JP2004536089A - Formulations and methods for introducing substances into cells - Google Patents
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Abstract
本発明は、物質を細胞内に導入するためのアルコール性脂質の配合物に関し、詳しくは、医療、美容、調査、診断、獣医、農業、又は製薬に使用される配合物に関する。前記配合物は、リン脂質、エタノール(又は他のC2−C4などの揮発性アルコール)、水、少なくとも1つの活性分子、任意的に追加するグリコール又は/及び他の添加物を含んでおり、物質を、取り込まれた、付着した、吸着した、複合した分子の細胞に導入する。The present invention relates to formulations of alcoholic lipids for introducing substances into cells, and more particularly to formulations used in medicine, cosmetology, research, diagnosis, veterinary, agriculture, or pharmaceuticals. The formulation comprises a phospholipid, ethanol (or other volatile alcohol such as C2-C4), water, at least one active molecule, optionally additional glycols and / or other additives. Is introduced into cells of the incorporated, attached, adsorbed, conjugated molecule.
Description
【技術分野】
【0001】
本発明は、物質を細胞内に導入するためのアルコール性脂質の配合物に関し、詳しくは、医療、美容、調査、診断、獣医、農業、又は製薬に使用される配合物に関する。前記配合物は、リン脂質、エタノール(又は他のC2−C4などの揮発性アルコール)、水、少なくとも1つの活性分子、任意的に追加するグリコール又は/及び他の添加物を含んでおり、物質を、取り込まれた、付着した、吸着した、複合した分子の細胞に導入する。
【背景技術】
【0002】
細胞膜は、生理的恒常性において、他の分子の浸透を阻んでいる間に、選択された分子の浸透を許可するのに、重要な役割を果たす。他の不透過性活性物質の導入が望まれる場合でも、透過障壁を破壊することが有用である。製薬の目的、遺伝子治療、ワクチン接種、微生物への導入、又は生物医学研究又は農業用の植物細胞のトランスフォーメーションでは、分子の細胞内への導入は、近年の研究では、多大な関心が持たれている。従来、この浸透の障害を克服するための1つの方法として、脂質濾胞方法がある。従来のリポソームでは、不浸透性分子の細胞膜障壁に対する浸透性を向上させることはできないが、いくつかの特別にデザインされた脂質濾胞によれば、それらの内容物を細胞質に効率良く導入することができる、ということが知られている。
【0003】
濾胞方法による細胞内導入を向上させるための試みが、いくつか開示されている。それらの試みの1つとして、脂質濾胞を荷電させることにより、分子の封入能力を向上させたものがある。単一の陽イオン脂質を含んでいるリポソームは、インビトロ又はインビボにて、DNA又はRNAを細胞に形質移入するのに使用される(Wrobel and Collins, 1995)。同様に、他の不浸透性物質の取り込み量を増加させるためにも使用される(Garrett et al. , 1999)。脂質と細胞膜とを混合させることができる陽イオンのリポソームは、複合したDNAを細胞に導入することが報告されている。これは、たいがい、エンドサイトーシス・プロセスにより行われる(Miller et al. , 1998)。ポリカチオンのリポソームは、p−ガラクトシダーゼと人胎盤のアルカリホスファターゼの、様々な細胞培養への導入を向上させることが知られている(Sells et al. , 1995)。他の試みとしては、例えばPEGのような立体スタビライザを組み込むことにより、濾胞における脂質の組成を変更したものがある(Duzgunes and Nir, 1999; Miller et al. , 1998)。他には、特にpH感応性リポソームに関して、細胞内に封入された分子に影響を及ぼすことを試みている(Chu et al. , 1990; Kono et al. , 1997)。また、ジメチル・スルホキシドと共にリポソームを投与することにより、ある濾胞方法による導入が向上することが知られている(Jain and Gewirtz, 1998; Kawai and Nishizawa, 1984)。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
ヨーロッパ特許第0 804 160号、及び米国特許第5,716,638号には、様々なリポフィリシティ(lypophilicity)を膜の内部に導入する又は通り抜けさせるための高性能キャリアになると考えられる方法(Ethosomes)が開示されている。皮膚内に分子を浸透させる主な経路は、細胞間であり、細胞を経てではない。
【0005】
したがって、調合することが容易で、細胞の取り込み及び輸送を向上させ、物質を細胞、腺、組織、及び他に導入することができ、細胞核又は他の細胞小器官に導入することができる配合物が求められている。
【発明を実施するための最良の形態】
【0006】
本発明は、生体膜を通り抜けて浸透させるための、方法及び配合物に関する。前記配合物は、水性アルコール又は水性/アルコール性/グルコール脂質配合物であり、少なくとも、リン脂質、エタノール(又は他のC2−C4揮発性アルコール)、水を含んでいる。また、本発明の方法及び配合物は、取り込まれた又は複合した分子を、生体及び細胞膜を通り抜けて、細胞と細胞小器官(例えば細胞核)に導入するのを容易にするためのものである。
【0007】
他の実施形態では、前記配合物は、さらに有機陽イオン小分子を含んでいる。
【0008】
他の実施形態では、前記配合物は、分子量が100〜600の小分子量陽イオン(有機陽イオン小分子)を含んでいる。
【0009】
他の実施形態では、前記配合物は、非リン脂質の有機陽イオン小分子を含んでいる。
【0010】
本発明の配合物及び方法は、製薬、美容、医療、獣医、診断、農業、及び調査の用途に使用することができる。
【0011】
本発明の配合物及び方法の利点は、次のとおりである。細胞の取り込み及び輸送を向上させる。前記配合物は調合するのが容易である。細胞、組織、腺、濾胞、及び器官に導入することができる。細胞核(又は他の細胞小器官)に導入することができる。
【0012】
ある実施形態では、前記配合物は、リン脂質、エタノール、水、及び非リン脂質の有機両親媒性陽イオンを含んでいる。このことにより、生体膜を通り抜けて浸透させることができる。また、取り込まれた又は複合した分子を、生体及び細胞膜を通り抜けて、細胞と細胞小器官に導入するのが容易となる。
【0013】
エタノールの存在は、10〜50%の量により、濾胞に負電荷を与える。また、陽イオンがそれらの配合物と結合することにより、濾胞に正電荷を与える。
【0014】
他の実施形態では、前記配合物は、他の揮発性のC2−C4アルコールも含んでいる。
【0015】
他の実施形態では、前記配合物は、エタノールの代わりに、他のC2−C4揮発性アルコールを含んでいる。
【0016】
前記配合物は、リン脂質、10%以上のエタノール(又は他のC2−C4揮発性アルコール)、0〜30%のグリコール及び水から成る。
【0017】
他の実施形態では、前記配合物は、0〜40%のポリオールも含んでいる。
【0018】
他の実施形態では、前記配合物は、リン脂質、エタノール(EtOH)、水(DDW)、及びプロピレングリコール(PG)から成る。
【0019】
他の実施形態では、陽イオンの配合物は、リン脂質、10%以上のエタノール(又は他のC2−C4揮発性アルコール)、0〜30%のグリコール及び水、非リン脂質陽イオン両親媒性分子を加えて調合される。本発明の非リン脂質陽イオン両親媒性分子は、リン脂質のグループに属さない比較的に小さな分子量(MW 100−600)のものであり、例えば、プロプラノロールHCLのようなものである(なお、これに限定されるわけではない)。
【0020】
他の実施形態では、前記配合物は、インビトロ、生体外又は生体内のいずれの場合でも、物質を、細胞(培養物)、細胞膜、腺、毛包、毛幹、脂腺、組織、又は動植物の全ての器官に導入するのに使用することができる。
【0021】
前記配合物は、生体及び細胞膜を通り抜けて浸透する。前記配合物は、取り込まれた又は複合した分子が生体及び細胞膜を通り抜けて浸透することを容易にする。
【0022】
また、本発明の配合物は、ホスファチジルコリン(PC)、水素化PC、ホスファチジン酸(PA)、ホスファチジルセリン(PS)、ホスファチジルエタノールアミン(PE)、ホスファチジルグリセロール(PPG)、ホスファチジルイノシトール(PI)、それらの混合物、リン脂質陽イオン、セラミド、及び他の脂質のような、異なるリン脂質を含んでいてもよい(なお、これらのリン脂質に限定されるものではない)。加えて、前記配合物は、コレステロールや界面活性剤などの他の添加物を含んでいてもよい。
【0023】
リン脂質は、エマルションの調合における乳化剤と同様に、リポソーム系において、その幅広い使途で知られている。製薬又は美容の目的に使用されるこれらの全ての系は、水性の系である。前記系は、製剤の保存及び/又は質感の向上のためのアルコール及び/又はグリコールをいくらか含む。
【0024】
前記リン脂質の原料としては、卵、大豆、半合成物、及び合成物を用いることができる。
【0025】
最終生成物におけるアルコール(例えばEtOH)の濃度は、15〜50%の範囲である。また、非水相(アルコールとグリコールの化合)における前記濃度は、12〜70%の範囲である。また、キャリアの残りには、水及び可能性がある添加物が含まれる。
【0026】
前記配合物は、分子を細胞内に効果的に導入することができる。
【0027】
本発明の配合物により導入することができる分子は、抗菌薬、駆虫薬、殺虫剤、治療薬、化学療法薬、生物学的製剤、診断用薬、ペプチド系抗生物質、抗にきび剤、有糸***性物質、抗有糸***性物質、ステロイド、抗多毛剤、発毛剤、ビタミン、抗生物質、抗真菌剤、抗ウイルス薬、核酸(DNA、RNA、プラスミド)、タンパク質/ペプチド/アミノ酸、脂質、糖、糖タンパク、糖脂質、アンチセンス・オリゴヌクレオチド(ODNs)、ポリ陰イオン性高分子とその派生物、核酸、ON's、DNAとRNAのオリゴヌクレオチド、裸のODNs、ビタミン、抗生物質、様々な高分子である(なお、これらに限定されるものではない)。
【0028】
図1〜4に示すように、本発明の配合物は、細胞膜を通り抜けて、分子を細胞質に効果的に導入することができる。
【0029】
前記配合物は、細胞核及び/又は他の細胞小器官(後に実施例1で説明する)に、分子を効果的に導入することができる。
