JP2004535794A - ***特異的カチオンチャネルおよびその使用 - Google Patents
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Abstract
Description
【0001】
本発明は、分子生物学の分野、および生殖技術に関する。特に、本発明は、***細胞に特異的に発現するカチオンチャネル蛋白質、当該蛋白質をコードする核酸、当該蛋白質を発現させるように操作された細胞、当該蛋白質の活性に影響する化合物のアッセイ、および不妊を治療しもしくは引き起こす際の、または避妊もしくは動物管理の手段としての、このような化合物の使用に関する。
[関連出願]
本出願は、2001年5月3日に出願された米国仮特許出願番号第60/288,402号、および2001年10月4日に出願された米国仮特許出願番号第60/327,167号に関する優先権の利益を主張する。
【背景技術】
【0002】
***および卵子は哺乳動物の受精において交換的に相互作用する(Wassarman, et al. (2000), Nature Cell Biology 3, E59-E64; Yanagimachi (1994), The Physiology of Reproduction, eds. Knobil & Neill (Raven Press, New York), pp.189-315)。受精部位に到達するため、***は比較的長い距離を移動し、受精能獲得等の過程を通じて卵子の受精のために感作されなければならない。***は、卵子の表面に到達すると、透明帯蛋白質を含む卵細胞外マトリックス糖蛋白質と相互作用する。***は先体反応中に酸性物質を放出する。これは、おそらくCa2+チャネルの開放およびCa2+の***頭部への流入に関与するシグナル伝達イベントである(O'Toole, et al. (2000), Mol Biol Cell 11, 1571-84)。最近では、推定Ca2+透過性チャネルであるTRPC2蛋白質が先体反応に関係しているとされている(Jungnickel, et al. (2001), Nat Cell Biol 3, 499-502)。***が卵子の厚い外層を通って侵入することは、卵膜の化学的溶解および/または***の機械的運動によって達成される(Bedford (1998), Biol Reprod 59, 1275-87)。卵ZP膜の浸潤後、***膜が卵膜と融合する。融合に続いて、受精過程の活性化が起こり、卵子内でCa2+振動が始まる(Wassarman, et al. (2001), Nature Cell Biology 3, E59-E64; Yanagimachi (1994), The Physiology of Reproduction, eds. Knobil & Neill (Raven Press, New York), pp.189-315)。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【0003】
Ca2+および環状ヌクレオチドが、***の運動性を制御する(Tash (1990) Controls of Sperm Motility: biological and clinical aspects, ed. Gagnon (CRC Press, Boca Raton), pp.229-240; Darszon, et al. (1999), Physiol Rev 79, 481-510; Hyne & Garbers (1979), Proc Natl Acad Sci U S A 76, 5699-703)。いくつかの電位依存性Ca2+チャネル(CaV)mRNAおよび環状ヌクレオチド作動性(CNG)チャネル蛋白質が、***細胞前駆細胞で検出されている(Darszon, et al. (1999), Physiol Rev 79, 481-510; Serrano, et al. (1999), FEBS Lett 462, 171-6; Weyand, et al. (1994) Nature 368, 859-63; Wiesner, et al. (1998), J Cell Biol 142, 473-84)。さらに、低電位で活性化されるジヒドロピリジン感受性「T型」チャネル(Santi, et al. (1996), Am J Physiol 271, C1583-93; Arnoult, et al. (1996), Proc Natl Acad Sci U S A 93, 13004-9)および薬理学的に定義されたN型およびR型電流が、***形成細胞で測定されている(Wennemuth, et al. (2000), J Biol Chem 275, 21210-7)。しかし、***形成および成熟***機能におけるこれらのチャネルの役割は知られていない。
【課題を解決するための手段】
【0004】
一態様では、本発明はCatSper1遺伝子の全部または一部に対応する単離された核酸を提供する。いくつかの実施形態では、単離された核酸は、SEQ ID NO:1もしくはSEQ ID NO:3の少なくとも10、12、14、16もしくは18個の連続するヌクレオチドのヌクレオチド配列、またはそれらに相補的な配列を含む。他の実施形態では、核酸は、CatSper1蛋白質、CatSper1蛋白質の少なくとも膜貫通ドメイン、CatSper1蛋白質の少なくとも細胞外ループ、CatSper1蛋白質の少なくとも孔領域、高い予測された抗原性を有するCatSper1蛋白質の少なくともエピトープ、をコードするヌクレオチド配列、またはそれらに相補的な配列を含む。特定実施形態では、核酸は、SEQ ID NO:1の配列;SEQ ID NO:3の配列;SEQ ID NO:2の残基447−468、481−502、516−533、542−563、583−604または649−670を含むポリペプチドをコードする配列;SEQ ID NO:4の残基351−372、385−406、419−438、448−469、489−510、または555−576を含むポリペプチドをコードする配列;SEQ ID NO:2の残基469−480、534−541、または605−648を含むポリペプチドをコードする配列;SEQ ID NO:4の残基373−384、439−448、および511−554を含むポリペプチドをコードする配列;SEQ ID NO:2の残基616−635を含むポリペプチドをコードする配列;SEQ ID NO:4のおよそ残基522−541の残基を含むポリペプチドをコードする配列;SEQ ID NO:2の残基2−34、52−70、108−130、264−305、387−417、または606−614を含むポリペプチドをコードする配列;SEQ ID NO:4の残基2−40、120−148、160−200、または512−520を含むポリペプチドをコードする配列;およびそれらに相補的な配列を含む。
【0005】
もう1つの態様では、本発明は、CatSper1蛋白質;CatSper1蛋白質の少なくとも膜貫通ドメイン;CatSper1蛋白質の少なくとも細胞外ループ;およびCatSper1蛋白質の少なくとも孔領域、と少なくとも80%、85%、90%、または95%のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドをコードする単離された核酸を提供する。いくつかの実施形態では、単離された核酸は、CatSper1蛋白質と少なくとも80%、85%、90%または95%のアミノ酸配列同一性を有し、かつCatSper1活性を発現させることが可能な細胞内でCatSper1活性を有するポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、単離された核酸は、SEQ ID NO:5からの少なくとも100、200、300または400個の連続するヌクレオチドと少なくとも80%、85%、90%または95%のヌクレオチド配列同一性を有する調節要素であって、CatSper1遺伝子が発現可能な哺乳類細胞内でそれに操作可能に接合するコーディング配列の転写を促進することが可能な調節要素を含む。
【0006】
もう1つの態様では、本発明は、65℃で1.0×SSCの洗浄ステップ、0.5×SSCの洗浄ステップ、0.2×SSCの洗浄ステップ、または0.1×SSCの洗浄ステップを含む条件下でSEQ ID NO:1またはSEQ ID NO:3の核酸の少なくとも一部にハイブリダイズする単離された核酸を提供する。いくつかの実施形態では、単離された核酸はCatSper1活性を有するポリペプチドをコードする。
【0007】
もう1つの態様では、本発明は、CatSper1活性を有するポリペプチドをコードし、65℃で1.0×SSCの洗浄ステップ、0.5×SSCの洗浄ステップ、0.2×SSCの洗浄ステップ、または0.1×SSCの洗浄ステップを含む条件下でSEQ ID NO:1またはSEQ ID NO:3の核酸の少なくとも一部にハイブリダイズするヌクレオチド配列であって、当該配列が発現するように非相同調節領域に操作可能に接合するヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。もう1つの実施形態では、本発明は、SEQ ID NO:2または4のアミノ酸配列と少なくとも80%、85%、90%または95%のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、当該配列が発現するように非相同調節領域に操作可能に接合するヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。
【0008】
もう1つの態様では、本発明はCatSper1核酸の少なくとも一部を検出するキットを提供する。キットは、本発明の上記の単離された核酸のいずれか、および単離された核酸を検出する手段を含み得る。いくつかの実施形態では、単離された核酸を検出する手段はそれに結合した検出可能な標識を含み、いくつかの実施形態では、当該手段は第1の単離された核酸に特異的にハイブリダイズする標識された二次核酸を含む。
【0009】
もう1つの態様では、本発明は、本発明の上記の単離された核酸のいずれかを含むベクターを提供する。いくつかの実施形態では、ベクターは本発明の核酸を発現させることが可能な遺伝子コンストラクトを含む。いくつかの実施形態では、本発明の核酸は外来性調節領域に操作可能に接合し、いくつかの実施形態では、核酸は非相同コーディング配列に操作可能に接合して融合ベクターを形成する。いくつかの実施形態では、ベクターはCatSper1調節領域を含み、いくつかの実施形態では、CatSper1調節領域は非相同コーディング配列に操作可能に接合する。
【0010】
もう1つの態様では、本発明は、本発明の上記の核酸、または本発明の核酸を発現させることが可能な遺伝子コンストラクトで形質転換された細胞を提供する。いくつかの実施形態では、本発明の核酸は非相同コーディング配列に操作可能に接合して融合蛋白質をコードする。いくつかの実施形態では、細胞は、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、線虫細胞、両生類細胞、齧歯類細胞、またはヒト細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、哺乳類体細胞、胎児細胞、胚幹細胞、接合子、配偶子、生殖系列細胞および遺伝子移植動物細胞である。
【0011】
もう1つの態様では、本発明は非ヒト遺伝子移植動物を提供する。これらの態様では、遺伝子コンストラクトが動物、または動物の原種のゲノムに修飾を導入しており、その修飾は、CatSper1蛋白質の少なくともフラグメントをコードする核酸の挿入、内在性CatSper1遺伝子の不活化、またはCatSper1調節要素に操作可能に接合するレポーター遺伝子の相同組換えによる挿入を含む。いくつかの実施形態では、修飾は、CatSper1蛋白質、CatSper1蛋白質の少なくとも膜貫通ドメイン、CatSper1蛋白質の少なくとも細胞外ループ、CatSper1蛋白質の少なくとも孔領域、または高い予測された抗原性を有するCatSper1蛋白質の少なくともエピトープ、をコードする核酸の挿入である。いくつかの実施形態では、動物はラット、マウス、ハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、および非ヒト霊長類である。
【0012】
もう1つの態様では、本発明は、CatSper1蛋白質;CatSper1蛋白質の少なくとも膜貫通ドメイン;CatSper1蛋白質の少なくとも細胞外ループ;CatSper1蛋白質の少なくとも孔領域;および高い予測された抗原性を有するCatSper1蛋白質の少なくともエピトープ、から選択されるポリペプチドを含む実質的に純粋な蛋白質製剤を提供する。特定実施形態では、ポリペプチドは、SEQ ID NO:2;SEQ ID NO:4;SEQ ID NO:2の残基447−468、481−502、516−533、542−563、583−604または649−670;SEQ ID NO:4の残基351−372、385−406、419−438、448−469、489−510、または555−576;SEQ ID NO:2の残基469−480、534−541、または605−648;SEQ ID NO:4の残基373−384、439−448、および511−554;SEQ ID NO:2の残基616−635;SEQ ID NO:4の残基522−541;SEQ ID NO:2の残基2−34、52−70、108−130、264−305、387−417、または606−614;ならびにSEQ ID NO:4の残基2−40、120−148、160−200、または512−520から選択される。
【0013】
もう1つの態様では、本発明は、CatSper1蛋白質と少なくとも80%、85%、90%、または95%のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチド;CatSper1蛋白質の少なくとも膜貫通ドメイン;CatSper1蛋白質の少なくとも細胞外ループ;またはCatSper1蛋白質の少なくとも孔領域、を含む実質的に純粋な蛋白質製剤を提供する。いくつかの実施形態では、実質的に純粋な蛋白質製剤は、CatSper1蛋白質と少なくとも80%、85%、90%、または95%のアミノ酸配列同一性を有し、かつCatSper1活性を発現させることが可能な細胞内でCatSper1活性を有するポリペプチドを含む。
【0014】
もう1つの態様では、本発明はCatSper1エピトープに対して産生される抗体を含む実質的に純粋な抗体製剤を提供する。いくつかの実施形態では、エピトープは高い予測された抗原性を有する。いくつかの実施形態では、エピトープは、SEQ ID NO:2の残基2−34、52−70、108−130、264−305、387−417、および606−614、ならびにSEQ ID NO:4の残基2−40、120−148、160−200、または512−520内のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、抗体はモノクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、Fabフラグメント、F(ab′)2フラグメント、Fvフラグメント、または一本鎖Fvフラグメント(scFv)である。
【0015】
もう1つの態様では、本発明はCatSper1蛋白質の少なくともエピトープを検出するキットを提供する。キットは本発明の抗CatSper1抗体、および当該抗体を検出する手段を含む。いくつかの実施形態では、上記抗CatSper1抗体を検出する手段はそれに結合した検出可能な標識を含み、いくつかの実施形態では、上記抗CatSper1抗体を検出する手段は、抗CatSper1抗体に特異的に結合する標識された二次抗体を含む。
【0016】
もう1つの態様では、本発明はCatSper1活性の潜在的モジュレーターを識別する方法を提供する。本方法は、CatSper1蛋白質を発現させる細胞と候補化合物を接触させること;細胞においてCatSper1活性のインジケーターを測定すること;候補化合物が基準レベルに対してインジケーターの上昇または低下を引き起こしたかどうかを判定すること;および上昇または低下が有意である場合に候補化合物をCatSper1活性の潜在的モジュレーターとして識別することを含む。いくつかの実施形態では、インジケーターは、CatSper1蛋白質をコードするmRNAのレベルのインジケーター、CatSper1蛋白質のレベルのインジケーター、上記細胞の膜を横切るカチオンフラックスのインジケーター、または上記細胞の全細胞もしくはチャネル電流のインジケーターである。いくつかの実施形態では、細胞はCatSper1蛋白質を発現させることが可能な遺伝子コンストラクトで形質転換されている。いくつかの実施形態では、細胞は成熟***細胞であり、インジケーターは***運動性の尺度である。
【0017】
もう1つの態様では、本発明は、候補化合物をCatSper1蛋白質の少なくとも構造ドメインと接触させること;候補化合物とCatSper1部分の間の結合がもしあればそれを測定すること;および結合が有意である場合に候補化合物をCatSper1活性の潜在的モジュレーターとして識別することを含む、CatSper1活性の潜在的モジュレーターを識別する方法を提供する。いくつかの実施形態では、CatSper1部分は、CatSper1蛋白質;CatSper1蛋白質の少なくとも膜貫通ドメイン;CatSper1蛋白質の少なくとも細胞外ループ;またはCatSper1蛋白質の少なくとも孔領域である。
【0018】
もう1つの態様では、本発明は、CatSper1活性を低下させる化合物を被験体に投与することによって雄被験体の妊性を低下させる方法を提供する。もう1つの態様では、本発明は、CatSper1活性を低下させる化合物を被験体に投与することによって雄被験体に可逆的不妊を引き起こす方法を提供する。もう1つの態様では、本発明は、CatSper1活性を低下させる化合物を雄または雌被験体に投与する避妊方法を提供する。上記の実施形態のそれぞれにおいて、化合物は、注射、経皮的パッチ、生分解性インプラント、潤滑剤、湿潤剤、フォーム、ゼリー、またはスポンジ中にあってもよい。被験体が雌である場合、化合物は、膣、子宮または輸卵管の少なくとも1つに投与されてもよい。上記の実施形態のそれぞれにおいて、化合物は、CatSper1遺伝子の少なくとも一部に対してアンチセンスである核酸、またはFabフラグメント、F(ab′)2フラグメント、Fvフラグメント、もしくはscFvフラグメントを含むCatSper1蛋白質に対する抗体であってもよい。いくつかの実施形態では、被験体は哺乳動物である。いくつかの実施形態では、被験体はヒト、イヌ、ネコ、ウシ、ヒツジ、ウマ、マウス、ラット、アライグマ、およびジリスである。他の実施形態では、被験体は魚、両生動物または昆虫である。関連態様では、本発明は、雄被験体の妊性を低下させるため、もしくは雄被験体に可逆的不妊を引き起こすための薬物の製剤、または雄もしくは雌への投与のための避妊の製剤における、CatSper1活性を低下させる化合物の使用を提供する。例えば、本発明は、CatSper1遺伝子の少なくとも一部に対してアンチセンスである核酸、およびCatSper1蛋白質に対する抗体を含む、CatSper1活性を低下させる化合物を含む避妊製剤を提供する。
【0019】
もう1つの態様では、本発明は、CatSper1遺伝子中の突然変異の有無を決定することによって哺乳動物におけるCatSper1関連障害を診断する方法を提供する。いくつかの実施形態では、決定された核酸またはアミノ酸配列と基準配列の間の差の有無が、CatSper1遺伝子中の突然変異の有無を示す。いくつかの実施形態では、本方法は、CatSper1蛋白質の少なくともフラグメントを、突然変異の有無が既知であるCatSper1蛋白質に結合することが既知である抗体と接触させること、および抗体とCatSper1蛋白質との間の結合を検出することを含む。他の実施形態では、本方法は、細胞においてCatSper1活性のインジケーターを測定すること;および測定されたインジケーターを基準レベルと比較することを含む。インジケーターは、CatSper1蛋白質をコードするmRNAのレベルのインジケーター、CatSper1蛋白質のレベルのインジケーター、上記細胞の膜を横切るカチオンフラックスのインジケーター、または上記細胞の全細胞もしくはチャネル電流のインジケーターであってもよい。いくつかの実施形態では、障害はCatSper1関連不妊である。もう1つの態様では、本発明はCatSper1遺伝子に関して被験体の遺伝子型を決定する方法を提供する。
【0020】
もう1つの態様では、本発明は、低下したCatSper1活性、低下した運動性、または低下した透明帯貫通能力を有する***によるインビトロ受精方法を提供する。ここで、少なくとも1つの卵子から透明帯が除去され、卵子は少なくとも1つの***と接触する。
【0021】
もう1つの態様では、低下したCatSper1活性による不妊により特徴づけられる被験体を治療する方法が提供される。本方法は、被験体の***または***幹細胞を、CatSper1蛋白質を発現させることが可能な遺伝子コンストラクトで形質転換すること、および上記被験体の形質転換***を用いて卵子を受精させることを含む。別法として、本方法は、CatSper1蛋白質を被験体の***または***幹細胞に投与することを含む。
【0022】
もう1つの態様では、本発明は、雌の泌尿生殖路に存在する抗CatSper1抗体によって引き起こされる抗CatSper1抗体媒介性不妊を診断する方法を提供する。もう1つの態様では、雌の泌尿生殖路に存在する抗CatSper1抗体によって引き起こされる抗CatSper1抗体媒介性不妊を治療する方法が提供される。
【0023】
もう1つの態様では、本発明は、(a)請求項41のアッセイによって、CatSper1活性に拮抗する1つまたは複数の作用物質を識別すること;(b)ステップ(a)で識別された作用物質、またはその類似体が、***運動性または卵子貫通性の少なくとも1つを阻害するかどうかを判定すること;(c)1つまたは複数の動物モデルにおける効能および毒性についてステップ(b)で阻害剤として識別された作用物質の治療プロファイリングを実行すること;および(d)ステップ(c)で許容し得る治療プロファイルを有すると識別された1つまたは複数の作用物質を含む薬物製剤を処方すること、を含む薬物発見ビジネスを実行する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本方法は、販売のために薬物製剤を頒布するシステムを確立するステップをさらに含み、随意に、薬物製剤を市販するための販売グループを確立することを含む。
【0024】
添付図面は、本発明の実施形態の例示であり、本発明の範囲を限定することを意図していない。
【発明を実施するための最良の形態】
【0025】
本発明は、部分的には、***細胞で発現するが検査された他の組織では発現せず、***の運動性および卵子を受精させる能力において重要な役割を果たすカチオンチャネル蛋白質の識別、単離および特徴づけに依存する。この蛋白質は、識別されるべき***(Sperm)固有の最初のカチオン(Cation)チャネルであることを示すために、CatSper1と表記されている。重要なことであるが、CatSper1の活性の阻害は、***細胞の運動性、特に透明帯(ZP)の貫通およびその後の受精に必要な最も活発な***尾部の振動運動の実質的低下を引き起こす。したがって、CatSper1蛋白質の活性の阻害剤は、ZPの貫通を妨害することが可能であり、雄および雌の避妊薬として使用可能である。
【0026】
