JP2002521423A - Lipid emulsions and solid lipid microparticles as gene or drug carriers - Google Patents
Lipid emulsions and solid lipid microparticles as gene or drug carriersInfo
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Abstract
(57)【要約】 本発明は、遺伝子形質感染剤及び薬物伝達系において使用されることができる非トリグリセリド系水中油型脂質エマルジョン、及び非トリグリセリド又はエチルステアレート系固形脂質微粒子、並びにこれらの製造方法に関する。また、本発明は、前記脂質エマルジョン及び固形脂質微粒子を使用して、遺伝子又は薬物を効果的に伝達する方法に関する。また、本発明は、基剤の油としてスクアレン又はスクアランを使用して、脂溶性又は両親媒性薬物を含有する脂質エマルジョンを製造する方法に関する。さらに、本発明は、基剤の脂肪としてエチルステアレートを使用して、脂溶性又は両親媒性薬物を含有する固形脂質微粒子を製造する方法に関する。 (57) Abstract: The present invention provides a non-triglyceride-based oil-in-water lipid emulsion which can be used in a gene transfectant and a drug delivery system, and non-triglyceride or ethyl stearate-based solid lipid fine particles, and production thereof. About the method. The present invention also relates to a method for effectively transferring a gene or a drug using the lipid emulsion and the solid lipid fine particles. The present invention also relates to a method for producing a lipid emulsion containing a fat-soluble or amphiphilic drug using squalene or squalane as a base oil. Furthermore, the present invention relates to a method for producing solid lipid microparticles containing a fat-soluble or amphiphilic drug using ethyl stearate as a base fat.
Description
【０００１】 本発明は、発明の詳細な説明及び添付の図面からより自明になるが、本発明が
これのみに限定されるものではない。The present invention will become more apparent from the detailed description of the invention and the accompanying drawings, but the invention is not limited thereto.
【０００２】 本発明は、水中油型脂質エマルジョン及びエマルジョンと遺伝子との複合体、
並びに生体に適合し且つ生分解性の脂肪及び油を使用して疎水性又は両親媒性薬
物を含有させたエマルジョンに関する。また、本発明は、水中油型脂質エマルジ
ョン及びエマルジョンと遺伝子との複合体、並びに生体に適合し且つ生分解性の
脂肪及び油を使用して疎水性又は両親媒性薬物を含有させたエマルジョンを製造
する方法に関する。 さらに、本発明は、上記脂質エマルジョンを使用して細胞内に遺伝子を効果的
に伝達（デリバリ；delivery）する方法に関する。The present invention relates to an oil-in-water lipid emulsion and a complex of the emulsion and a gene,
And an emulsion containing a hydrophobic or amphiphilic drug using biocompatible fats and oils. The present invention also provides an oil-in-water type lipid emulsion and a complex of the emulsion and a gene, and an emulsion containing a hydrophobic or amphiphilic drug using biocompatible and biodegradable fats and oils. It relates to a method of manufacturing. Furthermore, the present invention relates to a method for effectively delivering a gene into a cell using the lipid emulsion.
【０００３】 本発明の目的は、生体に適合する物質から成る水中油型脂質エマルジョン及び
固形脂質微粒子を製造する方法を提供するものである。 本発明の他の目的は、生理活性物質と非トリグリセリド系の油から成る脂質エ
マルジョンとの複合体、及び生理活性物質とトリグリセリド系及びエチルステア
レイトから成る群から選らばれた脂肪から成る固形脂質微粒子との複合体、並び
にこれらの製造方法を提供するものである。 本発明の他の目的は、薬物を含有するスクアレン又はスクアランから成る脂質
エマルジョン、又は薬物を含有するエチルステアレート固形脂質微粒子及びこれ
らの製造方法を提供するものである。An object of the present invention is to provide a method for producing an oil-in-water lipid emulsion and a solid lipid fine particle comprising a substance compatible with a living body. Another object of the present invention is to provide a complex of a physiologically active substance and a lipid emulsion comprising a non-triglyceride type oil, and solid lipid fine particles comprising a physiologically active substance and a fat selected from the group consisting of triglyceride type and ethyl stearate. And a production method thereof. Another object of the present invention is to provide a lipid emulsion comprising squalene or squalane containing a drug, or ethyl stearate solid lipid fine particles containing a drug, and a method for producing these.
【０００４】 また、本発明は、脂質エマルジョンを使用して細胞内に遺伝子及び薬物を効果
的に伝達する方法に関する。[0004] The present invention also relates to a method for effectively transferring genes and drugs into cells using a lipid emulsion.
【０００５】 リポソームとエマルジョンは、公知の非ウイルス性遺伝子運搬体として知られ
ている物質である。リポソームを使用した遺伝子治療は臨床試験中である。去る
数年間リポソーム媒介遺伝子伝達について多く報告されている。[0005] Liposomes and emulsions are substances known as known non-viral gene carriers. Gene therapy using liposomes is in clinical trials. There have been many reports of liposome-mediated gene transfer in the last few years.
【０００６】 最近開発されたトリグリセリド系脂質エマルジョンは、複合体を形成して、血
清の存在下でも物理的安定性が維持され、遺伝子を伝達することが出来る。とこ
ろが、このようなトリグリセリド系エマルジョンは、1-パルミトイル-2-オレオ
イル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N[-ポリ（エチレングリコール）2
000]（PEG2000PE）のような高分子性脂質がない場合は、物理的安定性が低く、
遺伝子を伝達する能力が減少する。エマルジョンの物理的安定性を提供すること
の出来る高分子性脂質としては、脂質のヘッド基にポリエチレングリコール部分
を有するSpan、Tween及びBrij系脂質を含む。ところが、このような高分子性脂
質は、高分子部分が立体障害を提供するため、脂質エマルジョンと遺伝子の間の
結合を妨げることが出来る。従って、高分子性脂質を含有する陽イオン性脂質エ
マルジョンは、3〜4倍の過量の陽電荷が存在する時、DNAと複合体を形成するこ
とが出来る。A recently developed triglyceride-based lipid emulsion forms a complex, maintains physical stability even in the presence of serum, and can transfer genes. However, such a triglyceride-based emulsion comprises 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N [-poly (ethylene glycol) 2
000] (PEG 2000 PE), the absence of high molecular weight lipids results in poor physical stability,
The ability to transfer genes is reduced. Polymeric lipids that can provide the physical stability of the emulsion include Span, Tween, and Brij based lipids that have a polyethylene glycol moiety on the lipid head group. However, such a high molecular lipid can prevent the binding between the lipid emulsion and the gene because the high molecular part provides steric hindrance. Thus, cationic lipid emulsions containing polymeric lipids can form complexes with DNA when there is a 3- to 4-fold excess of positive charge.
【０００７】 このような問題を克服するため、本発明の目的は、高分子性脂質無しに、又は
最少量の高分子性脂質をもって安定した脂質エマルジョンを製造することにある
。[0007] In order to overcome these problems, it is an object of the present invention to produce a stable lipid emulsion without or with a minimal amount of polymeric lipid.
【０００８】 従って、本発明者らは、毒性が低くて生体に適合すると知られている種々の油
を使用した。脂質エマルジョンのうち、卵ホスファチジルルコリン(PC)を乳化剤
として使用した時、水に対して高い界面張力を有する油が、低い界面張力を有す
る油に比べてより安定したエマルジョンを形成することを発見した。 また、エマルジョン安定性と油/水(o/w)の界面張力との相関関係が体系的に研
究されていないことを発見した。[0008] Accordingly, the present inventors have used various oils which are known to be low in toxicity and biocompatible. Among the lipid emulsions, we found that when using egg phosphatidyl rucholine (PC) as an emulsifier, oils with a high interfacial tension with water form more stable emulsions than oils with a low interfacial tension. . We also found that the correlation between emulsion stability and oil / water (o / w) interfacial tension has not been systematically studied.
【０００９】 o/wの界面張力が低い油が、より安定したエマルジョンを形成することが出来
ると推測していただけでる。従って、本発明者らは、エマルジョン安定性と油の
物理的特性との相関関係の原因を提供するため、科学的根拠を付与しようと努力
した。It can only be speculated that oils with low o / w interfacial tension can form more stable emulsions. Accordingly, we sought to provide a scientific basis to provide a source for a correlation between emulsion stability and the physical properties of the oil.
【００１０】 本発明の科学的根拠を付与するための予備実験： 脂質エマルジョンは、一般的に乳化剤を使用して水に油を分散させることによ
って製造される。エマルジョンを安定化させるための原動力を調べるために、多
くの理論的な作業が行われてきた。脂質エマルジョンを安定化させるための因子
を研究したところ、本発明者らは、脂溶性のような種々の物理的特性を有する油
の影響及びエマルジョンの安定性に対する研究が足りないことを発見した。Preliminary Experiments to Give Scientific Basis of the Invention: Lipid emulsions are generally prepared by dispersing oil in water using emulsifiers. Much theoretical work has been done to determine the driving forces for stabilizing emulsions. Investigating factors to stabilize lipid emulsions, the present inventors have found that there is insufficient research on the effects of oils having various physical properties such as lipophilicity and emulsion stability.
【００１１】 油の脂溶性が水中油型脂質エマルジョンの安定性をどのように変化させるかに
ついて調べるために、種々の油を選定して、乳化剤として卵ホスファチジルコリ
ン(egg PC）を使用してエマルジョンを形成した。10%(v/v)油及び1.2%(w/v)egg
PCを含有する脂質エマルジョンは、(1)水にegg PCを超音波処理してリポソーム
溶液を製造した後、(2)このリポソーム溶液に油を付加し、この混合物を2分間3
回にかけて(総6分)超音波処理して得られた。エマルジョンにおいて、粒子のサ
イズは光子相関分光器(photon correlation spectroscopy)で測定した。あまに
油で製造されたエマルジョンが一番大きいエマルジョン粒子サイズを有する反面
、スクアレン及びホホバビン油(jojoba bean oil)で形成されたエマルジョンは
、一番小さい粒子サイズを有する。エマルジョンの粒子サイズと油のo/w界面張
力との相関関係を図1に示す。この結果は、一番大きいo/w界面張力を有する油が
、一番小さい粒子サイズを有するエマルジョンを形成することを示す。油は、ス
クアレンを除いて主にトリグリセリド系と脂肪酸／アルコールエステル類との混
合物である。To examine how the oil solubility of an oil changes the stability of an oil-in-water lipid emulsion, various oils were selected and the emulsion was prepared using egg phosphatidylcholine (egg PC) as an emulsifier. Formed. 10% (v / v) oil and 1.2% (w / v) egg
The lipid emulsion containing PC is prepared by (1) sonicating egg PC in water to produce a liposome solution, and (2) adding oil to the liposome solution, and mixing the mixture for 3 minutes for 2 minutes.
Obtained by sonication over time (total 6 minutes). In the emulsion, the size of the particles was measured with a photon correlation spectroscopy. While emulsions made with linseed oil have the largest emulsion particle size, emulsions formed with squalene and jojoba bean oil have the smallest particle size. FIG. 1 shows the correlation between the particle size of the emulsion and the o / w interfacial tension of the oil. The results show that the oil with the highest o / w interfacial tension forms an emulsion with the smallest particle size. The oil is mainly a mixture of triglycerides and fatty acids / alcohol esters, except for squalene.
【００１２】 本発明において、スクアレン又はスクアランで製造されたエマルジョンは、高
分子性脂質を使用しなくても安定する。スクアレンエマルジョンについての先行
研究として幾つかの例がある。スクアレンエマルジョンは、ワクチン補助剤とし
て使用された(USP 5,376,369）。スクアレンは、細胞毒性が少なく、生分解性で
あるため、o/wエマルジョンにおいて油相に選定された。また、スクアレンエマ
ルジョンは、タクソル(Taxol)運搬体として処方された(US patent 5,407,683）
。ところが、このタクソル含有スクアレンエマルジョンは、界面活性剤又はアル
コールを添加して自己−乳化ガラス(self-emulsifying glass)を形成した後、こ
れを水に分散させることにより製剤化され、製剤に多量のエタノールが含有され
ている。従って、組成物及び製造方法が本発明とは異なる。In the present invention, the emulsion made of squalene or squalane is stable without using a polymer lipid. There are several examples of previous studies on squalene emulsions. Squalene emulsion has been used as a vaccine adjunct (USP 5,376,369). Squalene was selected as the oil phase in o / w emulsions because of its low cytotoxicity and biodegradability. Squalene emulsions have also been formulated as taxol carriers (US patent 5,407,683).
. However, this taxol-containing squalene emulsion is formulated by adding a surfactant or alcohol to form a self-emulsifying glass, and then dispersing the same in water. Is contained. Therefore, the composition and manufacturing method are different from the present invention.
【００１３】 つまり、今まで知られたスクアレンエマルジョンは、(1)抗体を伝達するため
のワクチン補助剤及び (2)本発明とは組成物及び製造方法が異なるタクソル含有
エマルジョンである。[0013] In other words, the squalene emulsions known so far are (1) a vaccine adjuvant for transmitting antibodies and (2) a taxol-containing emulsion having a different composition and a different production method from those of the present invention.
【００１４】 従って、遺伝子及び脂溶性又は両親媒性薬物を伝達するための本発明の脂質エ
マルジョンは、既存に存在するスクアレンエマルジョン製剤とは異なる。スクア
レンエマルジョンは、ひまし、大豆及びサフラワー又はひまわり油により製造さ
れたエマルジョンより非常に優れた安定性を示す。脂溶性薬物の放出速度は、よ
り安定したエマルジョンほど遅くなる。また、薬物の生体利用性も、安定したエ
マルジョンほど高い。界面張力とエマルジョン粒子サイズがどのような関連性が
あるか説明するために、さらなる研究が必要であるが、各種油によって種々の張
力勾配を提供することにより、界面張力が減少することから説明が可能である。Thus, the lipid emulsions of the present invention for delivering genes and lipophilic or amphiphilic drugs are different from existing squalene emulsion formulations. Squalene emulsions show much better stability than emulsions made with castor, soy and safflower or sunflower oil. The release rate of the fat-soluble drug is slower for a more stable emulsion. The more bioavailable the drug, the more stable the emulsion. Further studies are needed to explain the relationship between interfacial tension and emulsion particle size, but the explanation is that the different tension gradients provided by different oils reduce the interfacial tension. It is possible.
【００１５】 また、本発明は、エチルステアレート固形脂質微粒子に関する。エチルステア
レート、又はより広くC10-18直鎖を有する脂肪酸又はアルコール類のエチルエス
テルで製造した固形脂質微粒子は、遺伝子運搬体として使用されたことがない。
さらに、エチルステアレイト固形脂質微粒子は、脂溶性又は両親媒性薬物の運搬
体として使用されたことがない。[0015] The present invention also relates to ethyl stearate solid lipid fine particles. Solid lipid microparticles made from ethyl stearate or, more broadly, ethyl esters of fatty acids or alcohols having a C10-18 straight chain have never been used as gene carriers.
In addition, ethyl stearate solid lipid microparticles have never been used as a carrier for lipid-soluble or amphiphilic drugs.
【００１６】 本発明は、スクアレン又はスクアランを含む非トリグリセリド類及び (1)陽イ
オン性乳化剤及び (2)リン脂質及び PEG構造を有する脂質で製造された脂質エマ
ルジョン及びこれらの製造方法を提供する。また、本発明は、遺伝子又は他の生
理活性物質を伝達するための陽イオン性固形脂質微粒子及びその製造方法を提供
する。本発明の固形脂質微粒子は、水に固形脂肪粒子が懸濁されている。The present invention provides a lipid emulsion prepared from non-triglycerides containing squalene or squalane, (1) a cationic emulsifier, and (2) a phospholipid and a lipid having a PEG structure, and a method for producing these lipid emulsions. The present invention also provides cationic solid lipid microparticles for transferring a gene or other physiologically active substance, and a method for producing the same. The solid lipid fine particles of the present invention have solid fat particles suspended in water.
【００１７】 従って、脂肪粒子を保存するために、系から水を除去して、凍結乾燥させるこ
とが出来る。薬物が含まれた固形脂質微粒子を製造し、凍結乾燥させることによ
り、貯蔵期間を延長させることの出来るという利点がある。Thus, to preserve the fat particles, the water can be removed from the system and lyophilized. There is an advantage that the storage period can be extended by producing and freeze-drying solid lipid microparticles containing a drug.
【００１８】 陽イオン性固形脂質微粒子は、室温及び体温で固体として存在する C12-18直
鎖疎水性尾を有するトリグリセリド及び陽イオン性界面活性剤を含有する。現在
、遺伝子運搬体として陽電荷を呈する固形脂質微粒子についての報告はない。The cationic solid lipid microparticles contain a triglyceride having a C12-18 linear hydrophobic tail and a cationic surfactant present as a solid at room temperature and body temperature. At present, there is no report on solid lipid fine particles exhibiting a positive charge as a gene carrier.
【００１９】 トリグリセリドで製造された脂質エマルジョンは、薬物伝達系において広く使
用されている。例えば、オリゴペプチド免疫抑制剤であるシクロスポリン(cyclo
sporin）用エマルジョン製剤が多くある。 C8-12炭素原子を有する中間鎖トリグ
リセリドは、o/w型マルションにおいてシクロスポリンを溶解させるために使用
された(米国特許 5,660,858）。アルコール、アルカノール、ポリソルベート(po
lysorbate)80及びシクロスポリンで製造され、且つミクロン以下の粒子サイズを
有するエマルジョンが、安定し、優れた生体安定性を有すると報告された(WO 97
/35,603）。WO 97/35,610によると、中間鎖トリグリセリドに溶解されたシクロ
スポリンは、共同界面活性剤としてプロピレンカルボネートを使用すると、水に
分散しやすく、平均粒子サイズが約100nmのエマルジョンも製造することが出来
ると開示されている。多くのシクロスポリン製剤があるが、スクアレンまたはス
クアランのような純粋な高分枝性炭化水素(highly pure branched hydrocarbon)
を使用したエマルジョン製剤についての報告又は特許はない。[0019] Lipid emulsions made with triglycerides are widely used in drug delivery systems. For example, the oligopeptide immunosuppressant cyclosporin (cyclo
There are many emulsion formulations for sporin). Medium chain triglycerides having C8-12 carbon atoms have been used to dissolve cyclosporin in o / w emulsions (US Pat. No. 5,660,858). Alcohol, alkanol, polysorbate (po
lysorbate) 80 and cyclosporin and have a submicron particle size were reported to be stable and have excellent biostability (WO 97
/ 35,603). According to WO 97 / 35,610, cyclosporin dissolved in medium-chain triglyceride can be easily dispersed in water when propylene carbonate is used as a co-surfactant, and an emulsion having an average particle size of about 100 nm can be produced. It has been disclosed. There are many cyclosporine preparations, but highly pure branched hydrocarbons such as squalene or squalane
There are no reports or patents on emulsion preparations using.
【００２０】 また、エチルステアレートで製造した固形脂質微粒子を使用したシクロスポリ
ンについての報告もない。スクアレン、スクアラン及びエチルステアレートは、
単一成分油系である。従って、多くの成分から製造された植物性油とは異なり、
物理的及び化学的特性が多様でない。単一成分系は、大量生産時、よりよい品質
を提供する。さらに、本発明によると、スクアレンエマルジョンは、他の多くの
植物性エマルジョンより平均粒子サイズが小さく且つ安定する。また、生体内薬
物放出実験は、スクアレンエマルジョンからリファンピシンのような薬物の放出
が 0次放出パターンに維持されることを示す。スクアレン及びスクアランエマル
ジョン及びエチルステアレート固形脂質微粒子は、陽イオン性乳化剤を使用する
時、DNAを含む陰イオン性生理活性物質の運搬体として使用されることが出来、
脂溶性又は両親媒性薬物の伝達システムとして使用されることが出来る。Further, there is no report on cyclosporin using solid lipid fine particles produced with ethyl stearate. Squalene, squalane and ethyl stearate
It is a single component oil system. Therefore, unlike vegetable oils made from many ingredients,
The physical and chemical properties are not diverse. Single component systems provide better quality when mass produced. Furthermore, according to the present invention, squalene emulsions are smaller and more stable in average particle size than many other vegetable emulsions. In vivo drug release experiments also show that the release of drugs such as rifampicin from squalene emulsions is maintained in a zero order release pattern. Squalene and squalane emulsions and ethyl stearate solid lipid microparticles can be used as a carrier for anionic bioactive substances including DNA when using a cationic emulsifier,
It can be used as a delivery system for lipophilic or amphiphilic drugs.
【００２１】 さらに、脂溶性抗ガン剤を含有する陽イオン性エマルジョン又は固形脂質微粒
子は、ガン治療時に治療用遺伝子と複合体を形成することが出来る。Further, the cationic emulsion or solid lipid fine particles containing a fat-soluble anticancer agent can form a complex with a therapeutic gene during cancer treatment.
【００２２】 本発明の第１様態によると、本発明は、(a)非トリグリセリド系油2-30％と、(
b)陽イオン性界面活性剤を含む1種以上の乳化剤0.01-20％と、(c)残量の水とよ
りなることを特徴とする、遺伝子又は他の生理活性物質を伝達するための脂質エ
マルジョンを提供する。本発明の脂質エマルジョンは、他の添加剤をさらに含む
ことができる。本発明では、乳化剤は、エマルジョンの表面が陽電荷を呈するよ
うにするに必要なものであって、DNAを含む陰電荷を呈する生理活性物質と複合
体を形成することができるように、陽電荷を有する乳化剤から選ばれる。乳化剤
としては、非イオン性界面活性剤、リン脂質、脂肪酸、脂肪アルコール、胆汁酸
又はコレステロールが使用されることができる。According to a first aspect of the present invention, the present invention provides (a) 2-30% of non-triglyceride oil,
b) lipids for transmitting genes or other bioactive substances, characterized by comprising 0.01-20% of one or more emulsifiers containing a cationic surfactant and (c) the remaining amount of water. Provide an emulsion. The lipid emulsion of the present invention may further include other additives. In the present invention, the emulsifier is necessary to make the surface of the emulsion exhibit a positive charge, and forms a positive charge so that it can form a complex with a negatively-charged physiologically active substance containing DNA. Is selected from emulsifiers having As emulsifiers, nonionic surfactants, phospholipids, fatty acids, fatty alcohols, bile acids or cholesterol can be used.
