマー病(AD)、パーキンソン病(PD)及びレヴィ小体病(LBD)は、高齢者において最も一般的に見られる神経変性障害である。それらの発生は増大し続け、重大な社会的な健康問題を引き起こしているが、今までのところこれらの病気は治癒も予防もできない。これらの疾患に対する遺伝要素はあるが、大部分の場合、突然変異なしで集団中で自然発生的に生じる。神経損傷は、脳で正常に発現したタンパク質からなるタンパク質凝集体の発生に起因する。本来は非毒性のタンパク質を、何がそれらの毒性状態へと変換させるのかは知られていない。
【0004】
近年の疫学的研究によれば、アルツハイマー病患者の約30%はPDをも有するとして、ADとPDとの密接な臨床的関係が証明されている。他の高齢集団と比べて、AD患者は大概、合併PDを発生させている。さらに痴呆になったPD患者は、通常古典的なADを発生させている。
【0005】
各々の神経変性疾患は、特定の脳領域及び細胞集団に偏りを有するらしく、明確な病理像をもたらすが、PD、AD及びLBDはまた、共通の特徴を共有する。家族性AD、ダウン症候群及び散発性ADの患者は、PDの典型的な神経病理学的特徴である、扁桃体上にレヴィ小体を増殖させる。さらに各々の疾患は、ニューロンの変性、ニューロン内のシナプス結合及び最終的には細胞死、神経伝達物質の減少、ならびにその前駆体は正常な中枢神経系機能に関与する異常折り畳み構造の蛋白質の異常な蓄積に関連する。
【0006】
生化学的研究から、AD、PD及びLBD間の関連性が確認されている。レヴィ小体の中心成分は、NACP(非アミロイド成分前駆体)としても知られている、α−シヌクレインである。NACとして知られている、NACPのタンパク質分解性フラグメントは、ADにおけるアミロイドプラークの重要な構成要素である。このことは、α−シヌクレインがADとPDの両方の病因にある役割を果たしていることを示唆している。
【0007】
これらの知見は、レヴィ小体病(LBD)と呼ばれる神経変性障害の新規な分類の進展に導いた。LBD患者は、痴呆、パーキンソン症候群、精神変化、アミロイドの沈着、線維状特徴を有するレヴィ小体(LB)の形成で特徴付けられる。LBはPD及びLBDの病態の特徴である。ADのある面を模倣するいくつかの動物モデル及びPDのある面を模倣する他の動物モデルが存在するが、LBDで見られるような、ADとPDの特徴を組み合わせたモデルは存在しない。
【0008】
ADの典型的な病態の特徴である神経炎プラークは、主として、アルツハイマーアミロイド前駆タンパク質(APP)の39〜43アミノ酸(aa)タンパク質分解性生成物であるAβ、及びNACPタンパク質の35aaタンパク質分解性フラグメントであるNACで構成されている。AβとNACの両者は、完全長cDNAが同定されクローン化されている、それらの完全長タンパク質のタンパク質分解性フラグメントとしてアミロイドプラーク中で最初に同定された。APPのクローン化(Kangら、1987年)は、結果として研究の急増につながり、その中でADにおける多数の変異が見出されており、K670N/M671L(スウェーデン変異)、V717I(ロンドン変異)、V717F(インディアナ変異)、プレセニリン1及びプレシニリン2を含む家族性型が関連付けられた。(注記:変異は、野生型アミノ酸、変異が見出されたアミノ酸の番号、及びタンパク質の変異型において見出されたアミノ酸で示される)。これらの変異は、APPのプロセッシングを、病原性を有する凝集体を形成する傾向があるAβ1−42タンパク質分解性フラグメント優先へと変更すると思われる。しかしながら、そのような変異では、病気が自然発生的に生じる大部分のアルツハイマー患者を説明することはできない。
【0009】
APPは正常な状態でシナプスにおいて多く発現され、種を超えてよく保存されており、神経の柔軟性、学習、及び記憶に関係している。APPは、完全長転写物から、エクソン7及び8(hAPP695)、エクソン8(hAPP751)または無エクソン(hAPP770)がスプライシングされた、3種の代替スプライシング変異型を有する。3種の型の比率は、脳の領域の間及び正常状態と病気の状態で異なるが、正常と異常の明確なパターンは決定されていない(Rockensteinら、1995年)。転写物の異なるスプライシングを調整するものが何であるかは知られていないが、証拠は、ニューロン中でのスプライシングはニューロンの分化及び活性に影響を及ぼす因子によって調整され得ることを示唆している。さらに、APPは正常な状態で、タンパク質分解性フラグメントAβ39−43にプロセッシングされる。疾患は、タンパク質分解性フラグメント、特に凝集体(すなわち、Aβ1−42)の形成を開始できるものの過剰産生に偏った、フラグメントの産生におけるアンバランスに起因する。
【0010】
α−シヌクレインは、β−及びγ−シヌクレインならびにシノレチンを含む大きなファミリーのタンパク質の一部である。APPと同様、α−シヌクレインは正常状態でシナプスで発現され、神経の柔軟性、学習、及び記憶においてある役割を果たすと考えられている。α−シヌクレインの凝集を促進する、ヒト(h)α−シヌクレインにおける変異が同定されており(A30P及びA53T)、そしてそれらはPDの常染色体の優性形の希少形に関係している。これらの変異が、α−シヌクレインの凝集する傾向を増大させるメカニズムは知られていない。
【0011】
集団中に多数の変異をAPP及びα−シヌクレインに見出すことができるという事実にも拘わらず、AD及びPDの多くのケースは自然発生的に生じる。これらの病気のうち最も多い散発性型は、それぞれ、Aβ及びα−シヌクレインの異常蓄積に関係している。しかしながら、これらタンパク質の過剰蓄積の理由は知られていない。Aβはニューロンから分泌され、細胞外アミロイドプラーク中に蓄積する。さらに、Aβはニューロン内部で検出される。α−シヌクレインは、レヴィ小体と呼ばれるニューロン内の封入体中に蓄積する。この二種のタンパク質は典型的には共に細胞外神経ADプラーク中で見出されるが、それらはまた時々細胞内封入体中で一緒に見出される。
【0012】
無毒性前駆体タンパク質の、それらのタンパク質分解性生成物へのプロセシングは、組織培養系中と精製タンパク質を用いての両方において、解析するために研究が行われている。α−シヌクレインの過剰発現により、凝集体が神経細胞培養において形成されうる。野生型APPの過剰発現は、培養において細胞外タンパク質凝集体の形成を引き起こさないが、APP変異の最も病原性のものであるスウェーデン変異の過剰発現は引き起こす。凝集体はまた、α−シヌクレインを過剰発現している細胞中で、細胞培養における酸化的ストレスに対応して形成され、それが病気の発生において重要であることを示唆している。さらに、精製Aβ及びNACペプチドは、単独であるいは混合されて、同一の温度及びpH条件下で、生体外で凝集体を形成することができる。
【0013】
AD、PD及びLBDの動物モデルを構築する試みは期待はずれであった。当初は、遺伝子組換えAPPを発現する動物は、広範なAD型神経病態を示さなかった(Kammesheidtら、1992年;Lambら、1993年;Muckeら、1994年;Higginsら、1995年;Andraaら、1996年)。これはおそらく、タンパク質の発現が低レベルであることが原因だろう。Gamesら(1995年)は、PDGF−βプロモータで駆動される変異型APP(V717F)が高レベルで発現するため、あるAD型病態を示す遺伝子組換えマウスを作成することができた。遺伝子組換え動物は、海馬、脳梁及び大脳皮質でのヒトAβの沈着を示したが、脳の他の領域では示さなかった。プラークは観察されたが、神経原線維変化はなかった。著者は、神経原線維変化は齧歯動物には存在しないので、そのような結果が予想されたと述べた。
