JP2004531202A

JP2004531202A - Isolated human kinase protein, nucleic acid molecule encoding human kinase protein and uses thereof

Info

Publication number: JP2004531202A
Application number: JP2002529512A
Authority: JP
Inventors: ビーズリー，エレン，エム; ウェイ，ミン・ホイ; ボナッツィ，ビビアン，アール; サンダース，ロバート; フランセスコ，バレンティナディ
Original assignee: PE Corp
Current assignee: Applied Biosystems Inc
Priority date: 2000-09-19
Filing date: 2001-09-19
Publication date: 2004-10-14
Also published as: CA2422549A1; EP1320613A2; WO2002024920A3; AU2001292755A1; WO2002024920A2

Abstract

本発明は、ヒトゲノム中の遺伝子によりコード化されているペプチド、本発明のキナーゼペプチドのアミノ酸配列を提供するものである。本発明は、特に、単離ペプチド及び核酸分子、キナーゼペプチドのオルトログ及びパラログを同定する方法、及びキナーゼペプチドのモジュレータを同定する方法を提供するものである。The present invention provides a peptide encoded by a gene in the human genome, the amino acid sequence of the kinase peptide of the present invention. The invention provides, inter alia, methods for identifying isolated peptides and nucleic acid molecules, orthologs and paralogs of kinase peptides, and methods for identifying modulators of kinase peptides.