【００２３】 本発明の第２態様によると、本発明は、(a)各々の疎水性尾に10-18の炭素原子
を有するトリグリセリド又はエチルステアレート2-30％と、(b)陽イオン性界面
活性剤を含む1種以上の乳化剤0.01-20％と、(c)残量の水とよりなることを特徴
とする、遺伝子又は他の生理活性物質を伝達するための固形脂質微粒子を提供す
る。本発明の脂質エマルジョンは、他の添加剤をさらに含むことができる。本発
明では、乳化剤は、エマルジョンの表面が陽電荷を呈するようにするに必要なも
のであって、DNAを含む陰電荷を呈する生理活性物質と複合体を形成することが
できるように、陽電荷を有する乳化剤から選ばれる。乳化剤としては、非イオン
性界面活性剤、リン脂質、脂肪酸、脂肪アルコール、胆汁酸又はコレステロール
が使用されることができる。According to a second aspect of the present invention, the present invention provides (a) 2-30% of a triglyceride or ethyl stearate having 10-18 carbon atoms in each hydrophobic tail, and (b) a cationic Provided are solid lipid microparticles for transmitting genes or other physiologically active substances, characterized by comprising 0.01 to 20% of one or more emulsifiers containing a surfactant and (c) the remaining amount of water. . The lipid emulsion of the present invention may further include other additives. In the present invention, the emulsifier is necessary to make the surface of the emulsion exhibit a positive charge, and forms a positive charge so that it can form a complex with a negatively-charged physiologically active substance containing DNA. Is selected from emulsifiers having As emulsifiers, nonionic surfactants, phospholipids, fatty acids, fatty alcohols, bile acids or cholesterol can be used.
【００２４】 本発明の第3態様によると、本発明は、(a)スクアレン又はスクアランのような
非トリグリセリド系油2-30％と、(b)1種以上の乳化剤0.01-20％と、(c)脂溶性又
は両親媒性薬物0.1-10％と、(d)残量の水とよりなることを特徴とする、脂溶性
又は両親媒性薬物を伝達するための薬物含有脂質エマルジョンを提供する。本発
明の薬物含有エマルジョンは、他の添加剤をさらに含むことができる。本発明の
薬物含有エマルジョンの表面電荷は、陽電荷、ゼロ又は陰電荷であってもよい。According to a third aspect of the present invention, the present invention provides (a) 2-30% of a non-triglyceride oil such as squalene or squalane, (b) 0.01-20% of one or more emulsifiers, c) providing a drug-containing lipid emulsion for delivering a fat-soluble or amphiphilic drug, characterized by comprising 0.1-10% of a fat-soluble or amphiphilic drug and (d) a residual amount of water. . The drug-containing emulsion of the present invention may further include other additives. The surface charge of the drug-containing emulsion of the present invention may be positive, zero or negative.
【００２５】 本発明の第4態様によると、本発明は、(a)エチルステアレート2-30％と、(b)1
種以上の乳化剤0.01-20％と、(c)脂溶性又は両親媒性薬物0.1-10％と、(d)残量
の水とよりなることを特徴とする、脂溶性又は両親媒性薬物を伝達するための薬
物含有固形脂質微粒子を提供する。本発明の薬物含有固形脂質微粒子は、他の添
加剤をさらに含むことができる。本発明の薬物含有固形脂質微粒子の表面電荷は
、陽電荷、ゼロ又は陰電荷であってもよい。According to a fourth aspect of the present invention, the present invention provides a method comprising: (a) 2-30% ethyl stearate;
At least one kind of emulsifier 0.01-20%, (c) fat-soluble or amphiphilic drug 0.1-10%, and (d) the remaining amount of water, characterized in that the fat-soluble or amphiphilic drug Provide drug-containing solid lipid microparticles for communication. The drug-containing solid lipid fine particles of the present invention can further include other additives. The surface charge of the drug-containing solid lipid microparticles of the present invention may be positive, zero or negative.
【００２６】 また、本発明は、遺伝子又は他の生理活性物質を細胞内に伝達するための脂質
エマルジョンを製造する方法に関する。本発明による脂質エマルジョンの製造方
法は、(a)陽イオン性乳化剤を含む1種以上の乳化剤0.01-20％を水と混合して水
相を製造する第１段階と、(b)前記水相と非トリグリセリド系油2-30％を混合し
てエマルジョンを製造する第２段階とを含む。The present invention also relates to a method for producing a lipid emulsion for transferring a gene or another physiologically active substance into cells. The method for producing a lipid emulsion according to the present invention comprises: (a) a first step of producing an aqueous phase by mixing 0.01 to 20% of one or more emulsifiers including a cationic emulsifier with water; And 2-30% of a non-triglyceride oil to form an emulsion.
【００２７】 また、本発明は、遺伝子又は他の生理活性物質を細胞内に伝達するための固形
脂質微粒子を製造する方法に関する。本発明による固形脂質微粒子の製造方法は
、(a)陽イオン性乳化剤を含む1種以上の乳化剤0.01-20％と水とを混合して水相
を製造する第1段階と、(b)前記水相と、々の疎水性尾に10-18個の炭素原子を有
するトリグリセリド系脂肪又はエチルステアレート2-30％とを混合してエマルジ
ョンを製造する第2段階とを含む。The present invention also relates to a method for producing solid lipid microparticles for transferring a gene or other physiologically active substance into cells. The method for producing solid lipid microparticles according to the present invention comprises (a) a first step of producing an aqueous phase by mixing 0.01 to 20% of one or more emulsifiers containing a cationic emulsifier and water and (b) A second step of mixing the aqueous phase with 2-30% of a triglyceride-based fat or ethyl stearate having 10-18 carbon atoms in each hydrophobic tail to produce an emulsion.
【００２８】 また、本発明は、脂溶性又は両親媒性薬物を細胞内に伝達するための脂質エマ
ルジョンを製造する方法に関する。本発明による薬物含有脂質エマルジョンの製
造方法は、(a)1種以上の乳化剤0.01-20％と水とを混合して水相を製造する第1段
階と、(b)脂溶性又は両親媒性薬物0.1-10％と非トリグリセリド系油2-30％とを
混合して油相を製造する第2段階と、(c)前記第1段階の水相と第2段階の油相とを
混合して薬物含有エマルジョンを製造する第3段階とを含む。The present invention also relates to a method for producing a lipid emulsion for delivering a fat-soluble or amphiphilic drug into cells. The method for producing a drug-containing lipid emulsion according to the present invention comprises (a) a first step of producing an aqueous phase by mixing 0.01 to 20% of one or more emulsifiers and water, and (b) a fat-soluble or amphiphilic A second step of preparing an oil phase by mixing 0.1-10% of the drug with 2-30% of non-triglyceride oil, and (c) mixing the water phase of the first step with the oil phase of the second step And preparing a drug-containing emulsion.
【００２９】 また、本発明は、脂溶性又は両親媒性薬物を細胞内に伝達するための固形脂質
微粒子を製造する方法に関する。本発明による薬物含有固形脂質微粒子の製造方
法は、(a)1種以上の乳化剤0.01-20％と水とを混合して水相を製造する第1段階と
、(b)脂溶性又は両親媒性薬物0.1-10％とエチルステアレートのような脂肪2-30
％とを混合して油相を製造する第2段階と、(c)前記第1段階の水相と前記第2段階
の油相とを混合して薬物含有固形脂質微粒子を製造する第3段階とを含む。The present invention also relates to a method for producing solid lipid microparticles for delivering a fat-soluble or amphiphilic drug into cells. The method for producing drug-containing solid lipid fine particles according to the present invention comprises: (a) a first step of producing an aqueous phase by mixing 0.01 to 20% of one or more emulsifiers and water; and (b) a fat-soluble or amphiphilic agent. Fats like 0.1-10% sexual drugs and ethyl stearate 2-30
% To produce an oil phase, and (c) a third step of producing the drug-containing solid lipid microparticles by mixing the first-stage aqueous phase and the second-stage oil phase. And
【００３０】 上記した方法とは異なり、各々油又は脂肪、乳化剤及び薬物を含有する油又は
脂肪相を予め製造した後、このオイル相と水とを混合することにより、薬物含有
脂質エマルジョン又は固形脂質微粒子を製造する方法も可能である。[0030] Unlike the above-mentioned method, an oil or fat phase containing oil or fat, an emulsifier and a drug is prepared in advance, and then the oil phase and water are mixed to form a drug-containing lipid emulsion or solid lipid. A method for producing fine particles is also possible.
【００３１】 また、本発明は、遺伝子を含む生理活性物質を細胞内に伝達するための脂質エ
マルジョンの製造方法に関する。この製造方法は、(a)陽イオン性乳化剤を含む1
種以上の乳化剤2-30％と、非トリグリセリド系油0.1-20％とを混合して、油相を
製造する第１段階と、(b)前記油相と水とを混合する第２段階とを含む。The present invention also relates to a method for producing a lipid emulsion for delivering a physiologically active substance containing a gene into cells. This production method comprises (a) a cationic emulsifier containing 1
A first stage of preparing an oil phase by mixing 2-30% of at least one emulsifier and 0.1-20% of a non-triglyceride oil, and (b) a second stage of mixing the oil phase with water. including.
【００３２】 また、本発明は、遺伝子を含む生理活性物質を細胞内に伝達するための固形脂
質微粒子の製造方法に関する。この製造方法は、(a)陽イオン性乳化剤を含む1種
以上の乳化剤0.1-20％と、各々の疎水性尾に10-18個の炭素原子を有するトリグ
リセリド系脂肪又はエチルステアレート2-30％とを混合して、脂肪相を製造する
第1段階と、(b)前記脂肪相と水とを混合する第2段階とを含む。The present invention also relates to a method for producing solid lipid fine particles for transferring a physiologically active substance containing a gene into cells. This process comprises (a) 0.1-20% of one or more emulsifiers, including cationic emulsifiers, and 2-30 triglyceride fats or ethyl stearate having 10-18 carbon atoms in each hydrophobic tail. % To produce a fatty phase, and (b) a second step of mixing the fatty phase with water.
【００３３】 また、本発明は、薬物含有脂質エマルジョンを製造する方法に関する。この製
造方法は、(a)1種以上の乳化剤0.1-20％、脂溶性又は両親媒性薬物0.1-10％及び
非トリグリセリド系油2-30％を混合して油相を製造する第1段階と、(b)前記油相
と水とを混合する第2段階とを含む。The present invention also relates to a method for producing a drug-containing lipid emulsion. This production method comprises: (a) a first step of producing an oil phase by mixing 0.1-20% of one or more emulsifiers, 0.1-10% of a fat-soluble or amphiphilic drug, and 2-30% of a non-triglyceride oil; And (b) a second step of mixing the oil phase and water.
【００３４】 また、本発明は、薬物含有固形脂質微粒子を製造する方法に関する。この製造
方法は、(a)1種以上の乳化剤0.1-20％、脂溶性又は両親媒性薬物0.1-10％及びエ
チルステアレートのような脂肪2-30％を混合して脂肪相を製造する第1段階と、(
b)前記脂肪相と水とを混合する第2段階とを含む。The present invention also relates to a method for producing drug-containing solid lipid fine particles. This production method comprises the steps of (a) mixing 0.1-20% of one or more emulsifiers, 0.1-10% of a fat-soluble or amphiphilic drug and 2-30% of a fat such as ethyl stearate to produce a fatty phase. The first stage and (
b) a second step of mixing the fatty phase with water.
【００３５】 本発明による脂質エマルジョンは、2種以上の不混和性の液体が界面活性剤又
は乳化剤により安定された不均質混合物を意味する。 本発明による固形脂質微粒子は、液体に分散された固体状態の脂肪が界面活性
剤又は乳化剤により安定化されたものを意味する。A lipid emulsion according to the invention means a heterogeneous mixture in which two or more immiscible liquids are stabilized by surfactants or emulsifiers. The solid lipid fine particles according to the present invention mean those in which solid fat dispersed in a liquid is stabilized by a surfactant or an emulsifier.
【００３６】 本発明の非トリグリセリド系油は、スクアレン及びスクアランを含む。 本発明の固形脂質微粒子において、脂肪は、10-18個の炭素原子を有する直鎖
のアルコール又は酸のエチルエステル、好ましくは、エチルステアレートを含む
。The non-triglyceride oil of the present invention contains squalene and squalane. In the solid lipid microparticles of the present invention, the fat comprises a linear alcohol or acid ethyl ester having 10-18 carbon atoms, preferably ethyl stearate.
【００３７】 本発明による乳化剤は、リン脂質又は非イオン性界面活性剤をさらに含むこと
ができる。本発明の乳化剤として使用される陽イオン性界面活性剤は、1,2-ジミ
リストイル-3-トリメチルアンモニウムプロパン(DMTAP)、1,2-ジパルミトイル-3
-トリメチルアンモニウムプロパン(DPTAP)、1,2-ジステアロイル-3-トリメチル
アンモニウムプロパン(DSTAP)、1,2-ジオレオイル-3-トリメチルアンモニウムプ
ロパン(DOTAP)、1,2-ジミリストイル-3-ジメチルアンモニウムプロパン(DMDAP)
、1,2-ジパルミトイル-3-ジメチルアンモニウムプロパン(DPDAP)、1,2-ジラウロ
イル-3-ジメチルアンモニウムプロパン(DLDAP)、1,2-ジステアロイル-3-ジメチ
ルアンモニウムプロパン(DSDAP)、ジメチルジオクタデシルアンモニウムクロラ
イド(DDAB)、N-[1-(1,2-ジオレオイルオキシ)プロピル]-N,N,N-トリメチルアン
モニウムクロライド(DOTMA)、1,2-ジオレオイル-3-エチルホスホコリン(DOEPC)
及び他の陽イオン性リン脂質を含む。陽イオン性乳化剤は、陰電荷を呈するDNA
と相互作用をして複合体を形成することができるだけでなく、余分の陽電荷で細
胞との相互作用を促進することができるため、遺伝子を伝達するに必要である。[0037] The emulsifier according to the present invention may further comprise a phospholipid or a non-ionic surfactant. Cationic surfactants used as emulsifiers of the present invention include 1,2-dimyristoyl-3-trimethylammonium propane (DMTAP), 1,2-dipalmitoyl-3
-Trimethyl ammonium propane (DPTAP), 1,2-distearoyl-3-trimethyl ammonium propane (DSTAP), 1,2-dioleoyl-3-trimethyl ammonium propane (DOTAP), 1,2-dimyristoyl-3-dimethyl ammonium Propane (DMDAP)
, 1,2-dipalmitoyl-3-dimethylammoniumpropane (DPDAP), 1,2-dilauroyl-3-dimethylammoniumpropane (DLDAP), 1,2-distearoyl-3-dimethylammoniumpropane (DSDAP), dimethyldiamine Octadecyl ammonium chloride (DDAB), N- [1- (1,2-dioleoyloxy) propyl] -N, N, N-trimethylammonium chloride (DOTMA), 1,2-dioleoyl-3-ethylphosphocholine ( DOEPC)
And other cationic phospholipids. Cationic emulsifiers are negatively charged DNA
Is necessary for gene transfer because it not only can interact with and form a complex, but can also interact with cells with an extra positive charge.
【００３８】 本発明によるリン脂質は、ホスファチジルコリン(phosphatidylcholine;PC)及
びその誘導体、ホスファチジルエタノールアミン(PE)及びその誘導体、及びホス
ファチジルセリン(PS)を含む。リン脂質のうち、L-α-ジオレイルホスファチジ
ルエタノールアミン(DOPE)は、エンドソマル膜(endosomal membrance)を破壊し
て、DNAを細胞質内に導入することにより、形質感染効率を増加させる脂質とし
て知られている。The phospholipids according to the present invention include phosphatidylcholine (PC) and its derivatives, phosphatidylethanolamine (PE) and its derivatives, and phosphatidylserine (PS). Among the phospholipids, L-α-dioleylphosphatidylethanolamine (DOPE) is known as a lipid that disrupts the endosomal membrance and introduces DNA into the cytoplasm, thereby increasing transfection efficiency. ing.
【００３９】 DOPE又はジオレインを含むフソジニック(fusogenic)脂質が乳化剤として追加
に使用されることができる。また、脂質エマルジョン又は固形脂質微粒子の物理
的安定性を増加させるために、脂肪酸、脂肪アルコール、コレステロール又は胆
汁酸が追加に使用されることができる。[0039] Fusogenic lipids containing DOPE or diolein may additionally be used as emulsifiers. Also, fatty acids, fatty alcohols, cholesterol or bile acids can be additionally used to increase the physical stability of the lipid emulsion or solid lipid microparticles.
【００４０】 本発明において、非イオン性界面活性剤は、ポロキサマ(poloxamers;プルロニ
ック(pluronic)として公知:ポリオキシエチレンとポリオキシプロピレンの共重
合体)、ソルビタンエステル類(Span)、ポリオキシエチレン-ソルビタン脂肪酸エ
ステル類(Tween)及びポリオキシエチレンエテール類(Brij)を含む。In the present invention, nonionic surfactants are known as poloxamers (copolymers of polyoxyethylene and polyoxypropylene), sorbitan esters (Span), polyoxyethylene- Includes sorbitan fatty acid esters (Tween) and polyoxyethylene ethers (Brij).
【００４１】 本発明は、親水性高分子、又は親水性高分子がリン脂質又はジアセチル化され
たリン脂質のような重合性脂質に共有結合された高分子性脂質を追加に含むこと
ができる。本発明で使用可能な親水性高分子の例としては、ポリオキシエチレン
、ポリエチルオキサゾリン及びポリエチレングリコール(PEG)がある。高分子性
脂質としては、エマルジョンの立体安定性を向上させ、低分子量のPEGは、フソ
ジニック剤として知られている。The present invention may additionally include a hydrophilic polymer or a polymer lipid covalently bonded to a polymerizable lipid such as a phospholipid or a diacetylated phospholipid. Examples of hydrophilic polymers that can be used in the present invention include polyoxyethylene, polyethyloxazoline and polyethylene glycol (PEG). As a high molecular lipid, steric stability of an emulsion is improved, and low molecular weight PEG is known as a fusogenic agent.
【００４２】 また、本発明の組成物は、グリセロールのよう浸透圧調節剤を含むことができ
る。 また、本発明は、形質感染効率を向上させるため、低分子量ポリエチレングリ
コール(平均分子量500-1000)及びHa gp41のようなフソジニックペプチドを含む
ことができる。The compositions of the present invention can also include an osmotic pressure regulator such as glycerol. In addition, the present invention may include a low molecular weight polyethylene glycol (average molecular weight 500-1000) and a fusogenic peptide such as Hagp41 to improve the transfection efficiency.
【００４３】 また、本発明は、特定細胞又は器官へのターゲッティングのため、糖脂質、リ
ポペプチド、抗体、収容体に対するリガンド又はウイルス性蛋白質のような物質
をさらに含むことができる。 また、本発明は、DNAを凝縮させるため、プロタミンフルフェート、ヒストン
、ポリリシンなど陽性高分子を含むことができる。In addition, the present invention may further include a substance such as a glycolipid, a lipopeptide, an antibody, a ligand for a container, or a viral protein for targeting to a specific cell or organ. In addition, the present invention can include positive macromolecules such as protamine sulfate, histone and polylysine for condensing DNA.
【００４４】 また、本発明は、脂質運搬体とDNAとの相互作用を変化させるため、1価-又は
多価-陰イオンを含むことができる。 本発明で使用可能な生理活性物質としては、DNA、RNA、アンチセンス核酸、リ
ボソーム、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド又は他の薬剤学的薬物を含む
ことができる。 伝達しようとする生理活性物質がDNAのような核酸である場合、運搬体は、核
酸と複合体を形成するため、陽電荷を呈しなければならないし、適当なサイズを
有しなければならない。In addition, the present invention can include a monovalent or polyvalent anion to change the interaction between the lipid carrier and DNA. Bioactive substances that can be used in the present invention can include DNA, RNA, antisense nucleic acids, ribosomes, polynucleotides, oligonucleotides or other pharmaceutical drugs. When the bioactive substance to be transmitted is a nucleic acid such as DNA, the carrier must exhibit a positive charge to form a complex with the nucleic acid, and must have an appropriate size.
【００４５】 本発明による陽電荷を呈する脂質エマルジョン又は固形脂質微粒子は、脂溶性
又は両親媒性薬物を含むことができる。 本発明の脂質エマルジョン又は固形脂質微粒子は、水相に水溶性薬物を追加に
含むことができる。 また、生体適用のため、血清効果を考慮しなければならない。本発明の脂質エ
マルジョンは、血清下で物理的に安定し、且つ形質感染効率が高い。The positively charged lipid emulsion or solid lipid microparticles according to the present invention may comprise a lipophilic or amphiphilic drug. The lipid emulsion or solid lipid fine particles of the present invention may further contain a water-soluble drug in an aqueous phase. Also, for biological applications, serum effects must be considered. The lipid emulsion of the present invention is physically stable under serum and has high transfection efficiency.
【００４６】 本発明によりDNAのような生理活性物質を伝達することができる脂質エマルジ
ョンは、(a)非トリグリセリド系油2-30％、及び(b)陽イオン性界面活性剤を含む
1種以上の乳化剤0.01-20％と、付加的に親水性高分子又は親水性高分子部分を有
するリン脂質0.01-10％とよりなる水相を混合することにより製造される。The lipid emulsion capable of transmitting a physiologically active substance such as DNA according to the present invention comprises (a) 2-30% of a non-triglyceride-based oil, and (b) a cationic surfactant.
It is produced by mixing an aqueous phase consisting of 0.01-20% of one or more emulsifiers and 0.01-10% of a phospholipid additionally having a hydrophilic polymer or a hydrophilic polymer portion.
