JP2005500004A

JP2005500004A - Isolated human kinase protein, nucleic acid molecule encoding human kinase protein, and methods of use thereof

Info

Publication number: JP2005500004A
Application number: JP2002548100A
Authority: JP
Inventors: ミン−ホイウェイ; カールグェグラー; カレンエイ．ケチャム; ジェナディーブイ．マークロフ; フランチェスコバレンティナディ; エレンエム．ビースリー
Original assignee: PE Corp
Current assignee: Applied Biosystems Inc
Priority date: 2000-12-08
Filing date: 2001-12-06
Publication date: 2005-01-06
Also published as: AU2002239483A1; CA2430624A1; WO2002046382A3; WO2002046382A2; EP1414965A2

Abstract

本発明は、ヒトゲノム中の遺伝子によりコードされる、本発明のキナーゼペプチドのアミノ酸配列を提供するものである。本発明は、特に、単離ペプチド及び核酸分子、キナーゼペプチドのオルソログ及びパラログを同定する方法、ならびにキナーゼペプチドのモジュレータを同定する方法を提供するものである。The present invention provides the amino acid sequence of the kinase peptide of the present invention encoded by a gene in the human genome. The present invention specifically provides isolated peptides and nucleic acid molecules, methods for identifying orthologs and paralogs of kinase peptides, and methods for identifying modulators of kinase peptides.

Description

【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、MAP/細胞外シグナル調節キナーゼサブファミリーに関連するキナーゼタンパク質、組換えDNA分子、及びタンパク質の製造の分野に関する。本発明は、特に、タンパク質のリン酸化に影響を与える新規ペプチドおよびタンパク質、ならびにこれらのペプチドおよびタンパク質分子をコードする核酸分子を提供するものである。これら全てはヒトの治療用及び診断用の組成物、ならびに方法の開発に有用である。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
プロテインキナーゼ
キナーゼはタンパク質にリン酸基を付加することにより、様々な細胞の増殖、分化、及びシグナル伝達を調節する。シグナル伝達の制御異常は、炎症、癌、動脈硬化、及び乾癬等を含む様々な病態に関与していることが分かってきている。可逆的タンパク質リン酸化は、真核細胞の活性化を制御する主要な方法である。典型的な哺乳動物の細胞では、活性を有するタンパク質10,000個中で1,000個より多くがリン酸化を受けていると推測されている。活性化を制御する高エネルギーリン酸は通常、プロテインキナーゼによってアデノシン三リン酸分子(ATP)から特定のタンパク質に移され、またプロテインホスファターゼによってそのタンパク質から外される。リン酸化反応は、細胞外シグナル（ホルモン、神経伝達物質、成長因子、および分化因子など）、細胞周期チェックポイント、環境ストレス、または栄養性ストレスに反応して起こり、分子スイッチを入れることに類似している。そのスイッチがオンになると、代謝酵素、調節タンパク質、受容体、細胞骨格タンパク質、イオンチャンネルもしくはポンプ、または転写因子を適当なプロテインキナーゼが活性化する。
【０００３】
キナーゼにはこれまでに知られている最大のタンパク質群が含まれており、広範で多様な機能と特異性を有する酵素のスーパーファミリーである。キナーゼは普通、その基質、調節分子、または変異型が示すある種の表現型から名前が決定される。基質に基づいた場合、プロテインキナーゼをおおまかに、チロシン残基をリン酸化するキナーゼ（プロテインチロシンキナーゼ、PTK）とセリンまたはトレオニン残基をリン酸化するキナーゼ（セリン/トレオニンキナーゼ、STK）の2つの群に分類することができる。いくつかのプロテインキナーゼは両方の特異性を有し、トレオニン残基とチロシン残基をリン酸化する。ほとんど全てのキナーゼは、類似する250〜300アミノ酸の触媒ドメインを含む。サブドメインI〜IVを含むN末領域は、通常2葉構造に折りたたまれ、ATP（またはGTP）ドナー分子と結合し、方向付けられる。サブドメインVI A-XIを含むさらに大きなC末領域(lobe)は、タンパク質基質と結合し、ATPからのγリン酸をセリン、トレオニン、またはチロシン残基の水酸基に移す作業を実施する。サブドメインVは両領域にわたっている。
【０００４】