【0014】
Thy1発現カセットの制御下で、スウェーデン型二重変異(670/671)、またはロンドン変異(V717I)と結合したスウェーデン型変異を発現する、遺伝子組換えマウスも作成された(Sturchler−Pierratら、1997年)。プラークの発生する年齢は、各々のマウス種において、6ヶ月から2年以上の間で変動し、タンパク質の発現レベルによく相関しているようだった。スウェーデン型及びインディアナ型変異の両方を有する動物において、病気に関連する病理的変化を誘起するには、より低い発現レベルが必要だった。しかしながらいずれの動物も、病気を完全かつ正確には現さなかった。神経変化、ジストロフィーのコリン作動性線維及び炎症を伴うプラーク形成が海馬及び新皮質で観察されたが、他の脳領域では観察されなかった。PrP−プロモータ下でAPPのスウェーデン型変異を発現する遺伝子組換えマウスを用いた別の研究において(Hsiaoら、1996年)、マウスは3ヶ月において正常な学習と記憶を有することが見出されたが、9ヶ月または10ヶ月までに障害が現れた。プラークは、これらの遺伝子組換えマウスにおいて皮質及び辺縁系領域で観察され、Aβ1−42 / 43の14倍の増加が観察された。
【0015】
Aβ1−42はADにおける強い原因因子の一つであることが知られているので、Muckeら(2000年)は、APPの毒性フラグメント、Aβ1−42のみを発現する遺伝子組換えマウスを作成した。Aβ1−42フラグメントの発現は細胞毒であったが、プラークは形成されず、ADの進行におけるAβ1−42に対するプラーク非依存的な役割を示唆している。
【0016】
さらに、APPを発現する遺伝子組換え動物は、学習欠損、障害のある挙動及び発作を含む種々の神経異常を示すことが見出された。再び、神経の機能不全の重篤さは、APPタンパク質の発現レベルと結びついているように思われた。相違は、また、プロモータ、ゲノムへの統合等における相違による、APPが発現される脳の領域に帰することができる。生理的な症状と同様に、これらの動物における神経機能不全は、AD、PD及びLBDにおいてみられるそれらのある面で、ただしすべてではないが、類似していた。この病気に対する動物モデルがないことは、明らかに努力不足のためではなく、むしろ病気の状態において生じるすべての変化を誘起ことができないためである。
【0017】
遺伝子組換え配列の発現効果は、また、変異遺伝子が発現されるマウスの系統に大きく依存した。例えば、異系交配遺伝子組換え系統においてプラークを産生するAPPの濃度は、近交系のFVB/NまたはC57BL/6Jマウスにおいて致命的であることが見出された(Carlsonら、1997年)。生存可能な十分低いレベルのAPP695を発現するFVB/Nマウスの系統は、主に大脳におけるグルコース利用の減少及び星状細胞増加症と共に、新奇恐怖症、損傷された空間的交互変化を含むCNS障害を発生させることが見出された(Hsiaoら、1995年)。同様の症候群が同一の種の非遺伝子組換えマウスの約20%で発生することが知られており、APPがその系統の中にすでに存在する傾向を促進することを示唆している。
【0018】
遺伝子組換えマウスの系統を交配して病気の症状を変化させることにより、ADのより正確なモデルを発生させる試みがなされた。APPを過剰発現する遺伝子組換えマウスにおける線維芽細胞増殖因子2遺伝子(FGF2)の過剰発現は、APPをより致命的なものとするが、見られる症状を変えることはない。Holtzmanら(2000年)は、APPのV717F変異型を発現する遺伝子組換えマウスと種々の形のアポリポタンパク質E(アポE)を発現するマウスとを交配することによって、多数の二遺伝子マウスを発生させた。アポEのε4対立遺伝子は、散発性AD及び遅発型家族性AD(FAD)に対して同定された最初の遺伝的危険因子であった(Strittmatterら、1993年)。その後、アポEのε3対立遺伝子は、その疾患に対するより弱い危険因子であることが見出された。マウスにおけるAPPのV717F変異型バージョンと共に、アポE変異型、特にε4対立遺伝子の発現は、細線維沈着、神経プラーク及び神経変性の発生を増大させた。ADの同様の病態的特徴は、APPのV717F変異型のみを発現するマウスにおいて、単純に老齢期に観察された。導入遺伝子の発現の組み合わせは、病気の観察された病態を変化させることはなく、単純に病態が観察される時間枠を変化させた。アポEノックアウトマウスにおけるAPPのV717F変異型バージョンの発現は、神経変性をもたらさなかった。この研究は、ADの病態におけるアポEの明確な役割を示しているが、一重の遺伝子組換えマウスよりもより正確なその病気のモデルは提供しなかった。
【0019】
PDGFβプロモータの制御下でα−シヌクレインを発現する遺伝子組換えマウスはまた、PD及びLBDのモデルとして使用されるために生み出されている(Masliahら、2000年)。α−シヌクレインのニューロンでの発現は、α−シヌクレインの進行性の蓄積及び新皮質、海馬及び黒質におけるニューロン中の封入の発生をもたらした。さらに、電子が密な核内沈着及び細胞質内封入が観察された。そのマウスは、基底核中のドーパミン作用性の末端欠損に関連する運動障害を示した。しかしながら、アミロイドプラーク、線維変化または細胞死は観察されなかった。
【0020】
多数のα−シヌクレイン遺伝子組換えマウスが、同様に、生成されている。しかし、α−シヌクレインの野生型及び変異型(A30P及びA53T)の両方の使用はもとより、異なるプロモータ(例えば、PDGFβ、Thy−1)も使用したにもかかわらず、どのマウスもPDの完全に的確なモデルをもたらさない。種々のAPP遺伝子組換えマウスと同じく、使用したプロモータとゲノムへの導入遺伝子の挿入部位に依存して、タンパク質の発現量及び発現位置に相違が見られた。例えば、hα−シヌクレイン導入遺伝子からの発現がPDGFβプロモータにより駆動された場合には、hα−シヌクレインの発現パターンは、正常な脳または広汎性LBDにおいて見られるものと最も酷似していた。Thy−1プロモータを用いたhα−シヌクレインの発現は、PDにおいて見られる発現パターンに最も酷似したパターンで、導入遺伝子のより高い発現をもたらした。より高い発現は、より重篤な病態をもたらした。hα−シヌクレインの変異型バージョンを発現するマウスは、タンパク質の野生型バージョンを発現するものよりも早く病気の特徴を明らかに示した。さらに、神経機能不全は、タンパク質が発現される脳の領域に依存する。
【0021】
病気の状態は、しばしば、単一タンパク質または遺伝子内の単一変異の発現レベルにおける変化よりもむしろ、生物における多重変化の結果である。上記の遺伝子組換え動物の各々はAD、PD及び/またはLBDのある特徴を有しているが、それらはいずれもどの病気についても完全なモデルを与えることはできなかった。単一の動物で、ADの典型的な指標である神経原線維変化を有するものは見出されなかった。AD、PD及びLBDの病態と発生が重複していることを認識すると、病気の病態及び臨床的徴候のより完全なセットを示す動物モデルの必要性が強調される。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【0022】
(発明の要約)
本発明は、ヒトβ−アミロイドペプチドまたはhAPP及びhα−シヌクレインの発現用導入遺伝子を有する遺伝子組換えマウスモデルである。導入遺伝子は、遺伝子の野生型、変異型または切断型でありうる。導入遺伝子は、PDGF−β、Thy1及びプリオン(PrP)プロモータを含む多数のプロモータのいずれかの下で、発現されうる。SV40イントロンのようなイントロンは、導入遺伝子構築物またはプロモータに含まれていてもよく、Thy1プロモータの場合のように、プロモータのイントロンを用いてもよい。