【0030】
前記配合物は、微生物、細菌、病原体などに、分子を効果的に導入することができる。
【0031】
前記配合物は、IP、IM、SC、IV、腫瘍内、又は皮膚内に投与することができる。
【0032】
前記配合物の形態としては、固形、スプレー状、パッチ状、又は半液状をとることができる。
【0033】
他の実施形態では、前記配合物は、イオントフォレーゼ、音波泳動法、マイクロポレーション、極微針、エレクトロポレーション、ジェット、又はレーザにより投与される。
【0034】
他の実施形態では、前記配合物は、培養に、10−200μl/ウエルの量で添加される。ウエルの容積は、1〜2mlである。ウエルのサイズが異なる場合でも、同様の比率が保たれる。
【0035】
本発明の配合物は、植物のどの部分にも投与することができる。例えば、葉、根、外皮、茎、アース、花、芽に投与される。
【0036】
遺伝子治療に使用する場合は、本発明の配合物は、非リン脂質有機陽イオンを含んでいる。このことにより、選択された真核細胞内に、DNAを導入することができる。形質移入された細胞のゲノム内に組み込まれたDNAの発現及びトランスフォーメーションを安定させる方法は知られている。リポソーム仲介トランスフェクションのための代表的な方法は、Ausebel 他によるCurrent Protocols in Molecular Biology,Volume 1, Unit 9.4.1に記載されている。哺乳類細胞へのDNAの導入については、第9章を参照されたい。前記配合物の、細胞のトランスフェクションを容易にするための能力は、実施例4に示す。
【0037】
本発明の核酸配合物は、核RNA、mRNA、cDNA、ゲノムDNA、プラスミドDNA、又は様々な組み合わせの混成物であろうとなかろうと、生物源(遺伝子組み換え型を含む)又はインビトロでの合成物から単離される。本発明の核酸は、形質転換された又は形質移入された全細胞、形質転換された又は形質移入された全細胞、細胞溶解物、又は部分的に精製された又は十分に純粋なものに存在する。脂質と複合させる際は、前記核酸は、概ね十分なものが用いられる。
【0038】
本発明の複合物において封入に使用される核酸は、癌関連の治療に用いることができる。例えば、HER−2/neu(例えば、the tumor suppressor E1A from adenovirus 5)のような腫瘍遺伝子の発現を抑制する核酸や、細胞増殖又は分化を制御する核酸は、本発明の脂質:核酸複合物の好ましい成分である。例えば、サイトカイン、炎症性分子、増殖因子、テロメラーゼ、成長因子受容体、癌遺伝子産物、インターロイキン、インターフェロン、alpha-FGF、IGF-I、IGF-II、beta-FGF、PDGF、TNF、TGF-alpha、TGF-beta、KGF、SCF/c-Kit リガンド、CD40L/CD40、VLA-4/VCAM-1、ICAM-l/LFA-1、及びhyalurinCD44の発現をエンコードした核酸、シグナル・トランスフェクション分子と対応する腫瘍遺伝子製品(例えば、Mos、Ras、Raf、及びMet)、転写活性化因子及びサプレッサ(例えば、p53、p21、Tat、ステロイド・ホルモン受容体(エストロゲン、プロゲステロン、テストステロン、及びコルチコステロンなどのような))が知られており、好ましく、幅広く利用できる。上記したいかなるmRNAのトランスレーションを認識し抑制するアンチセンスRNAやリボザイムのような、それら分子の阻止因子をエンコードした核酸も好ましい。最終的には、アポトーシス又は他の形態の細胞死を引き起こす自殺遺伝子をエンコードしている核酸が好ましい。特に、急速に***する細胞(例えば、癌細胞)において最も活動的な自殺遺伝子、ガンシクロビルと組み合わせて単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ、アデノウイルス由来のE1A細胞生成物、又は様々な他のウイルス遺伝子が好ましい。反作用剤が添加されるまで活性化しないネガティブの各種のマーカも適している。細胞増殖制御因子と結合する分子をエンコードしたおとり核酸は、ある用途に対しては適している。トランスドミナント分子をエンコードした核酸は、同様に、用途によっては適している。
【0039】
本発明の配合物は、例えば、従来の手法による原核細胞のプロトプラスト(原形質体)へのプラスミドDNA導入のような、核酸を導入するにも使用することができる。
【0040】
本発明の配合物は、植物細胞のプロトプラスト内に、核酸を導入するのに使用することができる。リン脂質の水泡は、リポソーム内容物を植物細胞へ細胞内導入するのに使用される(例えばタバコプロトプラスト)。タバコモザイク病ウイルス(TMV)、RNAは、SzokaとPapahadjopoulosにより開発されたリバース蒸着法を使用して、リポソーム調合液に封入される。PNAS USA 75:4194-4198(1978)を参照されたい。トマト、ユリ、甘草、タマネギ、エンドウ、ペチュニアのような、様々な植物種(花と野菜)を対照にした研究が報告されている。Genetic Engineering of Plants, Ed. Kosuge, Merideith and Hollaender(出版:Plenum Press、著者:FraleyとHorsch)の表題「In vitro Plant Transformation Systems Using Liposomes and Bacterial Co-Cultivation」, Vol. 26, pps. 177-194(1983)や他の項目を参照されたい。同じように、本発明の配合物の当業者による目的に応じた適切な改良は、植物を形質転換するのに使用される。
【0041】
DNAプラスミドのような活性物質を含む本発明の配合物は、患者の腫瘍疾患に直接噴射するのに適している。そのような配合物は、嚢胞性線維症の患者の気管、鼻、又は他の体腔などの、気道内へのエアロゾルに適用することができる。同じように、そのような配合物は、腹膜腔に転移した卵巣癌の患者への腹膜注入に用いられる。アルツハイマー病の治療には、欠陥標的遺伝子の治療コピーの発現を引き起こすための脳細胞のトランスフェクションと直接注入に、多大な関心が持たれている。本発明の配合物は、同様に、欠陥遺伝子が原因となる、筋ジストロフィー、B型血友病、及びいくつかの他の病気に対しての遺伝子治療に有用であると考えられる。前記配合物は、本発明の陽イオン分子を1つ以上含んでいる。なお、これは、他の陽イオン分子の使用を除外するものではない。製剤を提供することは、細胞のトランスフェクションに対して十分に安定的及び効果的である。本発明の陽イオン分子の特性に関する知識(及び他の脂質に関する知識)を有する当業者は、特殊な細胞のトランスフェクションに最適となるように、配合物を容易に形成することが可能であろう。
【0042】
他の実施形態では、前記配合物は、細胞に導入するために、概して、ポリアニオン化合物(核酸を含む)と混ぜる。複合物は、陽イオン配合物と負電荷のポリアニオン化合物との荷電相互作用により形成される。特定の用途のポリアニオンは、例えばDNA、RNA、又はそれらの化合物の核酸を含む。中性脂質は、前記複合物に随意的に添加される。
【0043】
他の実施形態では、本発明は、本発明の配合物を投与することにより、細胞内へ物質を導入する方法を提供する。
【0044】
他の実施形態では、本発明は、本発明の配合物を投与することにより、細胞核へ核酸配列を導入する方法を提供する。
【0045】
本発明のさらなる理解を容易にするために、本発明の詳細な説明を主な目的として、下記の実施例を挙げる。
【実施例】
【0046】
(実施例1:蛍光プローブの細胞内導入)
《実験方法》
〈材料〉
ローダミン・赤・ジヘキサデカノイルグリセロホスホエタノールアミン(RR)、4−(4−ジエチルアミノ)スチリル−N−メチルピリジニウム・ヨードデ(D−289)、カルセイン、及び、リブ/デッド 生存可能性/細胞傷害性・キット(Molecular Probes Eugene, Oregon, USAより購入)。
【0047】
螢光ホスファチジルコリン[l−パルミトイル−2−[12−7−ニトロ−2−1,3−ベンズオキサジアジル1−4イル・アミノ[ドデカニル]sn−グリセロ−3]]−ホスファチジルコリン(AvantiPolar Lipids, USAより購入)。
【0048】
ホスホリポン90(Natterman GMBH, Germanyより購入)。
【0049】
エタノール(Frutarom, Israelより購入)。
【0050】
Dulbecco社製の調整済最小必須培養液(DMEM)、Dulbecco社製のリン酸緩衝生理食塩水(PBS)(Biological Industries, Beit HaEmek, Israel)より購入)。
【0051】
他の全ての材料は分析的な品質で用意した。
【0052】
〈配合物の調合〉
ホスホリポン90(PL)とプローブ(0.03% w/w)をエタノール中に溶解させる。陽イオン小分子(プロプラノロールHCl又はトリヘキシフェニジルHCl(THP)のような)を添加する実験では、前記化合物もエタノール相に溶解させる。Heidolph digital 2000 RZR-2000(Heidolph Digital, Germany)により攪拌しながら、水をアリコートに添加する(望ましい濃度となるまで)。従来の合成手法によりリポソームを調合する。簡単に説明すると、PLと蛍光プローブをクロロホルム中に溶解させる。続いて、R−ロータリ蒸発装置(Buchi, Germany)を使用して、溶媒を蒸発させる。そして、フラスコの内壁に残留している薄膜を水和させる。
【0053】
本明細書中では次の略語を使用している。
【0054】
PC:ホスファチジルコリン[l−パルミトイル−2−[12−7−ニトロ−2−1,3−ベンズオキサジアジル1−4イル・アミノ[ドデカニル]sn−グリセロ−3]]−ホスファチジルコリン
PL:ホスホリポン90(卵ホスファチジルコリン)
RR:ローダミン・赤・ジヘキサデカノイルグリセロホスホエタノールアミン
D−289:4−(4−ジエチルアミノ)スチリル−N−メチルピリジニウム・ヨードデ
DDW:再蒸留水
EtOH:エタノール
THP:トリヘキシフェニジル(HCl or at a pH when the molecule is ionized)
プロプラノロール:(HCl or at a pH when the molecule is ionized)
【0055】
〈配合物I〉
2gのPLと、0.03gのD−289を3gのエタノールに溶解させる。
【0056】
Heidolph digital 2000 RZR-2000により攪拌しながら、DDWをアリコートに10gになるまで添加する。
【0057】
〈配合物II〉
D−289の代わりPCを使用する。方法は、配合物Iの場合と同じである。
【0058】
〈配合物III〉
D−289の代わりRRを使用する。手法は、配合物Iの場合と同じである。
【0059】
〈対照系〉
(A)プローブの水性エタノール溶液:0.03gのプローブ(RR又はD−289又はカルセイン)を、3gのエタノールに溶解させ、10gになるまでDDWを添加する。