キナーゼドメインの一方の端に存在するか、またはキナーゼドメインのループに挿入されているアミノ酸配列（通常5〜100残基）の違いによって、キナーゼはファミリーに分類されることもある。これらの付加アミノ酸配列は、キナーゼの標的タンパク質を認識し、それと相互作用することでキナーゼごとの調節が可能になる。キナーゼドメインの一次構造は保存されており、11のサブドメインにさらに分類されうる。11のサブドメインは、それぞれのサブドメインの特徴となり、且つ高度に保存されている特定のアミノ酸残基およびモチーフ、またはアミノ酸パターンを含む(Hardie, G.およびHanks, S.、(1995)、「プロテインキナーゼの実際（The Protein Kinase Facts Books）」、第I巻:7-20 Academic Press、San Diego、Calif.)。
【０００５】
二次メッセンジャー依存性プロテインキナーゼは主に、サイクリックAMP（cAMP）、サイクリックGMP、イノシトール三リン酸、ホスファチジルイノシトール、3,4,5-三リン酸、サイクリックADPリボース、アラキドン酸、ジアシルグリセロール、及びカルシウム-カルモジュリンなどの二次メッセンジャーの作用を媒介する。サイクリックAMP依存性プロテインキナーゼ（PKA）はSTKファミリーの重要なメンバーである。サイクリックAMPは、これまで調べられた全ての原核生物および動物細胞におけるホルモン作用の細胞内媒介物である。このようなホルモンが誘導する細胞応答には、甲状腺ホルモン分泌、コルチゾール分泌、プロゲステロン分泌、グリコーゲン分解、骨吸収、及び心拍数と心筋収縮力の調節が挙げられる。PKAは全ての動物細胞中に存在し、これらの細胞の大部分においてサイクリックAMPの作用に関与していると考えられている。PKA発現異常は、癌、甲状腺障害、糖尿病、アテローム性動脈硬化症、及び心臓血管系疾患を含む様々な障害及び疾患に関与している (Isselbacher, K. J.ら、(1994)、「ハリソンの内科学の原理（Harrison's Principles of Internal Medicine）」、McGraw-Hill、New York、N.Y.、pp. 416-431、1887)。
【０００６】
カルシウム-カルモジュリン（CaM）依存性プロテインキナーゼもまたSTKファミリーのメンバーである。カルモジュリンは、カルシウムとの結合に応答して標的タンパク質に結合することにより、カルシウムで調節される多くの過程に介在するカルシウム受容体である。これらの過程における第一の標的タンパク質はCaM依存性プロテインキナーゼである。CaMキナーゼは平滑筋収縮（MLCキナーゼ）、グリコーゲン分解（ホスホリラーゼキナーゼ）、及び神経伝達（CaMキナーゼIおよびCaMキナーゼII）の調節に関与している。CaMキナーゼIは、神経伝達関連タンパク質シナプシンIおよびII、遺伝子転写調節因子CREB、ならびに嚢胞性線維症膜貫通調節タンパク質CFTRを含む様々な基質をリン酸化する (Haribabu, B.ら、(1995) EMBO Journal 14:3679-86)。CaM IIキナーゼは別の部位でシナプシンをリン酸化し、チロシン水酸化酵素をリン酸化し活性化することにより脳におけるカテコールアミンの合成を制御する。CaMキナーゼの多くは、CaMに結合することに加えてリン酸化によって活性化を受ける。このキナーゼは自己リン酸化をすることもあり、または「キナーゼカスケード」の一部として別のキナーゼによりリン酸化される場合もある。
【０００７】
別のリガンド活性化プロテインキナーゼとして、5'-AMP活性化プロテインキナーゼ（AMPK）がある (Gao, G.ら、(1996) J. Biol Chem. 15:8675-81)。哺乳類のAMPKは、アセチル-CoAカルボキシラーゼおよびヒドロキシメチルグルタリル-CoA還元酵素のリン酸化による脂肪酸およびステロール合成の調節因子であり、熱ショック、ならびにグルコースおよびATP欠乏などの細胞ストレスに対するこれらの経路の反応を媒介する。AMPKは触媒活性を有するアルファサブユニットと、触媒活性を有さないベータおよびガンマの2つのサブユニットを含むヘテロ3量体であり、後者はアルファサブユニットの活性を調節していると考えられている。AMPKのサブユニットは、脳、心臓、脾臓、及び肺などの脂質生成のない組織に、予想されていた以上に広範に分布する。この広範な分布から、脂質代謝調節以外の別の作用があることが示唆されている。
【０００８】
PRK（増殖関連キナーゼ）は血清/サイトカイン誘導性STKであり、ヒトの巨核球系細胞の細胞周期および細胞増殖の調節に関与する (Li, B.ら、(1996) J. Biol. Chem. 271:19402-8)。PRKは、細胞***に関与するSTKのポロ（ヒトのポロ遺伝子に由来する）ファミリーに関係する。PRKは肺腫瘍組織で発現が下方調節されており、これが正常組織で調節を解除されて発現することにより癌化トランスフォーメーションが引き起こされる癌原遺伝子である可能性が考えられる。
【０００９】
サイクリン依存性プロテインキナーゼ（CDK）は別の群のSTKであり、細胞周期を通じて細胞の発達を制御する。サイクリンは小型の調節タンパク質であり、CDKに結合し、その後、細胞***過程に関与する特定のタンパク質をリン酸化及び活性化することにより細胞周期の様々な過程を動かすような活性化の作用がある。CDKは活性化を受けるために多様な刺激を必要とする点で特有である。サイクリンの結合に加えて、CDKが活性化されるためには特定のトレオニン残基のリン酸化と特定のチロシン残基の脱リン酸化が必要とされる。
【００１０】