【0023】
本発明のマウスは、α−シヌクレインまたはhAPPに対する単一遺伝子を有するマウスの交配によって生成される。出願人は、hα−シヌクレインを過剰発現する遺伝子組換えマウス系統(Masliahら、2000年)及び野生型または変異型のいずれかのhAPP(Muckeら、2000年)を多数生成して、AD、PD及びLBDにおけるアミロイド生成の生体内メカニズムを解明している。さらに、参照されるように、入手可能な多数の他のhAPP遺伝子組換えマウスが存在する。入手可能なマウスには、マウスまたはヒトThy1プロモータの制御下でAPPを発現するもの(Andraaら、1996年)、SV40イントロンを有するまたは有しないPDGF−βプロモータ(Gamesら、1995年)、及びPrP(Borcheltら、1996年;Hsiaら、1999年)プロモータが含まれる。それらマウスはよく研究され、導入遺伝子が発現される脳の領域及び時間枠について特徴が明らかにされている。二遺伝子マウスは、所望によりAD、PDまたはLBDによって最も達成される脳の領域においてhAPPまたはhα−シヌクレインのいずれかを過剰発現する2頭のマウスを交配することにより、容易に生成することができる。理想的には、交配されたマウスは、両方の導入遺伝子を発現する、どちらかの導入遺伝子を発現する、またはいずれの導入遺伝子をも発現しない同腹子を互いに比較できるように、導入遺伝子のただ一つのコピーを有する必要がある。導入遺伝子の過剰発現は、それらに限定されるものではないが、リボヌクレアーゼ保護アッセイ(RPA),ウエスタンブロット、免疫蛍光法、または他の分析法を含む当業者に周知の多数の方法のいずれかによって、検出することができ、そこにおいて、得られるシグナルは、非遺伝子組換え同腹子で見出されるマウスRNAまたはタンパク質とのバックグラウンド交差反応性を超えるものである。
【0024】
本発明の二遺伝子PDGF−β−α−シヌクレイン−PDGF−β−hAPPマウスは、年齢及び脳領域特異的な形で形態的にADにおいて見られる老年性プラークに類似の、細胞外アミロイドーシス及び神経原線維変化を示すことに加えて、適正にAβフラグメントにプロセッシングされたAPPを発現することが示されている。hα−シヌクレインの発現が、hAPPの発現を変えるようにはみえなかった。しかし、単一のhα−シヌクレインマウスに比べて、二遺伝子マウスにおいてhα−シヌクレインの広範な蓄積が存在した。
【0025】
PDGF−β−α−シヌクレイン−PDGF−β−hAPP二遺伝子マウスにおける機能的及び形態的な変化は、ADのレヴィ小体変異型に似ていた。二遺伝子マウスは、生理的かつ病理的特徴を生み出し、そして単一遺伝子組換えマウスに比べて、ヒトの病気状態により酷似して、運動機能を低下させた。両方の遺伝子の発現の組み合わせの効果は、相乗的である。それ以前には齧歯動物では観察されなかったがPD及びLBDの標準的な特徴である、線維α−シヌクレイン封入体の発生が見られた。シナプスの変性が単一遺伝子組換えマウスの両方で観察されていたが、二遺伝子マウスでは見られた、ニューロン細胞の死は観察されていなかった。二遺伝子マウスは、学習及び記憶において重篤な欠損を有し、運動欠損症が生じたとしても軽微なものを示すのみであるPDGF−β−α−シヌクレイン単一遺伝子組換えマウスより先に、運動欠陥が発生した。運動欠陥の発症は、PDGF−β−hAPPマウスで典型的に見られる12ヶ月ではなくて、二遺伝子マウスでは6ヶ月で始まった。二遺伝子マウスは、単一遺伝子組換え同腹子または非遺伝子組換え同腹子に比べて、コリン作動性ニューロン及びシナプス前末端の最も顕著な年齢依存性変性を示した。シナプス変性は単一遺伝子組換えマウスにおいて観察されたが、ニューロン細胞死は単一遺伝子組換え同腹子では観察されなかった。hAPP−α−シヌクレインマウスは同じく、大量のβ−アミロイドプラークを有し、そしてむしろより多数のα−シヌクレイン−免疫反応性ニューロン封入体を有した。超微細構造的に、これらの封入体は、しばしば、二重遺伝子組換えマウスにおいて線維状であるが、単一遺伝子組換えα−シヌクレインマウスでは不定形であった。これは、以前には、齧歯動物には存在しないと考えられていた線維状レヴィ小体様封入体の存在の最初の実証である。
【0026】
さらに、本発明は、α−シヌクレインとAPPとの組み合わせの、アミロイド生成及び神経変性に対する生体内での効果を評価する方法である。病気の発生及び進行におけるタンパク質の効果の評価は、機能的、病理的、または生化学的アッセイにより、理想的には、α−シヌクレインまたはhAPPのいずれかに対する単一の導入遺伝子のみを有するかあるいは導入遺伝子を有しない同腹子と比較して、評価しうる。二遺伝子α−シヌクレイン−hAPPマウスでの研究は、hα−シヌクレイン及びhAPP/Aβが脳の統合性及び機能に対して明確な、そして重複する病原性の効果を有することを示している。hα−シヌクレインは脳におけるAβ依存性の神経プラークの発生または全体としてのAβ含有量に影響を与えないが、特定の脳の領域において、hAPP/Aβ依存性の認識欠如及び神経変性を悪化させる。これらの知見は、hα−シヌクレインがプラーク非依存性メカニズムを通してAβの毒性を増強できることを示している。それらは、ADのレヴィ小体変異を持つ人々は、純粋なADを持つ人々よりも、急激な認知減退を有することが示唆される、臨床所見とよく相関している。hAPP/Aβの過剰発現は、今度は、遺伝子組換えマウスにおいてhα−シヌクレインのニューロン内蓄積を促進し、運動欠陥の発生を加速した。Aβとhα−シヌクレインとの間のこれら病原性相互作用の観点から、Aβまたはhα−シヌクレインの蓄積を阻止することを目的とする医薬は、以前に予期されていたよりも広いスペクトルの神経変性障害に利益をもたらすことになるであろう。さらに、二遺伝子マウスは患者に対して有用である介入の可能性についてのよりよい予見モデルを提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【0027】
(詳細な説明及び好ましい態様)
α−シヌクレインまたはAPPの変化した発現及びプロセッシングがAD、PD及びLBDのような神経変性障害をもたらすメカニズムは多少不明のままである。異常なタンパク質凝集がこれらの障害における共通の特徴であり、そして完全長α−シヌクレインまたはそのタンパク質フラグメントのいずれか及びAβがこれらのタンパク質凝集体の主な成分であることが一般に理解されている。多くの病的状態において、多重変化が完全な病状の発生に必要である。APPまたはα−シヌクレインのいずれかに単一の変異を持つ動物モデルは、AD、PDまたはLBDの正確なモデルをもたらしていない。しかしながら、二遺伝子PDGF−β−α−シヌクレイン−PDGF−β−hAPPマウスは、単一遺伝子組換え動物のいずれにおいても以前には観察されなかったこれらの病気の特徴を示す。両方のタンパク質を発現することによって、病気の正確なモデルが得られる。異なるレベルの各々のタンパク質を発現するマウスの使用により、病気の発生及び重篤度の割合が異なる種々のモデルを得ることができる。これらは、ヒトにおいて見られる差異の模倣であろう。
【0028】
