CN1518479A - 磷脂制剂的稳定化和终末消毒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种对含有脂质的制剂进行消毒的方法，其中可选择地对所述含有脂质的制剂的pH值和离子强度进行调节，所述含有脂质的制剂在大约126℃－130℃下消毒大约2－10分钟。可供选择的是，向所述含有脂质的制剂中加入一种稳定赋形剂。

Description

磷脂制剂的稳定化和终末消毒
发明领域
本方面涉及对磷脂制剂进行蒸汽消毒的方法，特别是涉及对任选地含有稳定化赋性剂的磷脂制剂进行消毒的方法，其中使所述磷脂制剂经过一个高温、短停留时间的蒸汽消毒周期。
背景技术
超声作为一种显像诊断技术，与其它诊断方法相比，该方法具有一系列的优势。与诸如核医学和X线等技术不同的是，超声不需要将患者暴露于具有潜在危害的离子化电子辐射中，这种辐射可能会对生物物质(例如DNA，RNA以及蛋白质)造成损伤。此外，与计算机成像(CT)或磁共振成像等技术相比，超声技术是一种相对较为便宜的技术。
超声的原理基于这样一个事实，也就是说，根据所观察的组织或脉管***的组成和密度，声波将会有区别地从组织中反射回来。根据组织的构成，超声波要么被吸收，穿过组织，要么被反射回来。反射，是指反向散射或反射性，是超声成像的基础。传感器，特别是能够检测临床环境中1MHz到10MHz范围内的声波的传感器，用于灵敏地检测返回的声波。然后，这些声波被整合成可以定量的图像。经定量的声波然后被转换成所观察的组织的图像。
尽管超声方法在技术上有所改进，但是所得到的图像仍然需要进一步的完善，特别是其中有血液流动的脉管和组织的成像。为了达到这个目的，通过使用造影剂有助于清楚地呈现出脉管和与脉管有关的组织。特别是，微气泡或小泡是非常好的超声造影剂，因为在小泡表面的界面处，声波反射率非常高。众所周知，要生产适当的、由微气泡组成的造影剂首先要将优选由脂质构成的含水悬浮液(也就是气泡涂布剂)放入小瓶或容器中。然后在小瓶的剩余部分或顶部空间，在含水悬浮液相的上方引入气体。然后在使用前，振摇小瓶从而形成微气泡。应注意的是，在振摇前，小瓶中含有含水悬浮液相和气相。含水悬浮液相中可以使用各种各样的气泡涂布剂。同样，气相中也可以使用各种各样不同的气体。特别是使用例如全氟丙烷等全氟烃类。参见例如Unger等人的美国专利5769080，该专利中所公开的内容在此引入作为本申请的参考。
磷脂在人体中无处不在。例如，人体细胞膜的大部分(即大于50％)由1，2-二棕榈酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DPPC)构成。磷脂还大量存在于肺泡膜上，用于防止肺泡的塌陷。磷脂不溶于水(或者一般的含水介质)，而且磷脂是两亲性的，也就是说，它们通常包括一个亲水的极性首基，二个厌水的非极性尾部。在水中，脂质将根据结构自发地形成微团或脂质体。由于磷脂没有毒性，可以与人体相容，因此它们是最理想的药物运载工具，用于将难溶解的治疗物质(例如，肽、蛋白、其它大分子以及基因)携带到靶组织或作为一种控制-释放装置使药物在体内长时间内通过肠道外途径缓慢释放。而且，由于它们的两亲性的特性，磷脂还可以在制备乳剂和微气泡超声造影剂的过程中作为稳定剂。
在给予患者磷脂之前，应对磷脂进行消毒。然而，磷脂分子含有四个酯键，当有酸或碱存在的情况下，这些酯键会产生水解。由于水解降解，大多数的脂质产品要进行无菌处理，也就是指消毒过滤，使产品的无菌程度达到1×10-3。更好的是采用更加严格的处理方法以达到更高的无菌程度，使其相当于对常规肠道外产品所进行的终末消毒，也就是说，消毒失败的概率小于1×10-12。
发明简述
本发明涉及含有脂质的制剂的处理方法。通过所述方法可以得到具有高度无菌程度的含有脂质的制剂。尤其是，这些方法可以达到等于或高于常规肠道外产品终末消毒的无菌程度，也就是说，消毒失败的概率小于1×10-12。此外，由本发明的所述方法所得到的无菌含有脂质的制剂中的脂质没有发生明显降解，而且不产生大量杂质。
本发明所述方法包括将含有脂质的制剂在大约126℃-130℃的温度下消毒2-10分钟左右的步骤。优选地，将所述制剂在大约128℃±1℃的温度下消毒6±0.5分钟左右。在一个实施方案中，所述含有脂质的制剂包括一种或多种磷脂。