プロテインチロシンキナーゼ（PTK）は、標的タンパク質のチロシン残基を特異的にリン酸化し、膜貫通型の受容体型PTKと非膜貫通型の非受容体型PTKに分類されうる。膜貫通型プロテインチロシンキナーゼは、大部分の増殖因子の受容体である。増殖因子が受容体に結合すると、ATPからのリン酸基が受容体およびそれ以外の特定のタンパク質の特定のチロシン側の鎖に移される。受容体型PTKに関与する増殖因子（GF）には、上皮増殖因子、血小板由来増殖因子、線維芽細胞増殖因子、肝細胞増殖因子、インスリンおよびインスリン様増殖因子、神経増殖因子、血管内皮細胞増殖因子、ならびにマクロファージコロニー刺激因子が含まれる。
【００１１】
非受容体型PTKは膜貫通領域を欠いており、細胞表面受容体の細胞内領域と結合して複合体を形成する。このように非受容体型PTKを通じて機能を発揮する受容体には、サイトカイン受容体、ホルモン（成長ホルモンおよびプロラクチン）受容体、ならびにTリンパ球およびBリンパ球の抗原特異的受容体がある。
【００１２】
これらのPTKの多くが最初に同定されたのは、癌細胞中の変異癌遺伝子産物としてであり、癌細胞におけるPTKの活性化はもはや正常な細胞制御を行ってはいない。実際、これまでに知られている癌遺伝子の約1/3はPTKをコードしており、細胞トランスフォーメーション（腫瘍形成）にはしばしばチロシンリン酸化活性の上昇を伴うことはよく知られている (Carbonneau HおよびTonks NK (1992) Annu. Rev. Cell. Biol. 8:463-93)。すなわち、ある種の癌を制御するには、PTK活性の調節が重要な戦略になり得る。
【００１３】
細胞外シグナル調節キナーゼ (ERK)/ マイトジェン活性化プロテイン (MAP) キナーゼ
本発明で提供されるタンパク質は新規ヒトマイトジェン活性化プロテイン(MAP)キナーゼであり、細胞外シグナル調節キナーゼ(extracellular signal-regulated kinase：ERK)とも呼ばれる。MAPキナーゼはSTKファミリーのメンバーである。MAPキナーゼは膨大な細胞シグナル伝達経路を調節し、リン酸化カスケードを通じて細胞表面から核内へのシグナル伝達を介在する。これまでにいくつかのサブグループが同定されており、それぞれが異なる基質特異性を示し、異なる細胞外刺激に反応する (Egan, S. E.およびWeinberg、R. A. (1993) Nature 365：781-783)。MAPキナーゼシグナル伝達経路は、哺乳動物細胞および酵母にも存在する。哺乳動物の経路を活性化する細胞外刺激には、上皮増殖因子（EGF）、紫外線、高浸透圧培地、熱ショック、内毒素リポ多糖体（LPS）、ならびに腫瘍壊死因子（TNF）およびインターロイキン1（IL-1）などの前炎症性サイトカインが含まれる。MAPキナーゼの発現異常は、癌、炎症、免疫異常、ならびに増殖および発達に影響する疾患などの様々な病態に関係している。
【００１４】
MAPキナーゼは広範な細胞外シグナルにより活性化されること、トレオニンおよびチロシン残基が高度にリン酸化されていること、ならびに種間で高度に保存されていることから、膨大な生化学シグナルの統合の中心点である可能性が考えられている (Crewsら、Science 258：478-480, 1992)。
【００１５】
MEK1およびMEK2もERK/MAPキナーゼである。MEK1の構成的な活性化は細胞のトランスフォーメーションを引き起こし、それ故、MEK1は増殖性疾患の治療における理想的な薬物標的である。さらに、MEK1阻害により毒性副作用なしに結腸癌の増殖を80%まで減少させたという結果もある (Sebolt-Leopoldら、Nature Med. 5：810-816, 1999)。したがって、MEKおよびその他のERK/MAPキナーゼの阻害剤は、結腸癌をはじめとする癌に対する安全で効果的な治療薬として有用である。
【００１６】
本発明で提供されるERKタンパク質は、ERK7と高度に構造的類似性を示す。ERK7は血清枯渇細胞において構成的に活性化されている。この活性は、ERK7の核局在と増殖阻害機能を調節するC末端尾部の存在に依存している。それ故、ERK7は、その活性化、局在、及び機能の調節において、細胞外シグナルが介在する活性化よりも、むしろ自身のC末端尾部を介する相互作用が重要となることを特徴とする新規タイプのMAPキナーゼを示す(Abeら、Mol Cell Biol 1999 Feb；19(2)：1301-12)。
【００１７】
ERK/MAPキナーゼに関するさらに詳細な総説は、Crewsら、Science 258：478-480, 1992；Orthら、Science 285：1920-1923, 1999；Rampoldiら、Cytogenet. Cell Genet. 78：301-303, 1997；Ryanら、Nature 404：892-897, 2000；Sebolt-Leopoldら、Nature Med. 5：810-816, 1999；Segerら、FASEB J. 9：726-735, 1995；Segerら、J. Biol. Chem. 267：25628-25631, 1992；およびZhengら、J. Biol. Chem. 268：11435-11439, 1993を参照。
【００１８】
キナーゼタンパク質、特にMAP/細胞外シグナル調節キナーゼサブファミリーのメンバーは、薬剤作用と薬剤開発の主要な標的である。したがって、キナーゼタンパク質のこのサブファミリーに属するこれまでに知られていないメンバーを同定し、特徴付けることは、製薬開発の分野において価値のあることである。本発明は、MAP/細胞外シグナル調節キナーゼサブファミリーのメンバーと相同性を有するこれまでに未知のヒトキナーゼタンパク質を提供するという点で、当技術分野の状況を促進するものである。
【発明の開示】