CatSper1遺伝子は、単一の6回膜貫通型リピート(電位依存性K+[KV]チャネルと同様の)をコードする一方、その孔領域および全体の相同性は、はるかに大きい4リピートCa2+チャネル(CaV)の単一ドメインによく似ているという点で独特である。遺伝子産物は精巣で排他的に発現し、脳、心臓、腎臓または免疫系のような他の組織では発現しない。***では、チャネルは、頭部や中片部ではなく主として尾部の主部に局在する。以下の実施例で示すように、***運動性低下および雄性不妊は、遺伝子ターゲッティングによるマウスCatSper1蛋白質の除去の結果として生じる。
【0027】
本明細書で参照される特許、科学および医学刊行物は、本発明がなされた時に当業者に利用可能であった知識を確定する。本明細書に引用される発行済み米国特許、公開済みおよび係属中の特許出願、ならびに他の文献の開示全体は参照により本明細書に援用される。特に、米国仮特許出願第60/288,402号および米国仮特許出願第60/327,167号の開示全体は参照により本明細書に援用される。
【0028】
定義
本明細書で使用されるすべての技術および科学用語は、以下で別段の定義をしない限り、当業者によって一般的に理解されているのと同じ意味を有することが意図される。本明細書で使用される技法への言及は、当技術分野で一般的に理解されている通りの技法を指すことが意図され、当業者には明らかなその技法に対する変形または同等の技法による置換を含む。本発明である主題をより明確かつ簡潔に説明するため、本明細書で使用されるいくつかの用語について以下の定義を提供する。
【0029】
本明細書で使用される場合、「CatSper1蛋白質」という用語は、SEQ ID NO:2に開示されたヒトCatSper1蛋白質、開示されたCatSper1蛋白質のヒト対立遺伝子変種、これらのヒトCatSper1蛋白質の哺乳類同族体、およびそれらの機能的同等物のような、***固有のカチオンチャネルを意味する。CatSper1蛋白質という用語は、***から単離されるような天然の蛋白質、CatSper1遺伝子で形質転換された細胞から組換えにより産生される蛋白質、およびCatSper1配列がN末端またはC末端ポリペプチドに融合した融合蛋白質を指す。「フラグメント」という用語は、構造ドメインおよびエピトープのような、CatSper1蛋白質のフラグメントを指す。CatSper1蛋白質のフラグメントは、少なくとも6個のアミノ酸残基を含む。
【0030】
本明細書で使用される場合、「CatSper1遺伝子」という用語は、SEQ ID NO:2に開示されたヒトCatSper1蛋白質、開示されたCatSper1蛋白質のヒト対立遺伝子変種、これらのヒトCatSper1蛋白質の哺乳類同族体、およびそれらの機能的同等物を含む、CatSper1蛋白質をコードする遺伝子を意味する。CatSper1遺伝子という用語は、ゲノムDNAから単離されるような天然の遺伝子、およびCatSper1コーディング領域が内在性または外来性のいずれかの調節要素に操作可能に接合する、組換えにより産生された遺伝子の両方を指し、イントロン配列の有無、および非相同(すなわち非CatSper1)配列をコードしてCatSper1融合蛋白質を形成する5′または3′フランキング配列の有無は問わない。CatSper1遺伝子は、最低限、CatSper1蛋白質に翻訳され得るmRNAへの、コーディング領域の転写を可能にする調節要素(例えば、プロモーター、エンハンサー)に操作可能に接合する蛋白質をコードするコーディング領域を含むであろう。
【0031】
本明細書で使用される場合、「CatSper1」活性とは、CatSper1が正常に発現する細胞または細胞型でCatSper1が正常に発現する条件下で発現する時の野生型CatSper1蛋白質のいかなる正常の生物活性をも意味する。このような活性としては、イオン電流の誘導;cAMP誘導性Ca2+流入の媒介;CatSper1−/−***で発現する時の***運動性の回復;および/またはCatSper1−/−***で発現する時の卵子を貫通する能力の回復があり得る。CatSper1活性は、***細胞もしくは***細胞、または必要な補助因子が存在する他の細胞で測定可能である。
【0032】
本明細書で核酸およびアミノ酸配列に関して使用される場合、「同一性」という用語は、同一性を最大化する配列のアラインメントに基づく2つの配列の類似性の程度の尺度を意味し、これは同一のヌクレオチドまたは残基の個数、全ヌクレオチドまたは残基の個数、および配列アラインメントにおけるギャップの存在および長さの関数である。標準的なパラメータを用いて配列同一性を決定する種々のアルゴリズムおよびコンピュータプログラムが利用可能である。例えば、Gapped BLASTまたはPSI−BLAST(Altschul et al. (1997), Nucleic Acids Res. 25:3389-3402)、BLAST(Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410)、およびSmith−Waterman(Smith et al. (1981), J. Mol. Biol. 147:195-197)。本明細書で使用される場合、パーセント同一性はBLASTアルゴリズムのデフォルト値に基づいている。
【0033】
本明細書で使用される場合、「同族体」という用語は、基準蛋白質と進化的に関連し、実質的な保存された構造的および機能的類似性を共有するが、異なる種に存在する蛋白質を意味する(例えば、ヒト、ラット、および昆虫のCatSper1蛋白質は互いの同族体である)。
【0034】
本明細書で使用される場合、「突然変異」という用語は、ある基準配列に対する核酸配列中の変化を指し、対応するコードされた蛋白質配列中の変化として発現するかどうかを問わない。基準配列は、「野生型」配列(すなわち、「正常」表現型に対応する集団における1つまたは複数の高頻度配列)、またはいかなる他の配列でもよい。本明細書で使用される場合、突然変異という用語は、多型という用語と同義であることが意図され、したがっていかなる2つの非同一配列間の差も突然変異とみなされ得る。突然変異という用語は、基準配列に対する1つまたは複数のヌクレオチドの挿入、欠失および/または置換を包含することが意図される。
【0035】
本明細書で使用される場合、「外来性」または「非相同」という用語は、2個以上の遺伝子配列に関して、遺伝子配列が互いに同じ物理的関係で自然に生じないこと、および/または同じゲノム中に自然に生じないことを意味する。例えば、遺伝子コンストラクトは、1つまたは複数の調節要素に操作可能に接合するコーディング領域を含み得るが、これらの配列は、自然状態では操作可能に接合しない場合、および/または同じゲノム中に自然状態では見出されない場合に、互いに非相同とみなされる。同様に、細胞に導入される遺伝子コンストラクトは、その細胞に見出されない遺伝子配列を含む限り、その細胞に対して非相同であるとみなされる。さらに、天然配列に基づいて合成により産生された遺伝子配列は、コドンが変更され、合成配列が自然に存在しない限り、天然配列に対して非相同となる。ある種における配列の対立遺伝子変種は、互いに非相同とはみなされない。
【0036】
本明細書で使用される場合、「操作可能に接合」という用語は、複数の遺伝子調節要素と遺伝子コーディング領域の共有結合による機能的連関であって、1つまたは複数の調節要素に結合可能なRNAポリメラーゼによってコーディング領域がmRNAに転写されるようにすることができるものを指す。したがって、調節要素を含む調節領域は、RNAポリメラーゼが許容条件下で調節領域内のプロモーターに結合しコーディング領域のmRNAへの転写を引き起こすことが可能な時に、コーディング領域に操作可能に接合している。この関連で、許容条件としては、構成性プロモーターのための標準的な細胞内条件、抑制性/誘導性プロモーターのための標準的条件および抑制体の不存在またはインデューサーの存在、ならびにインビトロ転写系のための当技術分野で知られているような適当なインビトロ条件がある。
【0037】
本明細書で使用される場合、「発現」という用語は、遺伝子のコーディング配列が一次mRNA転写物に転写され、一次mRNA転写物が成熟mRNAへとプロセッシングされ、成熟mRNAが蛋白質に翻訳されるというプロセスを指す。発現は、随意に、結果として得られるポリペプチドの翻訳後修飾を含んでもよい。
【0038】
本明細書で使用される場合、「CatSper1蛋白質をコードする遺伝子コンストラクト」という句は、CatSper1蛋白質のアミノ酸配列をコードする遺伝子配列を含む、またはCatSper1蛋白質のアミノ酸配列をコードする遺伝子配列に相補的である、当該コンストラクトで形質転換された細胞で発現することが可能な組換えDNA、RNA、または核酸類似体分子を意味する。このコンストラクトは、CatSper1蛋白質を一過的に発現させてもよく、あるいは細胞のゲノムに安定的に組み込まれ、条件的または構成的に蛋白質を発現させてもよい。
【0039】
本明細書で使用される場合、「ベクター」という用語は、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、染色体、ウィルス、ウィルス粒子等のような、細胞間で遺伝子配列を伝達することが可能ないかなる遺伝子コンストラクトをも意味する。ベクターは、複製、発現、および挿入または組込みの1つまたは複数が可能であってもよいが、これらの能力のそれぞれを所有する必要はない。したがって、この用語は、クローニング、発現、相同組換え、およびノックアウトベクターを包含する。
【0040】
本明細書で遺伝子工学に関して使用される場合、「形質転換」という用語は、細胞または生体に、その細胞または生体内で複製し、その細胞または生体内で発現するポリペプチド配列をコードし、および/または遺伝子座の発現に影響するようにその細胞または生体のゲノムに組み込まれる外来性の核酸または核酸類似体を、導入することを意味する。「形質転換」という用語は、このような核酸または核酸類似体を導入する種々の方法のすべてを包含するために使用され、その方法としては、以下のものには限定されないが、当技術分野でトランスフォーメーション、トランスフェクション、トランスダクション、エレクトロポレーション、バリスティックインジェクション等と呼ばれているような方法がある。
【0041】
本明細書で使用される場合、「核酸類似体」は、相補的核酸の配列固有の転写または逆転写を指示し、または生細胞内でコードされているポリペプチドの配列固有の翻訳を指示するのに十分な、核酸との構造的および機能的類似性を有する分子を意味する。
【0042】
本明細書で使用される場合、「レポーター遺伝子」という用語は、発現すると、検出可能な生化学的または表現型的効果を有するいかなる遺伝子配列をも意味する。レポーター遺伝子は、当技術分野では「マーカー」遺伝子としても知られている。
【0043】
本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、自然に産生された抗体、組換えにより産生された抗体、およびFabフラグメント、F(ab′)2フラグメント、Fvフラグメント、または一本鎖Fvフラグメント(scFv)のような抗体フラグメントを包含することが意図される。
【0044】
本明細書で使用される場合、アゴニストもしくはアンタゴニスト、またはエンハンサーもしくは抑制体の「有効量」という用語は、検出可能な生化学的または表現型的特性に関して統計的に有意な変化を引き起こすのに十分な、組成物の1つまたは複数の活性成分の全量を意味する。単独で投与される個々の活性成分に適用される場合、この用語はその成分のみを指す。組合せに適用される場合、この用語は、効果を生じる活性成分の組み合わされた量を指し、順次または同時のいずれで組み合わせて投与されるかを問わない。
【0045】
本明細書で使用される場合、「実質的に純粋な」という用語は、他の意図的に含まれる化合物の重量を除いて、問題にする蛋白質を少なくとも60%(乾燥重量で)含む製剤を意味する。好ましくは、製剤は、他の意図的に含まれる化合物の重量を除いて、当該蛋白質が乾燥重量で少なくとも75%、より好ましくは少なくとも90%、最も好ましくは少なくとも99%である。純度は、任意の適当な方法でも測定可能であり、例えばカラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、アミノ酸組成分析またはHPLC分析がある。製剤が意図的に本発明の2種以上の異なる蛋白質を含む場合、「実質的に純粋な」製剤とは、本発明の蛋白質の全乾燥重量が、他の意図的に含まれる化合物の重量を除いて、全乾燥重量の少なくとも60%である製剤を意味する。好ましくは、本発明の2種以上の蛋白質を含むこのような製剤について、本発明の蛋白質の全重量は、他の意図的に含まれる化合物の重量を除いて、製剤の全乾燥重量の少なくとも75%、より好ましくは少なくとも90%、最も好ましくは少なくとも99%であるべきである。したがって、投与、安定性、貯蔵等の目的で、本発明の蛋白質が1つまたは複数の他の化合物(例えば、希釈剤、洗剤、補形薬、塩類、糖、脂質)と混合される場合、このような他の化合物の重量は、製剤の純度の計算から無視される。
【0046】
本明細書で使用される場合、「AがBと接触する」という句の場合の「接触」という用語は、AとBを溶液中で一緒に混合すること、またはAの溶液を基板上のBに注ぐことによって、AとBが分子レベルで相互作用するほど十分な物理的近傍にもたらされることを意味する。本明細書で使用される場合、「AがBと接触する」という句は、「BがAと接触する」という句と同等であることが意図され、一方の要素が他方に対して固定されていることや、一方の要素が他方に対して移動されることを含意することは意図されない。
【0047】
本明細書で使用される場合、「変調する」または「影響する」という用語は、上昇または低下のいずれかを意味する。本明細書で使用される場合、「上昇」および「低下」という用語は、それぞれ、統計的に有意な上昇(すなわちp<0.1)および統計的に有意な低下(すなわちp<0.1)を意味する。
【0048】
一般的考察
本発明は、部分的には、***細胞で発現するが検査された他の組織では発現せず、***の運動性および卵子を受精させる能力において重要な役割を果たすカチオンチャネル蛋白質の識別、単離および特徴づけに依存する。この蛋白質は、識別されるべき***(Sperm)固有の最初のカチオン(Cation)チャネルであることを示すために、CatSper1と表記されている。重要なことであるが、CatSper1の活性の阻害は、***細胞の運動性、特に透明帯(ZP)の貫通およびその後の受精に必要な最も活発な***尾部の振動運動の実質的低下を引き起こす。したがって、CatSper1蛋白質の活性の阻害剤は、ZPの貫通を妨害することが可能であり、一時的、可逆的な不妊を引き起こすために男性または女性において男性用避妊薬として使用可能である。
【0049】
CatSper1アミノ酸配列は、電位依存性Ca2+チャネル(CaV)4リピート構造の単一の6回膜貫通型リピートに非常によく似ている。以下の実施例で詳述するように、CatSper1は***尾部の主部に特異的に位置し、遺伝子の標的破壊により、他の点では正常なマウスに雄性不妊を生じる。CatSper1-/-マウスの***運動性は劇的に低下し、それらは無処置卵子を受精させることができなかった。さらに、突然変異マウスの***では、cAMP誘導性Ca2+流入がなくなった。このように、CatSper1はcAMP媒介性Ca2+流入、***運動性、および受精にとって極めて重要である。したがって、CatSper1は、ヒトおよび他の哺乳動物を含めて、雌雄両方の非ホルモン性避妊薬の優れた標的となる。CatSper1遺伝子および蛋白質の識別もまた、不妊の診断および治療の新しい標的を提示し、したがって妊性を変調することが可能な化合物の識別のための新規なアッセイを提供する。
【0050】
CatSper1核酸
一態様では、本発明は、CatSper1蛋白質をコードする核酸分子、もしくは核酸類似体、またはその有用なフラグメントを提供する。ヒトCatSper1遺伝子の完全長cDNAはSEQ ID NO:1として、およびGenBankアクセス番号AF407333として開示されている。マウス同族体の完全長cDNA配列はSEQ ID NO:3として、およびGenBankアクセス番号AF407332として開示されている。マウス同族体の5′調節領域(翻訳開始コドンから5′を延ばす926塩基を含む)はSEQ ID NO:5として開示されている。マウス同族体の3′調節領域(翻訳終止コドンから3′を延ばす498塩基を含む)はSEQ ID NO:6として開示されている。
【0051】
本発明の核酸分子は、DNAもしくはRNA分子、またはハイブリッドDNA−RNA分子のいずれでもよい。本発明の核酸類似体は、ペプチド核酸、修飾塩基(例えば2′−ハロゲノ−2′−デオキシヌクレオシド)を含む類似体および/または修飾されたヌクレオシド間の結合(例えばホスホロチオエート結合)を含む類似体のような、当技術分野で知られているもののいずれを含んでもよく、これらはインビトロ翻訳やアンチセンス技術のような応用例で有用である。本明細書の残りの部分および添付の特許請求の範囲において、「核酸」という用語が使用される時はいつでも、この用語は、その使用の文脈においてこのような類似体が有用または好適である場合には、核酸類似体を包含することが意図される。核酸は、CatSper1遺伝子配列の全部または一部に対応するセンス分子であってもよく、CatSper1遺伝子配列の全部または一部に相補的なアンチセンス分子であってもよい。核酸は、ゲノムDNAまたはcDNAに由来または対応してもよく、あるいはCatSper1蛋白質配列および遺伝子コードに基づく合成分子(例えば、発現系で使用される宿主細胞におけるコドン使用頻度選択性を反映した合成核酸)であってもよい。
【0052】
いくつかの実施形態では、CatSper1核酸は、CatSper1遺伝子(例えば、SEQ ID NO:1またはSEQ ID NO:3)の全コーディング領域を含む。このような核酸は、細胞の形質転換のため、またはインビトロ転写および翻訳系のための遺伝子コンストラクトを産生するために使用可能である。このような核酸はまた、他の核酸の試料中のCatSper1配列を検出するためのハイブリダイゼーションアッセイにおけるプローブとしても使用可能である。
【0053】
他の実施形態では、CatSper1核酸配列のサブセットが、核酸増幅反応のためのプライマーとして、他の核酸の試料中のCatSper1配列を検出するためのハイブリダイゼーションアッセイにおけるプローブとして、または異常すなわち突然変異配列から正常すなわち野生型配列を区別するためのプローブとして、の使用のために提供される。これらの実施形態では、本発明の核酸は、SEQ ID NO:1のようなCatSper1配列から選択される10個の、好ましくは少なくとも12個の、より好ましくは少なくとも14個の、最も好ましくは少なくとも16個の連続するヌクレオチドを含む。応用の性質に応じて、プローブされ、または増幅される試料内の、ユニークな標的を有する、またはユニークな標的を有すると予想されるCatSper1配列を選択することが好ましいであろう。したがって、例えば、より長い配列や、頻繁に反復される要素(例えばポリアデニル化シグナル)を含まない配列のほうが、任意の所与の試料内でユニークに表現される可能性が高い。増幅反応のためのプライマーを選択する目的上、少なくとも15個、好ましくは18〜25個のヌクレオチドの配列が好ましい。
【0054】
いくつかの好ましい実施形態では、CatSper1蛋白質の構造ドメインをコードする、または、抗体の産出のためのエピトープとして働き得る蛋白質のフラグメントをコードする核酸が提供される。したがって、例えば、好ましい核酸は、CatSper1蛋白質の膜貫通ドメイン(すなわち、SEQ ID NO:2のおよそ残基447−468、481−502、516−533、542−563、583−604および649−670、SEQ ID NO:4のおよそ残基351−372、385−406、419−438、448−469、489−510、および555−576、ならびにそれらの対立遺伝子変種および同族体)をコードするもの、膜貫通ドメイン間の細胞外ループ(すなわち、SEQ ID NO:2のおよそ残基469−480、534−541、および605−648、SEQ ID NO:4のおよそ残基373−384、439−448、および511−554、ならびにそれらの対立遺伝子変種および同族体)をコードするもの、または孔領域(すなわち、SEQ ID NO:2のおよそ残基616−635、SEQ ID NO:4のおよそ残基522−541、ならびにそれらの対立遺伝子変種および同族体)をコードするものを含む。他の好ましい核酸は、以下で説明する標準的な配列解析技法により識別されるような、高い予測された抗原性を有するCatSper1蛋白質のエピトープをコードするものを含む。したがって、例えば、好ましい核酸は、SEQ ID NO:2のおよそ残基2−34、52−70、108−130、264−305、387−417、および606−614、SEQ ID NO:4のおよそ残基2−40、120−148、160−200、および512−520、ならびにそれらの対立遺伝子および哺乳類同族体内の配列をコードするものを含む。
【0055】
いくつかの実施形態では、CatSper1蛋白質の少なくとも構造ドメインと少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%、90%または95%のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸が提供される。したがって、いくつかの実施形態では、CatSper1蛋白質の膜貫通ドメイン(例えば、SEQ ID NO:2のおよそ残基447−468、481−502、516−533、542−563、583−604および649−670、SEQ ID NO:4のおよそ残基351−372、385−406、419−438、448−469、489−510、および555−576、ならびにそれらの対立遺伝子変種および同族体)、膜貫通ドメイン間の細胞外ループ(例えば、SEQ ID NO:2のおよそ残基469−480、534−541、および605−648、SEQ ID NO:4のおよそ残基373−384、439−448、および511−554、ならびにそれらの対立遺伝子変種および同族体)、または孔領域(例えば、SEQ ID NO:2のおよそ残基616−635、SEQ ID NO:4のおよそ残基522−541、ならびにそれらの対立遺伝子変種および同族体)と少なくとも80%、85%、90%または95%のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸が提供される。いくつかの好ましい実施形態では、CatSper1蛋白質と少なくとも80%、85%、90%または95%のアミノ酸配列同一性を有し、CatSper1活性を有するポリペプチドをコードする核酸が提供される。蛋白質がCatSper1活性を示す能力は、本来ならCatSper1活性を発現させることが可能な細胞(例えばCatSper1−/−突然変異体由来の***細胞)においてCatSper1−/−突然変異体(例えばCatSper1ノックアウト突然変異体)を補足し正常すなわちCatSper1+/+表現型を回復させる(例えば***運動性を回復させる)その能力によって測定可能である。
【0056】
他の実施形態では、厳しいハイブリダイゼーション条件下でCatSper1コーディング配列(例えば、SEQ ID NO:1またはSEQ ID NO:3)の少なくとも一部にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む単離された核酸が提供される。このような条件は、65℃で1.0×SSCの洗浄ステップ、およびその同等物を使用するハイブリダイゼーションを含む。より厳しい条件として、0.5×SSC、0.2×SSC、またはさらには0.1×SSCの洗浄ステップを含み得る。他の同等に厳しい条件は当技術分野で周知である。例えば、Ausubel et al., eds. (1989), Current Protocols in Molecular Biology, Vol.I, John Wiley & Sons, Inc., New York、を参照されたい。好ましい実施形態では、核酸はCatSper1活性を有するポリペプチドをコードする。