可选择地，在所述含有脂质的制剂中加入稳定赋形剂。在一个实施方案中，所述稳定赋形剂包括pH缓冲剂，例如，磷酸钠或柠檬酸钠。作为选择，或者附加地，所述稳定赋形剂任选地包括丙二醇或甘油。
可选择地，本发明的所述方法还包括调整含有脂质的制剂的pH或离子强度的步骤。
根据下文所公开的内容和所附的权利要求书，本申请的其它特征和实施方案对于本领域的技术人员来说是显而易见的。
本发明的详细描述
[1]在第一个实施方案中，本发明涉及一种处理含有脂质的制剂的方法，包括将所述制剂在大约126℃-130℃的温度下放置2-10分钟左右的步骤。
[2]在另一个实施方案中，本发明涉及如实施方案1所述的方法，其中，将所述制剂在大约128℃±1℃的温度下放置6±0.5分钟左右。
[3]在另一个实施方案中，本发明涉及如实施方案1或实施方案2所述的方法，包括在无菌条件下将所述含有脂质的制剂放入至少一个小瓶中的步骤。
[4]在另一个实施方案中，本发明涉及如实施方案1至实施方案3中任一项所述的方法，包括在所述含有脂质的制剂中加入一种稳定赋形剂的步骤。
[5]在另一个实施方案中，本发明涉及如实施方案1至实施方案4中任一项所述的方法，其中所述稳定赋形剂包括一种pH缓冲剂。
[6]在另一个实施方案中，本发明涉及如实施方案5所述的方法，其中所述pH缓冲剂包括柠檬酸盐缓冲剂。
[7]在另一个实施方案中，本发明涉及如实施方案5所述的方法，其中所述pH缓冲剂包括磷酸盐缓冲剂。
[8]在另一个实施方案中，本发明涉及如实施方案4所述的方法，其中所述稳定赋形剂包括丙二醇。
[9]在另一个实施方案中，本发明涉及如实施方案1至实施方案8中任一项所述的方法，包括调节所述含有脂质的制剂pH值的步骤。
[10]在另一个实施方案中，本发明涉及如实施方案1至实施方案9中任一项所述的方法，包括调节所述含有脂质的制剂总的离子强度的步骤。
[11]在另一个实施方案中，本发明涉及如实施方案9所述的方法，其中在所述调节离子强度步骤之后调整含有脂质的制剂的pH值。
本发明涉及对含有磷脂的药物制剂进行蒸汽消毒或高压消毒的方法，其中磷脂包括但不局限于1，2-二棕榈酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DPPC)、1，2-二棕榈酰-sn-甘油基-3-磷酸一钠盐(DPPA)等，或与磷脂形成共轭的聚合物，例如N-(MPEG5000氨基甲酰)-棕榈酰-sn-甘油基-3-磷脂酰(phosphaditeyl)乙醇胺(pegyated DPPE或MPEG5000-DPPE)。对含有磷脂的肠道外制剂进行终末消毒(高压消毒)可以通过减少例如大量的潜在微生物污染而显著提高肠道外制剂的无菌程度和安全性，其中磷脂作为表面活性剂、助溶剂、乳化剂或药物运载工具。在较高的温度下停留较短的时间(例如，在127℃-130℃下2-3分钟)，并结合使用稳定赋形剂(例如，pH为6.5的磷酸盐或柠檬酸盐缓冲剂，和/或丙二醇)可以显著降低消毒过程中磷脂所发生的水解降解。通过本发明的所述方法对磷脂产品进行消毒可以将例如嗜热脂肪芽孢杆菌等微生物污染最低降至1×10-12。稳定赋形剂和对产品进行的终末消毒，在含有脂质的药物制剂和超声造影增强剂中是非常有用的，其中在微气泡的产生和稳定过程中，磷脂或脂质体作为药物前体。
本发明的所述方法结合适当的防水解赋形剂和一个消毒周期，所述赋形剂例如有丙二醇和甘油、和/或pH缓冲剂。在所述消毒周期中，将产品停留时间(也就是说产品暴露于较高的高压消毒温度的时间)降至最短，从而使微生物污染有效地降至1×10-12，并且没有对产品造成不良影响。适宜的防水解赋形剂包括例如，0.1ml/ml(0.11035g/ml)的丙二醇、0.1ml/ml(0.11262g/ml)的甘油、5-25mM的磷酸钠溶液(pH6.5)、5-13mM的柠檬酸钠溶液(pH6.5)。
在使用前，对所述磷脂制剂进行消毒或高压消毒。为了达到消毒目的，消毒温度足够高而且时间足够长，同时没有对所述磷脂造成不良影响。在一个实施例中，在大约126℃-130℃的温度下进行消毒2-10分钟左右。优选地，在大约128±1℃的温度下进行消毒6±0.5分钟左右。在一个具体实施方案中，选择消毒周期的温度和时间从而使经杀菌处理的含有磷脂的制剂的微生物污染的减少程度等于或大于106(也就是说，消毒失败的概率小于1×10-6)。优选地，所述消毒周期使产品的无菌程度等于或高于常规肠道外产品的终末消毒，也就是说，消毒失败的概率小于1×10-12。