【００１９】
発明の概要
本発明は、MAP/細胞外シグナル調節キナーゼサブファミリー、これらの対立遺伝子変異体、および他の哺乳類におけるこれらのオルソログに関係する、ヒトキナーゼペプチド及びタンパク質のアミノ酸配列同定の一部に基づいたものである。これらの特有のペプチド配列及びこれらのペプチドをコードする核酸配列は、ヒトの治療標的開発のためのモデルとして用いることができ、治療に用いるタンパク質の同定に役立ち、キナーゼを発現する細胞及び組織内でのキナーゼ活性を調節するヒトの治療薬の開発における標的となり得る。図1の実験データにより、ヒトにおいて喉頭、腎臓（成人および胎児）、膵臓、胎児の心臓、子宮、及び前立腺における発現が示されている。
【００２０】
発明の詳細な説明
概論
本発明は、ヒトゲノムの配列決定に基づいている。ヒトゲノムの配列決定及び構築に際して、配列情報を解析することによって、当技術分野においてキナーゼタンパク質、またはその一部であると同定及び特徴付けされ、またMAP/細胞外シグナル調節キナーゼサブファミリーに関連付けられるタンパク質/ペプチド/ドメインに対して構造及び/又は配列の相同性を有するペプチドをコードするヒトゲノムの未同定の断片が明らかになった。これらの配列を用いて、付加的なゲノム配列を構築、転写し、及び/又はcDNA配列を単離し、特徴付けた。この解析に基づき、本発明は、MAP/細胞外シグナル調節キナーゼサブファミリーに関連するヒトキナーゼペプチド及びタンパク質のアミノ酸配列、これらのキナーゼペプチド及びタンパク質をコードする転写配列、cDNA配列、及び/又はゲノム配列形態における核酸配列、核酸変異（対立遺伝子情報）、発現の組織分布、ならびに本発明のキナーゼに対して構造又は配列の相同性を有する、最も関連性の高い既知のタンパク質/ペプチド/ドメインに関する情報を提供するものである。
【００２１】
本発明において提供されるペプチドは、従来より未知であることに加えて、商業的に重要な製品及びサービスの開発にとって有用であるという能力に基づいて、選択され得る。特に、本発明のペプチドは、MAP/細胞外シグナル調節キナーゼサブファミリーにおける既知のキナーゼタンパク質に対して相同性及び/又は構造上の相関性を有し、ならびに発現パターンが観察されることに基づいて選択される。図1の実験データにより、ヒトにおいて喉頭、腎臓（成人および胎児）、膵臓、胎児の心臓、子宮、及び前立腺における発現が示されている。この技術は、このファミリーのタンパク質、及び本発明の遺伝子に類似した発現パターンを有するタンパク質の商業的な重要性を明確に確立するものである。本発明のペプチドについてのより特異的な性質、及びその使用については、本明細書、特に発明の背景、図面の注釈に記載され、及び/又は既知のMAP/細胞外シグナル調節キナーゼファミリーもしくはキナーゼタンパク質サブファミリーのそれぞれについては、当技術分野で周知である。
【００２２】
特定の態様
ペプチド分子
本発明は、キナーゼファミリーのタンパク質のメンバーであると同定されたタンパク質分子をコードする核酸配列を提供するものであり、これらはMAP/細胞外シグナル調節キナーゼサブファミリー(図2にタンパク質配列、図1に転写/cDNA配列、図3にゲノム配列を示す)に関連付けられる。図2にはペプチド配列が記載され、明らかな変異体、特に本明細書及び図3の情報を用いて同定される対立遺伝子変異体も記載されており、これらは、本明細書において、本発明のキナーゼペプチド、キナーゼペプチド、又は本発明のペプチド/タンパク質と呼ばれる。
【００２３】
本発明は、図2に示すキナーゼペプチド（図1の転写/cDNA、又は図3のゲノム配列に示される核酸分子によりコードされる）のアミノ酸配列からなる、または実質的になる、またはこれらを含む単離ペプチド及びタンパク質分子を提供するとともに、本技術に含まれ、作製および使用されるこれらのペプチドの全ての明らかな変異体を提供するものである。これらの変異体については、以下で詳述する。
【００２４】
本明細書で使用されているように、ペプチドが細胞物質を実質的に含まない、又は化学前駆物質もしくは他の化学物質を含まない場合に、ペプチドは「単離」または「精製」されたという。本発明のペプチドは、均一、又は他の純度になるまで精製することができる。精製のレベルは使用目的に基づくと考えられる。重要な性質は、調製物中に他の成分が多量に存在していたとしても、所望のペプチドの機能を発揮できるということである（単離核酸分子の性質については、後述する）。
【００２５】
いくつかの使用では、「実質的に細胞物質を含まない」とは、他のタンパク質（すなわち汚染タンパク質）を約30％（乾燥重量）未満、他のタンパク質を約20％未満、他のタンパク質を約10％未満、又は、他のタンパク質を約5％未満有するペプチド調製物を含む。ペプチドが組換えにより製造される場合、培地がタンパク質調製物の容量に対して20％未満の場合には、実質的に培地を含まないとすることができる。
【００２６】
「実質的に化学前駆物質又は他の化学物質を含まない」という用語は、合成に関与した化学前駆物質又は他の化学物質から分離されたペプチド調製物を含む。ある態様においては、「実質的に化学前駆物質又は他の化学物質を含まない」という用語は、化学前駆物質もしくは他の化学物質を約30％（乾燥重量）未満、化学前駆物質もしくは他の化学物質を約20％未満、化学前駆物質もしくは他の化学物質を約10％未満、又は化学前駆物質もしくは他の化学物質を約5％未満有するキナーゼペプチド調製物を含む。
【００２７】