Description

【０００１】
関連出願
本出願は、２０００年９月１９日付け出願のＵ．Ｓ．ＳｅｒｉａｌＮｏ．６０／２３３，４９３（Ａｔｔｙ．ＤｏｃｋｅｔＣＬ０００８５７−ＰＲＯＶ）、２０００年１１月１３日付け出願のＵ．Ｓ．ＳｅｒｉａｌＮｏ．６０／２４７，０３１（Ａｔｔｙ．ＤｏｃｋｅｔＣＬ０００９０４−ＰＲＯＶ）、及び２０００年１２月６日付け出願のＵ．Ｓ．ＳｅｒｉａｌＮｏ．０９／７２９，９９５（Ａｔｔｙ．ＤｏｃｋｅｔＣＬ０００９０４）の優先権を主張するものである。
【０００２】
【技術分野】
本発明は、カルシウム／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼキナーゼサブファミリーに関連したキナーゼタンパク質、組み換えＤＮＡ分子、及びタンパク質の製造に関する。本発明は、特に、タンパク質のリン酸化に影響を与える新規なペプチド、タンパク質、及びこれらのペプチド、タンパク質分子をコード化する核酸分子を提供するものである。そして、これらはヒトの治療及び診断用の組成物、方法の開発に有用である。
【０００３】
【背景技術】
プロテインキナーゼ
キナーゼはタンパク質にリン酸基を付加することにより様々な細胞の増殖、分化、及びシグナル伝達を制御する。シグナル伝達系の制御異常は、炎症、癌、動脈硬化、及び乾癬等を含む様々な病態に関与していることが分かってきている。可逆的タンパク質リン酸化は、真核細胞の活性化を制御する主要な方法である。典型的な哺乳動物の細胞では、機能しているタンパク質１０，０００個中１，０００個以上がリン酸化を受けていると推測されている。活性化を制御する高エネルギーリン酸は通常、キナーゼによってアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）から特定のタンパク質に移され、またプロテインホスファターゼによってその蛋白質から外される。リン酸化反応は、細胞外シグナル（ホルモン、神経伝達物質、成長因子、分化因子など）、細胞周期チェックポイント、環境ストレス、及び栄養性ストレスに反応して起こり、分子スイッチを入れることにほぼ匹敵する。そのスイッチがオンになっていると、代謝酵素、制御蛋白、レセプター、細胞骨格蛋白、イオンチャンネル／ポンプ、あるいは転写因子を適当なプロテインキナーゼが活性化する。
キナーゼはこれまでに知られている最大の蛋白質グループであり、広範で多様な機能と特異性を有する酵素のサブファミリーである。キナーゼは普通、その基質、制御分子、或いは変異型が示すある種の表現型から名前が決められる。基質に基づいた場合、プロテインキナーゼはおおまかに、チロシン残基をリン酸化するキナーゼ（プロテインチロシンキナーゼ、ＰＴＫ）とセリンかスレオニン残基をリン酸化するキナーゼ（セリン／スレオニンキナーゼ、ＳＴＫ）の２つのグループに分類される。いくつかのキナーゼは両方の特異性を有し、スレオニンとチロシン残基をリン酸化する。ほとんど全てのキナーゼは２５０−３００アミノ酸からなる類似した酵素活性部位を有する。サブドメインＩ−ＩＶから成るＮ末領域は、通常２葉構造に折りたたまれ、ＡＴＰ（またはＡＤＰ）ドナー分子と結合し、方向付ける。サブドメインＶＩＡ−ＸＩから成るさらに大きなＣ末領域は、基質蛋白と結合し、ＡＴＰからのγリン酸をセリン、スレオニン、或いはチロシン残基の水酸基に移す作業を実行する。サブドメインＶは両端をつないでいる。
【０００４】
キナーゼ領域の一方の端に存在するか、あるいはキナーゼ領域のループに挿入されているアミノ酸配列（通常５−１００残基からなる）の違いによって、キナーゼはファミリーに分類されることもある。これらの付加アミノ酸配列は、キナーゼの標的蛋白を認識し、相互作用することでキナーゼごとの制御が可能になる。キナーゼ領域の一次構造は保存されており、１１のサブドメインにさらに分類されうる。１１のサブドメインはそれぞれ特別なアミノ酸残基とモチーフ、或いはアミノ酸パターンを有しており、それがサブドメインそれぞれの特徴となり、高度に保存されている（Ｈａｒｄｉｅ，Ｇ．ａｎｄＨａｎｋｓ，Ｓ．（１９９５）ＴｈｅＰｒｏｔｅｉｎＫｉｎａｓｅＦａｃｔｓＢｏｏｋｓ，ＶｏｌＩ：７−２０ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）。
【０００５】
セカンドメッセンジャー依存性プロテインキナーゼは、サイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）、サイクリックＧＭＰ、イノシトール三リン酸、ホスファチジルイノシトール、３，４，５−三リン酸、サイクリックＡＤＰリボース、アラキドン酸、ジアシルグリセロール、及びカルシウムーカルモジュリンなどのセカンドメッセンジャーの機能を主に介在する。サイクリックーＡＭＰ依存性プロテインキナーゼ（ＰＫＡ）はＳＴＫファミリーの重要なメンバーである。サイクリック−ＡＭＰは、これまで調べられた全ての原核生物、および動物細胞におけるホルモン作用の細胞内媒介物である。このようなホルモンが誘導する細胞応答には、甲状腺ホルモン分泌、コルチゾール分泌、プロゲステロン分泌、グリコーゲン分解、骨吸収、及び心拍数と心筋収縮力の制御が挙げられる。ＰＫＡは全ての動物細胞中に存在し、これらの細胞の大部分においてサイクリック−ＡＭＰの機能に関与していると考えられている。ＰＫＡ発現異常は、癌、甲状腺障害、糖尿病、アテローム性動脈硬化症、及び心臓血管系疾患などの様々な障害や病気に関与している（Ｉｓｓｅｌｂａｃｈｅｒ，Ｋ．Ｊ．ｅｔａｌ．（１９９４）Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓｏｆＩｎｔｅｒｎａｌＭｅｄｉｃｉｎｅ，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，ＮｅｗＹｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｐｐ．４１６−４３１，１８８７）。
【０００６】
カルシウムーカルモジュリン（ＣａＭ）依存性プロテインキナーゼもまたＳＴＫファミリーのメンバーである。カルモジュリンは、カルシウムとの結合に応答してターゲット蛋白に結合することにより、カルシウムで制御される過程の多くに介在するカルシウムレセプターである。これらの過程における第一のターゲット蛋白はＣａＭ依存性プロテインキナーゼである。ＣａＭ−キナーゼは平滑筋収縮（ＭＬＣキナーゼ）、グリコーゲン分解（ホスホリラーゼキナーゼ）、及び神経伝達（ＣａＭキナーゼＩとＣａＭキナーゼＩＩ）などの制御に関与している。ＣａＭキナーゼＩは、神経伝達関連蛋白シナプシンＩとＩＩ、遺伝子転写制御因子ＣＲＥＢ、及び嚢胞性線維症コンダクタンス制御蛋白、ＣＦＴＲなどの様々な基質をリン酸化する（Ｈａｒｉｂａｂｕ，Ｂ．ｅｔａｌ．（１９９５）ＥＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ１４：３６７９−８６）。ＣａＭＩＩキナーゼはシナプシンの別の部位をリン酸化し、チロシン水酸化酵素をリン酸化し活性化することにより脳におけるカテコールアミンの合成を制御する。ＣａＭキナーゼの多くは、ＣａＭに結合することに加えてリン酸化によって活性化を受ける。このキナーゼは自己リン酸化をすることもあり、また一連の「キナーゼカスケード」において別のキナーゼによりリン酸化される場合もある。
【０００７】
別のリガンド活性化プロテインキナーゼとして、５’−ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ（ＡＭＰＫ）がある（Ｇａｏ，Ｇ．ｅｔａｌ．（１９９６）Ｊ．ＢｉｏｌＣｈｅｍ．１５：８６７５−８１）。哺乳類のＡＭＰＫは、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼやヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡ還元酵素のリン酸化により脂肪酸やステロール合成を制御し、熱ショックやグルコース、ＡＴＰ欠乏などの細胞ストレス対するこれらの経路の反応を介在する。ＡＭＰＫは酵素活性を有するアルファサブユニットと、活性を持たないベータとガンマの２つのサブユニットからなるヘテロ３量体であり、後者はアルファサブユニットの活性を制御していると考えられている。ＡＭＰＫのサブユニットは、脳、心臓、脾臓、及び肺などの脂質生成のない組織に、想像されていた以上に幅広く分布する。この広範な分布から、脂質代謝制御以外の別の働きがあることが示唆されている。
【０００８】
マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰ）もまた、ＳＴＫファミリーのメンバーである。ＭＡＰキナーゼも細胞内シグナル伝達を制御する。このキナーゼは、リン酸化カスケードを通じて細胞表面から核内へのシグナル伝達を介在する。これまでにいくつかのサブグループが同定されており、それぞれが異なる基質特異性を示し、異なる細胞外刺激に反応する（Ｅｇａｎ，Ｓ．Ｅ．ａｎｄＷｅｉｎｂｅｒｇ，Ｒ．Ａ．（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ３６５：７８１−７８３）。ＭＡＰキナーゼシグナル伝達経路は、哺乳動物にも酵母にも存在する。哺乳動物の経路を活性化する細胞外刺激には、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、紫外線、高浸透圧培地、熱ショック、内毒素リポ多糖体（ＬＰＳ）、及び腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）やインターロイキン１（ＩＬ−１）などの前炎症性サイトカインなどがある。
【０００９】
ＰＲＫ（増殖関連キナーゼ）は血清／サイトカイン誘導性ＳＴＫであり、ヒトの巨核球系細胞の細胞周期や細胞増殖の制御に関与する（Ｌｉ，Ｂ．ｅｔａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：１９４０２−８）。ＰＲＫは、細胞***に関与するＳＴＫのポロ（ヒトのポロ遺伝子に由来する）ファミリーに関係があるキナーゼである。ＰＲＫは肺癌組織で発現が低下しており、正常組織におけるその発現異常が癌化へと繋がる癌遺伝子である可能性が考えられている。ＭＡＰキナーゼの発現異常は、癌、炎症、免疫異常、及び成長や発達に影響する疾患などの様々に病態に関係している。
【００１０】
サイクリン依存性プロテインキナーゼ（ＣＤＫｓ）は別のグループのＳＴＫであり、細胞周期を通じて細胞の発達を制御する。サイクリンは小さな調節蛋白であり、ＣＤＫに結合し、活性化する働きがある。サイクリンが結合したＣＤＫはその後、細胞***過程に関与する特定の蛋白質をリン酸化、及び活性化することにより細胞周期の様々な過程を動かす働きをする。ＣＤＫは活性化を受けるために多様な刺激を必要とする点で独特なキナーゼである。サイクリンの結合に加えて、ＣＤＫが活性化されるためには特定のスレオニン残基のリン酸化と特定のチロシン残基の脱リン酸化が必要である。
【００１１】
プロテインチロシンキナーゼ（ＰＴＫ）は、標的蛋白のチロシン残基を専らリン酸化し、膜型のレセプタータイプＰＴＫと非膜型の非レセプタータイプＰＴＫに分類されうる。膜型プロテインチロシンキナーゼは、大部分の増殖因子のレセプターである。増殖因子がレセプターに結合すると、ＡＴＰからのリン酸基がレセプターやそれ以外の特定の蛋白の決められたチロシン残基に移される。レセプター型ＰＴＫに関与する増殖因子（ＧＦ）には、上皮増殖因子、血小板由来増殖因子、線維芽細胞増殖因子、肝細胞増殖因子、インスリン、インスリン様増殖因子、神経増殖因子、血管内皮細胞増殖因子、及びマクロファージコロニー刺激因子などがある。
【００１２】
非レセプター型ＰＴＫは膜貫通領域を欠いており、細胞表面レセプターの細胞内領域と結合して複合体を形成する。このように非レセプター型ＰＴＫを通じて機能を発揮するレセプターには、サイトカインレセプター、ホルモン（成長ホルモンとプロラクチン）レセプター、およびＴ細胞とＢ細胞の抗原特異的レセプターがある。
【００１３】
これらのＰＴＫの多くが最初に同定されたのは、癌細胞中の変異癌遺伝子産物としてであり、癌細胞におけるＰＴＫの活性化はもはや正常な細胞制御を行ってはいない。実際、これまでに知られている癌遺伝子の約１／３はＰＴＫをコードしており、細胞トランスフォーメーション（腫瘍形成）にはしばしばチロシンリン酸化活性の上昇が伴うことはよく知られている（ＣａｒｂｏｎｎｅａｕＨａｎｄＴｏｎｋｓＮＫ（１９９２）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：４６３−９３）。すなわち、ある種の癌をコントロールするには、ＰＴＫ活性の制御が重要な戦略になり得る。
【００１４】
カルシウム／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼを含むセリン／スレオニンプロテインキナーゼ
カルシウム／カルモジュリン（ＣａＭ）依存性プロテインキナーゼは、セリン／スレオニンプロテインキナーゼ（ＳＴＫ）ファミリーのメンバーである。セリン／スレオニンプロテインキナーゼは、基質のセリン、またはスレオニン残基にリン酸基を付加する。プロテインキナーゼの基質には、転写因子やイオンチャンネルなどのシグナル伝達系の構成因子とともに、フィラメントや細胞モーターなどの構造蛋白がある。プロテインキナーゼ遺伝子ファミリーはゲノムにおいて最大の遺伝子ファミリーの一つである。キナーゼの分類は、塩基配列、組織分布、及びドメイントポロジーに基づいて行われる。キナーゼの基本的な構造はどちらかといえば保存されている。多くの分泌蛋白や膜蛋白が、キナーゼ領域と共にそれ以外の構造を有しており、これらの多機能領域を有する蛋白もしばしばキナーゼと見なされる。キナーゼの組織特異的発現は、転写制御因子によって決められることが多い。
【００１５】
カルモジュリンはカルシウム受容体であり、カルシウムとの結合に反応して標的蛋白に結合することによりカルシウムで制御される多くの過程を介在する。これらの過程における本来の標的蛋白はＣａＭ依存性プロテインキナーゼ（ＣａＭキナーゼとも呼ばれる）である。ＣａＭキナーゼは、平滑筋の収縮（ＭＬＣキナーゼ）、グリコーゲン分解（ホスホリラーゼキナーゼ）、及び神経伝達（ＣａＭキナーゼＩ及びＣａＭキナーゼＩＩ）に関与する。ＣａＭキナーゼＩは、神経伝達物質関連蛋白シナプシンＩとＩＩ、遺伝子転写制御因子ＣＲＥＢ、及び嚢胞性線維症コンダクタンス制御蛋白ＣＦＴＲを含む様々に基質をリン酸化する（Ｈａｒｉｂａｂｕ，Ｂ．ｅｔａｌ．（１９９５）ＥＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ１４：３６７９−８６）。ＣａＭキナーゼＩＩもシナプシンを異なる部位でリン酸化し、チロシンヒドロキシラーゼのリン酸化と活性化を通じて脳におけるカテコールアミン合成を制御する。ＣａＭキナーゼの多くは、ＣａＭの結合に加えて、リン酸化により活性化される。このキナーゼは自己リン酸化することもあり、或いは「キナーゼカスケード」の一部として別のキナーゼによりリン酸化を受ける場合もある（Ｔｏｋｕｍｉｔｓｕｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９５２７０：１９３２０−１９３２４）。
【００１６】
本発明で提供されるキナーゼは、ＣａＭキナーゼＩＶを活性化する酵素であるカルモジュリン依存性キナーゼキナーゼと高レベルの相同性を有している。ＣａＭキナーゼＩＶは、ＣａＭキナーゼＩＶキナーゼによるリン酸化で著明に活性化される。ＣａＭキナーゼＩＶは、その活性化キナーゼであるＣａＭキナーゼＩＶキナーゼとともに、神経細胞やリンパ球におけるカルシウム依存性シグナル伝達カスケードの重要な構成要素である。
【００１７】
ＣａＭキナーゼＩＶキナーゼ活性の存在が確認されているラットの小脳において、ノーザン、及びウエスタンブロット解析によるＣａＭキナーゼＩＶキナーゼのシグナルは比較的弱いことが示されている。このことは、小脳には大脳皮質から単離された酵素とは異なるＣａＭキナーゼＩＶキナーゼのアイソフォームが存在する可能性を示している。免疫沈降法により、脳にはＣａＭキナーゼＩＶキナーゼの異なるアイソフォームが少なくとも２つ存在することが示されている（Ｏｋｕｎｏｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ（Ｔｏｋｙｏ）１９９６Ｊｕｎ；１１９（６）：１１７６−８１）。
【００１８】
さらに、骨髄性細胞におけるＣａＭキナーゼカスケードは、好中球の機能と成熟に対するカルシウムの効果を介在する重要な役割を果たしている可能性がある。レチノイン酸誘導による好中球の成熟過程において、ＣａＭプロテインキナーゼキナーゼα（ＣａＭＫＫα）の発現が亢進することがウエスタンブロット解析により確認されている。これに加えて、好中球前駆細胞はＣａＭＬＩとＣａＭＬＩＶの両者の転写産物を発現しており、ＣａＭＬＩＶは好中球の成熟過程で発現が抑制され、ＣａＭＬＩは誘導されていない細胞で発現し、オールトランスレチノイン酸により誘導される（Ｌａｗｓｏｎｅｔａｌ．，ＥｘｐＨｅｍａｔｏｌ１９９９Ｎｏｖ；２７（１１）：１６８２−９０）。
【００１９】
本発明で提供される遺伝子は、酵母で発現させることによりキナーゼ蛋白のキガンド、又は基質として可能性のある因子を同定することが可能である。その方法としては「コンプリメンテーションアッセイ」や「２−ハイブリッドアッセイ」がある。人工的に合成した酵素やそれ由来のペプチドを用いて、このキナーゼが介在する細胞作用を活性化したり阻害することも可能である。イムノアッセイやＰＣＲを用いて、この蛋白質の濃度を定量し、増殖異常が起こっている組織や癌性増殖を検出することも考えられる。
【００２０】
カルシウム／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼキナーゼのさらなる総説としては、ｓｅｅＰａｒｋｅｔａｌ．，ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ１９９５Ｄｅｃ２２；２７０（５１）：３０４６４−９；Ｓａｋａｇａｍｉｅｔａｌ．，ＢｒａｉｎＲｅｓＭｏｌＢｒａｉｎＲｅｓ１９９８Ｍａｒ１；５４（２）：３１１−５；ａｎｄＥｎｓｌｅｎｅｔａｌ．，ＢｉｏｃｈｅｍＢｉｏｐｈｙｓＲｅｓＣｏｍｍｕｎ１９９５Ｆｅｂ２７；２０７（３）：１０３８−４３の文献を参照されたい。
【００２１】
キナーゼ蛋白、特にカルシウム／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼキナーゼのサブファミリーのメンバーは、薬剤作用と薬剤開発の主要なターゲットである。したがって、キナーゼ蛋白の中のこのサブファミリーに属するこれまでに知られていないメンバーを同定し、性状解析することは製薬開発の分野において価値のあることである。本発明は、カルシウム／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼキナーゼサブファミリーのメンバーとホモロジーを有するこれまでに未知のヒトキナーゼ蛋白を提供するという点で最先端のものである。
【００２２】
【発明の要約】
本発明は、カルシウム／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼキナーゼサブファミリーに関係する、ヒトキナーゼペプチド及びタンパク質のアミノ酸配列同定の一部、これらの対立遺伝子変異体、および他の哺乳類におけるこれらのオルトログに基づいたものである。これらの特異なペプチド配列、及びこれらのペプチドをコード化する核酸配列は、ヒトの治療ターゲット開発のためのモデルとして用いることができ、治療に用いるタンパク質の識別に役立ち、また、キナーゼを発現する細胞及び組織内でのキナーゼ活性を調節するようなヒトの治療薬の開発におけるターゲットとなり得る。図１の実験データによると、ヒトにおいては、眼（網膜芽細胞腫）と脳において発現が示されている。
【００２３】
【発明を実施するための最良の形態】
概論
本発明は、ヒトゲノムの配列解析に基づいている。ヒトゲノムの配列解析及び構築に際して、配列情報を解析することによって、当該分野においてキナーゼ蛋白質、またはその一部であると同定され、またカルシウム／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼキナーゼサブファミリーに関連付けられる蛋白質／ペプチド／ドメインに対して構造及び／又は配列の相同性を有するペプチドをコード化するヒトゲノムの未確認フラグメントが明らかになった。これらの配列を用いて、付加的なゲノム配列を構築、、転写し、及び／又はｃＤＮＡ配列を単離し、特徴付けた。この解析に基づき、本発明は、カルシウム／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼキナーゼサブファミリーに関連するヒトキナーゼペプチドと蛋白のアミノ酸配列、これらの蛋白をコード化する転写配列、ｃＤＮＡ配列及びゲノム配列型の核酸配列、核酸変異（対立遺伝子情報）、発現の組織分布、及び本発明のキナーゼに対して構造又は配列の相同性を有する、最も関連性の高い既知の蛋白質／ペプチド／ドメインに関する情報を提供するものである。
【００２４】
本発明において提供されるペプチドは、従来未知であることに加えて、商業的に重要な製品及びサービスの開発にとって有用であるという点に基づいて、選択され得るものである。特に、本発明のペプチドは、カルシウム／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼキナーゼサブファミリーにおける既知のキナーゼタンパク質に対して相同性及び／又は構造上の相関性を有し、発現パターンが観察されることに基づいて選択される。図１の実験データによると、ヒトにおいては、眼（網膜芽細胞腫）と脳において発現が示されている。この技術は、このファミリーのタンパク質、及び本発明の遺伝子に類似した発現パターンを有するタンパク質の商業的な重要性を確立するものである。本発明のペプチドについてのより特異的な性質、及びその使用については、本明細書、特に背景技術、図面の注釈に記載され、及び／又は既知のカルシウム／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼキナーゼファミリー、またはキナーゼタンパク質サブファミリーのそれぞれにおいて周知である。
【００２５】
【実施例の詳細】
ペプチド分子
本発明は、キナーゼファミリーのタンパク質の１つであると同定されたタンパク質分子をコード化する核酸配列を提供するものであり、これらはカルシウム／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼキナーゼサブファミリー（図２にタンパク質配列、図１に転写／ｃＤＮＡ配列、図３にゲノム配列を示す）に関連付けられる。図２にはペプチド配列が記載され、ここには明らかな変異体、特に本明細書及び図３の情報を用いて同定される対立変異体も記載されており、これらは、本発明のキナーゼペプチド、キナーゼペプチド、又は本発明のペプチド／タンパク質と呼ばれる。
【００２６】
本発明は、図２に示すキナーゼペプチド（図１の転写／ｃＤＮＡ、又は図３のゲノム配列に示される核酸分子によりコード化される）のアミノ酸から成る、あるいは実質的に成る、あるいはこれを含む単離ペプチド及びタンパク質分子を提供するとともに、本技術により作製、使用されるこれらのペプチドの明らかな変異体を提供するものである。これらの変異体については、以下で詳述する。
【００２７】
本明細書で使用されているように、ペプチドが細胞物質を実質的に含まない、又は化学前駆物質あるいは他の化学物質を含まない場合に、ペプチドは「単離」または「精製」されたという。本ペプチドは、均一、又は他の純度になるまで精製することができる。精製のレベルは使用目的に基づく。重要な性質は、調製物中に他の成分が多量に存在していたとしても、要求されるペプチドの機能を発揮できるということである（単離核酸分子の性質については、後述する）。
【００２８】
いくつかの例によると、「実質的に細胞物質を含まない」とは、他のタンパク質（すなわち汚染タンパク質）を約３０％（乾燥重量）未満、他のタンパク質を約２０％未満、他のタンパク質を約１０％未満、又は、他のタンパク質を約５％未満有するペプチド調製物を含む。ペプチドが組み換えにより製造される場合、培地がタンパク質調製物の容量に対して２０％未満の時には、実質的に培地は存在しないとすることができる。
【００２９】
「実質的に化学前駆物質又は他の化学物質を含まない」という用語は、合成に関与した化学前駆物質又は他の化学物質から分離されたペプチド調製物をいう。ある例においては、「実質的に化学前駆物質又は他の化学物質を含まない」とは、化学前駆物質又は他の化学物質を約３０％（乾燥重量）未満、化学前駆物質又は他の化学物質を約２０％未満、化学前駆物質又は他の化学物質を約１０％未満、又は化学前駆物質又は他の化学物質を約５％未満有するキナーゼペプチド調製物を含む。
【００３０】
単離キナーゼペプチドは、自然に発現する細胞、発現のために変形された（組み換えられた）細胞から精製するか、又は、既知のタンパク質合成方法を用いて合成することができる。図１の実験データによると、ヒトにおいては、眼（網膜芽細胞腫）と脳において発現が示されている。例えば、キナーゼペプチドをコード化している核酸分子は、発現ベクター中にクローニングされ、さらにこの発現ベクターは宿主細胞に導入されて、タンパク質が宿主細胞内で発現する。そして、タンパク質は標準のタンパク質精製技術を用いた適当なスキームによって、細胞から単離することができる。これらの多くの技術については、以下で詳述する。
【００３１】
したがって、本発明は、図２に示されるアミノ酸配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：２）から成るタンパク質、例えば、図１に示される転写／ｃＤＮＡ核酸配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：１）や、図３に示されるゲノム配列（ＳＥＱＩＤＮＯ．３）によりコード化されるタンパク質を提供するものである。このようなタンパク質の最終的なアミノ酸配列がこのアミノ酸配列であるとき、タンパク質はアミノ酸配列から成る。
【００３２】
本発明はさらに、図２に示されるアミノ酸配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：２）から実質的に成るタンパク質、例えば、図１に示される転写／ｃＤＮＡ核酸配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：１）や、図３に示されるゲノム配列（ＳＥＱＩＤＮＯ．３）によりコード化されるタンパク質を提供するものである。このようなアミノ酸配列が微量の付加アミノ酸残基、例えば、最終的にタンパク質中に約１〜１００程度の付加残基、一般的には１〜２０の付加残基が存在する場合、タンパク質はアミノ酸配列から実質的に成る。
【００３３】
本発明はさらに、図２に示されるアミノ酸配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：２）を含むタンパク質、例えば、図１に示される転写／ｃＤＮＡ核酸配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：１）及び図３に示されるゲノム配列（ＳＥＱＩＤＮＯ．３）によりコード化されるタンパク質を提供するものである。このアミノ酸配列が、タンパク質の最終的なアミノ酸配列の少なくとも一部である場合、タンパク質はアミノ酸配列を含む。このような場合、タンパク質はペプチドのみであるか、またはタンパク質と自然に結びついているアミノ酸残基（コード化された配列と隣接する）や、非相同アミノ酸残基／ペプチド配列のように、付加的なアミノ酸を有することができる。このようなタンパク質は、少量の付加的アミノ酸残基を有するか、又は数百あるいはそれ以上の付加的アミノ酸を含むことができる。本発明のキナーゼペプチドが含まれるタンパク質の好適な種として、天然の成熟タンパク質がある。これらの各種タンパク質を調製／単離する方法について、以下に簡単に述べる。
【００３４】
本発明のキナーゼペプチドは、キメラ又は融合タンパク質を形成するために、非相同性の配列に結合することができる。このようなキメラ及び融合タンパク質は、キナーゼペプチドに対して実質的に相同性のないアミノ酸配列を有する非相同タンパク質に、有効に結合され得るキナーゼペプチドを含む。「有効に結合され得る」とは、キナーゼペプチドと非相同タンパク質がフレーム中で融合していることを意味する。非相同タンパク質は、キナーゼペプチドのＮ末端又はＣ末端に融合されることができる。
【００３５】
いくつかの例では、融合タンパク質は、キナーゼペプチド自体に活性に影響を及ぼさない。例えば、融合タンパク質には、βガラクトシダーゼ融合、イースト２−ハイブリッドＧＡＬ融合、ポリＨｉｓ融合、ＭＹＣ標識、ＨＩ標識及びＩｇ融合といった酵素融合タンパク質が含まれるが、融合タンパク質はこれに限られるものではない。このような融合タンパク質、特にポリＨｉｓ融合は、組み換えキナーゼペプチドの精製に有用である。ある種の宿主細胞（例えば哺乳類の宿主細胞）においては、タンパク質の発現及び／又は分泌は、非相同信号配列を用いることにより増加させることができる。
【００３６】
キメラ又は融合タンパク質は、標準の組み換えＤＮＡ技術により製造することができる。例えば、異なるタンパク質配列をコードしているＤＮＡフラグメントは、従来技術に従ってフレーム中に共に配置される。あるいは、融合遺伝子は、自動ＤＮＡ合成機を含む従来技術により合成することが可能である。あるいは、遺伝子フラグメントのＰＣＲ増幅にアンカープライマーを用い、２つの連続的な遺伝子フラグメント間に相補的な突出部を形成し、その後アニールすることにより、キメラ遺伝子配列を再増幅することができる（Ａｕｓｕｂｅｌｅｔａｌ．，ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，１９９２参照）。さらに、発現ベクターとしては、既に融合部分（例えばＧＳＴタンパク質）をコード化した多くのものを、商業的に入手することができる。キナーゼペプチドをコード化した核酸は、融合部がフレーム中でキナーゼペプチドに結合するようにして、このような発現ベクター中にクローニングされることができる。
【００３７】
以上説明したように、本研究はまた、天然のペプチド成熟形態、ペプチドの対立遺伝子／配列変異体、非天然の組み換え誘導変異体、ペプチドのオルトログ及びパラログなど、本発明のタンパク質のアミノ酸配列における明らかな変異体を提供、及び実施可能にするものである。このような変異体は、核酸組み換え技術やタンパク質生化学の分野で公知の技術を用いることにより、容易に生成することができる。しかし、当然のことながら、この変異体には、本発明以前に公開されている何れのアミノ酸配列も含まれないものである。
【００３８】
このような変異体は、本発明に示される分子技術や配列情報を用いることにより、容易に同定／製造することが可能である。さらに、このような変異体は、本発明のキナーゼペプチドに対する配列及び／又は構造上の相同性に基づいて、他のペプチドと容易に区別することができる。相同性／同一性の程度は、主に、ペプチドが機能的な変異体であるか非機能的な変異体であるか、パラログファミリー中に存在する分化量、オルトログ間の進化的相違に基づいて判断される。
【００３９】
２つのアミノ酸配列、又は２つの核酸配列の同一性パーセントを決定するために、最適な比較を行う目的で配列は整列される（例えば、最適な配列比較のために、ギャップが第一及び第二アミノ酸又は核酸配列の一方又は両方に導入され、非相同性配列は比較を行うために無視することができる）。好適な例としては、対象配列の長さの少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又はそれ以上が、比較目的に応じて整列される。そして、対応するアミノ酸配置又はヌクレオチド配置上のアミノ酸残基又はヌクレオチドが比較される。第一配列での配置が、第二配列において対応する配置と同じアミノ酸残基又はヌクレオチドによって占められている時、分子はその配置と同じで同一である（ここで用いられているアミノ酸又は核酸の「同一性」は、アミノ酸又は核酸の「相同性」と同意義である）。２つの配列間の同一性パーセントは、配列において共有される同一配置数の関数であり、ギャップ数及び各ギャップ長さを考慮し、ギャップは２つの配列が最適な比較を行えるように導入される必要がある。
【００４０】
２つの配列間における、配列の比較及び同一性、類似性パーセントの決定は、数学的アルゴリズムを用いて行うことができる（ＣｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．，ＯｘｆｏｒｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，１９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：ＩｎｆｏｒｍａｔｉｃｓａｎｄＧｅｎｏｍｅＰｒｏｊｅｃｔｓ，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，１９９３；ＣｏｍｐｕｔｅｒＡｎａｌｙｓｉｓｏｆＳｅｑｕｅｎｃｅＤａｔａ，Ｐａｒｔ１，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．，ＨｕｍａｎａＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＪｅｒｓｅｙ，１９９４；ＳｅｑｕｅｎｃｅＡｎａｌｙｓｉｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎＨｅｉｎｊｅ，Ｇ．，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，１９８７；ａｎｄＳｅｑｕｅｎｃｅＡｎａｌｙｓｉｓＰｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．，ＭＳｔｏｃｋｔｏｎＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，１９９１）。好適な例として、２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントはＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで入手可能）のＧＡＰプログラムに組み込まれたＮｅｅｄｌｅｍａｎ・Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（４８）：４４４−４５３（１９７０））を用い、Ｂｌｏｓｓｏｍ６２マトリックス、又はＰＡＭ２５０マトリックス、及びギャップ重量１６、１４、１２、１０、８、６、４、長さ重量１、２、３、４、５、６を用いて決定される。他の好適な例としては、２つのヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、ＧＡＰプログラム（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｔａｌ．，（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１２（１）：３８７（１９８４））を用い、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリックス、ギャップ重量４０、５０、６０、７０、８０と長さ重量１、２、３、４、５、６を用いて決定される。さらに他の一例としては、２つのアミノ酸又ヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれたＥ．Ｍｙｅｒｓ・Ｗ．Ｍｉｌｌｅｒのアルゴリズム（ＣＡＢＩＯＳ，４：１１−１７（１９８９））を用い、ＰＡＭ１２０重量残基表、ギャップ長ペナルティ２、ギャップペナルティ４を用いて決定される。
【００４１】
本発明の核酸及びタンパク質配列は、例えば他のファミリー又は関連した配列を発見するために、配列データベースに対して検索を行う「クエリー配列」として用いられることができる。このような検索は、ＡｌｔｓｃｈｕｌらのＮＢＬＡＳＴ、及びＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０（１９９０））を用いて行うことができる。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、本発明の核酸分子に相同性のあるヌクレオチド配列を得るために、ＮＢＬＡＳＴプログラムを用い、ｓｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２で行うことができる。ＢＬＡＳＴタンパク検索は、本発明のタンパク質に相同性のあるアミノ酸配列を得るために、ＸＢＬＡＳＴプログラムを用い、ｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３で行うことができる。比較目的のギャップ配列を得るために、ＡｌｔｓｃｈｕｌらのＧａｐｐｅｄＢＬＡＳＴ（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２５（１７）：３３８９−３４０２（１９９７））を用いることができる。ＢＬＡＳＴ及びギャップＢＬＡＳＴプログラムを用いる際には、各プログラム（例えばＸＢＬＡＳＴやＮＢＬＡＳＴ）の既定のパラメータを用いることができる。
【００４２】
本発明のペプチドのうちの一つを含むタンパク質における、成熟プロセシングを受ける前の形態、およびプロセシングを受けた形態の全長は、本発明のキナーゼのうちの一つに対して完全な配列同一性を有し、本発明のキナーゼペプチドと同じ遺伝子位置によりコード化されているものとして、容易に同定することができる。図３で提示されたデータに示されているように本発明の新規ヒトキナーゼ蛋白をコードする遺伝子は、ヒト第１７番染色体上に存在することが知られているパブリックＢＡＣＡＣ００５９４０上に位置している。
【００４３】
キナーゼペプチドの対立遺伝子変異体は、キナーゼペプチドの少なくとも一部に対して高度の（著しい）配列相同性／同一性を有するヒトタンパク質であり、同様に本発明のキナーゼペプチドと同じ遺伝子位置においてコード化されるものとして、容易に同定することができる。遺伝子位置は、対象となるヒトに対してマッピングされたゲノム配列のような、図３に示されるゲノム情報に基づいて容易に決定することができる。図３で提示されたデータに示されているように本発明の新規ヒトキナーゼ蛋白をコードする遺伝子は、ヒト第１７番染色体上に存在することが知られているパブリックＢＡＣＡＣ００５９４０上に位置している。本発明に用いられているように、アミノ酸配列において、典型的には少なくとも約７０〜８０％、８０〜９０％、９０〜９５％、さらに典型的には少なくとも約９０〜９５％、又はそれ以上の相同性を有する場合、２つのタンパク質（又はタンパク質の一領域）は著しい相同性を有している。本発明によれば、著しい相同性を有するアミノ酸配列は、より詳細には以下に述べられるようなストリンジェントな条件の下で、核酸分子にコード化されるキナーゼペプチドとハイブリダイズする核酸配列によりコード化される。
【００４４】
図３には、本発明の新規ヒトキナーゼ蛋白をコードする遺伝子中に見いだされたＳＮＰについての情報を示す。ＳＮＰは、イントロン、及びＯＲＦの５’と３’領域において３４カ所の異なる塩基ポジションにおいて確認された。その中には、ポジション１６１３５における非同義性ｃＳＮＰと、制御／調整領域に影響を与える可能性があるＯＲＦの５’端の２つのＳＮＰ（ポジション２０８２と２７４８）が含まれる。Ｇ１６１３５ＡのＳＮＰにより生じるアミノ酸配列の変化は図３に示されており、ユニバーサル遺伝子コードと図２に参照として示してある蛋白配列により容易に確認することができる。
【００４５】
キナーゼペプチドのパラログは、キナーゼペプチドの少なくとも一部に対して、ある程度の著しい配列相同性／同一性を有し、ヒトの遺伝子によってコード化され、また同様の活性又は機能を有しているものとして、容易に同定することができる。アミノ酸配列が、与えられた領域又はドメインを通じて、典型的に少なくとも約６０％以上、さらに典型的には７０％以上の相同性を有する場合、２つのタンパク質は典型的なパラログであると考えられる。このようなパラログは、より詳細には以下に述べられるような適度にストリンジェントな条件の下で、核酸分子にコード化されるキナーゼペプチドとハイブリダイズする核酸配列によりコード化される。
【００４６】
キナーゼペプチドのオルトログは、キナーゼペプチドの少なくとも一部に対してある程度の著しい配列相同性／同一性を有し、他の生体の遺伝子によってコード化されているものとして、容易に同定することができる。オルトログは、好適には、哺乳類、さらに好適には霊長類から単離され、ヒトの治療のターゲット及び治療薬剤の開発のために用いられる。このようなオルトログは、より詳細には以下に述べられるような、モディレートからストリンジェントな条件の下で核酸をコード化するキナーゼペプチドとハイブリダイズするような核酸配列によりコード化され、これはタンパク質を生成する２つの生体の関連性に依存する。
【００４７】
本発明にキナーゼペプチドの非天然の変異体は、組み換え技術を用いて容易に生成することができる。このような変異体には、キナーゼペプチドのアミノ酸配列中における欠失、付加、置換によるものが含まれるが、これらに限定されるものではない。例えば、置換の１種として、保存的アミノ酸置換が挙げられる。この置換は、キナーゼペプチドにおける特定のアミノ酸が同様の特徴を持つ他のアミノ酸によって置換されるものである。保存的置換においては、脂肪族のアミノ酸Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅの中の一つが他の一つに置換、ヒドロキシル残基ＳｅｒとＧｌｎ間の置換、酸性残基ＡＳＰとＧｌｕとの置換、アミド残基ＡｓｎとＧｌｎ間の置換、塩基性残基ＬｙｓとＡｒｇとの置換、芳香族残基ＰｈｅとＴｙｌとの置換がある。表現型に現れないアミノ酸置換に関する指針については、Ｂｏｗｉｅｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２４７：１３０６−１３１０（１９９０）に述べられている。
【００４８】
変異キナーゼペプチドは、完全に機能しているか、又は、例えば基質結合能、基質リン酸化能、信号伝達調整能の一つ以上の活性において機能が欠落していることがある。完全機能的な変異体は、一般的に、保存的な変異、又は致命的でない残基あるいは領域内での変異体のみが含まれる。図２は、タンパク質分析の結果を示しており、致命的ドメイン／領域を特定するのに使用することができる。機能的変異体には、機能が変化しない、又は著しい機能変化の無い類似アミノ酸の置換も含まれる。他方、このような置換は、ある程度機能に対してプラス又はマイナスの影響を及ぼすことがある。
【００４９】
非機能的変異は、典型的には、一つ以上の非保存的なアミノ酸の置換、欠失、導入、反転、切断、又は致命的な残基あるいは領域での置換、欠失、導入、反転が含まれる。
【００５０】
機能において必須のアミノ酸は、例えば、特定部位の突然変異誘発、又はアラニンスキャニング突然変異誘発（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２４４：１０８１−１０８５（１９８９））等の当該分野における既知の方法により、特に図２に示す結果を用いて確認することができる。アラニンスキャニング突然変異誘発では、分子内のすべての残基において、単独のアラニン突然変異を行う。この結果生じた変異分子は、その後、キナーゼ活性のような生物活性、又はｉｎｖｉｔｒｏ増殖活性分析のようなアッセイのために試験される。結合相手／基質結合にとって重要な部位は、結晶化、核磁気共鳴、光学親和性ラベル等の構造解析によって決定される（Ｓｍｉｔｈｅｔａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２４：８９９−９０４（１９９２）；ｄｅＶｏｓｅｔａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ２５５：３０６−３１２（１９９２））。
【００５１】
本発明はさらに、キナーゼペプチドのフラグメントを提供し、これに加えて、該フラグメントを含む、及びから成るタンパク質及びペプチド、特に図２に同定された残基を含むタンパク質及びペプチドを提供するものである。しかしながら、本発明に関連するフラグメントは、本発明より以前に公開されているフラグメントを含むものとは見なされない。
【００５２】
ここで用いられているように、フラグメントは、キナーゼペプチドに隣接するアミノ酸残基を、少なくとも８、１０、１２、１４、１６又はそれ以上含んでいる。このようなフラグメントは、１以上のキナーゼペプチドの活性を保持する能力によって選択されるか、あるいは、基質との結合又は抗原としての挙動等の機能を果たす能力によって選択され得る。特に重要なフラグメントは生物活性フラグメントであり、これは例えば、８又はそれ以上のアミノ酸のペプチドである。このようなフラグメントは、典型的には、例えば活性部位、膜内外ドメイン又は基質結合ドメインのような、キナーゼペプチドのドメイン又はモチーフを含んでいる。さらに、可能なフラグメントとしては、ドメイン又はモチーフ含有フラグメント、溶解性ペプチドフラグメント、抗原性構造含有フラグメントを含むが、フラグメントは此に限定されるものではない。予想されるドメイン及び機能性部位は、当業者にとって容易に入手可能な公知のコンピュータプログラム（例えばＰＲＯＳＩＴＥ分析）により、容易に確認することができる。このような分析結果の１つを図２に示す。
【００５３】
ポリペプチドは、一般に２０天然アミノ酸と呼ばれている２０種のアミノ酸以外のアミノ酸を、しばしば含むことがある。さらに、末端アミノ酸を含む多くのアミノ酸は、プロセシング及び翻訳後修飾等の自然の過程、又は当該分野において公知の化学修飾技術によって修飾され得る。キナーゼペプチドにおいて自然に生じる一般的な修飾については、基本的なテキスト、詳細な研究論文及び文献に記述されており、これは当業者においては周知である（これらの特性のいくつかは図２において確認される）。
【００５４】
既知の修飾としては、アセチル化、アシル化、ＡＤＰリボシル化、アミド化、フラビンの共有結合付加、ヘム部分の共有結合付加、ヌクレオチド又はヌクレオチド誘導体の共有結合付加、脂質又は脂質誘導体の共有結合付加、ホスファチジルイノシトールの共有結合付加、架橋結合、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合架橋の形成、シスチンの形成、ピログルタミン酸塩の形成、ホルミン化、γ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、参加、タンパク質分解プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニン化などのタンパク質へのアミノ酸の転写ＲＮＡ媒介付加、ユビキチン化を含むが、修飾はこれに限定されるものではない。
【００５５】
このような修飾は、当業者には周知であり、科学文献に非常に詳細に記載されてきた。グリコシル化、脂質付加、硫酸化、グルタミン酸残基のγ−カルボキシル化、ヒドロキシル化、ＡＤＰリボシル化など、特に一般的な修飾は、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ − ＳｔｒｕｃｔｕｒｅａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，２ｎｄＥｄ．，Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｗ．Ｈ．ＦｒｅｅｍａｎａｎｄＣｏｍｐａｎｙ，ＮｅｗＹｏｒｋ（１９９３）のような、ほとんどの基本テキストにおいて記載されている。この点に関する詳細な文献としては、Ｗｏｌｄ，Ｆ．，ＰｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌＣｏｖａｌｅｎｔＭｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＰｒｏｔｅｉｎｓ，Ｂ．Ｃ．Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｅｄ．，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ１−１２（１９８３）；Ｓｅｉｆｔｅｒｅｔａｌ．（Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８２：６２６−６４６（１９９０））ａｎｄＲａｔｔａｎｅｔａｌ．（Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６６３：４８−６２（１９９２））のような多くの文献を利用することができる。
【００５６】