【００４７】 本発明によりDNAのような生理活性物質を伝達することができる固形脂質微粒
子は、(a)疎水性尾に各々10-18個の炭素原子を有するトリグリセリド又はエチル
ステアレート2-30％を融点以上の温度で加熱したもの、及び(b)陽イオン性界面
活性剤を含む1種以上の乳化剤0.01-20％と、付加的に親水性高分子又は親水性高
分子部分を有するリン脂質0.01-10％とよりなる水相を加熱したものを混合する
ことにより製造される。混合の際、水相と油相の温度は、油相の融点以上の温度
で維持しなければならない。The solid lipid microparticles capable of transmitting a physiologically active substance such as DNA according to the present invention include (a) triglyceride or ethyl stearate 2-30% each having 10 to 18 carbon atoms in a hydrophobic tail. And (b) one or more emulsifiers containing a cationic surfactant, 0.01 to 20%, and additionally a hydrophilic polymer or a phospholipid having a hydrophilic polymer portion. It is produced by mixing the heated aqueous phase consisting of 0.01-10%. During mixing, the temperature of the water phase and the oil phase must be maintained at a temperature equal to or higher than the melting point of the oil phase.
【００４８】 また、本発明は、脂溶性又は両親媒性薬物を生体内に伝達するため、薬物含有
脂質エマルジョンを製造する方法を提供する。 本発明の薬物含有脂質エマルジョンは、(a)非トリグリセリド系油2-30％と、
脂溶性又は両親媒性薬物0.1-10％とよりなる油相、及び(b)1種以上の乳化剤0.01
-20％と、付加的に親水性高分子又は親水性高分子部分を有するリン脂質0.01-10
％とよりなる水相を混合することにより製造される。The present invention also provides a method for producing a drug-containing lipid emulsion for delivering a fat-soluble or amphiphilic drug into a living body. The drug-containing lipid emulsion of the present invention, (a) non-triglyceride oil 2-30%,
An oil phase comprising 0.1-10% of a fat-soluble or amphiphilic drug, and (b) one or more emulsifiers 0.01
-20% and additionally a phospholipid having a hydrophilic polymer or a hydrophilic polymer moiety 0.01-10
% By mixing the aqueous phase.
【００４９】 また、本発明は、脂溶性又は両親媒性薬物を生体内に伝達するため、薬物含有
固形脂質微粒子を製造する方法を提供する。 本発明の薬物含有固形脂質微粒子は、(a)疎水性尾に各々10-18個の炭素原子を
有するトリグリセリド油又はエチルステアレートを融点以上の温度で加熱したも
の2-30％と、脂溶性又は両親媒性薬物0.1-10％とよりなる油相、及び(b)1種以上
の乳化剤0.01-10％と、付加的に親水性高分子又は親水性高分子部分を有するリ
ン脂質0.01-10％とよりなる水相を混合することにより製造される。混合の際、
水相と油相の温度は、油相の融点以上の温度で維持しなければならない。The present invention also provides a method for producing drug-containing solid lipid microparticles for delivering a fat-soluble or amphiphilic drug into a living body. The drug-containing solid lipid fine particles of the present invention are: (a) 2-30% of triglyceride oil or ethyl stearate having a hydrophobic tail each having 10 to 18 carbon atoms heated at a temperature not lower than the melting point; Or an oil phase comprising 0.1-10% of an amphipathic drug, and (b) 0.01-10% of one or more emulsifiers, and additionally 0.01-10% of a phospholipid having a hydrophilic polymer or a hydrophilic polymer portion. % By mixing the aqueous phase. When mixing
The temperature of the water and oil phases must be maintained above the melting point of the oil phase.
【００５０】 上記の方法とは異なり、油相に乳化剤及び脂溶性又は両親媒性薬物を完全に溶
解させた後、水相と油相を混合することにより、薬物含有脂質エマルジョン又は
固形脂質微粒子を製造することも可能である。Unlike the above method, after completely dissolving the emulsifier and the fat-soluble or amphiphilic drug in the oil phase, the aqueous phase and the oil phase are mixed to form the drug-containing lipid emulsion or solid lipid fine particles. It is also possible to manufacture.
【００５１】 本発明によるDNAのような生理活性物質を伝達することができる脂質エマルジ
ョンは、(a)非トリグリセリド系油2-30％と、陽イオン性界面活性剤を含む1種以
上の乳化剤0.1-10％とよりなる油相、及び(b)親水性高分子又は親水性高分子部
分を有するリン脂質0.01-10％よりなる水相を混合することにより製造される。The lipid emulsion capable of transmitting a physiologically active substance such as DNA according to the present invention comprises (a) 2-30% of a non-triglyceride-based oil and one or more emulsifiers containing a cationic surfactant. It is produced by mixing an oil phase consisting of -10% and an aqueous phase consisting of (b) 0.01-10% of a phospholipid having a hydrophilic polymer or a hydrophilic polymer part.
【００５２】 本発明によるDNAのような生理活性物質を伝達することができる固形脂質微粒
子は、(a)疎水性尾に各々10-18個の炭素原子を有するトリグリセリド系脂肪又は
エチルステアレートを融点以上の温度で加熱したもの2-30％と、陽イオン性界面
活性剤を含む1種以上の乳化剤0.01-20％よりなる油相、及び(b)親水性高分子又
は親水性高分子部分を有するリン脂質0.01-10％よりなる水相を加熱したものを
混合することにより製造される。混合の際、水相と油相の温度は、油相の融点以
上の温度で維持しなければならない。The solid lipid microparticles capable of transmitting a physiologically active substance such as DNA according to the present invention include (a) a triglyceride-based fat or ethyl stearate having 10 to 18 carbon atoms in a hydrophobic tail, respectively. An oil phase consisting of 2-30% heated at the above temperature and 0.01-20% of one or more emulsifiers containing a cationic surfactant, and (b) a hydrophilic polymer or a hydrophilic polymer portion It is produced by mixing a heated aqueous phase consisting of 0.01-10% phospholipids. During mixing, the temperature of the water phase and the oil phase must be maintained at a temperature equal to or higher than the melting point of the oil phase.
【００５３】 また、本発明は、脂溶性又は両親媒性薬物を生体内に伝達するため、薬物含有
脂質エマルジョンを製造する方法を提供する。 本発明の薬物含有脂質エマルジョンは、(a)非トリグリセリド系油2-30％と、1
種以上の乳化剤0.1-10％と、脂溶性又は両親媒性薬物0.1-10％とよりなる油相、
及び(b)親水性高分子又は親水性高分子部分を有するリン脂質0.01-10％よりなる
水相を混合することにより製造される。The present invention also provides a method for producing a drug-containing lipid emulsion for delivering a fat-soluble or amphiphilic drug into a living body. The drug-containing lipid emulsion of the present invention comprises (a) 2-30% of a non-triglyceride oil,
An oil phase comprising 0.1-10% of one or more emulsifiers and 0.1-10% of a fat-soluble or amphiphilic drug,
And (b) an aqueous phase consisting of 0.01-10% of a phospholipid having a hydrophilic polymer or a hydrophilic polymer portion.
【００５４】 また、本発明は、脂溶性又は両親媒性薬物を生体内に伝達するため、薬物含有
固形脂質微粒子を製造する方法を提供する。 本発明の薬物含有固形脂質微粒子は、(a)疎水性尾に各々10-18個の炭素原子を
有するトリグリセリド油又はエチルステアレートを融点以上の温度で加熱したも
の2-30％と、1種以上の乳化剤0.01-20％と、脂溶性又は両親媒性薬物0.1-10％と
よりなる油相、及び(b)親水性高分子又は親水性高分子部分を有するリン脂質0.0
1-10％よりなる水相を混合することにより製造される。混合の際、水相と油相の
温度は、油相の融点以上の温度で維持しなければならない。The present invention also provides a method for producing drug-containing solid lipid fine particles for delivering a fat-soluble or amphiphilic drug into a living body. The drug-containing solid lipid microparticles of the present invention include (a) 2-30% of triglyceride oil or ethyl stearate having 10-18 carbon atoms each in a hydrophobic tail heated at a temperature equal to or higher than the melting point; An oil phase comprising the above emulsifier 0.01-20% and a fat-soluble or amphiphilic drug 0.1-10%, and (b) a phospholipid having a hydrophilic polymer or a hydrophilic polymer portion 0.0
Produced by mixing 1-10% aqueous phase. During mixing, the temperature of the water phase and the oil phase must be maintained at a temperature equal to or higher than the melting point of the oil phase.
【００５５】 水相は、この技術分野において公知の方法でリポソームを製造することにより
製造される。水相及び油相は、この技術分野において公知の方法を使用して混合
する。製造された水相及び油相は、成分を溶解させるために加熱し、ホモジナイ
ザ、ソニケータ又はマイクロフルイダイザなどの機器を使用して混合する。The aqueous phase is produced by making liposomes by methods known in the art. The aqueous and oil phases are mixed using methods known in the art. The produced water phase and oil phase are heated to dissolve the components, and mixed using equipment such as a homogenizer, a sonicator or a microfluidizer.
【００５６】 また、本発明は、非トリグリセリドで製造した脂質エマルジョン及び飽和トリ
グリセリド系又はエチルステアレート系で製造した固形脂質微粒子を使用して、
DNAのような生理活性物質を細胞内に伝達する方法に関する。Further, the present invention uses a lipid emulsion prepared from non-triglyceride and solid lipid fine particles prepared from saturated triglyceride or ethyl stearate,
The present invention relates to a method for transmitting a physiologically active substance such as DNA into cells.
【００５７】 また、本発明は、非トリグリセリドで製造した脂質エマルジョン及び飽和トリ
グリセリド系又はエチルステアレート系で製造した固形脂質微粒子を使用して、
脂溶性又は両親媒性薬物を生体内に伝達する方法に関する。Further, the present invention uses a lipid emulsion prepared from non-triglyceride and solid lipid fine particles prepared from saturated triglyceride or ethyl stearate,
The present invention relates to a method for delivering a fat-soluble or amphiphilic drug into a living body.
【００５８】 本発明による脂質エマルジョン及び固形脂質微粒子は、生理活性物質を細胞内
に伝達するためのもので、細胞は、白血球、繊維芽細胞、ガン細胞、ウイルスに
感染された細胞、上皮細胞、内皮細胞、筋肉細胞、肝細胞、内分泌線細胞、神経
細胞、皮膚細胞、性細胞、卵母細胞、***、造血細胞、胎細胞、Ｍ細胞、ランゲ
ルハンス島細胞、大食細胞、植物細胞、動物細胞及び不朽化細胞株よりなる群か
ら選ばれたものである。The lipid emulsion and solid lipid microparticles according to the present invention are for transmitting a physiologically active substance into cells, and include cells such as leukocytes, fibroblasts, cancer cells, cells infected with viruses, epithelial cells, Endothelial cells, muscle cells, hepatocytes, endocrine cells, nerve cells, skin cells, sex cells, oocytes, sperm, hematopoietic cells, fetal cells, M cells, Langerhans islet cells, macrophages, plant cells, animal cells And immortalized cell lines.
【００５９】 本発明によりターゲット細胞に生理活性物質を伝達する方法は、脂質エマルジ
ョン又は固形脂質微粒子と生理活性物質とが複合体を形成することである。 本発明の脂質エマルジョンを遺伝物質の運搬体として使用する場合、脂質エマ
ルジョンを、局所投与により静脈内に、筋肉内に、鼻腔内に、器官内に、皮下に
、非経口的に投与するか、又は特定器官に直接投与することができる。A method for delivering a physiologically active substance to target cells according to the present invention is to form a complex between a lipid emulsion or solid lipid fine particles and a physiologically active substance. When the lipid emulsion of the present invention is used as a carrier of genetic material, the lipid emulsion is administered intravenously, intramuscularly, intranasally, intraorganically, subcutaneously, parenterally, by topical administration, Alternatively, it can be directly administered to a specific organ.
【００６０】 脂質エマルジョン又は固形脂質微粒子に含有されることができる脂溶性及び/
又は両親媒性薬物としては、抗ウイルス剤、ステロイド系消炎剤(SAID)、非ステ
ロイド系消炎剤(NSAID)、抗生剤、抗真菌剤、ビタミン、ホルモン、レチノイン
酸、プロスタグラジン、ブロスタサイクリン、抗ガン剤、抗代謝剤、縮瞳剤、コ
リン作動性物質、アドレナリン拮抗剤、抗痙攣剤、抗不安剤、強トランキライザ
、抗憂鬱剤、麻酔剤、鎮痛剤、同化性ステロイド剤、エストロゲン、プロゲステ
ロン、グリコサミノグリカン、ポリヌクレオチド、免疫抑制剤及び免疫促進剤が
含まれる。[0060] Lipid-soluble and / or can be contained in a lipid emulsion or solid lipid microparticles.
Or as an amphipathic drug, antiviral agents, steroidal anti-inflammatory agents (SAID), non-steroidal anti-inflammatory agents (NSAID), antibiotics, anti-fungal agents, vitamins, hormones, retinoic acid, prostaglandin, brostacyclin , Anticancer drugs, antimetabolites, miotics, cholinergic substances, adrenergic antagonists, anticonvulsants, anxiolytics, strong tranquilizers, antidepressants, anesthetics, analgesics, anabolic steroids, estrogens , Progesterone, glycosaminoglycans, polynucleotides, immunosuppressants and immunostimulants.
【００６１】 以下、本発明を実施例に基づいて詳細に説明するが、本発明がこれらの実施例
のみに限定されるものではない。Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to Examples, but the present invention is not limited to these Examples.
【００６２】 実施例１ 卵ホスファチジルコリンを乳化剤として使用したエマルジョンの製 造 [0062] manufacturing of emulsion was used in Example 1 egg phosphatidylcholine as emulsifier
【００６３】 卵ホスファチジルコリン(egg PC) 12mg/mlを水と混合した後、10分以上放置し
て水和させた後、混合物をプローブタイプソニケータ(High intensity ultrason
ic processor, 600-Watt)を用いて2分間超音波処理して、リポーソム溶液を製造
した。下記に記載された各種油を10％(v/ｖ)の量でリポーソム溶液に入れ、2分
間3回にかけて(総6分)リポソーム溶液を超音波処理して、エマルジョンを製造し
た。エマルジョン粒子のサイズは、イオン化された蒸留水でエマルジョンを300
倍希釈した後、Malvern Zetasizer(Malvern Instruments Limited, England)で
測定した。エマルジョン粒子の経時変化を調べるため、製造1日後及び20日後の
エマルジョン粒子のサイズを表1に示す。表1の値は、単一試料に対して3回測定
した値の平均である。表1から明らかなように、非トリグリセリド系脂質である
スクアレンは、下記に記載された他の油成分で形成したエマルジョンより小さい
平均粒子サイズを有する安定したエマルジョンを形成する。製造されたエマルジ
ョンは、実験前まで4℃で保管した。After mixing egg phosphatidylcholine (egg PC) 12 mg / ml with water and leaving it to stand for at least 10 minutes to hydrate it, the mixture was probe-type sonicator (High intensity ultrason
It was sonicated for 2 minutes using an ic processor (600-Watt) to produce a liposomal solution. Various oils described below were added to the liposomal solution in an amount of 10% (v / v), and the liposome solution was sonicated for 3 times for 2 minutes (total 6 minutes) to prepare an emulsion. The size of the emulsion particles is 300
After double dilution, measurement was performed using a Malvern Zetasizer (Malvern Instruments Limited, England). Table 1 shows the size of the emulsion particles 1 day and 20 days after the production to examine the change over time of the emulsion particles. The values in Table 1 are the average of three measurements on a single sample. As is evident from Table 1, squalene, a non-triglyceride-based lipid, forms a stable emulsion having an average particle size smaller than the emulsions formed with the other oil components described below. The prepared emulsion was stored at 4 ° C. before the experiment.
【００６４】[0064]
【表１】 [Table 1]
【００６５】 実施例2 o/w界面張力が異なる油を使用した陽イオン性脂質エマルジョンの製 造 - 0065] Manufacture Example 2 o / w interface cationic lipid emulsion tension using different oil
【００６６】 各種油(10%(v/v))及び乳化剤としてDOTAPを使用して、脂質エマルジョンを製
造した。DOTAPを24mg/mlの濃度で水と混合し、37℃で脂質を可溶化させた。脂質
溶液をプローブタイプソニケータを用いて2分間超音波処理して、リポソーム溶
液を形成した。リポソーム溶液に各種油(10%(v/v))を添加し、2分間3回(総6回)
にかけて超音波処理して脂質エマルジョンを形成した。脂質エマルジョンの粒子
サイズ及びゼータ電位(zeta potential)をMalvern Zetasizerで測定した(n=3)。
その結果を表２に示す。o/w界面張力が大きい油で形成した脂質エマルジョンは
、o/w界面張力が小さい油で製造した脂質エマルジョンに比べて平均粒子サイズ
が小さい。あまに油エマルジョンを除いてエマルジョンの粒子サイズは、200nm
以下である。エマルジョンのゼータ電位は、48.4±8.5mVである(n=3)。エマルジ
ョンは、実験前まで4℃で保管した。Lipid emulsions were prepared using various oils (10% (v / v)) and DOTAP as emulsifier. DOTAP was mixed with water at a concentration of 24 mg / ml to solubilize the lipids at 37 ° C. The lipid solution was sonicated using a probe-type sonicator for 2 minutes to form a liposome solution. Various oils (10% (v / v)) are added to the liposome solution, and 3 times for 2 minutes (6 times in total)
And sonicated to form a lipid emulsion. The particle size and zeta potential of the lipid emulsion were measured with a Malvern Zetasizer (n = 3).
Table 2 shows the results. Lipid emulsions formed with oils with high o / w interfacial tension have smaller average particle sizes than lipid emulsions made with oils with low o / w interfacial tension. Except for oil emulsion, the particle size of the emulsion is 200nm
It is as follows. The zeta potential of the emulsion is 48.4 ± 8.5 mV (n = 3). The emulsion was stored at 4 ° C. before the experiment.
【００６７】[0067]
【表２】 [Table 2]
【００６８】 実施例3 血清下で各種油で製造した脂質エマルジョンの安定性 DOTAPリポソームとエマルジョンの安定性を比較するため、血清下でのエマル
ジョン粒子サイズを測定した。測定結果を表3に示す。血清が0.5％である場合で
も、リポソームの粒子サイズが2.7倍増加した。脂質エマルジョンの場合、血清
下で粒子サイズに変化がなかった。リポソームを用いて遺伝子を伝達する時の問
題点の１つは、形質感染効率を低下させることができる、大きい不溶性凝集物が
形成されることである。本発明の脂質エマルジョンは、血清下で狭いサイズ分布
を有しつつ、小さいサイズを維持することにより、前記問題点を解決することが
できる。 Example 3 Stability of Lipid Emulsions Prepared with Various Oils in Serum In order to compare the stability of DOTAP liposomes with emulsions, the emulsion particle size in serum was measured. Table 3 shows the measurement results. Even with 0.5% serum, the liposome particle size increased 2.7-fold. For lipid emulsions, there was no change in particle size under serum. One of the problems with gene transfer using liposomes is the formation of large insoluble aggregates that can reduce transfection efficiency. The lipid emulsion of the present invention can solve the above problem by maintaining a small size while having a narrow size distribution under serum.
【００６９】[0069]
【表３】 [Table 3]
【００７０】 実施例4 陽イオン性固形脂質微粒子の製造 各種油(10%(v/v))及び乳化剤としてDOTAPを使用して脂質エマルジョンを製造
した。DOTAPを24mg/mlの濃度で水と混合し、37℃で脂質を可溶化させた。脂質溶
液をプローブタイプソニケータで2分間超音波分解処理して、リポーソム溶液を
形成した。表1によりトリラウリン又はエチルステアレートを50℃で加熱した。
溶解された油(10%(v/v))をリポソーム溶液に添加し、50℃で2分間3回にかけて（
総6分）超音波処理して、脂質エマルジョンを形成した。脂質エマルジョンを室
温で徐々に冷却して溶解させた油を固体化させることにより、固形脂質微粒子を
形成した。脂質エマルジョンの粒子サイズ及びゼータ電位をMalvern Zetasizer
で測定した(n=3)。その結果を表4に示す。エマルジョンは、実験前まで4℃で保
管した。 Example 4 Production of Cationic Solid Lipid Fine Particles A lipid emulsion was produced using various oils (10% (v / v)) and DOTAP as an emulsifier. DOTAP was mixed with water at a concentration of 24 mg / ml to solubilize the lipids at 37 ° C. The lipid solution was sonicated with a probe-type sonicator for 2 minutes to form a liposomal solution. According to Table 1, trilaurin or ethyl stearate was heated at 50 ° C.
The dissolved oil (10% (v / v)) is added to the liposome solution and the mixture is added three times at 50 ° C. for 2 minutes (
A total of 6 minutes) was sonicated to form a lipid emulsion. Solid lipid fine particles were formed by gradually cooling the lipid emulsion at room temperature to solidify the dissolved oil. Malvern Zetasizer for particle size and zeta potential of lipid emulsions
(N = 3). The results are shown in Table 4. The emulsion was stored at 4 ° C. before the experiment.
【００７１】[0071]
【表４】 [Table 4]
【００７２】 実施例５ 細胞培養及びプラスミドDNAの分離 細胞培養 COS-1細胞(kidney, SV40 transformed, African green monkey)を10％牛胎児
血清(FBS)、ペニシリン 100units/ml及びストレプトマイシン100μg/mlが含まれ
たDMEM培地で5%CO2培養器で培養した。 Example 5 Cell Culture and Isolation of Plasmid DNA Cell culture COS-1 cells (kidney, SV40 transformed, African green monkey) contained 10% fetal bovine serum (FBS), penicillin 100 units / ml and streptomycin 100 μg / ml. The cells were cultured in the DMEM medium thus prepared in a 5% CO 2 incubator.