単離キナーゼペプチドは、それを天然に発現する細胞、それを発現させるために変化させた（組換えられた）細胞から精製するか、又は、既知のタンパク質合成方法を用いて合成することができる。図1の実験データにより、ヒトにおいて喉頭、腎臓（成人および胎児）、膵臓、胎児の心臓、子宮、及び前立腺における発現が示されている。例えば、キナーゼペプチドをコードする核酸分子は、発現ベクター中にクローニングされ、さらにこの発現ベクターは宿主細胞に導入されて、タンパク質が宿主細胞内で発現する。その後、タンパク質は標準のタンパク質精製技術を用いた適当な精製スキームによって、細胞から単離することができる。これらの多くの技術については、以下で詳述する。
【００２８】
したがって、本発明は、図2に示されるアミノ酸配列 (配列番号：2)からなるタンパク質、例えば、図1に示される転写/cDNA核酸配列 (配列番号：1)及び図3に示されるゲノム配列 (配列番号：3)によりコードされるタンパク質を提供するものである。このようなタンパク質のアミノ酸配列を図2に示す。このようなタンパク質の最終的なアミノ酸配列がこのアミノ酸配列である場合、タンパク質はアミノ酸配列からなる。
【００２９】
本発明はさらに、図2に示されるアミノ酸配列 (配列番号：2)から実質的になるタンパク質、例えば、図1に示される転写/cDNA核酸配列 (配列番号：1)及び図3に示されるゲノム配列 (配列番号：3) によりコードされるタンパク質を提供するものである。このようなアミノ酸配列に数個の付加アミノ酸残基、例えば、最終的なタンパク質中に約1〜約100個程度の付加残基、一般的には1個〜約20個の付加残基が存在する場合、タンパク質はアミノ酸配列から実質的になる。
【００３０】
本発明はさらに、図2に示されるアミノ酸配列 (配列番号：2)を含むタンパク質、例えば、図1に示される転写/cDNA核酸配列 (配列番号：1) 及び図3に示されるゲノム配列 (配列番号：3) によりコードされるタンパク質を提供するものである。このアミノ酸配列が、タンパク質の最終的なアミノ酸配列の少なくとも一部である場合、タンパク質はアミノ酸配列を含む。このような場合、タンパク質はペプチドのみであるか、またはタンパク質と天然に結合しているアミノ酸残基（連続するコード配列）もしくは非相同アミノ酸残基/ペプチド配列のような付加アミノ酸分子を有することができる。このようなタンパク質は、数個の付加アミノ酸残基を有するか、又は数百もしくはそれ以上の付加アミノ酸を含むことができる。本発明のキナーゼペプチドが含まれるタンパク質の好ましい種として、天然の成熟タンパク質がある。これらの様々な種のタンパク質を調製/単離する方法について、以下に簡単に述べる。
【００３１】
本発明のキナーゼペプチドは、キメラ又は融合タンパク質を形成するために、非相同性の配列に結合することができる。このようなキメラ及び融合タンパク質は、キナーゼペプチドに対して実質的に相同性のないアミノ酸配列を有する非相同タンパク質に、機能的に結合されるキナーゼペプチドを含む。「機能的に結合される」とは、キナーゼペプチドと非相同タンパク質がフレーム中で融合していることを意味する。非相同タンパク質は、キナーゼペプチドのN末端又はC末端に融合されることができる。
【００３２】
いくつかの使用において、融合タンパク質は、キナーゼペプチド自体の活性に影響を及ぼさない。例えば、融合タンパク質には、βガラクトシダーゼ融合、酵母2-ハイブリッドGAL融合、ポリHis融合、MYC標識、HI標識及びIg融合などの酵素融合タンパク質が含まれるが、これらに限定されるものではない。このような融合タンパク質、特にポリHis融合は、組換えキナーゼペプチドの精製を容易にすることができる。ある種の宿主細胞（例えば哺乳類の宿主細胞）においては、タンパク質の発現及び/又は分泌は、非相同シグナル配列を用いることにより増加させることができる。
【００３３】
キメラ又は融合タンパク質は、標準の組換えDNA技術により製造することができる。例えば、異なるタンパク質配列をコードするDNA断片は、従来技術に従ってフレーム中に共に連結される。他の態様では、融合遺伝子は、自動DNA合成機を含む従来技術により合成することが可能である。あるいは、遺伝子断片のPCR増幅にアンカープライマーを用い、2つの連続的な遺伝子断片間に相補的な突出部を形成し、その後アニーリングし、再増幅して、キメラ遺伝子配列を作製することができる (Ausubelら、「分子生物学の最新プロトコール（Current Protocols in Molecular Biology）」、1992参照) 。さらに、既に融合部分（例えばGSTタンパク質）をコードした多くの発現ベクターが市販されている。キナーゼペプチドをコードした核酸を、融合部がフレーム中でキナーゼペプチドに結合するようにして、このような発現ベクター中にクローニングすることができる。
【００３４】
以上説明したように、本発明はまた、天然のペプチド成熟形態、ペプチドの対立遺伝子/配列変異体、非天然のペプチドの組換え誘導変異体、ならびにペプチドのオルソログ及びパラログなど、本発明のタンパク質のアミノ酸配列における明らかな変異体を提供、及び実施可能にするものである。このような変異体は、核酸組換え技術及びタンパク質生化学の分野で公知の技術を用いることにより、容易に生成することができる。しかし、当然のことながら、この変異体には、本発明以前に開示されているいずれのアミノ酸配列も含まれないものである。
【００３５】
このような変異体は、本明細書に示される分子技術及び配列情報を用いることにより、容易に同定/製造することが可能である。さらに、このような変異体は、本発明のキナーゼペプチドに対する配列及び/又は構造上の相同性に基づいて、他のペプチドと容易に区別することができる。この相同性/同一性の程度は、主に、ペプチドが機能的な変異体であるか非機能的な変異体であるか、パラログファミリー中に存在する相違量、及びオルソログ間の進化距離に基づいて判断される。