したがって、本発明のキナーゼペプチドは、誘導体又は類似体をも包括するものであり、ここで、置換されたアミノ酸残基は遺伝子コードによってコード化されるものではなく、置換基が含まれ、成熟キナーゼペプチドが、例えばキナーゼペプチドの半減期を長くする化合物（例えば、ポリエチレングリコール）のような他の化合物と融合するか、又は付加アミノ酸が、例えば主、副配列、成熟キナーゼペプチドの精製配列、あるいは前タンパク質配列のような成熟キナーゼペプチドと融合する。
【００５７】
タンパク質／ペプチドの使用
本発明のタンパク質は、図面に示される機能情報に関連した、実質的かつ特異的なアッセイにおいて、例えば、抗体を高める、又は他の免疫反応を誘導させるための、生物液中でのタンパク質（又はその結合対象、又はリガンド）レベルの定量のためのアッセイに用いる試薬（ラベル化試薬を含む）として、また、対象となるタンパク質を選択的に発現する組織のマーカー（組織の分化又は発達のある特定段階、あるいは疾患の状態）として使用することができる。タンパク質が、別のタンパク質又はリガンドと結合する、又は結合し得る場合（例えば、キナーゼ関与タンパク質間の相互作用、又はキナーゼリガンド間の相互作用）、このタンパク質を用いて結合相手／リガンドを特定し、結合相互作用のインヒビターを同定するシステムを開発することができる。これらの一部又はすべての使用により、試薬グレード、又は商業製品としてのキットファーマットへと開発することが可能となる。
【００５８】
上に列記した使用を実際に行う方法は、当業者にとって周知のことである。このような方法を開示している参考文献としては、”ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ”，２ｄｅｄ．，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｅ．Ｆ．ＦｒｉｔｓｃｈａｎｄＴ．Ｍａｎｉａｔｉｓｅｄｓ．，１９８９と ”ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：ＧｕｉｄｅｔｏＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ”，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，Ｂｅｒｇｅｒ，Ｓ．Ｌ．ａｎｄＡ．Ｒ．Ｋｉｍｍｅｌｅｄｓ．，１９８７がある。
【００５９】
本発明のペプチドの潜在的な用途は、第一に、タンパク源、及びタンパク質の種類／作用に基づいている。例えば、ヒトから単離したキナーゼ、及びそれらのヒト／哺乳類オルトログは、哺乳類の治療用医薬、例えば、ヒト用の医薬品、特に、キナーゼを発現する細胞又は組織での生物反応又は病理学的反応の調整に用いられる医薬を発見するためのターゲットとして有用である。図１の実験データに示されるように、本発明のキナーゼ蛋白はヒトにおいては、眼（網膜芽細胞腫）と脳に発現している。特に、実質的なノーザンブロット解析により網膜芽細胞腫における発現、およびＰＣＲを用いた組織スクリーニングパネルにより脳における発現が示されている。キナーゼタンパク質、特に、カルシウム／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼキナーゼサブファミリーの活性を調整する医薬品の多くは、現在開発中である（背景技術を参照）。背景技術及び図面に記載されている構造情報及び機能情報は、特に、図１の発現情報と組み合わせることによって、本発明の分子の特異的及び本質的な使用が提供される。図１の実験データによると、ヒトにおいては、眼（網膜芽細胞腫）と脳において発現が示されている。このような使用は、本発明で与えられる情報と、当業者において既知の情報、及びルーチン実験を用いて、容易に決定することができる。
【００６０】
本発明のタンパク質（本発明以前に開示されている変異体及びフラグメントを含む）は、カルシウム／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼキナーゼサブファミリーに関連付けられるキナーゼに関する生物学的アッセイに有用である。このようなアッセイは、キナーゼの機能あるいは活性、又は、特にキナーゼを発現する細胞及び組織における本発明の一つが属するキナーゼサブファミリーに特有のキナーゼに関連する症状の診断及び治療に有用な性質、の何れかに関連している。図１の実験データに示されるように、本発明のキナーゼ蛋白はヒトにおいては、眼（網膜芽細胞腫）と脳に発現している。特に、実質的なノーザンブロット解析により網膜芽細胞腫における発現、およびＰＣＲを用いた組織スクリーニングパネルにより脳における発現が示されている。
【００６１】
本発明のタンパク質は、細胞ベース、又は無細胞系における薬剤スクリーニングアッセイにおいても有用である。細胞ベース系は、天然型、すなわちキナーゼを正常に発現する細胞であり、生体組織検査、又は細胞培地中で増殖する。図１の実験データによると、ヒトにおいては、眼（網膜芽細胞腫）と脳において発現が示されているあるいは、細胞ベースアッセイは、キナーゼタンパク質を発現する組み換え宿主細胞に関係している。
【００６２】
ポリペプチドは、自然状態、又はキナーゼに関連する特定の疾患又は症状を引き起こす変異型のタンパク質のキナーゼ活性を調整する化合物を同定するために用いることができる。本発明のキナーゼ、及び適当な変異体やフラグメントは、このキナーゼに対して結合能力を持つ候補化合物をアッセイするための高効率スクリーンにおいて使用することができる。これらの化合物は、さらに、これらのキナーゼ活性に対する影響を判定するために、機能性のキナーゼに対してスクリーニングを行うことができる。さらにこれらの化合物は、動物又は無脊椎動物系において、活性／効果を判定するために試験することができる。化合物は、キナーゼを望ましい程度まで活性化（アゴニスト）又は不活化（アンタゴニスト）するかどうか判定される。
【００６３】
さらに、本発明のタンパク質は、キナーゼタンパク質と、該キナーゼタンパク質と通常相互作用する分子、例えば、キナーゼタンパク質が通常相互作用する信号経路の基質又は含有成分（例えば別のキナーゼ）との間での相互作用を促進又は阻害する能力を持つ化合物をスクリーニングするのに用いることができる。このようなアッセイでは、一般的には、キナーゼタンパク質又はフラグメントがターゲット分子と相互作用するか、タンパク質とターゲットとの複合物を検出するか、又はタンパク質リン酸化、ｃＡＭＰ回転、アデニル酸シクラーゼ活性などの信号変換に関連する影響のような、キナーゼタンパク質とターゲットとの間の相互作用の生化学的結果を検出することができる条件で、キナーゼタンパク質と候補化合物が結合される工程が含まれる。
【００６４】
候補化合物としては、例えば、１）最終部がＩｇの融合ペプチド、及びランダムペプチドライブラリを含む可溶性ペプチド（例えば、Ｌａｍｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３５４：８２−８４（１９９１）；Ｈｏｕｇｈｔｅｎｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３５４：８４−８６（１９９１）参照）、及びＤ−及び／又はＬ−型アミノ酸の組み合わせからできている科学誘導分子ライブラリを含むペプチド、２）ホスホペプチド（例えば、ランダム、又は部分的に変質したホスホペプチドライブラリ。例えば、Ｓｏｎｇｙａｎｇｅｔａｌ．，Ｃｅｌｌ７２：７６７−７７８（１９９３）参照）、３）抗体（例えば、ポリクローナル抗体、モノクローン抗体、ヒト化抗体、抗イディオタイプ抗体、キメラ抗体、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ発現ライブラリフラグメントを含む単鎖抗体、及び抗体のエピトープ結合フラグメントを含む単鎖抗体、及び抗体のエピトープ結合フラグメント）、４）小さな有機及び無機分子、（例えば、組み合わせ及び天然生成物ライブラリから得られる分子）が含まれる。
【００６５】
ある候補化合物は、基質結合と競合する受容体の可溶性フラグメントである。他の候補化合物には、変異キナーゼ、又はキナーゼ機能に影響を及ぼす変異体を含む適切なフラグメントがあり、このため、基質との競合が起こる。したがって、例えば高い親和性を有するか、又はフラグメントが基質と結合し解離しないような、基質と競合するフラグメントが本発明に包含される。
【００６６】
本発明はさらに、キナーゼ活性を調整（刺激又は阻害）する化合物を同定するための、他のエンドポイントアッセイを含む。このアッセイは、一般的に、キナーゼ活性を示す信号変換経路における挙動のアッセイに関連している。このため、キナーゼタンパク質依存信号カスケードに対する応答が促進又は抑制するよう調整される、基質のリン酸化、タンパク質の活性化、遺伝子発現の変化についてのアッセイが行われる。
【００６７】
キナーゼにより媒介される、生物学的又は生化学的な機能は、何れもエンドポイントアッセイとして用いることができる。これらは、ここに記載されている全ての生化学的又は生化学的／生物学的挙動を含み、ここに引用される文献にはこれらのエンドポイントアッセイのターゲットが織り込まれており、また、他の機能については、当業者において公知であるか、又は図面、特に図２の情報を用いて、容易に確認することができる。特に、キナーゼを発現する又は組織の生化学的機能についてのアッセイを行うことができる。図１の実験データに示されるように、本発明のキナーゼ蛋白はヒトにおいては、眼（網膜芽細胞腫）と脳に発現している。特に、実質的なノーザンブロット解析により網膜芽細胞腫における発現、およびＰＣＲを用いた組織スクリーニングパネルにより脳における発現が示されている。
【００６８】
結合及び／又は活性化化合物はまた、アミノ末端細胞外ドメイン又はその一部、あるいは、異種ドメイン又はサブリジョンに弛緩され得る７つの膜内外セグメントの何れかの又は細胞内又は細胞外ループの何れか、及びカルボキシ末端細胞内ドメインのような膜内外ドメイン全体あるいはサブリジョン、又はその一部においてキメラキナーゼタンパク質を用いることによりスクリーニングを行うことができる。例えば、基質結合領域は、異なる基質と相互作用するものとして用いられることができ、さらに天然のキナーゼによって認識されるものとして同定されうる。同様に、異なるセットの信号変換成分を活性化のエンドポイントアッセイとして利用することができる。このような方法により、キナーゼが由来する特定の宿主細胞以外でアッセイを行うことが可能となる。
【００６９】
本発明のタンパク質はまた、キナーゼと相互作用する化合物（例えば、結合相手及び／又はリガンド）を発見するため利用される方法である、競争結合アッセイにも有用である。このために、化合物がポリペプチドと結合又は相互作用できる条件下で、化合物をキナーゼポリペプチドと接触させる。可溶性キナーゼポリペプチドもまた混合物中に加えられる。テスト化合物が可溶性キナーゼポリペプチドと相互作用する場合、キナーゼターゲットから形成される複合体の量、又は活性は減少する。このタイプのアッセイは特にキナーゼの特定領域と相互作用する化合物を検索する場合に有用である。したがって、標的のキナーゼ領域と競合する可溶性ポリペプチドは、対象となる領域に対応したペプチド配列を含むように設計されている。
【００７０】
無細胞系薬剤のスクリーニングアッセイを行うためには、タンパク質の一方又は両方の非複合化形態からの複合化形態の分離を効率化し、アッセイを自動化するために、キナーゼタンパク質又はフラグメント、そのターゲット分子の何れかを固定化するのが望ましい場合がある。
【００７１】
薬剤スクリーニングアッセイにおいては、マトリックスにタンパク質を固定化する技術を使用することができる。ある例では、融合タンパク質はタンパク質をマトリックスに結合することのできるドメインを付加することができる。例えばグルタチオンＳトランスフェラーゼ融合タンパク質は、グルタチオンセファロースビーズ（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａ１，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍ０）又はグルタチオン誘導マイクロタイタープレート上に吸着され、細胞溶解物（例えば、^３５Ｓ標識）と候補化合物とが結合され、複合体形成条件（例えば、塩及びＰＨの生理学的条件）の下で混合物が培養される。培養の後、非結合ラベルの除去のためにビーズは洗浄され、マトリックスを固相化して、放射性ラベルを直接、又は複合体を分離した後の上澄みを測定することにより定量される。あるいは、複合体はＳＤＳ−ＰＡＧＥによりマトリックスから分離することができ、標準の電気泳動技術を用いることによって、ゲルからビーズフラクション中のキナーゼ結合タンパク質のレベルを定量することができる。例えば、ポリペプチド又はそのターゲット分子は、当業者に周知の技術を利用して、ビオチン及びストレプトアビジンの結合を用いて固定化される。あるいは、タンパク質と反応し、タンパク質とターゲット分子との結合を妨げない抗体は、プレートのウェルに誘導化されこのタンパク質は抗体との結合によりそのウェルの中に捕らえられる。キナーゼ結合タンパク質の組成物と候補化合物は、キナーゼタンパク質存在ウェル中で培養され、ウェルに捕らえられた複合体の量を測定する。このような複合体を検出する方法としては、ＧＳＴ固定複合体による前述の方法に加えて、キナーゼタンパク質ターゲット分子に反応性のある抗体、又は、キナーゼタンパク質に反応性がありターゲット分子と競合する抗体を用いた複合体の免疫検出怯、及びターゲット分子と関連する酵素活性の検出に基づく酵素結合アッセイが含まれる。
【００７２】
本発明のキナーゼのうちの１つに介在する薬剤は、上述の分析方怯を単独あるいは組み合わせて用いることにより同定することができる。一般的には、最初に細胞ベース又は無細胞系のシステムを用いて、動物又は他のモデルシステムにおける活性を確認することが好ましい。このようなモデルシステムは、当業者に周知であり、本記載において容易に用いることができる。
【００７３】
これらの薬剤スクリーニングアッセイによって同定されるキナーゼタンパク質活性のモジュレータは、キナーゼを発現する細胞又は組織を処置することにより、キナーゼ経路により媒介される疾患を患う患者の治療に用いることができる。図１の実験データによると、ヒトにおいては、眼（網膜芽細胞腫）と脳において発現が示されている。これらの治療方法には、薬剤組成物中のキナーゼ活性のモジュレータを患者の治療に必要な量投与する工程が含まれており、このモジュレータはここに記載されるようにして同定される。
【００７４】
本発明は、他の観点では、キナーゼと結合又は相互作用する、又はキナーゼ活性に関連している他のタンパク質を同定するために、２−ハイブリッドアッセイ又は３−ハイブリッドアッセイ（Ｕ．Ｓ．ＰａｔｅｎｔＮｏ．５，２８３，３１７；Ｚｅｒｖｏｓｅｔａｌ．（１９９３）Ｃｅｌｌ７２：２２３−２３２；Ｍａｄｕｒａｅｔａｌ．（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１２０４６−１２０５４；Ｂａｒｔｅｌｅｔａｌ．（１９９３）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ１４：９２０−９２４；Ｉｗａｂｕｃｈｉｅｔａｌ．（１９９３）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ８：１６９３−１６９６；ａｎｄＢｒｅｎｔＷＯ９４／１０３００参照）においてキナーゼタンパク質を「ｂａｉｔタンパク質」として使用することができる。このようなキナーゼ結合タンパク質は、例えば、キナーゼ媒介信号伝達経路の下流因子としてのキナーゼタンパク質、又はキナーゼターゲットによる信号伝達に関与している。あるいは、このようなキナーゼ結合タンパク質は、キナーゼ阻害剤である可能性も考えられる。
【００７５】
２−ハイブリッドシステムは、分離可能なＤＮＡ結合ドメイン及び活性化ドメインから成る、大部分の転写因子のモジュラー性に基づいている。簡単に言うと、このアッセイでは２つの異なるＤＮＡ構造を利用する。一方の構造においては、キナーゼタンパク質をコードしている遺伝子は、既知の転写調節因子（例えばＧＡＬ４）のＤＮＡ結合ドメインをコード化している遺伝子に融合される。他方の構造においては、ＤＮＡ配列ライブラリから得られ、未知のタンパク質（「ｐｒａｙ」又は「ｓａｍｐｌｅ」）をコード化しているＤＮＡ配列が既知の転写調節因子の活性化ドメインをコード化している遺伝子に融合される。「ｂａｉｔタンパク質」及び「ｐｒａｙタンパク質」が生体内で相互作用することができ、キナーゼ依存複合体を形成する場合、転写調節因子のＤＮＡ結合ドメイン及び活性化ドメインは近接する。この近接により、転写調節因子に反応する転写調節部位に結合可能なリポーター遺伝子（例えばＬａｃＺ）の転写を行うことができる。リポーター遺伝子の発現は検出することが可能であり、機能的転写調節因子を含んでいる細胞コロニーを単離及び使用して、キナーゼタンパク質と相互作用するタンパク質をコード化するクローン遺伝子を得ることができる。
【００７６】
本発明はさらに、前述のスクリーニングアッセイによって同定される新規な薬剤にも関係する。したがって、ここに記載されるようにして同定された薬剤を適当な動物のモデルに使用することも本発明の範囲内である。例えば、本発明で同定された薬剤（例えばキナーゼ媒介薬剤、アンチセンスキナーゼ核酸分子、キナーゼ特異抗体、又はキナーゼ結合パートナー）は、これらの薬剤の処方における有効性、毒性、副作用を判定するために、動物、又は他のモデルで用いることができる。あるいは、本発明で同定された薬剤が、このような薬剤の作用のメカニズムを決定するために、動物又は他のモデルで使われることができる。さらに、本発明は、治療のための前記スクリーニングアッセイにより同定された新規な薬剤の使用に関する。
【００７７】
本発明のキナーゼタンパク質は、ペプチドにより媒介される疾患又は疾患体質の診断のためのターゲットを提供するのに有用である。したがって、本発明は、タンパク質（又はコード化したｍＲＮＡ）が、細胞、組織、又は生体中の存在、あるいはそのレベルを検出する方法を提供するものである。図１の実験データによると、ヒトにおいては、眼（網膜芽細胞腫）と脳において発現が示されている。方法としては、キナーゼタンパク質との相互作用能力を有する化合物と生物サンプルとを接触させるものが含まれ、この方法により相互作用が検出される。このようなアッセイは、シングル検出形態、又は抗体チップアレイのようなマルチ検出形態で提供される。
【００７８】
サンプル中のタンパク質を検出する１つの薬剤は、タンパク質に選択的に結合することのできる抗体である。生物サンプルには、被験者から単離されるか、又は被験者の内部に存在する組織、細胞、体液が含まれる。
【００７９】
本発明のペプチドは、ペプチド変異体を持つ患者、特に現存するタンパク質ファミリー以外のものとして知られる活性、及び症状において、タンパク質の活性、疾患又は疾患素質の診断に用いるためのターゲットを提供するものである。したがって、ペプチドは生物学的サンプルから単離されることができ、また、異常ペプチドを生じる遺伝子突然変異の存在についてアッセイを行うことができる。これは、アミノ酸置換、欠失、挿入、再配置（異常なスプライシング拳動の結果生じる）、及び不適当な翻訳後の修飾を含む。分析方法としては、変容電気泳動移動度、変容トリプシンペプチド消化、細胞ベース又は無細胞系アッセイによる変容キナーゼ活性、基質又は抗体の変容結合パターン、変容等電点、直接アミノ酸配列、及びタンパク質の変異の検出に有用な他の公知のアッセイ技術を含む。このようなアッセイは、シングルディテクション形態、又は抗体チップアレイのような、マルチディテクション形態で提供される。
【００８０】
ペプチドのｉｎｖｉｔｒｏ検出技術としては、酵素結合免疫吸着剤アッセイ（ＥＬＩＳＡｓ）ウェスタンブロット、抗体、又はタンパク質結合剤のような検出試薬を用いた免疫沈降、免疫蛍光検査法を含む。あるいは、ラベルされた抗ペプチド抗体、又は他のタイブの検出試薬を被験者に導入することにより、被験著のｉｎｖｉｖｏ検出を行うことができる。例えば、抗体は放射性マーカーをラベルすることができ、被験者中のこのマーカーの存在及び位置は、標準イメージング技術によって検出することができる。被験者において発現されたペプチドの対立変異体を検出する方法、及びサンブル中のペプチドのブラグメントを検出する方法は、特に有用である。
【００８１】
ペプチドはまた、薬理学分析においても有用である。薬理学では、薬剤の変化の傾向と、影響を受けたヒトの異常拳動に従って、薬剤に対しての応答における著しい遺伝的変異について臨床的に取り扱う。例えば、Ｅｉｃｈｅｌｂａｕｍ，Ｍ．（Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２３（１０−１１）：９８３−９８５（１９９６）），ａｎｄＬｉｎｄｅｒ，Ｍ．Ｗ．（Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４３（２）：２５４−２６６（１９９７））参照。これらの変異の臨床的な結果、個人の代謝変異の結果として、ある個人に対しては治療薬剤が重い毒性となり、又はある個人に対しては治療の失敗に終わる。このように、個人の遺伝子型は、体内で治療化合物を作用させる方法、又は体が化合物を代謝する方法を決定することができる。さらに、酵素を代謝させる薬剤の活性は、薬剤の作用の強度と期間に影響する。このように、個人の薬理学は、個人の遺伝子型に基づいた予防、又は治療的な処置において、効果的な化合物、又はこのような化合物の効果的な投与量の選択を可能とする。遺伝子多形性の発見により、酵素代謝性の薬剤において、患者が期待される薬効を得られない、不自然な薬効を示す、又は標準の投薬量から重大な毒性を被るといったことの理由を説明することができる。多形性は、強い代謝系の表現型と弱い代謝形の表現型で表されることができる。したがって、遺伝子の多形性は、ある集団のキナーゼ機能の１つ以上が他の集団のそれと異なるような、キナーゼタンパク質の対立タンパク質変異に至るかもしれない。このように、ペプチドは治療法に影響する遺伝子の素因を確認するためのターゲットとなり得る。このため、リガンドベースの治療において、多形性は末端アミノ基の細胞外ドメイン及び／又は他の基質結合領域における基質結合活性及びキナーゼ活性が、より高い、又はより低いことを引き起こし得る。したがって、多形性を含む集団においては、治療効果を最大にするように、基質投薬量は必然的に修正される。遺伝子型に代わるものとしては、特定の多形性のペプチドを同定することができる。
【００８２】
ペプチドはまた、タンパクの発現がない、発現が不適当、又は発現が不必要であることによって特徴づけられる障害を治療することに有用である。図１の実験データによると、ヒトにおいては、眼（網膜芽細胞腫）と脳において発現が示されている。したがって、処置方法としては、キナーゼタンパク質又はフラグメントの使用を含むものである。
【００８３】
抗体
本発明は、本発明のペプチド、このようなペプチドを含むタンパク質、それらの変異体及びフラグメントの１つに選択的に結合する抗体を提供するものである。ここで用いられているように、抗体がターゲットペプチドと結合し、無関係なタンパク質と強く結合しないような場合、抗体は選択的にターゲットペプチドと結合している。ターゲットペプチドと実質的に相同性の無い他のタンパク質と結合していても、そのぺプチドが抗体のターゲットとなるペプチドに対してフラグメント又はドメインにおける相同性を有している限り、抗体は選択的にペプチドを結びつけると考えられる。この場合、ペプチドに結合している抗体は、ある程度の交差反応性を持つにも関わらず、選択的であると理解される。
【００８４】
ここで用いられるように、抗体は当該分野で認められているものと同じ用語で定義され、これらは、哺乳類生体により生成され、抗原の攻撃に対して応答するマルチサブユニットタンパク質である。本発明の抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、及びこれらの抗体のフラグメントを含み、また、Ｆａｂ又はＦ（ａｂ’）２、及びＦｖを含むが、これに限定されるものではない。
【００８５】
ターゲットペプチドを得るための、抗体の生成及び／又は同定について、多くの方法が知られている。このような方法のいくつかは、Ｈａｒｌｏｗ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＰｒｅｓｓ，（１９８９）に記載されている。
【００８６】
一般に、抗体を生成するためには、単離ペプチドを免疫原として用い、例えばネズミ、ウサギ又はマウスのような哺乳類生体に投与される。全長タンパク質、抗原性ペプチドブラグメント又は融合タンパク質が用いられる。特に重要なフラグメントは、図２に示されるような、機能性ドメインをカバーするものであり、また、タンパク質配置方法を使用して容易に確認することができ、図に示されているようなファミリーと配列相同性又は相違性を持つドメインである。
【００８７】
抗体は、キナーゼタンパク質の領域、又は単離されたフラグメントから好適に調製される。抗体は、ここで述べられているように、ペプチドのどんな領域からでも調製することができる。しかしながら、好適な領域には、機能／活性及び／又はキナーゼ結合対象相互作用に関係している領域が含まれる。図２は特に重要な領域を特定するのに用いることができ、この時、配列配置は保持されたユニークな配列フラグメントを特定するのに用いることができる。
【００８８】
抗原性フラグメントは、一般的に、少なくとも８つの憐接するアミノ酸残基から成っている。抗原性ペプチドは、少なくとも１０、１２、１４、１６以上のアミノ酸残基から成ることができる。このようなフラグメントは、例えば、タンパク質の表面上に位置する領域、例えば、親水性の領域に対応するフラグメントのような物理的な性質、あるいは配列の特異性（図２参照）に基づいて選択することができる。
【００８９】
本発明の抗体の検出は、検出可能物質と抗体とのカップリング（すなわち、物理的な結合）によって容易にすることができる。検出可能物質の例としては、例えば、種々の酵素、補欠分子族、蛍光性物質、発光性物質、生物発光性物質、及び放射性物質が含まれる。好適な酵素の例としては、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、βガラクトシダーゼ、又はアセチルコリンエステラーゼを含み、好適な補欠分子族の例としては、ストレプトアピジン／ビオチン、アビジン／ビオチンを含み、好適な蛍光性物質の例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセイン・イソチオシアン酸塩、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロライド、又はフィコエリトリンを含み、発光性物質の例としては、ルミノールを含み、生物発光性物質の例としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、及びエクオリンを含み、そして、適切な放射性物質の例として、は^１２５Ｉ、^１３１Ｉ、^３５Ｓ、又は^３Ｈを含む。
【００９０】
抗体の使用
抗体は、本発明のタンパク質の１つを、アフィニティクロマトグラフィ、又は免疫沈降のような標準の技術によって単離するために用いることができる。抗体は、細胞からの自然タンパク質、及び宿主細胞に表現される組換えによって生産されたタンパク質の精製を容易にすることができる。さらに、このような抗体は組織や生体内のタンパク質の発現パターンを決定するため、細胞や組織内における本発明のタンパク質の存在の検出に、通常の開発段階を経ずに用いることができる。図１の実験データに示されるように、本発明のキナーゼ蛋白はヒトにおいては、眼（網膜芽細胞腫）と脳に発現している。特に、実質的なノーザンブロット解析により網膜芽細胞腫における発現、およびＰＣＲを用いた組織スクリーニングパネルにより脳における発現が示されている。さらに、このような抗体は、発現の量及びパターンを評価することによって、ｉｎｓｉｔｕ、ｉｎｖｉｔｒｏ、細胞溶解物中、及び上澄み中でのタンパク質の検出に用いることができる。また、このような抗体は、生物学的状態の発展又は進行問における、異常な組織分布、又は異常な発現を評価するのに用いることができる。全長タンパク質の循環フラグメントにおける抗体探知は、回転率を同定するのに用いることができる。
【００９１】
さらに、抗体は、タンパク質に関連した疾患の活発な段階、又は該疾患素因を持つ個人といった、疾患の症状発現を評価するのに用いることができる。障害が不適当な組織分布、発展性の発現、タンパク質の発現レベル、又は発現／進行状態に起因する場合、抗体は通常のタンパク質に対して調製される。図１の実験データによると、ヒトにおいては、眼（網膜芽細胞腫）と脳において発現が示されている。障害がタンパク質の特定の変異により特徴づけられる場合、この変異タンパク質に特異的な抗体を、特定の変異タンパク質の存在のアッセイを行うために用いることができる。
【００９２】
抗体はまた、生体内の各種組織における、細胞の正常又は異常な細胞小器官の位置を評価するのに用いることができる。図１の実験データによると、ヒトにおいては、眼（網膜芽細胞腫）と脳において発現が示されている。診断としての使用は、遺伝子のテストだけでなく、治療法をモニターすることにも適用することができる。したがって、治療が最終的に、発現レベル、又は異常配列及び異常組織配布の存在、又は発展性の発現を修正することを目指すものである場合、タンパク質又は関連するフラグメントに直接的に対する抗体を、治療の有効性をモニターするのに用いることができる。
【００９３】
さらに、抗体は薬理学的な分析に有用である。このように、多形態のタンパク質に対して調製される抗体は、治療法の修正を必要とする個人を特定するために用いることができる。抗体は、また、電気泳動、等電点、トリプシンペプチド消化、当該分野において周知な他の物理的なアッセイによって分析される異常タンパク質の免疫学的なマーカーのような診断上のツールとしても有用である。
【００９４】
抗体はまた、組織型の分類にも有用である。図１の実験データによると、ヒトにおいては、眼（網膜芽細胞腫）と脳において発現が示されている。このように、特定のタンパク質が特定の組織中の発現と相関していた場合、このタンパク質に特異である抗体を、組織型を同定するために用いることができる。
【００９５】
抗体はまた、タンパク質機能を阻害するのに有用であり、例えば、基質のような結合相手へのキナーゼペプチドの結合をブロックする。これらの使用はタンパク質の機能阻害に関連する治療法における、治療環境において適用されることができる。抗体は、例えば、結合をブロックすることにより、ペプチド活性の変調（アゴナイズ又はアンタゴナイズ）を阻害することに用いることができる。抗体は、機能のために必要な部位を含む特定のフラグメントに対して、又は細胞又は細胞膜と関係している完全タンパク質に対して調製される。図２に、本発明のタンパク質に関する構造情報を示す。
【００９６】
本発明は、生物学的サンプル中のタンパク質の存在を検出するために抗体を用いたキットを包含する。キットには、ラベル化された、又はラベル化可能な抗体と、生物学的サンブル中でタンパク質を検出するための化合物又は試薬を含み、サンプル中のタンパク質量を決定する手段；標準サンプルのタンパク質量と比較する手段；及び使用の説明、とを含む。このようなキットは、単一のタンパク質、又はエピトープを検出するために提供されるか、又は抗体検出アレイのように、多数のエピトープのうちの１つを検出するように設定されることができる。アレイとしては、核酸アレイが後述され、また抗体アレイのための同様の方法も開発されている。
【００９７】
核酸分子
本発明は、さらに本発明のキナーゼペプチド又はタンパク質をコード化する核酸分子（ｃＤＮＡ、転写及びゲノム配列）を提供するものである。このような核酸分子は、本発明のキナーゼペプチドの１つをコード化する核酸分子、又はこれらの対立変異体、又はこれらのオルトログ又はパラログから成る、実質的に成る、又は含んでいる。
【００９８】
ここで用いられているように、「単離された」核酸分子は、核酸の天然起源における他の核酸の存在から分離されたものである。好ましくは、「単離」核酸はその核酸の由来となる生物のゲノムＤＮＡにおいて、核酸の側面に位置する配列（すなわち、５’、及び３’末端に位置する配列）は含まない。しかしながら例えば、約５ＫＢ、４ＫＢ、３ＫＢ、２ＫＢ又は特にｌＫＢ以上、またはこれ以下、特に配列によりコード化された隣接ペプチドのように、いくつか側面のヌクレオチド配列があるが、同一の遺伝子の配列によりコード化されたペプチドはゲノム配列中のイントロンにより分離されている。重要な点は、核酸が、ここに記載されているような特定の操作、例えば、組み換え発現、プローブやプライマ一の調製、核酸配列のための他の使用等に取り扱うことができるように、遠くの重要でない側面の配列から分離されているということである。
【００９９】
さらに、例えば、転写／ｃＤＮＡ分子のような「単離」核酸分子は、他の細胞物質、組み換え技術により製造される場合には培地、また化学的に合成される場合には前駆体又は他の化学物質を、実質的に含まない。しかしながら、この核酸分子は、コード化又は調節する他の配列に融合されることができるが、これは単離されたものとして考えられる。
【０１００】
例えば、ベクターに含まれる組み換えＤＮＡ分子は、単離されたものとして考えられる。さらに、単離したＤＮＡ分子の例は、非相同的な宿主細胞、又は溶液中で精製（部分的又は実質的に）されたＤＮＡ分子中に保持される。単離されたＲＮＡ分子は、本発明の単離したＤＮＡ分子の、ｉｎｖｉｖｏ又はｉｎｖｉｔｒｏで転写されたＲＮＡを含む。本発明により単離された核酸分子としては、更に合成的に製造された分子を含む。
【０１０１】
したがって、本発明は、図１又は３（ＳＥＱＩＤＮＯ：１，転写産物配列、及びＳＥＱＩＤＮＯ：３，ゲノム配列）において示されるヌクレオチド配列から成る核酸分子、又は図２（ＳＥＱＩＤＮＯ：２）に示されるタンパク質をコード化する核酸分子を提供するものである。ヌクレオチド配列がこの核酸分子の完全なヌクレオチド配列であるとき、核酸分子はヌクレオチド配列から成る。
【０１０２】
本発明はさらに、図１又は３（ＳＥＱＩＤＮＯ：１，転写産物配列、及びＳＥＱＩＤＮＯ：３，ゲノム配列）において示されるヌクレオチド配列から実質的に成る核酸分子、又は図２（ＳＥＱＩＤＮＯ：２）に示されるタンパク質をコード化する核酸分子を提供するものである。最終的な核酸分子において、このようなヌクレオチド配列がごくわずかの付加アミノ残基とともに存在するとき、核酸分子はヌクレオチド配列から実質的に成る。
【０１０３】
本発明はさらに、図１又は３（ＳＥＱＩＤＮＯ：１，転写産物配列、及びＳＥＱＩＤＮＯ：３，ゲノム配列）において示されるヌクレオチド配列を含む核酸分子、又は図２（ＳＥＱＩＤＮＯ：２）に示されるタンパク質をコード化する核酸分子を提供するものである。核酸分子の最終的な核酸配列においての少なくとも一部がこの核酸配列である場合、核酸分子はヌクレオチド配列を含む。これによると、核酸分子は、そのヌクレオチド配列だけであるか又は付加的な核酸残基、例えば、自然に関する核酸配列、又は非相同的な核酸配列を有することもできる。このような核酸分子は、ごくわずかの付加的なヌクレオチドを有するか、又は数百又はそれ以上の付加的なヌクレオチドを含むこともできる。これらの種々のタイプの核酸分子を容易に生成／単離する方法について、以下に簡単に述べる。
【０１０４】
図１及び３に、コード、及び非コードの配列の両者が示される。本発明のソースである、ヒトゲノム配列（図３）、及びｃＤＮＡ／転写・配列（図１）のため、図中の核酸分子は、ゲノムイントロン配列、５’と３’の非コード配列、遺伝子調節領域、及び非コード遺伝子間配列を含む。一般に、図１と３の両方において記載されているこのような配列の特徴は、当該分野において公知の計算ツールを用いて容易に確認することができる。以下で議論されるように、いくつかの非コーディング部位、特にプロモーターのような遺伝子の調節因子は、例えば、非相同的な遺伝子発現の制御、遺伝子活性を変調する化合物同定のターゲット等の種々の目的にとって有用であり、また特に、本発明で提供されるゲノム配列のフラグメントとしてクレームされている。
【０１０５】
単離した核酸分子は、成熟したタンパク質と付加的アミノ末端あるいはカルボキシ未端アミノ基、又は成熟ペプチド内のアミノ基（例えば、成熟形態が１以上のペプチド鎖を有する場合）をコード化することができる。このような配列は、前駆体から成熟した形態へのタンパク質のプロセシングにおいて、タンパク質搬送の促進、タンパク質半減期の延長あるいは短縮、又はタンパク質のアッセイ又は製造の際の操作の効率化、又は他の事象における役割を果たし得る。一般に、ｉｎｓｉｔｕの場合、付加アミノ酸は細胞酵素によって成熟したタンパク質へとプロセシングされる。
【０１０６】
上述したように、単離した核酸分子は、単独でキナーゼペプチドをコード化している配列、成熟したペプチドをコード化している配列、そして、主、又は副配列（例えば、ｐｒｅ−ｐｒｏ、ｐｒｏ−ｐｒｏｔｅｉｎ配列）のような付加的なコード配列を含むが、これに限定されるものではなく、付加的なコード配列、プラス付加的な非コード配列、例えば、イントロンと非コード５’及び３’配列のような、転写されるものの翻訳はされずに、転写、ｍＲＮＡブロセシング（スプライシング及びポリアデニル化を含む）、リボソームの結合、及びｍＲＮＡの安定性の役割を果たすものを、含んでも含まなくても良い。加えて、核酸分子は、例えば、精製を容易にするようなコード化した配列のマーカーと融合されることもできる。
【０１０７】
単離した核酸分子は、ｍＲＮＡのようなＲＮＡの形態、又はクローニング、化学合成技術又はその組み合わせによって生成するｃＤＮＡ及びゲノムＤＮＡを含む、ＤＮＡの形態をとり得る。核酸、特にＤＮＡは、二重鎖、又は単鎖であり得る。単鎖の核酸は、コード鎖（センス鎖）、又は非コード鎖（アンチセンス鎖）であり得る。
【０１０８】
本発明はさらに、本発明のペプチドのフラグメントをコード化する核酸分子と同様に、上記したような本発明のキナーゼタンパク質の明らかな変異体をコード化する核酸分子を提供するものである。このような核酸分子は、対立変異体（同一位置）、パラログ（異なる位置）とオルトログ（異なる生体）のように自然に発生するか、又は組み換えＤＮＡ法あるいは化学合成によって生成され得る。このような非自然に発生する変異体は、核酸分子、細胞又は生体に適用される突然変異生成技術によって生成され得る。したがって、上述したように、変異体にはヌクレオチドの置換、欠失、倒置、挿入が含まれる。変異は、コード、非コード領域のどちらか、又は両方で起こることができる。変異は、保持及び非保持アミノ酸置換の両方で生じることができる。
【０１０９】
本発明はさらに、図１及び３に示される核酸分子の非コードのフラグメントを提供するものである。好適な非コードのフラグメントとしては、プロモーター配列、エンハンサ配列、遺伝子変調配列、遺伝子終結配列が含まれるが、これに限定されるものではない。このようなフラグメントは、非相同的な造伝子発現の制御、及び遺伝子変調薬の同定を行うためのスクリーニングの開発において有用であるプロモーターは、図３のゲノム配列における５’からＡＴＧ開始部位において容易に確認される。
【０１１０】
フラグメントは、１２又はそれ以上の隣接するヌクレオチド配列を含む。さらに、フラグメントは少なくとも３０、４０、５０、１００、２５０、又は５００のヌクレオチド長であり得る。フラグメントの長さは使用自的に基づく。例えばフラグメントは、ペプチドのエピトープ結果領域をコード化することができるか、又はＤＮＡプローブ及びＤＮＡプライマーとして有用である。このようなフラグメントは、オリゴヌクレオチドプローブを合成するための既知のヌクレオチド配列を用いて単離することができる。ラベル化されたプローブは、コード化領域と対応する核酸を単離するため、ｃＤＮＡライブラリ、ゲノムＤＮＡライブラリ、又はｍＲＮＡのスクリーニングに用いることができる。さらに、プライマーは、遺伝子の特定領域をクローンするためのＰＣＲ反応に用いることができる。
【０１１１】
一般的なプローブプライマーは、実質的に精製されたオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドペアを含む。オリゴヌクレオチドは、一般に、少なくとも１２、２０、２５、４０、５０又はそれ以上の連続的ヌクレオチドに、ストリンジェントな柔件下でハイブリダイズされたヌクレオチド配列領域を含む。
【０１１２】
オルトログ、ホモログ、及び対立変異体は、当該技術分野において周知の方法を用いて同定することができる。ペプチドの項で述べたように、これらの変異体は、ペプチドをコード化するヌクレオチド配列を含み、図面に示されるヌクレオチド配列、又はこの配列のフラグメントに対して、典型的には、６０〜７０％、７０〜８０％、８０〜９０％、より典型的には、少なくとも９０〜９５％以上の相同性を有するものである。このような核酸分子は、モディレートな条件からストリンジェントな条件の下で、図面に示されるヌクレオチド配列、又はこの配列のフラグメントに対してハイブリダイズが可能なものとして、容易に同定することができる。対立変異体は、コード化している遺伝子の遺伝子位置で、容易に決定されることができる。図３で提示されたデータに示されているように本発明の新規ヒトキナーゼ蛋白をコードする遺伝子は、ヒト第１７番染色体上に存在することが知られているパブリックＢＡＣＡＣ００５９４０上に位置している。
【０１１３】
図３には、本発明の新規ヒトキナーゼ蛋白をコードする遺伝子中に見いだされたＳＮＰについての情報を示す。ＳＮＰは、イントロン、及びＯＲＦの５’と３’領域において３４カ所の異なる塩基ポジションにおいて確認された。その中には、ポジション１６１３５における非同義性ｃＳＮＰと、制御／調整領域に影響を与える可能性があるＯＲＦの５’端の２つのＳＮＰ（ポジション２０８２と２７４８）が含まれる。Ｇ１６１３５ＡのＳＮＰにより生じるアミノ酸配列の変化は図３に示されており、ユニバーサル遺伝子コードと図２に参照として示してある蛋白配列により容易に確認することができる。
【０１１４】
ここで用いられるように、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」という用語は、互いにハイブリダイズして残存する、ペプチドをコード化しているヌクレオチド配列が、互いに少なくとも６０〜７０％の相同性を有する程度にハイブリダイズ、及び洗浄が行われる条件を意味している。この条件では、ハイブリダイズして残る配列が、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、又はそれ以上となる。このようなストリンジェントな条件は、当業者においては周知であり、ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９），６．３．１−６．３．６．に記載されている。ストリンジェントなハイブリダイズ条件の１つの例では、６Ｘ塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中、約４５℃でハイブリダイズし、その後、０．２ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、５０〜６５℃で洗浄する。モディレートな、低ストリンジェントのハイブリダイズ条件の例は、当業者において周知である。
【０１１５】
核酸分子の使用
本発明の核酸分子は、プローブ、プライマー、化学合成中間体、及び生物学アッセイにおいて有用である。核酸分子は、図２に示されているペプチドをコード化する全長ｃＤＮＡ及びゲノムクローンを単離するため、及び図２に示すペプチドと同一又は関連したペプチドを生成する変異体（対立遺伝子、オルトログ等）に対応するゲノムクローンを単離するために、メッセンジャーＲＮＡ、転写／ｃＤＮＡ、及びゲノムＤＮＡのハイブリダイゼーションプローブとして有用である。図３に示されるように、ＳＮＰは３４カ所の異なる塩基ポジションにおいて確認された。
【０１１６】
プローブは、図に示されている核酸分子の全長における、どんな配列とも対応することができる。したがって、それは５’非コード領域、コード領域、及び３’非コード領域から誘導することができる。しかしながら、すでに述べたように、フラグメントは、本発明以前に公開されたフラグメントを含まないものと見なされる。
【０１１７】
核酸分子はまた、核酸分子の何れかの領域を増幅するＰＣＲのプローブとしても有用であり、必要な長さ及び配列のアンチセンス分子の合成においても有用である。
【０１１８】
核酸分子はまた、組み換えベクターの製造にも有用である。このようなベクターとしては、ペプチド配列の一部、又は全部を表現する発現ベクターを含む。ベクターはまた、挿入ベクターも含み、これは他の核酸分子中に統合され、例えば細胞ゲノム中で、遺伝子及び／又は遺伝子生成物のｉｎｓｉｔｕ発現を変化させるために用いられる。例えば、内生コード配列では、１つ以上の特異的に導入された変異を含むコード領域の一部、又は全部との相同的な組み換えを経て置換され得る。
【０１１９】
核酸分子はまた、タンパク質の抗原部分を発現することにも有用である。
【０１２０】
核酸分子はまた、ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション法により、核酸分子の染色体の位置を決定するためのプローブとしても有用である。図３で提示されたデータに示されているように本発明の新規ヒトキナーゼ蛋白をコードする遺伝子は、ヒト第１７番染色体上に存在することが知られているパブリックＢＡＣＡＣ００５９４０上に位置している。
【０１２１】
核酸分子はまた、本発明の核酸分子の遺伝子調整領域を含むベクターの製造にも有用である。
【０１２２】
核酸分子はまた、ここに記載される核酸分子から生成されるｍＲＮＡの、一部又は全部と対応しているリボザイムの設計にも有用である。
【０１２３】
核酸分子はまた、ペプチドの一部又は全部を表現しているベクターの製造にも有用である。
【０１２４】
核酸分子はまた、核酸分子及びペプチドの一部又は全部を表現している宿主細胞の製造にも有用である。
【０１２５】
核酸分子はまた、核酸分子及びペプチドの一部又は全部を表現している遺伝子導入動物の製造にも有用である。
【０１２６】
核酸分子はまた、核酸発現の存在、レベル、形態、分布を決定するためのハイブリダイゼーションプローブとしても有用である。図１の実験データに示されるように、本発明のキナーゼ蛋白はヒトにおいては、眼（網膜芽細胞腫）と脳に発現している。特に、実質的なノーザンブロット解析により網膜芽細胞腫における発現、およびＰＣＲを用いた組織スクリーニングパネルにより脳における発現が示されている。したがって、このプローブは細胞、組織、及び臓器中での特定の核酸分子の存在、あるいは量を測定することに使用することができる。定量可能な核酸には、ＤＮＡとＲＮＡがある。したがって、ここで述べられるペプチドに対応するプローブは、与えられた細胞、組織、及び臓器における発現、及び／或いは遺伝子コピー数の評価に用いることができる。これらの使用は、正常値と比較して上昇、或いは低下しているキナーゼ蛋白の異常の診断に適当である。
【０１２７】
ｍＲＮＡを検出するｉｎｖｉｔｒｏの技術にはノーザンブロットハイブリダイゼーションとｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーションがある。ＤＮＡを検出するｉｎｖｉｔｒｏの技術にはサザンブロットハイブリダイゼーションとｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーションがある。
【０１２８】
プローブは、例えばｍＲＮＡやゲノムＤＮＡといったサンプル細胞中でキナーゼをコードしている核酸の量を測定したり、キナーゼ遺伝子が変異しているかを確認することにより、キナーゼ蛋白を発現している細胞、あるいは組織を同定する診断キットの一部として使用することができる。図１の実験データに示されるように、本発明のキナーゼ蛋白はヒトにおいては、眼（網膜芽細胞腫）と脳に発現している。特に、実質的なノーザンブロット解析により網膜芽細胞腫における発現、およびＰＣＲを用いた組織スクリーニングパネルにより脳における発現が示されている。
【０１２９】
核酸発現アッセイは、キナーゼの核酸発現を変化させる化合物を同定する薬剤スクリーニングに有用である。
【０１３０】
本発明は、キナーゼ遺伝子の核酸発現、特に、細胞及び組織においてキナーゼを媒介する生物学的、病理学的プロセスに関連した障害の治療に用いる化合物を同定する方法を提供するものである。図１の実験データによると、ヒトにおいては、眼（網膜芽細胞腫）と脳において発現が示されている。この方法は、典型的には、キナーゼ核酸の発現を変調する化合物の能力についてアッセイを行い、その後、不必要なキナーゼ核酸発現により特徴づけられる障害を治療するのに用いることができる化合物を同定する。このアッセイは、細胞ベース及び無細胞の系において行われることができる。細胞ベースのアッセイには、自然にキナーゼ核酸を表現している細胞、又は特定の核酸配列を表現するために設計された組み換え細胞を含む。
【０１３１】
キナーゼ核酸発現のアッセイは、例えばｍＲＮＡレベルのような核酸レベル、又は信号経路に関連する副次化合物の直接的なアッセイと関連している。さらに、キナーゼタンパク質信号経路における応答性を向上、又は低下させる遺伝子の発現についてもアッセイされる。この例として、これらの遺伝子の調整領域は、ルシフェラーゼのようなリポーター遺伝子に結合されることができる。