(B)リポソーム:リポソームは従来の手法により調合される(New,1990)。簡単に説明すると、PLと蛍光プローブをクロロホルム(Frutarom ,Israel)より中に溶解させる。続いて、R−ロータリ蒸発装置(Buchi, Germany)を使用して、溶媒を蒸発させる。そして、フラスコの内壁に残留している薄膜をDDWにより水和させる。
(C)プローブを含んでいないシステム:2gのPLを3gのエタノールに溶解させる。Heidolph digital 2000 RZR-2000により攪拌しながら、DDWをアリコートに10gになるまで添加する。
【0060】
〈細胞培養〉
Subconfluent Swissアルピノマウス線維芽細胞(3T3)を、Dulbecco社製の調整済イーグル培地(DMEM)の、カバースリップの直径3.5cmのウエルにて成長させる。前記ウエルは、共焦点レーザ顕微鏡(CLSM)用である。また、流動細胞分析用に、プラスチック製の6穴プレートが用いられる。
【0061】
〈CLSM実験〉
細胞を、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)により2度洗浄し、インキュベーター内で摂氏37度に調整した後、再度洗浄する。2mlのPBSを各ウエルに添加した後、50μlの試液を添加する(配合物I−III、対照系A−B、又はPC、RR、又はD−289を含んでいる他の配合物)。細胞を、試験製剤と共に、0、3、7、10、又は30分間培養する。培養後、培地を取り除き、前記細胞を1mlのメタノールに3分間定着させた後、PBSにより2回洗浄する。蛍光放射は、RRでは560nm以上のときに、D−289では527nmのときに、カルセインでは488nmのときに検出される。
【0062】
〈フローサイトメトリー〉
細胞を、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)により2度洗浄し、インキュベーター内で摂氏37度に調整した後、再度洗浄する。2mlのPBSを各ウエルに添加した後、50μlの試液を添加する(配合物I又は対照系C)。細胞は、試験系と共に、穏やかに攪拌しつつ、0、3、7、10、又は30分間培養する。培養後、培地を取り除き、前記細胞をトリプシン処理する(摂氏37度,2分)。細胞は、1.5mlのPBSとウシ胎仔血清(FCS)によりさらに処理した後、試験管に集められる。遠心分離(1000rpm,5分)した後、上清を取り除き、前記細胞をホルムアルデヒドに定着させる。前記細胞を、最終的に濃度が0.5x106となるように、300μlのPBS中で再懸濁させる。D−289の流動細胞分析は、4色FACSスキャン(Becton-Dickinson Immunocytometry Systems, USA)とLysysIIソフトウェアを使用して行う。各分析では、50,000〜200,000範囲の事象が集められる。D−289の蛍光は、1024チャンネルの分解度で対数尺上に集計する。蛍光強度の平均値は、LysysIIソフトウェアにより線形値として示される。
【0063】
《実験結果》
配合物IIに由来する両親媒性蛍光色素D−289の時間依存性の浸透は、CLSMにより計測される。蛍光強度により決定される最大浸透(27.5±1.2 任意のユニット)は、10分間で到達し、少なくとも20分間一定に保たれる。対照系Cの蛍光レベル(プローブを含んでいない)は、実験中は不変である。配合物Iに封入されたD−289の線維芽細胞への導入は、FACSにより評価される。プラトー・レベルを表すための、10分間の導入時間は、FACSにより測定される。最初の(t=0min)の平均蛍光強度(MFI)は22.47±11.56であり、10分後には474.60±68.24まで増加した。FACSとCLSMの両実験で、プローブの浸透が培養の3分以内に観測されたことは、注目に値するものである。
【0064】
3つの異なるプローブであるD−289、RR、及びPC(配合物I〜III及び対照系A,Bに由来する)の導入を、さらに試験した(図1参照)。適用した10分後、配合物I,II,IIIにより処理された細胞にのみ蛍光が観測され、対照系では蛍光は観測されなかった。蛍光性脂質(RR及びPC)の浸透は、それらの系の配合物は、それ自体が線維芽細胞に浸透することを示している。プローブD−289では、さらに細胞核内に蛍光が観測された。蛍光プローブが小有機陽イオンを含んでいる系から導入された場合、蛍光が観測されるレベルは、細胞核において観測される高レベルの蛍光と同様に、さらに強度である。これらの検出結果を、図2及び図3に示す。
【0065】
〈PCにより調合された配合物(図2)〉
【0066】
【表1】
【0067】
【表2】
【0068】
【表3】
【0069】
【表4】
【0070】
【表5】
【0071】
【表6】
【0072】
【表7】
【0073】
【表8】
【0074】
〈D−289により調合された配合物(図3)〉
【0075】
【表9】
【0076】
【表10】
【0077】
【表11】
【0078】
【表12】
【0079】
【表13】
【0080】
(実施例2:培養細胞の生存可能性における導入システムの効果)
《実験方法》
〈リブ/デッド 生存可能性/細胞傷害性テスト〉
細胞内エステラーゼ活性と細胞膜の保全性を、リブ/デッド 生存可能性/細胞傷害性・キット(Molecular Probes Eugene, Oregon, USA)を使用して調べる。細胞を、前述した様々な試験系にて培養する。試液は、エチジウムホモダイマー(20μl)、10mlのPBS、及び5μlのカルセイン溶液から調合される。培養の終わりには、培地を取り除き、1mlの試薬をウエルに添加する。プレートは室温にて、30分間置かれる。カバースリップを取り除き、前述したようにしてCLSMにより観察する。
【0081】
《実験結果》
この実験は、上記した蛍光プローブの浸透は、結果として、細胞の生存可能性の損失よりも、浸透を強化したかのかどうかを判断する目的で実施する。培養された細胞を、リブ/デッド 生存可能性/細胞傷害性・キットを使用して、細胞膜の保全性と生存可能性を試験する。この試験は、(a)カルセインの細胞内エステラーゼとの反応と、(b)損傷した細胞膜を通り抜けたエチジウムホモダイマーの核酸との反応とに基づいて行われる。緑色の発色は生存可能性を示し、赤色の発色は死細胞を示す。この試験の結果は、様々な製剤が適用された場合でも、処理された細胞が生存できることを明確に実証する。
【0082】
(実施例3:感受性テスト)
〈配合物IV〉
エリスロマイシン(Trima, Israel)ストックを、エタノール性溶液内に調合する。0.2gのPL(ホスホリポン90, Natterman GMBH, Germany)を、2gのエタノール(Frutarom, Israel)に溶解させる。前記エタノールに、前記薬剤の望ましい量のエタノール性原液を、最終的な濃度に達するまで添加する。そして、アリコート内に6.8gのDDWが添加されているエタノールと共に、Heidolph digital 2000 RZR-2000(Heidolph Digital, Germany)により攪拌しながら3gにする。前記調合液を、0.2μのフイルタに通すことにより消毒する。
【0083】
〈配合物V〉
エリスロマイシン(Trima, Israel)ストックを、エタノール性溶液内に調合する。0.2gのPL(ホスホリポン90, Natterman GMBH, Germany)と、0.1gのN−デシルメチルスルホキシド(Division Alameda Laboratories, Los Angles, USA)を、2gのエタノール(Frutarom, Israel)に溶解させる。望ましい量のエタノール性原液の薬剤を添加し、アリコート内に6.7gのDDWが添加されているエタノールと共に、Heidolph digital 2000 RZR-2000 (Heidolph Digital, Germany)により攪拌しながら3gにする。前記調合液を、0.2μのフイルタに通すことにより消毒する。
【0084】
〈標準液〉
滅菌水内の、様々な濃度のエリスロマイシン(1.25,7.5,10,12.5g/ml)。
【0085】
〈使用される菌株〉
枯草菌 ATCC−6633
黄色ブドウ球菌 ATCC−29213
エリスロマイシン耐性黄色ブドウ球菌(臨床株)
【0086】
各エリスロマイシン濃縮液は、リン酸緩衝生理食塩水(PBS,Biological Industries, BeitHaEmek, Israel)と共に、配合物I、配合物II、及び標準液と、1:1の容量で混合される。様々な抗生物質濃縮物を含んでいる、20μlの配合物I,II,標準液を、ペトリ板上の6mmのウエルに添加する。前記ペトリ板は微生物が接種されたトリプシンダイズ寒天(TSA)を含んでいる。調合液は、好気的に、摂氏37度にて24時間培養される。各サンプルの抑制域を測定する。
【0087】
《実験結果》
〈枯草菌 ATCC−6633〉
エリスロマイシン濃度 1.25マイクログラム/ml
【0088】
エリスロマイシン濃度 7.5マイクログラム/ml
【0089】
〈黄色ブドウ球菌 ATCC−29213〉
エリスロマイシン濃度 1.25マイクログラム/ml
【0090】
エリスロマイシン濃度 10マイクログラム/ml
【0091】
〈エリスロマイシン耐性黄色ブドウ球菌(臨床株)〉
エリスロマイシン濃度 10マイクログラム/ml
【0092】
エリスロマイシン濃度 12.5マイクログラム/ml
【0093】
(実施例4:インビボでの細胞内への遺伝子導入)
〈配合物VI〉
原液:0.2gのPLを2.5gのエタノールに溶解させ、その後、アリコート内の6.3gのDDWと共に攪拌する(Heidolph digital 2000 RZR-20000により)ことにより調合する。実験を実施する前に(15分前に)、180マイクロリットルの原液(4mgのPLを含む)を、アリコート内の、6マイクログラムのEGFP cDNAを含んでいる20マイクロリットルの水溶液に添加し、穏やかに攪拌する。最終的に、cDNAの濃度は、6マイクログラム/200マイクロリットルになる。
【0094】
〈配合物VII〉
原液:0.2gのPLを2.5gのエタノールに溶解させ、その後、攪拌しながら(Heidolph digital 2000 RZR-20000により)、6.3gのDDWをアリコート内に添加する。実験を実施する前に(15分前に)、180マイクロリットルの原液(4mgのPLを含む)を、アリコート内の、6マイクログラムのp53 cDNAを含んでいる20マイクロリットルの水溶液へ添加し、穏やかに攪拌する。最終的に、cDNAの濃度は、6マイクログラム/200マイクロリットルになる。
【0095】
〈配合物VIII〉
原液:0.2gのPLを2.5gのエタノールに溶解させ、その後、攪拌しながら(Heidolph digital 2000 RZR-20000により)、6.3gのDDWをアリコート内に添加する。実験を実施する前に(15分前に)、180マイクロリットルの原液(4mgのPLを含む)を、アリコート内の、60マイクログラムのEGFP cDNAを含んでいる20マイクロリットルの水溶液へ添加し、穏やかに攪拌する。最終的に、cDNAの濃度は、60マイクログラム/200マイクロリットルになる。
【0096】
〈配合物VIX〉