【００３６】
2つのアミノ酸配列、又は2つの核酸配列の同一性割合（％）を決定するために、最適な比較を行う目的で配列は整列される（例えば、最適なアライメントのために、ギャップが第一及び第二アミノ酸又は核酸配列の一方又は両方に導入され、非相同性配列は比較を行う目的のために無視することができる）。好ましい態様としては、基準配列の長さの少なくとも30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％又はそれ以上が、比較目的に応じて整列化される。その後、対応するアミノ酸の位置又はヌクレオチドの位置上のアミノ酸残基又はヌクレオチドが比較される。第一配列での位置が、第二配列において対応する位置と同じアミノ酸残基又はヌクレオチドによって占められている場合、分子はその位置と同一である（ここで用いられているアミノ酸又は核酸の「同一性」は、アミノ酸又は核酸の「相同性」と同等である）。2つの配列間の同一性割合（％）は、配列において共有される同一配置数の関数であり、ギャップ数及び各ギャップ長さを考慮し、ギャップは2つの配列の最適なアライメントのために導入される必要がある。
【００３７】
2つの配列間における、配列の比較ならびに同一性割合（％）および類似性割合（％）の決定は、数学的アルゴリズムを用いて行うことができる(「計算分子生物学（Computational Molecular Biology）」、Lesk, A.M.編、Oxford University Press、New York、1988;「バイオコンピューティング：情報学およびゲノムプロジェクト（Biocomputing: Informatics and Genome Projects）」、Smith, D.W.編、Academic Press、New York、1993;「配列データのコンピュータ解析、パート1（Computer Analysis of Sequence Data, Part 1）」、Griffin, A.M.,およびGriffin, H.G.編、Humana Press、New Jersey、1994;「分子生物学における配列解析（Sequence Analysis in Molecular Biology）」、von Heinje, G.、Academic Press、1987;ならびに「配列解析プライマー（Sequence Analysis Primer）」、Gribskov, M.およびDevereux, J.編、M Stockton Press、New York、1991)。好ましい態様として、2つのアミノ酸配列間の同一性割合（％）はGCGソフトウェアパッケージ（http://www.gcg.comで入手可能）のGAPプログラムに組み込まれたNeedleman及びWunschアルゴリズム（J. Mol. Biol. (48):444-453 (1970)）を用い、Blossom62マトリックス又はPAM250マトリックスのいずれか、ならびにギャップ重量16、14、12、10、8、6または4、及び長さ重量1、2、3、4、5または6を用いて決定される。さらに好ましい態様としては、2つのヌクレオチド配列間の同一性割合（％）は、GCGソフトウェアパッケージ（http://www.gcg.comで入手可能）のGAPプログラム (Devereux, J.,ら、(Nucleic Acids Res. 12(1) : 387 (1984))を用い、NWSgapdna.CMPマトリックス、ならびにギャップ重量40、50、60、70または80、及び長さ重量1、2、3、4、5または6を用いて決定される。他の態様としては、2つのアミノ酸又はヌクレオチド配列間の同一性割合（％）は、ALIGNプログラム（バージョン2.0）に組み込まれたE. Myers及びW. Millerのアルゴリズム (CABIOS、4:11-17 (1989))を用い、PAM120重量残基表、ギャップ長ペナルティ12、及びギャップペナルティ4を用いて決定される。
【００３８】
本発明の核酸及びタンパク質配列を、例えば他のファミリー又は関連した配列を同定するために、配列データベースに対して検索を行う「クエリー配列」としてさらに使用することができる。このような検索は、AltschulらのNBLAST、及びXBLASTプログラム（バージョン2.0）(J. Mol. Biol. 215:403-10 (1990))を用いて行うことができる。BLASTヌクレオチド検索は、本発明の核酸分子に相同性のあるヌクレオチド配列を得るために、NBLASTプログラムを用い、スコア（score）=100、ワード長（wordlength）=12で行うことができる。BLASTタンパク質検索は、本発明のタンパク質に相同性のあるアミノ酸配列を得るために、XBLASTプログラムを用い、スコア=50、ワード長=3で行うことができる。比較目的のギャップアライメントを得るために、Altschulらの記載のように、ギャップBLAST(Gapped BLAST)(Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402 (1997))を用いることができる。BLAST及びギャップBLASTプログラムを用いる際には、各プログラム（例えばXBLAST及びNBLAST）の既定のパラメータを用いることができる。
【００３９】