【０１３２】
したがって、キナーゼ遺伝子発現のモジュレータは、細胞と候補化合物と接触させ、ｍＲＮＡの発現を判定する方法により同定されることができる。候補化合物の存在下でのキナーゼｍＲＮＡの発現レベルは、候補化合物非存在下でのキナーゼｍＲＮＡの発現レベルと比較される。この比較に基づいて、候補化合物は核酸発現のモジュレータとして同定され、例えば、異常核酸発現により特徴付けられる障害の治療に用いることができる。候補化合物存在下でのｍＲＮＡの発現が、非存在下のものと比較して統計的に著しく大きい場合、候補化合物は核酸発現のスティミュレータとして同定される。候補化合物存在下でのｍＲＮＡの発現が、非存在下のものと比較して統計的に著しく小さい場合、候補化合物は核酸発現のインヒビターとして同定される。
【０１３３】
本発明はさらに、キナーゼを発現する細胞及び組織においてキナーゼ核酸発現を変調する遺伝子モジュレータとしての薬剤スクリーニングを経て同定された化合物を用い、これをターゲットとして用いる治療方法を提供するものである。図１の実験データに示されるように、本発明のキナーゼ蛋白はヒトにおいては、眼（網膜芽細胞腫）と脳に発現している。特に、実質的なノーザンブロット解析により網膜芽細胞腫における発現、およびＰＣＲを用いた組織スクリーニングパネルにより脳における発現が示されている。変調は、上方調整（例えば、活性化又はアゴニゼーション）、下方調整（抑制又はアンタゴニゼーション）の両者、又は核酸発現を含む。
【０１３４】
あるいは、薬剤又は小分子がタンパク質を発現している細胞又は組織中でキナーゼ発現を阻害するものである限りは、キナーゼ核酸発現のモジュレータは、ここに記載されるスクリーニングアッセイを用いて同定される薬剤又は小分子であり得る。図１の実験データによると、ヒトにおいては、眼（網膜芽細胞腫）と脳において発現が示されている。
【０１３５】
核酸分子はまた、臨床試験又は治療方法において、キナーゼ遺伝子の発現及び活性に対する変調化合物の効果をモニターするのに有用である。したがって、遺伝子発現パターンは、化合物、特に患者の耐性を向上させる化合物を用いた治療における、継続的効果のバロメータとなり得る。遺伝子発現パターンは、また、化合物に対する細胞の生理的反応を示すマーカーとなり得る。したがってこのようなモニタリングにより、化合物の投与量の増加、又は患者が耐性を示さない代替化合物の投与を行うことができる。同様に、核酸発現のレベルが望ましいレベルまで低下したならば、化合物の投与をこれに比例して減少することができる。
【０１３６】
核酸分子はまた、キナーゼ核酸発現の質的変化、特に疾患に至る質的変化の診断アッセイにも有用である、核酸分子は、ｍＲＮＡのようなキナーゼ遺伝子、及び遺伝子発現生成物における突然変異の検出に用いることができる。核酸分子は、キナーゼ遺伝子において自然発生した遺伝子突然変異を検出し、その変異を持つ被験者が変異により生じる障害の危険性を有しているかどうかを判定するためのハイブリダイゼーションプローブとして用いることができる。突然変異は、欠失、付加、又は遺伝子中の１以上のヌクレオチドの置換、倒置又は転移のような染色体の組み換え、異常メチル化パターンのようなゲノムＤＮＡの修飾、又は増幅のような遺伝子コピー数の変化を含む。障害に関連するキナーゼ遺伝子の変異体の検出は、疾患がキナーゼタンパク質の過剰発現、過小発現、変異発現の結果生じる場合に、活性又は感受性の診断ツールを提供するものである。
【０１３７】
キナーゼ遺伝子における突然変異をもたらしている個体は、種々の技術によって核酸レベルにおいて検出されることができる。図３には、本発明の新規ヒトキナーゼ蛋白をコードする遺伝子中に見いだされたＳＮＰについての情報を示す。ＳＮＰは、イントロン、及びＯＲＦの５’と３’領域において３４カ所の異なる塩基ポジションにおいて確認された。その中には、ポジション１６１３５における非同義性ｃＳＮＰと、制御／調整領域に影響を与える可能性があるＯＲＦの５’端の２つのＳＮＰ（ポジション２０８２と２７４８）が含まれる。Ｇ１６１３５ＡのＳＮＰにより生じるアミノ酸配列の変化は図３に示されており、ユニバーサル遺伝子コードと図２に参照として示してある蛋白配列により容易に確認することができる。図３で提示されたデータに示されているように本発明の新規ヒトキナーゼ蛋白をコードする遺伝子は、ヒト第１７番染色体上に存在することが知られているパブリックＢＡＣＡＣ００５９４０上に位置している。ゲノムＤＮＡは直接又は予めＰＣＲを用いて増幅した後で分析されることができる。ＲＮＡ又はｃＤＮＡも、同様にして用いることができる。ある使用においては、突然変異の検出は、例えば、アンカーＰＣＲ、ＲＡＣＥＰＣＲのような、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（例えばＵ．Ｓ．ＰａｔｅｎｔＮｏｓ．４，６８３，１９５ａｎｄ４，６８３，２０２参照）又は他のものとして、リゲーション違鎖反応（ＬＣＲ）（例えば、Ｌａｎｄｅｇｒａｎｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２４１：１０７７−１０８０（１９８８）；ａｎｄＮａｋａｚａｗａｅｔａｌ．，ＰＮＡＳ９１：３６０−３６４（１９９４）参照）において、プローブ／プライマーの使用に関連し、特に後者は遺伝子中の変異位置の同定に有用である（Ａｂｒａｖａｙａｅｔａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２３：６７５−６８２（１９９５）参照）。この方法には、患者から細胞サンプルを収集する工程と、サンプルの細胞から核酸（例えば、ゲノム、ｍＲＮＡ又はその両方）を単離する工程と、遺伝子（もし存在すれば）のハイブリダイズ及び増幅が起こりうる条件下で遺伝子に特異的にハイブリダイズさせた１以上のプライマーと、核酸とを接触させる工程と、増幅生成物の存在を検出するか、又は増幅生成物のサイズを検出し、コントロールサンプルの長さと比較する工程を含む。欠失及び挿入は、増幅生成物のサイズの変化を、正常な遺伝子型と比較することにより検出することができる。点突然変異は、増幅ＤＮＡと正常なＲＮＡ、又はアンチセンスのＤＮＡ配列とハイブリダイズすることによって確認することができる。
【０１３８】
あるいは、キナーゼ遺伝子の突然変異は、例えば、ゲル電気泳動により決定される制限酵素消化パターンの変更により、直接的に確認することができる。
【０１３９】
さらに、配列特定リボザイム（Ｕ．Ｓ．ＰａｔｅｎｔＮｏ．５，４９８，５３１）は、リボザイム開裂部位の成長又は滅少により、特定の変異の存在を評点することに用いることがてきる。完全に一致する配列は、ヌクレアーゼ開裂消化分析評価、又は融点の違いによって、不一致の配列から分離することができる。
【０１４０】
特定位置での配列変化は、ＲＮａｓｅ及びＳ１保護、又は化学開裂法のようなヌクレアーゼ保護アッセイによって評価することができる。さらに、変異体キナーゼ遺伝子と野生型遺伝子との配列の相違は、直接ＤＮＡ配列解析によって決定することができる。種々の自動化された配列解析手段は、診断アッセイ（Ｎａｅｖｅ，Ｃ．Ｗ．，（１９９５）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ１９：４４８）の実行において有用であり、これらには、マススペクトルによる配列解析（例えば、ＰＣＴＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＰｕｂｌｉｃａｔｉｏｎＮｏ．ＷＯ９４／１６１０１；Ｃｏｈｅｎｅｔａｌ．，Ａｄｖ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．３６：１２７−１６２（１９９６）；ａｎｄＧｒｉｆｆｉｎｅｔａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３８：１４７−１５９（１９９３）参照）も含まれる。
【０１４１】
遺伝子中の突然変異を検出する他の技術の例としては、ＲＮＡ／ＲＮＡ、又はＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖から、不一致の塩基を検出するために、開裂試薬から保護する方法（Ｍｙｅｒｓｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２３０：１２４２（１９８５））；Ｃｏｔｔｏｎｅｔａｌ．，ＰＮＡＳ８５：４３９７（１９８８）；Ｓａｌｅｅｂａｅｔａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：２８６−２９５（１９９２））、変異体と野生型の核酸の電気泳動移動度を比較する方法（Ｏｒｉｔａｅｔａｌ．，ＰＮＡＳ８６：２７６６（１９８９）；Ｃｏｔｔｏｎｅｔａｌ．，Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．２８５：１２５−１４４（１９９３）；ａｎｄＨａｙａｓｈｉｅｔａｌ．，Ｇｅｎｅｔ．Ａｎａｌ．Ｔｅｃｈ．Ａｐｐｌ．９：７３−７９（１９９２））、及び変性剤の勾配を含んだポリアクリルアミドゲル中での変異体又は野生型のフラグメントの動きを、勾配ゲル電気泳動を用いてアッセイする方法（Ｍｙｅｒｓｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３１３：４９５（１９８５））を含む。点突然変異を検出する他の技術の例としては、選択的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、選択的増幅、及び選択的プライマー伸長を含む。
【０１４２】
核酸分子は、治療方法としての効果を持つにも関わらず、必ずしも疾患を引き起こすわけではない遺伝子型のための、個人テストにおいても有用である。このため、核酸分子は、個人の遺伝子型と、治療に用いられる化合物に対する個人の応答との相関（薬理ゲノム相関）についての研究に用いることができる。したがって、ここに記載されている核酸分子は、治療のための適切な化合物及び投与量を選択することによって、個人のキナーゼ遺伝子の変異についての評価に用いることができる。図３には、本発明の新規ヒトキナーゼ蛋白をコードする遺伝子中に見いだされたＳＮＰについての情報を示す。ＳＮＰは、イントロン、及びＯＲＦの５’と３’領域において３４カ所の異なる塩基ポジションにおいて確認された。その中には、ポジション１６１３５における非同義性ｃＳＮＰと、制御／調整領域に影響を与える可能性があるＯＲＦの５’端の２つのＳＮＰ（ポジション２０８２と２７４８）が含まれる。Ｇ１６１３５ＡのＳＮＰにより生じるアミノ酸配列の変化は図３に示されており、ユニバーサル遺伝子コードと図２に参照として示してある蛋白配列により容易に確認することができる。
【０１４３】
このように、治療に影響する遺伝子変異を示す核酸分子は、個人におけるテイラー治療に用いることのできる診断ターゲットを提供するものである。したがって、これらの多形性を含んだ組み換え細胞及び組み換え動物の製造は、治療化合物及び薬剤投与についての効果的な臨床設計を可能とする。
【０１４４】
核酸分子は、細胞、組織、及び生体におけるキナーゼ遺伝子発現を制御するためのアンチセンス構成物として有用である。ＤＮＡアンチセンスの核酸分子は、転写に聞連する遺伝子の部位に対して相補的になるよう設計され、それ故に、キナーゼタンパク質の生産と転写が防がれる。アンチセンスのＲＮＡ又はＤＮＡ核酸分子はｍＲＮＡへとハイブリダイズされ、これによりキナーゼタンパク質中でのｍＲＮＡの翻訳がブロックされる。
【０１４５】
あるいは、アンチセンス分子は、キナーゼ核酸の発現を減少させるためのｍＲＮＡの不活性化に用いることができる。したがって、これらの分子は、異常、又は不必要なキナーゼ核酸の発現により特徴づけられる障害の治療に用いることができる。この技術は、ｍＲＮＡの翻訳能力を減少させるような、ｍＲＮＡの１以上の領域に相補的なヌクレオチド配列を含んだリボザイムによる開裂に関連している。可能な領域としては、コード領域、特に、基質結合のようなキナーゼタンパク質の触媒活性及び他の機能活性に対応したコード領域を含む。
【０１４６】
核酸分子はまた、キナーゼ遺伝子発現において異常な細胞を持つ患者の遺伝子治療のためのベクターを提供するものである。Ｅｘｖｉｖｏで調製され患者に戻される細胞を含む、組み換え細胞は、個人の体内に導入されて、そこで個人の治療のために必要とされるキナーゼタンパク質を生産する。
【０１４７】
本発明は、生物学的サンブル中のキナーゼ核酸の存在を検出するために抗体を用いたキットも包含する。図１の実験データに示されるように、本発明のキナーゼ蛋白はヒトにおいては、眼（網膜芽細胞腫）と脳に発現している。特に、実質的なノーザンブロット解析により網膜芽細胞腫における発現、およびＰＣＲを用いた組織スクリーニングパネルにより脳における発現が示されている。例えば、キットは、ラベル化された、又はラベル化可能な核酸、又は生物学的サンプル中でキナーゼ核酸を検出することのできる試薬を含み、；サンプル中のキナーゼ核酸量を決定する手段；標準サンプルのキナーゼ核酸量と比較する手段とを含むことができる。この化合物又は試薬は適当な容器に封入することができる。このキットは、さらにキナーゼプロテインｍＲＮＡ又はＤＮＡの検出キットとして使用するための説明を含むことができる。
【０１４８】
核酸アレイ
本発明はさらに、核酸検出キットを提供するものであり、これらは、例えば、図１及び３（ＳＥＱＩＤＮＯ．１，３）に示される配列情報に基づいた核酸分子のアレイ又はマイクロアレイである。
【０１４９】
ここで用いられている、「アレイ」又は「マイクロアレイ」は、紙、ナイロン又は他の膜、フィルタ、チップ、ガラススライド、又は他の適当な固形支持体のような、基板の上で合成された別個のポリヌクレオチド、又はオリゴヌクレオチドのアレイのことである。１つの例として、マイクロアレイは、ＵＳＰａｔｅｎｔ５，８３７，８３２，Ｃｈｅｅｅｔａｌ．，ＰＣＴａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎＷ０９５／１１９９５（Ｃｈｅｅｅｔａｌ．），Ｌｏｃｋｈａｒｔ，Ｄ．Ｊ．ｅｔａｌ．（１９９６；Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１４：１６７５−１６８０）ａｎｄＳｃｈｅｎａ，Ｍ．ｅｔａｌ．（１９９６；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９３：１０６１４−１０６１９）に記載される方法にしたがって調製、使用され、これらの全ては参考としてここに折り込まれる。あるいは、このようなアレイは、Ｂｒｏｗｎｅｔａｌ．，ＵＳＰａｔｅｎｔＮｏ．５，８０７，５２２．に記載される方法により製造される。
【０１５０】
マイクロアレイ又は検出キットは、好適には、多数の特異的な単鎖の核酸配列を構成し、通常は合成アンチセンスのオリゴヌクレオチドか、又はｃＤＮＡのフラグメントのどちらかが固体支持体上に固定される。オリゴヌクレオチドは、好適には約６〜６０のヌクレオチド長さより好適には１５〜３０のヌクレオチド長、最も好適には２０〜２５のヌクレオチド長である。あるタイプのマイクロアレイ又は検出キットのためには、７〜２０のヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドのみを使うことが好適であり得る。マイクロアレイ又は検出キットは、既知の５’又は３’配列を含んだオリゴヌクレオチド、全長配列を含んだオリゴヌクレオチド、又は配列長さの特定領域から選択された特異なオリゴヌクレオチドを含むものであり得る。マイクロアレイ又は検出キットにおいて用いられるポリヌクレオチドは、遺伝子又は対象となる遺伝子において特異的なオリゴヌクレオチドであり得る。
【０１５１】
マイクロアレイ又は検出キットにおいて、既知の配列のオリゴヌクレオチドを製造するために、対象となる遺伝子（又は、本発明により確認されたＯＲＦ）は典型的にはコンピュータアルゴリズムを用いて、核酸配列の５’から開始、又は３’で終了する。典型的なアルゴリズムでは、遺伝子に特異的な長さに規定されたオリゴマーが同定され、ハイブリダイゼーションに好適な範囲にＧＣ成分を持ち、ハイブリダイゼーションの妨害となると予測される二次構造を持たない。ある条件では、マイクロアレイ又は検出キットにおいて、オリゴヌクレオチドのペアを用いることが好適であり得る。オリゴヌクレオチドの「ペア」は、好適には、配列の中央に位置する１つのヌクレオチドを除いて、同一である。２つ目のペアのオリゴヌクレオチド（一方とは不一致）はコントロールとして用いられる。オリゴヌクレオチドペアの数は、２から１００万の間である。オリゴマーは、光誘導化学プロセスを用いて、基盤上の指定領域で合成される。基盤は、紙、ナイロン又は他の膜、フィルタ、チップ、ガラススライド、又は他の適当な固形支持体である。
【０１５２】
他方、オリゴヌクレオチドは、ＰＣＴａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎＷ０９５／２５１１１６（Ｂａｌｄｅｓｃｈｗｅｉｌｅｒｅｔａｌ．）に記載されているように、化学カップリング手段、及びインクジェットアプリケーション装置を用いて基盤の表面上で合成され、これらの全ては参考としてここに折り込まれる。あるいは、「グリッドした」アレイではドット（又はスロット）ブロットとなるように、真空システム、加熱、ＵＶ、機械的又は化学的結合工程を用いて、ｃＤＮＡ、又はオリゴヌクレオチドを基板の表面上に結合させることができる。上記のようなアレイは、手工、又は利用可能な装置（スロットブロット、又はドットブロット装置）、材料（適当な固形支持体）、及び機械（ロボット装置を含む）を用いて製造され、また、８、２４、９６、３８４、１５３６、６１４４又はこれ以上、又は商業的に用いられる装置に効果的に使用される２から１００万の間の他の数のオリゴヌクレオチドを含んでもいても良い。
【０１５３】
マイクロアレイ又は検出キットを用いてサンプルの分析を行うために、生物サンプルから得られたＲＮＡ又はＤＮＡは、ハイブリダイゼーションプローブ中に調製される。ｍＲＮＡが単離され、そしてｃＤＮＡが調製され、アンチセンスのＲＮＡ（ａＲＮＡ）を調製するためのテンプレートとして用いられる。ａＲＮＡは蛍光性ヌクレオチドの存在化で増輻し、ラベル化されたプローブがマイクロアレイ又は検出キットと共に培養され、そして、プローブの配列がマイクロアレイ又は検出キット中の相補的なオリゴヌクレオチドとハイブリダイズされる。培養条件は、正碓に相補的に一致しているか、又は各種程度の相補性でハイブリダイゼーションが起こりうるように調節される。ハイブリダイズしていないプローブを除去した後、蛍光のレベルとパターンを判定するためにスキャナが用いられる。スキャンされたイメージは、マイクロアレイ又は検出キット上の、相補性の程度及び各々のオリゴヌクレオチド配列の相対的な量を決定するために試験される。生物学的サンプルは、体液（例えば血、尿、唾液、痰、胃液、その他）、培養細胞、生体組織検査、又は他の組織調製品から得られる。検出システムでは、全ての異なる配列において、ハイブリダイゼーションの存在、非存在、及び量を、同時に計測するのに用いられる。このデータは、サンプル中での、配列、発現パターン、変異、変異体、又は多形性といった、大規模な相関性の研究に用いられる。
【０１５４】
本発明は、このようなアレイを用いて、本発明のキナーゼタンパク質／ペプチドの発現を同定するための方法を提供するものである。詳細には、このような方法は、テストサンプルと一つ以上の核酸分子との培養とテストサンプル中の成分と核酸分子との結合についてのアッセイとを含む。このようなアッセイは、少なくとも遺伝子の一つが本発明の遺伝子及び／又は本発明のキナーゼ遺伝子の対立変異体である、多くの遺伝子を含むアレイに関連している。図３には、本発明の新規ヒトキナーゼ蛋白をコードする遺伝子中に見いだされたＳＮＰについての情報を示す。ＳＮＰは、イントロン、及びＯＲＦの５’と３’領域において３４カ所の異なる塩基ポジションにおいて確認された。その中には、ポジション１６１３５における非同義性ｃＳＮＰと、制御／調整領域に影響を与える可能性があるＯＲＦの５’端の２つのＳＮＰ（ポジション２０８２と２７４８）が含まれる。Ｇ１６１３５ＡのＳＮＰにより生じるアミノ酸配列の変化は図３に示されており、ユニバーサル遺伝子コードと図２に参照として示してある蛋白配列により容易に確認することができる。
【０１５５】
テストサンプルと核酸分子のインキュベーションの条件は変化する。インキュベーション条件は、使用されるアッセイの形式、使用される検出方法、及びアッセイに用いられる核酸分子のタイプ及び性質に依存する。一般的に利用可能なハイブリダイゼーション、増幅、又はアレイアッセイの形式を認識している当業者は、ここに記載されるヒトゲノムの新規フラグメントを用いるに当って、容易に適用を行うことができる。このようなアッセイの例は、Ｃｈａｒｄ，Ｔ，ＡｎＩｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎｔｏＲａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙａｎｄＲｅｌａｔｅｄＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ＥｌｓｅｖｉｅｒＳｃｉｅｎｃｅＰｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，ＴｈｅＮｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ（１９８６）；Ｂｕｌｌｏｃｋ，Ｇ．Ｒ．ｅｔａｌ．，ＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓｉｎＩｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，Ｏｒｌａｎｄｏ，ＦＬＶｏｌ．１（１９８２），Ｖｏｌ．２（１９８３），Ｖｏｌ．３（１９８５）；Ｔｉｊｓｓｅｎ，Ｐ．，ＰｒａｃｔｉｃｅａｎｄＴｈｅｏｒｙｏｆＥｎｚｙｍｅＩｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ：ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓｉｎＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ＥｌｓｅｖｉｅｒＳｃｉｅｎｃｅＰｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，ＴｈｅＮｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ（１９８５）に記載されている。
【０１５６】
本発明のテストサンプルは、細胞、タンパク質、細胞からの膜抽出物を含む。上記の方法に用いられるテストサンプルは、アッセイの形式、検出方法の性質、及びアッセイのサンプルとして用いられる組織、細胞、又はその抽出物に基づいて変化する。核酸抽出物又は細胞抽出物の調製は、当業者において周知であり、用いられるシステムと調和するサンプルを得ることにより、容易に適用することができる。
【０１５７】
本発明の他の例としては、本発明のアッセイを行うために必要な試薬を含むキットが提供される。
【０１５８】
特に、本発明は、（ａ）ここに記載されるヒトゲノムのフラグメントと結合することのできる１以上の核酸分子を含む第一の容器、（ｂ）１以上の洗浄試薬、結合核酸を検出することのできる試薬を含む他の１以上の容器、とを含む１以上の容器に区分され、封入されたキットを提供するものである。
【０１５９】
詳細には、区分されたキットには、試薬が別々の容器に含まれているキットを含む。このような容器としては、小さいガラスの容器、プラスチック容器、帯状のブラスチック、ガラス又は紙、又は二酸化ケイ素のようなアレイ材料を含む。このような容器は、サンプルと試薬が混合して汚染しないように、１つの区分から他の区分へと試薬を効率的に移動することができ、またそれぞれの容器の試薬又は溶液は他の容器へと定量的に添加することができる。このような容器には、テストサンプルを入れる容器、核酸プローブが含まれる容器、洗浄試薬（例えば、リン酸塩緩衝液、Ｔｒｉｓ−緩衝液等）を含む容器、及び結合プローブを検出に用いられる試薬を含む容器を含む。当業者は、本発明にかかる従来未知のキナーゼ遺伝子を認識し、ここに開示されている配列情報を用いて定型的に確認することができ、さらにこれを当業者において周知の確立されたキット形態、特に発現アレイに組み込んで用いることができる。
【０１６０】
ベクター／宿主細胞
本発明は、またここに記載される核酸分子を含んだベクターを提供するものである。「ベクター」という用語は、ビヒクルのことを言い、好適には核酸分子であり、核酸分子の輸送をすることができるものである。ベクターが核酸分子である場合、核酸分子はベクターの核酸と共有結合している。本発明のこの観点ではベクターはプラスミド、単鎖又は二重鎖のファージ、単鎖又は二重鎖のウイルス性ベクター、又はＢＡＣ、ＰＡＣ、ＹＡＣ、ＯＲＭＡＣのような人工染色体を含む。
【０１６１】
ベクターは宿主細胞中に染色体外の成分として保持され、そこで核酸分子の付加的なコピーを複製及び生成する。あるいは、ベクターは宿主細胞のゲノム中に組み込まれ、宿主細胞の複製の際に核酸分子の付加的なコピーを生成する。
【０１６２】
本発明は、核酸分子の補修のためのベクター（クローニングベクター）、又は核酸分子の発現のためのベクター（発現ベクター）を提供するものである。このベクターは、原核生物細胞又は真核生物細胞、又はその両方で機能することができる（シヤトルベクター）。
【０１６３】
発現ベクターは、ベクター中で核酸分子と結合可能なｃｉｓ作用性調節領域を含み、これにより宿主細胞中での核酸分子の転写が可能となる。この核酸分子は転写に影響を及ぼす核酸分子と分けられて、宿主細胞に導入されることができる。したがって、第二の核酸分子は、ベクターからの核酸分子の転写を行うｃｉｓ調節制御領域と相互作用するトランス作用性因子を提供するものである。あるいは、トランス作用性因子は宿主細胞により提供される。最終的に、トランス作用性因子は、ベクター自身から作り出すことができる。しかし、いくつかの例では、核酸分子の転写及び／又は翻訳は無細胞系でも起こり得る。
【０１６４】
ここに記載される核酸分子の調節配列は、目的のｍＲＮＡ転写のためのプロモーターを含んで結合されることができる。これらには、パクテリオファージλからの左部プロモーター、Ｅ．ｃｏｌｉから得られたｌａｃ、ＴＲＰ及びＴＡＣプロモーター、ＳＶ４０から得られた初期及び後期のプロモーター、ＣＭＶの極初期のプロモーター、アデノウイルスの初期及び後期のプロモーター、及びレトロウイルスのＬＴＲが含まれるが、これに限定されるものではない。
【０１６５】
転写を促進する制御領域に加えて、発現ベクターはまた、リプレッサー結合部位やエンハンサのような転写を調整する領域を含むものであり得る。この例としては、ＳＶ４０エンハンサ、サイトメガロウイルスの極初期のエンハンサ、ポリオーマエンハンサ、アデノウイルスエンハンサー、レトロウイルスＬＴＲエンハンサが含まれる。
【０１６６】
転写の開始及び制御領域を含む場合に加えて、発現ベクターはまた、転写のためのリボソーム結合部位である転写領域における、転写終了のために必要な配列を含むことができる。他の発現調整制御成分としては、ポリアデニル化信号と同様に、開始及び終止コドンが含まれる。当業者は、発現ベクターに有用な多数の調整配列を知り得る。このような調整配列は、例えば、ｉｎＳａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ．２ｎｄ．ｅｄ．，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，ＮＹ，（１９８９）に記載されている。
【０１６７】
各種発現ベクターは、核酸分子の発現に用いることができる。このようなベクターには、染色体、エピソーム、ウイルス由来のベクターが含まれ、これらは例えば、バクテリアプラスミド、バクテリオファージ、酵母エピソーム、人工酵母染色体のような酵母染色体成分、バキュロウイルス、ＳＶ４０のようなパボパウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、ポックスウイルス、シュードラビスウイルス、及びレトロウイルスのようなウイルス由来のベクターである。ベクタ一はまた、これらの起源の組み合わせから誘導することができ、例えば、コスミドとファージミドのようなプラスミドとバクテリオファージの遺伝子成分から誘導することができる。原核及び真核生物の宿主細胞のための適切なクローニングベクター及び発現ベクターは、Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ．２ｎｄ．ｅｄ．，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，ＮＹ，（１９８９）に記載されている。
【０１６８】
調整配列では、１以上の宿主細胞の構成としての発現（すなわち組織特異性）又は、温度、養分添加、又はホルモンや他のリガンドのような外生の要因による１以上の細胞タイプでの指示的な発現を提供するものである。原核及び真核生物の宿主細胞において構成的、及び指示的に発現する種々のベクターは、当業者において周知である。
【０１６９】
核酸分子は、周知の方法によってベクター核酸内に導入されることができる。通常、最終的に発現するＤＮＡ配列は、発現ベクターと１以上の制限酵素によりＤＮＡ配列とが開裂し、フラグメントが共に結さつすることによって、発現べクターと結合される。制限酵素の消化及び結さつの手順は、当業者において周知である。
【０１７０】
適切な核酸分子を含んでいるベクターは、公知の技術を用いて、増殖又は発現のために適切な宿主細胞内へ導入することができる。バクテリア細胞には、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、及びＳａｌｍｏｎｅｌｌａｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍが含まれるがこれに限定されるものではない。真核生物細胞には、酵母、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａのような昆虫細胞、ＣＯＳ及びＣＨＯ細胞のような動物細胞、及び植物細胞が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０１７１】
ここに記載されているように、融合タンパク質としてのペプチドの発現が好適である。したがって、本発明はペプチドの生産が可能な融合ベクターを提供するものである。融合ベクターは組み換えタンパク質の発現及び溶解性を向上することができ、また、例えば、アフィニティー精製のためのリガンドの作用によってタンパク質精製を促進することができる。タンパク質分解性開裂部位は、融合部分との結合位置に導入され、このために、目的となるペプチドは最終的に融合部分から分離される。タンパク質分解酵素としては、ファクターＸａ、スロンビン、エンテロキナーゼを含むが、これに限定されるものではない。典型的な融合発現ベクターとしては、グルタチオンＳ転移酵素（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合蛋白質、又は蛋白質Ａのそれぞれをターゲット組み換え蛋白質に融合した、ｐＧＥＸ（Ｓｍｉｔｈｅｔａｌ．，Ｇｅｎｅ６７：３１−４０（１９８８）），ｐＭＡＬ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）ａｎｄｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を含むが、これに限定されるものではない。好適な指示的非融合Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターの例としては、ｐＴｒｃ（Ａｍａｎｎｅｔａｌ．，Ｇｅｎｅ６９：３０１−３１５（１９８８））ａｎｄｐＥＴ１１ｄ（Ｓｔｕｄｉｅｒｅｔａｌ．，ＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ１８５：６０−８９（１９９０））を含む。
【０１７２】
組み換えタンパク質の発現は、宿主細胞において、組み換えタンパク質のタンパク質分解性の開裂欠損能カを持つ遺伝子の背景を提供することによって宿主バクテリアにおいて最大化することができる（Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ，Ｓ．，ＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ１８５，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ（１９９０）１１９−１２８）。あるいは、対象となる核酸分子の配列は、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのような特定の宿主細胞のために優先的に使用されるコドンとなるように変更されることができる（Ｗａｄａｅｔａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２０：２１１１−２１１８（１９９２））。
【０１７３】
核酸分子はまた、酵母において作用する発現ベクターにより発現されることもできる。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのような酵母中で発現するベクターの例としては、ｐＹｅｐＳｅｃ１（Ｂａｌｄａｒｉ，ｅｔａｌ．，ＥＭＢＯＪ．６：２２９−２３４（１９８７）），ｐＭＦａ（Ｋｕｒｊａｎｅｔａｌ．，Ｃｅｌｌ３０：９３３−９４３（１９８２）），ｐＪＲＹ８８（Ｓｃｈｕｌｔｚｅｔａｌ．，Ｇｅｎｅ５４：１１３−１２３（１９８７）），ａｎｄｐＹＥＳ２（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）を含む。
【０１７４】
核酸分子はまた、例えば、バキュロウイルス発現ベクターを用いて、昆虫細胞内で表現されることもできる。培養昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９細胞）中のタンパク質の発現に利用されるベクターは、ｐＡｃシリーズ（Ｓｍｉｔｈｅｔａｌ．，Ｍｏｌ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．３：２１５６−２１６５（１９８３））ａｎｄｔｈｅｐＶＬシリーズ（Ｌｕｃｋｌｏｗｅｔａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ１７０：３１−３９（１９８９））を含む。
【０１７５】
本発明のある実施例においては、ここに記載されている核酸分子は、哺乳類発現ベクターを用いて哺乳類の細胞内で表現される。哺乳類発現ベクターの例としては、ｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ，Ｂ．Ｎａｔｕｒｅ３２９：８４０（１９８７））ａｎｄｐＭＴ２ＰＣ（Ｋａｕｆｍａｎｅｔａｌ．，ＥＭＢＯＪ．６：１８７−１９５（１９８７））を含む。
【０１７６】
ここに列記されている発現ベクターとしては、核酸分子を表現するために有用であり、当業者が利用可能なベクターとして周知のもののみが示されている。ここに記載されている核酸分子の維持増殖、又は発現において、好適な他のベクターは、当業者において周知である。これらは、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｈ，Ｅ．Ｆ．，ａｎｄＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ．２ｎｄ，ｅｄ．，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９に記載されている。
【０１７７】
ここに記載されている核酸配列がベクター中に逆方向にクローンされたベクターは、アンチセンスＲＮＡの転写を許す調節配列に結合可能であるが、本発明はまた、このようなベクターも包含するものである。このように、アンチセンス転写は、コード、非コード領域の両方が含まれている、ここに記載されている核酸分子配列の、全部又は一部を生産することができる。そして、このアンチセンスのＲＮＡの発現は、センスＲＮＡの発現（調整配列、構成的、又は指示的発現、組織特異発現）に関して、前記した各パラメータに対応する。
【０１７８】
本発明はまた、ここに記載されるベクターを含む組み換え宿主細胞に関連するものである。宿主細胞は、したがって、原核生物細胞、酵母のような低真核生物細胞、昆虫細胞のような他の真核生物細胞、及び哺乳類の細胞のような高真核生物細胞を含む。
【０１７９】
組み換え宿主細胞は、当業者が容易に利用することのできる技術により、ここに記載されるように構成されるベクターを細胞中に導入することにより、調製することができる。これらには、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥデキストラン媒介トランスフェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、トランスダクション、インフェクション、リポフェクション、及びＳａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔａｌ．（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ．２ｎｄ，ｅｄ．，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９）に記載されているような他の技術が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０１８０】
宿主細胞は、１以上のベクターを含むことができる。このため、異なるヌクレオチド配列が、同じ細胞の異なるベクター中に導入されることができる。同様に、核酸分子は、単独で、又は発現ベクターのトランス作用因子を提供しているような、関連のない他の核酸分子と共に導入されることができる。１以上のベクターが細胞内に導入される場合、ベクターは単独で導入されるか、共に導入されるか、又は核酸分子ベクターに結合されることができる。
【０１８１】
バクテリオファージ及びウイルスベクターの場合、これらはインフェクション及びトランスダクションの標準的な操作により、封入又はカプセル化されたウイルスとして細胞内に導入されることができる。ウイルスベクターは、複製可能、又は複製欠陥であり得る。ウイルスの複製に欠陥がある場合、複製は欠陥を補完する機能が提供される宿主細胞内で起こり得る。
【０１８２】
ベクターは一般に、組み換えベクターの構成物を含む細胞の部分母集団の選択を可能とする選択性マーカーを含む。このマーカーは、ここに記載される核酸分子を含む同一のベクター内か、又は別のベクター中に含まれることができる。マーカーは、原核生物宿主細胞のためのテトラサイクリン又はアンピシリン−抵抗遺伝子、及び真核生物宿主細胞のためのジヒドロフォレート還元酵素又はネオマイシン耐性を含む。しかしながら、表現型特性の選択性を提供するマーカーは何れの場合にも有効である。
【０１８３】
成熟タンパク質は、適切な調整配列の制御下で、バクテリア、酵母、哺乳類の細胞、及び他の細胞で生産されることができるが、無細胞系転写及び翻訳システムもまた、ここに記載されるＤＮＡ構成物から誘導されるＲＮＡを用い、これらのタンパク質を生産するために用いることができる。
【０１８４】
ペプチドの分泌が必要とされる場合、キナーゼのようなタンパク質を含むマルチトランスメンブランドメイン内で達成されることは難しく、適切な分泌信号がベクター中に組み込まれる。信号配列は、これらのペプチドに内生であるか、又はペプチドに非相同であり得る。
【０１８５】
ペプチドが媒体内で分泌されない場合、典型的にはキナーゼの場合、タンパク質は、凍結融解、超音波処理、機械的破壊、分解試薬等の標準的な破壊操作によって、宿主細胞から単離されることができる。ペプチドは、硫酸アンモニウム沈降、酸抽出、又はアニオン又はカチオン交換クロマトグラフィ、ホスホセルロースクロマトグラフィ、疎水性相互作用クロマトグラフィ、アフィニテイクロマトグラフィ、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィ、レクチンクロマトグラフィ、又は高速液体クロマトグラフィを含む、公知の精製方法によって、回収、精製されることができる。
【０１８６】
また、ここに記載されているペプチドの組み換え製造の宿主細胞に依存して、ペプチドは種々のグリコシル化パターンを持ち、細胞に依存する場合、グリコシル化されずにバクテリア内で製造され得ることが理解される。さらに、ペプチドは、ホストを媒介する過程の結果として、いくつかの場合で最初に修飾されたメチオニンを含むものであり得る。
【０１８７】
ベクター及び宿主細胞の使用
ここに記載されているペプチドを表現している組み換え宿主細胞には、種々の使用用途がある。まず、この細胞は、キナーゼタンパク質又はフラグメントを必要量生産するため、さらに精製を行うことのできるキナーゼタンパク、又はペプチドの生産に有用である。このため、発現ベクターを含む宿主細胞は、ペプチドの生産に有用である。
【０１８８】
宿主細胞は、キナーゼタンパク質又はキナーゼタンパク質フラグメントに関連している細胞ベースのアッセイ、例えば上記したもの、同様に当業者において周知の他の形態のものの実行において有用である。このため、天然のキナーゼタンパク質を表現している組み換え宿主細胞は、キナーゼタンパク質機能を刺激又は阻害する化合物のアッセイに有用である。
【０１８９】
宿主細胞はまた、機能的な影響を受けるキナーゼタンパク質変異体を同定することに有用である。変異が自然に生じ病理を引き起こすような場合、突然変異を含む宿主細胞は、天然のキナーゼタンパク質の効果を示さずに、キナーゼタンパク質変異体に要求される効果（例えば、機能を刺激、又は阻害）を持つ化合物のアッセイに有用である。
【０１９０】
遺伝子的に工作された宿主細胞は、さらにヒト以外の遺伝子組み換え動物を生産するために用いることができる。遺伝子組み換え動物は、好適には哺乳類であり、例えば、１以上の細胞が組み換え遺伝子を含んだ、ネズミ又はマウスのような齧歯類動物である。組み換え遺伝子は、成長中の遺伝子組み換え動物の細胞のゲノムに組み込まれ、１以上の細胞型又は組織において、成熟した動物のゲノム中に残存する外生のＤＮＡである。これらの動物は、キナーゼタンパク質の機能の研究、及びキナーゼタンパク質活性のモジュレータの同定及び評価に有用である。遺伝子組み換え動物の他の例としては、ヒト以外の霊長類、羊、犬、牛、ヤギ、鶏、及び両生類を含む。
【０１９１】
遺伝子組み換え動物は、例えば、マイクロインジェクション、レトロウイルス感染によって、受精卵母細胞の雄性前核細胞内に核酸分子を導入し、卵母細胞は偽妊娠性の雌性育成動物中で育成されることにより作製される。何れのキナーゼタンパク質ヌクレオチド配列も、マウスのようなヒト以外の動物のゲノム中に組み換え遺伝子として導入されることができる。
【０１９２】
発現ベクターに有用な調整配列、又は他の配列は、何れも組み換え遺伝子配列の一部分を形成することができる。これには、イントロン配列及びポリアデニル化信号が、すでに含まれていない場合には含まれる。組織特異性調整配列は、特定の細胞に対しキナーゼタンパク質が直接発現するために、組み換え遺伝子に結合されることができる。
【０１９３】
受胎操作及びマイクロインジェクションを通して、遺伝子組み換え動物を生産する方法、特にマウスのような動物を用いる方法は、当業界において一般化されており、例えば、Ｕ．Ｓ．ＰａｔｅｎｔＮｏｓ．４，７３６，８６６ａｎｄ４，８７０，００９，ｂｏｔｈｂｙＬｅｄｅｒｅｔａｌ．，Ｕ．Ｓ．ＰａｔｅｎｔＮｏ．４，８７３，１９１ｂｙＷａｇｎｅｒｅｔａｌ．ａｎｄｉｎＨｏｇａｎ，Ｂ．，ＭａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇｔｈｅＭｏｕｓｅＥｍｂｒｙｏ，（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８６）に記載されている。また、同様の方法が、他の遺伝子組み換え動物の生産のために用いられている。最初の遺伝子組み換え動物は、ゲノム中の組み換え遺伝子の存在及び／又は動物の組織や細胞内での遺伝子組み換えｍＲＮＡの発現に基づいて確認されることができる。最初の遺伝子組み換え動物は、その後、さらに組み換え遺伝子を有する動物を繋殖するために用いられることができる。その上、組み換え遺伝子を有している遺伝子組み換え動物は、さらに他の組み換え遺伝子を有する他の遺伝子組み換え動物へと生育されることができる。遺伝子組み換え動物はまた、ここに記載されている相同的な組み換え宿主細胞を用いて製造された、全ての動物又は動物の組織を含む。
【０１９４】
他の例では、ヒト以外の遺伝子組み換え動物は、組み換え遺伝子の調節された発現を行う選択システムを含むものとして生産されることができる。このようなシステムの１つの例は、バクテリオファージＰ１のｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼシステムである。ｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼシステムについての記載は、例えば、Ｌａｋｓｏｅｔａｌ．ＰＮＡＳ８９：６２３２−６２３６（１９９２）参照。リコンビナーゼシステムのもう一つの例は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＦＬＰリコンビナーゼシステムである（Ｏ’Ｇｏｒｍａｎｅｔａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ２５１：１３５１−１３５５（１９９１）。ｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼシステムが組み換え遺伝子の発現の調節に用いられる場合は、動物において、ｃｒｅリコンビナーゼ及び選択されたタンパク質をコード化している組み換え遺伝子が含まれていることが必要である。このような動物は、例えば、一方は選択されたタンパク質をコード化した組み換え遺伝子を持ち、他方はリコンビナーゼをコード化した組み換え遺伝子を持った２つの組み換え遺伝子動物を交配させることにより、「二重」遺伝子組み換え動物を構成することによって提供される。
【０１９５】
ここに記載されるヒト以外の遺伝子組み換え動物のクローンは、また、Ｗｉｌｍｕｔ，Ｉ．ｅｔａｌ．Ｎａｔｕｒｅ３８５：８１０−８１３（１９９７）ａｎｄＰＣＴＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＰｕｂｌｉｃａｔｉｏｎＮｏｓ．ＷＯ９７／０７６６８ａｎｄＷＯ９７／０７６６９に記載されている方法に従って生産されることができる。簡単に述べると、遺伝子組み換え動物からの細胞、例えば体細胞は単離されて、成長サイクルから出てＧ_０相に入れられるように誘導することができる。静止細胞は、例えば、電気パルスの使用によって、静止細胞単離されたものと同種の動物の細胞核を取り除かれた卵母細胞に融合されることができる。再構成された卵母細胞は、桑実胚又は芽細胞に発達するよう培養され、その後、偽妊娠性の雌性育成動物中に移される。この雌性育成動物から誕生する子孫は、細胞、例えば体細胞を単離した動物のクローンとなる。
【０１９６】
ここに記載されているペプチドを表現する組み換え細胞を含んだ遺伝子組み換え動物は、ｉｎｖｉｖｏの環境で、ここに記載したようなアッセイを行うために有用である。したがって、生体内に存在し、基質結合、キナーゼタンパク質活性化、信号伝達に影響を与えている各種の生理学的ファクターは、ｉｎｖｉｔｒｏの無細胞系又は細胞ベースのアッセイでは明らかにならないかもしれない。したがって、これらは、基質相互作用、キナーゼタンパク質機能及び基質相互作用に対する特定の変異体キナーゼタンパク質の影響、及びキメラなキナーゼタンパク質の影響を含むキナーゼタンパク質機能を、ｉｎｖｉｖｏでアッセイするための、ヒト以外の遺伝子組み換え動物を提供するために有用である。また、実質的に又は完全に一つ以上のキナーゼタンパク質機能を除去する突然変異である、ヌル変異の影響を評価することも可能である。
【０１９７】
本明細書において、上に記載された全ての刊行物及び特許は、ここに参考として折り込まれている。本発明に記載された方法及びシステムの各種修正及び変形は、本発明の範囲及び精神から外れない限り、当業者において明らかなものである。本発明は、特定の好適な具体例に関連して記述されているが、特許請求の範囲に記載された発明は、このような特定の実施例に不当に限定されないと理解されるべきである。実際に、本発明を実行するための上記方法の各種変形は、分子生物学又は関連した分野の当業者において明らかであり、このようなものも特許請求の範囲に含まれるものである。
【配列表】
ＳＥＱＵＥＮＣＥＬＩＳＴＩＮＧ