【００７３】 プラスミドDNAの分離 ヒトサイトメガロウイルス中-初期プロモータ(human cyomegalovirus immedia
te-early promoter)により発現されるクロラムフェニコールアセチルトランスフ
ェラーゼを暗号化するプラスミドpCMV-CATは、インビトロゲン社(Groningen, Ne
therlands)から購入した。ヒトサイトメガロウイルス中-初期プロモータにより
発現されるβ-ガラクトシダーゼを暗号化するプラスミド pCMV-betaは、クロン
テック社(clontech, Inc.)から購入した。 プラスミドは、E.coli DH5-α菌株
で増幅した後、製造社の指示によりQuiagen mega-kit(Quiagen Inc., Chatswort
h, CA)を用いて精製した。DNAの純度は、アガロースゲル電気泳動及び吸光度を
測定して求めた。O.D.260/O.D.280≧1.8を有するDNAがこの研究で使用された。Isolation of Plasmid DNA Human cytomegalovirus medium-early promoter (human cyomegalovirus immedia)
Plasmid pCMV-CAT, which encodes chloramphenicol acetyltransferase expressed by the te-early promoter, was obtained from Invitrogen (Groningen, Ne.
therlands). Plasmid pCMV-beta, encoding β-galactosidase expressed by the human cytomegalovirus-early promoter, was purchased from Clontech, Inc. The plasmid was amplified with E. coli DH5-α strain, and then, according to the manufacturer's instructions, Quiagen mega-kit (Quiagen Inc., Chatswort).
h, CA). DNA purity was determined by measuring agarose gel electrophoresis and absorbance. DNA with OD 260 / OD 280 ≧ 1.8 was used in this study.
【００７４】 実施例6 陽イオン性脂質エマルジョンとDNAとの複合体形成 DNAと実施例2で製造した脂質エマルジョンとの複合体形成は、ゲル電気泳動技
術を利用して観察した。リポフェクタミン及びDOTAPリポソームを対照区として
使用した。DNA(1μg)を試験管内で適当量の脂質運搬体と混合し、複合体を室温
で30分間放置した。複合体を、エチジウムブロマイドを含有する1%アガロースゲ
ルに積載し、トリス-アセテート-EDTA(pH8.0)緩衝溶液で電気泳動した。ゲルをU
V線下で視覚化して図９に示した。図９から明らかなように、2μlのリポフェク
タミンが、1μgのDNAと複合体を形成した。また、エマルジョンは、エマルジョ
ン/DNA複合体を効果的に形成した。 Example 6 Formation of Complex between Cationic Lipid Emulsion and DNA Complex formation between DNA and the lipid emulsion prepared in Example 2 was observed using a gel electrophoresis technique. Lipofectamine and DOTAP liposomes were used as controls. DNA (1 μg) was mixed with an appropriate amount of lipid carrier in a test tube, and the complex was left at room temperature for 30 minutes. The conjugate was loaded on a 1% agarose gel containing ethidium bromide and electrophoresed in a Tris-acetate-EDTA (pH 8.0) buffer solution. Gel U
Visualized under the V line is shown in FIG. As is apparent from FIG. 9, 2 μl of Lipofectamine formed a complex with 1 μg of DNA. Also, the emulsion effectively formed an emulsion / DNA complex.
【００７５】 実施例7 PLAAに対するDNAの抵抗性 実施例6と同様に、リポフェクタミン、DOTAPリポソーム及び陽イオン性脂質エ
マルジョンによりDNAと複合体を形成した。ポリ-L-アスパルト酸(PLAA)の濃度を
異ならせて複合体に添加した。PLAAが陰イオン性高分子であるため、複合体から
陰イオン性DNAが分離されることができる。従って、PLAAの存在時、複合体から
のDNAの分離は、複合体の強度を示す指標である。DNAは、1.25のPLAA/DNA間の等
価又はその以上でリポフェクタミン/DNA複合体及びDOTAPリポソーム/DNA複合体
から分離される。一方、BRC 001-DNA複合体は、640の等価で安定に維持される。
この結果は、陰イオン性競争者の存在時、脂質エマルジョン/DNA複合体がリポソ
ーム/DNA複合体より非常に強いことを意味する。従って、エマルジョン伝達体系
は、血清又は粘膜を含む生物学的障壁下で非常に優れた形質感染効率を示すこと
ができると期待する。 Example 7 Resistance of DNA to PLAA As in Example 6, a complex was formed with DNA using lipofectamine, DOTAP liposome and cationic lipid emulsion. Different concentrations of poly-L-aspartic acid (PLAA) were added to the conjugate. Since PLAA is an anionic polymer, anionic DNA can be separated from the complex. Thus, in the presence of PLAA, separation of DNA from the complex is an indicator of the strength of the complex. DNA is separated from the lipofectamine / DNA complex and the DOTAP liposome / DNA complex with an equivalent of or greater than 1.25 PLAA / DNA. On the other hand, the BRC 001-DNA complex is stably maintained at the equivalent of 640.
This result means that the lipid emulsion / DNA complex is much stronger than the liposome / DNA complex in the presence of anionic competitors. Therefore, we expect that the emulsion delivery system can exhibit very good transfection efficiency under biological barriers including serum or mucosa.
【００７６】 実施例8 COS-1細胞株で陽イオン性脂質エマルジョンによる遺伝子形質感染効 率 [0076] Gene trait infection efficiency by the cationic lipid emulsion in Example 8 COS-1 cell line
【００７７】 COS-1細胞を形質感染する約12時間前に96ウェルプレートに1×104細胞の濃度
で接種した。pCMV-betaプラスミド(0.5μg)をDOTAPリポソーム及び実施例2の脂
質エマルジョンのDOTAP 2μgと混合した。混合物を血清を含有しないDMEM培地2
μlで希釈した。混合物を30分間放置しつつ、上下に10回完全に攪拌した。血清
を含有しないRPMI 1640でCOS-1細胞を洗浄した後、血清を含有しない培地160μl
及び運搬体-DNA混合物を細胞に添加した。37℃で5％CO2培養器で1時間培養した
後、溶液に残存する運搬体-DNA複合体を除去するため、血清を含有しないDMEM培
地で細胞を洗浄した。血清10％が含まれたDMEM培地で細胞を24時間培養した。培
養後、形質感染された細胞を回収した。細胞を200μlのPBSで洗浄し、50μlの溶
解溶液(lysis solution; 0.1% Triton X-100, 250mM Tris, pH0.8)を用いて回収
した後、冷凍-解凍サイクルで溶解させた。各々のウェルに0.5％ 牛血清アルブ
ミンを含有するPBS 50μlを添加し、基剤溶液(150μl 1mg/mlクロラムフェニコ
ールレッドガラクトピラノサイド)を常温で１時間添加して、酵素反応させた。
組換えβ-ガラクトシダーゼを標準物として使用した。吸光度は、570nmで測定し
た(n=3)。形質感染効率は、表5に示すように、相対的にβ-ガラクトリダーゼの
活性で表示した。Approximately 12 hours prior to transfecting COS-1 cells, 96-well plates were seeded at a concentration of 1 × 10 4 cells. The pCMV-beta plasmid (0.5 μg) was mixed with DOTAP liposomes and 2 μg of the DOTAP of the lipid emulsion of Example 2. Mix the serum-free DMEM medium 2
Diluted in μl. The mixture was thoroughly stirred up and down 10 times while standing for 30 minutes. After washing COS-1 cells with serum-free RPMI 1640, 160 μl of serum-free medium
And a vehicle-DNA mixture was added to the cells. After culturing at 37 ° C. for 1 hour in a 5% CO 2 incubator, the cells were washed with a serum-free DMEM medium to remove the carrier-DNA complex remaining in the solution. Cells were cultured in DMEM medium containing 10% serum for 24 hours. After culturing, the transfected cells were collected. The cells were washed with 200 μl of PBS, collected using 50 μl of a lysis solution (lysis solution; 0.1% Triton X-100, 250 mM Tris, pH 0.8), and then lysed by a freeze-thaw cycle. To each well, 50 μl of PBS containing 0.5% bovine serum albumin was added, and a base solution (150 μl 1 mg / ml chloramphenicol red galactopyranoside) was added at room temperature for 1 hour to carry out an enzyme reaction.
Recombinant β-galactosidase was used as a standard. Absorbance was measured at 570 nm (n = 3). As shown in Table 5, the transfection efficiency was relatively expressed as β-galactidase activity.
【００７８】[0078]
【表５】 [Table 5]
【００７９】 実施例9 COS-1細胞株で血清が形質感染効率に及ぼす影響 血清がDNA形質感染効率に及ぼす影響を評価するため、運搬体-DNA複合体を、
血清を含有しないDMEM培地で製造した。細胞を、血清を含有しないDMEM培地で洗
浄した。 実施例8のの方法により80％血清を含有するDMEM培地160μlで形質感染を行った
。80％血清が存在する場合の形質感染効率を表5に示す。 Example 9 Effect of Serum on Transfection Efficiency in COS-1 Cell Line To evaluate the effect of serum on DNA transfection efficiency, the carrier-DNA complex was
Produced in DMEM medium without serum. Cells were washed with serum-free DMEM medium. Transfection was carried out with 160 μl of DMEM medium containing 80% serum according to the method of Example 8. Table 5 shows the transfection efficiency in the presence of 80% serum.
【００８０】 実施例10 細胞毒性 生き細胞を3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニル-テトラゾリ
ウムブロマイド(MTT)法を用いて定量した。テトラゾリウム環開環反応は、活性
ミトコンドリアを有する生き細胞が存在する場合のみに発生することができる。
この黄色-紫色反応は、スキャニングマルチフェル分光光度計(ELISA reader)を
用いて定量した。 Example 10 Cytotoxicity Live cells were quantified using the 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyl-tetrazolium bromide (MTT) method. The tetrazolium ring opening reaction can occur only when there are living cells having active mitochondria.
The yellow-purple reaction was quantified using a scanning multifel spectrophotometer (ELISA reader).
【００８１】 COS-1細胞をトリプシン処理により指数期培養物(exponential phase culture)
から回収し、計数した後、96-ウェルマイクロプレートに1×104細胞/ウェルの濃
度で接種した。プレートを湿っている大気中で37℃の温度で1日間培養した。脂
質エマルジョンを最終体積が200μlとなるように、成長培地で希釈した後、細胞
に添加し、24時間培養した。脂質エマルジョンを露出させた後、細胞をPBSで2回
洗浄した。MTTをPBSに溶解させ、濾過、殺菌した後、実験前まで4℃で保管した
。新鮮な培地200μlと0.5％MTT溶液50μｌを各々のウェルに添加し、細胞内代謝
のため、37℃で4時間培養した。ホルマザン結晶をジメチルスルホキシド(DMSO)
200μlを添加して溶解させた。ソレンセンのグリシン緩衝溶液(Sorensen's glyc
ine buffer)25μlを添加した。570nmで吸光度をElisa reader[SOFTmax PRO(Mole
cular Devices corporation, California, U.S.A.)]で測定し、表5に示した。[0081] Exponential phase culture of COS-1 cells by trypsinization
After harvesting and counting, 96-well microplates were seeded at a concentration of 1 × 10 4 cells / well. Plates were incubated for 1 day at a temperature of 37 ° C. in a humid atmosphere. The lipid emulsion was diluted with a growth medium to a final volume of 200 μl, added to the cells, and cultured for 24 hours. After exposing the lipid emulsion, the cells were washed twice with PBS. MTT was dissolved in PBS, filtered, sterilized, and stored at 4 ° C. until the experiment. 200 μl of fresh medium and 50 μl of 0.5% MTT solution were added to each well, and cultured at 37 ° C. for 4 hours for intracellular metabolism. Formazan crystals in dimethyl sulfoxide (DMSO)
200 μl was added and dissolved. Sorensen's glycine buffer solution
ine buffer) was added. Measure the absorbance at 570 nm using the Elisa reader [SOFTmax PRO (Mole
cular Devices corporation, California, USA)] and shown in Table 5.
【００８２】 脂質エマルジョンの形質感染効率は、無血清のリポソームより低い。しかし、
血清を添加する場合、リポソームの形質感染効率は、18.2倍減少した。これに対
して、脂質エマルジョンの形質感染効率は、血清を添加した時、1.6-2.7倍減少
した。脂質エマルジョンのうち、スクアレン脂質エマルジョンの形質感染効率は
、無血清又は血清下で他のエマルジョン運搬体より優れる。スクアレンエマルジ
ョンは、無血清又は血清下で優れた物理的な安定性を有する。このような物理的
な安定性は、不安定性因子が多い生体内適用時、細胞内に遺伝子を伝達する能力
を提供することができる。また、エマルジョンの細胞毒性は、リポソームより低
い。スクアレンエマルジョンは、細胞増殖率が89％以上と最も低い細胞毒性を有
する。The transfection efficiency of lipid emulsions is lower than serum-free liposomes. But,
When serum was added, the transfection efficiency of the liposomes was reduced 18.2 times. In contrast, the transfection efficiency of lipid emulsions was reduced by a factor of 1.6-2.7 when serum was added. Among lipid emulsions, the transfection efficiency of squalene lipid emulsions is superior to other emulsion carriers in serum-free or serum-free. Squalene emulsions have excellent physical stability in serum-free or in serum. Such physical stability can provide the ability to transfer genes into cells during in vivo applications with high instability factors. Also, the cytotoxicity of the emulsion is lower than liposomes. Squalene emulsion has the lowest cytotoxicity with a cell growth rate of 89% or more.
【００８３】 実施例11 陽イオン性固形脂質微粒子とDNAの複合体形成 実施例4のトリラウリンよりなる陽イオン性固形脂質微粒子及びDNAを異なる比
率で緩衝溶液中で混合し、1％ウラニルアセテートでネガティブ染色して、電子
顕微鏡上で50,000倍の倍率で複合体を観察した。 図6Aは、純粋なDNAである。図6C及び図6Dは、固形脂質微粒子/DNA複合体を示す
。 Example 11 Formation of Complex between Cationic Solid Lipid Fine Particles and DNA The cationic solid lipid fine particles comprising trilaurin of Example 4 and DNA were mixed at different ratios in a buffer solution, and negatively mixed with 1% uranyl acetate. After staining, the complex was observed on an electron microscope at a magnification of 50,000 times. FIG. 6A is pure DNA. 6C and 6D show the solid lipid microparticle / DNA complex.
【００８４】 実施例12 陽イオン性固形脂質微粒子を用いた形質感染 生体内形質感染のため、トリラウリンよりなる陽イオン性固形脂質微粒子を使
用した。β-ガラクトシダーゼ活性は、無血清の場合、0.24±0.07 mU/wellであ
り、血清下では、0.11±0.02mU/wellである。細胞増殖率は、82.6±15.6％で、
これは、固形脂質微粒子の細胞毒性が低いことを意味する。このような結果は、
固形脂質微粒子が遺伝子運搬体として使用されることができることを意味する。 Example 12 Transfection Using Cationic Solid Lipid Fine Particles For transfection in vivo, cationic solid lipid fine particles made of trilaurin were used. β-galactosidase activity is 0.24 ± 0.07 mU / well in the absence of serum, and 0.11 ± 0.02 mU / well in serum. The cell growth rate is 82.6 ± 15.6%,
This means that the solid lipid microparticles have low cytotoxicity. Such a result is
It means that solid lipid microparticles can be used as a gene carrier.
【００８５】 実施例13 陽イオン性脂質エマルジョンにDOPEをヘルパー脂質として添加した 時の形質感染効率の増加 Example 13 Increased transfection efficiency when DOPE was added as a helper lipid to a cationic lipid emulsion
【００８６】 形質感染効率を増加させるため、DOPEを追加の乳化剤として使用してスクアレ
ンエマルジョンを製造した。ヘルパー脂質としてDOPEは、室温でフソジニシティ
(fusogenicity)を有し、エンドソマル膜を破壊して形質感染効率を増加させると
知られている。To increase transfection efficiency, a squalene emulsion was prepared using DOPE as an additional emulsifier. DOPE as a helper lipid is fusogenic at room temperature
(fusogenicity), and is known to increase endothelial efficiency by disrupting the endosomale membrane.
【００８７】 乳化剤として純粋なDOTAPの代わりに、DOTAP/DOPE混合物24mg/mlを使用するこ
とを除いて、実施例2と同様の方法でリポソーム及びスクアレンエマルジョンを
製造した。DOTAP及びDOPEの質量比は、 11:1、 7:1、 5:1、 3:1、 5:3、 1:1、 1:3及
び 1:5である。形質感染は、実施例8の方法により行った。また、血清に対する
影響を実施例9の方法を用いて研究した。その結果を図１２に示す。A liposome and squalene emulsion were prepared in the same manner as in Example 2, except that 24 mg / ml of a DOTAP / DOPE mixture was used instead of pure DOTAP as an emulsifier. The mass ratio of DOTAP and DOPE is 11: 1, 7: 1, 5: 1, 3: 1, 5: 3, 1: 1, 1: 3 and 1: 5. The transfection was performed by the method of Example 8. The effect on serum was also studied using the method of Example 9. FIG. 12 shows the result.
【００８８】 形質感染効率は、リポソームと脂質エマルジョンにおいていずれもDOTAP/DOPE
の比率が5:1である時、最大である。高いDOPEの濃度では、形質注入効率が減少
する傾向を示すが、これは、DOPEの付加により脂質運搬体と複合体が不安定にな
るからであると思われる。The transfection efficiency was determined for both liposomes and lipid emulsions by DOTAP / DOPE.
Is maximum when the ratio is 5: 1. At higher DOPE concentrations, transfection efficiency tends to decrease, presumably because the addition of DOPE destabilizes lipid carriers and complexes.
【００８９】 実施例14 陽イオン性脂質エマルジョンにジオレイン(diolein)をヘルパー脂
質として添加した時の形質感染効率の増加 Example 14 Diolein was added to a cationic lipid emulsion by helper fat.
Of transfection efficiency when added as quality
【００９０】 形質感染効率を増加させるため、追加の乳化剤としてジオレインを使用して、
スクアレンエマルジョンを製造した。 本発明者らは、形質感染効率を増加させるため、ヘルパー脂質として使用され
たことがないジオレインの使用可能性をテストした。乳化剤として純粋なDOTAP
の代わりに、DOTAP/ジオレイン混合物(重量比9:1)を使用することを除いて、実
施例2と同様の方法でリポソーム及びスクアレンエマルジョンを製造した。形質
感染は、実施例8の方法により行った。また、血清に対する影響は、実施例9と同
様の方法で研究した。結果を表6に示す。To increase transfection efficiency, using diolein as an additional emulsifier,
A squalene emulsion was prepared. We have tested the potential use of diolein, which has never been used as a helper lipid, to increase transfection efficiency. Pure DOTAP as emulsifier
Was prepared in the same manner as in Example 2, except that a DOTAP / diolein mixture (weight ratio 9: 1) was used instead of liposome and squalene emulsion. The transfection was performed by the method of Example 8. The effect on serum was studied in the same manner as in Example 9. Table 6 shows the results.
【００９１】 形質感染効率は、リポソームと脂質エマルジョンにおいていずれもジオレイン
の添加により増加した。リポソームの細胞毒性は、ジオレインの付加により減少
した。このような結果は、DOPEの添加によりリポソームの細胞毒性が増加する現
象とは相反するものである。細胞毒性の減少は、ジオレインが細胞の機能を調節
する蛋白質キナーゼCを活性化させることができるからであると思われる。従っ
て、DOPEとは異なり、ジオレインは、細胞毒性が低くて、形質感染効率を増加さ
せるので、優れたヘルパー脂質となり得る。The transfection efficiency was increased in both liposomes and lipid emulsions by the addition of diolein. Liposomal cytotoxicity was reduced by the addition of diolein. Such a result is contrary to the phenomenon that the cytotoxicity of the liposome is increased by the addition of DOPE. The decrease in cytotoxicity appears to be due to the ability of diolein to activate protein kinase C, which regulates cell function. Thus, unlike DOPE, diolein can be an excellent helper lipid because it has low cytotoxicity and increases transfection efficiency.
【００９２】[0092]
【表６】 [Table 6]
【００９３】 実施例15 陽イオン性脂質エマルジョンにヘルパー脂質としてDOPEとジオレイ ンを同時に添加することによる形質感染効率の増加 [0093] increase of plasma infection efficiency by simultaneously adding DOPE and Jiorei in as helper lipid in Example 15 Cationic lipid emulsion
【００９４】 形質感染においてスクアレンエマルジョンのDOTAPのヘルパー脂質として各々
実施例13及び14のDOPE及びジオレインを使用した。DOTAP及びDOPEの質量比は5:1
で固定し、タイオレインの量を変化させた。純粋なDOTAPの代わりに、DOTAP、DO
PE及びジオレインの混合物を乳化剤として使用することを除いて、実施例2と同
様の方法でスクアレンエマルジョンを製造した。(DOTAP+DOPE)とジオレイン間の
重量比は、1:0,7:1,5:1,3:1,1:1及び1:3である。形質感染は、実施例8の方法で
行った。また、血清に対する影響は、実施例9の方法で研究した。その結果を図
１４に示す。In the transfection, DOPE and diolein of Examples 13 and 14, respectively, were used as helper lipids of DOTAP in squalene emulsion. The mass ratio of DOTAP and DOPE is 5: 1
And the amount of tie olein was changed. DOTAP, DO instead of pure DOTAP
A squalene emulsion was prepared in the same manner as in Example 2, except that a mixture of PE and diolein was used as an emulsifier. The weight ratio between (DOTAP + DOPE) and diolein is 1: 0,7: 1,5: 1,3: 1,1: 1 and 1: 3. The transfection was performed by the method of Example 8. The effect on serum was studied by the method of Example 9. The result is shown in FIG.
【００９５】 形質感染効率は、DOTAP+DOPE/DOPEの比率が5:1である時、最大である。DOPEと
ジオレインを添加することにより、DOPEとジオレインがフソジニシティを提供す
ることができ、ジオレインが蛋白質キナヘゼC活性化剤として作用することがで
きる。しなしながら、形質感染活性は、高い濃度で減少するが、これは、ジオレ
インがエマルジョン/DNA複合体の安定性を変化させることと関連があると思われ
る。The transfection efficiency is highest when the ratio of DOTAP + DOPE / DOPE is 5: 1. By adding DOPE and diolein, DOPE and diolein can provide fusogenicity, and diolein can act as a protein kinahase C activator. However, transfectant activity is reduced at higher concentrations, which may be related to dioleoin altering the stability of the emulsion / DNA complex.