【0057】
もう1つの態様では、本発明は、CatSper1活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が、CatSper1配列が発現するように非相同調節領域に操作可能に接合する核酸を提供し、その核酸は単離されているか細胞内に存在するかを問わない。したがって、いくつかの実施形態では、非相同調節領域が、内在性CatSper1配列に操作可能に接合するように染色体に挿入されてもよい。いくつかの実施形態では、ポリペプチドはSEQ ID NO:2または4のアミノ酸配列と少なくとも80%、85%、90%または95%のアミノ酸配列同一性を有する。他の実施形態では、ポリペプチドをコードする核酸は、65℃で1.0×SSC、0.5×SSC、0.2×SSC、または0.1×SSCの洗浄ステップを含む条件下でSEQ ID NO:1またはSEQ ID NO:3の核酸の少なくとも一部にハイブリダイズする。
【0058】
いくつかの実施形態では、本発明の核酸は、長さが少なくとも50アミノ酸残基の、好ましくは長さが少なくとも100、200または300アミノ酸残基の、CatSper1配列を含むポリペプチドをコードする。これらのポリペプチドは、少なくとも1つの膜貫通ドメイン、少なくとも1つの細胞外ループドメイン、少なくとも孔領域、またはそれらの組合せを含むCatSper1配列を含み得る。いくつかの好ましい実施形態では、ポリペプチドはCatSper1活性を有する。このような活性としては、イオン電流の誘導;cAMP誘導性Ca2+流入の媒介;CatSper1−/−***で発現する時の***運動性の回復;および/またはCatSper1−/−***で発現する時の卵子を貫通する能力の回復があり得る。
【0059】
もう1つの態様では、本発明はCatSper1核酸(すなわち、CatSper1ゲノムDNA、mRNA、cDNAまたはそれらの増幅産物)の少なくとも一部を検出するキットを提供する。キットは、本発明の単離された核酸を、プローブおよびそのプローブを検出する手段として含む。プローブを検出する手段は、プローブに結合した検出可能な標識、または第1のプローブを検出するための二次核酸プローブ(例えば、単離された核酸に特異的にハイブリダイズする標識された二次核酸)であってもよい。
遺伝子コンストラクト
もう1つの態様では、本発明は、CatSper1遺伝子から選択された配列を含む遺伝子コンストラクトを提供する。いくつかの実施形態では、CatSper1遺伝子配列はCatSper1遺伝子のコーディング領域から選択され、他の実施形態では、CatSper1遺伝子配列は、開始コドンの5′側におよそ500〜1,500塩基、もしくはおよそ600〜1,000塩基、または終止コドンの3′側におよそ250〜1,000塩基、もしくはおよそ500〜750塩基だけ延びるCatSper1調節領域から選択されてもよい。
【0060】
一連の実施形態では、CatSper1コーディング配列(例えば、全コーディング領域、構造ドメインをコードする配列、潜在的エピトープをコードする配列、または有用なプライマーもしくはプローブをコードする配列)が、内在性または外来性の調節領域に操作可能に接合して発現コンストラクトを形成する。これらの目的のための有用な調節領域としては、内在性CatSper1調節領域、構成性プロモーター配列(例えば、CMV、SV40、EF2)、誘導性プロモーター配列(例えば、lacZ、tet)がある。多くの有用なベクター系が現在広く入手可能である。例えば、有用な細菌ベクターとしては、以下のものには限定されないが、pQE70、pQE60、pQE−9(Qiagen, Valencia, CA)、pBluescript II(Stratagene, La Jolla, CA)、pTRC99a、pKK223−3、pDR540およびpRIT2T(Pharmacia, Piscataway, NJ)、pTrc(Amann et al. (1988), Gene 69:301-315)ならびにpET 11d(Studier et al. (1990), Methods in Enzymol. 185:60-89)がある。酵母での発現のためのベクターの例としては、pYepSec1(Baldari et al. (1987), EMBO J. 6:229-234)、pMFa(Kurjan et al. (1982), Cell 30:933-943)、pJRY88(Schultz et al. (1987), Gene 54:113-123)、およびpYES2(Invitrogen Corporation, San Diego, Calif.)がある。CatSper1蛋白質はまた、例えばバキュロウィルス発現ベクターを用いて昆虫細胞(例えばSf9細胞)で発現することも可能であり、バキュロウィルス発現ベクターには、以下のものには限定されないが、pAcベクター(Smith et al. (1983), Mol. Cell Biol. 3:2156-2165)およびpVLベクター(Lucklow et al. (1989), Virology 170:31-39)がある。哺乳類発現ベクターの例としては、以下のものには限定されないが、pCDM8(Seed (1987), nature 329:840)およびpMT2PC(Kaufman et al. (1987), EMBO J. 6:187-195)がある。他の有用な真核生物ベクターとしては、以下のものには限定されないが、pXT1、pSG5(Stratagene, La Jolla, CA)、ならびにpSVK3、pBPV、pMSG、およびPSVLSV40(Pharmacia, Piscataway, NJ)がある。このように、当業者は、形質転換されるべき宿主細胞に適したベクター系を選択することができる。
【0061】
他の実施形態では、ベクターは、「ノックアウト」ベクターにおける欠損すなわち部分的CatSper1配列を含む。このようなベクターは当技術分野で周知であり、内在性配列内に突然変異を導入する一部相同な外来性配列による組換えによって内在性遺伝子が「ノックアウト」されたトランスジェニック生物を産生するために使用可能である。通常、ベクターは、問題とする遺伝子の全部または一部のいずれでもよい内在性標的配列を対象とする。ベクターは、標的の5′および3′端に相同な5′および3′フランキング配列を含む。5′および3′のフランキング配列間には、突然変異を含む配列がある。突然変異は、終止突然変異、フレームシフト突然変異、大欠失、またはさらには、内在性遺伝子を破壊することおよび相同組換えが成功するためのマーカーとして作用することの両方の働きをする新しいコーディング配列の導入であり得る。ノックアウトベクターについては以下でさらに説明する。
【0062】
他の実施形態では、CatSper1コーディング配列は、調節領域および非相同コーディング配列に接合して、融合蛋白質をコードする遺伝子コンストラクトまたは融合ベクターを形成することができる。融合ベクターおよび融合蛋白質は、CatSper1蛋白質の発現の上昇、CatSper1蛋白質の溶解度の上昇、およびCatSper1蛋白質の精製を助けること(例えば、アフィニティー精製のためのリガンドとして作用することにより)のために有用となり得る。蛋白質分解切断部位をCatSper1と非CatSper1蛋白質配列の接合部に導入することにより、CatSper1蛋白質が融合部分から容易に分離可能となるようにしてもよい。典型的な融合発現ベクターとしては、pGEX(Smith et al. (1988), Gene 67:31-40)、pMAL(New England Biolabs, Beverly, MA)およびpRIT5(Pharmacia, Piscataway, NJ)があり、これらはそれぞれ、グルタチオンS−トランスフェラーゼ(GST)、マルトースE結合蛋白質、またはプロテインAを標的組換え蛋白質に融合する。
【0063】
別の一連の実施形態では、レポーター遺伝子由来のコーディング領域が、CatSper1遺伝子の調節領域(例えば、5′端でSEQ ID NO:5、および随意に、3′端でSEQ ID NO:6)に操作可能に接合するベクターまたは遺伝子コンストラクトが産生される。このような遺伝子コンストラクトは、CatSper1遺伝子の転写を促進または抑制することによってCatSper1遺伝子発現を促進または抑制する化合物を識別し、または特徴づけるためのアッセイにおいて有用である。多様な好適なレポーター遺伝子が当業者に知られており、市販されている。例としては、以下のものには限定されないが、lacZおよびルシフェラーゼ遺伝子がある。
【0064】
有用なCatSper1調節要素としては、SEQ ID NO:5から選択された少なくとも100個の連続するヌクレオチド、好ましくは少なくとも200個の連続するヌクレオチド、より好ましくは少なくとも300〜500個の連続するヌクレオチドと少なくとも80%のヌクレオチド同一性を有する配列がある。有用な調節要素は、CatSper1遺伝子が発現する哺乳類細胞内の要素に操作可能に接合するコーディング配列の転写を促進する能力を保持するであろう。特に、有用な調節要素は、その要素が由来するCatSper1遺伝子が発現する細胞、またはそのCatSper1遺伝子の同族体が発現する細胞において転写を促進する能力を保持するであろう。
【0065】
形質転換細胞株
もう1つの態様では、本発明は、本発明の核酸分子で形質転換された細胞株を提供する。このような細胞株は、これらの核酸分子を単に増殖させることも可能であり(例えばクローニングベクターで形質転換された場合)、あるいはこれらの核酸によってコードされるポリペプチドを発現させることも可能である(例えば、発現ベクターで形質転換された場合)。このような形質転換細胞株は、本発明のCatSper1蛋白質およびCatSper1フラグメントを産生するために使用可能であり、あるいはCatSper1の発現または活性の促進、抑制、作動(agonize)、または拮抗(antagonize)の作用をする化合物のスクリーニングのためのアッセイに使用可能である。
【0066】
形質転換細胞は、細胞に、その細胞内で複製し、その細胞で発現するポリペプチド配列をコードし、および/または遺伝子座の発現に影響するようにその細胞のゲノムに組み込まれる外来性の核酸または核酸類似体を、導入することによって産生されてもよい。形質転換は、当技術分野でトランスフォーメーション、トランスフェクション、トランスダクション、エレクトロポレーション、バリスティックインジェクション等と呼ばれているような標準的方法のいずれによって実現されてもよい。形質転換の方法は、形質転換される細胞の型、および細胞に導入される遺伝子コンストラクトの性質にとって好適であるように選択される。
【0067】
形質転換のための好ましい細胞株としては、細菌細胞(例えばEscherichia coli)、酵母細胞(例えばSaccharomyces cerevisiae)、昆虫細胞(例えばキイロショウジョウバエ(Drosophila melanogaster)Schneider細胞)、線虫細胞(例えばCaenorhabditis elegans)、両生類細胞(例えばアフリカツメガエル(Xenopus)卵母細胞)、齧歯類細胞(例えば、ハツカネズミ(Mus musculus)(例えばマウス3T3繊維芽細胞)、クマネズミ(Rattus rattus)、チャイニーズハムスター卵巣細胞(例えばCHO−K1))、およびヒト細胞(例えば、ヒト皮膚繊維芽細胞、ヒト胎生腎細胞(例えばHEK−293細胞)、COS細胞)がある。本発明において有用な形質転換された哺乳類細胞としては、体細胞、胎児細胞、胚幹細胞、接合子、配偶子、生殖系列細胞およびトランスジェニック動物細胞がある。これらおよび多くの他のタイプの細胞がCatSper1蛋白質を産生する目的で形質転換され得るが、予備的研究によれば、アフリカツメガエル卵母細胞、CHO−K1およびHEK−293細胞は、チャネル電流のパッチクランプ測定により判定されるところでは検出可能なCatSper1活性を生じないことがわかっている。これらの後者の細胞は、CatSper1活性に必要な***の主部に存在する共同因子もしくは補助蛋白質、機能的チャネル組織化に必要な主部の構造属性、または必要なCatSper1翻訳後プロセッシングもしくは局在機序が欠けているようである。酵母2ハイブリッド手法および共免疫沈降手法を用いてライブラリーをスクリーニングし、CatSper1活性のモジュレーターを含むCatSper1補助、付随または相互作用蛋白質を識別することができる。
【0068】
CatSper1蛋白質のフラグメント、CatSper1蛋白質の融合蛋白質、またはマーカー蛋白質、を含むCatSper1蛋白質をCatSper1調節領域の制御下で産生するために、適当な細胞を上記の遺伝子コンストラクトのいずれかで形質転換してもよい。
【0069】
細胞は、形質転換される細胞型に適した当技術分野で既知のいかなる方法に従って形質転換してもよい。適当な方法は、例えば、Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, New York;および、Davis et al. (1986), Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier、に一般的に記載されているものを含み得る。特定の方法としては、リン酸カルシウム共沈(Graham et al. (1973), Virol. 52:456-467)、培養細胞内への直接マイクロインジェクション(Capecchi (1980), Cell 22:479-488)、エレクトロポレーション(Shigekawa et al. (1988), BioTechniques 6:742-751)、リポソーム媒介遺伝子導入(Mannino et al. (1988), BioTechniques 6:682-690)、脂質媒介トランスダクション(Felgner et al. (1987), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413-7417)、および高速マイクロプロジェクタイルを用いた核酸配送(Klein et al. (1987), Nature 327:70-73)がある。
【0070】
トランスジェニック動物
本発明はまた、野生型、対立遺伝子変種、キメラ、もしくはアンチセンスCatSper1配列が発現し、またはCatSper1配列が不活化もしくは欠失(例えば「ノックアウト」コンストラクト)、もしくはレポーターもしくはマーカー遺伝子で置換された(例えば「ノックインレポーター」コンストラクト)、トランスジェニック非ヒト動物モデルの産生も提供する。CatSper1配列は、トランスジェニック動物に対して同種他個体(例えばトランスジェニックマウス内のマウス配列)であっても、トランスジェニック動物に対してトランスペシフィック(transpecific)(例えばトランスジェニックマウス内のヒト配列)であってもよい。このようなトランスジェニック動物では、トランスジェニック配列は、誘導的、構成的または異所的のいずれで発現してもよい。発現は、組織特異的であっても、生体全体にわたってもよい。正常にはCatSper1遺伝子を含まない組織および細胞におけるCatSper1配列の操作された発現は、カチオンフラックスの新規な変質を生じ、新規な細胞または組織表現型につながる可能性がある。CatSper1配列の異所性の、または変質したレベルの発現は、細胞、組織および/または発生表現型を変質させることがある。トランスジェニック動物は、CatSper1活性における欠損から生じる障害のモデルとして有用である。
【0071】
トランスジェニック動物はまた、CatSper1活性に対する効果について化合物をスクリーニングするためにも有用である。レポーターコンストラクトで形質転換されたトランスジェニック動物は、CatSper1遺伝子および蛋白質の発現に対する小分子または薬物または物理的摂動の転写効果をインビボで測定するために使用可能である。本発明のトランスジェニック動物は、治療的利用のためにこのような化合物をスクリーニングするのに使用可能である。
【0072】
本発明の動物モデルでの使用に好適な動物種としては、以下のものには限定されないが、ラット、マウス、ハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、および非ヒト霊長動物(例えば、アカゲザル、チンパンジー)がある。初期研究には、トランスジェニック齧歯動物(例えばマウス)が、比較的その飼養が容易であり寿命が短いために好ましい。トランスジェニック非ヒト霊長動物は、ヒトとの類似性がより高いために、より長期の研究に好ましいであろう。
【0073】
本明細書に開示される等により可能とされる核酸を用いて、トランスジェニック動物を作製するにはいくつかの利用可能な手法がある。例えば、可能とされる動物モデルには以下のものがある:(1)CatSper1遺伝子の少なくとも機能性フラグメントをコードする配列が、外来性または内在性のいずれかのプロモーター要素の調節下で、ミニ遺伝子(すなわち、イントロンが除去されたcDNAに基づくCatSper1遺伝子の遺伝子コンストラクト)または大きいゲノムフラグメントのいずれかとして、追加遺伝子として動物のゲノムに組換え的に導入された動物;(2)CatSper1遺伝子の少なくとも機能性フラグメントをコードする配列が、相同組換えまたは遺伝子ターゲッティングによって動物の内在性CatSper1遺伝子の一方または両方のコピーを組換え的に置換された動物;(3)動物の相同CatSper1遺伝子の1つの一方または両方のコピーが、相同組換えまたは遺伝子ターゲッティングによって、ヒト同族体をコードする配列による部分置換によって組換え的に「ヒト化」された動物;(4)レポーター遺伝子をコードする配列が、相同組換えによって内在性CatSper1遺伝子を置換した動物;および(5)動物のCatSper1配列の一方または両方のコピーが、相同組換えによる1つまたは複数のヌクレオチドの挿入、欠失または置換により部分的にまたは完全に不活化された「ノックアウト」動物。本発明のこれらおよびその他のトランスジェニック動物は、CatSper1遺伝子および/または蛋白質における欠損から生じる不妊等の障害のモデルとして有用である。これらの動物は、CatSper1遺伝子および/または蛋白質に対する効果について化合物をスクリーニングするためにも有用である。
【0074】
動物モデル(例えばトランスジェニックマウス)を産生するには、好ましくは、野生型もしくは対立遺伝子変種のCatSper1配列、またはCatSper1蛋白質の少なくとも機能性フラグメントをコードする野生型もしくは対立遺伝子変種の組換え核酸が、卵母細胞もしくは胚幹細胞のマイクロインジェクション、またはこのような細胞のその他の形態の形質転換の標準的技法を用いて、生殖系列細胞または幹細胞に挿入される。別法として、成体からの他の細胞を使用してもよい。これらまたは類似のプロセスによって産生される動物はトランスジェニックであると呼ばれる。同様に、内在性CatSper1配列を不活化または置換したい場合、卵母細胞、胚幹細胞等の細胞を用いた相同組換えが使用可能である。これらまたは類似のプロセスによって産生される動物は「ノックアウト」(不活化)または「ノックイン」(置換)モデルと呼ばれる。
【0075】
卵母細胞注入の場合、本発明の組換えDNAコンストラクトの1つまたは複数のコピーを、受精したばかりの卵母細胞の前核に挿入してもよい。次に、この卵母細胞を偽妊娠代理母に再着床させる。生きて生まれた動物は、挿入された組換えトランスジーン配列の存在に対する標準的なDNA/mRNA解析(例えば仔マウスの尾静脈からの)を用いて、構成要素がスクリーニングされる。トランスジーンは、酵母人工染色体(YAC)、細菌人工染色体(BAC)等の染色体DNAフラグメントの一部として;内在性プロモーターもしくは非相同プロモーターのいずれかを有するcDNAとして;または最適な発現に必要であることがわかっているコーディング領域等の要素の全部を含むミニ遺伝子として、宿主に導入された完全なゲノム配列のいずれでもよい。
【0076】
トランスジーンを作製するには、問題にしている標的配列(例えば、野生型または対立遺伝子変種のCatSper1配列)が通常、その配列からのRNAの発現を調節するプロモーター要素の下流に位置するクローニング部位にライゲーションされる。コーディング配列の下流には通常、ポリアデニル化配列がある。トランスジーンを作製する代替手法は、外来性プロモーターおよび調節配列を用いてトランスジーンの発現を促進することである。最後に、適当な調節配列とともに所望の全遺伝子を含むYACのような大きいゲノムDNAフラグメントを用いてトランスジーンを作製することも可能である。
【0077】
動物モデルは、相同組換えのために内在性CatSper1配列をターゲッティングすることによって作製してもよい。このようなターゲッティング事象は、ヒトの疾患に関連するアミノ酸変化またはその他の異常配列(例えば、もとの動物配列よりもヒト配列に似ている配列)を生じる内在性配列の除去(ノックアウト)または内在性配列の変質の効果を有し得る(ノックイン動物モデル)。これを達成するために多数のベクターが入手可能であり、ターゲッティングされるマウス等の動物のゲノムのためのゲノムDNAの適当なソースが市販されている(例えば、GenomeSystems Inc., St. Louis, MO)。
【0078】
これらのターゲッティングベクターコンストラクトの典型的特徴は、2〜4kbのゲノムDNAが、選択可能なマーカー(例えば、「ネオマイシンカセット」と呼ばれる固有のプロモーター要素の支配下にある細菌ネオマイシン耐性遺伝子)の5′側にライゲーションされていることである。そして、問題としている遺伝子からの第2のDNAフラグメントが、ネオマイシンカセットの下流であるが第2の選択可能なマーカー(例えばチミジンキナーゼ)の上流にライゲーションされる。DNAフラグメントは、ベクターに含まれるいずれか1つの配列による内在性配列の相同置換によって突然変異配列が標的動物の生殖系列に導入され得るように選択される。別法として、配列は、正常であればネオマイシンカセットの周囲のベクターの左右のアームの間に存在する配列の欠失を引き起こすように選択してもよい。前者はノックインとして知られ、後者はノックアウトとして知られている。
【0079】
本発明の組換えDNAコンストラクトを挿入するために、初期胚のレトロウィルス感染を行うことも可能である。この方法では、トランスジーン(例えば、野生型または対立遺伝子変種のCatSper1配列)がレトロウィルスベクターに挿入される。このレトロウィルスベクターは、部分的トランスジェニック動物を作製するために発生の初期段階中に胚(例えば、マウスまたは非ヒト霊長類胚)に直接感染させるために使用され、その部分的トランスジェニック動物の一部は生殖系列細胞にトランスジーンをもつ。
【0080】
別法として、幹細胞の集団を用いた相同組換えにより、成功した形質転換体の集団のスクリーニングが可能となる。いったん識別されると、これらは胚盤胞に注入されることが可能であり、その結果として得られる動物の一部は、トランスジーンの生殖系列伝播を示すであろう。
【0081】
トランスジェニック動物を作製する技法は、相同組換えまたは遺伝子ターゲッティングの技法とともに、現在では広く受け入れられ実施されている。例えばマウス胚の操作に関する実験室マニュアルが入手可能であり、これにはトランスジェニックマウスの産生のための標準的な実験室技法が詳述されている(Hogan, et al. (1986), Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY)。