hAPPまたはα−シヌクレインを発現する遺伝子組換えマウスは、低発現系統及び高発現系統の二つの一般的カテゴリーに分けることができる。この分類はさらに変異タンパク質よりも低毒性である野生型タンパク質を発現するマウスに再分割できる。例えば、APPを発現するすべてのマウスは、最終的には、いくらかのプラークといくらかの病気を発生するだろう。しかしながら、プラークの発生及び生じる病気の速度は、aa670/671でのスウェーデン二重変異を発現するマウスで最も速いだろう。aa717での単一変異でのhAPPの発現は、年齢が合致した動物においてより少ないプラークで病気をもたらすであろう。同様に、異なる変異及びプロモータは、α−シヌクレイン遺伝子組換えマウスにおいて病気の種々の重篤度を示すことになろう。Thy−1プロモータの制御下でhα−シヌクレインを発現するマウスは、視床、基底核、黒質及び脳幹を含む、脳全体にシナプス及びニューロン中にタンパク質を蓄積する。PDGF−βの制御下でα−シヌクレインを発現するマウスの1系統は、神経皮質のより深い層中のニューロンの封入体中と同様に、新皮質、辺縁系及び嗅覚部におけるシナプス中にタンパク質を蓄積する。他の系統は、多重系萎縮を模倣して、グリア細胞中でのα−シヌクレイン発現を示した。
【0029】
単一遺伝子組換えマウスにおいて見られなかった病態を生じさせるべくタンパク質が相乗的に働くためには、同一の脳領域でそれらのタンパク質を発現させるマウスの系統を番にする必要がある。Aβ1−42の産生は、明らかに、二遺伝子マウスにおけるLBD様状態の発生における駆動力である。hAPPの発現は、hα−シヌクレインの蓄積を増大させる。それはまた、病気の重篤度を増し、そしてhα−シヌクレイン遺伝子組換えマウスにおいて早い年齢での病気の発症をもたらす。明白な病気を持たないhα−シヌクレイン遺伝子組換えマウスは、APPのアミロイド生成バージョンを発現する遺伝子組換えマウスと交配すると、病気を発生させる。明白な病気を持たないhα−シヌクレインマウスとhAPPの非アミロイド生成バージョンを発現する遺伝子組換えマウスとの交配は、病気の発生プロセスを悪化させない。AD、PD及びLBDの自然発生形は、相対的に緩慢な発症を有し、低レベルの変異タンパク質発現を示唆しているので、有意な病気を示さない二つの系統の交配だけでは、ヒトでしばしば見られる病気の自然発生的発症に対するモデルを提供しない。同様に、α−シヌクレインよりも早期にAPPを発現する遺伝子組換え動物は、後で痴呆になるAD患者を模倣する。両方のタンパク質を低レベルで発現する遺伝子組換え動物は、AD、PD及びLBDでは遅い、それらの病気の自然発生的発症を模倣する。発現の脳領域はまた、特定の遺伝子組換え系統を交配するという動機を与える。例えば、LBDにおいて最も重篤にもたらされる脳の領域においてhAPPとhα−シヌクレインを発現するマウスは、LBDに対するモデルを与えるために交配させることができた。
【0030】
存在する遺伝子組換えマウスは、タンパク質発現のレベルと脳領域、症状の発生する年齢、神経障害及びバックグラウンド系統の効果等の基準に基づいて選択される。多数の表現型をもたらすことができるマウス胚に構築物を挿入することにより発生させられた遺伝子組換えマウスとは異なり、本発明のマウスは、周知の特徴を持つマウスの組み合わせによって生み出された二遺伝子マウスである。モデルは、上で列挙した中の基準に基づいて、対象の病気に最もよく適合するようにデザインされる。一つのタンパク質の発現は、他の発現によって妨害されない。hAPPの共発現によるα−シヌクレインの病態の悪化は知られていない。当業者は、対象の病気の状態を最も近く模倣する二遺伝子系統を作成するために、マウスの既知系統の組み合わせにおいて合理的な決定をなしうる。
【実施例1】
【0031】
遺伝子組換えα−シヌクレイン及びhAPPマウスの創出。遺伝子組換えマウスは、Lederらに発行された米国特許第4,736,866号に記載され、B.Hoganら(1986年)によって提供された、マイクロインジェクション法を用いて、当業界で日常的に作製されている。Jolicoeurに発行された米国特許第5,574,206号では特に、機能的HIV遺伝子を有する遺伝子組換えマウスの作成及びHIV介在疾病のモデリング及び研究におけるそれらの使用が記載されている。これらの文献は、ここに引用して援用する。
【実施例2】
【0032】
hα−シヌクレイン及びhAPPの生体内での共発現。hα−シヌクレイン(Masliahら、2000年)またはFAD−変異hAPP(Muckeら、2000年)のニューロン発現がPDGFβ鎖プロモータにより導かれる遺伝子組換えマウスは記載されている。さらに、本出願に記載のものを含めて多数の他のAPPマウスが記載されているが、それらに限定されるものではない。高レベルのニューロン性hα−シヌクレイン(系統D)またはAβ(系統J9)産生系統が選択された。これらの系統からの異型接合hα−シヌクレインと異型接合hAPPマウスの間での交配は、4群の同腹子:hα−シヌクレインマウス(n=26)、hAPPマウス(n=32)、hα−シヌクレイン/hAPPマウス(n=21)、及び非遺伝子組換え対照(n=31)を与えた。脳での導入遺伝子由来のmRNAのレベルは、単一遺伝子組換えマウス及び二重遺伝子組換えマウスにおいて同様であり、hα−シヌクレイン及びhAPPの共発現は導入遺伝子発現を変えないことを示した(図2)。タンパク質レベルにおいて、hα−シヌクレインの発現は、二重遺伝子組換えマウスでのhAPP発現に影響を与えなかった。しかしながら、脳のhα−シヌクレインレベルは、hα−シヌクレインマウスよりもhα−シヌクレイン/hAPPマウスにおいてより高い傾向があり、Aβのhα−シヌクレイン蓄積への効果を反映していると思われる。
【実施例3】
【0033】
二遺伝子マウスにおけるヒトα−シヌクレインの過剰発現はアルツハイマー病様の神経病態を悪化させる。α−シヌクレインとNACの両方はアルツハイマー病の生体外モデルにおいて形成されるプラークの統合成分であることが立証されている。これらの分子が生体内で、特にPDAPP二遺伝子マウスモデルで、アミロイド生成にどのように寄与しているかを確定するために、得られた二遺伝子マウスからの脳切片をギ酸で処理し、α−シヌクレイン及びNACに対する抗体で免疫染色した。結果の解析から、アルツハイマー病の生体外モデルとして、PDAPP二遺伝子マウスにおいて、NACがアミロイドコアに存在し、一方α−シヌクレインはジストロフィーの神経突起で見出されることが確認される。さらに、α−シヌクレインを過剰発現するPDAPP二遺伝子マウスの神経病理学的検討から、アミロイド沈着の増加を伴う新皮質及び海馬における広範囲にわたる星状グリオーシスが解明され、α−シヌクレインの発現増加がアミロイド生成に関連する神経変性状態の病原性に重要な役割を果たすことが再度確認された。したがって、α−シヌクレインは生体内プラーク形成にきわめて重要であり、それ自体で、アルツハイマー病及びアミロイド生成を含んでいる他の神経変性状態の生体内治療に有用な抗アミロイド生成化合物の設計に対する合理的なターゲットを構成することが、最終的に実証された。
【実施例4】
【0034】
hα−シヌクレイン/hAPPマウスにおける神経欠損。運動欠陥は回転棒試験で評価された(図1)。以前の観察と一致して、hα−シヌクレインマウスは年齢依存性運動欠陥を生じた。月齢6ヶ月で、hα−シヌクレイン/hAPPマウスは既に非遺伝子組換え対照に対して欠損を示したが(反復測定ANOVAによると、P<0.03)、hα−シヌクレインマウスは依然として正常に実行した。月齢12ヶ月で、hα−シヌクレインマウスとhα−シヌクレイン/hAPPマウスの両方が、非遺伝子組換え対照(反復測定ANOVAによると、P<0.001)に比較して、この試験で欠損を示した。hAPPマウスは、いずれの年齢でも、有意な運動欠陥を有しなかった。運動欠陥の重篤度は、6月齢のhα−シヌクレイン/hAPPマウスと12月齢のhα−シヌクレインマウス及びhα−シヌクレイン/hAPPマウスで同様であり、hAPP/Aβがhα−シヌクレイン依存性運動欠陥の発生を促進することを示唆している。