【図面の簡単な説明】
【図１】
図１には、本発明のキナーゼ蛋白をコードするｃＤＮＡ分子のヌクレオチド配列を示す。（ＳＥＱＩＤＮＯ：１）。さらに、ＡＴＧ開始、終結、及び組織分布のような構造及び機能情報が提供され、ここではこの分子配列に基づく発明の特定用途を容易に決定することのできる構造及び機能情報を利用することができる。図１の実験データによると、ヒトにおいては、眼（網膜芽細胞腫）と脳において発現が示されている。
【図２】
図２には、本発明の３つのキナーゼの予測アミノ酸配列を示す（ＳＥＱＩＤＮＯ：２）。さらに、タンパク質ファミリー、機能、変更部位のような構造及び機能情報が提供され、ここではこの分子配列に基づく発明の特定用途を容易に決定することのできる構造及び機能情報を利用することができる。
【図３】
図３には、本発明のキナーゼをコード化している遺伝子のゲノム配列を示す。（ＳＥＱＩＤＮＯ：３）。さらに、イントロン／エクソン構造、プロモーター位置のような構造及び機能情報が提供され、ここではこの分子配列に基づく発明の特定用途を容易に決定することのできる構造及び機能情報を利用することができる。図３に描かれているように、ＳＮＰは３４カ所の異なる塩基ポジションにおいて確認された。[0001]
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This application is related to U.S. Patent Application Ser. S. Serial No. 60 / 233,493 (Atty. Docket CL000857-PROV), filed on November 13, 2000 with U.S. Pat. S. Serial No. 60 / 247,031 (Atty. Docket CL000904-PROV), and U.S. application Ser. S. Serial No. 09 / 729,995 (Atty. Socket CL000904).
[0002]
【Technical field】
The present invention relates to kinase proteins, recombinant DNA molecules, and the production of proteins related to the calcium / calmodulin-dependent protein kinase kinase subfamily. The present invention provides, inter alia, novel peptides and proteins that affect the phosphorylation of proteins, and nucleic acid molecules encoding these peptides and protein molecules. They are also useful for developing compositions and methods for human therapy and diagnosis.
[0003]
[Background Art]
Protein kinase
Kinases control the growth, differentiation, and signaling of various cells by adding phosphate groups to proteins. Abnormal control of the signal transduction system has been found to be involved in various disease states including inflammation, cancer, arteriosclerosis, psoriasis and the like. Reversible protein phosphorylation is the primary method of controlling eukaryotic cell activation. In a typical mammalian cell, it is estimated that more than 1,000 out of 10,000 functional proteins are phosphorylated. The high-energy phosphates that control activation are usually transferred from adenosine triphosphate (ATP) to specific proteins by kinases and removed from the proteins by protein phosphatases. Phosphorylation occurs in response to extracellular signals (hormones, neurotransmitters, growth factors, differentiation factors, etc.), cell cycle checkpoints, environmental and trophic stress, and is almost comparable to turning on a molecular switch . When turned on, appropriate protein kinases activate metabolic enzymes, regulatory proteins, receptors, cytoskeletal proteins, ion channels / pumps, or transcription factors.
Kinases are the largest protein group known to date and a subfamily of enzymes with a wide variety of functions and specificities. Kinases are usually named for their substrate, regulatory molecule, or some phenotype exhibited by the variant. On the basis of substrates, protein kinases are roughly divided into two groups: kinases that phosphorylate tyrosine residues (protein tyrosine kinases, PTKs) and kinases that phosphorylate serine or threonine residues (serine / threonine kinases, STKs). are categorized. Some kinases have both specificities and phosphorylate threonine and tyrosine residues. Almost all kinases have a similar enzyme active site consisting of 250-300 amino acids. The N-terminal region, consisting of subdomains I-IV, usually folds into a bilobal structure and binds and directs ATP (or ADP) donor molecules. The larger C-terminal region consisting of subdomains VIA-XI binds to the substrate protein and performs the task of transferring gamma phosphate from ATP to the hydroxyl group of a serine, threonine, or tyrosine residue. Subdomain V connects both ends.
[0004]
Kinases may be classified into families by differences in the amino acid sequence (usually consisting of 5-100 residues) present at one end of the kinase domain or inserted into a loop of the kinase domain. These additional amino acid sequences recognize kinase target proteins and interact with each other to enable control of each kinase. The primary structure of the kinase region is conserved and can be further classified into 11 subdomains. Each of the 11 subdomains has a special amino acid residue and motif or amino acid pattern, which is a feature of each subdomain and is highly conserved (Hardie, G. and Hanks, S. (1995) ) The Protein Kinase Facts Books, Vol I: 7-20 Academic Press, San Diego, Calif.).
[0005]
Second messenger-dependent protein kinases include cyclic AMP (cAMP), cyclic GMP, inositol triphosphate, phosphatidylinositol, 3,4,5-triphosphate, cyclic ADP-ribose, arachidonic acid, diacylglycerol, and calcium- It mainly mediates the functions of second messengers such as calmodulin. Cyclic-AMP dependent protein kinase (PKA) is an important member of the STK family. Cyclic-AMP is the intracellular mediator of hormonal action in all prokaryotic and animal cells examined to date. Such hormone-induced cellular responses include thyroid hormone secretion, cortisol secretion, progesterone secretion, glycogenolysis, bone resorption, and regulation of heart rate and myocardial contractility. PKA is present in all animal cells and is thought to be involved in the function of cyclic-AMP in most of these cells. Abnormal PKA expression is involved in various disorders and diseases such as cancer, thyroid disorders, diabetes, atherosclerosis, and cardiovascular diseases (Isselbacher, KJ et al. (1994) Harrison's). s Principles of Internal Medicine, McGraw-Hill, New York, NY, pp. 416-431, 1887).
[0006]
Calcium-calmodulin (CaM) -dependent protein kinases are also members of the STK family. Calmodulin is a calcium receptor that mediates many of the processes regulated by calcium by binding to target proteins in response to binding to calcium. The primary target protein in these processes is CaM-dependent protein kinase. CaM-kinase is involved in the regulation of smooth muscle contraction (MLC kinase), glycogenolysis (phosphorylase kinase), and neurotransmission (CaM kinase I and CaM kinase II). CaM kinase I phosphorylates various substrates such as the neurotransmission related proteins synapsin I and II, the gene transcription factor CREB, and the cystic fibrosis conductance control protein, CFTR (Haribabu, B. et al. (1995)). EMBO Journal 14: 3679-86). CaM II kinase controls the synthesis of catecholamines in the brain by phosphorylating other sites on synapsin and phosphorylating and activating tyrosine hydroxylase. Many of the CaM kinases are activated by phosphorylation in addition to binding to CaM. The kinase may be autophosphorylated or may be phosphorylated by another kinase in a series of "kinase cascades."
[0007]
Another ligand-activated protein kinase is 5'-AMP-activated protein kinase (AMPK) (Gao, G. et al. (1996) J. Biol Chem. 15: 8675-81). Mammalian AMPK regulates fatty acid and sterol synthesis by phosphorylation of acetyl-CoA carboxylase and hydroxymethylglutaryl-CoA reductase, and mediates the responses of these pathways to cellular stresses such as heat shock, glucose, and ATP deficiency. . AMPK is a heterotrimer composed of an alpha subunit having enzymatic activity and two subunits of beta and gamma having no activity, and the latter is thought to regulate the activity of the alpha subunit. AMPK subunits are more widely distributed in non-lipogenic tissues such as the brain, heart, spleen, and lungs than imagined. This broad distribution suggests that there are other actions besides lipid metabolism control.
[0008]
Mitogen-activated protein kinases (MAPs) are also members of the STK family. MAP kinase also regulates intracellular signaling. This kinase mediates signaling from the cell surface into the nucleus through a phosphorylation cascade. Several subgroups have been identified to date, each exhibiting different substrate specificity and responding to different extracellular stimuli (Egan, SE and Weinberg, RA (1993) Nature 365: 781-783). The MAP kinase signaling pathway exists in both mammals and yeast. Extracellular stimuli that activate mammalian pathways include epidermal growth factor (EGF), ultraviolet light, hyperosmotic media, heat shock, endotoxin lipopolysaccharide (LPS), and tumor necrosis factor (TNF) and interleukins Proinflammatory cytokines such as 1 (IL-1).
[0009]
PRK (proliferation-related kinase) is a serum / cytokine-inducible STK and is involved in the control of the cell cycle and cell proliferation of human megakaryocyte cells (Li, B. et al. (1996) J. Biol. Chem. 271: 19402-8). PRK is a kinase related to the polo (derived from the human polo gene) family of STKs involved in cell division. The expression of PRK is reduced in lung cancer tissues, and it is considered that PRK may be an oncogene whose abnormal expression in normal tissues leads to canceration. The abnormal expression of MAP kinase is related to various pathological conditions such as cancer, inflammation, immune abnormality, and diseases affecting growth and development.
[0010]
Cyclin-dependent protein kinases (CDKs) are another group of STKs that control cell development throughout the cell cycle. Cyclin is a small regulatory protein that binds and activates CDKs. Cyclin-bound CDKs then serve to drive various processes of the cell cycle by phosphorylating and activating certain proteins involved in the cell division process. CDKs are unique kinases in that they require a variety of stimuli to undergo activation. In addition to cyclin binding, CDK activation requires phosphorylation of specific threonine residues and dephosphorylation of specific tyrosine residues.
[0011]
Protein tyrosine kinases (PTKs) exclusively phosphorylate tyrosine residues in target proteins and can be classified into membrane-type receptor-type PTKs and non-membrane-type non-receptor-type PTKs. Membrane-type protein tyrosine kinases are receptors for most growth factors. When growth factors bind to the receptor, the phosphate groups from ATP are transferred to defined tyrosine residues on the receptor and other specific proteins. Growth factors (GF) involved in receptor-type PTK include epidermal growth factor, platelet-derived growth factor, fibroblast growth factor, hepatocyte growth factor, insulin, insulin-like growth factor, nerve growth factor, vascular endothelial growth factor , And macrophage colony stimulating factor.
[0012]
Non-receptor PTKs lack a transmembrane domain and bind to the intracellular domain of cell surface receptors to form a complex. Receptors that exert their functions through non-receptor-type PTKs include cytokine receptors, hormones (growth hormone and prolactin) receptors, and T-cell and B-cell antigen-specific receptors.
[0013]
Many of these PTKs were first identified as mutant oncogene products in cancer cells, and activation of PTKs in cancer cells is no longer in normal cell regulation. In fact, about one third of the oncogenes known to date encode PTKs, and it is well known that cell transformation (tumorigenesis) is often accompanied by increased tyrosine phosphorylation activity ( Carbonneau H and Tonks NK (1992) Annu. Rev. Cell. Biol. 8: 463-93). That is, controlling PTK activity can be an important strategy for controlling certain types of cancer.
[0014]
Serine / threonine protein kinases including calcium / calmodulin-dependent protein kinase
Calcium / calmodulin (CaM) -dependent protein kinases are members of the serine / threonine protein kinase (STK) family. Serine / threonine protein kinases add a phosphate group to a serine or threonine residue on a substrate. Protein kinase substrates include structural proteins such as filaments and cell motors, as well as components of signal transduction systems such as transcription factors and ion channels. The protein kinase gene family is one of the largest gene families in the genome. Kinases are classified based on nucleotide sequence, tissue distribution, and domain topology. The basic structure of the kinase is rather conserved. Many secretory proteins and membrane proteins have other structures together with the kinase region, and proteins having these multifunctional regions are often regarded as kinases. Tissue-specific expression of kinases is often determined by transcription factors.
[0015]
Calmodulin is a calcium receptor and mediates a number of calcium-regulated processes by binding to target proteins in response to binding to calcium. The primary target protein in these processes is CaM-dependent protein kinase (also called CaM kinase). CaM kinase is involved in smooth muscle contraction (MLC kinase), glycogenolysis (phosphorylase kinase), and neurotransmission (CaM kinase I and CaM kinase II). CaM kinase I phosphorylates various substrates including the neurotransmitter-related proteins synapsin I and II, the gene transcription factor CREB, and the cystic fibrosis conductance control protein CFTR (Haribabu, B. et al. (1995)). EMBO Journal 14: 3679-86). CaM kinase II also phosphorylates synapsin at different sites and regulates catecholamine synthesis in the brain through phosphorylation and activation of tyrosine hydroxylase. Many of the CaM kinases are activated by phosphorylation in addition to CaM binding. This kinase may be autophosphorylated or may be phosphorylated by another kinase as part of the "kinase cascade" (Tokumitsu et al., J. Biol. Chem. 1995 270: 19320-19324). .
[0016]
The kinase provided in the present invention has a high level of homology to calmodulin-dependent kinase kinase, an enzyme that activates CaM kinase IV. CaM kinase IV is markedly activated by phosphorylation by CaM kinase IV kinase. CaM kinase IV, together with its activating kinase, CaM kinase IV kinase, is an important component of the calcium-dependent signaling cascade in nerve cells and lymphocytes.
[0017]
In the rat cerebellum in which the presence of CaM kinase IV kinase activity has been confirmed, the signal of CaM kinase IV kinase has been shown to be relatively weak by Northern and Western blot analysis. This suggests that the cerebellum may have a different CaM kinase IV kinase isoform than the enzyme isolated from the cerebral cortex. Immunoprecipitation has shown that there are at least two different isoforms of CaM kinase IV kinase in the brain (Okuno et al., J. Biochem (Tokyo) 1996 Jun; 119 (6): 1176). 81).
[0018]
In addition, the CaM kinase cascade in myeloid cells may play an important role in mediating the effects of calcium on neutrophil function and maturation. It has been confirmed by Western blot analysis that the expression of CaM protein kinase kinase α (CaMKKα) is enhanced during the neutrophil maturation induced by retinoic acid. In addition, neutrophil progenitor cells express both CaMLI and CaMLIV transcripts, CaMLIV is repressed during neutrophil maturation and CaMLI is expressed in cells that are not induced, Induced by all-trans retinoic acid (Lawson et al., Exp Hematol 1999 Nov; 27 (11): 1682-90).
[0019]
By expressing the gene provided by the present invention in yeast, it is possible to identify a chigand of a kinase protein or a factor which may be a substrate. As the method, there are a "complementation assay" and a "2-hybrid assay". It is also possible to activate or inhibit cellular activity mediated by this kinase using artificially synthesized enzymes or peptides derived therefrom. It is also conceivable to quantify the concentration of this protein by using an immunoassay or PCR to detect a tissue having abnormal growth or cancerous growth.
[0020]
For a further review of calcium / calmodulin-dependent protein kinase kinases, see Seek et al. , J Biol Chem 1995 Dec 22; 270 (51): 30464-9; Sakagami et al. , Brain Res Mol Brain Res 1998 Mar 1; 54 (2): 311-5; and Enslen et al. , Biochem Biophys Res Commun 1995 Feb 27; 207 (3): 1038-43.
[0021]
Kinase proteins, particularly members of the calcium / calmodulin-dependent protein kinase kinase subfamily, are major targets for drug action and drug development. Therefore, identifying and characterizing previously unknown members of this subfamily of kinase proteins is of value in the field of pharmaceutical development. The present invention is state of the art in providing previously unknown human kinase proteins having homology to members of the calcium / calmodulin-dependent protein kinase kinase subfamily.
[0022]
SUMMARY OF THE INVENTION
The present invention is based on portions of the amino acid sequence identification of human kinase peptides and proteins related to the calcium / calmodulin-dependent protein kinase kinase subfamily, their allelic variants, and their orthologs in other mammals It is. These specific peptide sequences, and the nucleic acid sequences encoding these peptides, can be used as models for the development of human therapeutic targets, help identify proteins for therapeutic use, and express kinase-expressing cells. And may be targets in the development of human therapeutics that modulate kinase activity in tissues. According to the experimental data in FIG. 1, in humans, expression is shown in the eyes (retinoblastoma) and brain.
[0023]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
Introduction
The present invention is based on sequence analysis of the human genome. In analyzing and constructing the sequence of the human genome, by analyzing the sequence information, proteins / peptides / proteins / peptides identified in the art as kinase proteins or a part thereof and associated with the calcium / calmodulin-dependent protein kinase kinase subfamily. An unidentified fragment of the human genome has been identified which encodes a peptide having structural and / or sequence homology to the domain. These sequences were used to construct, transcribe, and / or isolate and characterize additional genomic sequences. Based on this analysis, the present invention provides amino acid sequences for human kinase peptides and proteins related to the calcium / calmodulin-dependent protein kinase kinase subfamily, transcribed sequences encoding these proteins, cDNA sequences and genomic sequence-type nucleic acid sequences. , Nucleic acid mutations (allelic information), tissue distribution of expression, and information on the most relevant known proteins / peptides / domains with structural or sequence homology to the kinases of the invention. is there.
[0024]
The peptides provided in the present invention can be selected on the basis that they are useful for the development of commercially important products and services, in addition to those previously unknown. In particular, the peptides of the present invention have homology and / or structural correlation to known kinase proteins in the calcium / calmodulin-dependent protein kinase kinase subfamily and are based on the observed expression pattern. Selected. According to the experimental data in FIG. 1, in humans, expression is shown in the eyes (retinoblastoma) and brain. This technology establishes the commercial importance of this family of proteins, and proteins with expression patterns similar to the genes of the present invention. More specific properties for the peptides of the invention, and their use, are described herein, particularly in the background, in the notes to the drawings, and / or the known calcium / calmodulin-dependent protein kinase kinase family, or kinases. Well known in each of the protein subfamilies.
[0025]
[Details of Embodiment]
Peptide molecule
The present invention provides nucleic acid sequences encoding protein molecules identified as one of the proteins of the kinase family, which comprise the calcium / calmodulin-dependent protein kinase kinase subfamily (see FIG. 2 for protein sequences). , FIG. 1 shows the transcription / cDNA sequence, and FIG. 3 shows the genomic sequence). FIG. 2 describes the peptide sequence, which also describes the obvious variants, in particular the allelic variants identified using the information herein and in FIG. 3, which correspond to the kinase peptides of the invention. , Kinase peptides or peptides / proteins of the invention.
[0026]
The invention consists of, consists essentially of, or includes the amino acids of the kinase peptide shown in FIG. 2 (encoded by the nucleic acid molecule shown in the transcript / cDNA of FIG. 1, or the genomic sequence of FIG. 3). It provides isolated peptides and protein molecules, as well as obvious variants of these peptides made and used by the present technology. These variants are described in detail below.
[0027]
As used herein, a peptide is said to be "isolated" or "purified" if it is substantially free of cellular material or free of chemical precursors or other chemicals. . The peptide can be purified to homogeneity or other purity. The level of purification is based on the intended use. An important property is that the required function of the peptide can be exerted even if a large amount of other components are present in the preparation (the properties of the isolated nucleic acid molecule will be described later).
[0028]
According to some examples, “substantially free of cellular material” refers to less than about 30% (dry weight) of other proteins (ie, contaminating proteins), less than about 20% of other proteins, Less than about 10%, or less than about 5% of other proteins. If the peptide is produced recombinantly, the medium may be substantially absent when the medium is less than 20% of the volume of the protein preparation.
[0029]
The term "substantially free of chemical precursors or other chemicals" refers to peptide preparations that have been separated from the chemical precursors or other chemicals involved in the synthesis. In certain instances, "substantially free of chemical precursors or other chemicals" refers to less than about 30% (dry weight) of chemical precursors or other chemicals, chemical precursors or other chemicals. Less than about 20%, less than about 10% of a chemical precursor or other chemical, or less than about 5% of a chemical precursor or other chemical.
[0030]
An isolated kinase peptide can be purified from naturally expressing cells, cells that have been modified for expression (recombined), or synthesized using known protein synthesis methods. According to the experimental data in FIG. 1, in humans, expression is shown in the eyes (retinoblastoma) and brain. For example, a nucleic acid molecule encoding a kinase peptide is cloned into an expression vector, which is then introduced into a host cell and the protein is expressed in the host cell. The protein can then be isolated from the cells by a suitable scheme using standard protein purification techniques. Many of these techniques are described in more detail below.
[0031]
Accordingly, the present invention provides a protein comprising the amino acid sequence shown in FIG. 2 (SEQ ID NO: 2), for example, the transcription / cDNA nucleic acid sequence shown in FIG. 1 (SEQ ID NO: 1) and the protein shown in FIG. It provides a protein encoded by the genomic sequence (SEQ ID NO. 3). When the final amino acid sequence of such a protein is this amino acid sequence, the protein consists of the amino acid sequence.
[0032]
The present invention further provides a protein consisting essentially of the amino acid sequence shown in FIG. 2 (SEQ ID NO: 2), such as the transcription / cDNA nucleic acid sequence shown in FIG. It provides a protein encoded by the indicated genomic sequence (SEQ ID NO. 3). When such an amino acid sequence contains a trace amount of additional amino acid residues, for example, about 1 to about 100 additional residues, and generally 1 to 20 additional residues in the protein, the protein is an amino acid. Consists essentially of an array.
[0033]
The present invention further provides a protein comprising the amino acid sequence shown in FIG. 2 (SEQ ID NO: 2), such as the transcription / cDNA nucleic acid sequence shown in FIG. 1 (SEQ ID NO: 1) and the genomic sequence shown in FIG. (SEQ ID NO. 3). If the amino acid sequence is at least part of the final amino acid sequence of the protein, the protein comprises the amino acid sequence. In such cases, the protein may be only a peptide or additional amino acids such as amino acid residues that are naturally associated with the protein (adjacent to the encoded sequence) or heterologous amino acid residues / peptide sequences. Amino acids. Such proteins may have small amounts of additional amino acid residues, or may contain hundreds or more additional amino acids. A preferred species of protein containing the kinase peptide of the present invention is a naturally occurring mature protein. The method for preparing / isolating these various proteins is briefly described below.
[0034]
The kinase peptides of the present invention can be linked to heterologous sequences to form chimeric or fusion proteins. Such chimeric and fusion proteins include a kinase peptide that can be effectively bound to a heterologous protein having an amino acid sequence that has substantially no homology to the kinase peptide. "Able to bind effectively" means that the kinase peptide and the heterologous protein are fused in frame. Heterologous proteins can be fused to the N-terminus or C-terminus of the kinase peptide.
[0035]
In some cases, the fusion protein does not affect the activity of the kinase peptide itself. For example, fusion proteins include, but are not limited to, enzyme fusion proteins such as β-galactosidase fusion, yeast two-hybrid GAL fusion, poly-His fusion, MYC labeling, HI labeling and Ig fusion. Such fusion proteins, especially poly-His fusions, are useful for purifying recombinant kinase peptides. In certain host cells (eg, mammalian host cells), protein expression and / or secretion can be increased by using a heterologous signal sequence.
[0036]
Chimeric or fusion proteins can be produced by standard recombinant DNA techniques. For example, DNA fragments encoding different protein sequences are placed together in frame according to conventional techniques. Alternatively, the fusion gene can be synthesized by conventional techniques including an automatic DNA synthesizer. Alternatively, the chimeric gene sequence can be reamplified by using an anchor primer for PCR amplification of the gene fragment, forming a complementary overhang between two consecutive gene fragments, and then annealing (Ausubel et al. al., Current Protocols in Molecular Biology, 1992). Furthermore, many expression vectors that already encode a fusion moiety (eg, a GST protein) can be obtained commercially. The nucleic acid encoding the kinase peptide can be cloned into such an expression vector, such that the fusion joins the kinase peptide in frame.
[0037]
As explained above, this study also highlights the apparent amino acid sequences of the proteins of the invention, including naturally occurring peptide mature forms, allelic / sequence variants of the peptide, non-naturally occurring recombination-induced variants, peptide orthologs and paralogs. And to enable the implementation of such variants. Such a mutant can be easily produced by using a technique known in the field of nucleic acid recombination technology or protein biochemistry. However, it should be understood that this variant does not include any of the amino acid sequences published prior to the present invention.
[0038]
Such mutants can be easily identified / produced by using the molecular techniques and sequence information shown in the present invention. Furthermore, such variants can be easily distinguished from other peptides based on sequence and / or structural homology to the kinase peptides of the present invention. The degree of homology / identity is primarily based on whether the peptide is a functional or non-functional variant, the amount of differentiation present in the paralog family, and the evolutionary differences between orthologs. Is determined.
[0039]
To determine the percent identity of two amino acid sequences, or two nucleic acid sequences, the sequences are aligned for optimal comparison (eg, for optimal sequence comparison, gaps are first and second). Non-homologous sequences introduced into one or both amino acid or nucleic acid sequences can be ignored for comparison purposes). In a preferred example, at least 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% or more of the length of the subject sequence is aligned for comparison purposes. Then, amino acid residues or nucleotides on the corresponding amino acid configuration or nucleotide configuration are compared. When a configuration in the first sequence is occupied by the same amino acid residue or nucleotide as the corresponding configuration in the second sequence, then the molecule is identical and identical to that configuration (as used herein for an amino acid or nucleic acid). "Identity" is synonymous with "homology" of amino acids or nucleic acids.) The percent identity between two sequences is a function of the number of identical arrangements shared in the sequences, and taking into account the number of gaps and the length of each gap, gaps are introduced so that the two sequences can make an optimal comparison. There is a need.
[0040]
The comparison of sequences and the determination of percent identity and similarity between the two sequences can be performed using mathematical algorithms (Computational Molecular Biology, Lesk, AM, ed., Oxford University Press, New York). Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, DW, ed., Academic Press, New York, Canada, 1993, Computer Analysis, Gazette, Biotechnology, Inc., Biotechnology: Information and Genome Projects, Smith, DW, ed. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; equence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987;. and Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds, M Stockton Press, New York, 1991). As a preferred example, the percent identity between two amino acid sequences is determined by the Needleman-Wunsch algorithm (J. Mol. Biol.) Incorporated into the GAP program of the GCG software package (available at http://www.gcg.com). (48): 444-453 (1970)) using a Blossom 62 matrix or a PAM 250 matrix and