【0082】
CatSper1ノックアウトマウスの実際の産生についての詳細は、後述の実施例3で提供される。
【0083】
CatSper1蛋白質およびポリペプチド
もう1つの態様では、本発明はCatSper1蛋白質の実質的に純粋な製剤を提供する。蛋白質は、本発明の抗体(下記参照)による免疫アフィニティー精製のような標準的技法を用いて***細胞から単離できるが、好ましくは、本発明の形質転換細胞から(この場合には蛋白質はより高いレベルで発現しているであろう)、および随意に、より容易に単離および/または精製される融合蛋白質として、単離される。
【0084】
いくつかの実施形態では、CatSper1蛋白質は、CatSper1コーディング領域の翻訳される配列全体を含む。このような完全長CatSper1蛋白質の例としては、SEQ ID NO:2として開示されたヒトCatSper1蛋白質およびSEQ ID NO:4として開示されたそのマウス同族体、ならびに、これらのヒトCatSper1蛋白質の対立遺伝子および哺乳類同族体ならびにその機能的同等物を含む他のCatSper1蛋白質がある。
【0085】
他の実施形態では、CatSper1蛋白質はCatSper1フラグメントである。このようなフラグメントとしてはCatSper1蛋白質の構造ドメインがあり、これは蛋白質の膜貫通、ループおよび孔形成領域を含む。好ましい構造ドメインとしては、ヒトCatSper1蛋白質の膜貫通ドメイン(すなわち、SEQ ID NO:2のおよそ残基447−468、481−502、516−533、542−563、583−604および649−670、SEQ ID NO:4のおよそ残基351−372、385−406、419−438、448−469、489−510、および555−576)、膜貫通ドメイン間の細胞外ループ(すなわち、SEQ ID NO:2のおよそ残基469−480、534−541、および605−648、SEQ ID NO:4のおよそ残基373−384、439−448、および511−554)、および孔領域(すなわち、SEQ ID NO:2のおよそ残基616−635、SEQ ID NO:4のおよそ残基522−541)、ならびにそれらの対立遺伝子変種および同族体がある。他のCatSper1フラグメントとしては、後述の標準的な配列解析技法によって識別されるような、CatSper1蛋白質の潜在的に有用なエピトープがある。したがって、例えば、好ましいCatSper1フラグメントとしては、SEQ ID NO:2のおよそ残基2−34、52−70、108−130、264−305、387−417、および606−614、SEQ ID NO:4のおよそ残基2−40、120−148、160−200、および512−520、ならびにそれらの対立遺伝子および哺乳類同族体内のヒトCatSper1配列がある。
【0086】
いくつかの実施形態では、CatSper1蛋白質の少なくとも構造ドメインと少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%、90%または95%のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドが提供される。したがって、いくつかの実施形態では、CatSper1蛋白質の膜貫通ドメイン(例えば、SEQ ID NO:2のおよそ残基447−468、481−502、516−533、542−563、583−604および649−670、SEQ ID NO:4のおよそ残基351−372、385−406、419−438、448−469、489−510、および555−576、ならびにそれらの対立遺伝子変種および同族体)、膜貫通ドメイン間の細胞外ループ(例えば、SEQ ID NO:2のおよそ残基469−480、534−541、および605−648、SEQ ID NO:4のおよそ残基373−384、439−448、および511−554、ならびにそれらの対立遺伝子変種および同族体)、または孔領域(例えば、SEQ ID NO:2のおよそ残基616−635、SEQ I
NO:4のおよそ残基522−541、ならびにそれらの対立遺伝子変種および同族体)と少なくとも80%、85%、90%または95%のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドが提供される。いくつかの好ましい実施形態では、CatSper1蛋白質と少なくとも80%、85%、90%または95%のアミノ酸配列同一性を有し、CatSper1活性を有するポリペプチドが提供される。蛋白質がCatSper1活性を示す能力は、本来ならCatSper1活性を発現させることが可能な細胞(例えばCatSper1−/−突然変異体由来の***細胞)においてCatSper1−/−突然変異体(例えばCatSper1ノックアウト突然変異体)を補足し正常すなわちCatSper1+/+表現型を回復させる(例えば***運動性を回復させる)その能力によって測定可能である。
【0087】
いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチドは、長さが少なくとも50アミノ酸残基の、好ましくは長さが少なくとも100、200または300アミノ酸残基の、CatSper1配列を含む。これらのポリペプチドは、少なくとも1つの膜貫通ドメイン、少なくとも1つの細胞外ループドメイン、少なくとも孔領域、またはそれらの組合せを含むCatSper1配列を含み得る。いくつかの好ましい実施形態では、ポリペプチドはCatSper1活性を有する。このような活性としては、細胞(例えば卵母細胞)内で発現する時のイオン電流の誘導;cAMP誘導性Ca2+流入の媒介;CatSper1−/−***で発現する時の***運動性の回復;および/またはCatSper1−/−***で発現する時の卵子に浸透する能力の回復があり得る。
【0088】
CatSper1蛋白質およびポリペプチドに対する抗体
もう1つの態様では、本発明は、CatSper1蛋白質に対する抗体の実質的に純粋な製剤、およびこのような抗体を作製する方法を提供する。特に、本発明は、高い予測された抗原性を有するCatSper1エピトープに対して産生される抗体を提供する。したがってこの抗体は、野生型および/または変種形態のCatSper1蛋白質に選択的に結合し、よってそれを単離または識別するであろう。
【0089】
抗体は、完全長CatSper1蛋白質に対して、CatSper1蛋白質のフラグメントに対して、またはこの蛋白質に特徴的であってこれを他の蛋白質から実質的に区別するCatSper1エピトープを用いて、産生され得る。好ましい実施形態では、エピトープは、CatSper1蛋白質の少なくとも6〜12、好ましくは10〜20、より好ましくは15〜30個の連続するアミノ酸残基の蛋白質配列である。特定実施形態では、抗体は、SEQ ID NO:2のおよそ残基2−34、52−70、108−130、264−305、387−417、および606−614、ならびにSEQ ID NO:4のおよそ残基2−40、120−148、160−200、および512−520内の配列から選択されるCatSper1エピトープに対して産生される。他の好ましいエピトープとしては、これらのエピトープの対立遺伝子および哺乳類同族体がある。高い予測された抗原性を有するエピトープが、GCGおよびMacVector(Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, Madison, WI; Accelrys Inc., San Diego, CA)を含む標準的なプログラムを用いて、疎水性、表面確率(surface probability)および抗原性インデックス(antigenic index)の予測により識別された。また、Jameson and Wolf (1988), Comput. Appl. Biosci. 4:181-186、も参照されたい。
【0090】
CatSper1免疫原製剤は、粗抽出物(例えば、蛋白質を発現させる細胞のミクロソーム分画)から、蛋白質もしくはペプチドを自然にもしくは組換え的に発現させる細胞から実質的に精製された蛋白質もしくはペプチドから、または小さい免疫原の場合には化学的ペプチド合成によって、産生され得る。CatSper1免疫原は、非CatSper1領域がそのアジュバント特性および/または精製を容易にする能力のために選択された融合蛋白質の形態であることも可能であろう。
【0091】
本発明の抗体は、ポリクローナルでもモノクローナルでもよく、またはFabフラグメント、F(ab′)2フラグメント、Fvフラグメント、および一本鎖Fvフラグメント(scFv)を含む抗体フラグメントであってもよい。さらに、本発明の方法によって有用な抗体を識別した後、上に列挙した抗体フラグメントのいずれかとともに、CatSper1蛋白質に対する非ヒト抗体に基づくキメラおよび/またはヒト化抗体を含む、組換え抗体を作製してもよい。CatSper1蛋白質についての本明細書の開示と、本明細書により可能となる他のCatSper1蛋白質の特徴づけとに照らして、当業者は、任意の種々の標準的手段によって上記の抗体を産生することも可能である。抗体技法の概要については、Antibody Engineering, 2nd Ed., Borrebaek, ed., Oxford University Press, Oxford (1995)、を参照されたい。
【0092】
一般的に、モノクローナル抗CatSper1抗体は次のように産生することができる。まず、好適な担体または希釈剤にCatSper1免疫原を入れて、マウス、ウサギ、ヤギ等の好適な動物に注射する。担体蛋白質またはアジュバントが利用可能であり、必要に応じて追加接種注射(例えば、8〜10週間にわたって週に2または3回)を使用可能である。体液性応答を発生させた後、動物を屠殺し、その脾臓を取り出し、適当な緩衝液(例えばリン酸緩衝食塩液)に再懸濁する。脾臓細胞はリンパ球源として働き、その一部は適当な特異性の抗体を産生することになる。次にこれらの細胞を不死化細胞株(例えば骨髄腫)と融合し、融合産物を選択剤(例えばHAT)の存在下で組織培養ウェルに入れる。ウェルを順次スクリーニングし再プレーティングして、そのたびごとに有用な抗体を形成する細胞を選択する。通常、ウェルが抗体産生について陽性である単一クローンを含むまで、数回のスクリーニングおよび再プレーティング手順が実行される。このようなクローンにより産生されるモノクローナル抗体は、プロテインAセファロースを用いたアフィニティークロマトグラフィーのような標準的方法によって、イオン交換クロマトグラフィーによって、またはこれらの技法の変形および組合せによって、精製することが可能である。
【0093】
本発明の抗体は、さまざまな用途で使用可能である。例えば、抗体はCatSper1蛋白質の精製プロセス(すなわち、免疫アフィニティー精製)において、***中のCatSper1蛋白質の存在またはレベルを検出するためのアッセイにおいて(例えば、CatSper1関連障害の診断検査において)、または形質転換細胞中のCatSper1発現の存在またはレベルの測定のためのアッセイにおいて(例えば、CatSper1発現のレギュレーターのアッセイにおいて、CatSper1蛋白質を発現させる細胞を識別するためのウェスタンブロットにおいて、またはCatSper1蛋白質の細胞位置または細胞外位置を確定するための免疫細胞化学もしくは免疫蛍光技法において)、使用可能である。
【0094】
本発明の抗体は、診断および/または治療の用途のために他の化合物または材料と結合または共役させてもよい。例えば、抗体は、画像化または治療のため、放射性核種、蛍光化合物(例えばローダミン)、または酵素のような標識と結合させてもよい。標識と抗体の結合は、共有結合でも非共有結合でもよい。
【0095】
もう1つの態様では、本発明はCatSper1蛋白質の少なくともエピトープを検出するキットを提供する。キットは抗CatSper1抗体および当該抗体を検出する手段を含む。抗体を検出する手段は、抗体に結合する検出可能な標識であっても、抗CatSper1抗体を検出する二次抗体(例えば、ウサギ抗CatSper1抗体を検出するための二次抗体としての、標識されたヤギ抗ウサギIg抗体)であってもよい。
CatSper1発現または活性のモジュレーターのアッセイ
もう1つの態様では、本発明はCatSper1発現または活性のモジュレーターに対するアッセイを提供する。モジュレーターは、CatSper1遺伝子および/または蛋白質の転写、翻訳、翻訳後プロセッシング、局在、または活性に影響し得る。
【0096】
したがって、一連の実施形態では、本発明の形質転換細胞を候補化合物と接触させ、CatSper1の発現または活性に対する化合物の効果を決定する。一般的に、アッセイは、CatSper1蛋白質を発現させる細胞と候補化合物を接触させること、および細胞においてCatSper1活性のインジケーターを測定することを必要とする。インジケーターは、転写(例えばmRNAレベル)、翻訳(例えば蛋白質レベル)、翻訳後プロセッシング(例えば特異的グリコシル化)、局在(例えば免疫組織化学)、または活性(例えばナトリウム等の1価イオンフラックス;カルシウム等の2価イオンフラックス)のインジケーターであり得る。次に、インジケーター測定値を基準レベルと比較し、候補化合物がインジケーターの上昇または低下を引き起こしたかどうかを判定する。基準レベルは、外因性(例えば所定のベースラインレベル)でも内因性(例えば候補化合物との接触前の同一細胞の測定値)でもよい。上昇または低下が有意である(1つまたは複数の細胞からの単一の読みまたは複数の読みに基づいて)場合、候補化合物はCatSper1活性の潜在的モジュレーターとして識別される。CatSper1活性の変化に対するアッセイは、他の遺伝子について当技術分野で通常使用されるもののいずれを含んでもよい。例えば、CatSper1のmRNAまたは蛋白質の存在またはレベルの変化を検出して、CatSper1発現のエンハンサーまたは抑制体を識別してもよい。別法として、本発明のレポーター遺伝子コンストラクトを使用する場合、レポーターに特徴的な生化学的または表現型変化を、候補化合物がレポーター遺伝子発現を促進または抑制することの指標として使用することができる。他の実施形態では、CatSper1蛋白質の活性の変化は、例えば、CatSper1蛋白質により媒介されるカチオンのフラックスを測定することによって、または全細胞もしくはチャネル電流を測定することによって、検出することができる。イオンフラックスの測定は、特異的イオンの濃度に応じて色を変える発色団の使用により容易になり得る。成熟***細胞に対する候補化合物の効果を検査して、本発明の形質転換細胞で得られる結果を確認または検証することができる。
【0097】
CatSper1に結合する化合物は、CatSper1活性を変調する候補である。したがって、別の一連の実施形態では、化合物のライブラリーをスクリーニングし、候補化合物をCatSper1蛋白質、またはCatSper1蛋白質の少なくとも構造ドメインと接触させてCatSper1に結合する化合物を識別することによって、CatSper1活性を変調する候補を識別してもよい。これらの方法で使用可能なCatSper1構造ドメインとしては上記のもの(すなわち、膜貫通ドメイン、細胞外ループ、孔領域)があるが、細胞外ループおよび孔領域が好ましい。このような方法では、CatSper1蛋白質またはCatSper1構造ドメインを固定化(例えばカラムまたは微粒子に)して候補化合物の溶液をCatSper1部分と接触させてもよく、または候補化合物を固定化(例えばカラムまたは微粒子に)してCatSper1部分の溶液を候補化合物と接触させてもよい。別法として、いくつかの実施形態では、候補化合物もCatSper1部分も固定化せず、むしろ両方とも溶液中に入れ、例えば、相手と結合した粒子の凝集によって結合を検出する。結合は、当技術分野で周知の方法(例えば、潜在的結合対の一方の成分の放射性または蛍光標識;結合のプラズモン共鳴検出;凝集アッセイにおける混濁度変化)によって検出することが可能である。生理的条件(例えば、精巣もしくは副精巣内、または膣、子宮もしくは輸卵管内)下でCatSper1蛋白質への有意な結合(例えばKd≦10μM)を示す化合物は、CatSper1活性の潜在的モジュレーターである。
【0098】
妊性を変調する方法
CatSper1遺伝子および蛋白質は、潜在的な避妊薬の理想的な標的である。インビトロ受精結果は、CatSper1-/-***が卵子を受精させることができないことを示しているので、CatSper1の特異的遮断薬が雄または雌のいずれかによって摂取された場合に有効である可能性がある。成熟***へのCatSper1の制限された局在は、特異的遮断薬が他の組織に影響せず、したがって副作用は低いかまたは存在しないはずであることを意味している。さらに、突然変異マウスの正常な発生および行動(生殖行動を含む)はこのような予測を支持する。最後に、チャネルは、新規な構造となるので、新規なチャネルアゴニストまたはアンタゴニストの優れた標的となる可能性がある。
【0099】
したがって、もう1つの態様では、本発明は、CatSper1遺伝子または蛋白質の発現または活性を低下させることによって妊性を低下させる方法を提供する。発現または活性のこのような低下は、CatSper1遺伝子の発現を抑制する小分子によって、CatSper1 mRNAの翻訳を阻害するアンチセンス分子によって、CatSper1翻訳または翻訳後プロセッシングと干渉する小分子によって、CatSper1局在と干渉する小分子によって、またはイオンチャネルとしてのCatSper1活性を遮断する分子によって、実現することができる。Fabフラグメント、F(ab′)2フラグメント、Fvフラグメント、および一本鎖Fvフラグメント(scFv)のような抗体フラグメントを含む抗体もまた、蛋白質の細胞外ドメインに結合することによりCatSper1活性を阻害し、それによりその活性を遮断するために使用可能である。
【0100】
CatSper1発現または活性のほとんどの抑制体またはアンタゴニストは可逆的であるか、または成熟***にのみ影響するであろうから、妊性に対するこのような化合物の効果は可逆的であろう。というのも、分子は時間とともに体内から除去され、新たな***は絶えず産生されているからである。したがって、CatSper1発現または活性の抑制体またはアンタゴニストは、可逆的不妊を引き起こし得るので、ヒトの避妊薬として使用可能である。このような避妊薬は、膣、子宮または輸卵管内で十分な濃度を達成してCatSper1活性を有効に阻害することにより***運動性および***がZPを貫通する能力を低下させる場合には、女性によって経口的または非経口的(例えば、注射、経皮的パッチ、または生分解性インプラント)に摂取されることが可能である。同様に、このような避妊薬は、精巣または***内で十分な濃度を達成してCatSper1発現または活性を有効に阻害することにより***運動性および***がZPを貫通する能力を低下させる場合には、男性によって経口的または非経口的に摂取されることが可能である。別法として、このような化合物は、避妊具、子宮頸キャップ、または避妊用膣用スポンジ、発泡体もしくはゼリーとともに使用するための潤滑剤、湿潤剤、発泡体またはゼリー中に処方されてもよい。
【0101】
別の一連の実施形態では、CatSper1遺伝子および蛋白質の抑制体またはアンタゴニストは、非ヒト哺乳動物を治療するための避妊薬として使用可能である。これらの実施形態は、ヒトの避妊についての上記のものに類似している。このような避妊薬は、ペットとして養われる家畜化された動物に対して、他の商業的価値のある家畜化された動物(例えば、ウシ、ヒツジ、ウマ)に対して、または害獣(例えば、マウス、ラット、アライグマ、ジリス)に対して使用可能である。いくつかの実施形態では、避妊薬は経口的に利用可能であり、動物の飼料源に混合することができる。他の実施形態では、避妊薬は非経口的(例えば、注射、経皮的パッチ、または生分解性インプラント)に投与してもよい。
【0102】
哺乳類CatSper1遺伝子および蛋白質ならびにCatSper1遺伝子および蛋白質の魚類、両生類および昆虫同族体が実質的な配列同一性を共有する限り、哺乳類CatSper1遺伝子および蛋白質の抑制体またはアンタゴニストは、害となる魚類、両生類および昆虫(例えばカ)の制御にも使用可能である。さらに、CatSper1遺伝子および蛋白質の非哺乳類同族体は、このような同族体に、より特異的または有効な別の抑制体およびアンタゴニストを識別するために使用可能である。
【0103】
CatSper1遺伝子型決定およびCatSper1関連障害診断の方法
もう1つの態様では、本発明は、CatSper1遺伝子に関して被験体を遺伝子型決定する方法、および不妊のようなCatSper1関連障害を診断する方法を提供する。したがって、例えば、被験体のCatSper1核酸(またはその一部)を検査し、その被験体のCatSper1遺伝子型が野生型に対して配列の突然変異を含むかどうかを確認することが可能である。特に重要であるのは、機能性CatSper1蛋白質の産生を妨げる、終止を導入する突然変異またはフレームシフト突然変異であろう。しかし、CatSper1活性の低下を引き起こす点突然変異もまた識別することができる。同様に、本発明の抗体は、被験体の***を検査して、CatSper1蛋白質の存在またはレベルを決定するために使用可能である。特に注目すべきなのは、CatSper1蛋白質の不存在またはそのレベルの有意な低下である。しかし、点突然変異もまた不妊を引き起こす可能性があり、突然変異配列を含みまたはそれにより影響されるエピトープに特異的な抗体によって検出され得る。被験体のCatSper1遺伝子型の決定は、遺伝子もしくは生殖カウンセリングのため、またはCatSper1欠陥から生じる不妊を診断するために使用可能である。
【0104】
被験体のCatSper1遺伝子型を決定するため、またはCatSper1関連障害を診断するためには、本発明の核酸を、被験体のDNA/mRNAのポリメラーゼ連鎖反応(PCR)(例えばアンカーPCRもしくはRACE PCR)、またはリガーゼ連鎖反応(LCR)増幅におけるプライマーとして使用可能である。例えば、米国特許第4,683,195号および米国特許第4,683,202号;Landegran et al. (1988), Science 241:1077-1080;Nakazawa et al. (1994), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:360-364;ならびにAbravaya et al. (1995), Nucleic Acids Res. 23:675-682、を参照されたい。本発明の核酸を用いて被験体のDNA/mRNAを増幅するための他の有用な方法としては、自立配列複製(self-sustained sequence replication)(例えば、Guatelli et al. (1990), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874-1878)、転写増幅(例えば、Kwoh et al. (1989), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173-1177)、およびQ−βレプリカーゼ系(例えば、Lizardi et al. (1988), Bio/Technology 6:1197)がある。結果として生じる増幅産物の有無またはサイズ(例えば、Saiki et al. (1986), Nature 324:163; Saiki et al. (1989), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:6230; Gibbs et al. (1989), Nucleic Acids Res. 17:2437-2448; Prossner (1993), Tibtech 11:238; Gasparini et al. (1992), Mol. Cell Probes 6:1; Barany (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:189)、増幅産物の直接配列決定(例えば、Maxim and Gilbert (1977), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:560; Sanger (1977), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:5463)、および他の標準的な解析技法が、CatSper1遺伝子型を決定するために使用可能である。増幅産物は、以下で説明する技法の多くでも使用可能である。