【0035】
PDGF−hAPPマウスは、以前から認知欠損を発生することが示されている。hα−シヌクレイン及びhAPP/Aβの空間学習及び記憶に対する効果を確定するために、マウスを水迷路試験(Morris、1984年)で評価した。目標のプラットフォームが目に見えるセッションでは、すべての群のマウスは等しくうまくプラットフォームを探し出すことができ、hα−シヌクレイン/hAPPの運動欠陥は、水迷路試験において正常な動作を妨げないことを示していた。プラットフォームが隠されたセッションでは、マウスは、迷路外の見える手掛かりとプラットフォームとの空間的関係の記憶を用い、沈んだプラットフォームを探し出さなければならない。これらのセッションでは、hα−シヌクレイン/hAPPマウスは、最も有意な学習欠損を示し、一方、hα−シヌクレインマウスと非遺伝子組換え対照は正常に実行した。hAPPマウスは、隠されたプラットフォームのセッションで、hα−シヌクレイン/hAPPマウスよりも良好に実行する傾向があったが、その差は、統計的に有意ではなかった。その間にプラットフォームを移動する精査試験は、空間記憶保持力の推定尺度を提供する。精査試験では、hα−シヌクレイン/hAPPマウス及びhAPPマウスは、非遺伝子組換え対照よりも目的の象限への有意により少ない実行を示して記憶保持力の障害を示唆したが、一方、hα−シヌクレインマウスに障害性はなかった。
【0036】
これらの結果は、hα−シヌクレイン/hAPPマウスの運動欠陥は主にhα−シヌクレインにより引き起こされるが、空間学習及び記憶における欠損は、主にhAPP/Aβにより引き起こされることを示している。hα−シヌクレイン及びhAPPの同様の効果は、同じく運動欠陥及び認知欠損が組み合わさった、レヴィ小体病の原因となるだろう。
【実施例5】
【0037】
年齢依存性神経変性。マイネルト基底核におけるコリン作動性ニューロンの変性は、齧歯動物における水迷路試験での重大な獲得欠損をもたらす。それはまた、AD及びレヴィ小体病における認知減退の潜在的に重要な決定因子である。コリンアセチルトランスフェラーゼ(ChAT)は、アセチルコリンの合成に介在し、コリン作動性ニューロンのマーカーとして役立つ。遺伝子組換えモデル(n=12〜13頭/遺伝子型、月齢範囲:4〜20ヶ月)の基底核中のChAT免疫反応性ニューロンの密度を測定した。hα−シヌクレイン/hAPPマウスでは、単純な回帰分析から、加齢とコリン作動性ニューロンの数との間の高い有意な逆相関関係が見出された(R=0.828、P=0.0005)。そのような相関関係への傾向は、hα−シヌクレインマウス(R=0.538、P=0.071)及びhAPPマウス(R=0.511、P=0.089)においても存在するが、非遺伝子組換え対照(R=0.127、P=0.695)においては存在しない。コリン作動性ニューロンの最大の損失は、hα−シヌクレイン/hAPPマウスにおいて観察され、その一方では、より穏やかな損失が加齢hAPPマウスで見出された。これらの結果は、コリン作動性欠損はADのレヴィ小体変異型を持つヒトの場合に、純粋なADを持つ場合よりも重篤であるという所見と一致する。hα−シヌクレイン/hAPPマウス及びhAPPマウスは同様に、尾状核/被殻でのコリン作動性ニューロンの有意な損失を有し、これはレヴィ小体を持つまたは持たないAD患者の尾状核でのChAT活性の減少と一致する。
【0038】
ADまたはADのレヴィ小体変異型を持つ人々は、典型的に新皮質中の有意なシナプス損失をも生じ、それがシナプトフィシンの免疫反応性の低下に反映する。4〜20ヶ月齢のマウス(n=15〜19/遺伝子型)の新皮質中の、定められたシグナル強度のシナプトフィシン免疫活性シナプス前終末(SIPT)を測定した。hAPPマウス(R=0.744、P=0.0006)及びhα−シヌクレイン/hAPPマウス(R=0.524、P=0.021)において、加齢と新皮質SIPTレベルとの間に有意な逆相関関係があったが、hα−シヌクレインマウス(R=0.479、P=0.071)または非遺伝子組換え対照(R=0.151、P=0.564)においてはなかった。月齢20ヶ月では、新皮質におけるSIPTレベル(占有面積%、平均±SD、n=3〜4頭/遺伝子型)は、非遺伝子組換え対照(25.6±0.9)において最も高く、hα−シヌクレイン/hAPPマウス(18.3±4.8、チューキー・クレーマー検定でp<0.05)において最も低く、hAPPマウス(20.9±1.7)及びhα−シヌクレインマウス(23±0.9)に対する値は中間に位置した。対照的に、尾部/被殻でのSIPTレベルは、20ヶ月齢(平均±SD、n=3〜4頭/遺伝子型)では、非遺伝子組換えマウス(27.1±1.5)及びhAPPマウス(25.1±3.6)において正常であるが、hα−シヌクレインマウス(21.0±0.9)及びhα−シヌクレイン/hAPPマウス(20.1±1.7)(チューキー・クレーマー検定で非遺伝子組換え対照に対してP<0.05)において減少した。
【0039】
これらの結果は、hα−シヌクレイン/hAPPマウスにおけるコリン作動性ニューロンの年齢依存性の損失は、基底核においていくつかの付加的効果を有するhα−シヌクレインと共に、主にhAPP/Aβに依存することを示唆している。これらのマウスの新皮質でのSIPTの年齢依存性の損失は、hα−シヌクレインの少しの寄与と共に、主としてhAPP/Aβにもよるものであるのに対して、基底核におけるSIPTの損失は、ほとんど全くhα−シヌクレインによるものである。
【実施例6】
【0040】
Aβはhα−シヌクレインの蓄積を助長する。ニューロン内でのhα−シヌクレインの蓄積は、ADのレヴィ小体変異型を含む、レヴィ小体病の特徴である。hα−シヌクレイン単一遺伝子組換えマウスのニューロン中におけるhα−シヌクレインの年齢依存性蓄積は、既に観察されている(Masliah、2000年)。月齢4〜20ヶ月の間で、新皮質中でのニューロンの封入体の数は、hα−シヌクレイン/hAPPマウスにおいて、年齢が合致するhα−シヌクレインマウスよりも平均して1.6倍高かった(mm2あたり15.3±1.1対9.5±0.9、平均±SEM、不対両側スチューデントt検定でP=0.0002、n=28〜32頭/遺伝子型)。これは12月齢のマウスで例証される。封入体の数は、hα−シヌクレインマウス及びhα−シヌクレイン/hAPPマウスの両方で加齢と共に増加した。これらの結果は、hAPP/Aβがニューロンでのhα−シヌクレインの蓄積を促進することを示している。
【0041】
超構造解析により、hα−シヌクレインマウスにおけるすべてのニューロン内封入体は非晶質で電子稠密なのに対し、hα−シヌクレイン/hAPPにおけるニューロン内封入体の多くは線維状で、典型的に線維状要素を含むヒトの病気でのレヴィ小体との類似性が増していた。ニューロン細胞質中の線維状の封入体は、hα−シヌクレイン/hAPPマウスの脳切片が抗hα−シヌクレインまたは抗Aβを用いた免疫金電子顕微鏡による分析において、金粒子で装飾された。これらの結果は、Aβが直接的な相互作用によって、hα−シヌクレインの生体内線維化を促進することを示唆している。さらに、この可能性を支持して、Aβ−免疫反応性顆粒状沈着物が、hα−シヌクレイン/hAPPマウスにおけるhα−シヌクレイン−陽性ニューロン内封入体中で共焦点顕微鏡分析により検出された。
【0042】