【００９６】 実施例16 ポリエチレングリコール(PEG)構造を有する乳化剤の添加による形
質感染効率及び細胞毒性 Example 16 Form by adding an emulsifier having a polyethylene glycol (PEG) structure
Infection efficiency and cytotoxicity
【００９７】 ポリエチレングリコール(PEG)構造を有する乳化剤は、立体障害を提供するの
で、エマルジョンの安定性を増加させることができる。また、低分子量のPEG単
位(unit)はフソジニシティを提供することができる。従って、種々のPEG-脂質が
エマルジョンを形成するための共同乳化剤として使用された。スクアレンエマル
ジョンは、24mg/mlのDOTAP/DOPE(5:1)及び種々の高分子性乳化剤を使用して製造
された。Emulsifiers having a polyethylene glycol (PEG) structure provide steric hindrance and can increase emulsion stability. Also, low molecular weight PEG units can provide fusogenicity. Accordingly, various PEG-lipids have been used as co-emulsifiers to form emulsions. Squalene emulsions were made using 24 mg / ml DOTAP / DOPE (5: 1) and various polymeric emulsifiers.
【００９８】 高分子性乳化剤、Tween80、PEG2000PE、 HCO60及び Pluronic F68を相異する
量で(DOTAP/DOPE混合物の重量に対して10,20,30及び50％(w/w))添加して、エマ
ルジョンを形成した。形質感染及び細胞毒性に対する研究は、実施例8及び10の
方法で行った。高分子性脂質の種類によって最適形質感染効率が相異するDOTAP
濃度で得られた。表7の結果は、各々のエマルジョンでの最適効率を示す。The polymeric emulsifiers Tween 80, PEG 2000 PE, HCO 60 and Pluronic F68 were added in different amounts (10, 20, 30 and 50% (w / w) based on the weight of the DOTAP / DOPE mixture). To form an emulsion. Studies on transfection and cytotoxicity were performed as described in Examples 8 and 10. DOTAP with different optimal transfection efficiency depending on the type of high molecular lipid
Concentration. The results in Table 7 show the optimal efficiency for each emulsion.
【００９９】 リポソーム場合、80％血清下で形質感染効率は高分子性脂質の添加により有意
的に減少した。反対に、脂質エマルジョンを遺伝子運搬体として使用する場合、
80％血清下での形質感染効率は、無血清下での効率の最小50％である。Tween80
を添加する場合、リポソームとエマルジョンの形質感染効率が全部増加した。し
かし、他の高分子性脂質は、高分子部分の立体障害に起因して形質感染効率が低
くなった。その結果、陽イオン性脂質とDNA間の相互作用のため、多量の運搬体
が必要になり、これにより細胞毒性が増加する。 従って、Tween80は、エマルジョンとDNA間の相互作用を妨害しなく、エマルジ
ョンの安定性を提供する脂質として選択される。In the case of liposomes, the transfection efficiency under 80% serum was significantly reduced by the addition of the polymeric lipid. Conversely, when using lipid emulsions as gene carriers,
The transfection efficiency under 80% serum is a minimum of 50% of the efficiency under serum-free. Tween80
, The transfection efficiency of liposomes and emulsions all increased. However, the transfection efficiency of other high molecular lipids was reduced due to steric hindrance of the high molecular part. As a result, the interaction between the cationic lipid and DNA requires a large amount of carrier, which increases cytotoxicity. Thus, Tween 80 is selected as a lipid that provides emulsion stability without interfering with the interaction between the emulsion and DNA.
【０１００】[0100]
【表７】 [Table 7]
【０１０１】 実施例17 Tween80の添加による形質感染効率の増加 24mg/mlのDOTAP/DOPE(重量比5:1)と高分子性Tween80を使用して、スクアレン
エマルジョンを製造した。DOTAP/DOPEに添加されるTween80の量は、0,5,10,15及
び20％(w/w)である。形質感染は、実施例８と同様の方法で実施した。その結果
を図９に示す。Tween80の量のが10％となるまで形質感染効率が増加した。しか
し、Tween 80が10％以上である場合、ポリエチレングリコール部分の立体障害に
起因して形質感染効率が減少した。 Example 17 Increase in Transfection Efficiency by the Addition of Tween80 A squalene emulsion was prepared using 24 mg / ml DOTAP / DOPE (weight ratio 5: 1) and polymeric Tween80. The amount of Tween 80 added to DOTAP / DOPE is 0,5,10,15 and 20% (w / w). Transfection was performed in the same manner as in Example 8. FIG. 9 shows the result. The transfection efficiency increased until the amount of Tween80 became 10%. However, when Tween 80 was 10% or more, the transfection efficiency was reduced due to steric hindrance of the polyethylene glycol moiety.
【０１０２】 実施例18 Tween80の添加によるエマルジョン安定性の増加 Tween80がエマルジョンの安定性を増加させるかについて調べるため、24mg/ml
のDOTAP/DOPE(重量比5:1)に10％(w/w)のTween80を添加するか、添加しなく、実
施例17と同様の方法でスクアレンエマルジョンを製造した。エマルジョンを0.5
％の血清と0.1%のナトリウムアジドが含有されたPBSで300倍希釈し、600nmで吸
光度を測定した(n=3)。希釈直後の吸光度を100％にして図１５に示す。Tween80
を添加しなく製造したエマルジョンと異なり、Tween 80を添加して製造したエマ
ルジョンの吸光度は、経時によりほとんど変化しなかった。これは、Tween80の
添加によりエマルジョンの安定性が増加することを意味する。 Example 18 Increased Emulsion Stability by the Addition of Tween 80 To determine whether Tween 80 increased the stability of the emulsion, 24 mg / ml
A 10% (w / w) Tween 80 was added to DOTAP / DOPE (weight ratio: 5: 1) or no squalene emulsion was produced in the same manner as in Example 17. 0.5 emulsion
The solution was diluted 300-fold with PBS containing 0.1% serum and 0.1% sodium azide, and the absorbance was measured at 600 nm (n = 3). FIG. 15 shows the absorbance immediately after dilution as 100%. Tween80
Unlike the emulsion prepared without the addition of, the absorbance of the emulsion prepared with the addition of Tween 80 hardly changed over time. This means that the addition of Tween 80 increases the stability of the emulsion.
【０１０３】 実施例19 製造方法 実施例17の10%(w/w)Tween80を含有する脂質エマルジョンを、マイクロフルイ
ダイゼイション法及び超音波処理法の２つの製造方法で製造した。 粒子サイズ及び形質感染効率を比較した。超音波処理法でエマルジョンを製造
する方法は、実施例2と同様である。マイクロフルイダイゼイション法を利用す
る方法は、次のようである。２つの相を混合す前、成分を完全に可溶化させるた
め、油相と水相を70℃に加熱した。 Example 19 Production Method The lipid emulsion containing 10% (w / w) Tween80 of Example 17 was produced by two production methods, a microfluidization method and a sonication method. The particle size and transfection efficiency were compared. The method for producing the emulsion by the ultrasonic treatment is the same as in Example 2. The method using the microfluidization method is as follows. Before mixing the two phases, the oil phase and the aqueous phase were heated to 70 ° C. in order to completely solubilize the components.
【０１０４】 高速ホモジナイザ(T-25-Ultra-Turrax, S25-18G,IKA Werke,Janke＆Kunkel Gm
bH＆Co KG, Germany)で8000rpmで10分間2つの相を混合して、エマルジョンを製
造した。マイクロフルイダイザ(Microfluidics Co., Newton, MA)にて出口空気
圧80psiで混合物を10回通過させた。このように方法で製造されたエマルジョン
を実験前に4℃で保管した。High-speed homogenizer (T-25-Ultra-Turrax, S25-18G, IKA Werke, Janke & Kunkel Gm
The emulsion was prepared by mixing the two phases at 8000 rpm for 10 minutes on a bH & Co KG, Germany). The mixture was passed 10 times through a microfluidizer (Microfluidics Co., Newton, Mass.) At an outlet air pressure of 80 psi. The emulsion prepared in this way was stored at 4 ° C. before the experiment.
【０１０５】 エマルジョン粒子のサイズは、実施例１と同様に、水でエマルジョンを300倍
希釈した後、Malvern Zetasizerを用いて測定した。形質感染は、実施例8と同様
に実施した。その結果を表８に示す。The size of the emulsion particles was measured using a Malvern Zetasizer after diluting the emulsion 300 times with water as in Example 1. Transfections were performed as in Example 8. Table 8 shows the results.
【０１０６】[0106]
【表８】 [Table 8]
【０１０７】 ２つの相異する方法で製造されたエマルジョンは、類似な結果を示した(n=3)
。大量生産には、マイクロフルイダイゼイション法が、少量生産には、超音波処
理法を使用することが好ましい。Emulsions prepared in two different ways showed similar results (n = 3)
. It is preferable to use the microfluidization method for mass production, and to use the sonication method for small production.
【０１０８】 実施例20 プロタミンスルフェートの前処理が複合体のサイズに及ぼす影響 プロタミンスルフェートは、多価陽イオン性蛋白質であり、陰イオンと相互作
用及び凝縮によりプロタミンスルフェート/DNA複合体を形成する。また、プロタ
ミンスルフェートは、核志向序列(nucleus targetting moiety)を有しているの
で、複合体の核への移動を促進して、形質感染活性を増加させることができる。 Example 20 Influence of Protamine Sulfate Pretreatment on Complex Size Protamine sulfate is a polycationic protein, and interacts with anions and condenses to form a protamine sulfate / DNA complex. Form. Further, since protamine sulfate has a nucleus targeting moiety, it can promote the transfer of the complex to the nucleus and increase the transfection activity.
【０１０９】 エマルジョンとDNAとの複合体の形成の際、エマルジョン溶液を添加する前に
、プロタミンスルフェートをDNAと混合した。 エマルジョン溶液を添加する15分前に、0.5、1.0及び1.5μg/wellの量でプロ
タミンスルフェートをDNAと混合した。実施例6で使用したエマルジョンの半分(2
μgのDOTAP)をプロタミンスルフェート/DNA混合物に添加した。実施例1と同様に
、水でエマルジョンを300倍希釈した後、Malvern Zetasizerでエマルジョン粒子
のサイズを測定した。表９は、複合体のサイズがプロタミンスルフェートの添加
により増加しないことを示す。プロタミンスルフェートの添加は、陽イオン性脂
質エマルジョンの量を減少させることができ、その結果、エマルジョンと関連し
た細胞毒性を低減することができる。During the formation of the complex between the emulsion and the DNA, the protamine sulfate was mixed with the DNA before adding the emulsion solution. Fifteen minutes before adding the emulsion solution, protamine sulfate was mixed with the DNA in amounts of 0.5, 1.0 and 1.5 μg / well. Half of the emulsion used in Example 6 (2
μg of DOTAP) was added to the protamine sulfate / DNA mixture. As in Example 1, the emulsion was diluted 300-fold with water, and the size of the emulsion particles was measured with a Malvern Zetasizer. Table 9 shows that the size of the conjugate does not increase with the addition of protamine sulfate. Addition of protamine sulphate can reduce the amount of cationic lipid emulsion and consequently reduce the cytotoxicity associated with the emulsion.
【０１１０】[0110]
【表９】 [Table 9]
【０１１１】 実施例21 プロタミンスルフェートの添加による形質感染効率の増加 実施例20と同様に、プロタミンスルフェートで前処理した後、エマルジョン/D
NA複合体を製造し、実施例8と同様に形質感染を実施した。また、血清下での形
質感染効率は、実施例9と同様の方法で求めた。その結果を図１６に示す。 エマルジョン又はプロタミンスルフェートを単独で使用した形質感染効率は、
DNAで前処理したエマルジョン/DNA複合体を使用した形質感染効率より7-10倍低
い。1.0μgのプロタミンスルフェートを使用した場合、最も優れた形質感染効率
が得られる。 Example 21 Increase in Transfection Efficiency by Addition of Protamine Sulfate As in Example 20, after pretreatment with protamine sulfate, emulsion / D
An NA complex was prepared and transfected as in Example 8. The transfection efficiency under serum was determined in the same manner as in Example 9. FIG. 16 shows the result. The transfection efficiency using emulsion or protamine sulfate alone is:
7-10 fold lower than the transfection efficiency using the emulsion / DNA complex pretreated with DNA. The highest transfection efficiency is obtained when 1.0 μg of protamine sulfate is used.
【０１１２】 興味深いことは、エマルジョンの代わりに、リボソームを使用する場合、プロ
タミンスルフェートで前処理しても、形質感染効率は増加しないことができる。
また、脂質エマルジョンを遺伝子運搬体として使用する場合、形質感染効率が血
清下でも維持されることができる。Interestingly, when using ribosomes instead of emulsions, pretreatment with protamine sulfate may not increase transfection efficiency.
When a lipid emulsion is used as a gene carrier, the transfection efficiency can be maintained even in serum.
【０１１３】 実施例22 他の細胞株での形質感染効率 実施例19と同様に、DOTAP/DOPE/Tween 80を形質感染試薬として使用して、COS
-1の代わりに、CV-1又はNIH3T3細胞株を使用したことを除いて、実施例8と同様
の方法で形質感染効率を分析した。図１７は、脂質エマルジョンがこれらの細胞
株に対して遺伝子運搬体として使用されることができることを示す。 Example 22 Efficiency of Transfection with Other Cell Lines As in Example 19, COS was performed using DOTAP / DOPE / Tween 80 as a transfection reagent.
The transfection efficiency was analyzed in the same manner as in Example 8, except that CV-1 or NIH3T3 cell line was used instead of -1. FIG. 17 shows that lipid emulsions can be used as a gene carrier for these cell lines.
【０１１４】 実施例23 リファンピシンを含有する脂質エマルジョンの製造 表10の油1g、egg PC 100mg及びPEG2000PE 80mgよりなる油相の成分を完全に溶
解させるため、55℃で加熱した。リファンピシン(10mg)を油相に添加した。10ml
のPBSを添加し、2分間超音波処理してエマルジョンを製造した。実施例1と同様
に、水でエマルジョンを300倍希釈した後、エマルジョン粒子のサイズをMalvern
Zetasizerを用いて測定した(表10)。 Example 23 Preparation of Lipid Emulsion Containing Rifampicin Heating was performed at 55 ° C. to completely dissolve the components of the oil phase consisting of 1 g of the oil shown in Table 10, 100 mg of egg PC and 80 mg of PEG 2000 PE. Rifampicin (10 mg) was added to the oil phase. 10ml
Was added and sonicated for 2 minutes to produce an emulsion. As in Example 1, after diluting the emulsion 300 times with water, the size of the emulsion particles was adjusted to Malvern.
Measured using Zetasizer (Table 10).
【０１１５】[0115]
【表１０】 [Table 10]
【０１１６】 実施例24 脂質エマルジョンからリファンピシンの生体内放出 実施例23で製造したエマルジョン3mlを透析バッグ(dialysis bag)に入れ、ク
ロージャ(closures)で両側を各々縛った。エマルジョンが満たされたバッグを50
mlの渦動水槽に含有された10mlのPBSに浸した。渦動水槽(conical tubes)を37℃
の水浴で振とうして置いた。比較例として、ＰＢＳでのリファピシンの放出速度
を比較した。リファンピシンの濃度は、蛍光分光器で測定した。 図１８に示すように、放出速度は、スクアレンエマルジョンが最も低いし、0
次放出パターンを示した。あまに油エマルジョン及び大豆油エマルジョンに含有
されたリファンピシンの放出速度が最も早い、 Example 24 In Vivo Release of Rifampicin from Lipid Emulsion 3 ml of the emulsion prepared in Example 23 was placed in a dialysis bag, and both sides were tied up with closures. 50 bags filled with emulsion
It was immersed in 10 ml of PBS contained in a ml vortex water bath. 37 ° C in conical tubes
Shaking in a water bath. As a comparative example, the release rates of rifapicin in PBS were compared. Rifampicin concentration was measured with a fluorescence spectrometer. As shown in FIG. 18, the release rate was the lowest for the squalene emulsion,
The next release pattern was shown. The release rate of rifampicin contained in oil emulsion and soybean oil emulsion is the fastest,
【０１１７】 実施例25 ジクロフェナクナトリウムを含有した脂質エマルジョンの製造 リファンピシンの代わりに、ジクロフェナクナトリウム3ｍgを含有することを
除いて、実施例23と同様の方法でエマルジョンを製造した。実施例1と同様に、
水でエマルジョンを300倍希釈した後、エマルジョン粒子のサイズをMalvern Zet
asizerで測定した。 Example 25 Preparation of lipid emulsion containing diclofenac sodium An emulsion was prepared in the same manner as in Example 23 except that 3 mg of diclofenac sodium was used instead of rifampicin. As in Example 1,
After diluting the emulsion 300 times with water, the size of the emulsion particles is reduced by Malvern Zet.
It was measured with an asizer.
【０１１８】[0118]
【表１１】 [Table 11]
【０１１９】 実施例26 脂質エマルジョンからジクロフェナクナトリウムの生体内放出 実施例25で製造したエマルジョンからジクロフェナクナトリウムの生体内放出
実験を実施例26の方法で実施した。比較例として、PBSでのジクロフェナクナト
リウムの放出速度を比較した。ジクロフェナクナトリウムの濃度は、HPLCで測定
した。ジクロフェナクの放出は、ジクロフェナクがリファンピシンより親水性が
あるため、リファンピシンの放出速度より早い。 図１９に示すように、放出速度は、他のエマルジョンよりスクアレンエマルジ
ョンにおいて最も遅い。しかし、放出速度の差異は、リファンピシンの放出場合
より著しくない。また、ジクロフェナク溶液の放出は、 最も早い。 Example 26 In Vivo Release of Diclofenac Sodium from a Lipid Emulsion An in vivo release experiment of diclofenac sodium from the emulsion prepared in Example 25 was carried out by the method of Example 26. As a comparative example, the release rates of diclofenac sodium in PBS were compared. The concentration of diclofenac sodium was measured by HPLC. The release of diclofenac is faster than the release rate of rifampicin because diclofenac is more hydrophilic than rifampicin. As shown in FIG. 19, the release rate is slowest in squalene emulsions than in other emulsions. However, the difference in release rates is less pronounced than with the release of rifampicin. The release of diclofenac solution is the fastest.
【０１２０】 実施例27 致死量測定 致死量を測定するため、実施例2で製造したスクアレンエマルジョンを使用し
た。エマルジョンを1/2、1/4、1/8及び1/16倍希釈して200μlずつBalb/Cマウス6
匹に静脈注射し、24時間後に生存率を観察した。その結果を表12に示す。LD50は
、略1.6g DOTAP/kgである。 Example 27 Measurement of Lethal Dose The squalene emulsion produced in Example 2 was used to measure the lethal dose. Balb / C mouse 6 by diluting the emulsion 1/2, 1/4, 1/8 and 1/16 times and adding 200 μl each
Animals were injected intravenously and survival was observed 24 hours later. Table 12 shows the results. LD 50 is approximately 1.6 g DOTAP / kg.
【０１２１】[0121]
【表１２】 [Table 12]
【０１２２】 実施例28 エマルジョン/DNA複合体の静脈内投与による全身経路遺伝子伝達(
生体内実験) Example 28 Systemic Gene Transfer by Intravenous Administration of Emulsion / DNA Complex (
In vivo experiments)
【０１２３】 リポソーム/DNA複合体だけでなく、エマルジョン/DNA複合体が静脈内に投与さ
れ、全身に伝達された。実施例2で製造した1.7μlの脂質エマルジョンと10μgの
pCMV-luc+との複合体を、30gのBalb/Cマウスの尻尾を通じて静脈注射した。比較
のため、リポソーム/DNA複合体及びnaked DNAをも投与した。各臓器においてル
シフェラーゼの発現を分析するため、約22時間後、マウスを犠牲させた。分析の
ため、心臓、肝、肺、腎臓及び脾臓を分離した。ルシフェラーゼの発現は、プロ
メガ社のプロトコルにより分析した。簡単に説明すると、組織1ｍｇ当たり4μl
の細胞溶解緩衝溶液を添加した後、各々の臓器をホモジナイザで粉砕した。粉砕
された組織を2回の凍結-解凍サイクルを経た後、2分間10000gで遠心分離して、
上澄み液を得た。上澄み液を分析前まで-20℃で保管した。溶液10μlをルシフェ
ラーゼ分析のための緩衝溶液100μlと混合し、相対的な光単位を測定した。図２
０に示すように、各々の臓器での発現率、特に肺での発現率は、遺伝子運搬体と
してスクアレンエマルジョンを使用する時、極めて高い。The emulsion / DNA complex as well as the liposome / DNA complex was administered intravenously and delivered systemically. 1.7 μl of the lipid emulsion prepared in Example 2 and 10 μg of the lipid emulsion
The complex with pCMV-luc + was injected intravenously through the tail of a 30 g Balb / C mouse. For comparison, a liposome / DNA complex and naked DNA were also administered. Mice were sacrificed approximately 22 hours later to analyze luciferase expression in each organ. Heart, liver, lung, kidney and spleen were separated for analysis. Luciferase expression was analyzed according to the Promega protocol. Briefly, 4 μl per mg of tissue
After adding the cell lysis buffer solution, each organ was ground with a homogenizer. After two freeze-thaw cycles, the ground tissue was centrifuged at 10,000g for 2 minutes,
A supernatant was obtained. The supernatant was stored at −20 ° C. before analysis. 10 μl of the solution was mixed with 100 μl of buffer solution for luciferase analysis and the relative light units were measured. FIG.
As shown in FIG. 0, the expression rate in each organ, particularly in the lung, is extremely high when squalene emulsion is used as a gene carrier.
【０１２４】 実施例29 エマルジョン/DNA複合体の静脈内投与による全身経路遺伝子伝達(
生体内実験) Example 29 Systemic Gene Transfer by Intravenous Administration of Emulsion / DNA Complex (
In vivo experiments)
【０１２５】 10.5μlの脂質エマルジョンと50μgのDNAを有する複合体を使用することを除
いて、実施例28と同様の方法で生体内実験を実施した。比較のため、リポソーム
/DNA複合体及びnaked DNAをも投与した。各臓器においてルシフェラーゼの発現
を分析するため、約22時間後、マウスを犠牲させた。分析のため、心臓、肝、肺
、腎臓及び脾臓を分離した。図２１に示すように、各々の臓器での発現率、特に
肺での発現率は、遺伝子運搬体としてスクアレンエマルジョンを使用する時、極
めて高い。The in vivo experiment was performed in the same manner as in Example 28, except that a complex having 10.5 μl of the lipid emulsion and 50 μg of DNA was used. For comparison, liposomes
/ DNA complex and naked DNA were also administered. Mice were sacrificed approximately 22 hours later to analyze luciferase expression in each organ. Heart, liver, lung, kidney and spleen were separated for analysis. As shown in FIG. 21, the expression rate in each organ, particularly in the lung, is extremely high when squalene emulsion is used as a gene carrier.