【0105】
本発明の核酸は、被験体内の相補的または不完全に相補的な配列を識別するために、ハイブリダイゼーションおよび/またはコンフォメーションに基づくアッセイにおけるプローブとしても使用可能である。
【0106】
例えば、いくつかの実施形態では、突然変異は、固定化されたコントロール核酸に試料核酸を選択的にハイブリダイズさせることによって識別することができる。コントロールは、フィルターもしくはカラムに吸着されてもよく、または数百もしくは数千個のオリゴヌクレオチドプローブを含む高密度整列アレイとして並べてもよい(例えば、Cronin et al. (1996), Human Mutation 7:244-255; Kozal et al. (1996), Nature Medicine 2:753-759、を参照)。
【0107】
他の実施形態では、酵素的または化学的切断を用いて、ミスマッチ塩基における試料およびコントロール配列の二本鎖を切断または制限してもよい(例えば、Myers et al. (1985), Science 230:1242)。例えば、RNA/DNA二本鎖をRNAアーゼで処理し、DNA/DNAハイブリッドをS1ヌクレアーゼで処理して、ミスマッチ塩基で二本鎖を消化することが可能であり、G/Aミスマッチは大腸菌mutY酵素によりAで切断され、G/TミスマッチはヒトチミジンDNAグリコシラーゼによりTで切断される(例えば、Hsu et al. (1994), Carcinogenesis 15:1657-1662、を参照)。ミスマッチの化学的切断は、例えば、ヒドロキシルアミン、四酸化オスミウムおよび/またはピペリジンを用いて、使用可能である。概括的には、例えば、Cotton et al. (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:4397;Saleeba et al. (1992), Methods Enzymol. 217:286-295;および米国特許第5,459,039号を参照されたい。
【0108】
他の実施形態では、突然変異で、制限酵素またはリボザイムに対する切断点として働く特異的配列を作成または破壊することができる。例えば、制限フラグメント長多型(RFLP)解析を使用可能である。この解析では、(増幅された)試料DNAを少なくとも1つの制限エンドヌクレアーゼで消化し、結果として得られるフラグメント長を解析してコントロールと比較することにより、制限フラグメント長のパターンに影響する突然変異の有無を決定する。同様に、配列特異的リボザイムを用いて、リボザイム切断部位を作成または破壊する突然変異を識別することが可能である。例えば米国特許第5,498,531号を参照されたい。
【0109】
他の実施形態では、突然変異は、一本鎖核酸としてまたは二本鎖としてのいずれでも、配列の電気泳動移動度に対するその効果によって検出することができる。例えば、一本鎖DNA高次構造多型(SSCP)解析(Orita et al. (1989), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2766;Cotton (1993), Mutat. Res. 285:125-144;Hayashi (1992), Genet. Anal. Tech. Appl. 9:73-79;およびKeen et al. (1991), Trends Genet. 7:5)、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動(DGGE)(Myers et al. (1985), Nature 313:495)、および温度勾配ゲル電気泳動(Rosenbaum and Reissner (1987), Biophys. Chem. 265:12753)が使用可能である。
【0110】
CatSper1遺伝子および蛋白質における突然変異を検出するこれらおよび他の方法は、本明細書に開示される核酸および蛋白質配列に基づいて、当業者には明らかであろう。
【0111】
インビトロ受精
もう1つの態様では、本発明は、低下したCatSper1発現または活性によって特徴づけられる***による卵子のインビトロ受精の方法を提供する。下記の実施例に示すように、CatSper1欠損***は、その運動性およびそのZPを貫通する能力において以外のすべての点では正常であると思われる。さらに、CatSper1欠損***は、ZPが除去された卵子を受精させる能力がある。そこで本発明は、CatSper1欠損雄のインビトロ受精の方法を提供する。この方法では、このような雄の***が、CatSper1欠損を克服するように処置され、またはZPが除去された卵子と接触させられる他の遺伝子欠損が原因でZPを貫通することができない***ができることもあるので、本方法は、ZP貫通に影響する遺伝子欠損、または以前にZP無処置卵子を用いてはインビトロ受精が不成功であった遺伝子欠損を有する他の雄にも拡張可能である。
【0112】
CatSper1媒介性不妊を治療する方法
もう1つの態様では、本発明は、CatSper1欠損雄における不妊を治療する方法を提供する。この方法では、CatSper1発現のエンハンサーまたはCatSper1活性のアゴニストが被験体に投与される。他の実施形態では、遺伝子または蛋白質治療を使用して、CatSper1遺伝子または蛋白質が欠損している***(または***幹細胞)にCatSper1遺伝子または蛋白質を提供してもよい。遺伝子治療の場合、CatSper1蛋白質をコードする遺伝子コンストラクトを使用して、CatSper1遺伝子または蛋白質が欠損している***または***幹細胞においてCatSper1蛋白質の発現を引き起こすことができる。
【0113】
もう1つの態様では、交配対(例えばヒトの男女)の不妊は、雄の***に存在する抗原に対して雌によって作り出される抗体が原因である場合がある。いくつかの場合、CatSper1蛋白質のエピトープに対して抗体が誘導され得る。したがって、本発明は、雌の泌尿生殖路に存在する抗CatSper1抗体によって引き起こされる抗CatSper1抗体媒介性不妊を診断する方法も提供する。本方法は、雌に存在する抗体の試料を取得し、その抗体をCatSper1蛋白質またはCatSper1蛋白質のフラグメントに接触させることを含む。いくつかの実施形態では、CatSper1フラグメントは、高い予測された抗原性を有するCatSper1蛋白質のエピトープ(例えば、SEQ ID NO:2のおよそ残基2−34、52−70、108−130、264−305、387−417、および606−614、SEQ ID NO:4のおよそ残基2−40、120−148、160−200、および512−520、ならびにそれらの対立遺伝子および哺乳類同族体)である。これらの方法では、雌の抗体もしくはCatSper1蛋白質/フラグメントのいずれかが随意に固定化されてもよく、または雌の抗体もしくはCatSper1蛋白質/フラグメントのいずれかが随意に、抗体とCatSper1蛋白質/フラグメントとの間の結合の検出を容易にするために検出可能に標識されてもよい。
【0114】
これらの場合、過剰のCatSper1蛋白質、または関連エピトープを含むCatSper1蛋白質の少なくともフラグメントが、雌の泌尿生殖路に存在する抗CatSper1抗体の結合部位を飽和することにより、抗体媒介性不妊を阻害または低減することができる。別法として、抗イディオタイプ抗体(すなわち、規定の特異性を有する別の抗体の可変領域に特異的に結合する抗体)を使用可能である。すなわち、抗CatSper1抗体に特異的に結合する抗体を使用して、雌の泌尿生殖路に存在する抗CatSper1抗体を阻害することにより、抗体媒介性不妊を阻害または低減することができる。当業者は容易に、このような雌の抗体によって認識される関連するCatSper1エピトープを(例えば上記の方法を用いて)識別し、標準的な手段によって関連エピトープまたは抗イディオタイプ抗体の実質的に純粋な製剤を産生することができる。したがって、本発明は、雌の泌尿生殖路に存在する抗CatSper1抗体によって引き起こされる抗CatSper1抗体媒介性不妊を治療する方法も提供する。本方法は、抗CatSper1抗体を阻害することにより抗体媒介性不妊を阻害または低減するのに有効な量の関連CatSper1エピトープ(もしくはCatSper1蛋白質全体)またはそのような量の抗イディオタイプ抗体を、雌の泌尿生殖路に投与することを含む。
【0115】
CatSper1に関連するビジネス方法
もう1つの態様では、本発明は、本発明のアッセイによって、CatSper1活性に拮抗する1つまたは複数の作用物質を識別すること;このようなアッセイで識別された作用物質、またはそのような作用物質の類似体が、***運動性または卵子貫通性の少なくとも1つを阻害するかどうかを判定すること;1つまたは複数の動物モデルにおける効力および毒性についてアンタゴニストとして識別された作用物質の治療プロファイリングを実行すること;および許容し得る治療プロファイルを有すると識別された1つまたは複数のアンタゴニスト作用物質を含む薬物製剤を処方すること、を含む薬物発見ビジネスを実行する方法を提供する。
【0116】
一実施形態では、薬物発見ビジネスは、販売のために薬物製剤を頒布するシステムを確立するステップをさらに含み、随意に、薬物製剤を市販するための販売グループを確立することを含む。
【0117】
もう1つの態様では、本発明は、本発明のアッセイによって、CatSper1活性を作動させる1つまたは複数の作用物質を識別すること;このようなアッセイで識別された作用物質、またはそのような作用物質の類似体が、***運動性または卵子貫通性の少なくとも1つを上昇させるかどうかを判定すること;1つまたは複数の動物モデルにおける効力および毒性についてアゴニストとして識別された作用物質の治療プロファイリングを実行すること;および許容し得る治療プロファイルを有すると識別された1つまたは複数の作用物質を含む薬物製剤を処方すること、を含む薬物発見ビジネスを実行する方法を提供する。
【0118】
いくつかの実施形態では、薬物発見ビジネスは、販売のために薬物製剤を頒布するシステムを確立するステップをさらに含み、随意に、薬物製剤を市販するための販売グループを確立することを含む。
【0119】
いくつかの実施形態では、CatSper1活性を作動させる作用物質を識別するためのアッセイが、野生型CatSper1を用いて実行される。もう1つの実施形態では、CatSper1活性を作動させる作用物質を識別するためのアッセイが、突然変異CatSper1を用いて実行される。突然変異CatSper1とは、アミノ酸配列中に1つまたは複数の挿入、欠失、または置換を含むCatSper1ポリペプチドを含み、当該挿入、欠失、または置換は野生型CatSper1と比較して突然変異CatSper1の活性を変化させる、ということを意味する。このような活性の変化としては、以下のものには限定されないが、運動性、卵子貫通性、カチオン輸送の変化がある。活性の変化は、CatSper1蛋白質またはmRNAの固有の局在または発現の変化も含むであろう。
【0120】
さらにもう1つの態様では、本発明は、不妊問題を経験している男性患者からの***試料を検査すること;当該***が運動性の低下または卵子貫通性の低下の少なくとも1つによって特徴づけられるかどうかを判定すること;インビトロ分析を実行して***運動性または卵子貫通性の少なくとも1つを上昇させるCatSper1アゴニストの効力を決定すること;当該男性の***運動性または卵子貫通性の少なくとも1つを上昇させるために有効な量のCatSper1アゴニストを投与することを含む治療法を確定すること、を含む生殖医療ビジネスを実行する方法を提供する。
【0121】
いくつかの実施形態では、本方法は、不妊の改善を評価するために上記男性患者が医師によってモニタリングされるステップをさらに含む。このような評価は、治療開始後に規則的間隔で、***運動性または卵子貫通性の1つまたは複数における改善を測定するための***の検査を含んでもよい。治療医師による追跡評価の頻度は、医師または訓練された健康管理提供者によって決定されるであろう。考慮すべき因子としては、患者のスケジュールおよび快適度、ならびに男性患者が子をもうけようとしている緊急性の程度がある。代表的な追跡診療は、毎週、隔週、または毎月実行され得る。もう1つの実施形態では、本方法は、患者または患者の保険提供者に課金するステップをさらに含む。なお、患者の健康保険が上記不妊治療の全部または一部に支払をしている場合、上記健康保険提供者の保険契約は、追跡診療の頻度にも同様に影響する可能性が高いであろうということを注意しておく。
【0122】
さらにもう1つの態様では、本発明は、薬物発見ビジネスの方法を通じて発見された、CatSper1の活性を阻害する薬物製剤を提供すること;CatSper1の活性を阻害するのに有効な量であって、当該有効量は妊娠を予防するのに十分である量の、当該薬物製剤の投与のための使用説明書を医師および健康管理提供者に提供すること、を含む避妊医療ビジネスを実行する方法を提供する。
【0123】
一実施形態では、本方法は、販売のために薬物製剤を頒布するシステムを確立するステップをさらに含み、随意に、薬物製剤を市販するための販売グループを確立することを含む。
【0124】
以下でさらに詳細に説明するように、CatSper1活性に欠損があるマウスは不妊である。このようなマウスからの***の運動性は、見かけ上は正常であるが、有意に損なわれている。さらに、上記***は卵子の透明帯を有効に貫通することができない。したがって、CatSper1の活性に拮抗する作用物質は、避妊剤として実質的有用性を有する。
【0125】
CatSper1はカチオンチャネルをコードしている。数多くのタイプのカチオンチャネルが、心機能の調節を含む細胞プロセス(例えばカルシウムチャネル)において極めて重要な役割を果たしている。したがって、カチオンチャネルの活性の上昇または低下のいずれかを行う作用物質の投与を使用する方法の大きな制限は、このような方法が実質的な副作用を有する可能性が高いことである。このような副作用は、重大な心合併症を含むかもしれない。しかし、本明細書で提供される結果は、CatSper1が***で特異的に発現することを実証している。したがって、CatSper1の活性を上昇または低下させる作用物質は、一般的なカチオンチャネルアンタゴニストおよびアゴニスト、または体内で比較的広く発現するカチオンチャネルのアンタゴニストおよびアゴニストのいずれに関連する副作用もなしに、患者に投与することができる。
【0126】
薬物発見ビジネスを通じて、CatSper1の活性に拮抗し得る1つまたは複数の作用物質を識別することができる。活性に拮抗するとは、CatSper1の活性の全部または一部を低下させることを意味する。このような活性の低下は、***運動性、卵子貫通性、またはカチオン輸送の少なくとも1つを検査することによって測定することができる。低下させる、および拮抗するという用語は、本明細書全体を通じて交換して使用可能である。
【0127】
いくつかの実施形態では、最初に識別されたCatSper1アゴニストまたはアンタゴニストは、さらにリード最適化をかけることが可能である。例えば、効能および活性は維持されるが以下のものを含む重要な薬理学的特性と均衡するように、リード化合物の構造をさらに精緻化することができる:
・溶解度
・透過性
・生体利用効率
・毒性
・変異原性
・薬物動態−薬物の吸収、分布、代謝、排出
上に列挙したパラメータの問題に対処するために、リード化合物に構造修飾がなされる。しかし、このような修飾は、分子の効能および活性に対してあり得る効果を考慮に入れなければならない。例えば、リード化合物の溶解度が低い場合、溶解度を改善しようとして分子に変更を加えることができるが、このような修飾は、分子の効能および活性に悪影響を及ぼすかもしれない。そこで、SARデータを用いて、効能および活性に対する変更の効果を決定する。構造修飾およびSARデータの反復プロセスを用いて、化合物のこれらの薬理学的パラメータと効能および活性との間に均衡が作り出される。
【0128】
次に、候補アンタゴニスト、またはその組合せを、動物モデルにおける効力および毒性について試験しなければならない。このような治療プロファイリングは薬学分野で一般に使用されている。実験薬をヒトで試験する前に、安全性および効力について初期パラメータを確定するために広範な治療プロファイリング(例えば、前臨床試験)を完了しなければならない。前臨床試験は、インビトロで(すなわち、試験管、ビーカー、ペトリ皿等で)および動物で実行される研究を通して、薬物の作用機序、その生体利用効率、吸収、分布、代謝、および排出を確定する。動物実験は、薬物が所望の結果を提供するかどうかを評価するために使用される。種々の用量の実験薬を投与して、薬物の効力を試験し、起こり得る有害な副作用を識別し、毒性を評価する。
【0129】
略述すれば、当業者には認識されるように、薬物に基づくスクリーニングにおけるCatSper1活性に拮抗する候補作用物質の識別は、避妊剤として有用な薬物製剤を開発する際の最初のステップである。妊娠の予防に成功する(すなわち、有用な避妊剤として作用する)のに有効な量の上記薬物製剤の投与は、安全かつ有効でなければならない。当技術分野で通常使用されている初期段階の薬物試験は、潜在的な薬剤の安全性および効力についての懸念を解決する助けとなる。具体的なCatSper1アンタゴニストの場合、薬物製剤の効力は、マウスまたはラットモデルで容易に評価することができるであろう。略述すれば、雄マウスに種々の用量の上記薬物製剤を種々の期間スケジュールにわたり投与することができる。コントロール雄マウスには偽薬(例えば、担体または補形薬のみ)を投与することができる。次に、上記雄を雌マウスとともにケージに入れることによって雄マウスを自由につがわせ、一定期間にわたり妊娠率を測定する。現在利用可能な形態の受胎調節法の効力を考えると、有効な避妊は、妊娠の予防に少なくとも80%有効、好ましくは85%有効、より好ましくは90%有効、最も好ましくは95%、96%、97%、98%、99%または99%より高く有効であるべきである。
【0130】
一実施形態では、治療プロファイリングのステップは、細胞培地で、および動物での化合物の毒性試験;候補薬物の薬物動態および代謝の分析;ならびに疾病の動物モデルにおける効力の決定、を含む。いくつかの例では、本方法は、構造−活性関係を分析すること、ならびに効力、安全性および薬物動態プロファイルに基づいてリード構造を最適化することを含み得る。このようなステップの目標は、米国FDAへの治験新薬(「IND」)申請および/またはヒト臨床試験前の類似の規制当局への類似の申請、の提出につながる前臨床試験のための薬物候補の選択である。
【0131】
リード最適化と治療プロファイリングの間において、本方法の1つの目標は、副作用が最小限のCatSper1アゴニストまたはアンタゴニストを開発することである。アンタゴニストの場合、リード化合物は、血管拡張(すなわち、めまい、低血圧、頭痛、紅潮、浮腫等)、心筋虚血、低血圧、徐脈、一過性不全収縮、心不全の悪化、心室機能障害、SA結節またはAV伝導障害、または血漿ジゴキシンレベルに対する臨床的に許容し得る効果を有するであろう。
【0132】
「毒性プロファイリング」とは、有効量の薬物製剤が投与される時に起こり得る潜在的に有害な副作用の評価を意味する。副作用は有害であってもなくてよく、薬物製剤に関連する副作用が許容し得る副作用であるかどうかの判定は、規制認可プロセス中になされる。この判定は、厳重な規則に従うものではなく、許容し得る副作用とみなされるものは以下のものを含む因子により変動する:(a)治療されている状態の重篤度、ならびに(b)他の治療の利用可能性およびこれらの利用可能な治療に現在関連している副作用。例えば、癌という用語は、調節を誤った細胞成長、増殖、および分化に関連する複合した一群の疾病状態を包含する。多くの形態の癌が、激痛、作用を受けた組織の機能の喪失、そして死を引き起こす特に破壊的な疾病である。化学療法薬は、多くの形態の癌に対する標準的治療の重要な部分である。化学療法薬自体は脱毛、激しい吐き気、体重減少、および不妊を含む重篤な副作用を有し得るが、このような副作用は、治療しようとしている疾病の重篤度を考えれば許容し得るとみなされている。
【0133】
しかし、これに対して、ほとんどの現在利用可能な形態の受胎調節法は重大な副作用を有していない。したがって、CatSper1アンタゴニストの薬物製剤の毒性および副作用は最小限にすべきである。効力試験と並行して毒性試験を実行することが可能であり、有効用量の薬物製剤を投与した雄マウスを、その製剤に対する有害反応についてモニタリングすることができる。避妊剤に関連する潜在的な有害反応としては、***の喪失および行動変化があり得る。治療されたマウスから採取した血液、尿、および糞試料をモニタリングして、免疫、腎、または肝機能の潜在的な有害変化を検出することも可能である。さらに、CatSper1がカチオンチャネルであることを考えると、上記薬物製剤を受容したマウスは、CatSper1アンタゴニストと他のカチオンチャネルとの交差反応性を示す心機能の変化についてもモニタリングすべきである。
【0134】
CatSper1活性に拮抗し、動物実験で安全かつ有効であることが証明される作用物質は、薬物製剤に処方することができる。その後、このような薬物製剤は避妊剤として出荷され、頒布され、販売されることが可能である。
【0135】
CatSper1活性の喪失と妊性との関連を考えると、CatSper1の活性を上昇させて雄性妊性問題を治療する作用物質には実質的有用性がある。不妊の多くの例は、雄に関連する問題を含む。このような雄性不妊問題としては、***数減少、***運動性低下、および***形態異常がある。現在のところ、雄関連不妊に対する有効な治療はほとんどない。
【0136】
雄性不妊に対する成功可能性のある治療を開発する最初のステップは、CatSper1アゴニストの識別である。CatSper1アゴニストは、CatSper1の活性を上昇させる1つまたは複数の作用物質である。CatSper1アンタゴニストについて上記で詳細に説明したのと同様、CatSper1蛋白質のアゴニストは、他のカチオンチャネルアゴニストよりも潜在的副作用は少ないと予想される。
【0137】
CatSper1アゴニストとして作用する作用物質を識別すする方法は、概ねCatSper1アンタゴニストについて詳述したように実行される。ただし、好ましいCatSper1アゴニストは、***運動性または卵子貫通性の1つまたは複数を上昇させるであろう。さらに、CatSper1アゴニストを識別する場合、このような作用物質は野生型CatSper1の活性を作動させるかもしれないことに注意しておく。さらに、または代わりに、このような作用物質は、突然変異CatSper1の活性を作動させるかもしれない。その場合、これらの方法によって識別される1つまたは複数のアゴニストは、上記で詳細に説明したように、安全性および効力について試験されることが可能である。動物実験で安全かつ有効であることが示される作用物質は、薬物製剤に処方される。