原液:0.2gのPLを2.5gのエタノールに溶解させ、その後、攪拌しながら(Heidolph digital 2000 RZR-20000により)、6.3gのDDWをアリコート内に添加する。実験を実施する前に(15分前に)、180マイクロリットルの原液を、アリコート内の、60マイクログラムのp53 cDNAを含んでいる20マイクロリットルの水溶液へ添加し、穏やかに攪拌する。最終的に、cDNAの濃度は、60マイクログラム/200マイクロリットルになる。
【0097】
〈細胞培養〉
Subconfluent Osteosarcoma South細胞を、カバースリップ上のDMEM内で成長させる(直径5cmのペトリ皿に5つづつ)。
【0098】
〈トランスフェクション方法〉
細胞をPBSにより2度洗浄し、2mlのDMEMを各プレート(5つのカバースリップを含んでいる)に添加する。100マイクロリットルの配合物VI、VII、VIII又はIVをプレートに添加し、プレートを摂氏37度にて30分間培養する。そして、2mlの20%のウシ胎仔血清(FCS)を各プレートに添加し、24時間培養を継続する。続く培養では、培地を取り除き、プレートを冷たいPBSにより2度洗浄し、4mlのメタノールを添加することにより細胞を定着させ、少なくとも1時間摂氏−20度に保つ。細胞をPBSで2度洗浄し、再水和するために、少なくとも10分間放置する。GFP発現を検出するために、カバースリップをCLS顕微鏡により観察する。次のパラメータは、実験の前に設定する。ピンホールの大きさ、獲得する電子、減光フイルタ、そしてバックグラウンドのレベル。p53発現を測定するためには、第1にp53免疫染色を(anti p53 1801+DO-1)行い、第2に抗体(antimouse Cy-3)とカバースリップをCLS顕微鏡により観察する。
【0099】
《実験結果》
この実験の結果を図4に示す。CLS顕微鏡は、培養細胞が配合物VIIから導入されたp53プラスミドにより効果的にトランスフェクトされたことを実証する。
【0100】
【表14】
【0101】
【表15】
【0102】
(実施例5:インビボでの細胞内への遺伝子導入)
〈配合物X〉
原液:0.2gのPLを3gのエタノールに溶解させ、その後、Heidolph digital 2000 RZR-20000により攪拌しながら、4.3gのDDWをアリコートに添加する。調合液を、抗菌加工の0.2μmのフイルタに通す。実験を実施する前に(15分前に)、60マイクロリットルの原液を、アリコート内の、20マイクログラムのCMV−GFP cDNAを含んでいる20マイクロリットルのDDWに添加し、穏やかに攪拌する。最終的には、cDNAの濃度を、2.5マイクログラム/10マイクロリットルにする。
【0103】
〈配合物XI〉
原液:0.2gのPLを3gのエタノールに溶解させ、その後、Heidolph digital 2000 RZR-20000により攪拌しながら、4.3gのDDWをアリコートに添加する。調合液を、抗菌加工の0.2μmのフイルタに通す。実験を実施する前に(15分前に)、60マイクロリットルの原液を、アリコート内の、40マイクログラムのCMV−GFP cDNAを含んでいる20マイクロリットルのDDWに添加し、穏やかに攪拌する。最終的には、cDNAの濃度を、5マイクログラム/10マイクロリットルにする。
【0104】
〈配合物XII〉
原液:0.2gのPLを3gのエタノールに溶解させ、その後、Heidolph digital 2000 RZR-20000により攪拌しながら、4.3gのDDWをアリコートに添加する。調合液を、抗菌加工の0.2μmのフイルタに通す。実験を実施する前に(15分前に)、60マイクロリットルの原液を、アリコート内の、200マイクログラムのCMV−GFP cDNAを含んでいる20マイクロリットルのDDWに添加し、穏やかに攪拌する。最終的には、cDNAの濃度を、25マイクログラム/10マイクロリットルにする。
【0105】
【表16】
【0106】
【表17】
【0107】
〈使用方法〉
配合物X,XI,XIIを含んでいる配合物、プロパラノロールを含んでいる配合物、又はTHPを含んでいる配合物を、20,40又は60マイクロリットル、CD−1ヌードマウス(メス、生後5週間)の背部の皮膚表面に塗る。塗られた範囲を、ヒルトップパッチにより覆う。包帯は48時間内に取り除かれる。動物は3週間後に屠殺する。処理された皮膚を取り除き、細胞内の全ての組織に遺伝子を導入した後に、GFP(緑色蛍光タンパク質)の構造を、前述のCLSMにより視覚化する。
【0108】
《実験結果》
CLS顕微鏡写真は、配合物VIIIから導入されたCMV−GFP cDNAの全ての組織(皮膚)をトランスフェクションした後の、GFPの細胞内発現を実証する(図5参照)。
【図面の簡単な説明】
【0109】
【図1】配合物I〜III及び対照系から、蛍光プローブ導入後の、線維芽細胞内での細胞内蛍光発光を表すCLSM顕微鏡写真を示す。
【0110】
A−l,A−2,A−3:配合物I〜IIIに由来する
B−1,B−2,B−3:リポソーム対照系から導入される(対照系B)
C−1,C−2,C−3:水性エタノール対照系から導入される(対照系A)
【図2】有機陽イオンを含んでいる配合物及び対照系から、蛍光PC導入後の、3T3線維芽細胞内での細胞内蛍光発光を表すCLSM顕微鏡写真を示す。対照系は、(a)はリポソーム、(b)は製剤1、(c)はプロプラノロール製剤、(c)はTHP製剤である。
【図3】有機陽イオン(THP)を含んでいる配合物及(a)、及び対照系(b:水性エタノール水溶液、c:リポソーム)からRR導入後の、3T3線維芽細胞内での細胞内蛍光発光を表すCLSM顕微鏡写真を示す。
【図4】配合物及IVを使用したp53プラスミドによる線維芽細胞内のトランスフェクション後に、二次抗体の細胞内蛍光発光を表すCLSM顕微鏡写真を示す。
【図5】配合物VIII(M2)と対照(MI)由来のCMV−GFP cDNAによる全組織のトランスフェクション後の、GFP細胞内発現を表すCLSM顕微鏡写真を示す。【Technical field】
[0001]
The present invention relates to formulations of alcoholic lipids for introducing substances into cells, and more particularly to formulations used in medicine, cosmetology, research, diagnosis, veterinary, agriculture, or pharmaceuticals. The formulation comprises a phospholipid, ethanol (or other volatile alcohol such as C2-C4), water, at least one active molecule, optionally additional glycols and / or other additives. Is introduced into cells of the incorporated, attached, adsorbed, conjugated molecule.
[Background Art]
[0002]
Cell membranes play an important role in physiological homeostasis while allowing the penetration of selected molecules while preventing the penetration of other molecules. Even when the introduction of other impermeable actives is desired, it is useful to break the permeation barrier. For pharmaceutical purposes, gene therapy, vaccination, introduction into microorganisms, or transformation of plant cells for biomedical research or agriculture, the introduction of molecules into cells has been of great interest in recent studies. ing. Conventionally, one method for overcoming this barrier to penetration is the lipid follicle method. Conventional liposomes cannot improve the permeability of impermeable molecules to cell membrane barriers, but some specially designed lipid follicles can efficiently introduce their contents into the cytoplasm. It is known that it is possible.
[0003]
Several attempts to improve intracellular transduction by the follicular method have been disclosed. One of these attempts is to increase the molecule encapsulation ability by charging lipid follicles. Liposomes containing a single cationic lipid are used to transfect cells with DNA or RNA in vitro or in vivo (Wrobel and Collins, 1995). Similarly, it is used to increase the uptake of other impermeable substances (Garrett et al., 1999). It has been reported that cationic liposomes capable of mixing lipids and cell membranes introduce complexed DNA into cells. This is mostly done by the endocytosis process (Miller et al., 1998). Polycation liposomes are known to enhance the introduction of p-galactosidase and human placental alkaline phosphatase into various cell cultures (Sells et al., 1995). Other attempts have altered the composition of lipids in follicles, for example by incorporating a steric stabilizer such as PEG (Duzgunes and Nir, 1999; Miller et al., 1998). Others have attempted to affect intracellularly encapsulated molecules, especially with pH-sensitive liposomes (Chu et al., 1990; Kono et al., 1997). It is also known that administration of a liposome together with dimethyl sulfoxide improves transduction by a certain follicular method (Jain and Gewirtz, 1998; Kawai and Nishizawa, 1984).