在另一个实施方案中，本发明涉及事先经振摇的超声造影剂的蒸汽消毒，其中所述超声造影剂含有由一种或多种磷脂形成的脂质体。所述脂质体可由任一种常规的、本领域技术人员公知的脂质体制备技术进行制备。这些技术包括冷冻-解冻、声处理、螯合透析、均质处理、溶剂浸入、微乳化作用、自发形成、溶剂蒸发、French pressure cell技术、控制清洗剂透析、溶剂浸入、溶剂注射注射以及其它技术。如果需要，可以通过各种各样的方法调节脂质体的大小，包括挤压、过滤、声处理法、均质处理、将核心为液体的层流引入不能相混溶的液体流中以及其它类似方法，从而调整所产生的脂质体的生物分布和清除率。上述技术以及其它方法在例如以下文献中公开：US4,728,578；GB2193095A；US 4,728,575；US 4,737,323；PCT/US85/01161；Mayer等人的Biochimica et Biophysica Acta，Vol.858，pp.161-168(1986)；Hope等人的Biochimicaet Biophysica Acta，Vol.812，pp.55-65(1985)；US 4,533,254；Mayhew等人的Methods in Enzymology，第149卷，第64-77页(1987)；Mayhew等人的Biochimicaet Biophysica Acta，第755卷，第169-174页(1984)；Cheng等人的InvestigativeRadiology，第22卷，第47-55页(1987)；PCT/US89/05040；US 4,162,282；US 4,310,505；US 4,921,706；Liposomes Technology，Gregoriadis，G.，ed.，Vol.I，pp 29-37，51-67，79-108(CRC Press Inc，BocaRaton，Fla.，1984)。上述专利、出版物、专利申请均作为本申请的参考文献引入本文。
尽管可以使用任何一种技术使含水介质中的脂质共混物进行水合和分散，但是优选地采用WO99/36104中所公开的新方法制备所述脂质体。上述申请作为本申请的参考文献引入本文。简而言之，所述过程是形成小的单一薄层泡沫(SUVs)的技术。首先，将所述脂质或脂质共混物溶解于加热至50-55℃的丙二醇中。然后，将上述脂质共混物/丙二醇混合物加入到加热至50-55℃的氯化钠、甘油和水的混合物中。该混合物可选择地用磷酸钠或柠檬酸钠进行缓冲。然后用氢氧化钠调节pH至6-6.5。在该经过缓冲的溶液中加入氯化钠以调整离子强度至0.116。然后将溶液加热至70-75℃。制备大批量的脂质体可以任选采用过滤消毒，例如使用0.22mm的过滤器。
用于制备本发明所述方法中的脂质体的材料可以选用本领域技术人员熟知的用于构建脂质体的材料或其组合。所使用的脂质可以是源自天然的或人工合成的。上述材料包括但不局限于脂质例如脂肪酸类、溶血脂质类、二棕榈酰磷脂酰胆碱、磷脂酰胆碱、磷脂酸、神经鞘磷脂、胆固醇、胆固醇半琥珀酸酯、生育酚半琥珀酸酯、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、溶血脂质类、神经鞘磷脂、糖鞘脂类、糖脂类、醣脂类、硫脂类，还包括含有醚的脂质以及与酯相连接的脂肪酸类、聚合脂质、二乙酰磷酸盐、十八烷酰胺、二硬脂酰磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、神经鞘磷脂、心脂质、具有6-8个碳原子的短链脂肪酸的磷脂、具有不对称酰基链的合成磷脂(例如，一个酰基链含有6个碳原子，而另一个酰基链含有12碳原子)、6-(5-胆甾烯-3β-基氧)-1-硫基-β-D-吡喃半乳糖苷、二半乳糖甘油二酯、6-(5-胆甾烯-3β-基氧)己基-6-氨基-6-脱氧-1-硫基-β-D-吡喃半乳糖苷、6-(5-胆甾烯-3β-基氧)己基-6-氨基-6-脱氧-1-硫代-β-D-吡喃甘露糖苷、甘油二山萮酰-磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、二月桂酰磷脂酰胆碱、二二油酸酰磷脂酰胆碱、和/或它们的组合。符合本发明的发明精神的、本领域技术人员所知晓的其它脂质或其组合也属于本发明的范围。