【0138】
上記CatSper1アゴニストは、すべての雄性妊性問題を治療するために有効であるとは思われないことを注意しておく。しかし、ある程度の未定の比率の雄性不妊問題は、CatSper1機能のアゴニストを用いた治療に敏感に反応するであろう。例えば、***運動性低下を生じる雄性不妊のある一定比率は、CatSper1における突然変異に起因する可能性が高い。CatSper1が***に特異的に発現することを考えると、このような突然変異を有する雄は、追加的な医学上の問題はほとんどまたは全くないと予想され、このことは、それ以外の点では健康な男性になぜ不妊がしばしば見出されるかを部分的に説明する。さらに、CatSper1アゴニストは、***運動性を全体的に改善し、従って、他の無関係の原因による***運動性低下を補償する助けとなる可能性がある。
【0139】
生殖医療ビジネスの実行
野生型または突然変異CatSper1の活性を作動させる1つまたは複数の作用物質を含む薬物製剤は、妊性困難を経験している候補男性患者に対する治療を提供する生殖医療ビジネスを確立するのに有用な可能性がある。男性患者によって提供された***試料を検査して、当該男性患者における不妊が薬物製剤による治療に敏感に反応し得るかどうかを判定する。***が運動性または卵子貫通性の少なくとも1つの低下によって特徴づけられる患者は、治療に適格である可能性がある。治療前に、男性患者によって提供された***試料を薬物製剤によりインビトロで検査し、当該男性が治療に適格であるかどうかをさらに評価する。このインビトロ検査の追加ステップは、CatSper1アゴニストでは不妊が改善される可能性が低い男性における不要な治療を軽減する助けとなる。
【0140】
***がインビトロで運動性または卵子貫通性の増大を示す男性患者は、1つまたは複数のCatSper1アゴニストを含む薬物製剤を含む妊性治療に適格である。正確な治療法は患者によって変わるであろうが、熟練した医療専門家によって容易に決定されることが可能である。ただし、治療法は、上記治療される男性において***運動性または卵子貫通性の少なくとも1つを上昇させるのに有効な量の上記薬物製剤の投与を含むであろう。好ましい実施形態では、***運動性または卵子貫通性の上昇の結果として妊性が上昇するであろう。
【0141】
薬物製剤
治療的有効量の1つまたは複数の識別された上記の作用物質(すなわち、アンタゴニストまたはアゴニスト)を含む薬学的に許容し得る製剤が、1つまたは複数の薬学的に許容し得る担体(添加剤)および/または希釈剤とともに処方される。以下で詳細に説明するように、本発明の薬学的組成物は、以下のことに適応したものを含めて、固体または液体での投与のために具体的に処方され得る:(1)経口投与、例えば、水薬(水溶液もしくは非水溶液または懸濁液)、錠剤、丸剤、粉末薬、顆粒剤、舌に塗布するためのペースト;(2)非経口投与、例えば滅菌溶液もしくは懸濁液として例えば皮下、筋内もしくは静脈内注射による;(3)局所応用、例えば皮膚に応用されるクリーム、軟膏またはスプレーとして;または(4)膣内または直腸内に、例えば膣座薬、クリームまたは発泡剤として。しかし、いくつかの実施形態では、本発明の化合物を単に滅菌水に溶解または懸濁してもよい。
【0142】
「治療的有効量」という句は、本明細書で使用される場合、いずれの医療にも適用可能な妥当な便益/リスク比で、何らかの所望の治療効果を生じるために有効な作用物質または組成物の量を意味する。
【0143】
「薬学的に許容し得る」という句は、本明細書では、正しい医学的判断の範囲内で、妥当な便益/リスク比に見合って、過剰な毒性、刺激、アレルギー反応等の問題や合併症なしに、人間および動物の組織に接触しての使用に好適な、化合物、材料、組成物、および/または投薬形態を指すために使用される。
【0144】
「薬学的に許容し得る担体」という句は、本明細書で使用される場合、体の一器官または一部から体の別の器官または一部へ本発明のアンタゴニストを運搬または輸送することに関与する液体または固体の充填剤、希釈剤、補形薬、溶剤またはカプセル化材料のような、薬学的に許容し得る材料、組成物または賦形剤を意味する。各担体は、剤形の他の成分と適合し、患者に有害でないという意味で「許容し得る」ものでなければならない。薬学的に許容し得る担体として働き得る材料のいくつかの例には以下のものがある:(1)ラクトース、グルコースおよびスクロースのような糖;(2)トウモロコシデンプンおよびバレイショデンプンのようなデンプン;(3)カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースおよび酢酸セルロースのようなセルロースおよびその誘導体;(4)粉末トラガカント;(5)麦芽;(6)ゼラチン;(7)タルク;(8)ココアバターおよび座薬ワックスのような補形薬;(9)落花生油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油およびダイズ油のような油;(10)プロピレングリコールのようなグリコール;(11)グリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコールのようなポリオール;(12)オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルのようなエステル;(13)寒天;(14)水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムのような緩衝剤;(15)アルギン酸;(16)パイロジェンフリー水;(17)等張食塩液;(18)リンガー溶液;(19)エチルアルコール;(20)リン酸緩衝溶液;ならびに(21)薬物処方で使用される他の非毒性の適合物質。いくつかの実施形態では、薬物製剤は非発熱性である。すなわち、患者の体温を上昇させない。
【0145】
この点で「薬学的に許容し得る塩」という用語は、本発明の化合物の比較的非毒性の無機または有機酸付加塩を指す。これらの塩は、本発明の化合物の最終的な単離および精製中にin situで調製してもよく、または本発明の精製された化合物をその遊離塩基形態で好適な有機または無機酸と別個に反応させ、こうして形成された塩を単離することによって調製してもよい。代表的な塩としては、臭化水素酸塩、塩酸塩、硫酸塩、硫酸水素塩、リン酸塩、硝酸塩、酢酸塩、吉草酸塩、オレイン酸塩、パルミチン酸塩、ステアリン酸塩、ラウリン酸塩、安息香酸塩、乳酸塩、リン酸塩、トシル酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、ナフチル酸塩、メシル酸塩、グルコヘプトン酸塩、ラクトビオン酸塩、およびラウリルスルホン酸塩等がある。(例えば、Berge et al. (1977), J. Pharm. Sci. 66:1-19、を参照されたい。)
本発明の作用物質の薬学的に許容し得る塩としては、例えば非毒性の有機または無機酸からの、化合物の従来の非毒性塩または第四アンモニウム塩がある。例えば、このような従来の非毒性塩としては、塩酸、臭化水素酸、硫酸、スルファミン酸、リン酸、硝酸等のような無機酸から誘導されたもの;ならびに酢酸、プロピオン酸、コハク酸、グリコール酸、ステアリン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、パルミチン酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、フェニル酢酸、グルタミン酸、安息香酸、サリチル酸、スルファニル酸、2−アセトキシ安息香酸、フマル酸、トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、エタンジスルホン酸、シュウ酸、イソチオン酸等のような有機酸から調製された塩がある。
【0146】
他の場合、本発明の作用物質は、1つまたは複数の酸性官能基を含んでもよく、したがって、薬学的に許容し得る塩基と薬学的に許容し得る塩を形成することが可能である。これらの例で「薬学的に許容し得る塩」という用語は、本発明の化合物の比較的非毒性の無機または有機塩基付加塩を指す。これらの塩も同様に、作用物質の最終的な単離および精製中にin situで調製してもよく、または精製された作用物質をその遊離酸形態で、薬学的に許容し得る金属カチオンの水酸化物塩、炭酸塩または炭酸水素塩のような好適な塩基と、アンモニアと、または薬学的に許容し得る有機第一、第二または第三アミンと別個に反応させることによって調製してもよい。代表的なアルカリまたはアルカリ土類塩としては、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、およびアルミニウム塩等がある。塩基付加塩の形成に有用な代表的な有機アミンとしては、エチルアミン、ジエチルアミン、エチレンジアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、ピペラジン等がある。(例えば、Berge et al. (1977)、前掲、を参照されたい。)
【0147】
ラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウムのような湿潤剤、乳化剤および潤滑剤、ならびに着色剤、放出剤、被覆剤、甘味料、香味剤および香料、保存料および酸化防止剤もまた組成物中に存在してもよい。
【0148】
薬学的に許容し得る酸化防止剤の例には以下のものがある:(1)アスコルビン酸、塩酸システイン、硫酸水素ナトリウム、二亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム等のような水溶性酸化防止剤;(2)パルミチン酸アスコルビル、ブチルヒドロキシアニソール(BHA)、ブチルヒドロキシトルエン(BHT)、レシチン、没食子酸プロピル、α−トコフェロール等のような油溶性酸化防止剤;ならびに(3)クエン酸、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)、ソルビトール、酒石酸、リン酸等のような金属キレート剤。
【0149】
本発明の剤形は、経口、経鼻、局所(口内および舌下を含む)、直腸、膣および/または非経口投与に好適なものを含む。剤形は、単位投薬形態で都合よく差し出されてもよく、薬学分野で周知のいかなる方法によって調製されてもよい。担体材料と組み合わせて単一投薬形態を作製することができる活性成分の量は、治療されるホスト、特定の投与方式に応じて変わるであろう。担体材料と組み合わせて単一投薬形態を作製することができる活性成分の量は一般に、治療効果を生じる化合物の量であろう。一般に、100パーセントのうち、この量は、約1%から約99%まで、好ましくは約5%から約70%まで、最も好ましくは約10%から約30%までの範囲の活性成分である。
【0150】
これらの剤形または組成物を調製する方法は、本発明の1つまたは複数の作用物質を担体と、および随意に1つまたは複数の副成分と結びつけるステップを含む。一般に、剤形は本発明の1つまたは複数の作用物質を液体担体、もしくは微粉化した固体担体、またはその両方と均一かつ緊密に結びつけ、必要であれば製品を整形することによって調製される。
【0151】
経口投与に好適な本発明の剤形は、カプセル、カシェ、丸薬、錠剤、ロゼンジ(味付けされた主薬、通常はスクロースおよびアラビアゴムまたはトラガカント、を用いる)、粉末、顆粒、の形態でもよく、または水性もしくは非水性液体中の溶液もしくは懸濁液として、または水中油もしくは油中水液体乳剤として、またはエリキシルもしくはシロップとして、または香錠(ゼラチンおよびグリセリン、またはスクロースおよびアラビアゴムのような不活性基剤を用いる)および/または含嗽剤等としてでもよく、それぞれ活性成分として所定量の本発明の化合物を含む。本発明の作用物質は、巨丸剤、舐剤、またはペーストとして投与されてもよい。
【0152】
経口投与のための本発明の固体投薬形態(カプセル、錠剤、丸薬、糖衣錠、粉末薬、顆粒剤等)では、活性成分は、クエン酸ナトリウムまたはリン酸二カルシウムのような1つまたは複数の薬学的に許容し得る担体、および/または以下のもののいずれかと混合される:(1)デンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール、および/またはケイ酸のような充填剤または増量剤;(2)例えばカルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロースおよび/またはアラビアゴムのような粘結剤;(3)グリセロールのような保湿剤;(4)寒天、炭酸カルシウム、バレイショまたはタピオカデンプン、アルギン酸、ある特定のケイ酸塩、および炭酸ナトリウムのような崩壊剤;(5)パラフィンのような溶解遅延剤;(6)4級アンモニウム化合物のような吸収促進剤;(7)セチルアルコールおよびモノステアリン酸グリセロールのような湿潤剤;(8)カオリンおよびベントナイト粘土のような吸収剤;(9)タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、およびそれらの混合物のような潤滑剤;ならびに(10)着色剤。カプセル、錠剤および丸薬の場合、薬物組成物は緩衝剤を含んでもよい。同様の種類の固体組成物が、ラクトースまたは乳糖のような補形薬と、高分子量ポリエチレングリコール等とを用いたソフトおよびハード充填ゼラチンカプセル内の充填剤としても使用可能である。
【0153】
錠剤は、圧縮または成形によって、随意に1つまたは複数の副成分とともに、作製され得る。圧縮された錠剤は、粘結剤(例えば、ゼラチンもしくはヒドロキシプロピルメチルセルロース)、潤滑剤、不活性希釈剤、保存料、崩壊剤(例えば、グリコール酸ナトリウムデンプンもしくは架橋型カルボキシメチルセルロースナトリウム)、表面活性剤または分散剤を用いて調製され得る。成形タブレットは、不活性液体希釈剤で湿潤化された粉末化合物の混合物を好適な機械で成形することによって作製され得る。
【0154】
糖衣錠、カプセル、丸薬および顆粒剤のような、本発明の薬物組成物の錠剤等の固体投薬形態は、随意に、刻み目を付けられ、または薬物調剤分野において周知の腸溶性被膜等の被膜のような被膜および殻を用いて調製されてもよい。それらは、例えば、所望の放出プロファイルを提供するための種々の比率でのヒドロキシプロピルメチルセルロース、他のポリマーマトリックス、リポソームおよび/またはミクロスフェアを用いて、内部の活性成分の緩徐なまたは制御された放出を提供するように調剤されてもよい。それらは、例えば、細菌保持フィルターを通す濾過によって、または使用直前に滅菌水等の滅菌注射可能媒質に溶解することができる滅菌固体組成物の形態で滅菌剤を組み込むことによって、滅菌してもよい。これらの組成物は、随意に乳白剤を含んでもよく、胃腸管のある特定の部分のみで、またはそこで優先的に、随意に遅延したやり方で、1つまたは複数の活性成分を放出する組成であってもよい。使用可能な埋込み組成物の例として、ポリマー物質およびワックスがある。活性成分は、適当であれば1つまたは複数の上記の補形薬とともに、マイクロカプセル化された形態であってもよい。
【0155】
本発明の化合物の経口投与のための液体投薬形態としては、薬学的に許容し得る乳剤、マイクロエマルジョン、溶液、懸濁液、シロップおよびエリキシルがある。液体投薬形態は、活性成分に加えて、例えば水や他の溶媒のような当技術分野で一般に使用される不活性希釈剤、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、1,3−ブタジエングリコール、油(特に、綿実油、落花生油、トウモロコシ油、胚油、オリーブ油、ヒマシ油およびゴマ油)、グリセロール、テトラヒドロフリルアルコール、ポリエチレングリコールおよびソルビタンの脂肪酸エステルのような可溶化剤および乳化剤、およびそれらの混合物を含んでもよい。
【0156】
不活性希釈剤の他に、経口組成物は、湿潤剤、乳化剤および懸濁剤、甘味料、香味剤、着色剤、香料および保存剤のような補助薬を含んでもよい。
【0157】
懸濁液は、活性化合物に加えて、例えば、エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールおよびソルビタンエステル、微結晶セルロース、メタ水酸化アルミニウム、ベントナイト、寒天およびトラガカント、ならびにそれらの混合物のような懸濁剤を含んでもよい。
【0158】
直腸または膣投与のための本発明の薬物組成物の剤形は、座薬として提示され得る。この座薬は、例えば、ココアバター、ポリエチレングリコール、座薬ワックスまたはサリチル酸塩を含む1つまたは複数の好適な非刺激性補形薬または担体と、本発明の1つまたは複数の作用物質を混合することによって調製することが可能であり、室温で固体であるが、体温では液体であるため、直腸または膣腔で融解し、活性化合物を放出することになる。
【0159】
膣投与に好適な本発明の剤形はまた、当技術分野で適当であることが知られているような担体を含むペッサリー、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、発泡またはスプレー剤形も含む。
【0160】
本発明の1つまたは複数の作用物質の局所的または経皮的投与の投薬形態は、粉末、スプレー、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、溶液、パッチおよび吸入薬を含む。活性作用物質は、薬学的に許容し得る基材と、および必要であれば保存料、緩衝液、または推進剤と、滅菌条件下で混合してもよい。
【0161】
軟膏、ペースト、クリームおよびゲルは、本発明の活性化合物に加えて、動物または植物脂、油、ワックス、パラフィン、デンプン、トラガカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコーン、ベントナイト、ケイ酸、タルクおよび酸化亜鉛、またはそれらの混合物のような補形薬を含んでもよい。
【0162】
粉末およびスプレーは、本発明の化合物に加えて、ラクトース、タルク、ケイ酸、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウムおよびポリアミド粉末、またはこれらの物質の混合物のような補形薬を含んでもよい。スプレーは、塩化フッ化炭化水素や、ブタンおよびプロパンのような揮発性非置換炭化水素のような通例の高圧ガスをさらに含んでもよい。
【0163】
経皮的パッチは、本発明の作用物質を、体に制御して配送するという更なる利点を有する。このような投薬形態は、適当な媒質に本発明の化合物を溶解または分散させることによってなされ得る。吸収増進剤を用いて、皮膚を横切る本発明の作用物質のフラックスを上昇させることも可能である。このようなフラックスの速さは、速さ制御膜を設けるか、またはポリマーマトリックスもしくはゲル中に化合物を分散させるかのいずれかによって制御することができる。
【0164】
非経口投与に好適な本発明の薬物組成物は、本発明の1つまたは複数の化合物とともに、1つまたは複数の薬学的に許容し得る滅菌等張水溶液または非水溶液、分散剤、懸濁液もしくは乳剤、または使用直前に滅菌注射可能溶液または分散剤中で戻すことが可能な滅菌粉末を含み、これは酸化防止剤、緩衝剤、静菌剤、調剤を目的レシピエントの血液と等張にする溶質、または懸濁剤もしくは濃縮剤を含み得る。
【0165】
本発明の薬物組成物で使用可能な好適な水性および非水性担体の例としては、水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等)、およびそれらの好適な混合物、オリーブ油のような植物油、ならびにオレイン酸エチルのような注射可能有機エステルがある。固有の流動性は、例えば、レシチンのような被覆材料の使用によって、分散剤の場合には必要な粒子サイズの維持によって、および界面活性剤の使用によって、維持することができる。
【0166】
これらの組成物は、保存料、湿潤剤、乳化剤および分散剤のような補助薬を含んでもよい。微生物の活動の防止は、例えば、パラベン、クロロブタノール、ソルビン酸フェノール等の種々の抗菌剤および抗真菌剤の含有によって確保し得る。糖、塩化ナトリウム等の等張剤を組成物に含めると望ましいかもしれない。さらに、注射可能薬物形態の持続性吸収が、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンのような吸収を遅延させる作用物質の含有により引き起こされ得る。
【0167】
本発明の化合物は、薬剤としてヒトおよび動物に投与される場合、化合物それ自体で与えられてもよく、または、薬学的に許容し得る担体とともに例えば0.1〜99.5%(より好ましくは、0.5〜90%)の活性成分を含む薬物組成物として与えられてもよい。
【0168】
以下の実施例では、本発明を実施するいくつかの好ましい形態を例示するが、特許請求の範囲に記載された発明の範囲を限定することは意図していない。代替的な材料および方法を用いて、類似の結果を得ることが可能である。
【0169】
実施例1
ヒトおよびマウスCatSper1遺伝子のクローニング
既知の高電位作動性Ca2+チャネルとの類似性を示すEST cDNA(アクセス番号AA416682)のフラグメントを、新規なCa2+チャネルのデータベースサーチ中に識別した。この配列由来のプライマーを用いてRT/PCRを実行し、cDNAフラグメントを得た。そのフラグメントをプローブとして用い、精巣中に発現の主な源を局在させた(下記参照)。cDNAライブラリースクリーニングおよびRACEを用いて、ヒトおよびマウスの精巣からの全オープンリーディングフレーム(ORF)を含むcDNAをクローニングした。ORFの開始は、最初のATGの上流のフレーム内終止コドンによって確認した。CatSper1遺伝子のORFは、686個のアミノ酸の一次構造をコードしている(図1a)。哺乳類細胞中の発現のためのcDNAコンストラクトを、Pfuポリメラーゼを用いたPCRによって作製した。そのコンストラクトは完全に配列決定され、突然変異は含んでいなかった。ノーザンおよびドットブロットは、Clontech(Palo Alto, CA)からのものであった。
【0170】
BLASTサーチでは、CatSper1に最も近い類似性を有する機能性蛋白質は、電位作動性Ca2+チャネル(KVではなく)、環状ヌクレオチド作動性(CNG)、またはTRP(transient receptor potential)チャネルであった。CaVチャネルの孔形成サブユニット(α1)は、4リピートの6回膜貫通型ドメインを有する(Ertel, et al. (2000), Neuron 25, 533-5)。4個のリピートのそれぞれの推定チャネル孔領域には、Ca2+イオンを配位することによってチャネルにCa2+選択性を与えるグルタミン/アスパラギン酸残基が位置する(Ellinor, et al. (1995), Neuron 15, 1121-32)。これらの残基は、すべての確立されているCaVチャネルおよびCatSper1の間で保存されている(図1c)。電位作動性チャネルに特徴的なように、正に荷電したアミノ酸(K/R)が、推定CatSper1 S4ドメインの膜貫通領域において3個のアミノ酸ごとに散在している。KV、CNG、およびTRPチャネルと同様に、CatSper1の疎水性プロット(図1b)では、それが6回膜貫通型ドメインを含むと予測された。CatSper1は、そのアミノ末端に顕著な量のヒスチジン残基(49/250アミノ酸)を含み、これは***運動性の周知のpH調節においてある役割を果たしている可能性がある(Yanagimachi (1994), The Physiology of Reproduction, eds. Knobil & Neill (Raven Press, New York), pp.189-315)。ヒトCatSper1は、そのマウス対応物と高度の相同性を示し(55%同一/72%類似)、特に膜貫通ドメインおよびヒスチジンの豊富な領域においてそうであった。膜貫通ドメインでは、81%同一/93%類似であり、孔領域では89%同一/100%類似であった。マウス精巣cDNAライブラリーをヒトCatSper1で低ストリンジェンシーのスクリーニングをしたところ、他に高い類似性の遺伝子は現れなかった。