DISCLOSURE OF THE INVENTION
[Problems to be solved by the invention]
[0004]
EP 0 804 160 and US Pat. No. 5,716,638 disclose methods (Ethosomes) that are considered to be high-performance carriers for introducing or passing various lipophilicities into the interior of the membrane. Have been. The main route of penetration of molecules into the skin is between cells, not through cells.
[0005]
Thus, formulations that are easy to formulate, enhance cellular uptake and transport, can introduce substances into cells, glands, tissues, and others, and can be introduced into cell nuclei or other organelles Is required.
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
[0006]
The present invention relates to methods and formulations for permeating through biological membranes. The formulation is a hydro-alcoholic or aqueous / alcoholic / glycol lipid formulation and includes at least phospholipids, ethanol (or other C2-C4 volatile alcohol), and water. Also, the methods and formulations of the present invention are for facilitating the introduction of incorporated or complexed molecules through living organisms and cell membranes into cells and organelles (eg, cell nuclei).
[0007]
In another embodiment, the formulation further comprises a small organic cation molecule.
[0008]
In another embodiment, the formulation comprises a small molecular weight cation having a molecular weight of 100-600 (organic cation small molecule).
[0009]
In another embodiment, the formulation comprises a non-phospholipid organic cation small molecule.
[0010]
The formulations and methods of the present invention can be used in pharmaceutical, cosmetic, medical, veterinary, diagnostic, agricultural, and research applications.
[0011]
The advantages of the formulations and methods of the present invention are as follows. Improve cell uptake and transport. The formulation is easy to formulate. It can be introduced into cells, tissues, glands, follicles, and organs. It can be introduced into the cell nucleus (or other organelle).
[0012]
In one embodiment, the formulation comprises a phospholipid, ethanol, water, and a non-phospholipid organic amphiphilic cation. This allows penetration through the biological membrane. It also facilitates the incorporation of the incorporated or conjugated molecule through living organisms and cell membranes and into cells and organelles.
[0013]
The presence of ethanol confers a negative charge on the follicles by an amount of 10-50%. Also, the binding of cations to those formulations imparts a positive charge to the follicles.
[0014]
In another embodiment, the formulation also includes other volatile C2-C4 alcohols.
[0015]
In another embodiment, the formulation includes other C2-C4 volatile alcohols instead of ethanol.
[0016]
The formulation consists of phospholipids, 10% or more ethanol (or other C2-C4 volatile alcohol), 0-30% glycol and water.
[0017]
In another embodiment, the formulation also comprises 0-40% of a polyol.
[0018]
In another embodiment, the formulation consists of phospholipids, ethanol (EtOH), water (DDW), and propylene glycol (PG).
[0019]
In other embodiments, the formulation of the cation is a phospholipid, 10% or more ethanol (or other C2-C4 volatile alcohol), 0-30% glycol and water, non-phospholipid cationic amphiphilic Formulated by adding molecules. The non-phospholipid cationic amphiphilic molecule of the present invention is of a relatively small molecular weight (MW 100-600) that does not belong to the group of phospholipids, such as, for example, propranolol HCL (note that But not limited to this).
[0020]
In other embodiments, the formulation, whether in vitro, in vitro or in vivo, converts the substance to cells (culture), cell membranes, glands, hair follicles, hair shafts, sebaceous glands, tissues, or animals and plants. Can be used to introduce into all organs.
[0021]
The formulation penetrates through living and cell membranes. The formulation facilitates the penetration of entrapped or conjugated molecules through biological and cellular membranes.
[0022]
Also, the formulation of the present invention comprises phosphatidylcholine (PC), hydrogenated PC, phosphatidic acid (PA), phosphatidylserine (PS), phosphatidylethanolamine (PE), phosphatidylglycerol (PPG), phosphatidylinositol (PI) , Different phospholipids, such as, but not limited to, phospholipid cations, ceramides, and other lipids. In addition, the formulation may include other additives such as cholesterol and surfactants.
