JP2004532068A - リン脂質製剤の安定化および最終滅菌 - Google Patents
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Abstract
脂質含有製剤を滅菌する方法であって、脂質含有製剤のpＨおよびイオン強度を所望により調整し、脂質含有製剤を約１２６℃〜約１３０℃の温度に約２分〜約１０分間さらす方法を提供する。安定化剤を、所望により脂質含有製剤に加える。
Description
【技術分野】
【０００１】
本発明はリン脂質製剤を蒸気滅菌するための方法、および特に安定化剤が所望により添加されたリン脂質製剤を滅菌するための方法であって、リン脂質製剤を、高温で短い滞留時間(dwell time)の蒸気滅菌サイクルにかける方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
超音波検査は他の診断法を凌ぐ多くの利点をもたらす画像診断技術である。核医学やＸ線などの技術とは異なり、超音波は、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびたんぱく質などの生物学的物質を傷つける可能性のあるイオン化電子照射の潜在的に有害な曝露に患者をさらさない。さらに、超音波法はコンピュータ断層撮影法(ＣＴ)や磁気共鳴画像法などの技術に比べて比較的安価な手法である。
【０００３】
超音波の原理は音波が観察されている組織または脈管の構造および密度に依存して組織による反射が異なるであろうという事実に基づいている。組織構成により、超音波は吸収により消散するか、組織を透過するか、または反射して戻るのいずれかである。反射(後方散乱または反射力とも称される)は、超音波像を現像するための原理である。変換器は通常、臨床的設定で１ＭＨｚ〜１０ＭＨｚの範囲の音波を検出することができ、返ってくる音波を敏感に検出するために用いられる。次いでこれらの波は定量化され得る画像へと積分される。次いで定量化された波は観察組織の画像へと変換される。
【０００４】
超音波法の技術的改良にもかかわらず、得られる画像は特に脈管血液供給により灌流されている脈管構造および組織の画像に関して、さらなる改善を施すことが依然として必要である。この目的のために、通常、造影剤を用いて脈管構造および脈管関連器官の可視化を補助する。特に、微小気泡または小胞が超音波検査のための造影剤として望ましいが、これは小胞表面で創り出される界面での音の反射が非常に有効であることによる。公知の微小気泡からなる適当な造影剤の製造方法は、水性懸濁液(すなわち泡被覆剤)、好ましくは脂質をまずバイアルまたは容器に入れる。次いで気体相をバイアルの残りの部分の水性懸濁液相の上、すなわち、上部空き高に導入する。次いで、微小気泡を形成するために使用前にバイアルを振盪する。振盪前にバイアルが水性懸濁液相および気相を含むことが理解される。種々の泡被覆剤を水性懸濁相に用いることができる。同様に多種の異なる気体を気相に用いることができる。しかし、具体的にはペルフルオロプロパンなどのペルフルオロカーボンガスを用いることができる。例えば、Ungerらの米国特許第5,769,080号(ここに引用して開示のすべてをこの明細書の記載とする)を参照。
【０００５】
リン脂質はヒトの体内に偏在する。例えば、１,２−ジパルミトイル−sn−グリセロ−３−ホスホコリン(ＤＰＰＣ)はヒト細胞膜の大きな画分(すなわち＞５０％)を構成する。リン脂質は肺胞膜上にも、空気の袋の崩壊を防ぐために大量に存在する。リン脂質は水(または通常、水性媒体)に不溶性であり、両親媒性である、すなわち通常は親水性の極性頭部基と疎水性の２つの無極尾部からなる。水の存在下で、脂質は自発的に集合し、それらの構造に依存してミセルまたはリポソームを形成する。リン脂質は非毒性でありヒト適合性であって、溶解が困難な治療物質(例えば、ペプチド、タンパク質、他の高分子および遺伝子)を標的に運ぶ薬物送達媒体、またはインビボで非経口経路による長時間の薬物持続放出のための制御放出手段として理想的な候補である。さらに、その両親媒性特性により、リン脂質は乳濁液および微小気泡超音波造影剤の製造における安定化剤としても用いることができる。
【０００６】
リン脂質は患者に投与され得る前に、リン脂質を滅菌しなければならない。しかし、リン脂質分子は酸または塩基の存在下で加水分解を受け得る４つのエステル結合を含む。加水分解のため、ほとんどの脂質製品は無菌的濾過などにより無菌的に処理され、１０３個の製品中１個という無菌保証(sterility assurance)が得られる。通常の非経口製品の最終滅菌(terminal sterilization)と同等、すなわち無菌不成功の確率が１０１２単位中１個未満であるさらに高い無菌保証が得られるであろうより厳格な処理を行うことが非常に望ましい。
【発明の開示】
【０００７】
発明の要約
本発明は脂質含有製剤の処理方法に関する。本発明の方法により、高度の無菌保証を有する脂質含有製剤が得られる。特に本発明の方法は通常の非経口製品の最終滅菌と同等またはそれに優る無菌保証の程度、すなわち１０12単位中１個未満である滅菌失敗率を提供することができる。さらに、本発明の方法により、製剤を構成する脂質を著しく分解させることなく、および著しい量の不純物を生成することなく、無菌性脂質含有製剤が製造される。
【０００８】
本発明の方法は脂質含有製剤が約１２６℃〜約１３０℃の温度に約２分〜約１０分間さらされる工程を含む。好ましくは、上記製剤は約１２８℃±１℃の温度に約６±０.５分間さらされる。１つの態様において、脂質含有製剤は１つまたはそれ以上のリン脂質を含む。
【０００９】
安定化剤は脂質含有製剤に加えてもよい。１つの態様において、安定化剤はpＨ緩衝剤、例えば、リン酸ナトリウムまたはクエン酸ナトリウムを含む。別法として、または追加的に、安定化剤はプロピレングリコールまたはグリセリンを含んでいてもよい。
【００１０】
さらに本発明の方法は、所望により脂質含有製剤のpＨおよび／またはイオン強度を調整する工程を含んでいてもよい。
【００１１】
本発明の別の特徴および態様は、以下の開示および特許請求の範囲を考慮すれば当業者には明らかであろう。
【００１２】
発明の詳細な説明
[１]第一の態様において、本発明は脂質含有製剤の処理方法であって、上記製剤が約１２６℃〜約１３０℃の温度に約２分〜約１０分間さらされる工程を含む方法に関する。
[２]別の態様において、本発明は、上記製剤が約１２８±１℃の温度に約６±０.５分間さらされる、態様[１]記載の方法に関する。
[３]別の態様において、本発明は、無菌状態で脂質含有製剤を少なくとも１つのバイアルに導入する工程を含む、態様[１]または[２]のいずれか一方に記載の方法に関する。
[４]別の態様において、本発明は、安定化剤を脂質含有製剤に添加する工程を含む、態様[１]〜[３]のいずれか１つ記載の方法に関する。
[５]別の態様において、本発明は、安定化剤がpＨ緩衝剤を含む、態様[１]〜[４]のいずれか１つ記載の方法に関する。
[６]別の態様において、本発明は、pＨ緩衝剤がクエン酸緩衝液を含む、態様[５]記載の方法に関する。
[７]別の態様において、本発明は、pＨ緩衝剤がリン酸緩衝液を含む、態様[５]記載の方法に関する。
[８]別の態様において、本発明は安定化剤がプロピレングリコールを含む、態様[４]記載の方法に関する。