hα−シヌクレイン/hAPPマウスにおいて観察された変化が本当にAβとhα−シヌクレインとの間の病原性相互作用から生じたものであるかどうかをさらに評価するために、生体内分析を二つの生体外モデルに拡張した。無細胞系では、新たに溶解した場合と想定される凝集した(加齢)場合の両方のヒトAβ1−42が、以前の観察と一致して、hα−シヌクレインの高分子量ポリマーの生成を強く促進した。対照的に、より線維質の少ないAβ1−40はhα−シヌクレインの生体外での凝集に影響を及ぼさなかった。明らかに、Aβ1−42とAβ1−40はまた、培養培地に加えたときに、ニューロンの細胞培養において、α−シヌクレインの細胞内蓄積に対するそれらの効果が異なっていた。Aβ1−42はα−シヌクレインの細胞内蓄積を強く増大させたが、Aβ1−40は増大させなかった。
【0043】
小胞体及び中間コンパートメント内でのAβ1−42の過剰産生は、その蓄積を促進するhα−シヌクレインのプロセッシングを妨害しうる。しかしながら、細胞培養データは、Aβ1−42への細胞外暴露は、hα−シヌクレインの細胞内蓄積を誘起するのに十分なのに対し、Aβ1−40への暴露はそうではないことを示している。この意味において、細胞の細胞外Aβ1−42へのインキュベーションは、リソソーム膜の完全性を乱すのに対し、Aβ1−40への細胞のインキュベーションではそうならないことは興味深い。また、溶解性hα−シヌクレインと平面状脂質二重層との会合は、広範な二重層の崩壊をもたらす。Aβ1−42とhα−シヌクレインとの組み合わせ作用は、エンドソーム−リソソーム膜の漏れを招き、細胞基質でのAβ1−42とhα−シヌクレインとの間での直接的な相互作用を可能にする。そのような相互作用は、hα−シヌクレインの細胞内蓄積を促進する。Aβ1−42のhα−シヌクレインに対するこの効果には、おそらく、これらの分子間の直接的な線維質相互作用で、あるいはフリーラジカルによって仲介される。Aβは酸化的ストレスを与え、研究により、hα−シヌクレインの酸化的架橋がレヴィ小体の形成に寄与することを示された(Hashimotoら、1999年;Leeら、2000年)。
【0044】
hα−シヌクレイン−関連病態におけるhAPP/Aβの顕著な効果とは対照的に、hα−シヌクレイン発現は、Aβからプラークへの細胞外沈着、あるいは8−、12−及び20−月齢のhα−シヌクレイン/hAPPマウスにおけるプラーク関連神経突起ジストロフィーの発生を、年齢が合致したhAPPマウス(1遺伝型及び月齢あたり、n=3〜4頭)と比べて有意には変えなかった。12月齢のhAPP及びhα−シヌクレイン/hAPPマウスは、ELISA(mg/g脳半球、平均±SD,n=4〜11頭/遺伝子型)により測定では、類似の大脳レベルのAβ1−40(4.3±0.88対4.6±0.6)及びAβ1−42(248±48対275±41)を有していた。
【実施例7】
【0045】
脳半球からあるいは切開した脳領域からの全RNAを単離し、その後、溶液ハイブリダイゼーションRNアーゼ保護アッセイで分析し、そしてアクリルアミド/尿素/トリス/ホウ酸塩/EDTAゲル上で分離した(図2)。レーンUは、α−シヌクレイン遺伝子(α−syn)、Aβ前駆体遺伝子(APP)及びアクチン(actin)の未消化転写物を表す。図の右手側の注記は、消化試料のサイズを示す。試料レーンは、3つの別々のマウスの分析を表し、それぞれ、非Tg、非遺伝子組換えマウス(すなわち、対照);Thy1−hAPPtg、マウス(m)Thy−1遺伝子の調節制御下でヒト(h)APP751cDNAを発現する遺伝子組換えマウス;Thy1−α−syn’tg、マウス(m)Thy−1遺伝子の調節制御下でヒトα−シヌクレインを発現する遺伝子組換えマウス;ならびに二重tg、マウス(m)Thy−1遺伝子の調節制御下でヒト(h)APP751及びα−シヌクレイン遺伝子の両方を含む遺伝子組換えマウスである。
【実施例8】
【0046】
hα−シヌクレインまたはPDAPP−J9Mtgマウスとmα−またはmβ−シヌクレインKOマウスとの交雑育種。二遺伝子マウスにおいてα−シヌクレインの欠失がAβ沈着の抑制をもたらす一方、β−シヌクレインの欠失がAβ沈着を刺激することをさらに確認するために、α−シヌクレインまたはβ−シヌクレインの欠失をコードする遺伝子を有するノックアウト(KO)マウス(Lexicon Genetics Inc.,The Woodlands,テキサス州)を異型接合PDAPP−J9Mtgマウスと交配した。以下の系統が作成された:1)(PDAPP−/−;mα−syn+/+)、2)(PDAPP−/−;mα−syn+/−)、3)(PDAPP+/−;mα−syn+/+)、4)(PDAPP+/−;mα−syn+/−)、及び5)(PDAPP−/−;mα−syn−/−)。マウス遺伝子型は末端DNAを用いてPCRにより決定した。続いて、その(PDAPP+/−;mα−syn+/−)を交雑させ、以下の子孫を産出した:1)(PDAPP+/+;mα−syn+/+)、2)(PDAPP+/+;mα−syn+/−)、及び3)(PDAPP+/+;mα−syn−/−)。同じ交配プロトコルを、二遺伝子hα−シヌクレインまたはPDAPP−J9M及びmβ−シヌクレインKOマウス作成のために続けた。
【0047】
アミロイド沈着に対するα−シヌクレインとβ−シヌクレインの影響は、先の実施例で用いた同一の回転棒及び神経病理学的分析を用いて、同型接合KOマウス(PDAPP+/+;mα−syn−/−)及びシヌクレインについて半接合のマウス(PDAPP+/+;mα−syn+/−)の両方で評価した。
【実施例9】
【0048】
hα−シヌクレインまたはPDAPP−J9Mtgマウスとhβ−シヌクレインを過剰発現するマウスとの交雑育種。その内容をここに引用して援用する、標準的な交雑育種プロトコル(Muckeら、1995年)に従い、高発現異型接合β−シヌクレインマウスを異型接合α−シヌクレインまたはPDAPP−J9Mtgマウスと交配して、1)非tg同腹子(PDAPP−/−;hα−またはβsyn−/−)、2)二遺伝子(PDAPP+/−及びhβ−シヌクレイン+/−)、3)二遺伝子(hα−シヌクレイン+/−及びhβ−シヌクレイン+/−)、4)単一tg hAPP、及び5)単一tg hα−シヌクレインまたはβ−シヌクレインの発生がもたらされた。マウスの遺伝子型は末端DNAを用いてPCRにより決定した。
【0049】
回転棒に処されたとき、α−シヌクレインtgマウスの原系統は運動欠陥を示したため、二遺伝子交配体は同様の方法で評価した。回転棒行動の解析から、β−シヌクレインの過剰発現は、α−シヌクレインtgマウスにおける運動欠陥を減少させることが明らかとなった。続いての神経病理学的解析から、β−シヌクレインの過剰発現は、ニューロンの封入体の減少をもたらすことが示された。β−シヌクレインの過剰発現は、また、α−シヌクレインtgマウスにおけるニューロン損失の減少をもたらすことが示された。これらの結果はさらに、β−シヌクレインは生体内で活性であること、ならびにそれは抗パーキンソン及び抗アルツハイマー治療薬として可能性のある物質を構成することを確認するものである。
【0050】
hα−シヌクレイン/hAPP二遺伝子マウスは、認知及び運動変性、コリン作動性ニューロン及びSIPTの損失、広範なアミロイドプラーク、ならびにhα−シヌクレイン免疫反応性ニューロン内線維状封入体を有する。これらすべての特徴は、ADのレヴィ小体変異型においても見出される。集合的には、レヴィ小体病は、ADのみを除いて第2位の、一般的な神経変性疾患である。それらは、PD,広汎性レヴィ小体病、及びADのレヴィ小体変異型を含む、異種構造群の病気を含んでなる。レヴィ小体病の患者は、典型的には、レヴィ小体、パーキンソン症候群及び認知損傷を有する。ADを持つ患者の約25%が、明らかなパーキンソン症候群を発生し、そしてhα−シヌクレイン免疫反応性レヴィ小体様封入体が、早発性ADと関連するダウン症候群におけると同様に、散発性AD及びFADの大部分の場合に発生する。また、レヴィ小体はhAPPを含む。これらの関連性は、hAPP/Aβがレヴィ小体の形成及びレヴィ小体病の発生において、ある役割を果たしていることを示している。