例如，US4310505中所描述的用于体内靶向给药的含有脂质的碳氢化合物。本发明特别感兴趣的是在振摇操作所进行的温度下处于胶体状态的脂质(与液晶状态相比)。不同脂质的相转变温度对于本领域的技术人员来说是显而易见的，例如在脂质体技术(LiposomeTechnology，Gregoriadis，G.，ed，Vol.I，pp.1-18(CRC Press，Inc.Boca Raton，Fla.1984)中所公开的。该文章中所公开的内容作为本发明的参考文献引入本文。此外还发现，当任一脂质体膜上结合有至少带有少量负电荷的脂质时，尽管不是必需的，但是其有利于保持脂质体的高度稳定性。其中至少少量的含义是指总脂质的约1摩尔百分比。对于本领域的技术人员来说，带有负电荷的脂质是显而易见的，包括例如磷脂酰丝氨酸和脂肪酸。从生态遗传性和稳定性两方面考虑，最优选的是由二棕榈酰磷脂酰胆碱制备成的脂质体。在本发明的消毒过程中可以采用上述任一种脂质，以及本领域技术人员所熟知的其它脂质。
总的来说，二棕榈酰磷脂酰胆碱脂质体的制备如下：将脂质溶解于一个非水溶性的溶液，其中所述脂质可以溶于该溶液中，优选该溶液为丙二醇，然后将该溶液与水溶液相接触，从而形成脂质体悬浮液。
然后，可选择地将所述脂质体放在一个小瓶中。可选地，调整小瓶的顶部空间，使其含有预定量的气体，例如全氟丙烷气体，然后在无菌条件下将所述小瓶密封。例如，将所述小瓶放在一个冷冻干燥室中，降低室中压力，然后将所述气体引入该室中，从而将所述气体引入小瓶内脂质体顶部空间。
在使用前，对本发明中所述含有磷脂的混合物进行蒸汽消毒或高压消毒。消毒的温度应足够地高，时间足够长，从而可以有效地进行消毒而对所述含有磷脂的混合物不产生显著的不良作用。在一个特定实施方案中，在大约126℃-130℃的温度下进行消毒2-10分钟左右。优选地，在大约128±1℃的温度下进行消毒6±0.5分钟左右。在一个实施方案中，所选消毒周期中所采用的温度和时间使经过无菌处理的含有磷脂的制剂的微生物污染减少程度等于或大于106(也就是说，消毒失败的概率小于1×10-6)。优选地，所选消毒周期所达到的消毒程度等于或高于常规肠道外产品的终末消毒程度，也就是说，消毒失败的概率小于1×10-12。
一旦进行了消毒，在即将使用前振摇小瓶，形成脂质包绕的微气泡。
应注意的是，为了清楚起见，在单独的多个实施方案中对本发明某些特征进行了描述。这些特征也可以在一个实施方案中进行组合。相反地，为了简便起见，本发明的不同特征在一个实施方案中进行了描述，其也可以在不同实施方案中分别进行，或者还可以将不同特征进行亚组合。
对含有磷脂的制剂进行检测以证明本发明所述方法的消毒效果和程度。根据表1所给出的重量百分比和浓度制备脂质共混物。然后将0.375g的脂质共混物与51.8g的丙二醇相混合。丙二醇/脂质共混物的温度保持在55℃，定期对其进行旋转，直至所述脂质共混物分散在所述丙二醇中。
表1
    成分     重量百分数(％)     浓度(mg/ml)
    DPPC     53.5     0.401
    MPEG5000-DPPE     40.5     0.304
    DPPA     6.0     0.045
将所述丙二醇/脂质共混物加入水溶液中(USP级)，该水溶液中含有6.8mg/ml NaCl(USP级)和0.1ml/ml(0.11262g/ml)的甘油(USP级)，从而制备成含有磷脂的制剂。各组分在所述含有磷脂的制剂中的最终浓度参见表2。在所述含有脂质制剂中加入磷酸钠或柠檬酸钠得到经缓冲的制剂。
表2
    成分     浓度
    氯化钠     4.5-6.8mg/ml
    甘油     0.1ml/ml(0.11262g/ml)
    丙二醇     0.1ml/ml(0.11035g/ml)
    脂质共混物     0.75mg/ml
    磷酸钠     5-25mM(可任选)
    柠檬酸钠     5-13mM(可任选)
加入氢氧化钠或盐酸调节所得到的本体溶液的pH值，使pH值在6.0-7.0之间。对于经缓冲的制剂，在本体溶液中加入氯化钠调整本体溶液的离子强度，使离子强度达到0.116。然后向本体溶液中再加入氢氧化钠或盐酸调节本体溶液的pH值。对于未经缓冲的制剂，开始时加入6.8mg/ml的氯化钠，使其离子强度等于0.116。
实施例1