[９]別の態様において、本発明は、脂質含有製剤のpＨを調整する工程を含む、態様[１]〜[８]のいずれか１つ記載の方法に関する。
[１０]別の態様において、本発明は、脂質含有製剤の総イオン強度を調整する工程を含む、態様[１]〜[９]のいずれか１つ記載の方法に関する。
[１１]別の態様において、本発明は、脂質含有製剤のpＨが、イオン強度調整工程後に調整される、態様[９]記載の方法に関する。
【００１３】
本発明は、リン脂質を含有する医薬製剤の蒸気滅菌または加圧滅菌方法に関するものであり、上記リン脂質は、これらに限定されるものではないが、１,２−ジパルミトイル−sn−グリセロ−３−ホスホコリン(ＤＰＰＣ)、１,２−ジパルミトイル−sn−グリセロ−３−ホスフェ−ト・モノナトリウム塩(ＤＰＰＡ)など、またはポリマーコンジュゲート化リン脂質、例えばＮ−(ＭＰＥＧ５０００・カルバモイル)−パルミトイル−sn−グリセロ−３−ホスファジテイルエタノールアミン(ペグ化ＤＰＰＥまたはＭＰＥＧ５０００−ＤＰＰＥ)を含む。界面活性剤、共溶解剤(cosolvent)、乳化剤または薬物送達媒体としてのリン脂質を含有する非経口製剤の最終滅菌(加圧滅菌)は、例えば多様な潜在的微生物の汚染物質の存在を減少させることにより、非経口製品の無菌保証および安全性を著しく高める。高温での短期製品滞留時間(例えば、１２７℃〜１３０℃で２〜１０分間)と安定化剤(例えば、pＨ６.５でのリン酸またはクエン酸緩衝液および／またはプロピレングリコール)の組み合わせにより、滅菌処理中のリン脂質の加水分解は大きく低下する。本発明の方法による脂質製品の滅菌は、Bacillus stearothermopＨilusなどの微生物汚染物の最小限１２−logの減少を達成することができる。製品の安定化剤および最終滅菌は、脂質を含有する薬物製剤において、ならびに微小気泡の生成および安定化においてリン脂質またはリポソームをプロドラッグとして使用する超音波造影増強剤において有用である。
【００１４】
本発明の方法において、プロピレングリコールおよびグリセリンなどの適当な加水分解阻害剤および／またはpＨ緩衝剤と、製品滞留時間(すなわち、加圧滅菌の高温での製品曝露時間)を最小にする滅菌サイクルを組み合わせて、製品に悪影響を及ぼすことなく、微生物汚染物について１２−logの減少が効果的に達成し得る。適切な加水分解阻害剤には、例えば、プロピレングリコール(０.１mL/mL(０.１１０３５g/mL))、グリセリン(０.１mL/mL(０.１１２６２g/mL))、リン酸ナトリウム(５〜２５mM、pＨ６.５)およびクエン酸ナトリウム(５〜１３mM、pＨ６.５)が含まれる。
【００１５】
使用前に、リン脂質製剤は滅菌されるか加圧滅菌される。滅菌はリン脂質に著しい悪影響を及ぼさずに滅菌を達成するのに十分な高温および時間で行われる。１つの具体的な態様において、滅菌は約１２７℃〜約１３０℃の温度で約２〜約１０分間行われる。好ましくは、滅菌は約１２８±１℃の温度で約６±０.５分間行われる。１つの態様において、用いる滅菌サイクルの温度および時間は、無菌的に処理されたリン脂質含有製剤に対する生物学的要件の６対数減少と等価なまたはそれを超える致死性(すなわち、滅菌失敗の確率が１０6単位中１未満)になるよう選択する。好ましくは、通常の非経口製品の最終滅菌と等価なまたはそれより高度の無菌保証(すなわち、滅菌失敗の確率が１０12単位中１未満)になるように滅菌サイクルを選択する。
【００１６】
別の態様において、本発明は、１またはそれ以上のリン脂質から形成されたリポソームを含有する振盪前の超音波造影剤の蒸気滅菌方法に関する。リポソームは当業者に明らかな通常の種々のリポソーム調製法のうちのいずれを用いて調製してもよい。これらの方法には、凍結融解、ならびに超音波処理、キレート透析、均質化、溶媒注入、マイクロエマルジョン化、自発形成、溶媒蒸発、フレンチ・プレッシャー・セル(French pressure cell)法、制御界面活性剤(detergent)透析、溶媒注入、溶媒注射などが含まれる。リポソームの大きさは、所望により、押出し(extrusion)、濾過、超音波処理、均質化、液体の非混和性被覆に導入された液体コア(core)の層流を用いることおよび同様の方法を含む種々の方法によって調節することができ、得られるリポソームの生物分配およびクリアランスを修飾することができる。上記技術、ならびに他の技術は、例えば米国特許第4,728,578号；英国特許出願GB 2193095 A；米国特許第4,728,575号；米国特許第4,737,323号；国際出願PCT/US85/01161；Mayerら、Biochimica et BiopＨysica Acta, Vol. 858, pp.161−168 (1986)；Hopeら、Biochimica et BiopＨysica Acta, Vol. 812, pp. 55−65 (1985)；米国特許第4,533,254号；Mayhewら、Methods in Enzymology, Vol.149, pp. 64−77 (1987); Mayhewら、Biochimica et BiopＨysica Acta, Vol 755, pp.169−74 (1984); Chengら、Investigative Radiology, Vol. 22, pp. 47−55 (1987)；PCT/US89/05040；米国特許第4,162,282号；米国特許第4,310,505号；米国特許第4,921,706号およびLiposomes Technology, Gregoriadis, G., ed., Vol. I, pp.29−37,51−67および79−108(CRC Press Inc, Boca Raton, Fla., 1984)において議論されている。上記特許、出版物および特許出願のそれぞれの開示をここに引用してすべて明細書の記載とする。
【００１７】
多くの種々の技術のいずれを用いてもよいが、好ましくは公開されている国際出願WO 99/36104(ここに引用してすべての開示を明細書の記載とする)に報告されているのと同様に水性媒体中の脂質混合物の水和および分散のための新規な方法によりリポソームを製造する。要約すれば記載の方法は、小さな単層小胞(ＳＵＶ)を形成するための技術である。脂質、または脂質混合物を最初にプロピレングリコールに溶解し、５０〜５５℃に加熱する。脂質混合物/プロピレングリコール混合物を塩化ナトリウム、グリセリンおよび水の混合物に加え、これも５０〜５５℃に加熱した。所望により、この混合物をリン酸ナトリウムまたはクエン酸ナトリウムを用いて緩衝化する。次いで水酸化ナトリウムを用いてpＨを６〜６.５に調整する。次いで、緩衝溶液に塩化ナトリウムを加えてイオン強度を０.１１６に調整する。次いで、この溶液を７０〜７５℃に加熱する。例えば、０.２２ｍｍのフィルターを用いて、より大きなバッチを所望により無菌的に濾過する。
【００１８】