gap weights

16, 14, 12, 10, 8, 6, 4,

length weights

1, 2, 3, 4, 5 , 6 are determined. As another preferred example, the percent identity between two nucleotide sequences is determined using the GAP program (Devereux, J., et al., (Nucleic Acids Res. 12 (1): 387 (1984)) and using the NWS gapdna. Determined using a CMP matrix, gap weights 40, 50, 60, 70, 80 and

length weights

1, 2, 3, 4, 5, 6. As a further example, a two amino acid or nucleotide sequence The percent identity between were determined using the E. Myers W. Miller algorithm (CABIOS, 4: 11-17 (1989)) incorporated into the ALIGN program (version 2.0) using the PAM120 weight residue table, gap It is determined using the long penalty 2 and the gap penalty 4.
[0041]
The nucleic acid and protein sequences of the present invention can be used as "query sequences" to search sequence databases, for example to find other families or related sequences. Such a search can be performed using the NBLAST of Altschul et al. And the XBLAST program (version 2.0) (J. Mol. Biol. 215: 403-10 (1990)). BLAST nucleotide searches can be performed with the NBLAST program, score = 100, wordlength = 12, to obtain nucleotide sequences homologous to the nucleic acid molecules of the invention. The BLAST protein search can be performed using the XBLAST program at score = 50 and wordlength = 3 in order to obtain an amino acid sequence homologous to the protein of the present invention. Gapped BLAST (Nucleic Acids Res. 25 (17): 3389-3402 (1997)) by Altschul et al. Can be used to obtain a gap sequence for comparison purposes. When using the BLAST and gap BLAST programs, predetermined parameters of each program (for example, XBLAST or NBLAST) can be used.
[0042]
The full-length form of the protein comprising one of the peptides of the present invention before maturation processing and the processed form has complete sequence identity to one of the kinases of the present invention. And can be easily identified as being encoded by the same gene location as the kinase peptide of the present invention. As shown in the data presented in FIG. 3, the gene encoding the novel human kinase protein of the present invention is located on the public BAC AC005940 known to be present on human chromosome 17. I have.
[0043]
An allelic variant of a kinase peptide is a human protein that has a high (significant) sequence homology / identity to at least a portion of the kinase peptide, and is also encoded at the same genetic location as the kinase peptide of the present invention. Can be easily identified. Gene locations can be readily determined based on the genomic information shown in FIG. 3, such as the genomic sequence mapped to the subject human. As shown in the data presented in FIG. 3, the gene encoding the novel human kinase protein of the present invention is located on the public BAC AC005940 known to be present on human chromosome 17. I have. As used in the present invention, typically at least about 70-80%, 80-90%, 90-95%, more typically at least about 90-95%, or more, in the amino acid sequence. Two proteins (or a region of a protein) have significant homology. According to the present invention, amino acid sequences with significant homology are encoded by a nucleic acid sequence that hybridizes, under more stringent conditions, to a kinase peptide encoded by the nucleic acid molecule as described below. Be transformed into
[0044]
FIG. 3 shows information on SNPs found in the gene encoding the novel human kinase protein of the present invention. SNPs were identified in introns and at 34 different base positions in the 5 'and 3' regions of the ORF. These include the non-synonymous cSNP at position 16135 and the two SNPs at the 5 'end of the ORF (positions 2082 and 2748) that may affect the control / regulation area. Changes in the amino acid sequence caused by the SNP of G16135A are shown in FIG. 3 and can be easily confirmed by the universal gene code and the protein sequence shown as a reference in FIG.
[0045]
A paralog of a kinase peptide may have some significant sequence homology / identity to at least a portion of the kinase peptide, be encoded by a human gene, and have similar activity or function. , Can be easily identified. Two proteins are considered to be typical paralogs if the amino acid sequences have at least about 60% or more, more typically at least 70%, homology over a given region or domain. Such paralogs are encoded by a nucleic acid sequence that hybridizes under moderately stringent conditions to the kinase peptide encoded by the nucleic acid molecule, as described in more detail below.
[0046]
An ortholog of a kinase peptide has some significant sequence homology / identity to at least a portion of the kinase peptide, and can be readily identified as being encoded by a gene from another organism. Orthologs are preferably isolated from mammals, more preferably primates, and used for the development of human therapeutic targets and therapeutic agents. Such orthologs are encoded by a nucleic acid sequence that hybridizes under moderate to stringent conditions with a kinase peptide encoding the nucleic acid, as described in more detail below, which encodes the protein. It depends on the relationship between the two living organisms to be created.
[0047]
Non-naturally occurring variants of the kinase peptides of the present invention can be readily produced using recombinant techniques. Such variants include, but are not limited to, deletions, additions, and substitutions in the amino acid sequence of the kinase peptide. For example, one type of substitution is a conservative amino acid substitution. This substitution is one in which a particular amino acid in the kinase peptide is replaced by another amino acid having similar characteristics. In conservative substitutions, one of the aliphatic amino acids Ala, Val, Leu, Ile is substituted with another, the substitution between hydroxyl residue Ser and Gln, the substitution between acidic residue ASP and Glu, the amide There are substitutions between the residues Asn and Gln, substitutions of the basic residues Lys and Arg, and substitutions of the aromatic residues Phe and Tyl. For guidelines on amino acid substitutions that do not appear in the phenotype, see Bowie et al. , Science 247: 1306-1310 (1990).
[0048]
The mutated kinase peptide may be fully functional or may lack function in one or more of its activities, for example, its ability to bind substrate, phosphorylate substrate, or modulate signal transduction. Fully functional variants generally include only conservative variants or variants within non-lethal residues or regions. FIG. 2 shows the results of a protein analysis, which can be used to identify critical domains / regions. Functional variants also include substitutions of similar amino acids that do not alter the function or that do not alter the function significantly. On the other hand, such substitutions may have some positive or negative effect on function.
[0049]
Non-functional mutations typically involve one or more non-conservative amino acid substitutions, deletions, introductions, inversions, truncations, or substitutions, deletions, introductions, or inversions at lethal residues or regions. Is included.
[0050]
Amino acids that are essential for function can be determined by methods known in the art, such as, for example, site-directed mutagenesis, or alanine scanning mutagenesis (Cunningham et al., Science 244: 1081-1085 (1989)). It can be confirmed using the results shown in FIG. In alanine scanning mutagenesis, a single alanine mutation is made at every residue in the molecule. The resulting mutant molecules are then tested for biological activity, such as kinase activity, or for assays, such as in vitro proliferation activity assays. Sites important for binding partner / substrate binding are determined by structural analysis such as crystallization, nuclear magnetic resonance, optical affinity labels, etc. (Smith et al., J. Mol. Biol. 224: 899-904 (1992)). De Vos et al. Science 255: 306-312 (1992)).
[0051]
The present invention further provides fragments of the kinase peptide, and additionally provides proteins and peptides comprising and consisting of the fragment, particularly proteins and peptides comprising the residues identified in FIG. . However, fragments relevant to the present invention are not considered to include fragments published prior to the present invention.
[0052]
As used herein, a fragment comprises at least 8, 10, 12, 14, 16, or more amino acid residues adjacent to the kinase peptide. Such fragments may be selected for their ability to retain the activity of one or more kinase peptides, or for their ability to perform a function such as binding to a substrate or acting as an antigen. Of particular interest are biologically active fragments, for example peptides of 8 or more amino acids. Such fragments typically contain a domain or motif of a kinase peptide, such as, for example, an active site, a transmembrane domain or a substrate binding domain. Further, possible fragments include, but are not limited to, domain or motif containing fragments, soluble peptide fragments, and antigenic structure containing fragments. Predicted domains and functional sites can be readily identified by known computer programs (eg, PROSITE analysis) readily available to those skilled in the art. One such analysis result is shown in FIG.
[0053]
Polypeptides often contain amino acids other than the twenty amino acids commonly referred to as the twenty natural amino acids. In addition, many amino acids, including terminal amino acids, can be modified by natural processes, such as processing and post-translational modifications, or by chemical modification techniques known in the art. The general modifications that occur naturally in kinase peptides are described in basic texts, detailed research papers and the literature, which are well known to those skilled in the art (some of these properties are illustrated in FIG. 2). It is confirmed).
[0054]
Known modifications include acetylation, acylation, ADP ribosylation, amidation, covalent addition of flavin, covalent addition of heme moieties, covalent addition of nucleotides or nucleotide derivatives, covalent addition of lipids or lipid derivatives, Covalent addition of phosphatidylinositol, cross-linking, cyclization, disulfide bond formation, demethylation, formation of covalent cross-links, formation of cystine, formation of pyroglutamate, formination, γ-carboxylation, glycosylation, GPI anchor Transcription RNA-mediated addition of amino acids to proteins such as formation, hydroxylation, iodination, methylation, myristoylation, participation, proteolytic processing, phosphorylation, prenylation, racemization, selenoylation, sulfation, arginylation, ubiquitin Modification, but is not limited to Not.
[0055]
Such modifications are well known to those skilled in the art and have been described in great detail in the scientific literature. Particularly common modifications, such as glycosylation, lipidation, sulphation, γ-carboxylation of glutamic acid residues, hydroxylation, ADP-ribosylation, are described in Proteins-Structure and Molecular Properties, 2nd Ed. , T .; E. FIG. Creighton, W.C. H. It is described in most basic texts, such as Freeman and Company, New York (1993). For a detailed literature on this point, see Wold, F.C. B., Posttranslational Covalent Modification of Proteins, B .; C. Johnson, Ed. , Academic Press, New York 1-12 (1983); Seifter et al. (Meth. Enzymol. 182: 626-646 (1990)) and Rattan et al. Many documents are available, such as (Ann. NY Acad. Sci. 663: 48-62 (1992)).
[0056]
Accordingly, the kinase peptides of the present invention also encompass derivatives or analogs, wherein the substituted amino acid residue is not encoded by the genetic code, but includes the substituent, The peptide is fused to another compound, such as, for example, a compound that increases the half-life of the kinase peptide (eg, polyethylene glycol), or the additional amino acids are, for example, primary or secondary sequences, a purified sequence of the mature kinase peptide, or Fuse with a mature kinase peptide, such as a protein sequence.
[0057]
Use of proteins / peptides
The protein of the present invention may be a protein (or a protein) in a biological fluid in a substantial and specific assay, e.g., for raising antibodies or inducing other immune responses, in relation to the functional information shown in the figures. As a reagent (including a labeling reagent) used in an assay for quantifying the level of the binding target or ligand, and as a marker for a tissue that selectively expresses a target protein (specificity of tissue differentiation or development) Stage, or disease state). If the protein binds or can bind to another protein or ligand (eg, an interaction between kinase-related proteins or an interaction between kinase ligands), the protein is used to identify a binding partner / ligand; Systems can be developed to identify inhibitors of binding interactions. The use of some or all of these makes it possible to develop reagent grade or kit products as commercial products.
[0058]
How to make the uses listed above in practice is well known to those skilled in the art. References disclosing such methods include "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2d ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Sambrook, J. et al. , E .; F. Fritsch and T.S. Maniatis eds. , 1989 and "Methods in Enzymology: Guide to Molecular Cloning Technologies", Academic Press, Berger, S.M. L. and A. R. Kimmel eds. , 1987.
[0059]
The potential uses of the peptides of the present invention are primarily based on the protein source and the type / effect of the protein. For example, kinases isolated from humans and their human / mammalian orthologs are useful for treating medicaments in mammals, for example, medicaments for humans, particularly biological or pathological reactions in cells or tissues expressing the kinase. It is useful as a target for discovering drugs used for adjustment. As shown in the experimental data of FIG. 1, the kinase protein of the present invention is expressed in eyes (retinoblastoma) and brain in humans. In particular, substantial Northern blot analysis shows expression in retinoblastoma and tissue screening panels using PCR show expression in brain. Many drugs that modulate the activity of kinase proteins, particularly the calcium / calmodulin-dependent protein kinase kinase subfamily, are currently under development (see Background Art). The structural and functional information described in the background art and figures, especially when combined with the expression information of FIG. 1, provides for specific and essential use of the molecules of the present invention. According to the experimental data in FIG. 1, in humans, expression is shown in the eyes (retinoblastoma) and brain. Such uses can be readily determined using the information provided in the present invention, information known to those of skill in the art, and routine experimentation.
[0060]
The proteins of the invention, including the variants and fragments disclosed before the invention, are useful in biological assays for kinases related to the calcium / calmodulin-dependent protein kinase kinase subfamily. Such assays may be useful for assessing the function or activity of the kinase, or properties useful in the diagnosis and treatment of conditions associated with the kinase, particularly in the kinase subfamily to which one of the present invention belongs, in cells and tissues that express the kinase. Related to either. As shown in the experimental data of FIG. 1, the kinase protein of the present invention is expressed in eyes (retinoblastoma) and brain in humans. In particular, substantial Northern blot analysis shows expression in retinoblastoma and tissue screening panels using PCR show expression in brain.
[0061]
The proteins of the invention are also useful in cell-based or cell-free drug screening assays. A cell-based system is a cell that is naturally occurring, ie, that normally expresses a kinase, that grows in a biopsy or cell culture. According to the experimental data in FIG. 1, in humans, expression is shown in the eye (retinoblastoma) and brain, or alternatively, the cell-based assay involves recombinant host cells expressing the kinase protein.
[0062]
Polypeptides can be used to identify compounds that modulate the kinase activity of proteins in the natural state or in a variant that cause a particular disease or condition associated with the kinase. The kinases of the present invention, and suitable variants and fragments, can be used in high efficiency screens for assaying candidate compounds capable of binding to the kinase. These compounds can be further screened against functional kinases to determine their effect on kinase activity. Further, these compounds can be tested in animal or invertebrate systems to determine activity / effect. The compound is determined to activate (agonist) or inactivate (antagonist) the kinase to a desired degree.
[0063]
In addition, the proteins of the present invention may comprise an interaction between a kinase protein and a molecule that normally interacts with the kinase protein, eg, a substrate or component of a signal pathway that the kinase protein normally interacts with (eg, another kinase). It can be used to screen for compounds that have the ability to promote or inhibit the action. Such assays generally involve the interaction of a kinase protein or fragment with the target molecule, detection of a complex between the protein and target, or detection of protein phosphorylation, cAMP rotation, adenylate cyclase activity, and the like. A step is included in which the kinase protein and the candidate compound are bound under conditions that allow detection of the biochemical consequences of the interaction between the kinase protein and the target, such as effects associated with signal transduction.
[0064]
As candidate compounds, for example, 1) a fusion peptide of which the final part is Ig, and a soluble peptide containing a random peptide library (for example, Lam et al., Nature 354: 82-84 (1991); Houghten et al., Nature 354) : 84-86 (1991)), and peptides comprising a library of scientifically derived molecules made up of combinations of D- and / or L-amino acids, 2) phosphopeptides (e.g., random or partially altered phosphodiesters). Peptide libraries, for example, Songyang et al., Cell 72: 767-778 (1993), 3) Antibodies (for example, polyclonal, monoclonal, humanized, anti-idiotype, chimeric, Fab, F) (Ab ') 2, Fab Single chain antibodies including expression library fragments, and single chain antibodies including epitope binding fragments of antibodies, and epitope binding fragments of antibodies), 4) small organic and inorganic molecules, (eg, molecules obtained from combinatorial and natural product libraries) ) Is included.
[0065]
Certain candidate compounds are soluble fragments of the receptor that compete for substrate binding. Other candidate compounds include mutant kinases, or appropriate fragments containing mutants that affect kinase function, which result in competition with the substrate. Thus, for example, fragments that compete with the substrate, such as those that have high affinity or that do not dissociate and dissociate with the substrate, are encompassed by the invention.
[0066]
The invention further includes other endpoint assays for identifying compounds that modulate (stimulate or inhibit) kinase activity. This assay generally involves assays for behavior in signal transduction pathways that exhibit kinase activity. To this end, assays are performed for phosphorylation of the substrate, activation of the protein, and alteration of gene expression, where the response to the kinase protein-dependent signal cascade is modulated to promote or suppress.
[0067]
Any biological or biochemical function mediated by the kinase can be used as an endpoint assay. These include all biochemical or biochemical / biological behavior described herein, the references cited herein incorporate the targets of these endpoint assays, and Are known to those skilled in the art or can be easily ascertained using the information in the drawings, particularly FIG. In particular, assays may be performed for expressing the kinase or for biochemical function of the tissue. As shown in the experimental data of FIG. 1, the kinase protein of the present invention is expressed in eyes (retinoblastoma) and brain in humans. In particular, substantial Northern blot analysis shows expression in retinoblastoma and tissue screening panels using PCR show expression in brain.
[0068]
The binding and / or activating compound may also be an amino-terminal extracellular domain or a portion thereof, or any of the seven transmembrane segments or any of the intracellular or extracellular loops that may be relaxed to a heterologous domain or subregion. Screening can be performed by using the chimeric kinase protein in the entire or submembrane domain, such as the carboxy-terminal intracellular domain, or a subregion, or a part thereof. For example, a substrate binding region can be used that interacts with a different substrate and can be further identified as being recognized by a native kinase. Similarly, different sets of signal transducing components can be used as endpoint assays for activation. Such methods allow the assay to be performed in other than the specific host cell from which the kinase was derived.
[0069]
The proteins of the invention are also useful in competitive binding assays, which are methods utilized to discover compounds (eg, binding partners and / or ligands) that interact with a kinase. To this end, the compound is contacted with the kinase polypeptide under conditions that allow the compound to bind or interact with the polypeptide. Soluble kinase polypeptide is also added to the mixture. When the test compound interacts with the soluble kinase polypeptide, the amount, or activity, of the complex formed from the kinase target is reduced. This type of assay is particularly useful when searching for compounds that interact with specific regions of the kinase. Therefore, soluble polypeptides that compete with the target kinase region are designed to include a peptide sequence corresponding to the region of interest.
[0070]
In order to conduct cell-free drug screening assays, the kinase protein or fragment, its target molecule, and / or its target molecule may be used to efficiently separate the complexed form from one or both uncomplexed forms of the protein and to automate the assay. It may be desirable to immobilize either.
[0071]
Techniques for immobilizing proteins on matrices can be used in drug screening assays. In one example, a fusion protein can add a domain that can bind the protein to a matrix. For example, the glutathione S-transferase fusion protein is adsorbed on glutathione sepharose beads (Sigma Chemical 1, St. Louis, MO) or glutathione-derived microtiter plates, and cell lysates (eg,³⁵The S-label) and the candidate compound are bound and the mixture is cultured under complex formation conditions (eg, physiological conditions of salt and PH). After incubation, the beads are washed to remove unbound label, and the matrix is immobilized and quantified by measuring the supernatant either directly on the radiolabel or after separation of the complex. Alternatively, the complexes can be separated from the matrix by SDS-PAGE, and the level of kinase binding protein in the bead fraction from the gel can be quantified by using standard electrophoresis techniques. For example, the polypeptide or its target molecule is immobilized using biotin and streptavidin linkages using techniques well known to those skilled in the art. Alternatively, antibodies that react with the protein and do not interfere with binding of the protein to the target molecule are derivatized into wells of the plate, and the protein is captured in the wells by binding to the antibody. The kinase binding protein composition and the candidate compound are cultured in the kinase protein-containing well, and the amount of the complex captured in the well is measured. As a method for detecting such a complex, in addition to the above-described method using a GST-immobilized complex, an antibody reactive with a kinase protein target molecule or an antibody reactive with a kinase protein and competing with the target molecule can be used. And enzyme-linked assays based on the detection of enzyme activity associated with the target molecule.
[0072]
Agents that mediate one of the kinases of the present invention can be identified using the above-described assays alone or in combination. In general, it is preferred to first confirm activity in an animal or other model system using a cell-based or cell-free system. Such model systems are well known to those skilled in the art and can be easily used in the present description.
[0073]
Modulators of kinase protein activity identified by these drug screening assays can be used to treat patients suffering from diseases mediated by the kinase pathway by treating cells or tissues that express the kinase. According to the experimental data in FIG. 1, in humans, expression is shown in the eyes (retinoblastoma) and brain. These methods of treatment include administering a modulator of kinase activity in the pharmaceutical composition in an amount required to treat the patient, wherein the modulator is identified as described herein.
[0074]
In another aspect, the present invention relates to a two-hybrid assay or a three-hybrid assay (U.S. Patent No. 1) for identifying other proteins that bind or interact with kinases or are associated with kinase activity. Zervos et al. (1993) Cell 72: 223-232; Madura et al. (1993) J. Biol. Chem. 268: 12046-12054; Bartel et al. (Iwabuchi et al. (1993) Oncogene 8: 1693-1696; and Brent WO94 / 10300). it can. Such kinase binding proteins are involved, for example, in kinase proteins as downstream factors in kinase-mediated signaling pathways, or in signaling by kinase targets. Alternatively, such a kinase binding protein could be a kinase inhibitor.
[0075]
The two-hybrid system is based on the modular nature of most transcription factors, consisting of a separable DNA binding domain and an activation domain. Briefly, this assay utilizes two different DNA structures. In one configuration, the gene encoding the kinase protein is fused to a gene encoding the DNA binding domain of a known transcription factor (eg, GAL4). In the other structure, a DNA sequence obtained from a DNA sequence library and encoding an unknown protein ("play" or "sample") is fused to a gene encoding the activation domain of a known transcriptional regulator. Is done. When the “bait protein” and “play protein” can interact in vivo and form a kinase-dependent complex, the DNA-binding and activation domains of the transcription factor are in close proximity. This proximity allows transcription of a reporter gene (eg, Lac Z) that can bind to a transcriptional regulatory site responsive to a transcriptional regulatory factor. Reporter gene expression can be detected, and cell colonies containing a functional transcriptional regulator can be isolated and used to obtain a cloned gene encoding a protein that interacts with a kinase protein. .
[0076]
The present invention further relates to novel agents identified by the aforementioned screening assays. Thus, the use of agents identified as described herein in a suitable animal model is also within the scope of the invention. For example, an agent identified in the present invention (eg, a kinase-mediated agent, an antisense kinase nucleic acid molecule, a kinase-specific antibody, or a kinase binding partner) can be used to determine the efficacy, toxicity, or side effects of these agents in a formulation. Can be used in animals, or other models. Alternatively, the agents identified in the present invention can be used in animals or other models to determine the mechanism of action of such agents. Furthermore, the present invention relates to the use of a novel agent identified by said screening assay for therapy.
[0077]
The kinase proteins of the present invention are useful for providing targets for the diagnosis of peptide-mediated diseases or disease predispositions. Accordingly, the present invention provides a method for detecting the presence or level of a protein (or encoded mRNA) in a cell, tissue, or living organism. According to the experimental data in FIG. 1, in humans, expression is shown in the eyes (retinoblastoma) and brain. Methods include contacting a biological sample with a compound capable of interacting with a kinase protein, and the interaction is detected by this method. Such assays are provided in a single detection format or in a multiple detection format, such as an antibody chip array.
[0078]
One agent that detects a protein in a sample is an antibody that can selectively bind to the protein. Biological samples include tissues, cells, and body fluids isolated from or present within a subject.
[0079]
The peptides of the present invention provide a target for use in diagnosing protein activity, disease or disease predisposition in patients with peptide variants, especially in activities and symptoms known as other than existing protein families. is there. Thus, peptides can be isolated from a biological sample and assayed for the presence of a gene mutation that results in an abnormal peptide. This includes amino acid substitutions, deletions, insertions, rearrangements (resulting from abnormal splicing rigging), and inappropriate post-translational modifications. Analytical methods include denaturing electrophoretic mobility, denaturing tryptic peptide digestion, denaturing kinase activity by cell-based or cell-free assays, denaturing binding patterns of substrates or antibodies, denaturing isoelectric points, direct amino acid sequences, and protein mutations. Includes other known assay techniques useful for detection. Such assays are provided in a single detection format or in a multi-detection format, such as an antibody chip array.
[0080]
Techniques for in vitro detection of peptides include enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) Western blots, immunoprecipitation using detection reagents such as antibodies or protein binders, and immunofluorescence. Alternatively, in vivo detection of a test subject can be performed by introducing a labeled anti-peptide antibody or another type of detection reagent into a subject. For example, the antibody can label a radioactive marker, and the presence and location of the marker in a subject can be detected by standard imaging techniques. Methods for detecting allelic variants of a peptide expressed in a subject, and methods for detecting fragmentation of a peptide in a sample, are particularly useful.
[0081]
Peptides are also useful in pharmacological analysis. In pharmacology, significant genetic variation in response to a drug is clinically treated according to the tendency of the drug to change and the abnormal kinematics of the affected human. See, for example, Eichelbaum, M .; (Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 23 (10-11): 983-985 (1996)), and Linder, M.E. W. (Clin. Chem. 43 (2): 254-266 (1997)). The clinical consequences of these mutations, as a result of an individual's metabolic mutations, result in severe toxicity of the therapeutic agent to some individuals, or failure to treat some individuals. Thus, the genotype of an individual can determine how the therapeutic compound works in the body or how the body metabolizes the compound. In addition, the activity of a drug that metabolizes enzymes affects the intensity and duration of action of the drug. Thus, the pharmacology of an individual allows the selection of effective compounds, or effective dosages of such compounds, in prophylactic or therapeutic treatment based on the genotype of the individual. Discovery of genetic polymorphisms explains why patients with enzymatic metabolism may not achieve the expected efficacy, exhibit unnatural efficacy, or suffer significant toxicity from standard dosages can do. Polymorphisms can be represented by a strong metabolic phenotype and a weak metabolic phenotype. Thus, polymorphisms in a gene may lead to allelic variations in the kinase protein such that one or more of the kinase functions in one population is different from that in another population. Thus, peptides can be targets for identifying the predisposition of genes that influence therapy. Thus, in ligand-based therapies, polymorphism can cause higher or lower substrate binding and kinase activity in the extracellular domain of the terminal amino group and / or other substrate binding regions. Thus, in populations containing polymorphisms, the substrate dosage will necessarily be modified to maximize the therapeutic effect. As an alternative to genotype, specific polymorphic peptides can be identified.
[0082]
The peptides are also useful for treating disorders characterized by lack of expression, inappropriate expression, or unnecessary expression of the protein. According to the experimental data in FIG. 1, in humans, expression is shown in the eyes (retinoblastoma) and brain. Thus, treatment methods include the use of kinase proteins or fragments.
[0083]
antibody
The present invention provides antibodies that selectively bind to one of the peptides of the present invention, proteins containing such peptides, variants and fragments thereof. As used herein, an antibody selectively binds to a target peptide when the antibody binds to the target peptide and does not bind strongly to unrelated proteins. Antibodies are selective even when bound to other proteins that have substantially no homology to the target peptide, as long as the peptide has homology in fragment or domain to the peptide targeted by the antibody. Is thought to bind the peptide to In this case, the antibody bound to the peptide is understood to be selective despite having some cross-reactivity.
[0084]
As used herein, antibodies are defined by the same terms as those recognized in the art, and are multi-subunit proteins that are produced by mammalian organisms and that respond to antigenic attack. Antibodies of the invention include polyclonal antibodies, monoclonal antibodies, and fragments of these antibodies, and include, but are not limited to, Fab or F (ab ') 2, and Fv.
[0085]
Many methods are known for generating and / or identifying antibodies to obtain a target peptide. Some of such methods are described in Harlow, Antibodies, Cold Spring Harbor Press, (1989).
[0086]
Generally, to produce antibodies, the isolated peptide is used as an immunogen and administered to a mammalian organism, such as a mouse, rabbit or mouse. Full length proteins, antigenic peptide fragments or fusion proteins are used. Fragments of particular interest cover functional domains, as shown in FIG. 2, and can be easily identified using protein placement methods, as shown in FIG. This is a domain having sequence homology or difference.
[0087]
Antibodies are suitably prepared from regions of the kinase protein, or from isolated fragments. Antibodies can be prepared from any region of the peptide, as described herein. However, preferred regions include those involved in function / activity and / or kinase binding target interaction. FIG. 2 can be used to identify regions of particular interest, where the sequence arrangement can be used to identify retained unique sequence fragments.
[0088]
Antigenic fragments generally consist of at least eight contiguous amino acid residues. An antigenic peptide can consist of at least 10, 12, 14, 16 or more amino acid residues. Such fragments are selected on the basis of physical properties, such as fragments corresponding to regions located on the surface of the protein, for example, hydrophilic regions, or sequence specificity (see FIG. 2). be able to.
[0089]
Detection of an antibody of the invention can be facilitated by coupling (ie, physical binding) the detectable substance with the antibody. Examples of detectable substances include, for example, various enzymes, prosthetic groups, fluorescent substances, luminescent substances, bioluminescent substances, and radioactive substances. Examples of suitable enzymes include horseradish peroxidase, alkaline phosphatase, β-galactosidase, or acetylcholinesterase; examples of suitable prosthetic groups include streptapidine / biotin, avidin / biotin, and suitable fluorescent Examples of materials include umbelliferone, fluorescein, fluorescein isothiocyanate, rhodamine, dichlorotriazinylamine fluorescein, dansyl chloride, or phycoerythrin; examples of luminescent materials include luminol; bioluminescent materials Examples include luciferase, luciferin, and aequorin, and examples of suitable radioactive materials include¹²⁵I,¹³¹I,³⁵S, or³H.
[0090]
Use of antibodies
Antibodies can be used to isolate one of the proteins of the invention by standard techniques, such as affinity chromatography, or immunoprecipitation. Antibodies can facilitate the purification of native proteins from cells and of recombinantly produced proteins expressed in host cells. Furthermore, such antibodies determine the expression pattern of a protein in a tissue or a living body, and thus can be used for detecting the presence of the protein of the present invention in a cell or a tissue without a normal development step. As shown in the experimental data of FIG. 1, the kinase protein of the present invention is expressed in eyes (retinoblastoma) and brain in humans. In particular, substantial Northern blot analysis shows expression in retinoblastoma and tissue screening panels using PCR show expression in brain. In addition, such antibodies can be used to detect proteins in situ, in vitro, in cell lysates, and in supernatants by evaluating the amount and pattern of expression. Also, such antibodies can be used to assess abnormal tissue distribution or abnormal expression in the development or progression of a biological state. Antibody detection in circulating fragments of the full-length protein can be used to identify turnover.
[0091]
In addition, the antibodies can be used to assess disease manifestations, such as active stages of a protein-related disease, or individuals predisposed to the disease. If the disorder is due to improper tissue distribution, developmental expression, protein expression levels, or expression / progression status, the antibodies will be prepared against normal proteins. According to the experimental data in FIG. 1, in humans, expression is shown in the eyes (retinoblastoma) and brain. If the disorder is characterized by a particular mutation in the protein, antibodies specific to the mutant protein can be used to assay for the presence of the particular mutant protein.
[0092]
Antibodies can also be used to assess the location of normal or abnormal organelles of cells in various tissues in vivo. According to the experimental data in FIG. 1, in humans, expression is shown in the eyes (retinoblastoma) and brain. Diagnostic uses can be applied not only to testing of genes, but also to monitoring therapies. Thus, if the treatment ultimately seeks to correct the expression levels, or the presence of abnormal sequences and abnormal tissue distribution, or the developmental expression, antibodies against the protein or related fragments directly may be used. Can be used to monitor the effectiveness of
[0093]
In addition, antibodies are useful for pharmacological analysis. Thus, antibodies prepared against polymorphic proteins can be used to identify individuals in need of therapy modification. Antibodies are also useful as diagnostic tools such as electrophoresis, isoelectric point, tryptic peptide digestion, immunological markers of abnormal proteins analyzed by other physical assays well known in the art. is there.
[0094]
Antibodies are also useful for tissue type classification. According to the experimental data in FIG. 1, in humans, expression is shown in the eyes (retinoblastoma) and brain. Thus, where a particular protein has been correlated with expression in a particular tissue, antibodies specific for that protein can be used to identify tissue types.
[0095]
Antibodies are also useful for inhibiting protein function, for example, blocking the binding of a kinase peptide to a binding partner such as a substrate. These uses can be applied in a therapeutic setting, in therapeutics involving protein function inhibition. Antibodies can be used, for example, to block modulation of peptide activity (agonization or antagonization) by blocking binding. Antibodies are prepared against specific fragments that contain the necessary sites for function, or against complete proteins that are associated with cells or cell membranes. FIG. 2 shows structural information on the protein of the present invention.
[0096]
The invention includes a kit that uses an antibody to detect the presence of a protein in a biological sample. The kit comprises a labeled or labelable antibody and a compound or reagent for detecting the protein in a biological sample, a means for determining the amount of protein in the sample; And a description of the use. Such kits can be provided to detect a single protein, or epitope, or can be configured to detect one of multiple epitopes, such as an antibody detection array. . As an array, a nucleic acid array is described later, and a similar method for an antibody array has been developed.
[0097]
Nucleic acid molecule
The present invention further provides nucleic acid molecules (cDNA, transcript and genomic sequences) encoding the kinase peptides or proteins of the present invention. Such a nucleic acid molecule comprises, consists essentially of or comprises a nucleic acid molecule encoding one of the kinase peptides of the invention, or allelic variants thereof, or orthologs or paralogs thereof.
[0098]
As used herein, an "isolated" nucleic acid molecule is one that has been separated from the presence of other nucleic acids in the natural source of the nucleic acid. Preferably, an "isolated" nucleic acid does not include sequences flanking the nucleic acid (i.e., sequences located at the 5 'and 3' ends) in the genomic DNA of the organism from which the nucleic acid is derived. However, there are several flanking nucleotide sequences, such as, for example, about 5 KB, 4 KB, 3 KB, 2 KB or especially lKB or more, especially flanking peptides encoded by the sequence, but depending on the sequence of the same gene. The encoded peptides are separated by introns in the genomic sequence. The important point is that the nucleic acid is so remote that it can be subjected to certain manipulations as described herein, such as recombinant expression, preparation of probes and primers, other uses for nucleic acid sequences, etc. Is that it is separated from the minor aspects of the sequence.
[0099]
In addition, "isolated" nucleic acid molecules, such as, for example, transcribed / cDNA molecules, can be obtained from other cellular materials, media if produced by recombinant techniques, or precursors or other forms if chemically synthesized. It is substantially free of chemicals. However, the nucleic acid molecule can be fused to other coding or regulatory sequences, which are considered isolated.
[0100]
For example, a recombinant DNA molecule contained in a vector is considered isolated. Further, examples of isolated DNA molecules are retained in heterologous host cells or in purified (partially or substantially) DNA molecules in solution. Isolated RNA molecule includes in vivo or in vitro transcribed RNA of the isolated DNA molecule of the present invention. Nucleic acid molecules isolated according to the present invention further include molecules that are synthetically produced.
[0101]
Therefore, the present invention provides a nucleic acid molecule consisting of the nucleotide sequence shown in FIG. 1 or 3 (SEQ ID NO: 1, transcript sequence, and SEQ ID NO: 3, genomic sequence), or FIG. 2 (SEQ ID NO: 2). The present invention provides a nucleic acid molecule encoding the protein described in (1). A nucleic acid molecule consists of a nucleotide sequence when the nucleotide sequence is the complete nucleotide sequence of the nucleic acid molecule.
[0102]
The present invention further provides a nucleic acid molecule consisting essentially of the nucleotide sequence shown in Figure 1 or 3 (SEQ ID NO: 1, transcript sequence, and SEQ ID NO: 3, genomic sequence), or Figure 2 (SEQ ID NO: 1). : 2) A nucleic acid molecule encoding the protein shown in 2). When such a nucleotide sequence is present with negligible additional amino residues in the final nucleic acid molecule, the nucleic acid molecule consists essentially of the nucleotide sequence.
[0103]
The invention further provides a nucleic acid molecule comprising the nucleotide sequence shown in FIG. 1 or 3 (SEQ ID NO: 1, transcript sequence and SEQ ID NO: 3, genomic sequence), or FIG. 2 (SEQ ID NO: 2). The present invention provides a nucleic acid molecule encoding the protein shown in (1). A nucleic acid molecule comprises a nucleotide sequence if at least a portion of the nucleic acid molecule in the final nucleic acid sequence is this nucleic acid sequence. According to this, a nucleic acid molecule can have its nucleotide sequence alone or additional nucleic acid residues, such as a nucleic acid sequence with respect to nature, or a heterologous nucleic acid sequence. Such nucleic acid molecules can have very few additional nucleotides, or can contain hundreds or more additional nucleotides. Methods for easily producing / isolating these various types of nucleic acid molecules are briefly described below.
[0104]
Figures 1 and 3 show both coded and non-coded sequences. Because of the source of the present invention, the human genomic sequence (FIG. 3) and the cDNA / transcript / sequence (FIG. 1), the nucleic acid molecules in the figure are genomic intron sequences, 5 ′ and 3 ′ non-coding sequences, Region and non-coding intergenic sequences. In general, the features of such an arrangement described in both FIGS. 1 and 3 can be readily ascertained using computational tools known in the art. As discussed below, some non-coding sites, particularly regulators of genes such as promoters, can be used to control heterologous gene expression, target various compounds, such as targets for identifying compounds that modulate gene activity. It is useful for the purpose and is particularly claimed as a fragment of the genomic sequence provided in the present invention.
[0105]
An isolated nucleic acid molecule may encode the mature protein and additional amino-terminal or carboxy-terminal amino groups, or amino groups within the mature peptide (eg, where the mature form has one or more peptide chains). it can. Such sequences may enhance protein transport, increase or decrease protein half-life, or increase the efficiency of manipulation during protein assay or production, or other events in the processing of a protein from precursor to mature form. Can play a role in Generally, in situ, additional amino acids are processed into mature proteins by cellular enzymes.
[0106]
As described above, an isolated nucleic acid molecule can be a sequence that alone encodes a kinase peptide, a sequence that encodes a mature peptide, and a major or minor sequence (eg, pre-pro, pro-protein). Sequences), but are not limited to additional coding sequences, plus additional non-coding sequences, such as introns and non-coding 5 'and 3' sequences. Such may be transcribed but not translated, and may or may not include those that play a role in transcription, mRNA processing (including splicing and polyadenylation), ribosome binding, and mRNA stability. In addition, nucleic acid molecules can be fused to markers of the encoded sequence, for example, to facilitate purification.
[0107]
An isolated nucleic acid molecule can be in the form of RNA, such as mRNA, or in the form of DNA, including cDNA and genomic DNA produced by cloning, chemical synthesis techniques, or a combination thereof. Nucleic acids, especially DNA, can be double-stranded or single-stranded. A single-stranded nucleic acid can be a coding strand (sense strand) or a non-coding strand (antisense strand).
[0108]
The present invention further provides nucleic acid molecules encoding obvious variants of the kinase proteins of the invention as described above, as well as nucleic acid molecules encoding fragments of the peptides of the invention. Such nucleic acid molecules can occur naturally, such as allelic variants (identical positions), paralogs (different positions) and orthologs (different organisms), or can be produced by recombinant DNA methods or chemical synthesis. Such non-naturally occurring variants can be generated by mutagenesis techniques applied to nucleic acid molecules, cells or organisms. Thus, as described above, variants include nucleotide substitutions, deletions, inversions, and insertions. Mutations can occur in either the coding, non-coding regions, or both. Mutations can occur in both conserved and non-conserved amino acid substitutions.
[0109]
The present invention further provides non-coding fragments of the nucleic acid molecules shown in FIGS. Suitable non-coding fragments include, but are not limited to, a promoter sequence, enhancer sequence, gene modulation sequence, gene termination sequence. Such fragments are useful in the development of screens to control heterologous gene expression and identify gene modulators. Promoters that are 5 'to the ATG start site in the genomic sequence of FIG. It is easily confirmed.
[0110]
Fragments contain 12 or more adjacent nucleotide sequences. Further, fragments can be at least 30, 40, 50, 100, 250, or 500 nucleotides in length. The length of the fragment is based on its use. For example, fragments can encode the epitope result regions of the peptide, or are useful as DNA probes and primers. Such fragments can be isolated using known nucleotide sequences for synthesizing oligonucleotide probes. The labeled probe can be used for cDNA library, genomic DNA library, or mRNA screening to isolate the nucleic acid corresponding to the coding region. In addition, primers can be used in PCR reactions to clone specific regions of the gene.