用上述制备得到的未经缓冲的脂质制剂检测本发明的高温短时间消毒过程对脂质制剂的消毒效果。在一组含有1.6ml本体溶液的2ml小瓶中，接种0.1ml的嗜热脂肪芽孢杆菌(目标菌种数达到106芽孢/瓶)。然后，在Finn-Aqua饱和蒸汽压力釜(型号为6912-D或121224-DP)或Barriquand过热水压力釜(型号为1342X)中，使接种细菌的小瓶经过一系列周期。在无菌条件下，打开每个瓶子，分别用独立包装的1ml无菌吸量管吸出内容物，将其分别注入100ml的大豆酪蛋白消化肉汤(Soybean Casein Digest Broth，SCDB)中进行培养。在55-65℃下至少温育7天，并观察培养物，如果出现混浊就表示有细菌生长。以所有测试小瓶中(#测试)中出现细菌生长的小瓶(#阳性)的数量作为所得结果见于表3。表3的数据显示高温短时间的消毒周期可以有效地对所述脂质制剂进行消毒。
表3
    温度(℃)    时间(分钟)    #阳性/#测试
    128         7             0/10a
    127         7             0/10a
    127         5             0/10a
    127         3.5           0/10a
    127         5             0/72a，b
    127         5             0/30c，d
a使用型号为1342X的Barriquand过热水压力釜进行的消毒周期。
b六轮独立的测试，每轮中有12个小瓶。
c使用型号为121224-DP的Finn-Aqua饱和蒸汽压力釜进行的消毒周期。
d三轮独立的测试，每轮中有10个小瓶。
实施例2
使用具有蒸发式光散射检测器的反相HPLC法检测消毒后的脂质降解。所述脂质制剂的制备参见实施例1。用本发明的高温、短时间消毒周期进行消毒的结果参见表4-6。为了进行比较，表7为用常规的低温、长时间的消毒周期进行消毒的结果。对照(未消毒)溶液的浓度和经消毒的溶液的浓度参见各表。经消毒的溶液(与未经消毒的对照溶液的浓度相比)的浓度改变已经计算并显示出来。同时显示的还有所述制剂、停留时间和温度、每轮消毒的小瓶数、计算的理论停留F0值(该消毒过程中热输入量的量度)。表4-7的数据显示与具有可比性的低温长时间的消毒过程相比(也就是说，具有相似F0值的消毒过程)，在高温短时间的消毒过程中脂质损耗较少。
表4
制剂 停留*时间/温度 #消毒过的小瓶 理论停留F0      DPPE-PEG5Ka DPPCa DPPAa
mg/ml ％ mg/ml ％ mg/ml ％
脂质共混物(0.75mg/ml)丙二醇(0.1ml/ml)甘油(0.1ml/ml)氯化钠(6.8mg/ml)水 对照(未消毒) NA NA 0.284(±0.001) NA 0.369(±0.013) NA 0.044(±0001) NA
130℃/15分钟 100 38.8 0.280(±0.002) -1.4 0.346(±0.001) -6.2 0.037(±0.001) -15.9
130℃/10分钟 100 77.6  0.273(±0.003) -3.9 0.338(±0.002) -8.4 0.033(±0.006) -25.0
a为3个测定值的平均值。
*使用型号为6912D的Finn-Aqua饱和蒸汽压力釜进行的消毒周期
表5
制剂 停留*时间/温度 #消毒过的小瓶 理论停留F0 DPPE-PEG5Ka DPPCa DPPAa
mg/ml ％ mg/ml ％ mg/ml ％
脂质共混物(075mg/ml)丙二醇(0.1ml/ml)甘油(0.1ml/ml)氯化钠(6.8mg/ml)水 对照(未消毒) NA NA 0.273(±0.002) NA 0.383(±0.012) NA 0.039(±0.001) NA
126℃/7分钟 150 21.6 0.269(±0.005) -1.5  0.340(±0.001) -11.2 0.035(±0.002) -10.3
126℃/7分钟 150 27.2 0.274(±0.007) 0.4 0.354(±0.011) -7.6 0.033(±0.001) -15.4