本発明の方法に採用されるリポソームの調製に使用し得る物質には、リポソーム構築に適当であると当業者に公知の物質またはそれらの組み合わせが含まれる。用いられる脂質は、天然または合成由来のいずれでもよい。そのような物質には、これらに限定されるものではないが、脂質、例えば脂肪酸、リゾ脂質、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ホスファチジルコリン、ホスファチジン酸、スフィンゴミエリン、コレステロール、コレステロール・ヘミスクシネート、トコフェロール・ヘミスクシネート、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジル−イノシトール、リゾ脂質、スフィンゴミエリン、グリコスフィンゴ脂質、グルコ脂質、グリコ脂質、スルファチド、エーテルおよびエステル関連脂肪酸を有する脂質、重合脂質、ジアセチルリン酸、ステアリルアミン、ジステアロイルホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、スフィンゴミエリン、カルジオリピン、炭素６〜８個の長さの短鎖脂肪酸を有するリン脂質、非対称アシル鎖を有する合成リン脂質(例えば、炭素６個のアシル鎖１本および１２個の炭素の別のアシル鎖を有する)、６−(５−コレステン−３β−イルオキシ)−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、ジガラクトシルジグリセリド、６−(５コレステン−３β−イルオキシ)ヘキシル−６−アミノ−６−デオキシ−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、６−(５−コレステン−３β−イルオキシ)ヘキシル−６−アミノ−６−デオキシル−１−チオ−β−Ｄ−マンノピラノシド、ジベヘノイル−ホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジラウロイルホスファチジルコリンおよびジオレオイル−ホスファチジルコリンおよび／またはこれらの組み合わせが含まれる。本発明の主旨に沿った、当業者に明白な他の有用な脂質またはそれらの組み合わせも本発明に包含される。例えば、米国特許第4,310,505号に記載のインビボ標的化に脂質坦持炭水化物を用いることができる。本発明に使用するために特に重要なのは、振盪が行われる温度でゲル状態にある脂質である(液体結晶状態と比較して)。種々の脂質の相転移温度は、当業者に容易に明白であり、例えば、Liposome Technology, Gregoriadis, G., ed., Vol. I, pp. 1〜18 (CRC Press, Inc. Boca Raton, Fla. 1984)(ここに引用してすべての開示を明細書の記載とする)に記載されている。さらに、少なくとも少量の負帯電脂質を任意のリポソーム膜に組み入れることは、必要ではないが、安定性の高いリポソームを得るために有益であることが判明した。少なくとも少量とは、総脂質の約１モル％であることを意味する。適当な負帯電脂質は当業者に自明であり、例えば、ホスファチジルセリンおよび脂肪酸が含まれる。総合して最終的な環境原性(ecogenicity)および安定性の理由から最も好ましいのは、ジパルミトイル−ホスファチジルコリンから調製されるリポソームである。上記の脂質の各々、ならびに当業者に自明な他の物質を用いて、本発明の滅菌処理を行ってもよい。
【００１９】
一般的な指針として、ジパルミトイル−ホスファチジルコリン・リポソームは、脂質が溶解し得る非水性溶媒、好ましくはプロピレングリコール中に、脂質を溶解し、次いでその溶液を水性溶液と接触させてリポソーム懸濁液を形成することにより調製することができる。
【００２０】
次いでリポソームを所望によりバイアルに入れ、バイアル上部空き高を、所望により所定量の気体、例えばペルフルオロプロパンガスを含むよう調整し、バイアルを無菌的に密封する。例えば、凍結乾燥室にバイアルを入れ、室内を減圧にし、次いで気体を室内に導入することにより、気体をバイアル内のリポソームの上部空き高に導入する。
【００２１】
使用前に、本発明のリン脂質含有化合物を蒸気滅菌するかまたは加圧滅菌する。滅菌はリン脂質含有化合物に著しい悪影響を及ぼすことなく滅菌を達成するのに十分な時間、十分な高温で行う。１つの具体的な態様において、滅菌は約１２６℃〜約１３０℃の温度で約２〜約１０分間行われる。好ましくは、滅菌は約１２８±１℃の温度で約６±０.５分間行われる。１つの態様において、用いる滅菌サイクルの温度および時間は、無菌的に処理されたリン脂質含有製剤に対する生物学的要件の６対数減少と等価なまたはそれを超える致死性(すなわち、滅菌失敗の確率が１０6単位中１未満)になるよう選択する。好ましくは、通常の非経口製品の最終滅菌と等価なまたはそれより高度の無菌保証、すなわち、滅菌失敗の確率が１０12単位中１未満になるように滅菌サイクルを選択する。
【００２２】
滅菌されたら、使用直前にバイアルを振盪して脂質封入ガス微小気泡を形成することができる。
【００２３】
明確にするために別々の態様に記載されている本発明のいくつかの特徴が、単一の態様中に組み合わせて提供され得ることが理解される。逆に、簡単にするために単一の態様中に記載されている本発明の種々の特徴が、別個にまたはあらゆるサブコンビネーションにおいて提供され得る。
【００２４】
リン脂質含有製剤を試験して、本発明の方法により提供される、追加的な無菌保証を示した。脂質混合物を表１に示す重量％および濃度に従い調製した。次いで、脂質混合物の一部０.３７５ｇをプロピレングリコール５１.８ｇと混合した。プロピレングリコール/脂質混合物の温度を５５℃に維持し、脂質混合物がプロピレングリコール中に分散するまで周期的にかき混ぜた。
【００２５】
【表１】
【００２６】
次いで、プロピレングリコール/脂質混合物を、ＮaＣl(ＵＳＰ級)６.８mg／mlおよびグリセリン(ＵＳＰ級)０.１mL/mL(０.１１２６２g/mL)の水溶液(ＵＳＰ級)に加えることによりリン脂質含有製剤を調製した。リン脂質含有製剤における成分の最終濃度を表２に示す。緩衝化製剤はリン酸ナトリウムまたはクエン酸ナトリウムを脂質製剤に加えることにより調製した。
【００２７】
【表２】
【００２８】
次いで、バルク溶液に水酸化ナトリウムまたは塩酸を加えて溶液のpＨを６.０〜７.０の特定のpＨ範囲内にもっていき、バルク溶液のpＨを調整した。緩衝化製剤のために、このバルク溶液に塩化ナトリウムを加えてバルク溶液のイオン強度を０.１１６にもっていき、バルク溶液のイオン強度を調整した。次いでバルク溶液に水酸化ナトリウムおよび／または塩酸を加えることによりバルク溶液のpＨを再度調整した。非緩衝化製剤のために、６.８mg／mlのＮaＣlを最初に加えたが、これはイオン強度０.１１６に等しかった。
【００２９】
実施例１
脂質製剤を滅菌するための本発明による高温、短時間処理能力を、上述のように調製した非緩衝化脂質製剤を用いて調べた。１.６mLのバルク溶液を含有する２mLバイアルの群に、それぞれ０.１mLのBacillus stearothermopＨilus(対象名目菌数１０６芽胞/バイアル)を接種した。接種されたバイアルをFinn−Aqua飽和水蒸気オートクレーブ(Saturated Steam Autoclave)(６９１２−Ｄまたは１２１２２４−ＤＰモデル)またはBarriquand過熱水オートクレーブ(Superheated Water Autoclave)(１３４２Ｘモデル)のどちらかを用いる一連のサイクルにかけた。各バイアルを無菌的に開封し、個々に包装された１mL滅菌ピペットで内容物を取り出し、大豆カゼイン消化ブロス(ＳＣＤＢ)の各１００mL単位中で培養し、次いで５５〜６５℃で最小７日間インキュベートし、成長を示す濁度の兆候について培養物を観察した。得られた結果は試験したバイアルの総数(試験数)のうち培養菌を生じたバイアルの数(陽性数)として表３に示す。表３のデータは、高温、短時間滅菌サイクルが脂質製剤の滅菌に有効であることを示している。