【０１２６】 実施例30 エマルジョン/DNAの静脈内投与による全身経路遺伝子伝達;PEG構造 を有する乳化剤の影響 Example 30 Systemic Gene Transfer by Intravenous Administration of Emulsion / DNA; Effect of Emulsifier Having PEG Structure
【０１２７】 実施例28と同様の方法で生体内実験を実施した。DNA(10μg)と実施例18と同様
の方法で製造した脂質エマルジョンとにより複合体を形成した。 複合体でのエマルジョンの量は、実施例18において生体内で最大形質感染効率を
示す量で調節された。比較のため、同一の脂質組成を有するリポソームをDNAと
複合体を形成した後、静脈注射した。各臓器においてルシフェラーゼの発現を分
析するため、約22時間後、マウスを犠牲させた。分析のため、心臓、肝、肺、腎
臓及び脾臓を分離した。An in vivo experiment was performed in the same manner as in Example 28. A complex was formed with DNA (10 μg) and the lipid emulsion produced in the same manner as in Example 18. The amount of the emulsion in the complex was adjusted in Example 18 to an amount showing the maximum transfection efficiency in vivo. For comparison, liposomes having the same lipid composition were complexed with DNA and then injected intravenously. Mice were sacrificed approximately 22 hours later to analyze luciferase expression in each organ. Heart, liver, lung, kidney and spleen were separated for analysis.
【０１２８】 DOTAP/DOPE及びDOTAP/DOPE/Tween 80を乳化剤として使用した時、エマルジョ
ンは、リポソームを使用した時より高い形質感染効率を示した。DOTAP/DOPE/Twe en 80エマルジョンは、特に肺において高い形質感染効率を有する。When DOTAP / DOPE and DOTAP / DOPE / Tween 80 were used as emulsifiers, the emulsion showed higher transfection efficiency than when using liposomes. DOTAP / DOPE / Tween 80 emulsion has a high transfection efficiency, especially in the lungs.
【０１２９】 実施例31 エマルジョン/DNAの静脈内投与による全身経路遺伝子伝達;PEG構造 を有する乳化剤の影響 Example 31 Systemic Gene Transfer by Intravenous Administration of Emulsion / DNA; Effect of Emulsifier Having PEG Structure
【０１３０】 実施例28と同様の方法で生体内実験を実施した。DNA(pCMV-luc+ 、10μg)を30
μgのプロタミンスルフェートと複合体を形成させた後、室温で15分間培養した
。実施例18と同様の方法で製造した適当量の脂質エマルジョンを、実施例21の方
法で添加して複合体を形成した。複合体でのエマルジョンの量は、実施例18にお
いて生体内で最大形質感染効率を示す量で調節された。比較のため、同一の脂質
組成を有するリポソームをDNAと複合体を形成させた後、静脈注射した。各臓器
においてルシフェラーゼの発現を分析するため、約22時間後、マウスを犠牲させ
た。分析のため、心臓、肝、肺、腎臓及び脾臓を分離した。DOTAP/DOPE及びDOTA
P/DOPE/Tween 80を乳化剤として使用した時、エマルジョンは、リポソームを使
用した時より高い形質感染効率を示した。DOTAP/DOPE/Tween 80エマルジョンは 、特に肺において高い形質感染効率を有する。An in vivo experiment was performed in the same manner as in Example 28. 30 DNA (pCMV-luc +, 10 μg)
After forming a complex with μg of protamine sulfate, the cells were cultured at room temperature for 15 minutes. An appropriate amount of a lipid emulsion prepared in the same manner as in Example 18 was added by the method of Example 21 to form a complex. The amount of the emulsion in the complex was adjusted in Example 18 to an amount showing the maximum transfection efficiency in vivo. For comparison, liposomes having the same lipid composition were complexed with DNA and then injected intravenously. Mice were sacrificed approximately 22 hours later to analyze luciferase expression in each organ. Heart, liver, lung, kidney and spleen were separated for analysis. DOTAP / DOPE and DOTA
When P / DOPE / Tween 80 was used as an emulsifier, the emulsion showed higher transfection efficiency than when using liposomes. DOTAP / DOPE / Tween 80 emulsion has high transfection efficiency, especially in the lung.
【０１３１】 実施例32 エマルジョン/DNAの鼻腔滴下による遺伝子伝達 実施例2、3及び16のエマルジョン/DNA複合体を鼻腔投与した。DNA(pCMV-luc+
、 20μg)とエマルジョンとの複合体を、Balb/Cマウス(30g)に投与した。比較の
ため、naked DNAだけでなく、リポソーム/DNA複合体を投与した。鼻腔及び肺に
おいてののルシフェラーゼ発現を分析するため、約20時間後、マウスを犠牲させ
た。ルシフェラーゼの発現は、プロメガ社のプロトコルにより測定した。図２４
に示すように、スクアレンエマルジョンは、リポソーム又はnaked DNAより一層
高いルシフェラーゼ発現効率を示した。興味深いことは、DOTAP/DOPEで製造した
スクアレンエマルジョンは、鼻腔において高いルシフェラーゼ発現率を示すが、
DOTAP/DOPE/Tween 80で製造したエマルジョンは、肺においてより有効である。 Example 32 Gene transfer by instillation of emulsion / DNA into nasal cavity The emulsion / DNA complexes of Examples 2, 3 and 16 were administered intranasally. DNA (pCMV-luc +
, 20 μg) and the emulsion were administered to Balb / C mice (30 g). For comparison, liposome / DNA complexes were administered as well as naked DNA. Mice were sacrificed approximately 20 hours later to analyze luciferase expression in the nasal cavity and lungs. Luciferase expression was measured according to the protocol of Promega. FIG.
As shown in the figure, the squalene emulsion showed higher luciferase expression efficiency than liposomes or naked DNA. Interestingly, squalene emulsions made with DOTAP / DOPE show high luciferase expression in the nasal cavity,
Emulsions made with DOTAP / DOPE / Tween 80 are more effective in the lungs.
【０１３２】 実施例33 ジクロフェナミック酸を含有した脂質エマルジョンの製造 リファンピシンの代わりに、3mgのジクロフェナミック酸を含有することを除
いて、実施例23と同様の方法でエマルジョンを製造した。実施例1と同様に、水
でエマルジョンを300倍希釈した後、Malvern Zetasizerを用いて粒子サイズを測
定した。 Example 33 Preparation of lipid emulsion containing diclofenamic acid An emulsion was prepared in the same manner as in Example 23 except that 3 mg of diclofenamic acid was used instead of rifampicin. As in Example 1, after the emulsion was diluted 300-fold with water, the particle size was measured using a Malvern Zetasizer.
【０１３３】[0133]
【表１３】 [Table 13]
【０１３４】 実施例34 脂質エマルジョンからジクロフェナクナトリウムの生体内放出 実施例32で製造したエマルジョンからジクロフェナクナトリウムの生体内放出
を、実施例24と同様の方法で実施した。比較例として、PBSでのジクロフェナク
ナトリウムの放出率を比較した。ジクロフェナクナトリウムの濃度をHPLCで測定
した。 ジクロフェナミック酸は、その塩形態より疎水性が大きい。図２５に示すよう
に、放出率は、他のエマルジョンよりスクアレンエマルジョンが最も低い。 Example 34 In Vivo Release of Diclofenac Sodium from Lipid Emulsion In vivo release of diclofenac sodium from the emulsion prepared in Example 32 was carried out in the same manner as in Example 24. As a comparative example, the release rates of diclofenac sodium in PBS were compared. The concentration of diclofenac sodium was measured by HPLC. Diclofenamic acid is more hydrophobic than its salt form. As shown in FIG. 25, the squalene emulsion has the lowest release rate than other emulsions.
【０１３５】 実施例35 シクロスポリンを含有した固形脂質微粒子の製造 ステアレート 1g、egg PC 100mg及びPEG2000PE 80mgよりなる油相を、成分を
完全に溶解させるため、55℃で加熱した。シクロスポリン(20mg)を55℃で油相に
添加した。10mlのPBSを添加し、2分間超音波処理して固形脂質微粒子を製造した
。実施例1と同様に、水でエマルジョンを300倍希釈した後、エマルジョン粒子の
サイズをMalvern Zetasizerを用いて測定した(表10)。また、リファンピシンの
代わりに、シクロスポリン20mgを含有することを除いて、実施例23と同様の方法
でエマルジョンを製造した。 Example 35 Preparation of Solid Lipid Fine Particles Containing Cyclosporin An oil phase consisting of 1 g of stearate, 100 mg of egg PC and 80 mg of PEG 2000 PE was heated at 55 ° C. to completely dissolve the components. Cyclosporine (20 mg) was added to the oil phase at 55 ° C. 10 ml of PBS was added and subjected to sonication for 2 minutes to produce solid lipid fine particles. As in Example 1, after the emulsion was diluted 300-fold with water, the size of the emulsion particles was measured using a Malvern Zetasizer (Table 10). Further, an emulsion was produced in the same manner as in Example 23, except that 20 mg of cyclosporine was used instead of rifampicin.
【０１３６】[0136]
【表１４】 [Table 14]
【０１３７】 実施例36 シクロスポリンを含有する固形脂質微粒子の凍結乾燥 便利な貯蔵のため、シクロスポリンを含有する固形脂質微粒子を凍結乾燥した
。水に再懸濁された固形脂質微粒子は、約500nmの平均粒子サイズを有する。 Example 36 Freeze-Drying of Solid Lipid Microparticles Containing Cyclosporin For convenient storage, solid lipid microparticles containing cyclosporin were freeze-dried. Solid lipid microparticles resuspended in water have an average particle size of about 500 nm.
【図１】 図1は、種々の油を使用して製造した脂質エマルジョンの平均粒
子サイズと、水及び油間の界面張力との相関関係を示すグラフである。FIG. 1 is a graph showing the correlation between the average particle size of lipid emulsions produced using various oils and the interfacial tension between water and oil.
【図２】 図２は、種々のトリグリセリドを使用して製造した脂質エマルジ
ョンの平均粒子サイズとDLPC濃度との相関関係を示すグラフである。FIG. 2 is a graph showing the correlation between average particle size and DLPC concentration of lipid emulsions produced using various triglycerides.
【図３】 図３は、トリブチリンを使用して製造した脂質エマルジョンの平
均粒子サイズの変化とDLPC濃度との相関関係を示すグラフである。FIG. 3 is a graph showing the correlation between the change in average particle size and the DLPC concentration of a lipid emulsion produced using tributyrin.
【図４】 図４は、トリカプロイン(tricaproin)を使用して製造した脂質エ
マルジョンの平均粒子サイズの変化とDLPC濃度との相関関係を示すグラフである
。FIG. 4 is a graph showing a correlation between a change in average particle size of a lipid emulsion manufactured using tricaproin and a DLPC concentration.
【図５】 図５は、トリカプリルリン(tricaprylin)を使用して製造した脂
質エマルジョンの平均粒子サイズの変化とDLPC濃度との相関関係を示すグラフで
ある。FIG. 5 is a graph showing the correlation between the change in average particle size and the DLPC concentration of a lipid emulsion produced using tricaprylin.
【図６】 図６は、トリブチリンを使用して製造した脂質エマルジョンの平
均粒子サイズと乳化剤の濃度との相関関係を示すグラフである。FIG. 6 is a graph showing the correlation between the average particle size of a lipid emulsion produced using tributyrin and the concentration of an emulsifier.
【図７】 図７は、トリカプロインを使用して製造した脂質エマルジョンの
平均粒子サイズと乳化剤の濃度との相関関係を示すグラフである。FIG. 7 is a graph showing the correlation between the average particle size of a lipid emulsion produced using tricaproin and the concentration of an emulsifier.
【図８】 図８は、トリカプリルリンを使用して製造した脂質エマルジョン
の平均粒子サイズと乳化剤の濃度との相関関係を示すグラフである。FIG. 8 is a graph showing the correlation between the average particle size of a lipid emulsion produced using tricaprylin and the concentration of an emulsifier.
【図９】 図９は、DNAと本発明の脂質エマルジョンとの複合体形成を示す
電気泳動写真である。1μgのpCMV-betaプラスミドと種々の含量の脂質エマルジ
ョンを使用して、複合体を形成した。 レイン1：DNA分子量マーカー（marker）； レイン2：1μgのpCMV-betaプラスミド[7164塩基対(bp)]； レイン3：2μlのリポフェクタミン(lipofectamine)と1μgのpCMV-betaプラス
ミド； レイン4：4μgのDOTAPリポソームと1μgのpCMV-betaプラスミド； レイン5、6、７及び8：各々1、2、4及び6μgのDOTAP／スクアレン脂質エマルジョ
ン及び1μgのpCMV-betaプラスミド； レイン9：4μgのDOTAP/大豆油脂質エマルジョン及び1μgのpCMV-betaプラスミ
ド； レイン10：4μgのDOTAP/あまに油脂質エマルジョン及び1μgのpCMV-betaプラ
スミド；FIG. 9 is an electrophoretic photograph showing the formation of a complex between DNA and the lipid emulsion of the present invention. Complexes were formed using 1 μg of pCMV-beta plasmid and various contents of lipid emulsion. Lane 1: DNA molecular weight marker; Lane 2: 1 μg of pCMV-beta plasmid [7164 base pairs (bp)]; Lane 3: 2 μl of lipofectamine and 1 μg of pCMV-beta plasmid; Lane 4: 4 μg DOTAP liposomes and 1 μg of pCMV-beta plasmid; Lanes 5, 6, 7 and 8: 1, 2, 4 and 6 μg of DOTAP / squalene lipid emulsion and 1 μg of pCMV-beta plasmid, respectively; Lane 9: 4 μg of DOTAP / soybean oil Lipid emulsion and 1 μg of pCMV-beta plasmid; Lane 10: 4 μg of DOTAP / linseed oil lipid emulsion and 1 μg of pCMV-beta plasmid;
【図１０】 図１０は、運搬体／DNA複合体をポリ-L-アスパルト酸(asparti
c acid)と交換反応した後のpCMV-beta電気泳動写真である。 A)リポフェクタミンとDOTAPリポソーム B)あまに油エマルジョン/pCMV-beta複合体 C)大豆油エマルジョン/pCMV-beta複合体；及び D)スクアランエマルジョン/pCMV-beta複合体； レイン1：DNA分子量マーカー； レイン2：1μgのpCMV-betaプラスミド[7164塩基対(bp)]； レイン3：運搬体/pCMV-beta複合体； レイン4-13：運搬体／pCMV-beta複合体と0.625、1.25、2.5、5.0、25、50、10
0、200、400及び800等価のポリ−Ｌ−アスパルト酸(PLLA)を１時間放置した。本
発明において、等価はDNAのリン酸基とPLLAのカルボキシル基間の電荷比を示す
。FIG. 10 shows that the carrier / DNA complex was transformed with poly-L-aspartic acid (asparti).
9 is a photograph of pCMV-beta electrophoresis after an exchange reaction with (c acid). A) lipofectamine and DOTAP liposomes B) linseed oil emulsion / pCMV-beta complex C) soybean oil emulsion / pCMV-beta complex; and D) squalane emulsion / pCMV-beta complex; rain 1: DNA molecular weight marker; rain 2: 1 μg of pCMV-beta plasmid [7164 base pairs (bp)]; Lane 3: Carrier / pCMV-beta complex; Lane 4-13: Carrier / pCMV-beta complex and 0.625, 1.25, 2.5, 5.0 , 25, 50, 10
0, 200, 400 and 800 equivalent poly-L-aspartic acid (PLLA) was left for 1 hour. In the present invention, the equivalent indicates the charge ratio between the phosphate group of DNA and the carboxyl group of PLLA.
【図１１】 図１１は、陽イオン性固形脂質微粒子、DNA及びこれらの複合
体の透過電子顕微鏡(transmission electron micrograph)写真である。 A)pCMV-beta、B)トリラウリン固形脂質微粒子、C)トリラウリン固形脂質微粒
子とpCMV-betaとの複合体（重量比1/1）及び D)トリラウリン固形脂質微粒子と
pCMV-betaとの複合体（重量比2/1）FIG. 11 is a transmission electron micrograph photograph of cationic solid lipid microparticles, DNA and a complex thereof. A) pCMV-beta, B) trilaurin solid lipid fine particles, C) complex of trilaurin solid lipid fine particles and pCMV-beta (weight ratio 1/1) and D) trilaurin solid lipid fine particles.
Complex with pCMV-beta (weight ratio 2/1)
【図１２】 図１２は、リポソームとエマルジョン運搬体の形質感染効率に
ヘルパ脂質DOPEが及ぼす影響を示すグラフである。 A)DOTAP/DOPEリポソーム、b)DOTAP/DOPEスクアレン脂質エマルジョン ■：無血清 □：80%血清FIG. 12 is a graph showing the effect of the helper lipid DOPE on the transfection efficiency of the liposome and the emulsion carrier. A) DOTAP / DOPE liposome, b) DOTAP / DOPE squalene lipid emulsion ■: serum-free □: 80% serum
【図１３】 図１３は、リポソームとエマルジョン運搬体の形質感染効率に
ヘルパー脂質ジオレインが及ぼす影響を示すグラフである。 A)DOTAP/DOPEリポソーム、b)DOTAP/DOPEスクアレン脂質エマルジョン、 ■：無血清 □：80%血清FIG. 13 is a graph showing the effect of the helper lipid diolein on the transfection efficiency of liposomes and emulsion carriers. A) DOTAP / DOPE liposome, b) DOTAP / DOPE squalene lipid emulsion, ■: serum-free □: 80% serum
【図１４】 図１４は、非イオン性界面活性剤であるTween 80の添加による
リポソームとエマルジョン運搬体の形質感染効率変化を示すグラフである。 A)DOTAP/DOPE/Tween 80リポソーム、B)DOTAP/DOPE Tween 80スクアレン脂質エ
マルジョン ■：無血清 □：80%血清FIG. 14 is a graph showing changes in the transfection efficiency of liposomes and emulsion carriers due to the addition of Tween 80, which is a nonionic surfactant. A) DOTAP / DOPE / Tween 80 liposome, B) DOTAP / DOPE Tween 80 squalene lipid emulsion ■: serum-free □: 80% serum
【図１５】 図１５は、Tween 80の添加による脂質エマルジョンの安定性を
示すグラフである。 μ：DOTAP/DOPEスクアレン脂質エマルジョン、λ：DOTAP/DOPE Tween 80スク
アレン脂質エマルジョンFIG. 15 is a graph showing the stability of a lipid emulsion due to the addition of Tween 80. μ: DOTAP / DOPE squalene lipid emulsion, λ: DOTAP / DOPE Tween 80 squalene lipid emulsion
【図１６】 図１６は、プロタミンスルフェートの添加によって脂質伝達体
を使用した形質感染効率での変化を示すグラフである。 A)プロタミンスルフェート b)4μgのDOTAP/DOPE/Tween 80リポソームとプロタ
ミンスルフェート C)4μgのDOTAP/DOPE/Tween 80脂質エマルジョンとプロタミン
スルフェート λ：無血清、μ：80%血清FIG. 16 is a graph showing changes in transfection efficiency using lipid carriers by addition of protamine sulfate. A) Protamine sulfate b) 4 μg of DOTAP / DOPE / Tween 80 liposome and protamine sulfate C) 4 μg of DOTAP / DOPE / Tween 80 lipid emulsion and protamine sulfate λ: serum-free, μ: 80% serum
【図１７】 図１７は、多様な細胞株で種々の脂質遺伝子伝達体を使用した
形質感染効率を示すグラフである。 ■：無血清 □：80%血清FIG. 17 is a graph showing the transfection efficiency using various lipid gene carriers in various cell lines. ■: Serum-free □: 80% serum
【図１８】 図１８は、種々の脂質エマルジョンからリファンピシンの生体
内放出速度の差異を示すグラフである。 ▽：PBS、λ：あまに油エマルジョン、μ：大豆油エマルジョン、τ：スクア
レンエマルジョンFIG. 18 is a graph showing the difference in the rate of in vivo release of rifampicin from various lipid emulsions. ▽: PBS, λ: linseed oil emulsion, μ: soybean oil emulsion, τ: squalene emulsion
【図１９】 図１９は、種々の脂質エマルジョンからジクロフェナクの生体
内放出速度の差異を示すグラフである。 ▽：PBS、λ：あまに油エマルジョン、μ：大豆油エマルジョン、τ：スクア
レンエマルジョンFIG. 19 is a graph showing the difference in in vivo release rates of diclofenac from various lipid emulsions. ▽: PBS, λ: linseed oil emulsion, μ: soybean oil emulsion, τ: squalene emulsion
【図２０】 図２０は、種々の脂質遺伝子伝達体を使用して10μgのDNAを静
脈内に投与した時、生体内形質感染効率を比較したグラフである。FIG. 20 is a graph comparing the efficiency of transfection in vivo when 10 μg of DNA was intravenously administered using various lipid gene carriers.
【図２１】 図２１は、種々の脂質遺伝子伝達体を使用して50μgのDNAを静
脈内に投与した時、生体内形質感染効率を比較したグラフである。FIG. 21 is a graph comparing in vivo transfection efficiencies when 50 μg of DNA was intravenously administered using various lipid gene carriers.
【図２２】 図２２は、種々の脂質遺伝子伝達体を使用してDNAを静脈内に
投与した時、生体内形質感染効率を比較したグラフである：PEG部分を有する乳
化剤の影響。FIG. 22 is a graph comparing the in vivo transfection efficiency when DNA was administered intravenously using various lipid gene carriers: effect of emulsifier with PEG moiety.