【0171】
実施例2
CatSper1の細胞局在
CatSper1 mRNAを精巣中に単一〜2.6kbバンドとして検出した。mRNAのサイズは、単離しておいたcDNAクローンのサイズと類似しており、この遺伝子産物が完全長転写産物であって、はるかに長い従来のCaVチャネルを切り落とした形態ではないことを示唆していた。CatSper1 mRNAは、8個のマウス組織(心臓、脳、脾臓、肺、肝臓、骨格筋、腎臓および精巣)ならびに16個のヒト組織(膵臓、腎臓、骨格筋、肝臓、肺、胎盤、脳、心臓、脾臓、胸腺、前立腺、卵巣、小腸、結腸粘膜内膜、末梢血白血球、および精巣)で調べた時に、精巣でのみ検出された。さらに、CatSper1 mRNAプローブは、50個のヒト組織mRNA(全脳、扁桃体、尾状核、小脳、大脳皮質、前頭葉、海馬、延髄、後頭葉、被殻、黒質、側頭葉、視床、側坐核、脊髄、心臓、大動脈、骨格筋、結腸、膀胱、子宮、前立腺、胃、精巣、卵巣、膵臓、下垂体、副腎、甲状腺、唾液腺、乳腺、腎臓、肝臓、小腸、脾臓、胸腺、末梢白血球、リンパ節、骨髄、虫垂、肺、気管、胎盤、胎児脳、胎児心臓、胎児腎臓、胎児肝臓、胎児脾臓、胎児胸腺、胎児肺)のドットブロットで精巣のみを認識した。
【0172】
アミノ末端の最初の150個のアミノ酸に対して誘導されたポリクローナル抗体がCatSper1蛋白質を認識した。この抗体は、HEK−293細胞からのテトラサイクリン誘導性CatSper1蛋白質ならびに精巣、***、および***細胞中の自然CatSper1を特異的に標識した。ノーザンブロットの結果と整合して、抗体は脳、心臓、または腎臓からの類似サイズの蛋白質を認識しなかった。
【0173】
間接免疫蛍光は、***CatSper1の細胞レベル下の局在を示した。蛋白質は***尾部の主部に著明に局在していた。主部は細胞内小器官(例えば小胞体)を含まないので、CatSper1はおそらく細胞膜に局在していたと思われる。***尾部における蛋白質の正確な位置を決定するため、間接免疫金(immunogold)電子顕微鏡法を実行した。CatSper1免疫反応性金粒子が、***主部の繊維状鞘の上の細胞膜に検出された。免疫蛍光染色と整合して、頭部または中片のいずれにも、免疫反応性金粒子はほとんど検出されなかった。細胞膜の細胞質面上での金粒子の検出は、CatSper1のアミノ末端の予測された細胞内局在を支持する。
【0174】
実施例3
CatSper1の標的破壊
CatSper1遺伝子を、インビボでその機能を研究するために、相同組換えによりマウス胚幹(ES)細胞において破壊した。CatSper1遺伝子を含むゲノムBACクローンを単離し、制限消化および配列決定により解析した。ターゲッティングベクター(図2)が、5kbのCatSper1の5′配列(左アーム)、IRES−LacZとそれに続くNeo耐性遺伝子(中間部)、および1.7kbのCatSper1の3′配列とそれに続く負選択マーカーとしてのTK(右アーム)を含むように構成された。したがって、第1の推定膜貫通ドメインをコードする第2エクソンは、IRES−LacZ配列とそれに続くネオマイシン耐性遺伝子で置換された。キメラを作製するため、129/SvJマウス由来のES細胞を線状化DNAでトランスフェクトし、選択し、ターゲッティングが正しいかどうかを解析した。遺伝子の突然変異コピーを有する正しくターゲッティングされたES細胞を胚盤胞に注射し、偽妊娠マウスに着床させた。キメラマウスをC57BL/6Jと交雑してヘテロ接合突然変異体を得、完全突然変異マウスを仔の交配から作製した。遺伝子の破壊がPCR、ウェスタンブロット、免疫染色および免疫金電子顕微鏡法により確認された。この研究で使用したマウスは、F1および/またはF2世代(129/SvJ/C57BL/6J遺伝子背景)間の交雑の仔であった。IVF実験におけるコントロールとして野生型同腹仔を使用した。
【0175】
実施例4
雄性妊性におけるCatSper1の役割
ヘテロ接合(+/−)の雄および雌の仔の遺伝子型はほぼメンデル型の比率(240+/−;106+/+;110−/−)を示し、突然変異は胚発生に影響しないことを示唆していた。CatSper1-/-(突然変異体)マウスは、生存率、外観、および巨視的行動ではその野生型同腹仔から区別できなかった。
【0176】
ヘテロ接合(+/−)または野生型(+/+)の雄とつがわせたホモ接合(−/−)の雌は妊性があった。野生型雌とつがわせたホモ接合の雄の突然変異体は、野生型雄のものと区別できないマウンティング行動を示した。交尾した雌に類似の頻度で膣栓が観察されたことは、野生型および突然変異マウスの正常な交尾行動を支持した。しかし、突然変異の雄は、2か月より長い期間にわたって妊娠を生じさせなかった(9か月まで;n=雌26;雄13)。これに対して、野生型同腹仔の雄は、100%妊性があった(n=雌8;雄4;図3a)。
【0177】
突然変異マウスの体重および精巣重量は、野生型対応物のものと差はなかった(図3b)。突然変異体および野生型の副精巣尾部からの***数に有意差はなく、***は細胞学的には区別できなかった(図3c)。CatSper1-/-マウスにおける***形成欠損の不存在は、野生型と突然変異マウスの精巣間の形態学的差異の欠如によって支持された。
【0178】
野生型および突然変異体の***の正確な電気生理学的特性を決定するために主要な努力がなされた。以下で詳細に説明するように、さまざまな条件および配置の下で野生型および突然変異体の両方の***の全細胞電流を測定しようと数百回試みたが、他の研究者の経験と整合して、不成功であった。しかし、突然変異体および野生型の***細胞からの電位作動性Ca2+チャネル電流を記録するのに成功した。測定されたCa2+電流は、先行データ(Santi, et al. (1996), Am J Physiol 271, C1583-93; Arnoult, et al. (1996), Proc Natl Acad Sci U S A 93, 13004-9)と整合しており、野生型と突然変異マウスの***細胞の内向き電流間には有意差は検出されなかった(図3d)。野生型または突然変異体の***細胞において、環状ヌクレオチドによっては内向き電流は誘導されなかった。したがって、CatSper1は、***細胞電位感受性Ca2+電流の主要な成分ではなく、***細胞からの***の発生には不要であった。
【0179】
実施例5
正常な***運動性におけるCatSper1の役割
光学顕微鏡法による生きている***のより精密な検査により、突然変異体と野生型の***の間の有意差が示された。野生型マウスからの***は、尾領域における活発な振動運動と、前進方向性運動を示した。CatSper1-/-***は緩慢であり、あまり方向性のない運動を示した。最も顕著であったこととして、突然変異体***は尾領域における活発な振動運動および屈曲を欠いていた。コンピュータ支援***分析(CASA)によれば、突然変異体***の、経路速度、直線速度、および曲線速さという主要な運動性パラメータは有意に低下していた(図4a)。このように、CatSper1遺伝子の破壊の結果として***運動性が劇的に減少した。
【0180】
実施例6
***は卵子の細胞外マトリックスを貫通するためにCatSper1を必要とする
CatSper1-/-***が卵子を受精させる能力を検査するために、インビトロ受精(IVF)アッセイを実行した。***を副精巣尾部から採集し、インビトロで2時間受精能獲得させた。卵子は、採集前に10単位のPMSGおよび10単位のhCGでそれぞれ46〜48時間および14時間同期化した成熟野生型雌(〜6週齢)から採集した。標準的なプロトコール(Perez, et al. (1999), Nat Genet 21, 200-3)を用いてIVFを実行した。卵子を〜105個のCatSper1+/+またはCatSper1-/-***と4時間37℃でインキュベートし、結合していない***を洗い落とした。37℃で20時間のインキュベーション後、受精成功の指標として2細胞期胚が存在するかどうか卵子を検査した。81%の卵子(66/81)が野生型***によって受精したが、CatSper1-/-***によって受精した卵子はなかった(0/79)(図4b)。野生型***によって受精した卵子は2細胞期胚へと成長したが、突然変異体***とともにインキュベートされた卵子は1細胞期に留まった。一部のCatSper1-/-***は卵子に付着したが、おそらくは低下した運動性に起因して、卵子を貫通することができるようには見えなかった。IVF直後のイメージングのために、いくつかの胚を固定し、ヘキスト33342で染色した。
【0181】
自然受精の経過中、***はZP蛋白質の周囲層を貫通し、卵子プラズマ細胞膜と融合する。突然変異体***が細胞膜と融合して受精を活性化させる能力を保持しているかどうかを確かめるため、ヒアルロニダーゼ(80IU/ml)で処理した後にタイロード溶液中で30〜40秒灌流することによって外層を酵素的に除去した卵子(ZP除去卵子)とともに、野生型および突然変異体の***をインキュベートした。このような条件下では、CatSper1+/+およびCatSper1-/-のマウスからの***は両方とも卵子を受精させることが可能であった(図4b)。したがって、CatSper1は***が卵子外層を貫通することができるために必要であるが、卵子活性化には不要である。
実施例7
CatSper1はcAMP誘導性Ca2+流入に必要である
電気生理学測定のため、***細胞調製および全細胞電流記録を、本質的に前述のように(Santi, et al. (1996), Am J Physiol 271, C1583-93; Arnoult, et al. (1997), EMBO J 16, 1593-9)実行した。ピペット溶液は以下のものを含んでいた(単位mM):120 Cs+、60 グルタミン酸、20 TEA−Cl、5 MgCl2、3 Mg−ATP、10 EGTA、10 HEPESおよび5 D−グルコース(pH7.4)。槽は以下のものを含んでいた(単位mM):135 NaCl、5 KCl、10 CaCl2、10 乳酸Na、10 ピルビン酸Na、10 グルコースおよび30 HEPES(pH7.4)。オンラインP/4プロトコールを用いてリーク電流を差し引いた。データを1kHzでフィルタリングした。データを接合電位に対して補正した。
【0182】
Ca2+イメージングのため、***をHS培地(Wennemuth, et al. (2000), J Biol Chem 275, 21210-7)で調製し、10μMのFluo−4−AMおよび0.05%のPluronic F−127を30分間室温で負荷した。Cell−Takを塗布したカバーグラス上に、洗った細胞を播種した。運動により引き起こされる蛍光変化アーティファクトを避けるため、付着した運動性***を非共焦点モードで画像化した。励起のためにアルゴン・クリプトンレーザーの488nm波長ビームを用い、蛍光放出を512nmで集めた(Zeiss LSM 410)。
【0183】
環状ヌクレオチドは、***運動性に広く関係している(Tash (1990)、 Controls of Sperm Motility: biological and clinical aspects, ed. Gagnon (CRC Press, Boca Raton), pp.229-240; Darszon, et al. (1999), Physiol Rev 79, 481-510, Physiol Rev 79, 481-510; Hyne & Garbers (1979), Proc Natl Acad Sci U S A 76, 5699-703; Aoki, et al. (1999), Mol Reprod Dev 53, 77-83)。CatSper1の機能を解明するため、マウスおよびヒトのCatSper1を、アフリカツメガエル卵母細胞、HEK−293およびCHO−K1細胞を含む種々の非相同発現系で発現させた。250例を超えるパッチクランプ実験で、CatSper1発現の結果として有意な電流は、単独でも、発現したCNGβチャネルサブユニット(CNG4またはCNG6)との組合せでも、検出されなかった。CatSper1蛋白質を発現系で検出することは可能であったが、電圧、pH、オスモル濃度、および/または環状ヌクレオチド濃度の変化によって電流を誘導することはできなかった。正のコントロールとして、CNGαサブユニット(CNG1)およびβサブユニット(CNG6)の発現後に、環状ヌクレオチド活性化チャネル電流を測定した。また、野生型と突然変異体の***頭部および尾部の膜の電流を比較することも試みた。他により報告されているように(Espinosa, et al. (1998), FEBS Lett 426, 47-51)、***から安定なパッチを得る成功率は非常に低かった。おそらくは、***尾部の小さい直径(0.5μm)および形状に起因すると思われる。種々の条件下での〜900試行のうち、形成されたギガシールは30未満であり、安定な全細胞記録はなかった。野生型と突然変異体の細胞付着パッチの間に差は認められなかったが、成功率が低いために信頼性のある分析はできなかった。そのため、Ca2+インジケーター(Wiesner, et al. (1998), J Cell Biol 142, 473-84; Kobori, et al. (2000), Biol Reprod 63, 113-20)で容易にモニタリングし得る***尾部細胞内Ca2+ダイナミックスを調べた。
【0184】
野生型および突然変異体の***にFluo−4を負荷し、それらの蛍光を一光子共焦点顕微鏡法により測定した。副精巣尾部野生型***を含む槽に細胞膜透過性cAMP(1mM 8−Br−cAMP)を加えると、***頭部および尾部の[Ca2+]iの急激な上昇が開始された(図5)。この[Ca2+]i信号は、無Ca2+槽の培地では検出されず、Ca2+流入が細胞膜チャネルにより媒介されることを示唆していた。膜透過性環状GMP(1mM 8−Br−cGMP)も、***におけるCa2+流入を開始させた。環状AMPおよび環状GMP誘導性の[Ca2+]i上昇は、***を非特異的キナーゼ阻害剤スタウロスポリンとインキュベート(1μM、10分)することによって遮断されず、環状ヌクレオチド依存性蛋白質キナーゼはチャネル活性化にとって本質的でないことを示唆していた。炭酸水素ナトリウム(20mM)を槽に加えると、生理的に関連する***への刺激(Hyne & Garbers (1979), Proc Natl Acad Sci U S A 76, 5699-703)が、環状AMPまたはGMPで観察されるのよりも小さい[Ca2+]iの上昇を誘導した。有意な環状ヌクレオチド誘導性[Ca2+]i上昇は、精巣由来***でも検出されたが、***細胞では検出されず(また、短い尾部をもつ発達中の細長い***細胞でも検出されない)、cAMPに対するCa2+応答は、完全に分化した***の属性であることを示唆していた。CatSper1-/-***では、cAMPもcGMPも有意なCa2+流入を誘導しなかった(図5)。十分な色素負荷のコントロールとして、プロゲステロンは、突然変異体および野生型の両方の***で大きいCa2+流入を開始させた。したがって、CatSper1は、***におけるcAMPおよびcGMP誘導性Ca2+流入に必要である。
実施例8
抗体および免疫染色
アフィニティー精製したポリクローナル抗体を、N末端150アミノ酸からなるGST融合蛋白質に対して作製した。2μg/mlの抗CatSper1抗体でウェスタンブロットを実行した。5μg/mlの抗CatSper1抗体での免疫染色が、ローダミン共役抗ウサギ二次抗体で検出された。10μg/mlの抗CatSper1抗体および10nmの金共役プロテインAを免疫電顕に使用した。埋め込まれた細胞から60nmの切片を切り出した。抗体の特異性を保証するため、すべての実験でCatSper1-/-***をコントロールとして使用した。
均等物
以上、本発明を、その好ましい実施形態に関して具体的に図示し説明したが、当業者には理解されるように、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、形態および細部における種々の変更をその実施形態において行うことが可能である。当業者は、通常の実験を超えるものを用いることなく、本明細書に具体的に記載された本発明の特定実施形態の多くの均等物を認識し、または確かめることができるであろう。このような均等物は、本発明の範囲に包含されると意図されている。
【図面の簡単な説明】
【0185】
【図1】マウスCatSper1の一次構造を示す。(a)アミノ酸配列;6個の推定膜貫通ドメイン(S1−S6)および孔(P)領域がボックスで囲まれている。S4領域における正に荷電した残基(K/R)が太字で示されている。(b)CatSper1の水治療法プロットは、6個の膜貫通ドメイン(1−6)およびPループ(P)を予測する。ウィンドウサイズ=11。(c)CatSper1の推定孔領域と、CaV1−3からの4個のドメイン(I,II,III,IV)のそれとのアラインメント。GenBankアクセス番号:X15539(CaV1.2)、M94172(CaV2.2)、054898(CaV3.1)、AF407332(マウスCatSper1)、およびAF407333(ヒトCatSper1)。
【図2】マウスCatSper1遺伝子と、CatSper1遺伝子の標的破壊に用いられるターゲッティングベクターの部分ゲノム構造を示す。エクソンは塗りつぶしたボックスで示され、イントロンは細い線で示されている。
【図3】CatSper1破壊によって引き起こされた雄性不妊を示す。(a)CatSper1+/+およびCatSper1-/-の雄の不妊。マウスの体重および精巣重量(b)ならびに***数(c)には有意差はなかった。(d)Ca2+チャネル電流は、活性化、振幅および動力学の範囲では、+/+と−/−のマウスの間で区別できなかった。電流は、−90から+20mVまで(±10mV)の試験パルスで誘導された。下のパネル;内向き電流の平均したI/V関係。保持電位=−100mV。平均細胞静電容量は10.8±1.4pF(n=9,+/+)および12.9±0.9pF(n=11,−/−)であった。
【図4】CatSper1-/-の***運動性およびインビトロ受精障害を示す。(a)経路速度(path velocity)、進行速度(progressive velocity)および軌道速さ(track speed)で定量した***運動性。(b)突然変異体および野生型***のZP無処置およびZP除去卵子とのインビトロ受精(IVF)率(それぞれ3対の突然変異体および野生型マウス)。
【図5】環状ヌクレオチド誘導性Ca2+変化の要約を示す。(a)野生型(CatSper1+/+)および突然変異体(CatSper1-/-)***主部におけるcAMP誘導性Ca2+変化の時間経過。(b)CatSper1+/+およびCatSper1-/-マウスからの***頭部および主部における平均蛍光変化。蛍光は、前刺激トレースの最初の7個のサンプリング点の平均に対して正規化した。
Claims (111)
- (a)SEQ ID NO:1の少なくとも10個の連続するヌクレオチド、
(b)SEQ ID NO:1の少なくとも12個の連続するヌクレオチド、
(c)SEQ ID NO:1の少なくとも14個の連続するヌクレオチド、
(d)SEQ ID NO:1の少なくとも16個の連続するヌクレオチド、
(e)SEQ ID NO:1の少なくとも18個の連続するヌクレオチド、および
(f)(a)〜(e)の配列のいずれか1つに相補的な配列、
からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有する単離された核酸。 - (a)SEQ ID NO:3の少なくとも10個の連続するヌクレオチド、
(b)SEQ ID NO:3の少なくとも12個の連続するヌクレオチド、
(c)SEQ ID NO:3の少なくとも14個の連続するヌクレオチド、
(d)SEQ ID NO:3の少なくとも16個の連続するヌクレオチド、
(e)SEQ ID NO:3の少なくとも18個の連続するヌクレオチド、および
(f)(a)〜(e)の配列のいずれか1つに相補的な配列、
からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有する単離された核酸。 - (a)CatSper1蛋白質をコードする配列、
(b)CatSper1蛋白質の少なくとも膜貫通ドメインをコードする配列、
(c)CatSper1蛋白質の少なくとも細胞外ループをコードする配列、
(d)CatSper1蛋白質の少なくとも孔領域をコードする配列、
(e)高い予測された抗原性を有するCatSper1蛋白質の少なくともエピトープをコードする配列、および
(f)(a)〜(e)の配列のいずれか1つに相補的な配列、
からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有する単離された核酸。 - (a)SEQ ID NO:1、
(b)SEQ ID NO:3、
(c)SEQ ID NO:2の残基447−468、481−502、516−533、542−563、583−604または649−670を含むポリペプチドをコードする配列、
(d)SEQ ID NO:4の残基351−372、385−406、419−438、448−469、489−510、または555−576を含むポリペプチドをコードする配列、
(e)SEQ ID NO:2の残基469−480、534−541、または605−648を含むポリペプチドをコードする配列、
(f)SEQ ID NO:4の残基373−384、439−448、および511−554を含むポリペプチドをコードする配列、
(g)SEQ ID NO:2の残基616−635を含むポリペプチドをコードする配列、
(h)SEQ ID NO:4のおよそ残基522−541の残基を含むポリペプチドをコードする配列、
(i)SEQ ID NO:2の残基2−34、52−70、108−130、264−305、387−417、または606−614を含むポリペプチドをコードする配列、
(j)SEQ ID NO:4の残基2−40、120−148、160−200、または512−520を含むポリペプチドをコードする配列、および
(k)(a)〜(j)の配列のいずれか1つに相補的な配列、
からなる群から選択される請求項3に記載の単離された核酸。 - (a)CatSper1蛋白質、
(b)CatSper1蛋白質の少なくとも膜貫通ドメイン、
(c)CatSper1蛋白質の少なくとも細胞外ループ、および
(d)CatSper1蛋白質の少なくとも孔領域、
からなる群から選択されるポリペプチドと少なくとも80%のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドをコードする単離された核酸。 - CatSper1蛋白質と少なくとも80%のアミノ酸配列同一性を有し、かつCatSper1活性を発現させることが可能な細胞においてCatSper1活性を有するポリペプチドをコードする単離された核酸。
- SEQ ID NO:5から選択される少なくとも100個の連続するヌクレオチドと少なくとも80%のヌクレオチド配列同一性を有する調節要素を含み、