【００３０】
【表３】
【００３１】
ａ：Barriquand過熱水オートクレーブ(１３４２Ｘモデル)を用いて行った滅菌サイクル
ｂ：試験は別々に６回の操作を行い、１回の操作当たり１２バイアルの試験を行った。
ｃ：Finn−Aqua飽和蒸気オートクレーブ(１２１２２４−ＤＰモデル)を用いて行った滅菌サイクル
ｄ：試験は別々に３回の操作を行い、１回の操作当たり１０バイアルの試験を行った。
【００３２】
実施例２
蒸発光散乱検出(evaporative light scattering detection)を用いる逆相ＨＰＬＣ法を使用して、滅菌後の脂質分解を調べた。実施例１に関して記載したと同様に脂質製剤を調製した。本発明による高温、短時間滅菌サイクルを用いた結果を表４〜６に示す。比較の目的で、通常の低温、長時間サイクルを用いた結果を表７に示す。対照(非滅菌)溶液の濃度を滅菌溶液の濃度と共に表に示す。滅菌された溶液の濃度におけるパーセントの変化(非滅菌対照の濃度に比較して)を計算して示している。製剤、滞留時間および温度、１実行当たりの滅菌バイアル数および計算した理論的滞留Ｆ０(サイクルの熱インプットの程度)も示す。表４〜７のデータにより、高温、短時間サイクルの結果、比較し得る低温、長時間サイクル(すなわち同様のＦ０値を有するサイクル)よりも脂質損失が低くなることを示す。
【００３３】
【表４】
【００３４】
ａ：３測定値の平均
＊：Finn−Aqua飽和蒸気オートクレーブ(６９１２−Ｄモデル)を用いて行った滅菌サイクル
【００３５】
【表５】
【００３６】
ａ：３測定値の平均
＊：Barriquand過熱水オートクレーブ(１３４２Ｘモデル)を用いて行った滅菌サイクル
【００３７】
【表６】
【００３８】
ａ：６測定値の平均
＊：Barriquand過熱水オートクレーブ(１３４２Ｘモデル)を用いて行った滅菌サイクル
【００３９】
【表７】
【００４０】
ａ：３測定値の平均
＊：Barriquand過熱水オートクレーブ(１３４２Ｘモデル)を用いて行った滅菌サイクル
【００４１】
実施例３
さらに、大量製造工程における、本発明による高温、短時間滅菌サイクルの使用について調べた。開示した様に好ましい方法により４５Lリポソーム製剤を調製した。製剤をバイアルに入れ、バイアルの上部空き高がペルフルオロプロパンガスを含むよう調整し、バイアルを無菌的に密封した。次いで表８に示すようにバイアルを滅菌した。結果を下記の表８に示す。表８のデータは著しい脂質分解を生じさせることなく、高温、短時間サイクルを大規模工程において用い得ることを示している。
【００４２】
【表８】
【００４３】
ａ：６測定値の範囲
【００４４】
実施例４
さらに、緩衝化脂質製剤を使用した場合を調べた。実施例１に関して記載した方法に従い、リン酸ナトリウムおよびクエン酸ナトリウム緩衝液を添加して緩衝化製剤を調製した。結果を以下の表９に示す。表９のデータは、pＨ６.５の緩衝液を含有する製剤が、緩衝液を含まない製剤と比較して滅菌中の脂質分解がより低いことを示している。
【００４５】
【表９】
【００４６】
ａ：製剤はさらに脂質混合物０.７５mg／ml、プロピレングリコール０.１mL/mL、グリセリン０.１mL/mLおよび水を含む。
ｂ：３測定値の平均
＊：Finn−Aqua飽和蒸気オートクレーブ(６９１２−Ｄモデル)を用いて行った滅菌サイクル
【００４７】
実施例５
さらに、大量製造工程において緩衝化製剤の脂質分解を調べた。結果を以下の表１０に示す。表１０のデータは、本発明の高温、短時間滅菌サイクルを用いて、リン酸ナトリウムまたはクエン酸ナトリウムで緩衝された製剤を大量処理した結果、脂質分解はほんのわずかな量であったことを示している。
【００４８】
【表１０】
【００４９】
ａ：製剤はさらに脂質混合物０.７５mg／ml、プロピレングリコール０.１mL/mL、グリセリン０.１mL/mLおよび水を含む。
ｂ：３測定値の範囲
＊：Finn−Aqua飽和蒸気オートクレーブ(６９１２−Ｄモデル)を用いて行った滅菌サイクル
【００５０】
実施例６
さらに、蒸発光散乱検出を用いた逆相ＨＰＬＣ法を使用し、本発明による高温、短時間滅菌サイクルにかけた脂質製剤中の既知の不純物の存在を測定した。実施例１および４に関して上記記載と同様にして脂質製剤を調製した。検出された不純物には、パルミチン酸、リゾ−ＰＣ(１−アシル)パルミトイルリゾホスファチジルコリン(１−アシル)およびｍＰＥＧ５Ｋ−リゾ−ＰＥ[メトキシポリエチレングリコール５０００パルミトイルリゾホスファチジルエタノールアミン(1−アシル)]が含まれていた。結果を以下の表１１に示す。表中には、(不純物濃度/(０.７５mg／ml))×１００として算出された検出された脂質不純物(総Ｉmp.)の総パーセントが含まれている。表１１のデータは、緩衝化および非緩衝化製剤の両方に、ほんのわずかな量の不純物が、高温、短時間サイクルにより生成することを示している。また表１１のデータは、緩衝化製剤に存在する不純物濃度が非緩衝化製剤と比較して著しく改善されたことを示している。
【００５１】
【表１１】
【００５２】
ａ：製剤はさらに脂質混合物０.７５mg／ml、プロピレングリコール０.１mL/mL、グリセリン０.１mL/mLおよび水を含む。
ｂ：２つの値の平均
＊：Finn−Aqua飽和蒸気オートクレーブ(６９１２−Ｄモデル)を用いて行った滅菌サイクル
【００５３】
実施例７
さらに大規模製造工程のために、本発明による高温、短時間滅菌サイクルにかけた脂質製剤中の既知の不純物の存在を調べた。結果を以下の表１２に示す。表１２のデータは、大規模工程において、本発明による高温、短時間サイクルにかけた緩衝化および非緩衝化製剤の両方がほんのわずかな濃度の不純物を生じたことを示している。
【００５４】
【表１２】
【００５５】
ａ：製剤はさらに脂質混合物０.７５mg／ml、プロピレングリコール０.１mL/mL、グリセリン０.１mL/mLおよび水を含む。
ｂ：３測定値の範囲
＊：Finn−Aqua飽和蒸気オートクレーブ(６９１２−Ｄモデル)を用いて行った滅菌サイクル
【００５６】
本発明の好ましい態様に多数の変更および修正がなされ得ること、そのような変更および修正は本発明の主旨から逸脱することなくなされ得ることは、当業者なら理解するであろう。ゆえに、本発明の真の範囲内および本発明の主旨内にある全ての均等な変形に特許請求の範囲が及ぶとの意図である。例えば、本明細書中で詳細に開示したもの以上に、本発明のリポソームについて種々の他の適用が存在する。そのような追加的な使用には、例えば、超音波のための高熱増強物質(hyperthermia potentiators)および薬物送達媒体としての適用などが含まれる。このような追加的な使用および他の当該関連事項は、ＰＣＴ特許出願WO92/22298および米国特許第5,209,720号に記載され、また請求の範囲として記載されており、ここに引用して各開示をすべて明細書の記載とする。
【０００１】