本発明のペプチドのうちの一つを含むタンパク質における、成熟プロセシングを受ける前の形態、およびプロセシングを受けた形態の全長は、本発明のキナーゼペプチドのうちの一つに対して完全な配列同一性を有し、本明細書により提供されるキナーゼペプチドと同じ遺伝子座によりコードされているものとして、容易に同定することができる。本発明で提供される遺伝子は、STSおよびBACのマップデータなどの様々な方面からの証拠に基づき、ヒト第8染色体にマッピングされたゲノム構成要素上に位置することが示されている（図3に示す）。
【００４０】
キナーゼペプチドの対立遺伝子変異体は、キナーゼペプチドの少なくとも一部に対して高度の（著しい）配列相同性/同一性を有するヒトタンパク質であり、同様に本明細書により提供されるキナーゼペプチドと同じ遺伝子座においてコードされるものとして、容易に同定することができる。遺伝子座は、基準となるヒトに対してマッピングされたゲノム配列のような、図3に示されるゲノム情報に基づいて容易に決定することができる。本発明で提供される遺伝子は、STSおよびBACのマップデータなどの様々な方面からの証拠に基づき、ヒト第8染色体にマッピングされたゲノム構成要素上に位置することが示されている（図3に示す）。本明細書において使用されるように、アミノ酸配列において、典型的には少なくとも約70〜80％、80〜90％、さらに典型的には少なくとも約90〜95％、又はそれ以上の相同性を有する場合、2つのタンパク質（又はタンパク質の領域）は著しい相同性を有している。本発明によれば、著しい相同性を有するアミノ酸配列は、より詳細には以下に述べられるようなストリンジェントな条件下で、キナーゼペプチドをコードする核酸分子とハイブリダイズする核酸配列によりコードされると考えられる。
【００４１】
図3に、本発明のキナーゼタンパク質をコードする遺伝子中に見出されたSNPについての情報が示される。同定されたのは以下の変異である；T1004G、G1822T、A2023G、A2562G、及びC6624A 。イントロン、及びORFの5'側のSNPは、制御/調節要素に影響を与える可能性がある。
【００４２】
キナーゼペプチドのパラログは、キナーゼペプチドの少なくとも一部に対して、ある程度の著しい配列相同性/同一性を有し、ヒト由来の遺伝子によってコードされ、且つ同様の活性又は機能を有しているものとして、容易に同定することができる。アミノ酸配列が、所与の領域又はドメインを通じて、典型的に少なくとも約60％またはそれ以上、さらに典型的には少なくとも約70％またはそれ以上の相同性を有する場合、2つのタンパク質は典型的にはパラログであると考えられる。このようなパラログは、より詳細には以下に述べられるような穏やかな条件からストリンジェントな条件下で、キナーゼペプチドをコードする核酸分子とハイブリダイズする核酸配列によりコードされると考えられる。
【００４３】
キナーゼペプチドのオルソログは、キナーゼペプチドの少なくとも一部に対してある程度の著しい配列相同性/同一性を有し、他の生物由来の遺伝子によってコードされているものとして、容易に同定することができる。好ましいオルソログは、哺乳類、好ましくは霊長類から単離され、ヒトの治療標的及び治療薬剤の開発のために用いられる。このようなオルソログは、より詳細には以下に述べられるような、穏やかな条件からストリンジェントな条件下で、キナーゼペプチドをコードする核酸分子とハイブリダイズするような核酸配列によりコードされると考えられ、これはタンパク質を生成する2つの生物の関連性の程度に依存する。
【００４４】
本発明のキナーゼペプチドの非天然の変異体は、組換え技術を用いて容易に生成することができる。このような変異体には、キナーゼペプチドのアミノ酸配列中における欠失、付加、及び置換によるものが含まれるが、これらに限定されるものではない。例えば、置換の1種として、保存的アミノ酸置換が挙げられる。この置換は、キナーゼペプチドにおける所与のアミノ酸が同様の特徴を持つ他のアミノ酸によって置換されるものである。保存的置換として典型的に見られるものには、脂肪族のアミノ酸Ala、Val、Leu及びIleの中の一つから他の一つへの置換、ヒドロキシル残基SerとThr間の置換、酸性残基AspとGluとの置換、アミド残基AsnとGln間の置換、塩基性残基LysとArgとの置換、ならびに芳香族残基PheとTyrとの置換がある。どのアミノ酸変化が表現型としてサイレントになる可能性を有するかに関する指針については、Bowieら、Science 247:1306-1310 (1990)に述べられている。
【００４５】
変異キナーゼペプチドは、完全に機能しているか、又は例えば基質結合能、基質リン酸化能、シグナル伝達調節能などの一つもしくは複数の活性において機能が欠失していることがある。完全に機能的な変異体には、典型的に、保存的な変異、又は致命的でない残基における変異もしくは致命的でない領域内での変異のみが含まれる。図2は、タンパク質分析の結果を示しており、致命的ドメイン/領域を同定するのに使用することができる。機能的変異体には、機能が変化しない、又は著しい機能変化の無い類似アミノ酸の置換も含まれるうる。他方、このような置換は、ある程度機能に対して正又は負の影響を及ぼすことがある。
【００４６】
非機能的変異体には、典型的に、1つもしくは複数の非保存的なアミノ酸の置換、欠失、挿入、反転もしくは切断、又は致命的な残基もしくは致命的な領域内での置換、挿入、反転もしくは欠失が含まれる。
【００４７】