[0023]
Phospholipids are known for their widespread use in liposome systems, as well as emulsifiers in the formulation of emulsions. All these systems used for pharmaceutical or cosmetic purposes are aqueous systems. The system contains some alcohol and / or glycol for storage and / or texture enhancement of the formulation.
[0024]
Eggs, soybeans, semi-synthetic products, and synthetic products can be used as the phospholipid raw material.
[0025]
The concentration of the alcohol (e.g. EtOH) in the final product ranges from 15 to 50%. The concentration in the non-aqueous phase (combination of alcohol and glycol) is in the range of 12 to 70%. Also, the balance of the carrier contains water and possible additives.
[0026]
The formulation can effectively introduce the molecule into the cell.
[0027]
Molecules that can be introduced by the formulations of the present invention include antibacterials, anthelmintics, insecticides, therapeutics, chemotherapeutics, biologicals, diagnostics, peptide antibiotics, anti-acne agents, Mitotic substances, antimitotic substances, steroids, anti-hirsutism agents, hair growth agents, vitamins, antibiotics, antifungal agents, antiviral drugs, nucleic acids (DNA, RNA, plasmids), proteins / peptides / amino acids, lipids , Sugars, glycoproteins, glycolipids, antisense oligonucleotides (ODNs), polyanionic polymers and their derivatives, nucleic acids, ON's, DNA and RNA oligonucleotides, naked ODNs, vitamins, antibiotics And various polymers (but not limited to these).
[0028]
As shown in FIGS. 1-4, the formulations of the present invention can effectively introduce molecules into the cytoplasm through cell membranes.
[0029]
The formulation can effectively introduce molecules into cell nuclei and / or other organelles (described below in Example 1).
[0030]
The formulations can effectively introduce molecules into microorganisms, bacteria, pathogens and the like.
[0031]
The formulation can be administered IP, IM, SC, IV, intratumoral, or intradermal.
[0032]
The form of the composition can be solid, spray, patch, or semi-liquid.
[0033]
In another embodiment, the formulation is administered by iontophoresis, phonophoresis, microporation, microneedle, electroporation, jet, or laser.
[0034]
In another embodiment, the formulation is added to the culture in an amount of 10-200 μl / well. The volume of the well is 1-2 ml. A similar ratio is maintained for different well sizes.
[0035]
The formulations of the present invention can be administered to any part of a plant. For example, it is administered to leaves, roots, hulls, stems, earths, flowers, and buds.
[0036]
When used in gene therapy, the formulations of the present invention include a non-phospholipid organic cation. This allows the DNA to be introduced into the selected eukaryotic cell. Methods for stabilizing the expression and transformation of DNA integrated into the genome of transfected cells are known. Representative methods for liposome-mediated transfection are described in Ausebel et al., Current Protocols in Molecular Biology,
[0037]
The nucleic acid formulations of the present invention, whether nuclear RNA, mRNA, cDNA, genomic DNA, plasmid DNA, or a hybrid of various combinations, can be prepared from biological sources (including recombinantly engineered forms) or synthetic in vitro. Isolated. The nucleic acids of the invention are present in transformed or transfected whole cells, transformed or transfected whole cells, cell lysates, or partially purified or sufficiently pure. . When complexing with a lipid, generally sufficient nucleic acid is used.
[0038]
The nucleic acids used for encapsulation in the conjugates of the invention can be used for cancer-related treatments. For example, a nucleic acid that suppresses the expression of an oncogene, such as HER-2 / neu (for example, the tumor suppressor E1A from adenovirus 5), or a nucleic acid that controls cell growth or differentiation, is used in the lipid: nucleic acid complex of the present invention. Preferred component. For example, cytokines, inflammatory molecules, growth factors, telomerase, growth factor receptors, oncogene products, interleukins, interferons, alpha-FGF, IGF-I, IGF-II, beta-FGF, PDGF, TNF, TGF-alpha Compatible with nucleic acids encoding signal, TGF-beta, KGF, SCF / c-Kit ligand, CD40L / CD40, VLA-4 / VCAM-1, ICAM-1 / LFA-1, and hyalurinCD44, signal transfection molecules Oncogene products (eg, Mos, Ras, Raf, and Met), transcriptional activators and suppressors (eg, p53, p21, Tat, steroid hormone receptors (such as estrogen, progesterone, testosterone, and corticosterone) Is known, preferred and widely available. Also preferred are nucleic acids that encode blocking factors for such molecules, such as antisense RNAs and ribozymes that recognize and suppress the translation of any of the above mRNAs. Ultimately, nucleic acids encoding suicide genes that cause apoptosis or other forms of cell death are preferred. In particular, the suicide gene most active in rapidly dividing cells (eg, cancer cells), herpes simplex virus thymidine kinase in combination with ganciclovir, E1A cell products from adenovirus, or various other viral genes are preferred. Negative markers that do not activate until the reaction is added are also suitable. Decoy nucleic acids encoding molecules that bind to cell growth regulators are suitable for certain applications. Nucleic acids encoding transdominant molecules are likewise suitable for some applications.
[0039]
The formulations of the present invention can also be used to introduce nucleic acids, such as, for example, the introduction of plasmid DNA into protoplasts of prokaryotic cells by conventional techniques.
[0040]
The formulations of the present invention can be used to introduce nucleic acids into protoplasts of plant cells. Bubble of phospholipids is used to introduce the liposome contents into plant cells (eg, tobacco protoplasts). Tobacco mosaic virus (TMV), RNA, is encapsulated in liposome preparations using a reverse deposition method developed by Szoka and Papahadjopoulos. See PNAS USA 75: 4194-4198 (1978). Studies have been reported that contrast various plant species (flowers and vegetables), such as tomatoes, lilies, licorice, onions, peas, and petunias. Title `` In vitro Plant Transformation Systems Using Liposomes and Bacterial Co-Cultivation, '' Genetic Engineering of Plants, Ed. (1983) and other topics. Similarly, suitable modifications of the formulations of the present invention for the purposes of those skilled in the art are used to transform plants.
[0041]
Formulations of the present invention that include an active agent such as a DNA plasmid are suitable for direct injection into a patient's tumor disease. Such a formulation can be applied to an aerosol into the respiratory tract, such as the trachea, nose, or other body cavity of a patient with cystic fibrosis. Similarly, such formulations are used for peritoneal injection into patients with ovarian cancer that has metastasized to the peritoneal cavity. There is great interest in the treatment of Alzheimer's disease for transfection and direct injection of brain cells to cause expression of therapeutic copies of defective target genes. The formulations of the present invention are also believed to be useful in gene therapy for muscular dystrophy, hemophilia B, and several other diseases caused by defective genes. Said formulation comprises one or more cationic molecules of the invention. This does not preclude the use of other cationic molecules. Providing the formulation is sufficiently stable and effective for transfection of cells. Those of skill in the art having knowledge of the properties of the cationic molecules of the present invention (and other lipids) will be able to readily formulate formulations that are optimal for transfection of specialized cells. .
[0042]
In another embodiment, the formulation is generally mixed with a polyanionic compound (including nucleic acids) for introduction into cells. The complex is formed by the charged interaction between the cationic compound and the negatively charged polyanionic compound. Polyanions for particular applications include, for example, nucleic acids of DNA, RNA, or compounds thereof. Neutral lipids are optionally added to the complex.
[0043]
In another embodiment, the present invention provides a method of introducing a substance into a cell by administering a formulation of the present invention.
[0044]
In another embodiment, the invention provides a method for introducing a nucleic acid sequence into a cell nucleus by administering a formulation of the invention.
[0045]
To facilitate a further understanding of the present invention, the following examples are set forth primarily for the purpose of a detailed description of the invention.
【Example】
[0046]
(Example 1: Introduction of fluorescent probe into cells)
"experimental method"
<material>
Rhodamine red dihexadecanoyl glycerophosphoethanolamine (RR), 4- (4-diethylamino) styryl-N-methylpyridinium iodode (D-289), calcein, and rib / dead Viability / cell injury Sex Kit (purchased from Molecular Probes Eugene, Oregon, USA).
[0047]
Fluorescent phosphatidylcholine [l-palmitoyl-2- [12-7-nitro-2-1,3-benzoxadiazyl 1-4ylamino [dodecanyl] sn-glycero-3]]-phosphatidylcholine (AvantiPolar Lipids, USA) Purchase).
[0048]
Phospholipon 90 (purchased from Natterman GMBH, Germany).
[0049]
Ethanol (purchased from Frutarom, Israel).
[0050]
Adjusted minimum essential culture solution (DMEM) manufactured by Dulbecco, phosphate buffered saline (PBS) manufactured by Dulbecco (purchased from Biological Industries, Beit HaEmek, Israel).
[0051]
All other materials were provided of analytical quality.