本発明はリン脂質製剤を蒸気滅菌するための方法、および特に安定化剤が所望により添加されたリン脂質製剤を滅菌するための方法であって、リン脂質製剤を、高温で短い滞留時間(dwell time)の蒸気滅菌サイクルにかける方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
超音波検査は他の診断法を凌ぐ多くの利点をもたらす画像診断技術である。核医学やＸ線などの技術とは異なり、超音波は、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびたんぱく質などの生物学的物質を傷つける可能性のあるイオン化電子照射の潜在的に有害な曝露に患者をさらさない。さらに、超音波法はコンピュータ断層撮影法(ＣＴ)や磁気共鳴画像法などの技術に比べて比較的安価な手法である。
【０００３】
超音波の原理は音波が観察されている組織または脈管の構造および密度に依存して組織による反射が異なるであろうという事実に基づいている。組織構成により、超音波は吸収により消散するか、組織を透過するか、または反射して戻るのいずれかである。反射(後方散乱または反射力とも称される)は、超音波像を現像するための原理である。変換器は通常、臨床的設定で１ＭＨｚ〜１０ＭＨｚの範囲の音波を検出することができ、返ってくる音波を敏感に検出するために用いられる。次いでこれらの波は定量化され得る画像へと積分される。次いで定量化された波は観察組織の画像へと変換される。
【０００４】
超音波法の技術的改良にもかかわらず、得られる画像は特に脈管血液供給により灌流されている脈管構造および組織の画像に関して、さらなる改善を施すことが依然として必要である。この目的のために、通常、造影剤を用いて脈管構造および脈管関連器官の可視化を補助する。特に、微小気泡または小胞が超音波検査のための造影剤として望ましいが、これは小胞表面で創り出される界面での音の反射が非常に有効であることによる。公知の微小気泡からなる適当な造影剤の製造方法は、水性懸濁液(すなわち泡被覆剤)、好ましくは脂質をまずバイアルまたは容器に入れる。次いで気体相をバイアルの残りの部分の水性懸濁液相の上、すなわち、上部空き高に導入する。次いで、微小気泡を形成するために使用前にバイアルを振盪する。振盪前にバイアルが水性懸濁液相および気相を含むことが理解される。種々の泡被覆剤を水性懸濁相に用いることができる。同様に多種の異なる気体を気相に用いることができる。しかし、具体的にはペルフルオロプロパンなどのペルフルオロカーボンガスを用いることができる。例えば、Ungerらの米国特許第5,769,080号(ここに引用して開示のすべてをこの明細書の記載とする)を参照。
【０００５】
リン脂質はヒトの体内に偏在する。例えば、１,２−ジパルミトイル−sn−グリセロ−３−ホスホコリン(ＤＰＰＣ)はヒト細胞膜の大きな画分(すなわち＞５０％)を構成する。リン脂質は肺胞膜上にも、空気の袋の崩壊を防ぐために大量に存在する。リン脂質は水(または通常、水性媒体)に不溶性であり、両親媒性である、すなわち通常は親水性の極性頭部基と疎水性の２つの無極尾部からなる。水の存在下で、脂質は自発的に集合し、それらの構造に依存してミセルまたはリポソームを形成する。リン脂質は非毒性でありヒト適合性であって、溶解が困難な治療物質(例えば、ペプチド、タンパク質、他の高分子および遺伝子)を標的に運ぶ薬物送達媒体、またはインビボで非経口経路による長時間の薬物持続放出のための制御放出手段として理想的な候補である。さらに、その両親媒性特性により、リン脂質は乳濁液および微小気泡超音波造影剤の製造における安定化剤としても用いることができる。
【０００６】
リン脂質は患者に投与され得る前に、リン脂質を滅菌しなければならない。しかし、リン脂質分子は酸または塩基の存在下で加水分解を受け得る４つのエステル結合を含む。加水分解のため、ほとんどの脂質製品は無菌的濾過などにより無菌的に処理され、１０３個の製品中１個という無菌保証(sterility assurance)が得られる。通常の非経口製品の最終滅菌(terminal sterilization)と同等、すなわち無菌不成功の確率が１０１２単位中１個未満であるさらに高い無菌保証が得られるであろうより厳格な処理を行うことが非常に望ましい。
【発明の開示】
【０００７】
発明の要約
本発明は脂質含有製剤の処理方法に関する。本発明の方法により、高度の無菌保証を有する脂質含有製剤が得られる。特に本発明の方法は通常の非経口製品の最終滅菌と同等またはそれに優る無菌保証の程度、すなわち１０12単位中１個未満である滅菌失敗率を提供することができる。さらに、本発明の方法により、製剤を構成する脂質を著しく分解させることなく、および著しい量の不純物を生成することなく、無菌性脂質含有製剤が製造される。
【０００８】
本発明の方法は脂質含有製剤が約１２６℃〜約１３０℃の温度に約２分〜約１０分間さらされる工程を含む。好ましくは、上記製剤は約１２８℃±１℃の温度に約６±０.５分間さらされる。１つの態様において、脂質含有製剤は１つまたはそれ以上のリン脂質を含む。
【０００９】
安定化剤は脂質含有製剤に加えてもよい。１つの態様において、安定化剤はpＨ緩衝剤、例えば、リン酸ナトリウムまたはクエン酸ナトリウムを含む。別法として、または追加的に、安定化剤はプロピレングリコールまたはグリセリンを含んでいてもよい。
【００１０】
さらに本発明の方法は、所望により脂質含有製剤のpＨおよび／またはイオン強度を調整する工程を含んでいてもよい。
【００１１】
本発明の別の特徴および態様は、以下の開示および特許請求の範囲を考慮すれば当業者には明らかであろう。
【００１２】
発明の詳細な説明
[１]第一の態様において、本発明は脂質含有製剤の処理方法であって、上記製剤が約１２６℃〜約１３０℃の温度に約２分〜約１０分間さらされる工程を含む方法に関する。
[２]別の態様において、本発明は、上記製剤が約１２８±１℃の温度に約６±０.５分間さらされる、態様[１]記載の方法に関する。
[３]別の態様において、本発明は、無菌状態で脂質含有製剤を少なくとも１つのバイアルに導入する工程を含む、態様[１]または[２]のいずれか一方に記載の方法に関する。
[４]別の態様において、本発明は、安定化剤を脂質含有製剤に添加する工程を含む、態様[１]〜[３]のいずれか１つ記載の方法に関する。
[５]別の態様において、本発明は、安定化剤がpＨ緩衝剤を含む、態様[１]〜[４]のいずれか１つ記載の方法に関する。
[６]別の態様において、本発明は、pＨ緩衝剤がクエン酸緩衝液を含む、態様[５]記載の方法に関する。
[７]別の態様において、本発明は、pＨ緩衝剤がリン酸緩衝液を含む、態様[５]記載の方法に関する。
[８]別の態様において、本発明は安定化剤がプロピレングリコールを含む、態様[４]記載の方法に関する。
[９]別の態様において、本発明は、脂質含有製剤のpＨを調整する工程を含む、態様[１]〜[８]のいずれか１つ記載の方法に関する。
[１０]別の態様において、本発明は、脂質含有製剤の総イオン強度を調整する工程を含む、態様[１]〜[９]のいずれか１つ記載の方法に関する。
[１１]別の態様において、本発明は、脂質含有製剤のpＨが、イオン強度調整工程後に調整される、態様[９]記載の方法に関する。
【００１３】