【0051】
hAPP/hα−シヌクレインマウスでの研究は、hα−シヌクレイン及びhAPP/Abが、脳の完全性及び機能に対して、集中的であるだけでなく明確な、病原性効果を持つことを示している。hα−シヌクレインはAβ依存性の神経炎プラークの発生または脳におけるAβ含有量全体には影響を与えないが、hAPP/Aβ依存性認知欠損及び特定の脳領域において神経変性を悪化させた。これらの知見は、hα−シヌクレインがプラーク非依存性メカニズムを通して、Aβの毒性を増強することを示している。これらのデータは、ADのレヴィ小体変異型をもつ人々は純粋なADをもつ人々よりも急速に認知減退を示すということを示唆する臨床所見を説明するものである。hAPP/Aβの過剰発現は次に、遺伝子組換えマウスにおいてhα−シヌクレインのニューロン内蓄積を促進し、運動欠陥の発生を加速した。これらの効果は、Aβまたは他のhAPP産物により仲介されることが最もありうることであり、生体外での研究は、Aβがその犯人であることを示している。Aβとhα−シヌクレインの間のこれら病原性相互作用の観点から、Abまたはhα−シヌクレインの蓄積の阻止を目的とする薬剤が、以前に予期されていたよりも広範囲の神経変性疾患に利益をもたらすであろう。
【0052】
(参照文献)
Andraa,K.,Abramowski,D.,Duke,M.,Probst,A.,Wiederhold,K.−H.,Buurki,K.,Goedert,M.,Sommer,B.及びStaufenbiel,M.1996年,Neurobiol.Aging 17,183−190.
Borchelt DR,Davis J,Fischer M,Lee MK,Slunt HH,Ratovitsky T,Regard J,Copeland NG,Jenkins NA,Sisodia SS,Price DL.1996年,遺伝子組換えマウスの脳及び心臓において外来遺伝子を発現するベクター。Genet.Anal.13:159−63.
Carlson,G.A.,Borchelt,D.R.,Dake,A.,Turner,S.,Danielson,V.,Coffin,J.D.,Eckman,C.,Meiners,J.,Nilsen,S.P.,Younkin,S.G.及びHsiao,1997年,Hum.Mol.Gen.6:1951−9.
Games,D.,Adams,D.,Alessandrini,R.,Barbour,R.,Berthelette,P.,ら,1995年,Nature(London)373,523−528.
Giasson,B.I.,Duda,J.E.,Murray,I.V.,Chen,Q.,Souza,J.M.,Hurtig,H.I.,Ischiropoulos,H.,Trojanowski,J.Q.,Lee,V.M.2000年,シヌクレイノパシー病変における選択的アルファ−シヌクレインニトロ化による神経変性にリンクした酸化的損傷.Science 290:985−9.
Hashimoto,M.,Hsu,L.J.,Xia,Y.,Takeda,A.,Sisk,A.,Sundsmo,M.及びMasliah,E.1999年,酸化的ストレスは生体外でNACP/α−シヌクレインのアミロイド様凝集体形成を誘起する.Neuroreport 10:717−21.
Higgins,L.S.,Rodems,J.M.,Catalano,R.,Quon,D.及びCordell,B.1995年,Proc.Natl. Acad.Sci.USA 92,4402−4406.
Hogan,B.ら、1986年,マウス胚の操作:実験室マニュアル,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,ニューヨーク、アメリカ.
Holtzman,D.M.,Bales,K.R.,Tenkova,T.,Fagan,A.M.,Parsadanian,M.,Sartorius,L.J.,Mackey,B.M.,Olney,J.,McKeel,D.,Wozniak,D.及びPaul,S.M.2000年,アルツハイマー病のマウスモデルにおけるアポリポタンパク質Eイソ型依存性アミロイド沈着及び神経突起変性.97:2892−7.
Hsia,A.Y.,Masliah,E.,McConlogue,L.,Yu,G.−Q.,Tatsuno,G.,Hu,K.,Kholodenko,D.,Malenka,R.C.,Nicoll,R.A.及びMucke,L.1999年,アルツハイマー病マウスモデルにおけるプラーク非依存性神経回路破壊.Proc Natl.Acad.Sci.USA 96:3228−33.
Hsiao KK,Borchelt DR,Olson K,Johannsdottir R,Kitt C,Yunis W,Xu S,Eckman C,Younkin S,Price D,ら.1995年,アルツハイマーアミロイド前駆体タンパク質を過剰発現する遺伝子組換えFVB/Nマウスにおける年齢関連性CNS障害及び早期死亡ron 15:1203−18.
Hsiao,K.,Chapman,P.,Nilsen,S.,Eckman,C.,Harigaya,Y.,Younkin,S.,Yang,F.及びCole,G.1996年,Science 274,99−102
Kammesheidt,A.,Boyce,F.M.,Spanoyannis,A.F.,Cummings,B.J.,Ortegon,M.,Cotman,C.,Vaught,J.L.及びNeve,R.L.1992年,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89,10857−10861.
Kang J,Lemaire HG,Unterbeck A,Salbaum JM,Masters CL,Grzeschik KH,Multhaup G,Beyreuther K,Muller−Hill B.1987年,アルツハイマー病のアミロイドA4タンパク質の前駆体は細胞表面受容体に似る.Nature 325:733−6.
Lamb,B.T.,Sisodia,S.S.,Lawler,A.M.,Slunt,H.H.,Kitt,C.A.,Kearns,W.G.,Pearson,P.L.,Price,D.L.及びGearhart,J.D.1993年,Nat.Genet.5,22−30.
Masliah,E.,Rockenstein,E.M.,Veinbergs,I.,Mallory,M.,Hashimoto,M.,Takeda,A.,Sagara,Y.,Sisk,A.,Mucke,L.2000年,アルファ−シヌクレインマウスにおけるドーパミン作動性損失及び封入体形成:神経変性障害のための意味.Science 287:1265−9.
Morris R.1984年,ラットにおける空間学習の研究のための、水迷路法の開発.J. Neurosci.Meth.11:47−60.
Mucke,L.,Masliah,E.,Johnson,W.B.,Ruppe,M.D.,Alford,M.,Rockenstein,E.M.,Forss−Petter,S.,Pietropaolo,M.,Mallory,M.及びAbraham,C.R.1994年,Brain Res.666,151−167.