前記調節要素は、CatSper1遺伝子が発現可能な哺乳類細胞内で該調節要素に操作可能に接合するコーディング配列の転写を促進することが可能である、単離された核酸。 - 65℃で1.0×SSCの洗浄ステップを含む条件下でSEQ ID NO:1またはSEQ ID NO:3の核酸の少なくとも一部にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む単離された核酸。
- 前記核酸はCatSper1活性を有するポリペプチドをコードする、請求項8に記載の単離された核酸。
- 核酸であって、
(i)CatSper1活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、当該核酸が65℃で1.0×SSCの洗浄ステップを含む条件下でSEQ ID NO:1またはSEQ ID NO:3の核酸の少なくとも一部にハイブリダイズする、ヌクレオチド配列と、
(ii)前記配列が発現するように前記配列に操作可能に接合する非相同調節領域と、
を含む核酸。 - (i)SEQ ID NO:2または4のアミノ酸配列と少なくとも80パーセントのアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と、
(ii)前記配列が発現するように前記配列に操作可能に接合する非相同調節領域と、
を含む核酸。 - 請求項1〜7のいずれか1項に記載の単離された核酸と、該単離された核酸を検出する手段とを含む、CatSper1核酸の少なくとも一部を検出するキット。
- 前記単離された核酸を検出する前記手段は、それに結合した検出可能な標識を含む、請求項12に記載のキット。
- 前記単離された核酸を検出する前記手段は、前記単離された核酸に特異的にハイブリダイズする標識された二次核酸を含む、請求項12に記載のキット。
- 請求項1〜11のいずれか1項に記載の単離された核酸を含むベクター。
- 請求項3〜11のいずれか1項に記載の核酸を発現させることが可能な遺伝子コンストラクトを含むベクター。
- 前記核酸は外来性調節領域に操作可能に接合する請求項16に記載のベクター。
- 前記核酸は非相同コーディング配列に操作可能に接合して融合ベクターを形成する請求項16に記載のベクター。
- 請求項3〜11のいずれか1項に記載の単離された核酸を含むベクター。
- レポーター遺伝子に操作可能に接合する請求項3〜11のいずれか1項に記載の単離された核酸を含むベクター。
- 請求項3〜11のいずれか1項に記載の核酸で形質転換された細胞。
- 請求項3〜11のいずれか1項に記載の核酸を発現させることが可能な遺伝子コンストラクトで形質転換された細胞。
- 前記核酸は非相同コーディング配列に操作可能に接合して融合蛋白質をコードする請求項22に記載の細胞。
- 前記細胞は、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、線虫細胞、両生類細胞、齧歯類細胞、およびヒト細胞からなる群から選択される請求項22に記載の細胞。
- 前記細胞は、哺乳類体細胞、胎児細胞、胚幹細胞、接合子、配偶子、生殖系列細胞およびトランスジェニック動物細胞からなる群から選択される請求項22に記載の細胞。
- 非ヒトトランスジェニック動物であって、遺伝子コンストラクトが該動物、またはその原種のゲノムに修飾を導入し、該修飾は、CatSper1蛋白質の少なくともフラグメントをコードする核酸の挿入、内在性CatSper1遺伝子の不活化、およびCatSper1調節要素に操作可能に接合するレポーター遺伝子の相同組換えによる挿入からなる群から選択される、非ヒトトランスジェニック動物。
- 前記修飾は、CatSper1蛋白質、CatSper1蛋白質の少なくとも膜貫通ドメイン、CatSper1蛋白質の少なくとも細胞外ループ、CatSper1蛋白質の少なくとも孔領域、および高い予測された抗原性を有するCatSper1蛋白質の少なくともエピトープからなる群から選択されるポリペプチドをコードする核酸の挿入である請求項26に記載の動物。
- 前記動物は、ラット、マウス、ハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、および非ヒト霊長動物から選択される請求項26に記載の動物。
- (a)CatSper1蛋白質、
(b)CatSper1蛋白質の少なくとも膜貫通ドメイン、
(c)CatSper1蛋白質の少なくとも細胞外ループ、
(d)CatSper1蛋白質の少なくとも孔領域、および
(e)高い予測された抗原性を有するCatSper1蛋白質の少なくともエピトープ、
からなる群から選択されるポリペプチドを含む実質的に純粋な蛋白質製剤。 - 前記ポリペプチドは、
(a)SEQ ID NO:2、
(b)SEQ ID NO:4、
(c)SEQ ID NO:2の残基447−468、481−502、516−533、542−563、583−604または649−670、
(d)SEQ ID NO:4の残基351−372、385−406、419−438、448−469、489−510、または555−576、
(e)SEQ ID NO:2の残基469−480、534−541、または605−648、
(f)SEQ ID NO:4の残基373−384、439−448、および511−554、
(g)SEQ ID NO:2の残基616−635、
(h)SEQ ID NO:4の残基522−541、
(i)SEQ ID NO:2の残基2−34、52−70、108−130、264−305、387−417、または606−614、および
(j)SEQ ID NO:4の残基2−40、120−148、160−200、または512−520、
からなる群から選択される請求項29に記載の実質的に純粋な蛋白質製剤。 - (a)CatSper1蛋白質、
(b)CatSper1蛋白質の少なくとも膜貫通ドメイン、
(c)CatSper1蛋白質の少なくとも細胞外ループ、および
(d)CatSper1蛋白質の少なくとも孔領域、
からなる群から選択されるポリペプチドと少なくとも80%のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドを含む実質的に純粋な蛋白質製剤。 - CatSper1蛋白質と少なくとも80%のアミノ酸配列同一性を有し、かつCatSper1活性を発現させることが可能な細胞においてCatSper1活性を有するポリペプチドを含む実質的に純粋な蛋白質製剤。
- CatSper1エピトープに対して産生される抗体を含む実質的に純粋な抗体製剤。
- 前記エピトープは高い予測された抗原性を有する請求項33に記載の実質的に純粋な抗体製剤。
- 前記エピトープは、SEQ ID NO:2の残基2−34、52−70、108−130、264−305、387−417、および606−614、ならびにSEQ ID NO:4の残基2−40、120−148、160−200、または512−520からなる群から選択されるアミノ酸配列内のアミノ酸配列を含む請求項33に記載の実質的に純粋な抗体製剤。
- 前記抗体はモノクローナル抗体である請求項33〜35のいずれか1項に記載の実質的に純粋な抗体製剤。
- 前記抗体は、Fabフラグメント、F(ab′)2フラグメント、Fvフラグメント、および一本鎖Fvフラグメント(scFv)からなる群から選択される抗体フラグメントである請求項33〜35のいずれか1項に記載の実質的に純粋な抗体製剤。
- 請求項33〜37のいずれか1項に記載の抗CatSper1抗体および該抗体を検出する手段を含む、CatSper1蛋白質の少なくともエピトープを検出するキット。
- 前記抗CatSper1抗体を検出する前記手段はそれに結合した検出可能な標識を含む請求項38に記載のキット。
- 前記抗CatSper1抗体を検出する前記手段は前記抗CatSper1抗体に特異的に結合する標識された二次抗体を含む請求項38に記載のキット。
- CatSper1活性の潜在的モジュレーターを識別する方法であって、
CatSper1蛋白質を発現させる細胞と候補化合物を接触させるステップ、
前記細胞においてCatSper1活性のインジケーターを測定するステップ、
前記候補化合物が基準レベルに対して前記インジケーターの上昇または低下を引き起こしたかどうかを判定するステップ、および
前記上昇または低下が有意である場合に前記候補化合物をCatSper1活性の潜在的モジュレーターとして識別するステップ、
を含む方法。 - 前記インジケーターは、前記CatSper1蛋白質をコードするmRNAのレベルのインジケーターである請求項41に記載の方法。
- 前記インジケーターは、CatSper1蛋白質のレベルのインジケーターである請求項41に記載の方法。
- 前記インジケーターは、前記細胞の膜を横切るカチオンフラックスのインジケーターである請求項41に記載の方法。
- 前記インジケーターは、前記細胞の全細胞またはチャネル電流のインジケーターである請求項41に記載の方法。
- 前記細胞はCatSper1蛋白質を発現させることが可能な遺伝子コンストラクトで形質転換されている請求項41〜45のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細胞は成熟***細胞であり、前記インジケーターは***運動性の尺度である請求項41に記載の方法。
- CatSper1活性の潜在的モジュレーターを識別する方法であって、
生理的条件下で候補化合物をCatSper1蛋白質の少なくとも構造ドメインを含むCatSper1部分と接触させるステップ、
前記候補化合物と前記CatSper1部分の間の結合がもしあればそれを測定するステップ、
前記結合が有意である場合に前記候補化合物をCatSper1活性の潜在的モジュレーターとして識別するステップ、
を含む方法。 - 前記CatSper1部分は、
(a)CatSper1蛋白質、
(b)CatSper1蛋白質の少なくとも膜貫通ドメイン、
(c)CatSper1蛋白質の少なくとも細胞外ループ、および
(d)CatSper1蛋白質の少なくとも孔領域、
からなる群から選択されるポリペプチドである請求項48に記載の方法。 - 雄被験体の妊性を低下させる方法であって、
CatSper1活性を低下させる化合物を前記雄に投与するステップを含む方法。 - 雄被験体に可逆的不妊を引き起こす方法であって、
CatSper1活性を低下させる化合物を前記雄に投与するステップを含む方法。 - CatSper1活性を低下させる化合物を雄被験体に投与するステップを含む避妊方法。
- CatSper1活性を低下させる化合物を雌被験体に投与するステップを含む避妊方法。
- 前記化合物は、注射、経皮的パッチ、生分解性インプラント、潤滑剤、湿潤剤、発泡剤、ゼリー、およびスポンジからなる群から選択される剤形である請求項50〜53のいずれか1項に記載の方法。
- 前記雌被験体は哺乳動物であり、前記化合物は前記雌の膣、子宮および輸卵管の少なくとも1つに投与される請求項53に記載の避妊方法。
- 前記化合物は、CatSper1遺伝子の少なくとも一部に対してアンチセンスである核酸、およびCatSper1蛋白質に対する抗体からなる群から選択される請求項50〜53のいずれか1項に記載の方法。
- 前記化合物は、Fabフラグメント、F(ab′)2フラグメント、Fvフラグメント、およびscFvフラグメントからなる群から選択される抗体フラグメントである請求項56に記載の方法。
- 前記被験体は哺乳動物である請求項50〜53のいずれか1項に記載の方法。
- 前記哺乳動物は、ヒト、イヌ、ネコ、ウシ、ヒツジ、ウマ、マウス、ラット、アライグマ、およびジリスからなる群から選択される請求項58に記載の方法。
- 前記被験体は魚、両生動物および昆虫からなる群から選択される請求項58に記載の方法。
- 雄被験体の妊性を低下させるための薬物の製剤における、CatSper1活性を低下させる化合物の使用。
- 雄被験体に可逆的不妊を引き起こすための薬物の製剤における、CatSper1活性を低下させる化合物の使用。
- 雄への投与のための避妊の製剤における、CatSper1活性を低下させる化合物の使用。
- 雌への投与のための避妊の製剤における、CatSper1活性を低下させる化合物の使用。
- 前記化合物は、注射、経皮的パッチ、生分解性インプラント、潤滑剤、湿潤剤、発泡剤、ゼリー、およびスポンジからなる群から選択される剤形である請求項61〜64のいずれか1項に記載の使用。
- 前記雌被験体は哺乳動物であり、前記化合物は前記雌の膣、子宮および輸卵管の少なくとも1つに投与される請求項64に記載の使用。
- 前記化合物は、CatSper1遺伝子の少なくとも一部に対してアンチセンスである核酸、およびCatSper1蛋白質に対する抗体からなる群から選択される請求項61〜64のいずれか1項に記載の使用。
- 前記化合物は、Fabフラグメント、F(ab′)2フラグメント、Fvフラグメント、およびscFvフラグメントからなる群から選択される抗体フラグメントである請求項67に記載の使用。
- 前記被験体は哺乳動物である請求項61〜64のいずれか1項に記載の使用。
- 前記哺乳動物は、ヒト、イヌ、ネコ、ウシ、ヒツジ、ウマ、マウス、ラット、アライグマ、およびジリスからなる群から選択される請求項69に記載の使用。
- 前記被験体は魚、両生動物および昆虫からなる群から選択される請求項69に記載の使用。
- CatSper1活性を低下させる化合物を含む避妊製剤。
- 前記化合物は、CatSper1遺伝子の少なくとも一部に対してアンチセンスである核酸、およびCatSper1蛋白質に対する抗体からなる群から選択される請求項72に記載の製剤。
- 前記製剤は、注射、経皮的パッチ、生分解性インプラント、潤滑剤、湿潤剤、発泡剤、ゼリー、およびスポンジからなる群から選択される剤形である請求項72に記載の製剤。
- CatSper1遺伝子中の突然変異の有無を決定するステップを含む、哺乳動物におけるCatSper1関連障害を診断する方法。
- 前記方法は、
CatSper1遺伝子配列の少なくとも一部を決定し、該決定された配列を基準配列と比較するステップ、
を含み、前記決定された配列と前記基準配列の間の差の有無が、前記CatSper1遺伝子中の突然変異の有無を示す、請求項75に記載の方法。 - CatSper1蛋白質中の突然変異の有無を決定するステップを含む、CatSper1関連障害を診断する方法。
- 前記方法は、
CatSper1蛋白質配列の少なくとも一部を決定し、該決定された配列を基準配列と比較するステップ、
を含み、前記決定された配列と前記基準配列の間の差の有無が、前記CatSper1遺伝子中の突然変異の有無を示す、請求項77に記載の方法。 - 前記決定は、前記CatSper1蛋白質の少なくともフラグメントを、突然変異の有無が既知であるCatSper1蛋白質に結合することが既知である抗体と接触させるステップ、および該抗体と前記CatSper1蛋白質の該フラグメントとの間の結合を検出するステップ、を含む請求項78に記載の方法。
- 哺乳動物におけるCatSper1関連障害を診断する方法であって、
前記細胞においてCatSper1活性のインジケーターを測定するステップ、および
前記測定されたインジケーターを基準レベルと比較するステップ、
を含む方法。 - 前記インジケーターは、前記CatSper1蛋白質をコードするmRNAのレベルのインジケーターである請求項80に記載の方法。
- 前記インジケーターは、CatSper1蛋白質のレベルのインジケーターである請求項80に記載の方法。
- 前記インジケーターは、前記細胞の膜を横切るカチオンフラックスのインジケーターである請求項80に記載の方法。
- 前記インジケーターは、前記細胞の全細胞またはチャネル電流のインジケーターである請求項80に記載の方法。
- 前記障害はCatSper1関連不妊である請求項75〜84のいずれか1項に記載の方法。
- CatSper1遺伝子配列の少なくとも一部を決定し、該決定された配列を基準配列と比較するステップ、
を含み、前記決定された配列と前記基準配列の間の差の有無が、前記基準配列に対応する遺伝子型の有無を示す、CatSper1遺伝子に関して被験体の遺伝子型を決定する方法。 - CatSper1蛋白質配列の少なくとも一部を決定し、該決定された配列を基準配列と比較するステップ、
を含み、前記決定された配列と前記基準配列の間の差の有無が、前記基準配列に対応する遺伝子型の有無を示す、CatSper1遺伝子に関して被験体の遺伝子型を決定する方法。 - 前記決定は、前記CatSper1蛋白質の少なくともフラグメントを、前記基準配列を含むCatSper1蛋白質に結合することが既知である抗体と接触させるステップ、および該抗体と前記CatSper1蛋白質の該フラグメントとの間の結合を検出するステップ、を含む請求項87に記載の方法。
- 低下したCatSper1活性を有する***によるインビトロ受精方法であって、
少なくとも1つの卵子から透明帯を除去するステップ、
前記卵子を前記***の少なくとも1つと接触させるステップ、および
前記***が前記卵子を受精させることを可能にするステップ、
を含む方法。 - 低下した運動性を有する***によるインビトロ受精方法であって、
少なくとも1つの卵子から透明帯を除去するステップ、
前記卵子を前記***の少なくとも1つと接触させるステップ、および
前記***が前記卵子を受精させることを可能にするステップ、
を含む方法。 - 低下した透明帯貫通能力を有する***によるインビトロ受精方法であって、
少なくとも1つの卵子から透明帯を除去するステップ、
前記卵子を前記***の少なくとも1つと接触させるステップ、および
前記***が前記卵子を受精させることを可能にするステップ、
を含む方法。 - 低下したCatSper1活性による不妊により特徴づけられる被験体を治療する方法であって、
前記被験体の***または***幹細胞を、CatSper1蛋白質を発現させることが可能な遺伝子コンストラクトで形質転換するステップ、および
前記被験体の形質転換***を使用して卵子を受精させるステップ、
を含む方法。 - 低下したCatSper1活性による不妊により特徴づけられる被験体を治療する方法であって、
CatSper1蛋白質を前記被験体の***または***幹細胞に投与するステップであって、それによって、該蛋白質が該***または***幹細胞にCatSper1活性を提供する、および
前記投与されたCatSper1蛋白質を有する***を使用して卵子を受精させるステップ、
を含む方法。 - 雌の泌尿生殖路に存在する抗CatSper1抗体によって引き起こされる抗CatSper1抗体媒介性不妊を診断する方法であって、
雌の泌尿生殖路に存在する抗体の試料を取得するステップ、
前記抗体の試料をCatSper1蛋白質の少なくともフラグメントと接触させるステップ、および
前記抗体の試料とCatSper1蛋白質の前記フラグメントとの間の結合を検出するステップ、
を含む方法。 - 前記CatSper1フラグメントは、高い予測された抗原性を有するCatSper1エピトープを含む請求項94に記載の方法。
- 前記エピトープは、SEQ ID NO:2の残基2−34、52−70、108−130、264−305、387−417、および606−614、ならびにSEQ ID NO:4の残基2−40、120−148、160−200、および512−520からなる群から選択される配列内に含まれる請求項95に記載の方法。
- 雌の泌尿生殖路に存在する抗CatSper1抗体によって引き起こされる抗CatSper1抗体媒介性不妊を治療する方法であって、
前記抗CatSper1抗体と前記泌尿生殖路内の***に存在するCatSper1蛋白質との結合を阻害するのに有効な量の、前記抗CatSper1抗体に特異的に結合する作用物質を、前記泌尿生殖路に投与するステップ、
を含む方法。 - 前記作用物質は、高い予測された抗原性を有するエピトープを含むCatSper1蛋白質の少なくともフラグメントを含む請求項97に記載の方法。
- 前記エピトープは、SEQ ID NO:2の残基2−34、52−70、108−130、264−305、387−417、および606−614、ならびにSEQ ID NO:4の残基2−40、120−148、160−200、および512−520からなる群から選択される配列内に含まれる請求項98に記載の方法。
- 前記作用物質は、前記抗CatSper1抗体に対する抗イディオタイプ抗体を含む請求項98に記載の方法。
- 薬物発見ビジネスを実行する方法であって、
(a)請求項41のアッセイによって、CatSper1活性に拮抗する1つまたは複数の作用物質を識別するステップ、
(b)ステップ(a)で識別された作用物質、またはその類似体が、***運動性または卵子貫通性の少なくとも1つを阻害するかどうかを判定するステップ、
(c)1つまたは複数の動物モデルにおける効力および毒性についてステップ(b)で阻害剤として識別された作用物質の治療プロファイリングを実行するステップ、および
(d)ステップ(c)で許容し得る治療プロファイルを有すると識別された1つまたは複数の作用物質を含む薬物製剤を処方するステップ、
を含む方法。 - 販売のために前記薬物製剤を頒布するシステムを確立するステップをさらに含み、随意に、前記薬物製剤を市販するための販売グループを確立することを含む請求項101に記載の方法。
- 薬物発見ビジネスを実行する方法であって、
(a)請求項41のアッセイによって、CatSper1活性を作動させる1つまたは複数の作用物質を識別するステップ、
(b)ステップ(a)で識別された作用物質、またはその類似体が、***運動性または卵子貫通性の少なくとも1つを上昇させるかどうかを判定するステップ、
(c)1つまたは複数の動物モデルにおける効力および毒性についてステップ(b)でアゴニストとして識別された作用物質の治療プロファイリングを実行するステップ、および
(d)ステップ(c)で許容し得る治療プロファイルを有すると識別された1つまたは複数の作用物質を含む薬物製剤を処方するステップ、
を含む方法。 - 販売のために前記薬物製剤を頒布するシステムを確立するステップをさらに含み、随意に、前記薬物製剤を市販するための販売グループを確立することを含む請求項101に記載の方法。
- ステップ(a)が、野生型CatSper1の活性を作動させる1つまたは複数の作用物質を識別することを含む請求項103に記載の方法。
- ステップ(a)が、1つまたは複数の突然変異を含むCatSper1蛋白質の活性を作動させる1つまたは複数の作用物質を識別することを含む請求項103に記載の方法。
- 生殖医療ビジネスを実行する方法であって、
(a)男性患者からの***試料を検査するステップであって、該患者は不妊問題を経験している、
(b)前記***が運動性の低下または卵子貫通性の低下の少なくとも1つによって特徴づけられるかどうかを判定するステップ、
(c)インビトロ分析を実行して***運動性または卵子貫通性の少なくとも1つを上昇させるCatSper1アゴニストの効力を決定するステップ、
(d)前記男性の***運動性または卵子貫通性の少なくとも1つを上昇させるために有効な量のCatSper1アゴニストを投与することを含む治療法を確定するステップ、
を含む方法。 - 不妊の改善を評価するために前記男性が医師によってモニタリングされるステップをさらに含む請求項107に記載の方法。
- 前記患者または前記患者の健康管理提供者に課金するステップをさらに含む請求項107に記載の方法。
- 避妊医療ビジネスを実行する方法であって、
(a)請求項101で発見された薬物製剤を提供するステップであって、該製剤はCatSper1の活性を阻害する、
(b)CatSper1の活性を阻害するのに有効な量の前記薬物製剤の投与のための使用説明書を医師および健康管理提供者に提供するステップであって、該有効な量は妊娠を予防するのに十分である、
を含む方法。 - 販売のために前記薬物製剤を頒布するシステムを確立するステップをさらに含み、随意に、前記薬物製剤を市販するための販売グループを確立することを含む請求項110に記載の方法。
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