【図２３】 図２３は、種々の脂質遺伝子伝達体を使用してDNAを静脈内に
投与した時、生体内形質感染効率を比較したグラフである：プロタミンスルフェ
ートの影響FIG. 23 is a graph comparing the in vivo transfection efficiency when DNA is intravenously administered using various lipid gene carriers: the effect of protamine sulfate
【図２４】 図２４は、種々の脂質遺伝子伝達体を使用してDNAを鼻腔内滴
下(intranasal instillation)で投与した時、生体内形質感染効率を比較したグ
ラフである。FIG. 24 is a graph comparing the transfection efficiency in vivo when DNA was administered by intranasal instillation using various lipid gene carriers.
【図２５】 図２５は、種々の脂質エマルジョンからダイクロフェナミック
酸（diclofenamic acid）の生体内放出速度の差異を示すグラフである。 ▽：PBS、λ：あまに油エマルジョン、μ：大豆油エマルジョン、τ：スクア
レンエマルジョンFIG. 25 is a graph showing the difference in in vivo release rate of diclofenamic acid from various lipid emulsions. ▽: PBS, λ: linseed oil emulsion, μ: soybean oil emulsion, τ: squalene emulsion
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書[Procedural Amendment] Submission of translation of Article 34 Amendment of the Patent Cooperation Treaty
【提出日】平成１２年２月２８日（２０００．２．２８）[Submission date] February 28, 2000 (2000.2.28)
【手続補正１】[Procedure amendment 1]
【補正対象書類名】明細書[Document name to be amended] Statement
【補正対象項目名】特許請求の範囲[Correction target item name] Claims
【補正方法】変更[Correction method] Change
【補正内容】[Correction contents]
【特許請求の範囲】[Claims]
【請求項８０】 免疫抑制剤がシクロスポリンＡである請求項６９に記載の80. The method according to claim 69, wherein the immunosuppressant is cyclosporin A.
複合体。Complex.
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書[Procedural Amendment] Submission of translation of Article 34 Amendment of the Patent Cooperation Treaty
【提出日】平成１２年９月２５日（２０００．９．２５）[Submission date] September 25, 2000 (2000.9.25)
【手続補正１】[Procedure amendment 1]
【補正対象書類名】明細書[Document name to be amended] Statement
【補正対象項目名】特許請求の範囲[Correction target item name] Claims
【補正方法】変更[Correction method] Change
【補正内容】[Correction contents]
【特許請求の範囲】[Claims]
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 31/5585 Ａ６１Ｋ 31/5585 31/566 31/566 31/57 31/57 47/10 47/10 47/14 47/14 47/18 47/18 47/24 47/24 47/28 47/28 47/30 47/30 47/34 47/34 47/42 47/42 47/44 47/44 47/46 47/46 Ａ６１Ｐ 31/12 Ａ６１Ｐ 31/12 37/06 37/06 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，Ｇ Ｅ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ， ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，Ｍ Ｗ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ， ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，Ｚ Ｗ (72)発明者 クォン イック チャン 大韓民国 ソウル 130−230 ノウォンク ハゲドン シヨンアパート 706−704 274 (72)発明者 ジョン ヘイソン 大韓民国 インチョン 405−240 ナンド ンク マンスドン ジュコンアパート 201−1005 Ｆターム(参考） 4C076 AA17 AA29 DD16 DD34 DD38 DD45 DD46 DD48 DD63 DD70 EE16 EE23 EE41 EE51 FF32 FF34 FF63 4C086 AA02 DA01 DA06 DA08 DA10 MA05 MA22 MA43 MA65 NA03 NA11 NA13 ZA02 ZA08 ZB08 ZB11 ZB26 ZB33 ZB35 ZC03 ZC12 4C206 AA02 DA05 DA12 FA31 MA05 MA42 MA63 MA85 NA03 NA11 NA13 ZB33 ZC23 ──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page (51) Int.Cl. 7 Identification symbol FI Theme coat ゛ (Reference) A61K 31/5585 A61K 31/5585 31/566 31/566 31/57 31/57 47/10 47/10 47 / 14 47/14 47/18 47/18 47/24 47/24 47/28 47/28 47/30 47/30 47/34 47/34 47/42 47/42 47/44 47/44 47/46 47/46 A61P 31/12 A61P 31/12 37/06 37/06 (81) Designated country EP (AT, BE, CH, CY, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT , LU, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, GW, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (GH, GM) , KE, LS, MW, SD, SL, SZ, UG, ZW), EA (AM, AZ, BY, KG, KZ, MD, RU, T , TM), AE, AL, AM, AT, AU, AZ, BA, BB, BG, BR, BY, CA, CH, CN, CU, CZ, DE, DK, EE, ES, FI, GB, GD, GE, GH, GM, HR, HU, ID, IL, IN, IS, JP, KE, KG, KP, KZ, LC, LK, LR, LS, LT, LU, LV, MD, MG, MK, MN , MW, MX, NO, NZ, PL, PT, RO, RU, SD, SE, SG, SI, SK, SL, TJ, TM, TR, TT, UA, UG, US, UZ, VN, YU, ZA, ZW (72) Inventor Kwon Ik Chang Seoul South Korea 130-230 Nowong Hagedon Shillong Apartment 706-704 274 (72) Inventor John Hayson South Korea Incheon 405-240 Nandong Mansdon Jukong Apartment 201-1005 F Term (Reference) 4C 076 AA17 AA29 DD16 DD34 DD38 DD45 DD46 DD48 DD63 DD70 EE16 EE23 EE41 EE51 FF32 FF34 FF63 4C086 AA02 DA01 DA06 DA08 DA10 MA05 MA22 MA43 MA65 NA03 NA11 NA13 ZA02 ZA08 ZB08 ZB11 ZB26 ZB33 ZB35 MA03 DA03 DA03 NA11 NA13 ZB33 ZC23
Claims (78)
む1種以上の乳化剤0.01-20％と、残量の水とよりなることを特徴とする脂質エマ
ルジョン。1. A lipid emulsion comprising 2-30% of a non-triglyceride oil, 0.01-20% of one or more emulsifiers containing a cationic surfactant, and the balance of water.
系脂肪又はエチルステアレート2-30％と、陽イオン性界面活性剤を含む1種以上
の乳化剤0.01-20％と、残量の水とよりなることを特徴とする固形脂質微粒子。2. 2-30% of a triglyceride-based fat or ethyl stearate having 10-18 carbon atoms in each hydrophobic tail, and 0.01-20% of one or more emulsifiers containing a cationic surfactant. Solid lipid microparticles comprising water and the remaining amount of water.
20％と、脂溶性又は両親媒性薬物0.1-10％と、残量の水とよりなることを特徴と
する薬物含有脂質エマルジョン。3. Squalene or squalane 2-30% and one or more emulsifiers 0.01-
A drug-containing lipid emulsion comprising 20%, 0.1-10% of a fat-soluble or amphiphilic drug, and the remaining amount of water.
、脂溶性又は両親媒性薬物0.1-10％と、残量の水とよりなることを特徴とする薬
物含有固形脂質微粒子。4. A composition comprising 2-30% of ethyl stearate, 0.01-20% of one or more emulsifiers, 0.1-10% of a fat-soluble or amphiphilic drug, and the balance of water. Drug-containing solid lipid microparticles.
合して水相を製造する第１段階と、(b)前記水相と非トリグリセリド系油2-30％
を混合してエマルジョンを製造する第２段階とを含むことを特徴とする脂質エマ
ルジョンの製造方法。5. A first step in which (a) a water phase is prepared by mixing 0.01 to 20% of one or more emulsifiers containing a cationic emulsifier, and (b) the water phase and a non-triglyceride oil 30%
And a second step of producing an emulsion by mixing the same.
とを混合して水相を製造する第1段階と、(b)前記水相と各々の疎水性尾に10-18
の炭素原子を有するトリグリセリド系脂肪又はエチルステアレート2-30％とを混
合する第2段階とを含むことを特徴とする固形脂質微粒子の製造方法。6. A first step of (a) mixing 0.01 to 20% of one or more emulsifiers containing a cationic emulsifier with water to produce an aqueous phase, and (b) said aqueous phase and each hydrophobic phase. 10-18 on the sex tail
A second step of mixing a triglyceride-based fat having 2 to 30 carbon atoms or ethyl stearate in an amount of 2 to 30%.
する第1段階と、(b)脂溶性又は両親媒性薬物0.1-10％と非トリグリセリド系油2-
30％とを混合して油相を製造する第2段階と、(c)前記第1段階の水相と第2段階の
油相とを混合して薬物含有エマルジョンを製造する第3段階とを含むことを特徴
とする薬物含有脂質エマルジョンの製造方法。7. A first step of preparing an aqueous phase by mixing (a) 0.01-20% of one or more emulsifiers with water and (b) 0.1-10% of a fat-soluble or amphiphilic drug. Triglyceride oil 2-
(C) mixing the aqueous phase of the first step and the oil phase of the second step to produce a drug-containing emulsion. A method for producing a drug-containing lipid emulsion, comprising:
する第1段階と、(b)脂溶性又は両親媒性薬物0.1-10％とエチルステアレート2-30
％とを混合して油相を製造する第2段階と、(c)前記第1段階の水相と前記第2段階
の油相とを混合して薬物含有固形脂質微粒子を製造する第3段階とを含むことを
特徴とする薬物含有固形脂質微粒子の製造方法。8. A first step of (a) mixing 0.01-20% of one or more emulsifiers with water to produce an aqueous phase, and (b) 0.1-10% of a fat-soluble or amphiphilic drug and ethyl Stearate 2-30
% To produce an oil phase, and (c) a third step of producing the drug-containing solid lipid microparticles by mixing the first-stage aqueous phase and the second-stage oil phase. A method for producing drug-containing solid lipid fine particles, comprising:
質0.01-10％をさらに含むことを特徴とする請求項1に記載の脂質エマルジョン。9. The lipid emulsion according to claim 1, wherein the lipid emulsion further comprises 0.01-10% of a hydrophilic polymer or hydrophilic polymer lipid.
アランであることを特徴とする請求項1に記載の脂質エマルジョン。10. The lipid emulsion according to claim 1, wherein the non-triglyceride-based oil in step (a) is squalene or squalane.
さらに含むことを特徴とする請求項1、9又は10に記載の脂質エマルジョン。11. The lipid emulsion according to claim 1, further comprising a phospholipid or a nonionic surfactant as the emulsifier.
リメチルアンモニウムプロパン、1,2-ジパルミトイル-3-トリメチルアンモニウ
ムプロパン、1,2-ジステアロイル-3-トリメチルアンモニウムプロパン、1,2-ジ
オレオイル-3-トリメチルアンモニウムプロパン、1,2-ジミリストイル-3-ジメチ
ルアンモニウムプロパン、1,2-ジパルミトイル-3-ジメチルアンモニウムプロパ
ン、1,2-ジラウロイル-3-ジメチルアンモニウムプロパン、1,2-ジステアロイル-
3-ジメチルアンモニウムプロパン、ジメチルジオクタデシルアンモニウムクロラ
イド、N-[1-(1,2-ジオレオイルオキシ)プロピル]-N,N,N-トリメチルアンモニウ
ムクロライド、1,2-ジオレオイル-3-エチルホスホコリン及び他の陽イオン性リ
ン脂質よりなる群から選ばれることを特徴とする請求項1に記載の脂質エマルジ
ョン。12. The cationic surfactant may be 1,2-dimyristoyl-3-trimethylammonium propane, 1,2-dipalmitoyl-3-trimethylammonium propane, 1,2-distearoyl-3-trimethyl Ammonium propane, 1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium propane, 1,2-dimyristoyl-3-dimethylammonium propane, 1,2-dipalmitoyl-3-dimethylammonium propane, 1,2-dilauroyl-3-dimethyl Ammonium propane, 1,2-distearoyl-
3-dimethylammonium propane, dimethyldioctadecyl ammonium chloride, N- [1- (1,2-dioleoyloxy) propyl] -N, N, N-trimethylammonium chloride, 1,2-dioleoyl-3-ethylphospho 2. The lipid emulsion according to claim 1, wherein the lipid emulsion is selected from the group consisting of choline and other cationic phospholipids.
(fusogenic)ペプチドをさらに含むことを特徴とする請求項1、9又は10に記載の
脂質エマルジョン。13. The method according to claim 13, wherein the lipid emulsion is glycerol or fusogenic.
11. The lipid emulsion according to claim 1, further comprising a (fusogenic) peptide.
リエチレングリコール又はHA gp41であることを特徴とする請求項13に記載の脂
質エマルジョン。14. The lipid emulsion according to claim 13, wherein the fusogenic peptide is polyethylene glycol having an average molecular weight of 500-1000 or HA gp41.
キサゾリン及びポリエチレングリコールよりなる群から選ばれることを特徴とす
る請求項9に記載の脂質エマルジョン。15. The lipid emulsion according to claim 9, wherein the hydrophilic polymer is selected from the group consisting of polyoxyethylene, polyethyloxazoline and polyethylene glycol.
エタノールアミン、ホスファチジルセリン、ジアセチル化されたリン脂質及びこ
れらの誘導体よりなる群から選ばれ、前記非イオン性界面活性剤は、ポロキサマ
(poloxamer)、ソルビタンエステル、ポリオキシエチレン-ソルビタン脂肪酸エス
テル及びポリオキシエチレンエテール類よりなる群から選ばれることを特徴とす
る請求項11に記載の脂質エマルジョン。16. The phospholipid is selected from the group consisting of phosphatidylcholine, phosphatidylethanolamine, phosphatidylserine, diacetylated phospholipids and derivatives thereof, and the nonionic surfactant is poloxamer.
12. The lipid emulsion according to claim 11, wherein the lipid emulsion is selected from the group consisting of (poloxamer), sorbitan ester, polyoxyethylene-sorbitan fatty acid ester, and polyoxyethylene ethers.
タノールアミン、ジオレイン、脂肪アルコール、コレステロール及び胆汁酸より
なる群から選ばれることを特徴とする請求項11に記載の脂質エマルジョン。17. The lipid according to claim 11, wherein the emulsifier is selected from the group consisting of 1,2-dioleoyl-sn-3-phosphatidylethanolamine, diolein, fatty alcohol, cholesterol, and bile acid. Emulsion.
質0.01-10％をさらに含むことを特徴とする請求項2に記載の固形脂質微粒子。18. The solid lipid fine particles according to claim 2, wherein the solid lipid fine particles further contain 0.01 to 10% of a hydrophilic polymer or a hydrophilic polymer lipid.
に含むことを特徴とする請求項2に記載の固形脂質微粒子。19. The solid lipid fine particles according to claim 2, wherein the emulsifier further comprises a phospholipid or a nonionic surfactant.
リメチルアンモニウムプロパン、1,2-ジパルミトイル-3-トリメチルアンモニウ
ムプロパン、1,2-ジステアロイル-3-トリメチルアンモニウムプロパン、1,2-ジ
オレオイル-3-トリメチルアンモニウムプロパン、1,2-ジミリストイル-3-ジメチ
ルアンモニウムプロパン、1,2-ジパルミトイル-3-ジメチルアンモニウムプロパ
ン、1,2-ジラウロイル-3-ジメチルアンモニウムプロパン、1,2-ジステアロイル-
3-ジメチルアンモニウムプロパン、ジメチルジオクタデシルアンモニウムクロラ
イド、N-[1-(1,2-ジオレオイルオキシ)プロピル]-N,N,N-トリメチルアンモニウ
ムクロライド、1,2-ジオレオイル-3-エチルホスホコリン及び他の陽イオン性リ
ン脂質よりなる群から選ばれることを特徴とする請求項2に記載の固形脂質微粒
子。20. The cationic surfactant may be 1,2-dimyristoyl-3-trimethylammonium propane, 1,2-dipalmitoyl-3-trimethylammonium propane, 1,2-distearoyl-3-trimethyl Ammonium propane, 1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium propane, 1,2-dimyristoyl-3-dimethylammonium propane, 1,2-dipalmitoyl-3-dimethylammonium propane, 1,2-dilauroyl-3-dimethyl Ammonium propane, 1,2-distearoyl-
3-dimethylammonium propane, dimethyldioctadecyl ammonium chloride, N- [1- (1,2-dioleoyloxy) propyl] -N, N, N-trimethylammonium chloride, 1,2-dioleoyl-3-ethylphospho 3. The solid lipid fine particles according to claim 2, wherein the solid lipid fine particles are selected from the group consisting of choline and other cationic phospholipids.
ペプチドをさらに含むことを特徴とする請求項2に記載の固形脂質微粒子。21. The solid lipid fine particles according to claim 2, wherein the lipid emulsion further contains glycerol or a fusogenic peptide.
リエチレングリコール又はHA gp41であることを特徴とする請求項21に記載の固
形脂質微粒子。22. The solid lipid microparticles according to claim 21, wherein the Fusinissi peptide is polyethylene glycol or HA gp41 having an average molecular weight of 500-1000.
キサゾリン及びポリエチレングリコールよりなる群から選ばれることを特徴とす
る請求項18に記載の固形脂質微粒子。23. The solid lipid fine particles according to claim 18, wherein the hydrophilic polymer is selected from the group consisting of polyoxyethylene, polyethyloxazoline and polyethylene glycol.
エタノールアミン、ホスファチジルセリン、ジアセチル化されたリン脂質及びこ
れらの誘導体よりなる群から選ばれ、前記非イオン性界面活性剤は、ポロキサマ
、ソルビタンエステル、ポリオキシエチレン-ソルビタン脂肪酸エステル及びポ
リオキシエチレンエテール類よりなる群から選ばれることを特徴とする請求項19
に記載の固形脂質微粒子。24. The phospholipid is selected from the group consisting of phosphatidylcholine, phosphatidylethanolamine, phosphatidylserine, diacetylated phospholipids and derivatives thereof, and the nonionic surfactant is poloxamer, sorbitan ester, 20. It is selected from the group consisting of polyoxyethylene-sorbitan fatty acid esters and polyoxyethylene ethers.
The solid lipid fine particles according to the above.
タノールアミン、ジオレイン、脂肪アルコール、コレステロール及び胆汁酸より
なる群から選ばれることを特徴とする請求項2に記載の固形脂質微粒子。25. The solid according to claim 2, wherein the emulsifier is selected from the group consisting of 1,2-dioleoyl-sn-3-phosphatidylethanolamine, diolein, fatty alcohol, cholesterol and bile acids. Lipid fine particles.
性高分子脂質0.01-10％をさらに含むことを特徴とする請求項3に記載の薬物含有
脂質エマルジョン。26. The drug-containing lipid emulsion according to claim 3, wherein the drug-containing lipid emulsion further contains 0.01 to 10% of a hydrophilic polymer or a hydrophilic polymer lipid.
に含むことを特徴とする請求項3に記載の薬物含有脂質エマルジョン。27. The drug-containing lipid emulsion according to claim 3, wherein the emulsifier further comprises a phospholipid or a nonionic surfactant.
記載の薬物含有脂質エマルジョン。28. The drug-containing lipid emulsion according to claim 27, wherein the emulsifier is a phospholipid.
び陰イオン性リン脂質よりなる群から選ばれることを特徴とする薬物含有脂質エ
マルジョン。29. A drug-containing lipid emulsion, wherein the surfactant is selected from the group consisting of cationic phospholipids, neutral phospholipids and anionic phospholipids.
ックペプチド又は蛋白質をさらに含むことを特徴とする請求項3に記載の薬物含
有脂質エマルジョン。30. The drug-containing lipid emulsion according to claim 3, wherein the drug-containing lipid emulsion further comprises glycerol, fusogenic peptide or protein.
リエチレングリコール又はHA gp41であることを特徴とする請求項30に記載の薬
物含有脂質エマルジョン。31. The drug-containing lipid emulsion according to claim 30, wherein the fusogenic peptide is polyethylene glycol having an average molecular weight of 500-1000 or HA gp41.
キサゾリン及びポリエチレングリコールよりなる群から選ばれることを特徴とす
る請求項26に記載の薬物含有脂質エマルジョン。32. The drug-containing lipid emulsion according to claim 26, wherein the hydrophilic polymer is selected from the group consisting of polyoxyethylene, polyethyloxazoline and polyethylene glycol.
エタノールアミン、ホスファチジルセリン、ジアセチル化されたリン脂質及びこ
れらの誘導体よりなる群から選ばれ、前記非イオン性界面活性剤は、ポロキサマ
、ソルビタンエステル、ポリオキシエチレン-ソルビタン脂肪酸エステル及びポ
リオキシエチレンエテール類よりなる群から選ばれることを特徴とする請求項28
に記載の薬物含有脂質エマルジョン。33. The phospholipid is selected from the group consisting of phosphatidylcholine, phosphatidylethanolamine, phosphatidylserine, diacetylated phospholipids and derivatives thereof, and the nonionic surfactant is poloxamer, sorbitan ester, 29. The method according to claim 28, which is selected from the group consisting of polyoxyethylene-sorbitan fatty acid esters and polyoxyethylene ethers.
3. The drug-containing lipid emulsion according to 1.).
ノールアミン、ジオレイン、脂肪アルコール、コレステロール及び胆汁酸よりな
る群から選ばれることを特徴とする請求項3に記載の薬物含有脂質エマルジョン
。34. The drug-containing composition according to claim 3, wherein the emulsifier is selected from the group consisting of 1,2-dioleoyl-sn-3-phosphatidylethanolamine, diolein, fatty alcohol, cholesterol, and bile acid. Lipid emulsion.
ド系消炎剤、非ステロイド系消炎剤、抗生剤、抗真菌剤、ビタミン、ホルモン、
レチノイン酸、プロスタグラジン、ブロスタサイクリン、抗ガン剤、抗代謝剤、
縮瞳剤、コリン作動性物質、アドレナリン拮抗剤、抗痙攣剤、抗不安剤、強トラ
ンキライザ、抗憂鬱剤、麻酔剤、鎮痛剤、同化性ステロイド剤、エストロゲン、
プロゲステロン、グリコサミノグリカン、ポリヌクレオチド、免疫抑制剤及び免
疫促進剤とよりなる群から選ばれることを特徴とする請求項3に記載の薬物含有
脂質エマルジョン。35. The lipophilic or amphipathic drug may be an antiviral, a steroidal anti-inflammatory, a non-steroidal anti-inflammatory, an antibiotic, an antifungal, a vitamin, a hormone,
Retinoic acid, prostaglandin, brostacyclin, anticancer drugs, antimetabolites,
Miotics, cholinergic substances, adrenergic antagonists, anticonvulsants, anxiolytics, strong tranquilizers, antidepressants, anesthetics, analgesics, anabolic steroids, estrogens,
4. The drug-containing lipid emulsion according to claim 3, wherein the emulsion is selected from the group consisting of progesterone, glycosaminoglycan, polynucleotide, immunosuppressant and immunostimulant.