128℃/7分钟 150 34.3 0.270(±0.003) -1.1 0.344(±0.022) -10.2 0.034(±0.001) -12.8
a为3个测定值的平均值。
*用型号为1342X的Barriquand过热水压力釜进行的消毒周期。
表6
制剂 停留*时间/温度 #消毒过的小瓶 理论停留F0 DPPE-PEG5Ka DPPCa  DPPAa
mg/ml ％ mg/ml ％ mg/ml ％
脂质共混物(0.75mg/ml)丙二醇(0.1ml/ml)甘油(0.1ml/ml)氯化钠(6.8mg/ml)水 对照(未消毒) NA NA 0.296(±0.004) NA 0.380(±0.009) NA 0.044(±0.001) NA
127℃/10分钟 75 38.9 0.292(±0.004) -1.4 0.331(±0.019) -12.9 0.039(±0.001) -11.4
128℃/10分钟 75 49.0 0.291(±0.002) -1.7 0.341(±0.013) -10.3 0.039(±0.001) -11.4
129℃/10分钟 75 61.7 0.289(±0.002) -2.4 0.334(±0.016) -12.1 0.038(±0.001) -13.6
a为6个测定值的平均值
*使用型号为1342X的Barriquand过热水压力釜进行的消毒周期。
表7
制剂 停留*时间/温度 #消毒过的小瓶 理论停留F0 DPPE-PEG5Ka DPPCa DPPAa
mg/l ％ mg/ml ％ mg/ml ％
脂质共混物(0.75mg/ml)丙二醇(0.1ml/ml)甘油(0.1ml/ml)氯化钠(6.8mg/ml)水 对照(未消毒) NA NA 0.284(±0.001) NA 0.369(±0.013) NA 0.044(±0.001) NA
124℃/22分钟 200 42.9 0.277(±0.003) -2.5 0.318(±0.013) -13.8 0.035(±0.001) -20.5
124℃/35分钟 200 68.2 0.273(±0.002) -3.9 0.311(±0.005) -15.7 0.033(±0.002) -25.0
124℃/35分钟 200 68.2 0.275(±0.000) -3.2 0.303(±0.006) -17.9 0.031(±0.001) -29.5
124℃/42分钟 200 81.9 0.273(±0.002) -3.9 0.305(±0.015) -17.3 0.030(±0.000) -31.8
a为3个测定值的平均值。
*使用型号为1342X的Barriquand过热水压力釜进行的消毒周期。
实施例3
同样对在大规模的生产过程中使用本发明的高温、短时间消毒周期进行检测。根据上述的优选方法制备45L的脂质体制剂。将该制剂放在小瓶中，调节小瓶顶部空间使其含有全氟丙烷气体，在无菌条件下密封所述小瓶。然后，在如表8所述的条件下对小瓶进行消毒。结果见表8。表8的数据显示高温、短时间的消毒周期可以用于大规模的生产过程中，而且脂质没有发生明显降解。
表8
制剂 停留*时间/温度 #消毒过的小瓶 DPPE-PEG5Ka DPPCa DPPAa
mg/ml mg/ml mg/ml
脂质共混物(0.75mg/ml)丙二醇(0.1ml/ml)甘油(0.1ml/ml)氯化钠(6.8mg/ml)水 未消毒 NA 0.28-0.30 0.36-0.40 0.044-0.047
128℃/6分钟 ～14000 0.29-0.31 0.38-0.39 0.040-0.042
未消毒 NA 0.31-0.32 0.42-0.44 0.049-0.051
128℃/6分钟 ～14000 0.27-0.31 0.36-0.43 0.037-0.051
未消毒 NA 0.30-0.31 0.42-0.44 0.043-0.045
128℃/6分钟 ～14000 0.30-0.30 0.39-0.41 0.038-0.040
未消毒 NA 0.31-0.33 0.41-0.31 0.046-0.047
128℃/6分钟 ～14000 0.32-0.34 0.38-0.41 0.041-0.044
a为6个测定值的范围。
实施例4