[0111]
Typical probe primers include substantially purified oligonucleotides or oligonucleotide pairs. Oligonucleotides generally comprise a nucleotide sequence region that is hybridized under stringency to at least 12, 20, 25, 40, 50 or more contiguous nucleotides.
[0112]
Orthologs, homologs, and allelic variants can be identified using methods well known in the art. As noted in the peptide section, these variants include the nucleotide sequence encoding the peptide, and typically comprise 60-70% of the nucleotide sequence shown in the figures, or a fragment of this sequence. , 70-80%, 80-90%, more typically at least 90-95% or more. Such nucleic acid molecules can be readily identified as being capable of hybridizing to the nucleotide sequence shown in the figures, or a fragment of this sequence, under moderate to stringent conditions. Allelic variants can be readily determined at the genetic location of the encoding gene. As shown in the data presented in FIG. 3, the gene encoding the novel human kinase protein of the present invention is located on the public BAC AC005940 known to be present on human chromosome 17. I have.
[0113]
FIG. 3 shows information on SNPs found in the gene encoding the novel human kinase protein of the present invention. SNPs were identified in introns and at 34 different base positions in the 5 'and 3' regions of the ORF. These include the non-synonymous cSNP at position 16135 and the two SNPs at the 5 'end of the ORF (positions 2082 and 2748) that may affect the control / regulation area. Changes in the amino acid sequence caused by the SNP of G16135A are shown in FIG. 3 and can be easily confirmed by the universal gene code and the protein sequence shown as a reference in FIG.
[0114]
As used herein, the term "hybridizes under stringent conditions" means that the nucleotide sequences encoding the peptides that remain hybridized to each other and have at least 60-70% homology to each other. It means the conditions under which hybridization and washing are performed to the extent that they have. Under these conditions, at least about 60%, at least about 70%, at least about 80% or more of the hybridized sequence remains. Such stringent conditions are well known to those skilled in the art, and are described in Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NJ. Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. It is described in. One example of stringent hybridization conditions is hybridization at about 45 ° C in 6X sodium chloride / sodium citrate (SSC), followed by 50-65 ° C in 0.2X SSC, 0.1% SDS. Wash. Examples of moderate, low stringency hybridization conditions are well known to those skilled in the art.
[0115]
Use of nucleic acid molecules
The nucleic acid molecules of the invention are useful in probes, primers, chemical synthesis intermediates, and biological assays. Nucleic acid molecules may be used to isolate full-length cDNAs and genomic clones encoding the peptides shown in FIG. ) Is useful as a hybridization probe for messenger RNA, transcript / cDNA, and genomic DNA to isolate genomic clones corresponding to). As shown in FIG. 3, SNPs were identified at 34 different base positions.
[0116]
A probe can correspond to any sequence in the entire length of the nucleic acid molecule shown in the figure. Thus, it can be derived from a 5 'non-coding region, a coding region, and a 3' non-coding region. However, as already mentioned, fragments are deemed not to include fragments published prior to the present invention.
[0117]
Nucleic acid molecules are also useful as PCR probes to amplify any region of the nucleic acid molecule and in the synthesis of antisense molecules of the required length and sequence.
[0118]
Nucleic acid molecules are also useful for producing recombinant vectors. Such vectors include expression vectors that express part or all of the peptide sequence. Vectors also include insertion vectors, which are integrated into other nucleic acid molecules and used to alter the in situ expression of genes and / or gene products, for example, in the genome of a cell. For example, an endogenous coding sequence can be replaced through homologous recombination with some or all of the coding region containing one or more specifically introduced mutations.
[0119]
Nucleic acid molecules are also useful for expressing the antigenic portion of a protein.
[0120]
Nucleic acid molecules are also useful as probes for determining the chromosomal location of nucleic acid molecules by in situ hybridization methods. As shown in the data presented in FIG. 3, the gene encoding the novel human kinase protein of the present invention is located on the public BAC AC005940 known to be present on human chromosome 17. I have.
[0121]
The nucleic acid molecule is also useful for producing a vector containing the gene regulatory region of the nucleic acid molecule of the present invention.
[0122]
Nucleic acid molecules are also useful in designing ribozymes corresponding to some or all of the mRNA produced from the nucleic acid molecules described herein.
[0123]
Nucleic acid molecules are also useful for the production of vectors expressing part or all of a peptide.
[0124]
Nucleic acid molecules are also useful for the production of host cells expressing some or all of the nucleic acid molecules and peptides.
[0125]
Nucleic acid molecules are also useful for the production of transgenic animals expressing some or all of the nucleic acid molecules and peptides.
[0126]
Nucleic acid molecules are also useful as hybridization probes to determine the presence, level, morphology, and distribution of nucleic acid expression. As shown in the experimental data of FIG. 1, the kinase protein of the present invention is expressed in eyes (retinoblastoma) and brain in humans. In particular, substantial Northern blot analysis shows expression in retinoblastoma and tissue screening panels using PCR show expression in brain. Thus, the probe can be used to determine the presence or amount of a particular nucleic acid molecule in cells, tissues, and organs. Quantitative nucleic acids include DNA and RNA. Accordingly, probes corresponding to the peptides described herein can be used to evaluate expression and / or gene copy number in a given cell, tissue, or organ. These uses are suitable for diagnosing abnormalities in kinase proteins that are elevated or decreased compared to normal values.
[0127]
In vitro techniques for detecting mRNA include Northern blot hybridization and in situ hybridization. In vitro techniques for detecting DNA include Southern blot hybridizations and in situ hybridizations.
[0128]
The probe may be a cell expressing a kinase protein by measuring the amount of a nucleic acid encoding a kinase in a sample cell such as mRNA or genomic DNA, or confirming whether the kinase gene is mutated, or It can be used as part of a diagnostic kit to identify tissue. As shown in the experimental data of FIG. 1, the kinase protein of the present invention is expressed in eyes (retinoblastoma) and brain in humans. In particular, substantial Northern blot analysis shows expression in retinoblastoma and tissue screening panels using PCR show expression in brain.
[0129]
Nucleic acid expression assays are useful for drug screening to identify compounds that alter the nucleic acid expression of a kinase.
[0130]
The present invention provides methods for identifying compounds for use in treating nucleic acid expression of a kinase gene, particularly disorders associated with biological and pathological processes that mediate kinases in cells and tissues. According to the experimental data in FIG. 1, in humans, expression is shown in the eyes (retinoblastoma) and brain. This method typically involves assaying for the ability of the compound to modulate the expression of a kinase nucleic acid, and then identifying a compound that can be used to treat a disorder characterized by unwanted kinase nucleic acid expression. . This assay can be performed in cell-based and cell-free systems. Cell-based assays include cells that naturally express the kinase nucleic acid or recombinant cells that are designed to express a particular nucleic acid sequence.
[0131]
Assays for kinase nucleic acid expression involve, for example, nucleic acid levels, such as mRNA levels, or direct assays for secondary compounds involved in signal pathways. In addition, the expression of genes that increase or decrease responsiveness in the kinase protein signaling pathway is also assayed. By way of example, the regulatory regions of these genes can be linked to a reporter gene such as luciferase.
[0132]
Thus, modulators of kinase gene expression can be identified by methods of contacting cells with a candidate compound and determining mRNA expression. The level of expression of the kinase mRNA in the presence of the candidate compound is compared to the level of expression of the kinase mRNA in the absence of the candidate compound. Based on this comparison, candidate compounds are identified as modulators of nucleic acid expression and can be used, for example, in treating disorders characterized by abnormal nucleic acid expression. If the expression of mRNA in the presence of the candidate compound is statistically significantly greater than in the absence, the candidate compound is identified as a stimulator of nucleic acid expression. A candidate compound is identified as an inhibitor of nucleic acid expression if the expression of mRNA in the presence of the candidate compound is statistically significantly less than that in the absence.
[0133]
The present invention further provides a therapeutic method using, as a target, a compound identified through drug screening as a gene modulator that modulates kinase nucleic acid expression in kinase-expressing cells and tissues. As shown in the experimental data of FIG. 1, the kinase protein of the present invention is expressed in eyes (retinoblastoma) and brain in humans. In particular, substantial Northern blot analysis shows expression in retinoblastoma and tissue screening panels using PCR show expression in brain. Modulation includes both up-regulation (eg, activation or agonisation), down-regulation (suppression or antagonisation), or nucleic acid expression.
[0134]
Alternatively, a modulator of kinase nucleic acid expression may be an agent identified using the screening assays described herein, as long as the agent or small molecule inhibits kinase expression in cells or tissues expressing the protein. Or it can be a small molecule. According to the experimental data in FIG. 1, in humans, expression is shown in the eyes (retinoblastoma) and brain.
[0135]
Nucleic acid molecules are also useful in clinical trials or therapeutic methods to monitor the effects of modulatory compounds on kinase gene expression and activity. Thus, gene expression patterns can be a barometer of continuous efficacy in treatment with compounds, especially compounds that enhance patient tolerance. Gene expression patterns can also be markers that indicate the physiological response of cells to the compound. Thus, such monitoring can result in increased doses of the compound or administration of alternative compounds to which the patient is not resistant. Similarly, if the level of nucleic acid expression is reduced to a desired level, administration of the compound can be reduced proportionately.
[0136]
Nucleic acid molecules are also useful in diagnostic assays for qualitative changes in kinase nucleic acid expression, particularly qualitative changes leading to disease. Nucleic acid molecules are useful for detecting kinase genes, such as mRNA, and mutations in gene expression products. Can be used. The nucleic acid molecule can be used as a hybridization probe to detect a naturally occurring gene mutation in the kinase gene and determine whether the subject with the mutation is at risk for the disorder caused by the mutation. Mutations can be deletions, additions, or substitutions of one or more nucleotides in a gene, chromosomal recombination such as inversion or transfer, modification of genomic DNA such as aberrant methylation patterns, or gene copy number such as amplification. Including changes. Detection of a variant of a kinase gene associated with a disorder provides a diagnostic tool for activity or sensitivity when the disease results from overexpression, underexpression, or mutated expression of a kinase protein.
[0137]
Individuals carrying a mutation in the kinase gene can be detected at the nucleic acid level by various techniques. FIG. 3 shows information on SNPs found in the gene encoding the novel human kinase protein of the present invention. SNPs were identified in introns and at 34 different base positions in the 5 'and 3' regions of the ORF. These include the non-synonymous cSNP at position 16135 and the two SNPs at the 5 'end of the ORF (positions 2082 and 2748) that may affect the control / regulation area. Changes in the amino acid sequence caused by the SNP of G16135A are shown in FIG. 3 and can be easily confirmed by the universal gene code and the protein sequence shown as a reference in FIG. As shown in the data presented in FIG. 3, the gene encoding the novel human kinase protein of the present invention is located on the public BAC AC005940 known to be present on human chromosome 17. I have. Genomic DNA can be analyzed directly or after pre-amplification using PCR. RNA or cDNA can be used in a similar manner. In some uses, the detection of the mutation may be by polymerase chain reaction (PCR), such as, for example, anchor PCR, RACE PCR (see, eg, US Patent Nos. 4,683,195 and 4,683,202) or Alternatively, in a ligation chain reaction (LCR) (see, for example, Landegran et al., Science 241: 1077-1080 (1988); and Nakazawa et al., PNAS 91: 360-364 (1994)). In connection with the use of probes / primers, the latter are particularly useful for identifying the location of mutations in genes (see Abravaya et al., Nucleic Acids Res. 23: 675-682 (1995)). The method involves collecting a cell sample from a patient, isolating nucleic acids (eg, genomic, mRNA, or both) from the cells of the sample, and hybridizing and amplifying the gene (if present). Contacting the nucleic acid with one or more primers specifically hybridized to the gene under possible conditions; detecting the presence of the amplification product or detecting the size of the amplification product; Comparing with the length of Deletions and insertions can be detected by comparing a change in the size of the amplified product to the normal genotype. Point mutations can be identified by hybridizing amplified DNA with normal RNA or antisense DNA sequences.
[0138]
Alternatively, mutations in the kinase gene can be identified directly, for example, by altering the restriction enzyme digestion pattern as determined by gel electrophoresis.
[0139]
In addition, sequence specific ribozymes (U.S. Patent No. 5,498,531) can be used to score the presence of specific mutations by growing or diminishing ribozyme cleavage sites. Perfectly matched sequences can be separated from mismatched sequences by nuclease cleavage digest assay or by differences in melting points.
[0140]
Sequence changes at specific positions can be assessed by RNase and S1 protection, or by nuclease protection assays such as chemical cleavage. Furthermore, sequence differences between the mutant kinase gene and the wild-type gene can be determined by direct DNA sequence analysis. A variety of automated sequence analysis tools are useful in performing diagnostic assays (Naeve, CW, (1995) Biotechniques 19: 448), including sequence analysis by mass spectrometry (eg, PCT International Publication). Cohen et al., Adv. Chromatogr. 36: 127-162 (1996); and Griffin et al., Appl. Biochem. Biotechnol. 38: 147-159 (1993). .
[0141]
Examples of other techniques for detecting mutations in genes include methods for protecting mismatched bases from RNA / RNA or RNA / DNA duplexes from cleavage reagents to detect mismatches (Myers et al., Science 230: 1242 (1985)); Cotton et al. , PNAS 85: 4397 (1988); Saleba et al. , Meth. Enzymol. 217: 286-295 (1992)), a method for comparing the electrophoretic mobilities of a mutant and a wild-type nucleic acid (Orita et al., PNAS 86: 2766 (1989); Cotton et al., Mutat. Res. 285) : 125-144 (1993); and Hayashi et al., Genet. Anal. Tech. Appl. 9: 73-79 (1992)), and mutants or wild in polyacrylamide gels containing denaturant gradients. A method for assaying the movement of fragments of a type using gradient gel electrophoresis (Myers et al., Nature 313: 495 (1985)). Examples of other techniques for detecting point mutations include selective oligonucleotide hybridization, selective amplification, and selective primer extension.
[0142]
Nucleic acid molecules are also useful in personal tests for genotypes that, although effective as therapeutics, do not necessarily cause disease. Thus, nucleic acid molecules can be used in studies of the correlation between an individual's genotype and the individual's response to the compound used for treatment (pharmacogenomic correlation). Thus, the nucleic acid molecules described herein can be used in evaluating an individual for a mutation in the kinase gene by selecting the appropriate compound and dosage for treatment. FIG. 3 shows information on SNPs found in the gene encoding the novel human kinase protein of the present invention. SNPs were identified in introns and at 34 different base positions in the 5 'and 3' regions of the ORF. These include the non-synonymous cSNP at position 16135 and the two SNPs at the 5 'end of the ORF (positions 2082 and 2748) that may affect the control / regulation area. Changes in the amino acid sequence caused by the SNP of G16135A are shown in FIG. 3 and can be easily confirmed by the universal gene code and the protein sequence shown as a reference in FIG.
[0143]
Thus, nucleic acid molecules that show therapeutic mutations provide diagnostic targets that can be used for Taylor therapy in an individual. Therefore, the production of recombinant cells and animals containing these polymorphisms allows for an effective clinical design for therapeutic compound and drug administration.
[0144]
Nucleic acid molecules are useful as antisense constructs for controlling kinase gene expression in cells, tissues, and organisms. The DNA antisense nucleic acid molecule is designed to be complementary to the site of the gene that is linked to transcription, thus preventing the production and transcription of the kinase protein. The antisense RNA or DNA nucleic acid molecule hybridizes to the mRNA, which blocks translation of the mRNA in the kinase protein.
[0145]
Alternatively, antisense molecules can be used to inactivate mRNA to reduce expression of a kinase nucleic acid. Thus, these molecules can be used in the treatment of disorders characterized by abnormal or unwanted expression of kinase nucleic acids. This technique involves cleavage by a ribozyme containing a nucleotide sequence complementary to one or more regions of the mRNA, such that the ability of the mRNA to be translated is reduced. Possible regions include coding regions, especially those corresponding to the catalytic activity of kinase proteins such as substrate binding and other functional activities.
[0146]
Nucleic acid molecules also provide vectors for gene therapy of patients with abnormal cells in kinase gene expression. Recombinant cells, including cells prepared ex vivo and returned to the patient, are introduced into the body of an individual, where they produce the kinase proteins required for treatment of the individual.
[0147]
The invention also includes kits using the antibodies to detect the presence of a kinase nucleic acid in a biological sample. As shown in the experimental data of FIG. 1, the kinase protein of the present invention is expressed in eyes (retinoblastoma) and brain in humans. In particular, substantial Northern blot analysis shows expression in retinoblastoma and tissue screening panels using PCR show expression in brain. For example, the kit comprises a labeled or labelable nucleic acid, or a reagent capable of detecting a kinase nucleic acid in a biological sample; a means for determining the amount of kinase nucleic acid in the sample; a standard sample Means for comparing the amount of the kinase nucleic acid. The compound or reagent can be enclosed in a suitable container. The kit can further include instructions for use as a kit for detecting kinase protein mRNA or DNA.
[0148]
Nucleic acid array
The present invention further provides nucleic acid detection kits, which are, for example, arrays or microarrays of nucleic acid molecules based on the sequence information shown in FIGS. 1 and 3 (SEQ ID NOs. 1, 3).
[0149]
As used herein, an "array" or "microarray" is synthesized on a substrate, such as paper, nylon or other membrane, filter, chip, glass slide, or other suitable solid support. An array of discrete polynucleotides or oligonucleotides. As one example, microarrays are disclosed in US Patent 5,837,832, Chee et al. , PCT application W095 / 11995 (Chee et al.), Lockhart, D .; J. et al. (1996; Nat. Biotech. 14: 1675-1680) and Schena, M .; et al. (1996; Proc. Natl. Acad. Sci. 93: 10614-10619), all of which are incorporated herein by reference. Alternatively, such arrays are described in Brown et al. , US Patent No. 5,807,522. It is manufactured by the method described in 1.
[0150]
The microarray or detection kit preferably comprises a large number of specific single-stranded nucleic acid sequences, usually either synthetic antisense oligonucleotides or cDNA fragments immobilized on a solid support. . The oligonucleotide is preferably about 6 to 60 nucleotides in length, more preferably 15 to 30 nucleotides in length, and most preferably 20 to 25 nucleotides in length. For certain types of microarrays or detection kits, it may be preferable to use only oligonucleotides of 7-20 nucleotides in length. The microarray or detection kit can include an oligonucleotide containing a known 5 'or 3' sequence, an oligonucleotide containing a full-length sequence, or a specific oligonucleotide selected from a specific region of sequence length. The polynucleotide used in the microarray or detection kit can be a gene or an oligonucleotide specific for the gene of interest.
[0151]
To produce oligonucleotides of known sequence in a microarray or detection kit, the gene of interest (or ORF identified according to the invention) is typically converted from the 5 ′ of the nucleic acid sequence using a computer algorithm. Start or end at 3 '. Typical algorithms identify oligomers defined to be gene-specific lengths, have GC components in a range suitable for hybridization, and have no secondary structure that would be expected to interfere with hybridization. Under certain conditions, it may be preferable to use a pair of oligonucleotides in a microarray or detection kit. Oligonucleotide "pairs" are preferably identical, except for one nucleotide located in the middle of the sequence. A second pair of oligonucleotides (mismatched with one) is used as a control. The number of oligonucleotide pairs is between 2 and 1 million. Oligomers are synthesized at designated areas on a substrate using a light-induced chemical process. The substrate is paper, nylon or other membrane, filter, chip, glass slide, or other suitable solid support.
[0152]
Oligonucleotides, on the other hand, are synthesized on the surface of a substrate using chemical coupling means and inkjet application equipment, as described in PCT application W095 / 251116 (Baldeshweiler et al.), All of which are referenced. Folded here. Alternatively, cDNA or oligonucleotides are bound onto the surface of a substrate using a vacuum system, heating, UV, mechanical or chemical binding steps, such that a "grid" array is a dot (or slot) blot. be able to. Arrays such as those described above are manufactured manually or using available equipment (slot blot or dot blot equipment), materials (suitable solid supports), and machinery (including robotic equipment). , 24, 96, 384, 1536, 6144 or more, or any other number of oligonucleotides between 2 and 1 million used effectively in commercially used equipment.
[0153]
To perform analysis of a sample using a microarray or a detection kit, RNA or DNA obtained from a biological sample is prepared in a hybridization probe. mRNA is isolated and cDNA is prepared and used as a template to prepare antisense RNA (aRNA). The aRNA is amplified in the presence of the fluorescent nucleotide, the labeled probe is incubated with the microarray or detection kit, and the sequence of the probe is hybridized with the complementary oligonucleotide in the microarray or detection kit. Culture conditions are adjusted so that hybridization can occur with complementary complementarity or various degrees of complementarity. After removing unhybridized probes, a scanner is used to determine the level and pattern of fluorescence. The scanned images are tested to determine the degree of complementarity and the relative amount of each oligonucleotide sequence on the microarray or detection kit. Biological samples are obtained from bodily fluids (eg, blood, urine, saliva, sputum, gastric juice, etc.), cultured cells, biopsies, or other tissue preparations. The detection system is used to simultaneously measure the presence, absence, and amount of hybridization in all different sequences. This data is used to study large-scale correlations, such as sequences, expression patterns, mutations, variants, or polymorphisms, in a sample.
[0154]
The present invention provides a method for identifying expression of the kinase protein / peptide of the present invention using such an array. In particular, such methods include culturing the test sample with one or more nucleic acid molecules and assaying for binding of the components in the test sample to the nucleic acid molecules. Such an assay involves an array comprising a number of genes, at least one of which is an allelic variant of a gene of the invention and / or a kinase gene of the invention. FIG. 3 shows information on SNPs found in the gene encoding the novel human kinase protein of the present invention. SNPs were identified in introns and at 34 different base positions in the 5 'and 3' regions of the ORF. These include the non-synonymous cSNP at position 16135 and the two SNPs at the 5 'end of the ORF (positions 2082 and 2748) that may affect the control / regulation area. Changes in the amino acid sequence caused by the SNP of G16135A are shown in FIG. 3 and can be easily confirmed by the universal gene code and the protein sequence shown as a reference in FIG.
[0155]
Conditions for incubation of nucleic acid molecules with test samples vary. Incubation conditions will depend on the type of assay used, the detection method used, and the type and nature of the nucleic acid molecule used in the assay. Those of skill in the art, who are aware of commonly available hybridization, amplification, or array assay formats, will readily be able to make use of the novel fragments of the human genome described herein. Examples of such assays are described in Chard, T, An Introduction to Radioimmunoassay and Related Technologies, Elsevier Science Publishers, Amsterdam, The Netherlands, The Netherlands, 19th. R. et al. , Technologies in Immunochemistry, Academic Press, Orlando, FL Vol. 1 (1982), Vol. 2 (1983), Vol. 3 (1985); Tijssen, P .; , Practice and Theory of Enzyme Immunoassays, described in Laboratory Technologies in Biochemistry and Molecular Biotechnology, Elsevier Science Education, Elsevier Science University, Elsevier Science, 85.
[0156]
The test samples of the present invention include cells, proteins, and membrane extracts from cells. The test sample used in the above methods will vary based on the format of the assay, the nature of the detection method, and the tissue, cells, or extracts thereof used as the sample for the assay. Preparation of nucleic acid extracts or cell extracts is well known to those skilled in the art and can be readily applied by obtaining a sample that is compatible with the system used.
[0157]
As another example of the present invention, there is provided a kit including the reagents necessary for performing the assay of the present invention.
[0158]
In particular, the present invention provides (a) a first container containing one or more nucleic acid molecules capable of binding to a fragment of the human genome described herein, (b) one or more washing reagents, detecting bound nucleic acid. And at least one other container containing a reagent capable of performing the above method.
[0159]
In particular, compartmentalized kits include kits where the reagents are contained in separate containers. Such containers include small glass containers, plastic containers, strips of plastic, glass or paper, or array materials such as silicon dioxide. Such containers can efficiently transfer reagents from one compartment to another so that the sample and reagents do not mix and contaminate, and the reagents or solutions in each container can be transferred to other containers. Can be added quantitatively. Such containers include a container for holding a test sample, a container containing a nucleic acid probe, a container containing a washing reagent (eg, phosphate buffer, Tris-buffer, etc.), and a reagent used for detecting a bound probe. Including a container. A person skilled in the art can recognize the conventionally unknown kinase gene according to the present invention and routinely confirm it using the sequence information disclosed herein, and further recognize this by using an established kit format well known to those skilled in the art. In particular, it can be used by being incorporated into an expression array.
[0160]
Vector / host cell
The invention also provides a vector comprising a nucleic acid molecule described herein. The term "vector" refers to a vehicle, preferably a nucleic acid molecule, capable of transporting a nucleic acid molecule. When the vector is a nucleic acid molecule, the nucleic acid molecule is covalently linked to the vector nucleic acid. Vectors in this aspect of the invention include plasmids, single or double stranded phage, single or double stranded viral vectors, or artificial chromosomes such as BAC, PAC, YAC, ORMAC.
[0161]
The vector is maintained as an extrachromosomal component in the host cell, where it replicates and produces additional copies of the nucleic acid molecule. Alternatively, the vector integrates into the genome of the host cell, producing additional copies of the nucleic acid molecule upon replication of the host cell.
[0162]
The present invention provides a vector for repairing a nucleic acid molecule (cloning vector) or a vector for expressing a nucleic acid molecule (expression vector). This vector can function in prokaryotic or eukaryotic cells, or both (shuttle vectors).
[0163]
Expression vectors contain a cis-acting regulatory region capable of binding the nucleic acid molecule in the vector, which allows for transcription of the nucleic acid molecule in a host cell. The nucleic acid molecule can be introduced into a host cell separately from the nucleic acid molecule that affects transcription. Thus, the second nucleic acid molecule provides a trans-acting factor that interacts with a cis-regulatory control region that transduces the nucleic acid molecule from the vector. Alternatively, the trans-acting factor is provided by a host cell. Finally, trans-acting factors can be created from the vector itself. However, in some instances, transcription and / or translation of the nucleic acid molecule can occur in a cell-free system.
[0164]
The regulatory sequences of the nucleic acid molecules described herein can be linked including a promoter for transcription of the mRNA of interest. These include the left promoter from Pacteriophage λ, E. coli. lac, TRP and TAC promoters from E. coli, the early and late promoters from SV40, the very early promoter of CMV, the early and late promoters of adenovirus, and the LTR of retroviruses. However, the present invention is not limited to this.
[0165]
In addition to control regions that promote transcription, expression vectors can also include regions that regulate transcription, such as repressor binding sites and enhancers. Examples include the SV40 enhancer, the cytomegalovirus immediate-early enhancer, the polyoma enhancer, the adenovirus enhancer, and the retroviral LTR enhancer.
[0166]
In addition to including transcription initiation and control regions, the expression vector can also include sequences necessary for transcription termination in the transcription region, which is a ribosome binding site for transcription. Other expression regulation control components include start and stop codons, as well as polyadenylation signals. One skilled in the art will know many regulatory sequences useful in expression vectors. Such regulatory sequences are described, for example, in Sambrook et al. , Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd. ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, (1989).
[0167]
Various expression vectors can be used for expression of a nucleic acid molecule. Such vectors include chromosomal, episomal, viral-derived vectors, such as bacterial plasmids, bacteriophages, yeast episomes, yeast chromosomal components such as artificial yeast chromosomes, baculoviruses, pabopaviruses such as SV40. , Vaccinia virus, adenovirus, poxvirus, pseudovirus, and retrovirus. Vectors can also be derived from combinations of these sources, for example, plasmids, such as cosmids and phagemids, and bacteriophage genetic components. Suitable cloning and expression vectors for prokaryotic and eukaryotic host cells are described in Sambrook et al. , Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd. ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, (1989).
[0168]
In the regulatory sequences, expression as a constituent of one or more host cells (ie, tissue specificity) or direction in one or more cell types due to exogenous factors such as temperature, nutrient addition, or hormones or other ligands. It provides excellent expression. A variety of vectors that are constitutively and instructionally expressed in prokaryotic and eukaryotic host cells are well known to those of skill in the art.
[0169]
A nucleic acid molecule can be introduced into a vector nucleic acid by well-known methods. Usually, the final expressed DNA sequence is linked to the expression vector by cleavage of the DNA sequence with the expression vector and one or more restriction enzymes, and the fragments ligated together. Restriction enzyme digestion and ligation procedures are well known to those skilled in the art.
[0170]
Vectors containing the appropriate nucleic acid molecules can be introduced into appropriate host cells for propagation or expression using known techniques. Bacterial cells include E. coli. coli, Streptomyces, and Salmonella typhimurium, but are not limited thereto. Eukaryotic cells include, but are not limited to, yeast, insect cells such as Drosophila, animal cells such as COS and CHO cells, and plant cells.
[0171]
As described herein, expression of the peptide as a fusion protein is preferred. Therefore, the present invention provides a fusion vector capable of producing a peptide. The fusion vector can improve the expression and solubility of the recombinant protein, and can promote protein purification, for example, by the action of a ligand for affinity purification. A proteolytic cleavage site is introduced at the point of attachment to the fusion moiety, for which purpose the peptide of interest is ultimately separated from the fusion moiety. Proteolytic enzymes include, but are not limited to, Factor Xa, thrombin, enterokinase. Typical fusion expression vectors include pGEX (Smith et al., Gene 67: 31-40 (1988), in which each of glutathione S-transferase (GST), maltose E-binding protein, or protein A is fused to a target recombinant protein. )), PMAL (New England Biolabs, Beverly, Mass.) And pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ), but are not limited thereto. Suitable Directive Non-Fusion Examples of E. coli expression vectors include pTrc (Amann et al., Gene 69: 301-315 (1988)) and pET 11d (Studier et al., Gene Expression Technology: Methods in Medicine 90: 90-90). including.
[0172]
Expression of the recombinant protein can be maximized in host cells by providing a genetic background in the host cell that is capable of deficient in proteolytic cleavage of the recombinant protein (Gottesman, S., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 119-128). Alternatively, the sequence of the nucleic acid molecule of interest is, for example, E. coli. E. coli can be modified to be the codon used preferentially for a particular host cell (Wada et al., Nucleic Acids Res. 20: 2111-2118 (1992)).
[0173]
The nucleic acid molecule can also be expressed by an expression vector that acts in yeast. S. Examples of vectors expressed in yeasts such as cerevisiae include pYepSec1 (Baldari, et al., EMBO J. 6: 229-234 (1987)) and pMFa (Kurjan et al., Cell 30: 933-943). 1982)), pJRY88 (Schultz et al., Gene 54: 113-123 (1987)), and pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA).
[0174]
Nucleic acid molecules can also be expressed in insect cells, for example, using a baculovirus expression vector. Vectors used for expression of proteins in cultured insect cells (for example, Sf9 cells) include pAc series (Smith et al., Mol. Cell Biol. 3: 2156-2165 (1983)) and the pVL series (Lucklow). et al., Virology 170: 31-39 (1989)).
[0175]
In certain embodiments of the invention, the nucleic acid molecules described herein are expressed in mammalian cells using a mammalian expression vector. Examples of mammalian expression vectors include pCDM8 (Seed, B. Nature 329: 840 (1987)) and pMT2PC (Kaufman et al., EMBO J. 6: 187-195 (1987)).
[0176]
As the expression vectors listed here, only those that are useful for expressing a nucleic acid molecule and are well known as vectors that can be used by those skilled in the art are shown. Other vectors suitable for the maintenance propagation or expression of the nucleic acid molecules described herein are well known to those of skill in the art. These are described, for example, in Sambrook, J .; Fritsh, E .; F. , And Maniatis, T .; Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd, ed. , Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989.
[0177]
Vectors in which the nucleic acid sequences described herein have been reverse cloned into vectors are capable of binding to regulatory sequences that permit transcription of the antisense RNA, although the present invention also encompasses such vectors. It is. Thus, antisense transcription can produce all or part of the nucleic acid molecule sequences described herein, including both coding and non-coding regions. The expression of the antisense RNA corresponds to the above-mentioned parameters with respect to the expression of the sense RNA (regulatory sequence, constitutive or directed expression, tissue-specific expression).
[0178]
The present invention also relates to a recombinant host cell comprising the vector described herein. Host cells thus include prokaryotic cells, lower eukaryotic cells such as yeast, other eukaryotic cells such as insect cells, and higher eukaryotic cells such as mammalian cells.
[0179]
Recombinant host cells can be prepared by introducing vectors constructed as described herein into cells by techniques readily available to those of skill in the art. These include calcium phosphate transfection, DEAE dextran mediated transfection, cationic lipid mediated transfection, electroporation, transduction, infection, lipofection, and Sambrook, et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, and techniques such as Cold Spring Harbor, NY, and the like are described in 19th, Cold Spring Harbor, NY, and the like. It is not done.
[0180]
A host cell can contain one or more vectors. Thus, different nucleotide sequences can be introduced into different vectors of the same cell. Similarly, a nucleic acid molecule can be introduced alone or with other unrelated nucleic acid molecules, such as providing a trans-acting factor for an expression vector. When one or more vectors are introduced into a cell, the vectors can be introduced alone, together, or conjugated to a nucleic acid molecule vector.
[0181]
In the case of bacteriophage and viral vectors, these can be introduced into cells as encapsulated or encapsulated viruses by standard procedures of infection and transduction. Viral vectors can be replicable or replication defective. If the replication of the virus is defective, replication can occur in the host cell where the function complementing the defect is provided.
[0182]
Vectors generally include a selectable marker that allows for the selection of a subpopulation of cells containing the components of the recombinant vector. The marker can be included in the same vector containing the nucleic acid molecules described herein, or in a separate vector. Markers include tetracycline or ampicillin-resistance genes for prokaryotic host cells, and dihydrofolate reductase or neomycin resistance for eukaryotic host cells. However, markers that provide phenotypic trait selectivity are effective in each case.
[0183]
Mature proteins can be produced in bacteria, yeast, mammalian cells, and other cells under the control of appropriate regulatory sequences, but cell-free transcription and translation systems also include the DNA described herein. RNA derived from the construct can be used to produce these proteins.
[0184]
If secretion of the peptide is required, it is difficult to achieve within a multi-transmembrane domain containing a protein such as a kinase, and an appropriate secretion signal is incorporated into the vector. The signal sequence may be endogenous to these peptides or may be heterologous to the peptides.
[0185]
If the peptide is not secreted in the medium, typically in the case of a kinase, the protein can be isolated from the host cell by standard disruption procedures such as freeze-thawing, sonication, mechanical disruption, degradation reagents, etc. it can. The peptide can be purified by known purification methods, including ammonium sulfate precipitation, acid extraction, or anion or cation exchange chromatography, phosphocellulose chromatography, hydrophobic interaction chromatography, affinity chromatography, hydroxylapatite chromatography, lectin chromatography, or high performance liquid chromatography. It can be recovered and purified.
[0186]
It is also understood that depending on the host cell for the recombinant production of the peptide described herein, the peptide may have various glycosylation patterns and, if dependent on the cell, may be produced in bacteria without glycosylation. Is done. Furthermore, the peptide may in some cases initially contain a modified methionine as a result of a host-mediated process.
[0187]
Use of vectors and host cells
Recombinant host cells expressing the peptides described herein have a variety of uses. First, this cell is useful for producing a kinase protein or peptide which can be further purified to produce a required amount of a kinase protein or fragment. Therefore, host cells containing the expression vector are useful for peptide production.
[0188]
Host cells are useful in performing cell-based assays involving kinase proteins or kinase protein fragments, such as those described above, as well as other forms well known to those skilled in the art. Thus, recombinant host cells expressing native kinase proteins are useful for assaying compounds that stimulate or inhibit kinase protein function.
[0189]
Host cells are also useful for identifying functionally affected kinase protein variants. If the mutation occurs spontaneously and causes pathology, the host cell containing the mutation will not exhibit the effects of the native kinase protein, but will have the desired effect on the kinase protein mutant (eg, stimulate or inhibit function). It is useful for assaying compounds having
[0190]
Genetically engineered host cells can be further used to produce non-human transgenic animals. The transgenic animal is preferably a mammal, for example, a rodent such as a mouse or a mouse, wherein one or more cells contains the recombinant gene. A recombinant gene is exogenous DNA that is integrated into the genome of cells of a developing transgenic animal and remains in the genome of the mature animal in one or more cell types or tissues. These animals are useful for studying kinase protein function and for identifying and evaluating modulators of kinase protein activity. Other examples of transgenic animals include non-human primates, sheep, dogs, cows, goats, chickens, and amphibians.
[0191]
Genetically modified animals are introduced, for example, by microinjection, retroviral infection, by introducing nucleic acid molecules into male prokaryotic cells of fertilized oocytes, and the oocytes are grown in pseudopregnant female foster animals. It is made. Any kinase protein nucleotide sequence can be introduced as a recombinant gene into the genome of a non-human animal, such as a mouse.
[0192]
Any of the regulatory sequences or other sequences useful in expression vectors can form part of the recombinant gene sequence. This includes intron sequences and polyadenylation signals if not already included. The tissue-specific regulatory sequence can be linked to a recombinant gene for direct expression of the kinase protein in particular cells.
[0193]
Methods for producing transgenic animals through conception manipulation and microinjection, particularly using animals such as mice, have been generalized in the art and are described, for example, in US Pat. S. Patent Nos. 4,736,866 and 4,870,009, both by Leder et al. , U.S. S. Patent No. 4,873,191 by Wagner et al. and in Hogan, B .; , Manipulating the Mouse Embryo, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1986). Similar methods have been used for the production of other transgenic animals. The first transgenic animal can be identified based on the presence of the transgenic gene in the genome and / or the expression of the transgenic mRNA in animal tissues or cells. The original transgenic animal can then be used to breed additional animals that have the transgenic gene. Moreover, the transgenic animal having the transgenic gene can be bred to another transgenic animal having another transgenic gene. Genetically modified animals also include all animals or animal tissues produced using the homologous recombinant host cells described herein.
[0194]
In another example, non-human transgenic animals can be produced that include a selection system that provides for regulated expression of the recombinant gene. One example of such a system is the cre / loxP recombinase system of bacteriophage P1. A description of the cre / loxP recombinase system can be found, for example, in Lakso et al. PNAS 89: 6232-6236 (1992). Another example of a recombinase system is the S. recombinase system. cerevisiae FLP recombinase system (O'Gorman et al. Science 251: 1351-1355 (1991). When the cre / loxP recombinase system is used to regulate the expression of recombinant genes, cre recombinase is selected in animals. It is necessary that such an animal, for example, has a recombinant gene encoding a selected protein and the other encodes a recombinase. It is provided by mating two transgenic animals with the transgenic gene to form a "double" transgenic animal.
[0195]
Non-human transgenic animal clones described herein are also described in Wilmut, I .; et al. Nature 385: 810-813 (1997) and PCT International Publication Nos. It can be produced according to the method described in WO 97/07668 and WO 97/07669. Briefly, cells from transgenic animals, such as somatic cells, are isolated and removed from the growth cycle by G₀It can be guided to enter a phase. A quiescent cell can be fused to a denucleated oocyte of an animal of the same species as the quiescent cell isolate, for example, by use of an electrical pulse. The reconstituted oocytes are cultured to develop into morula or blasts and then transferred into pseudopregnant female foster animals. The offspring born from the female rearing animal will be a clone of an animal from which cells, for example, somatic cells have been isolated.
[0196]
Genetically modified animals, including recombinant cells expressing the peptides described herein, are useful for performing assays as described herein in an in vivo environment. Thus, various physiological factors present in vivo and affecting substrate binding, kinase protein activation, and signal transduction may not be revealed in in vitro cell-free or cell-based assays. Accordingly, they are useful for assaying non-human kinase protein functions in vivo, including the effects of certain mutant kinase proteins on substrate interactions, kinase protein function and substrate interactions, and the effects of chimeric kinase proteins. Is useful for providing transgenic animals. It is also possible to assess the effect of a null mutation, which is a mutation that substantially or completely eliminates one or more kinase protein functions.
[0197]
In this specification, all publications and patents mentioned above are incorporated herein by reference. Various modifications and variations of the described method and system will be apparent to those skilled in the art without departing from the scope and spirit of the invention. Although the invention has been described in connection with specific preferred embodiments, it should be understood that the invention as claimed should not be unduly limited to such specific embodiments. . Indeed, various modifications of the above described modes for carrying out the invention which are obvious to those skilled in molecular biology or related fields are intended to be within the scope of the following claims.
[Sequence list]
SEQUENCE LISTING