フェナミック酸であることを特徴とする請求項35に記載の薬物含有脂質エマルジ
ョン。36. The drug-containing lipid emulsion according to claim 35, wherein the antiviral agent is diclofenac sodium or diclofenamic acid.
る請求項35に記載の薬物含有脂質エマルジョン。37. The drug-containing lipid emulsion according to claim 35, wherein the immunosuppressant is cyclosporin A.
含むことを特徴とする請求項3に記載の薬物含有脂質エマルジョン。38. The drug-containing lipid emulsion according to claim 3, wherein the lipid emulsion further contains a water-soluble drug in an aqueous phase thereof.
高分子脂質0.01-10％をさらに含むことを特徴とする請求項4に記載の薬物含有固
形脂質微粒子。39. The drug-containing solid lipid fine particles according to claim 4, wherein the drug-containing solid lipid fine particles further contain 0.01 to 10% of a hydrophilic polymer or a hydrophilic polymer lipid.
に含むことを特徴とする請求項4に記載の薬物含有固形脂質微粒子。40. The drug-containing solid lipid fine particles according to claim 4, wherein the emulsifier further comprises a phospholipid or a nonionic surfactant.
記載の薬物含有固形脂質微粒子。41. The drug-containing solid lipid fine particles according to claim 40, wherein the emulsifier is a phospholipid.
陰イオン性リン脂質よりなる群から選ばれることを特徴とする請求項41に記載の
薬物含有固形脂質微粒子。42. The drug-containing solid lipid fine particles according to claim 41, wherein the phospholipid is selected from the group consisting of a cationic phospholipid, a neutral phospholipid, and an anionic phospholipid.
ックペプチド又は蛋白質をさらに含むことを特徴とする請求項4に記載の薬物含
有固形脂質微粒子。43. The drug-containing solid lipid fine particles according to claim 4, wherein the drug-containing solid lipid fine particles further contain glycerol, fusogenic peptide or protein.
リエチレングリコール又はHA gp41であることを特徴とする請求項43に記載の薬
物含有固形脂質微粒子。44. The drug-containing solid lipid microparticle according to claim 43, wherein the fusogenic peptide is polyethylene glycol or HA gp41 having an average molecular weight of 500-1000.
キサゾリン及びポリエチレングリコールよりなる群から選ばれることを特徴とす
る請求項39に記載の薬物含有固形脂質微粒子。45. The drug-containing solid lipid fine particles according to claim 39, wherein the hydrophilic polymer is selected from the group consisting of polyoxyethylene, polyethyloxazoline and polyethylene glycol.
エタノールアミン、ホスファチジルセリン、ジアセチル化されたリン脂質及びこ
れらの誘導体よりなる群から選ばれ、前記非イオン性界面活性剤は、ポロキサマ
、ソルビタンエステル、ポリオキシエチレン-ソルビタン脂肪酸エステル及びポ
リオキシエチレンエテール類よりなる群から選ばれることを特徴とする請求項41
に記載の薬物含有固形脂質微粒子。46. The phospholipid is selected from the group consisting of phosphatidylcholine, phosphatidylethanolamine, phosphatidylserine, diacetylated phospholipids and derivatives thereof, and the nonionic surfactant is poloxamer, sorbitan ester, 42. The composition according to claim 41, which is selected from the group consisting of polyoxyethylene-sorbitan fatty acid esters and polyoxyethylene ethers.
3. The drug-containing solid lipid fine particles according to item 1.
タノールアミン、ジオレイン、脂肪アルコール、コレステロール及び胆汁酸より
なる群から選ばれることを特徴とする請求項4に記載の薬物含有固形脂質微粒子
。47. The drug according to claim 4, wherein the emulsifier is selected from the group consisting of 1,2-dioleoyl-sn-3-phosphatidylethanolamine, diolein, fatty alcohol, cholesterol, and bile acid. Containing solid lipid microparticles.
ド系消炎剤、非ステロイド系消炎剤、抗生剤、抗真菌剤、ビタミン、ホルモン、
レチノイン酸、プロスタグラジン、ブロスタサイクリン、抗ガン剤、抗代謝剤、
縮動剤、コリン作動性物質、アドレナリン拮抗剤、抗痙攣剤、抗不安剤、強トラ
ンキライザ、抗憂鬱剤、麻酔剤、鎮痛剤、同化性ステロイド剤、エストロゲン、
プロゲステロン、グリコサミノグリカン、ポリヌクレオチド、免疫抑制剤及び免
疫促進剤とよりなる群から選ばれることを特徴とする請求項4に記載の薬物含有
固形脂質微粒子。48. The lipophilic or amphiphilic drug may be an antiviral, steroidal anti-inflammatory, non-steroidal anti-inflammatory, antibiotic, anti-fungal, vitamin, hormone,
Retinoic acid, prostaglandin, brostacyclin, anticancer drugs, antimetabolites,
Vasoactive agents, cholinergic substances, adrenergic antagonists, anticonvulsants, anxiolytics, strong tranquilizers, antidepressants, anesthetics, analgesics, anabolic steroids, estrogens,
5. The drug-containing solid lipid fine particles according to claim 4, wherein the particles are selected from the group consisting of progesterone, glycosaminoglycans, polynucleotides, immunosuppressants and immunostimulants.
フェナミック酸であることを特徴とする請求項48に記載の薬物含有固形脂質微粒
子。49. The drug-containing solid lipid fine particles according to claim 48, wherein the antiviral agent is diclofenac sodium or diclofenamic acid.
る請求項49に記載の薬物含有固形脂質微粒子。50. The drug-containing solid lipid fine particles according to claim 49, wherein the immunosuppressant is cyclosporin A.
むことを特徴とする請求項4に記載の薬物含有固形脂質微粒子。51. The drug-containing solid lipid fine particles according to claim 4, wherein the solid lipid fine particles further contain a water-soluble drug in an aqueous phase thereof.
、リボソーム、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド及び他の薬剤学的薬物よ
りなる群から選ばれた生理活性物質との複合体。52. A complex of the emulsion of claim 1 and a physiologically active substance selected from the group consisting of DNA, RNA, antisense nucleic acids, ribosomes, polynucleotides, oligonucleotides and other pharmaceutical drugs.
ため、糖脂質、リポペプチド、抗体、収容体に対するリガンド又はウイルス性蛋
白質をさらに含むことを特徴とする請求項52に記載の複合体。53. The method according to claim 52, wherein the complex further comprises a glycolipid, a lipopeptide, an antibody, a ligand for a receptor or a viral protein for targeting to a specific cell or organ. Complex.
イオン性ポリマーをさらに含むことを特徴とする請求項52又は53に記載の複合体
。54. The conjugate according to claim 52 or 53, wherein said conjugate further comprises protamine sulfate, histone or a cationic polymer.
する請求項54に記載の複合体。55. The conjugate of claim 54, wherein said cationic polymer is polylysine.
する請求項52に記載の複合体。56. The complex according to claim 52, wherein said complex further comprises a monovalent or polyvalent salt.
染された細胞、上皮細胞、内皮細胞、筋肉細胞、肝細胞、内分泌線細胞、神経細
胞、皮膚細胞、性細胞、卵母細胞、***、造血細胞、胎細胞、Ｍ細胞、ランゲル
ハンス島細胞、大食細胞、植物細胞、動物細胞及び不朽化細胞株よりなる群から
選ばれることを特徴とする請求項53に記載の複合体。57. The cells, wherein the cells are leukocytes, fibroblasts, cancer cells, virus-infected cells, epithelial cells, endothelial cells, muscle cells, hepatocytes, endocrine cells, nerve cells, skin cells, sex cells, eggs The composite according to claim 53, wherein the composite is selected from the group consisting of mother cells, spermatozoa, hematopoietic cells, fetal cells, M cells, islet cells of Langerhans, macrophages, plant cells, animal cells, and immortalized cell lines. body.
非経口又は局所投与により、又は特定器官への直接投与により細胞内に伝達され
ることを特徴とする請求項52に記載の複合体。58. The method of claim 58, wherein the complex is intravenous, intramuscular, intranasal, intraorgan, subcutaneous,
53. The conjugate of claim 52, wherein the conjugate is delivered intracellularly by parenteral or topical administration, or by direct administration to a particular organ.
請求項1の細胞を使用する方法。59. A method for transmitting DNA or a physiologically active substance to a target cell,
A method of using the cell of claim 1.
含むことを特徴とする請求項52に記載の複合体。60. The complex of claim 52, wherein said complex further comprises a lipophilic or amphiphilic drug in the oil phase.
載の複合体。61. The conjugate of claim 60, wherein said drug is an anticancer drug.
酸、リボソーム、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド及び他の薬剤学的薬物
よりなる群から選ばれた生理活性物質との複合体。62. A complex of the solid lipid microparticle of claim 2 and a physiologically active substance selected from the group consisting of DNA, RNA, antisense nucleic acid, ribosome, polynucleotide, oligonucleotide and other pharmaceutical drugs. .
ため、糖脂質、リポペプチド、抗体、収容体に対するリガンド又はウイルス性蛋
白質をさらに含むことを特徴とする請求項62に記載の複合体。63. The method of claim 62, wherein the complex further comprises a glycolipid, a lipopeptide, an antibody, a ligand for a receptor, or a viral protein for targeting to a specific cell or organ. Complex.
イオン性ポリマーをさらに含むことを特徴とする請求項62又は63に記載の複合体
。64. The conjugate according to claim 62 or 63, wherein said conjugate further comprises protamine sulfate, histone or a cationic polymer.
する請求項64に記載の複合体。65. The conjugate of claim 64, wherein said cationic polymer is polylysine.
する請求項62に記載の複合体。66. The complex according to claim 62, wherein the complex further comprises a monovalent or polyvalent salt.
染された細胞、上皮細胞、内皮細胞、筋肉細胞、肝細胞、内分泌線細胞、神経細
胞、皮膚細胞、性細胞、卵母細胞、***、造血細胞、胎細胞、Ｍ細胞、ランゲル
ハンス島細胞、大食細胞、植物細胞、動物細胞及び不朽化細胞株よりなる群から
選ばれることを特徴とする請求項63に記載の複合体。67. The cell, wherein the cell is a leukocyte, a fibroblast, a cancer cell, a cell infected with a virus, an epithelial cell, an endothelial cell, a muscle cell, a hepatocyte, an endocrine cell, a nerve cell, a skin cell, a sex cell, an egg 64. The composite of claim 63, wherein the composite is selected from the group consisting of mother cells, spermatozoa, hematopoietic cells, fetal cells, M cells, Langerhans islet cells, macrophages, plant cells, animal cells, and immortalized cell lines. body.
非経口又は局所投与により、又は特定器官への直接投与により細胞内に伝達され
ることを特徴とする請求項62に記載の複合体。68. The method according to claim 68, wherein the complex is intravenous, intramuscular, intranasal, intraorgan, subcutaneous,
63. The conjugate of claim 62, which is delivered intracellularly by parenteral or topical administration, or by direct administration to a particular organ.
含むことを特徴とする請求項52に記載の複合体。69. The complex of claim 52, wherein the complex further comprises a fat-soluble or amphiphilic drug in fat.
載の複合体。70. The conjugate according to claim 69, wherein said drug is an anti-cancer drug.
％をさらに含むことを特徴とする請求項5に記載の脂質エマルジョンの製造方法
。71. The aqueous phase, wherein the hydrophilic polymer or the hydrophilic polymer lipid is 0.01-10.
6. The method for producing a lipid emulsion according to claim 5, further comprising%.
％をさらに含むことを特徴とする請求項6に記載の固形脂質微粒子の製造方法。72. The method according to claim 72, wherein the aqueous phase is a hydrophilic polymer or a hydrophilic polymer lipid.
7. The method for producing solid lipid microparticles according to claim 6, further comprising%.
％をさらに含むことを特徴とする請求項7に記載の薬物含有脂質エマルジョンの
製造方法。73. The aqueous phase contains a hydrophilic polymer or a hydrophilic polymer lipid 0.01-10.
8. The method for producing a drug-containing lipid emulsion according to claim 7, further comprising%.
％をさらに含むことを特徴とする請求項8に記載の薬物含有固形脂質微粒子の製
造方法。74. The aqueous phase, wherein the hydrophilic polymer or the hydrophilic polymer lipid is 0.01-10.
9. The method for producing drug-containing solid lipid fine particles according to claim 8, further comprising:
とする請求項5に記載の脂質エマルジョンの製造方法。75. The method according to claim 5, wherein the emulsifier is added to an oil phase instead of an aqueous phase.
とする請求項6に記載の固形脂質微粒子の製造方法。76. The method for producing solid lipid fine particles according to claim 6, wherein the emulsifier is added to an oil phase instead of an aqueous phase.
とする請求項7に記載の薬物含有脂質エマルジョンの製造方法。77. The method for producing a drug-containing lipid emulsion according to claim 7, wherein the emulsifier is added to an oil phase instead of an aqueous phase.
とする請求項8に記載の薬物含有固形脂質微粒子の製造方法。78. The method according to claim 8, wherein the emulsifier is added to an oil phase instead of an aqueous phase.
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Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| JP2014522841A (en) * | 2011-07-06 | 2014-09-08 | ノバルティス アーゲー | Cationic oil-in-water emulsion |
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Families Citing this family (35)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2689696C (en) | 1999-02-26 | 2013-08-06 | Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. | Microemulsions with adsorbed macromolecules and microparticles |
| AU5214200A (en) * | 1999-05-20 | 2000-12-12 | Pharmasol Gmbh | Stability, biocompatibility optimized adjuvant (sba) for enhancing humoral and cellular immune response |
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| US7189705B2 (en) | 2000-04-20 | 2007-03-13 | The University Of British Columbia | Methods of enhancing SPLP-mediated transfection using endosomal membrane destabilizers |
| AU5454801A (en) * | 2000-04-20 | 2001-11-07 | Univ British Columbia | Methods of enhancing splp-mediated transfection using endosomal membrane destabilizers |
| JP2001300287A (en) * | 2000-04-20 | 2001-10-30 | Nof Corp | Perfluorocarbon emulsifying preparation |
| KR100618033B1 (en) * | 2004-06-21 | 2006-08-30 | 에이엔에이치 케어연구소(주) | Topical Composition Comprising Doxepin as an Active Ingredient for Curing Atopy |
| ES2355159T3 (en) | 2005-08-11 | 2011-03-23 | University Of Saskatchewan | REDUCTION IN THE FORMATION OF POSTOPERATIVE ADHERENCES WITH INTRAPERITONEAL GLUTAMINE. |
| US8530436B2 (en) * | 2007-01-29 | 2013-09-10 | Transderm, Inc. | Methods and compositions for transdermal delivery of nucleotides |
| CA2578647A1 (en) * | 2007-02-15 | 2008-08-15 | University Of Saskatchewan | Reducing post-operative adhesion formation with intraperitoneal glutamine |
| EP2306978A2 (en) | 2008-06-06 | 2011-04-13 | Mirna Therapeutics, Inc. | Compositions for the in vivo delivery of rnai agents |
| GB0901857D0 (en) * | 2009-02-05 | 2009-03-11 | Nanoco Technologies Ltd | Encapsulated nanoparticles |
| EA013570B1 (en) * | 2009-02-24 | 2010-06-30 | Ооо "Научно-Производственный Комплекс "Наносистема"" | Pharmaceutical composition for treating tuberculosis and diseases mediated by helicobacter pylori based on solid lipid nanoparticles and a method for the treatment of tuberculosis |
| ES2351756B1 (en) | 2009-07-28 | 2011-10-05 | Universidad Del Pais Vasco | LIPID NANOPARTICLES FOR GENE THERAPY. |
| EP3296398A1 (en) | 2009-12-07 | 2018-03-21 | Arbutus Biopharma Corporation | Compositions for nucleic acid delivery |
| DE102010013064A1 (en) * | 2010-03-26 | 2011-12-15 | Gabriele Blume | Novel carrier system for the transport of active ingredients into the skin |
| ES2385080B1 (en) * | 2010-12-21 | 2013-05-10 | Universidad Del Pais Vasco-Euskal Herriko Unibertsitatea | LIPID NANOPARTICLES FOR THE TREATMENT OF EYE DISEASES. |
| TR201910686T4 (en) | 2011-06-08 | 2019-08-21 | Translate Bio Inc | Lipid nanoparticle compositions and methods for Mrna delivery. |
| CN104487075A (en) | 2012-02-29 | 2015-04-01 | 普马特里克斯公司 | Inhalable dry powders |
| US9693936B2 (en) | 2012-03-07 | 2017-07-04 | Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Ltd. | Dispersions in oil of Dead Sea nano sized material preparation and uses therof |
| CN102670484B (en) * | 2012-05-30 | 2013-06-05 | 浙江大学 | Mannose-modified solid lipid nanoparticle plural gel and preparation method thereof |
| BR102012015756A2 (en) * | 2012-06-26 | 2014-12-02 | Univ Fed De Ouro Preto Ufop | PROCEDURE FOR OBTAINING HIGH CONCENTRATIONS OF THE CHEMICAL CONSTITUTE TRANS-PINOCARVILLE ACETATE FOR HYDRODESTILATION OF THE GRAVEOLEN AIR PARTIES AND OBTAINING NANOEMULSIONAL FORMULATIONS. |
| US20140271923A1 (en) | 2013-03-14 | 2014-09-18 | Christopher Brian Reid | Compositions & formulations for preventing and treating chronic diseases that cluster in patients such as cardiovascular disease, diabetes, obesity, polycystic ovary syndrome, hyperlipidemia and hypertension, as well as for preventing and treating other diseases and conditions |
| US20140275261A1 (en) | 2013-03-15 | 2014-09-18 | Dr. Reddy's Laboratories, Inc. | Diclofenac parenteral compositions |
| ES2846809T3 (en) | 2014-11-05 | 2021-07-29 | Selecta Biosciences Inc | Methods and compositions related to the use of low HLB surfactants in the production of synthetic nanocarriers comprising a rapalogo |
| US10328087B2 (en) | 2015-07-23 | 2019-06-25 | Therapeuticsmd, Inc. | Formulations for solubilizing hormones |
| WO2017173071A1 (en) | 2016-04-01 | 2017-10-05 | Therapeuticsmd, Inc. | Steroid hormone pharmaceutical composition |
| US10286077B2 (en) | 2016-04-01 | 2019-05-14 | Therapeuticsmd, Inc. | Steroid hormone compositions in medium chain oils |
| BR102017016440A2 (en) * | 2017-07-31 | 2019-03-19 | Universidade Federal Do Rio Grande Do Sul | COMPOSITION FOR CENTRAL NERVOUS SYSTEM GENE THERAPY, OBTAINING AND USE PROCESS |
| CN111281982B (en) * | 2020-02-19 | 2023-11-17 | 深圳厚存纳米药业有限公司 | Poloxamer and/or poloxamer and lipid combined compound |
| US20210308058A1 (en) | 2020-03-11 | 2021-10-07 | Selecta Biosciences, Inc. | Methods and compositions related to synthetic nanocarriers |
| EP4056038A1 (en) * | 2021-03-10 | 2022-09-14 | Basf Se | Microparticles containing active substances |
| CN113350521B (en) * | 2021-04-08 | 2022-11-29 | 上海大学 | LPD nano liposome and preparation method and application thereof |
| CN113877000B (en) * | 2021-10-13 | 2023-01-24 | 科笛生物医药(无锡)有限公司 | Microsphere composition for injection and application thereof |
| CN114657147B (en) * | 2022-01-27 | 2023-12-01 | 安徽智飞龙科马生物制药有限公司 | Protective agent for biological material and application thereof |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0344314A (en) * | 1989-07-13 | 1991-02-26 | Nippon Petrochem Co Ltd | Hair dyeing assistant for acid dye |
| DE4039063A1 (en) * | 1990-12-07 | 1992-06-11 | Wella Ag | HAIR CURING IN THE FORM OF A MICROEMULSION |
| DK0591452T3 (en) * | 1991-06-27 | 1999-01-25 | Univ Emory | Multicomponent emulsions and processes for their preparation |
| JPH06219940A (en) * | 1993-01-27 | 1994-08-09 | Shiseido Co Ltd | Patch |
| CA2213517C (en) * | 1995-02-22 | 2002-01-22 | Bausch & Lomb, Incorporated | Skin care composition |
-
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- 2002-01-30 KR KR10-2002-0005448A patent/KR100374482B1/en not_active IP Right Cessation
Cited By (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2013531680A (en) * | 2010-07-06 | 2013-08-08 | ノバルティス アーゲー | Cationic oil-in-water emulsion |
| JP2014522841A (en) * | 2011-07-06 | 2014-09-08 | ノバルティス アーゲー | Cationic oil-in-water emulsion |
| JP2016501233A (en) * | 2012-11-30 | 2016-01-18 | インスメッド， インコーポレイテッド | Prostacyclin compounds and methods of using prostacyclin compounds |
| US11795135B2 (en) | 2013-10-25 | 2023-10-24 | Insmed Incorporated | Prostacyclin compounds, compositions and methods of use thereof |
| US10010518B2 (en) | 2013-10-25 | 2018-07-03 | Insmed Incorporated | Prostacyclin compounds, compositions and methods of use thereof |
| US10526274B2 (en) | 2013-10-25 | 2020-01-07 | Insmed Incorporated | Prostacyclin compounds, compositions and methods of use thereof |
| US10995055B2 (en) | 2013-10-25 | 2021-05-04 | Insmed Incorporated | Prostacyclin compounds, compositions and methods of use thereof |
| KR20160027498A (en) * | 2014-08-29 | 2016-03-10 | 세종대학교산학협력단 | Cationic emulsion containing iodized oil and use of the cationic emulsion for promoting gene delivery of virus vector |
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