此外，还对经缓冲的脂质制剂的使用进行了检测。根据实施例1中所述步骤加入磷酸钠和柠檬酸钠缓冲剂制备所述经缓冲的制剂。结果参见下表9。表9的结果表明，与不加缓冲液的制剂相比，在消毒过程中，含有pH为6.5的缓冲剂的制剂的脂质降解较少。
表9
  制剂a   停留*时间/温度    #消毒过的小瓶    DPPE-PEG5Kb         DPPCb          DPPAb
  mg/ml   ％   mg/ml   ％   mg/ml   ％
  6.8mg/ml NaCl(未缓冲)   未消毒    NA   0.266   NA   0.385   NA   0.052   NA
  pH6-6.5，I＝0.116   128℃/6分钟    ～100   0.258   -3.0   0.335   -13.0   0.045   -14.0
  5mM柠檬酸钠5.84mg/ml NaCl   未消毒    NA   0.272   NA   0.396   NA   0.064   NA
  pH6.5，I＝0.116   128℃/6分钟    ～100   0.262   -3.6   0.369   -6.9   0.061   -4.7
  (未缓冲)6.8mg/ml NaClpH6-6.5，I＝0.116   未消毒    NA   0.265   NA   0.389   NA   0.048   NA
  128℃/6分钟    ～100   0.252   -5.0   0.332   -14.6   0.039   -18.8
  5mM磷酸钠5.84mg/ml NaClpH6.5，I＝0.116   未消毒    NA   0.274   NA   0.403   NA   0.052   NA
  128℃/6分钟    ～100   0.273   -0.5   0.379   -5.9   0.045   -14.1
a制剂还含有：0.75mg/ml脂质共混物，0.1ml/ml丙二醇，0.1ml/ml甘油，以及水。
b3个测量值的平均值
*使用型号为6912D的Finn-Aqua饱和蒸汽压力釜进行的消毒周期
实施例5
同样研究在大规模的生产工艺过程中经缓冲的制剂的脂质降解。结果见下表10。表10的数据表明大规模生产的经磷酸钠或柠檬酸钠缓冲的制剂，用本发明的高温短时间的消毒周期进行消毒只产生了极少部分的脂质降解。
表10
制剂a 停留*时间/温度 #消毒过的小瓶 DPPE-PEG5Kb   DPPCb   DPPAb
mg/ml   mg/ml   mg/ml
理论靶浓度 N/A N/A 0.30   0.40   0.045
(未缓冲)6.8mg/ml NaCl，pH6-6.5，I＝0.116 128℃/6分钟 ～400 0.29-0.30   0.37-0.40   0.039-0.041
25mM磷酸钠5.18mg/ml NaCl，pH6.5，I＝0.116 128℃/6分钟 ～400 0.28-0.29   0.38-0.39   0.040-0.041
13mM柠檬酸钠，4.52mg/ml NaClpH6.5，I＝0.116 128℃/6分钟 ～400 0.28-0.28   0.43-0.43   0.058-0.060
a制剂还含有：0.75mg/ml脂质共混物，0.1ml/ml丙二醇，0.1ml/ml甘油，以及水。
b3个测量值的范围
*使用型号为6912D的Finn-Aqua饱和蒸汽压力釜进行的消毒周期
实施例6
用具有蒸发性光散射检测器的反相HPLC法检测经本发明的高温短时间消毒周期进行消毒的脂质制剂中所存在的已知杂质。所述脂质制剂的制备参见实施例1和4。检测到的杂质包括棕榈酸、溶血卵磷脂(1-酰基)[lyso-PC(1-acyl)]、棕榈酰溶血卵磷脂(1-酰基)，mPEG5K-lyso-PE[甲氧基聚乙二醇5000棕榈酰溶血磷脂酰胆碱乙二醇胺(1-酰基))。结果参见下表11。表中包括所检测到的脂质杂质的总百分比(总杂质)，其计算如下：杂质的浓度/(0.75mg/ml)*100。表11的结果表明经过本发明的高温短时间消毒，经缓冲和未经缓冲的制剂只产生极少量的杂质。表11的结果还表明经缓冲的制剂中所产生的杂质明显低于未经缓冲的制剂所产生的杂质。
表11
制剂a 停留*时间/温度 #消毒过的小瓶 棕榈酸b％ Lyso-PC(1-acyl)b％ MPEG5K-lyso-PEb％ MPEG5Kb％ 总杂质％