[0052]
<Formulation of compound>
Phospholipon 90 (PL) and probe (0.03% w / w) are dissolved in ethanol. In experiments where a small cationic molecule (such as propranolol HCl or trihexyphenidyl HCl (THP)) is added, the compound is also dissolved in the ethanol phase. Water is added to the aliquot (to the desired concentration) with stirring by Heidolph digital 2000 RZR-2000 (Heidolph Digital, Germany). The liposomes are prepared by conventional synthetic techniques. Briefly, PL and a fluorescent probe are dissolved in chloroform. Subsequently, the solvent is evaporated using an R-rotary evaporator (Buchi, Germany). Then, the thin film remaining on the inner wall of the flask is hydrated.
[0053]
The following abbreviations have been used herein.
[0054]
PC: phosphatidylcholine [l-palmitoyl-2- [12-7-nitro-2-1,3-benzoxadiazyl 1-4ylamino [dodecanyl] sn-glycero-3]]-phosphatidylcholine
PL: Phospholipon 90 (egg phosphatidylcholine)
RR: Rhodamine, red, dihexadecanoyl glycerophosphoethanolamine
D-289: 4- (4-Diethylamino) styryl-N-methylpyridinium iodode
DDW: Double distilled water
EtOH: ethanol
THP: trihexyphenidyl (HCl or at a pH when the molecule is ionized)
Propranolol: (HCl or at a pH when the molecule is ionized)
[0055]
<Formulation I>
Dissolve 2 g of PL and 0.03 g of D-289 in 3 g of ethanol.
[0056]
While stirring with Heidolph digital 2000 RZR-2000, add DDW to the aliquot until 10 g.
[0057]
<Formulation II>
Use a PC instead of D-289. The method is the same as for Formulation I.
[0058]
<Formulation III>
Use RR instead of D-289. The procedure is the same as for Formulation I.
[0059]
<Control system>
(A) Aqueous ethanol solution of probe: 0.03 g of probe (RR or D-289 or calcein) is dissolved in 3 g of ethanol, and DDW is added until the amount becomes 10 g.
(B) Liposomes: Liposomes are prepared by conventional techniques (New, 1990). Briefly, PL and a fluorescent probe are dissolved in chloroform (Frutarom, Israel). Subsequently, the solvent is evaporated using an R-rotary evaporator (Buchi, Germany). Then, the thin film remaining on the inner wall of the flask is hydrated by DDW.
(C) Probe-free system: 2 g of PL is dissolved in 3 g of ethanol. While stirring with Heidolph digital 2000 RZR-2000, add DDW to the aliquot until 10 g.
[0060]
<Cell culture>
Subconfluent Swiss Alpino mouse fibroblasts (3T3) are grown in Dulbecco's conditioned Eagle's medium (DMEM) in 3.5 cm diameter coverslip wells. The wells are for a confocal laser microscope (CLSM). A 6-well plastic plate is used for flow cell analysis.
[0061]
<CLSM experiment>
The cells are washed twice with phosphate buffered saline (PBS), adjusted to 37 degrees Celsius in an incubator and then washed again. After adding 2 ml of PBS to each well, 50 μl of reagent is added (Formulations I-III, control AB, or other formulations containing PC, RR, or D-289). The cells are cultured with the test formulation for 0, 3, 7, 10, or 30 minutes. After the culture, the medium is removed, the cells are fixed in 1 ml of methanol for 3 minutes, and then washed twice with PBS. Fluorescence emission is detected at RR above 560 nm for RR, at 527 nm for D-289, and at 488 nm for calcein.
[0062]
<Flow cytometry>
The cells are washed twice with phosphate buffered saline (PBS), adjusted to 37 degrees Celsius in an incubator and then washed again. After adding 2 ml of PBS to each well, add 50 μl of reagent (Formulation I or control system C). Cells are incubated with the test system for 0, 3, 7, 10, or 30 minutes with gentle agitation. After the culture, the medium is removed, and the cells are treated with trypsin (37 ° C., 2 minutes). Cells are collected in test tubes after further treatment with 1.5 ml PBS and fetal calf serum (FCS). After centrifugation (1000 rpm, 5 minutes), the supernatant is removed, and the cells are fixed on formaldehyde. The cells are finally brought to a concentration of 0.5 × 10 6 Resuspend in 300 μl PBS so that Flow cell analysis of D-289 is performed using a 4-color FACS scan (Becton-Dickinson Immunocytometry Systems, USA) and LysysII software. In each analysis, a range of 50,000 to 200,000 events is collected. The fluorescence of D-289 is tabulated on a logarithmic scale with a resolution of 1024 channels. The average value of the fluorescence intensity is shown as a linear value by LysysII software.
[0063]
"Experimental result"
The time-dependent penetration of the amphiphilic fluorescent dye D-289 from Formulation II is measured by CLSM. The maximum penetration determined by the fluorescence intensity (27.5 ± 1.2 arbitrary units) is reached in 10 minutes and kept constant for at least 20 minutes. The fluorescence level of control system C (without probe) is unchanged during the experiment. The introduction of D-289 encapsulated in Formulation I into fibroblasts is assessed by FACS. An introduction time of 10 minutes to represent the plateau level is measured by FACS. The average fluorescence intensity (MFI) at the first (t = 0 min) was 22.47 ± 11.56, and increased to 474.60 ± 68.24 after 10 minutes. It is noteworthy that in both FACS and CLSM experiments probe penetration was observed within 3 minutes of culture.
[0064]
The introduction of three different probes, D-289, RR, and PC (from formulations I-III and control systems A, B) was further tested (see FIG. 1). Ten minutes after application, fluorescence was observed only in cells treated with Formulations I, II, III, and no fluorescence was observed in the control system. Penetration of fluorescent lipids (RR and PC) indicates that formulations of those systems permeate fibroblasts themselves. With the probe D-289, fluorescence was further observed in the cell nucleus. When the fluorescent probe is introduced from a system containing small organic cations, the level at which fluorescence is observed is more intense, as is the high level of fluorescence observed in cell nuclei. These detection results are shown in FIGS.
[0065]
<Compound prepared by PC (Fig. 2)>
[0066]
[Table 1]
[0067]
[Table 2]
[0068]
[Table 3]
[0069]
[Table 4]
[0070]
[Table 5]
[0071]
[Table 6]
[0072]
[Table 7]
[0073]
[Table 8]
[0074]
<Formulation prepared according to D-289 (FIG. 3)>
[0075]
[Table 9]
[0076]
[Table 10]
[0077]
[Table 11]
[0078]
[Table 12]
[0079]
[Table 13]
[0080]
(Example 2: Effect of introduction system on viability of cultured cells)
"experimental method"
<Rib / dead viability / cytotoxicity test>
Intracellular esterase activity and cell membrane integrity are examined using the Rib / Dead Viability / Cytotoxicity kit (Molecular Probes Eugene, Oregon, USA). The cells are cultured in the various test systems described above. Reagents are prepared from ethidium homodimer (20 μl), 10 ml PBS, and 5 μl calcein solution. At the end of the culture, the medium is removed and 1 ml of reagent is added to the well. Plates are placed at room temperature for 30 minutes. Remove the coverslip and observe by CLSM as described above.
[0081]
"Experimental result"
This experiment is performed to determine whether the penetration of the fluorescent probe described above resulted in enhanced penetration rather than loss of cell viability. Cultured cells are tested for cell membrane integrity and viability using the rib / dead viability / cytotoxicity kit. This test is based on (a) the reaction of calcein with intracellular esterase and (b) the reaction of ethidium homodimer with nucleic acid that has passed through damaged cell membranes. A green color indicates viability and a red color indicates dead cells. The results of this test clearly demonstrate that the treated cells can survive even when various formulations are applied.
[0082]
(Example 3: Sensitivity test)
<Formulation IV>
Erythromycin (Trima, Israel) stock is formulated in ethanolic solution. Dissolve 0.2 g PL (Phospholipon 90, Natterman GMBH, Germany) in 2 g ethanol (Frutarom, Israel). To the ethanol is added a desired amount of an ethanolic stock solution of the drug until a final concentration is reached. Then, together with ethanol to which 6.8 g of DDW is added in an aliquot, the mixture is made up to 3 g with stirring by Heidolph digital 2000 RZR-2000 (Heidolph Digital, Germany). The preparation is disinfected by passing it through a 0.2μ filter.
[0083]
<Formulation V>
Erythromycin (Trima, Israel) stock is formulated in ethanolic solution. Dissolve 0.2 g PL (Phospholipon 90, Natterman GMBH, Germany) and 0.1 g N-decylmethylsulfoxide (Division Alameda Laboratories, Los Angles, USA) in 2 g ethanol (Frutarom, Israel). The desired amount of the drug in ethanolic stock solution is added and brought to 3 g with Heidolph digital 2000 RZR-2000 (Heidolph Digital, Germany) with ethanol having 6.7 g DDW added in aliquot. The preparation is disinfected by passing it through a 0.2μ filter.