[Brief description of the drawings]
FIG.
FIG. 1 shows the nucleotide sequence of a cDNA molecule encoding the kinase protein of the present invention. (SEQ ID NO: 1). In addition, structural and functional information such as ATG initiation, termination, and tissue distribution are provided, where structural and functional information can be utilized that can readily determine the particular use of the invention based on this molecular sequence. . According to the experimental data in FIG. 1, in humans, expression is shown in the eyes (retinoblastoma) and brain.
FIG. 2
FIG. 2 shows the predicted amino acid sequences of the three kinases of the present invention (SEQ ID NO: 2). In addition, structural and functional information such as protein family, function, and alteration site is provided, where structural and functional information can be used that can readily determine a particular use of the invention based on this molecular sequence.
FIG. 3
FIG. 3 shows the genomic sequence of the gene encoding the kinase of the present invention. (SEQ ID NO: 3). In addition, structural and functional information such as intron / exon structure and promoter position is provided, where structural and functional information can be used that can readily determine the particular use of the invention based on this molecular sequence. As depicted in FIG. 3, SNPs were identified at 34 different base positions.

Claims

下記グループから選択されるアミノ酸配列から成る単離ペプチド。
（ａ）ＳＥＱＩＤＮＯ．２に示されるアミノ酸配列；
（ｂ）ＳＥＱＩＤＮＯ．２に示されるアミノ酸配列の対立変異体のアミノ酸配列であって、該対立変異体は、ＳＥＱＩＤＮＯＳ：１あるいは３に示される核酸分子の対向鎖に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズされる核酸分子によってコード化されたアミノ酸配列；
（ｃ）ＳＥＱＩＤＮＯ．２で示されるアミノ酸配列のオルトログのアミノ酸配列であって、該オルトログは、ＳＥＱＩＤＮＯＳ：１あるいは３に示される核酸分子の対向鎖に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズされる核酸分子によってコード化されたアミノ酸配列；及び
（ｄ）ＳＥＱＩＤＮＯ．２に示されるアミノ酸配列のフラグメントであって、該フラグメントは、少なくとも１０の隣接するアミノ酸を含むアミノ酸配列。An isolated peptide consisting of an amino acid sequence selected from the following group:
(A) SEQ ID NO. The amino acid sequence shown in 2;
(B) SEQ ID NO. 2. An amino acid sequence of an allelic variant of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, which hybridizes under stringent conditions to the opposite strand of the nucleic acid molecule shown in SEQ ID NO: 1 or 3. An amino acid sequence encoded by the nucleic acid molecule;
(C) SEQ ID NO. An ortholog of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 3, which is encoded by a nucleic acid molecule that hybridizes under stringent conditions to the opposite strand of the nucleic acid molecule represented by SEQ ID NOS: 1 or 3. (D) SEQ ID NO. 2. A fragment of the amino acid sequence shown in 2, wherein the fragment comprises at least 10 adjacent amino acids.

下記グループから選択されるアミノ酸配列を含む単離ペプチド。
（ａ）ＳＥＱＩＤＮＯ．２に示されるアミノ酸配列；
（ｂ）ＳＥＱＩＤＮＯ．２に示されるアミノ酸配列の対立変異体のアミノ酸配列であって、該対立変異体は、ＳＥＱＩＤＮＯＳ：１あるいは３に示される核酸分子の対向鎖に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズされる核酸分子によってコード化されたアミノ酸配列；
（ｃ）ＳＥＱＩＤＮＯ．２に示されるアミノ酸配列のオルトログのアミノ酸配列であって、該オルトログは、ＳＥＱＩＤＮＯＳ：１あるいは３に示される核酸分子の対向鎖に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズされる核酸分子によってコード化されたアミノ酸配列；及び
（ｄ）ＳＥＱＩＤＮＯ．２に示されるアミノ酸配列のフラグメントであって、該フラグメントは、少なくとも１０の隣接するアミノ酸を含むアミノ酸配列。An isolated peptide comprising an amino acid sequence selected from the following group:
(A) SEQ ID NO. The amino acid sequence shown in 2;
(B) SEQ ID NO. 2. An amino acid sequence of an allelic variant of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, which hybridizes under stringent conditions to the opposite strand of the nucleic acid molecule shown in SEQ ID NO: 1 or 3. An amino acid sequence encoded by the nucleic acid molecule;
(C) SEQ ID NO. 2. An amino acid sequence of an ortholog of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, which is encoded by a nucleic acid molecule hybridized under stringent conditions to the opposite strand of the nucleic acid molecule shown in SEQ ID NOS: 1 or 3. (D) SEQ ID NO. 2. A fragment of the amino acid sequence shown in 2, wherein the fragment comprises at least 10 adjacent amino acids.

請求項２のペプチドに選択的に結合する単離抗体。An isolated antibody that selectively binds to the peptide of claim 2.

下記グループから選択されるヌクレオチド配列から成る単離核酸分子。
（ａ）ＳＥＱＩＤＮＯ．２に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；
（ｂ）ＳＥＱＩＤＮＯ．２に示されるアミノ酸配列の対立変異体のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列であって、該対立変異体は、ＳＥＱＩＤＮＯＳ：１あるいは３に示される核酸分子の対向鎖に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズされる核酸分子によってコード化されたヌクレオチド配列；
（ｃ）ＳＥＱＩＤＮＯ．２に示されるアミノ酸配列のオルトログのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列であって、該オルトログは、ＳＥＱＩＤＮＯＳ：１あるいは３に示される核酸分子の対向鎖に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズされる核酸分子によってコード化されたヌクレオチド配列；
（ｄ）ＳＥＱＩＤＮＯ．２に示されるアミノ酸配列のフラグメントをコードするヌクレオチド配列であって、該フラグメントは、少なくとも１０の隣接するアミノ酸を含むもの；及び
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列。An isolated nucleic acid molecule consisting of a nucleotide sequence selected from the following group:
(A) SEQ ID NO. A nucleotide sequence encoding the amino acid sequence shown in 2;
(B) SEQ ID NO. 2. A nucleotide sequence encoding an amino acid sequence of an allelic variant of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NOS: 1. A nucleotide sequence encoded by a nucleic acid molecule hybridized with;
(C) SEQ ID NO. 2. A nucleotide sequence encoding an amino acid sequence of an ortholog of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, which is hybridized under stringent conditions to the opposite strand of the nucleic acid molecule shown in SEQ ID NO: 1 or 3. A nucleotide sequence encoded by the nucleic acid molecule;
(D) SEQ ID NO. 2. A nucleotide sequence encoding a fragment of the amino acid sequence shown in 2, wherein the fragment comprises at least 10 contiguous amino acids; and (e) complementary to the nucleotide sequence of (a)-(d). Nucleotide sequence.

下記グループから選択されるヌクレオチド配列を含む単離核酸分子。
（ａ）ＳＥＱＩＤＮＯ．２に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；
（ｂ）ＳＥＱＩＤＮＯ．２に示されるアミノ酸配列の対立変異体のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列であって、該対立変異体は、ＳＥＱＩＤＮＯＳ：１あるいは３に示される核酸分子の対向鎖に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズされる核酸分子によってコード化されたヌクレオチド配列；
（ｃ）ＳＥＱＩＤＮＯ．２に示されるアミノ酸配列のオルトログのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列であって、該オルトログは、ＳＥＱＩＤＮＯＳ：１あるいは３に示される核酸分子の対向鎖に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズされる核酸分子によってコード化されたヌクレオチド配列；
（ｄ）ＳＥＱＩＤＮＯ．２に示されるアミノ酸配列のフラグメントをコードするヌクレオチド配列であって、該フラグメントは、少なくとも１０の隣接するアミノ酸を含むもの；及び
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列。An isolated nucleic acid molecule comprising a nucleotide sequence selected from the following group:
(A) SEQ ID NO. A nucleotide sequence encoding the amino acid sequence shown in 2;
(B) SEQ ID NO. 2. A nucleotide sequence encoding an amino acid sequence of an allelic variant of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NOS: 1. A nucleotide sequence encoded by a nucleic acid molecule hybridized with;
(C) SEQ ID NO. 2. A nucleotide sequence encoding an amino acid sequence of an ortholog of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, which is hybridized under stringent conditions to the opposite strand of the nucleic acid molecule shown in SEQ ID NO: 1 or 3. A nucleotide sequence encoded by the nucleic acid molecule;
(D) SEQ ID NO. 2. A nucleotide sequence encoding a fragment of the amino acid sequence shown in 2, wherein the fragment comprises at least 10 contiguous amino acids; and (e) complementary to the nucleotide sequence of (a)-(d). Nucleotide sequence.

請求項５の核酸分子を含む遺伝子チップ。A gene chip comprising the nucleic acid molecule according to claim 5.

請求項５の核酸分子を含むヒト以外の遺伝子組み換え動物。A non-human transgenic animal comprising the nucleic acid molecule of claim 5.

請求項５の核酸分子を含む核酸ベクター。A nucleic acid vector comprising the nucleic acid molecule of claim 5.

請求項８のベクターを含む宿主細胞。A host cell comprising the vector of claim 8.

請求項１記載の何れかのペプチドを製造する方法であって、（ａ）〜（ｄ）の何れかのアミノ酸配列をコード化するヌクレオチド配列を宿主細胞内に導入し、ペプチドがヌクレオチド配列から発現される条件かで宿主細胞を培養する方法。2. The method for producing a peptide according to claim 1, wherein a nucleotide sequence encoding any of the amino acid sequences (a) to (d) is introduced into a host cell, and the peptide is expressed from the nucleotide sequence. A method of culturing a host cell under the conditions to be performed.

請求項２記載の何れかのペプチドを製造する方法であって、（ａ）〜（ｄ）の何れかのアミノ酸配列をコード化するヌクレオチド配列を宿主細胞に導入し、ペプチドがヌクレオチド配列から発現される条件かで宿主細胞を培養する方法。3. The method for producing any peptide according to claim 2, wherein a nucleotide sequence encoding any of the amino acid sequences (a) to (d) is introduced into a host cell, and the peptide is expressed from the nucleotide sequence. A method of culturing a host cell under conditions.

サンプル中における請求項２記載の何れかのペプチドの存在を検出する方法であって、サンプル中に該ペプチドの存在を特異的に検出する試薬とサンプルを接触させ、該ペプチドの存在を検出する方法。A method for detecting the presence of any of the peptides according to claim 2 in a sample, the method comprising contacting the sample with a reagent for specifically detecting the presence of the peptide in the sample, and detecting the presence of the peptide. .

サンプル中における請求項５記載の核酸分子の存在を検出する方法であって、ストリンジェントな条件下で該核酸分子にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドとサンプルを接触させ、サンプル中の該核酸分子とオリゴヌクレオチドが結合するかどうかを判定する方法。A method for detecting the presence of a nucleic acid molecule according to claim 5 in a sample, wherein the sample is contacted with an oligonucleotide that hybridizes to the nucleic acid molecule under stringent conditions, and the nucleic acid molecule and the oligonucleotide in the sample are contacted. How to determine if joins.

請求項２記載のペプチドのモジュレータを同定する方法であって、該ペプチドを試薬と接触させ、該試薬が該ペプチドの機能又は活性を変調したかどうかを判定する方法。3. A method of identifying a modulator of a peptide according to claim 2, wherein said peptide is contacted with a reagent to determine whether said reagent has modulated the function or activity of said peptide.

請求項１４の方法において、前記試薬は前記ペプチドを発現する発現ベクターを含む宿主細胞に対して与えられる方法。15. The method of claim 14, wherein the reagent is provided to a host cell containing an expression vector that expresses the peptide.

請求項２に記載の何れかのペプチドに結合する試薬の同定方法であって、ペプチドと試薬を接触させ、接触混合物中にペプチドと試薬とが結合した複合体が形成されるかどうかをアッセイする方法。The method for identifying a reagent that binds to any peptide according to claim 2, wherein the peptide is contacted with the reagent, and an assay is performed to determine whether a complex in which the peptide and the reagent are bound is formed in the contact mixture. Method.

請求項１６の方法により同定された試薬と、薬学的に許容可能なそれらの担体とを含む薬剤組成物。17. A pharmaceutical composition comprising a reagent identified by the method of claim 16 and a pharmaceutically acceptable carrier thereof.

ヒトキナーゼタンパク質により媒介される疾患又は症状を治療する方法であって、請求項１６記載の方法で同定された試薬を薬学的に有効な量、患者に投与する方法。17. A method for treating a disease or condition mediated by a human kinase protein, wherein the agent identified by the method of claim 16 is administered to a patient in a pharmaceutically effective amount.

請求項２に記載のペプチドの発現のモジュレータを同定する方法であって、該ペプチドを発現する細胞と試薬とを接触させ、該試薬が該ペプチドの発現を変調したかどうかを測定する方法。3. A method for identifying a modulator of the expression of a peptide according to claim 2, wherein the reagent is brought into contact with a cell that expresses the peptide to determine whether the reagent has modulated the expression of the peptide.

ＳＥＱＩＤＮＯ．２に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％の相同性を持つアミノ酸配列を有する単離ヒトキナーゼペプチド。SEQ ID NO. An isolated human kinase peptide having an amino acid sequence having at least 70% homology to the amino acid sequence shown in 2.

請求項２０のペプチドにおいて、ＳＥＱＩＤＮＯ．２に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の相同性を持つアミノ酸配列を有するペプチド。21. The peptide of claim 20, wherein SEQ ID NO. 2. A peptide having an amino acid sequence having at least 90% homology with the amino acid sequence shown in 2.

ヒトキナーゼペプチドをコード化している単離核酸分子であって、ＳＥＱＩＤＮＯＳ：１あるいは３に示される核酸分子と少なくとも８０％の相同性を有している核酸分子。An isolated nucleic acid molecule encoding a human kinase peptide, wherein the nucleic acid molecule has at least 80% homology with the nucleic acid molecule set forth in SEQ ID NOS: 1 or 3.

請求項２２の核酸分子において、ＳＥＱＩＤＮＯＳ：１あるいは３に示される核酸分子と少なくとも９０％の相同性を有している核酸分子。23. The nucleic acid molecule of claim 22, having at least 90% homology with the nucleic acid molecule set forth in SEQ ID NOS: 1 or 3.