本発明は、リン脂質を含有する医薬製剤の蒸気滅菌または加圧滅菌方法に関するものであり、上記リン脂質は、これらに限定されるものではないが、１,２−ジパルミトイル−sn−グリセロ−３−ホスホコリン(ＤＰＰＣ)、１,２−ジパルミトイル−sn−グリセロ−３−ホスフェ−ト・モノナトリウム塩(ＤＰＰＡ)など、またはポリマーコンジュゲート化リン脂質、例えばＮ−(ＭＰＥＧ５０００・カルバモイル)−パルミトイル−sn−グリセロ−３−ホスファジテイルエタノールアミン(ペグ化ＤＰＰＥまたはＭＰＥＧ５０００−ＤＰＰＥ)を含む。界面活性剤、共溶解剤(cosolvent)、乳化剤または薬物送達媒体としてのリン脂質を含有する非経口製剤の最終滅菌(加圧滅菌)は、例えば多様な潜在的微生物の汚染物質の存在を減少させることにより、非経口製品の無菌保証および安全性を著しく高める。高温での短期製品滞留時間(例えば、１２７℃〜１３０℃で２〜１０分間)と安定化剤(例えば、pＨ６.５でのリン酸またはクエン酸緩衝液および／またはプロピレングリコール)の組み合わせにより、滅菌処理中のリン脂質の加水分解は大きく低下する。本発明の方法による脂質製品の滅菌は、Bacillus stearothermopＨilusなどの微生物汚染物の最小限１２−logの減少を達成することができる。製品の安定化剤および最終滅菌は、脂質を含有する薬物製剤において、ならびに微小気泡の生成および安定化においてリン脂質またはリポソームをプロドラッグとして使用する超音波造影増強剤において有用である。
【００１４】
本発明の方法において、プロピレングリコールおよびグリセリンなどの適当な加水分解阻害剤および／またはpＨ緩衝剤と、製品滞留時間(すなわち、加圧滅菌の高温での製品曝露時間)を最小にする滅菌サイクルを組み合わせて、製品に悪影響を及ぼすことなく、微生物汚染物について１２−logの減少が効果的に達成し得る。適切な加水分解阻害剤には、例えば、プロピレングリコール(０.１mL/mL(０.１１０３５g/mL))、グリセリン(０.１mL/mL(０.１１２６２g/mL))、リン酸ナトリウム(５〜２５mM、pＨ６.５)およびクエン酸ナトリウム(５〜１３mM、pＨ６.５)が含まれる。
【００１５】
使用前に、リン脂質製剤は滅菌されるか加圧滅菌される。滅菌はリン脂質に著しい悪影響を及ぼさずに滅菌を達成するのに十分な高温および時間で行われる。１つの具体的な態様において、滅菌は約１２７℃〜約１３０℃の温度で約２〜約１０分間行われる。好ましくは、滅菌は約１２８±１℃の温度で約６±０.５分間行われる。１つの態様において、用いる滅菌サイクルの温度および時間は、無菌的に処理されたリン脂質含有製剤に対する生物学的要件の６対数減少と等価なまたはそれを超える致死性(すなわち、滅菌失敗の確率が１０6単位中１未満)になるよう選択する。好ましくは、通常の非経口製品の最終滅菌と等価なまたはそれより高度の無菌保証(すなわち、滅菌失敗の確率が１０12単位中１未満)になるように滅菌サイクルを選択する。
【００１６】
別の態様において、本発明は、１またはそれ以上のリン脂質から形成されたリポソームを含有する振盪前の超音波造影剤の蒸気滅菌方法に関する。リポソームは当業者に明らかな通常の種々のリポソーム調製法のうちのいずれを用いて調製してもよい。これらの方法には、凍結融解、ならびに超音波処理、キレート透析、均質化、溶媒注入、マイクロエマルジョン化、自発形成、溶媒蒸発、フレンチ・プレッシャー・セル(French pressure cell)法、制御界面活性剤(detergent)透析、溶媒注入、溶媒注射などが含まれる。リポソームの大きさは、所望により、押出し(extrusion)、濾過、超音波処理、均質化、液体の非混和性被覆に導入された液体コア(core)の層流を用いることおよび同様の方法を含む種々の方法によって調節することができ、得られるリポソームの生物分配およびクリアランスを修飾することができる。上記技術、ならびに他の技術は、例えば米国特許第4,728,578号；英国特許出願GB 2193095 A；米国特許第4,728,575号；米国特許第4,737,323号；国際出願PCT/US85/01161；Mayerら、Biochimica et BiopＨysica Acta, Vol. 858, pp.161−168 (1986)；Hopeら、Biochimica et BiopＨysica Acta, Vol. 812, pp. 55−65 (1985)；米国特許第4,533,254号；Mayhewら、Methods in Enzymology, Vol.149, pp. 64−77 (1987); Mayhewら、Biochimica et BiopＨysica Acta, Vol 755, pp.169−74 (1984); Chengら、Investigative Radiology, Vol. 22, pp. 47−55 (1987)；PCT/US89/05040；米国特許第4,162,282号；米国特許第4,310,505号；米国特許第4,921,706号およびLiposomes Technology, Gregoriadis, G., ed., Vol. I, pp.29−37,51−67および79−108(CRC Press Inc, Boca Raton, Fla., 1984)において議論されている。上記特許、出版物および特許出願のそれぞれの開示をここに引用してすべて明細書の記載とする。
【００１７】
多くの種々の技術のいずれを用いてもよいが、好ましくは公開されている国際出願WO 99/36104(ここに引用してすべての開示を明細書の記載とする)に報告されているのと同様に水性媒体中の脂質混合物の水和および分散のための新規な方法によりリポソームを製造する。要約すれば記載の方法は、小さな単層小胞(ＳＵＶ)を形成するための技術である。脂質、または脂質混合物を最初にプロピレングリコールに溶解し、５０〜５５℃に加熱する。脂質混合物/プロピレングリコール混合物を塩化ナトリウム、グリセリンおよび水の混合物に加え、これも５０〜５５℃に加熱した。所望により、この混合物をリン酸ナトリウムまたはクエン酸ナトリウムを用いて緩衝化する。次いで水酸化ナトリウムを用いてpＨを６〜６.５に調整する。次いで、緩衝溶液に塩化ナトリウムを加えてイオン強度を０.１１６に調整する。次いで、この溶液を７０〜７５℃に加熱する。例えば、０.２２ｍｍのフィルターを用いて、より大きなバッチを所望により無菌的に濾過する。
【００１８】
本発明の方法に採用されるリポソームの調製に使用し得る物質には、リポソーム構築に適当であると当業者に公知の物質またはそれらの組み合わせが含まれる。用いられる脂質は、天然または合成由来のいずれでもよい。そのような物質には、これらに限定されるものではないが、脂質、例えば脂肪酸、リゾ脂質、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ホスファチジルコリン、ホスファチジン酸、スフィンゴミエリン、コレステロール、コレステロール・ヘミスクシネート、トコフェロール・ヘミスクシネート、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジル−イノシトール、リゾ脂質、スフィンゴミエリン、グリコスフィンゴ脂質、グルコ脂質、グリコ脂質、スルファチド、エーテルおよびエステル関連脂肪酸を有する脂質、重合脂質、ジアセチルリン酸、ステアリルアミン、ジステアロイルホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、スフィンゴミエリン、カルジオリピン、炭素６〜８個の長さの短鎖脂肪酸を有するリン脂質、非対称アシル鎖を有する合成リン脂質(例えば、炭素６個のアシル鎖１本および１２個の炭素の別のアシル鎖を有する)、６−(５−コレステン−３β−イルオキシ)−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、ジガラクトシルジグリセリド、６−(５コレステン−３β−イルオキシ)ヘキシル−６−アミノ−６−デオキシ−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、６−(５−コレステン−３β−イルオキシ)ヘキシル−６−アミノ−６−デオキシル−１−チオ−β−Ｄ−マンノピラノシド、ジベヘノイル−ホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジラウロイルホスファチジルコリンおよびジオレオイル−ホスファチジルコリンおよび／またはこれらの組み合わせが含まれる。