[0084]
<Standard solution>
Various concentrations of erythromycin (1.25, 7.5, 10, 12.5 g / ml) in sterile water.
[0085]
<Strain used>
Bacillus subtilis ATCC-6633
Staphylococcus aureus ATCC-29213
Erythromycin resistant Staphylococcus aureus (clinical strain)
[0086]
Each erythromycin concentrate is mixed with Formulation I, Formulation II, and standards in a 1: 1 volume with phosphate buffered saline (PBS, Biological Industries, BeitHaEmek, Israel). 20 μl of Formulations I, II, standards containing various antibiotic concentrates are added to 6 mm wells on a Petri plate. The Petri plate contains trypsin soy agar (TSA) inoculated with microorganisms. The preparation is incubated aerobically at 37 degrees Celsius for 24 hours. Measure the inhibition zone of each sample.
[0087]
"Experimental result"
<Bacillus subtilis ATCC-6633>
Erythromycin concentration 1.25 microgram / ml
[0088]
Erythromycin concentration 7.5 microgram / ml
[0089]
<Staphylococcus aureus ATCC-29213>
Erythromycin concentration 1.25 microgram / ml
[0090]
Erythromycin concentration 10 microgram / ml
[0091]
<Erythromycin-resistant Staphylococcus aureus (clinical strain)>
Erythromycin concentration 10 microgram / ml
[0092]
Erythromycin concentration 12.5 microgram / ml
[0093]
(Example 4: Gene transfer into cells in vivo)
<Formulation VI>
Stock solution: Formulated by dissolving 0.2 g of PL in 2.5 g of ethanol and then stirring (with Heidolph digital 2000 RZR-20000) with 6.3 g of DDW in aliquots. Before performing the experiment (15 minutes before), add 180 microliters of the stock solution (containing 4 mg of PL) to a 20 microliter aqueous solution containing 6 micrograms of EGFP cDNA in an aliquot; Stir gently. Eventually, the concentration of cDNA will be 6 micrograms / 200 microliters.
[0094]
<Formulation VII>
Stock solution: Dissolve 0.2 g PL in 2.5 g ethanol, then add 6.3 g DDW into aliquot with stirring (by Heidolph digital 2000 RZR-20000). Before performing the experiment (15 minutes before), add 180 microliters of the stock solution (containing 4 mg of PL) to a 20 microliter aqueous solution containing 6 micrograms of p53 cDNA in an aliquot; Stir gently. Eventually, the concentration of cDNA will be 6 micrograms / 200 microliters.
[0095]
<Formulation VIII>
Stock solution: Dissolve 0.2 g PL in 2.5 g ethanol, then add 6.3 g DDW into aliquot with stirring (by Heidolph digital 2000 RZR-20000). Before performing the experiment (15 minutes before), add 180 microliters of the stock solution (containing 4 mg of PL) to a 20 microliter aqueous solution containing 60 micrograms of EGFP cDNA in an aliquot; Stir gently. Eventually, the concentration of the cDNA will be 60 micrograms / 200 microliters.
[0096]
<Compound VIX>
Stock solution: Dissolve 0.2 g PL in 2.5 g ethanol, then add 6.3 g DDW into aliquot with stirring (by Heidolph digital 2000 RZR-20000). Before performing the experiment (15 minutes prior), add 180 microliters of the stock solution to a 20 microliter aqueous solution containing 60 micrograms of p53 cDNA in an aliquot and gently agitate. Eventually, the concentration of the cDNA will be 60 micrograms / 200 microliters.
[0097]
<Cell culture>
Subconfluent Osteosarcoma South cells are grown in DMEM on coverslips (5 each in a 5 cm diameter petri dish).
[0098]
<Transfection method>
The cells are washed twice with PBS and 2 ml of DMEM is added to each plate (containing 5 coverslips). Add 100 microliters of Formula VI, VII, VIII or IV to the plate and incubate the plate at 37 degrees Celsius for 30 minutes. Then, 2 ml of 20% fetal calf serum (FCS) is added to each plate, and the culture is continued for 24 hours. For subsequent cultures, the medium is removed, the plates are washed twice with cold PBS, and the cells are allowed to settle by adding 4 ml of methanol and kept at -20 degrees Celsius for at least 1 hour. The cells are washed twice with PBS and left for at least 10 minutes to rehydrate. Coverslips are observed with a CLS microscope to detect GFP expression. The following parameters are set before the experiment. Pinhole size, electron gain, dimming filter, and background level. In order to measure p53 expression, first, p53 immunostaining is performed (anti p53 1801 + DO-1), and second, the antibody (antimouse Cy-3) and the coverslip are observed with a CLS microscope.
[0099]
"Experimental result"
The result of this experiment is shown in FIG. CLS microscopy demonstrates that the cultured cells were effectively transfected with the p53 plasmid introduced from Formula VII.
[0100]
[Table 14]
[0101]
[Table 15]
[0102]
(Example 5: Gene transfer into cells in vivo)
<Formulation X>
Stock solution: Dissolve 0.2 g PL in 3 g ethanol, then add 4.3 g DDW to aliquot while stirring with Heidolph digital 2000 RZR-20000. The preparation is passed through a 0.2 μm filter with antimicrobial treatment. Before performing the experiment (15 minutes before), add 60 microliters of the stock solution to 20 microliters of DDW containing 20 micrograms of CMV-GFP cDNA in an aliquot and gently agitate. Ultimately, the concentration of cDNA is 2.5 micrograms / 10 microliters.
[0103]
<Formulation XI>
Stock solution: Dissolve 0.2 g PL in 3 g ethanol, then add 4.3 g DDW to aliquot while stirring with Heidolph digital 2000 RZR-20000. The preparation is passed through a 0.2 μm filter with antimicrobial treatment. Before performing the experiment (15 minutes prior), add 60 microliters of the stock solution to 20 microliters of DDW containing 40 micrograms of CMV-GFP cDNA in an aliquot and gently agitate. Eventually, the concentration of cDNA will be 5 micrograms / 10 microliters.
[0104]
<Formulation XII>
Stock solution: Dissolve 0.2 g PL in 3 g ethanol, then add 4.3 g DDW to aliquot while stirring with Heidolph digital 2000 RZR-20000. The preparation is passed through a 0.2 μm filter with antimicrobial treatment. Before performing the experiment (15 minutes before), add 60 microliters of the stock solution to 20 microliters of DDW containing 200 micrograms of CMV-GFP cDNA in aliquots and gently agitate. Ultimately, the concentration of cDNA is 25 micrograms / 10 microliters.
[0105]
[Table 16]
[0106]
[Table 17]
[0107]
<how to use>
A formulation containing Formulations X, XI, XII, a formulation containing Proparanolol, or a formulation containing THP was administered to 20, 40 or 60 microliters of CD-1 nude mice (female, (5 weeks after birth) on the back skin surface. Cover the painted area with a hilltop patch. The bandage is removed within 48 hours. Animals are sacrificed after 3 weeks. After removing the treated skin and introducing the gene into all intracellular tissues, the structure of GFP (green fluorescent protein) is visualized by CLSM as described above.
[0108]
"Experimental result"
CLS micrographs demonstrate intracellular expression of GFP after transfection of all tissues (skin) of CMV-GFP cDNA introduced from formulation VIII (see FIG. 5).
[Brief description of the drawings]
[0109]
FIG. 1 shows CLSM micrographs showing intracellular fluorescence emission in fibroblasts after introduction of a fluorescent probe from Formulations I-III and a control system.
[0110]
A-1, A-2, A-3: Derived from Formulations I-III
B-1, B-2, B-3: introduced from a liposome control system (control system B)
C-1, C-2, C-3: introduced from aqueous ethanol control system (control system A)
FIG. 2 shows CLSM micrographs showing intracellular fluorescence emission in 3T3 fibroblasts after introduction of fluorescent PC from formulations containing organic cations and control systems. In the control system, (a) is a liposome, (b) is
FIG. 3: Intracellular in 3T3 fibroblasts after introduction of RR from formulation containing organic cations (THP) and (a) and control system (b: aqueous ethanol solution, c: liposome) 3 shows a CLSM micrograph showing fluorescence emission.
FIG. 4 shows CLSM micrographs showing intracellular fluorescence of secondary antibodies after transfection of fibroblasts with p53 plasmid using formulation and IV.
FIG. 5 shows CLSM micrographs showing GFP intracellular expression after transfection of whole tissue with CMV-GFP cDNA from formulation VIII (M2) and control (MI).
Claims (19)
0.5〜l0%(w/w)のリン脂質、10〜50%(w/w)のエタノール又は他のC2−C4揮発性アルコール、及び水を含むことを特徴とする配合物。A composition for introducing a substance into cells,
A formulation comprising 0.5 to 10% (w / w) phospholipids, 10 to 50% (w / w) ethanol or other C2-C4 volatile alcohol, and water.
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