(未缓冲)6.8mg/ml NaClpH6-6.5，I＝0.116 未消毒对照 NA 0.09 0.44 0.57 4.27 5.37
128℃/6分钟 ～100 1.35 1.37 0.335 4.09 8.43
5mM柠檬酸钠5.84mg/ml NaCl pH6.5，I＝0.116 未消毒对照 NA 0.05 0.36 0.396 4.81 5.59
128℃/6分钟 ～100 0.79 0.87 0.369 4.51 7.24
(未缓冲)6.8mg/ml NaClpH6-6.5，I＝0.116 未消毒对照 NA 0.17 0.61 0.389 4.44 5.21
128℃/6分钟 ～100 1.56 1.49 0.332 4.32 8.83
5mM磷酸钠5.84mg/ml NaClpH6.5，I＝0.116 未消毒对照 NA 0.00 0.43 0.403 4.87 5.29
128℃/6分钟 ～100 0.85 0.89 0.379 4.64 7.18
a制剂还含有：0.75mg/ml脂质共混物，0.1ml/ml丙二醇，0.1ml/ml甘油，以及水。
b2个测量值的平均值
*使用型号为6912D的Finn-Aqua饱和蒸汽压力釜进行的消毒周期
实施例7
同样在大规模的生产工艺过程中，对经过本发明的高温短时间的消毒周期进行消毒的脂质制剂中出现的已知杂质进行调查。结果见下表12。表12的数据显示在大规模的生产工艺过程中，经过本发明的高温短时间消毒，经缓冲和未经缓冲的制剂只产生极少量的杂质。
表12
制剂a 停留*时间/温度 #消毒过的小瓶 棕榈酸b(％) Lyso-PC(1-acyl)b(％) mPEG5K-lyso-PEb(％) 总杂质b(％)
(未缓冲)6.8mg/ml NaClpH6-6.5，I＝0.116 128℃/6分钟 ～400 0.84-0.93 0.93-0.98 0.62-0.69 2.4-2.5
25mM磷酸钠，5.18mg/ml NaClpH6.5，I＝0.116 128℃/6分钟 ～400 0.76-0.80 0.74-0.77 0.50-0.50 1.5-1.5
13mM柠檬酸钠，4.52mg/ml NaCl pH6.5，I＝0.116 128℃/6分钟 ～400 0.77-0.79 0v72-0.76 0.50-0.54 1.4-1.5
a制剂还含有：0.75mg/ml脂质共混物，0.1ml/ml丙二醇，0.1ml/ml甘油，以及水。
b3个测量值的范围
*使用型号为6912D的Finn-Aqua饱和蒸汽压力釜进行的消毒周期
本领域的技术人员应知晓，可以不偏离本发明的精神对本发明的优选实施方案作出大量修改和变换。因此，所附的权利要求包括所有等同替换，它们同样落在本发明的实际范围和精神之内。例如，本发明的脂质体有很多本发明中没有提及的其他应用。这些其它用途，包括例如超声的高温增强剂和药物运载工具。在PCT申请WO92/22298和US 5209720中描述并请求保护了上述其它用途和其它相关主题。上述申请均作为本申请的参考文献引入本文。

Claims (11)

1.一种处理含有脂质的制剂的方法，包括以下步骤：将所述制剂在大约126℃-130℃下放置大约2-10分钟。
2.如权利要求1所述的方法，其中将所述制剂在大约128℃±1℃的温度下放置大约6±0.5分钟。
3.如权利要求1所述的方法，包括以下步骤：在无菌条件下，将所述含有脂质的制剂引入至少一个小瓶中。
4.如权利要求1所述的方法，包括以下步骤：在所述含有脂质的制剂中加入一种稳定赋形剂。
5.如权利要求4所述的方法，其中所述稳定赋形剂包括pH缓冲剂。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述pH缓冲剂包括柠檬酸盐缓冲剂。
7.如权利要求5所述的方法，其中所述pH缓冲剂包括磷酸盐缓冲剂。
8.如权利要求4所述的方法，其中所述稳定赋形剂包括丙二醇。
9.如权利要求1所述的方法，包括调节所述含有脂质的制剂的pH值的步骤。
10.如权利要求1所述的方法，包括调节所述含有脂质的制剂的总离子强度的步骤。
11.如权利要求10所述的方法，其中在所述调节离子强度步骤之后，调节所述含有脂质的制剂的pH值。
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