本発明の主旨に沿った、当業者に明白な他の有用な脂質またはそれらの組み合わせも本発明に包含される。例えば、米国特許第4,310,505号に記載のインビボ標的化に脂質坦持炭水化物を用いることができる。本発明に使用するために特に重要なのは、振盪が行われる温度でゲル状態にある脂質である(液体結晶状態と比較して)。種々の脂質の相転移温度は、当業者に容易に明白であり、例えば、Liposome Technology, Gregoriadis, G., ed., Vol. I, pp. 1〜18 (CRC Press, Inc. Boca Raton, Fla. 1984)(ここに引用してすべての開示を明細書の記載とする)に記載されている。さらに、少なくとも少量の負帯電脂質を任意のリポソーム膜に組み入れることは、必要ではないが、安定性の高いリポソームを得るために有益であることが判明した。少なくとも少量とは、総脂質の約１モル％であることを意味する。適当な負帯電脂質は当業者に自明であり、例えば、ホスファチジルセリンおよび脂肪酸が含まれる。総合して最終的な環境原性(ecogenicity)および安定性の理由から最も好ましいのは、ジパルミトイル−ホスファチジルコリンから調製されるリポソームである。上記の脂質の各々、ならびに当業者に自明な他の物質を用いて、本発明の滅菌処理を行ってもよい。
【００１９】
一般的な指針として、ジパルミトイル−ホスファチジルコリン・リポソームは、脂質が溶解し得る非水性溶媒、好ましくはプロピレングリコール中に、脂質を溶解し、次いでその溶液を水性溶液と接触させてリポソーム懸濁液を形成することにより調製することができる。
【００２０】
次いでリポソームを所望によりバイアルに入れ、バイアル上部空き高を、所望により所定量の気体、例えばペルフルオロプロパンガスを含むよう調整し、バイアルを無菌的に密封する。例えば、凍結乾燥室にバイアルを入れ、室内を減圧にし、次いで気体を室内に導入することにより、気体をバイアル内のリポソームの上部空き高に導入する。
【００２１】
使用前に、本発明のリン脂質含有化合物を蒸気滅菌するかまたは加圧滅菌する。滅菌はリン脂質含有化合物に著しい悪影響を及ぼすことなく滅菌を達成するのに十分な時間、十分な高温で行う。１つの具体的な態様において、滅菌は約１２６℃〜約１３０℃の温度で約２〜約１０分間行われる。好ましくは、滅菌は約１２８±１℃の温度で約６±０.５分間行われる。１つの態様において、用いる滅菌サイクルの温度および時間は、無菌的に処理されたリン脂質含有製剤に対する生物学的要件の６対数減少と等価なまたはそれを超える致死性(すなわち、滅菌失敗の確率が１０6単位中１未満)になるよう選択する。好ましくは、通常の非経口製品の最終滅菌と等価なまたはそれより高度の無菌保証、すなわち、滅菌失敗の確率が１０12単位中１未満になるように滅菌サイクルを選択する。
【００２２】
滅菌されたら、使用直前にバイアルを振盪して脂質封入ガス微小気泡を形成することができる。
【００２３】
明確にするために別々の態様に記載されている本発明のいくつかの特徴が、単一の態様中に組み合わせて提供され得ることが理解される。逆に、簡単にするために単一の態様中に記載されている本発明の種々の特徴が、別個にまたはあらゆるサブコンビネーションにおいて提供され得る。
【００２４】
リン脂質含有製剤を試験して、本発明の方法により提供される、追加的な無菌保証を示した。脂質混合物を表１に示す重量％および濃度に従い調製した。次いで、脂質混合物の一部０.３７５ｇをプロピレングリコール５１.８ｇと混合した。プロピレングリコール/脂質混合物の温度を５５℃に維持し、脂質混合物がプロピレングリコール中に分散するまで周期的にかき混ぜた。
【００２５】
【表１】
次いで、プロピレングリコール/脂質混合物を、ＮaＣl(ＵＳＰ級)６.８mg／mlおよびグリセリン(ＵＳＰ級)０.１mL/mL(０.１１２６２g/mL)の水溶液(ＵＳＰ級)に加えることによりリン脂質含有製剤を調製した。リン脂質含有製剤における成分の最終濃度を表２に示す。緩衝化製剤はリン酸ナトリウムまたはクエン酸ナトリウムを脂質製剤に加えることにより調製した。
【００２７】
【表２】
次いで、バルク溶液に水酸化ナトリウムまたは塩酸を加えて溶液のpＨを６.０〜７.０の特定のpＨ範囲内にもっていき、バルク溶液のpＨを調整した。緩衝化製剤のために、このバルク溶液に塩化ナトリウムを加えてバルク溶液のイオン強度を０.１１６にもっていき、バルク溶液のイオン強度を調整した。次いでバルク溶液に水酸化ナトリウムおよび／または塩酸を加えることによりバルク溶液のpＨを再度調整した。非緩衝化製剤のために、６.８mg／mlのＮaＣlを最初に加えたが、これはイオン強度０.１１６に等しかった。
【００２９】
実施例１
脂質製剤を滅菌するための本発明による高温、短時間処理能力を、上述のように調製した非緩衝化脂質製剤を用いて調べた。１.６mLのバルク溶液を含有する２mLバイアルの群に、それぞれ０.１mLのBacillus stearothermopＨilus(対象名目菌数１０６芽胞/バイアル)を接種した。接種されたバイアルをFinn−Aqua飽和水蒸気オートクレーブ(Saturated Steam Autoclave)(６９１２−Ｄまたは１２１２２４−ＤＰモデル)またはBarriquand過熱水オートクレーブ(Superheated Water Autoclave)(１３４２Ｘモデル)のどちらかを用いる一連のサイクルにかけた。各バイアルを無菌的に開封し、個々に包装された１mL滅菌ピペットで内容物を取り出し、大豆カゼイン消化ブロス(ＳＣＤＢ)の各１００mL単位中で培養し、次いで５５〜６５℃で最小７日間インキュベートし、成長を示す濁度の兆候について培養物を観察した。得られた結果は試験したバイアルの総数(試験数)のうち培養菌を生じたバイアルの数(陽性数)として表３に示す。表３のデータは、高温、短時間滅菌サイクルが脂質製剤の滅菌に有効であることを示している。
【００３０】
【表３】
ａ：Barriquand過熱水オートクレーブ(１３４２Ｘモデル)を用いて行った滅菌サイクル
ｂ：試験は別々に６回の操作を行い、１回の操作当たり１２バイアルの試験を行った。
ｃ：Finn−Aqua飽和蒸気オートクレーブ(１２１２２４−ＤＰモデル)を用いて行った滅菌サイクル
ｄ：試験は別々に３回の操作を行い、１回の操作当たり１０バイアルの試験を行った。
【００３２】
実施例２