Mucke,L.,Abraham,c.R.,ruppe,M.D.,Rockenstein,E.M.,Toggas,S.M.,Mallory.M., Alford,M.及びMasliah,E.1995年,ヒトアミロイド前駆体タンパク質(hAPP)のニューロン過剰発現によるHIV−1 gp120誘起脳損傷からの保護作用.J.Exp.Med 181:1551−56.
Mucke,L.,Masliah.E.,Yu,G.−Q.,Mallory,M.,Rockenstein,E.M.,Tatsuno,G.,Hu,K.,Kholodenko,D.,Johnson−Wood,K.及びMcConlogue,L.2000年,J.Neurosci.20:4050−8.
Quon,D.,Wang,Y.,Catalano,R.,Scardina,J.M.,Murakami,K.及びCordell,B.1991年,Nature(London)352:239−241.
Rockenstein EM,McConlogue L,Tan H,Power M,Masliah E,Mucke L,1995年,J.Biol.Chem.270:28257−28267.
Strittmatter,W.J.,Saunders,A.M.,Schmechel,D.,Pericak−Vance,M.,Enghild,J.,Salvesen,G.S.及びRoses,A.D.1993年,アポリポタンパク質E:β−アミロイドへの高結合活性結合、及び遅発性家族性アルツハイマー病における4型対立遺伝子の頻度の増大.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:1977−81.
Sturchler−Pierrat,C.,Ambramowski,D.,Duke,M.,Wiederhold,K.H.,ら.1997年,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:13287−92.
(実施例3中)Muckeら.1995年,J.Exp.Med.181:1551−6.
【図面の簡単な説明】
【0053】
【図1】回転棒におけるhSYN及びhAPPtgマウスでの運動欠陥の性質決定。非遺伝子組換え同腹子に比べて、単一tghSYNマウスは有意な運動欠陥を示した。同様に、二遺伝子hSYN/hAPPマウスは、単一tghSYNマウスと同様に、機能障害のレベルを示した。hAPPのみを発現するマウスは、非tg対照と違いがなかった。1遺伝子型あたりN=6〜8。月齢12ヶ月。
【図2】遺伝子組換え及び非遺伝子組換えマウスの脳からの全RNAのRNアーゼ保護アッセイ。レーンUは、未消化転写物を示す。図の右手側の注記は、消化試料のサイズを示す。試料レーンは、3つの別々のマウスの分析を表し、それぞれ、非Tg、非遺伝子組換えマウス(すなわち、対照);Thy1−hAPPtg、遺伝子組換えマウス;Thy1−α−syn’tg、遺伝子組換えマウス;ならびに二重tg、ヒト(h)APP751及びα−シヌクレイン遺伝子の両方を含む遺伝子組換えマウスである。
Claims (17)
- 以下を包含する遺伝子組換えマウス:
前記マウスのゲノムに組み込まれ、第一のプロモータに作動可能なように結合されたヒトアミロイドの前駆タンパク質(hAPP)をコードする、第一の遺伝子組換えヌクレオチド配列;及び
前記マウスのゲノムに組み込まれ、第二のプロモータに作動可能なように結合されたヒト(h)α−シヌクレインをコードする、第二の遺伝子組換えヌクレオチド配列;
第一及び第二の遺伝子組換えヌクレオチド配列が発現され、前記発現の結果、前記遺伝子組換えマウスが神経変性疾患を発生させている。 - 前記第一のプロモータが、場合によりシミアンウイルス(SV)40イントロン、Thy−1プロモータまたはプリオン(Prp)プロモータに作動可能なように結合された、血小板由来の増殖因子β(PDGF−β)プロモータを含んでなる、請求項1の遺伝子組換えマウス。
- 前記第二のプロモータが、場合によりSV40イントロン、Thy−1プロモータまたはPrpプロモータに作動可能なように結合された、PDGF−βプロモータを含んでなる、請求項1の遺伝子組換えマウス。
- 同一種の非遺伝子組換えマウスに比べて、第一及び第二の遺伝子組換えヌクレオチド配列によりコードされたタンパク質が過剰発現する、請求項1の遺伝子組換えマウス。
- hAPPのヌクレオチド配列が、hAPPのエクソン6〜9の間のイントロンを含み、hAPP770、hAPP751またはhAPP695をコードしている、請求項1の遺伝子組換えマウス。
- hAPPが、アミノ酸(aa)670でのリジンからアスパラギンへの変更及びaa671でのメチオニンからロイシンへの変更を含む二重変異、またはバリンからフェニルアラニンもしくはイソロイシンへの変更を含むaa717での単一変異を含んでなる変異型hAPPである、請求項1の遺伝子組換えマウス。
- hAPPをコードしているヌクレオチド配列が、Aβ1−42を含んでなるAPPの部分のみをコードしている、請求項1の遺伝子組換えマウス。
- α−シヌクレインのヌクレオチド配列がα−シヌクレインのコード配列を含んでなる、請求項1の遺伝子組換えマウス。
- hα−シヌクレインが、アラニンからプロリンへのaa30での変更またはアラニンからスレオニンへのaa53での変更を含むタンパク質をコードする変異型hα−シヌクレインcDNAを含んでなる変異型hα−シヌクレインである、請求項1の遺伝子組換えマウス。
- 以下を包含する遺伝子組換えマウス:
前記マウスのゲノムに組み込まれ、シミアンウイルス(SV)40イントロンに作動可能なように結合された血小板由来の増殖因子β(PDGF−β)プロモータに作動可能なように結合されたヒトアミロイドの前駆タンパク質(hAPP)をコードする、第一の遺伝子組換えヌクレオチド配列;
前記マウスのゲノムに組み込まれ、SV40イントロンに作動可能なように結合されたPDGF−βプロモータに作動可能なように結合されたヒト(h)α−シヌクレインをコードする、第二の遺伝子組換えヌクレオチド配列;
第一及び第二の遺伝子組換えヌクレオチド配列が発現され、前記発現の結果、前記遺伝子組換えマウスに神経変性疾患が発生する。 - 同一種の非遺伝子組換えマウスに比べて、第一及び第二の遺伝子組換えヌクレオチド配列によりコードされたタンパク質が過剰発現されている、請求項10の遺伝子組換えマウス。
- hAPPがエクソン6〜9の間のイントロンを含むコード配列を含んでなる、請求項10の遺伝子組換えマウス。
- hAPPが、アミノ酸717でのバリンからイソロイシンへの変異を含む、請求項10の遺伝子組換えマウス。
- hα−シヌクレインがhα−シヌクレインのコード配列を含んでなる、請求項10の遺伝子組換えマウス。
- 神経変性疾患が、レヴィ小体病に特有のニューロン内封入体の生成を含んでなる、請求項10の遺伝子組換えマウス。
- 神経変性疾患が、繊維性レヴィ小体様封入体の生成、ニューロンの死または(及び?)運動欠陥の発生を含んでなる、請求項10の遺伝子組換えマウス。
- 遺伝子組換えマウスに、治療的介入の投薬を含んでなる、神経疾患の予防または治療のための治療剤のスクリーニング方法であって、以下を包含する:
前記マウスのゲノムに組み込まれ、第一のプロモータに作動可能なように結合されたヒトアミロイドの前駆タンパク質(hAPP)をコードする、第一の遺伝子組換えヌクレオチド配列;
前記マウスのゲノムに組み込まれ、第二のプロモータに作動可能なように結合されたヒト(h)α−シヌクレインをコードする、第二の遺伝子組換えヌクレオチド配列;
第一及び第二の遺伝子組換えヌクレオチド配列が発現され、前記発現の結果、前記遺伝子組換えマウスが神経変性疾患を発生させる。
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