蒸発光散乱検出(evaporative light scattering detection)を用いる逆相ＨＰＬＣ法を使用して、滅菌後の脂質分解を調べた。実施例１に関して記載したと同様に脂質製剤を調製した。本発明による高温、短時間滅菌サイクルを用いた結果を表４〜６に示す。比較の目的で、通常の低温、長時間サイクルを用いた結果を表７に示す。対照(非滅菌)溶液の濃度を滅菌溶液の濃度と共に表に示す。滅菌された溶液の濃度におけるパーセントの変化(非滅菌対照の濃度に比較して)を計算して示している。製剤、滞留時間および温度、１実行当たりの滅菌バイアル数および計算した理論的滞留Ｆ０(サイクルの熱インプットの程度)も示す。表４〜７のデータにより、高温、短時間サイクルの結果、比較し得る低温、長時間サイクル(すなわち同様のＦ０値を有するサイクル)よりも脂質損失が低くなることを示す。
【００３３】
【表４】
ａ：３測定値の平均
＊：Finn−Aqua飽和蒸気オートクレーブ(６９１２−Ｄモデル)を用いて行った滅菌サイクル
【００３５】
【表５】
ａ：３測定値の平均
＊：Barriquand過熱水オートクレーブ(１３４２Ｘモデル)を用いて行った滅菌サイクル
【００３７】
【表６】
ａ：６測定値の平均
＊：Barriquand過熱水オートクレーブ(１３４２Ｘモデル)を用いて行った滅菌サイクル
【００３９】
【表７】
ａ：３測定値の平均
＊：Barriquand過熱水オートクレーブ(１３４２Ｘモデル)を用いて行った滅菌サイクル
【００４１】
実施例３
さらに、大量製造工程における、本発明による高温、短時間滅菌サイクルの使用について調べた。開示した様に好ましい方法により４５Lリポソーム製剤を調製した。製剤をバイアルに入れ、バイアルの上部空き高がペルフルオロプロパンガスを含むよう調整し、バイアルを無菌的に密封した。次いで表８に示すようにバイアルを滅菌した。結果を下記の表８に示す。表８のデータは著しい脂質分解を生じさせることなく、高温、短時間サイクルを大規模工程において用い得ることを示している。
【００４２】
【表８】
ａ：６測定値の範囲
【００４４】
実施例４
さらに、緩衝化脂質製剤を使用した場合を調べた。実施例１に関して記載した方法に従い、リン酸ナトリウムおよびクエン酸ナトリウム緩衝液を添加して緩衝化製剤を調製した。結果を以下の表９に示す。表９のデータは、pＨ６.５の緩衝液を含有する製剤が、緩衝液を含まない製剤と比較して滅菌中の脂質分解がより低いことを示している。
【００４５】
【表９】
ａ：製剤はさらに脂質混合物０.７５mg／ml、プロピレングリコール０.１mL/mL、グリセリン０.１mL/mLおよび水を含む。
ｂ：３測定値の平均
＊：Finn−Aqua飽和蒸気オートクレーブ(６９１２−Ｄモデル)を用いて行った滅菌サイクル
【００４７】
実施例５
さらに、大量製造工程において緩衝化製剤の脂質分解を調べた。結果を以下の表１０に示す。表１０のデータは、本発明の高温、短時間滅菌サイクルを用いて、リン酸ナトリウムまたはクエン酸ナトリウムで緩衝された製剤を大量処理した結果、脂質分解はほんのわずかな量であったことを示している。
【００４８】
【表１０】
ａ：製剤はさらに脂質混合物０.７５mg／ml、プロピレングリコール０.１mL/mL、グリセリン０.１mL/mLおよび水を含む。
ｂ：３測定値の範囲
＊：Finn−Aqua飽和蒸気オートクレーブ(６９１２−Ｄモデル)を用いて行った滅菌サイクル
【００５０】
実施例６
さらに、蒸発光散乱検出を用いた逆相ＨＰＬＣ法を使用し、本発明による高温、短時間滅菌サイクルにかけた脂質製剤中の既知の不純物の存在を測定した。実施例１および４に関して上記記載と同様にして脂質製剤を調製した。検出された不純物には、パルミチン酸、リゾ−ＰＣ(１−アシル)パルミトイルリゾホスファチジルコリン(１−アシル)およびｍＰＥＧ５Ｋ−リゾ−ＰＥ[メトキシポリエチレングリコール５０００パルミトイルリゾホスファチジルエタノールアミン(1−アシル)]が含まれていた。結果を以下の表１１に示す。表中には、(不純物濃度/(０.７５mg／ml))×１００として算出された検出された脂質不純物(総Ｉmp.)の総パーセントが含まれている。表１１のデータは、緩衝化および非緩衝化製剤の両方に、ほんのわずかな量の不純物が、高温、短時間サイクルにより生成することを示している。また表１１のデータは、緩衝化製剤に存在する不純物濃度が非緩衝化製剤と比較して著しく改善されたことを示している。
【００５１】
【表１１】
ａ：製剤はさらに脂質混合物０.７５mg／ml、プロピレングリコール０.１mL/mL、グリセリン０.１mL/mLおよび水を含む。
ｂ：２つの値の平均
＊：Finn−Aqua飽和蒸気オートクレーブ(６９１２−Ｄモデル)を用いて行った滅菌サイクル
【００５３】
実施例７
さらに大規模製造工程のために、本発明による高温、短時間滅菌サイクルにかけた脂質製剤中の既知の不純物の存在を調べた。結果を以下の表１２に示す。表１２のデータは、大規模工程において、本発明による高温、短時間サイクルにかけた緩衝化および非緩衝化製剤の両方がほんのわずかな濃度の不純物を生じたことを示している。
【００５４】
【表１２】
ａ：製剤はさらに脂質混合物０.７５mg／ml、プロピレングリコール０.１mL/mL、グリセリン０.１mL/mLおよび水を含む。
ｂ：３測定値の範囲
＊：Finn−Aqua飽和蒸気オートクレーブ(６９１２−Ｄモデル)を用いて行った滅菌サイクル
【００５６】
本発明の好ましい態様に多数の変更および修正がなされ得ること、そのような変更および修正は本発明の主旨から逸脱することなくなされ得ることは、当業者なら理解するであろう。ゆえに、本発明の真の範囲内および本発明の主旨内にある全ての均等な変形に特許請求の範囲が及ぶとの意図である。例えば、本明細書中で詳細に開示したもの以上に、本発明のリポソームについて種々の他の適用が存在する。そのような追加的な使用には、例えば、超音波のための高熱増強物質(hyperthermia potentiators)および薬物送達媒体としての適用などが含まれる。このような追加的な使用および他の当該関連事項は、ＰＣＴ特許出願WO92/22298および米国特許第5,209,720号に記載され、また請求の範囲として記載されており、ここに引用して各開示をすべて明細書の記載とする。
Claims (11)
- 脂質含有製剤の処理方法であって、上記製剤が、約１２６℃〜約１３０℃の温度に約２分〜約１０分間さらされる工程を特徴とする方法。
- 製剤が、約１２８±１℃の温度に約６±０.５分間さらされる、請求項１記載の方法。
- 脂質含有製剤を無菌状態で少なくとも１つのバイアルに導入する工程を含む、請求項１記載の方法。
- 安定化剤を脂質含有製剤に添加する工程を含む、請求項１記載の方法。
- 安定化剤が、pＨ緩衝剤を含む、請求項４記載の方法。
- pＨ緩衝剤が、クエン酸緩衝液を含む、請求項５記載の方法。
- pＨ緩衝剤が、リン酸緩衝液を含む、請求項５記載の方法。
- 安定化剤が、プロピレングリコールを含む、請求項４記載の方法。
- 脂質含有製剤のpＨを調整する工程を含む、請求項１記載の方法。
- 脂質含有製剤の総イオン強度を調整する工程を含む、請求項１記載の方法。
- 脂質含有製剤のpＨが、イオン強度調整工程後に調整される、請求項１０記載の方法。
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