機能において必須のアミノ酸は、例えば、特定部位の突然変異誘発、又はアラニンスキャニング突然変異誘発（Cunninghamら、Science 244:1081-1085 (1989)）等の当技術分野における既知の方法により、特に図2に示す結果を用いて同定することができる。アラニンスキャニング突然変異誘発では、分子内のすべての残基において、単独のアラニン突然変異を導入する。この結果生じた変異分子は、その後、キナーゼ活性のような生物活性、又はインビトロ増殖活性分析のようなアッセイのために試験される。結合対象/基質結合にとって重要な部位は、結晶化、核磁気共鳴、または光学的親和性標識等の構造解析によって決定される（Smithら、J. Mol. Biol. 224:899-904 (1992) ; de Vosら、Science 255:306-312 (1992) ）。
【００４８】
本発明はさらに、キナーゼペプチドの断片を提供し、このような断片を含む、及びこのような断片からなるタンパク質及びペプチドに加え、特に図2に同定された残基を含むタンパク質及びペプチドを提供するものである。しかしながら、本発明に関連する断片は、本発明より以前に公開されている断片を含むものとは見なされない。
【００４９】
本明細書で使用されるように、断片は、キナーゼペプチドの少なくとも8個、10個、12個、14個、16個又はそれ以上の連続するアミノ酸を含む。このような断片は、キナーゼペプチドの1つもしくは複数の生物活性を保持する能力に基づいて選択されるか、または基質との結合もしくは抗原としての作用等の機能を果たす能力によって選択され得る。特に重要な断片は生物活性断片であり、これは例えば、約8個又はそれ以上の長さのアミノ酸のペプチドである。このような断片は、典型的には、例えば活性部位、膜貫通ドメイン又は基質結合ドメインのような、キナーゼペプチドのドメイン又はモチーフを含むと考えられる。さらに、可能な断片としては、ドメイン又はモチーフ含有断片、可溶性ペプチド断片、免疫原性構造含有断片を含むが、これらに限定されるものではない。推定されるドメイン及び機能性部位は、当業者にとって容易に入手可能な公知のコンピュータプログラム（例えばPROSITE分析）により、容易に確認することができる。このような分析の1つによる結果を図2に示す。
【００５０】
ポリペプチドは、一般に、20天然アミノ酸と呼ばれている20種のアミノ酸以外のアミノ酸をしばしば含む。さらに、末端アミノ酸を含む多くのアミノ酸は、プロセシング及び他の翻訳後修飾等の天然の過程、又は当技術分野において公知の化学修飾技術によって修飾され得る。キナーゼペプチドにおいて天然に生じる一般的な修飾については、基本的なテキスト、詳細な文献及び研究論文に記述されており、これは当業者に周知である。（これらの特性のいくつかは図2において確認される）。
【００５１】
既知の修飾としては、アセチル化、アシル化、ADPリボシル化、アミド化、フラビンの共有結合付加、ヘム部分の共有結合付加、ヌクレオチド又はヌクレオチド誘導体の共有結合付加、脂質又は脂質誘導体の共有結合付加、ホスファチジルイノシトールの共有結合付加、架橋結合、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合架橋の形成、シスチンの形成、ピログルタミン酸塩の形成、ホルミル化、γ-カルボキシル化、グリコシル化、GPIアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニン化などのタンパク質へのアミノ酸の転写RNA媒介付加、及びユビキチン化を含むが、これらに限定されるものではない。
【００５２】
このような修飾は、当業者には周知であり、科学文献に非常に詳細に記載されてきた。グリコシル化、脂質付加、硫酸化、グルタミン酸残基のγ-カルボキシル化、ヒドロキシル化、及びADPリボシル化など、いくつかの特に一般的な修飾は、「タンパク質-構造と分子特性（Proteins - Structure and Molecular Properties）」、第2版、T.E. Creighton、W. H. Freeman and Company、New York (1993) のような多くの基本テキストに記載されている。この点に関する詳細な総説としては、Wold, F.、「タンパク質の翻訳後共有結合修飾（Posttranslational Covalent Modification of Proteins）」、B.C. Johnson編、Academic Press、New York 1-12 (1983); Seifterら、(Meth. Enzymol. 182: 626-646 (1990))およびRattanら、(Ann. N.Y. Acad. Sci. 663:48-62 (1992)) のような多くの総説を利用することができる。
【００５３】
したがって、本発明のキナーゼペプチドは、誘導体又は類似体をも包括するものであり、ここで、置換されたアミノ酸残基は遺伝子コードによってコードされるものではなく、置換基が含まれ、成熟キナーゼペプチドが、キナーゼペプチドの半減期を増加させる化合物（例えば、ポリエチレングリコール）のような他の化合物と融合するか、又は付加アミノ酸が、リーダー配列、分泌配列、成熟キナーゼペプチドの精製配列、または前タンパク質配列のような成熟キナーゼペプチドと融合する。
【００５４】
タンパク質 / ペプチドの使用
本発明のタンパク質は、図面に示される機能情報に関連した、実質的かつ特異的なアッセイ法において、例えば、抗体を産生させる、又は他の免疫反応を誘導するため；生物液中におけるタンパク質（又はその結合対象、又はリガンド）レベルの定量のためのアッセイ法に用いる試薬（標識試薬を含む）として；および対応するタンパク質を選択的に発現する（組織の分化もしくは発達または疾患の状態において、構成的もしくは特定の段階のいずれかで発現する）組織のマーカーとして使用することができる。タンパク質が、別のタンパク質もしくはリガンドと結合するか、又は結合する可能性を有する場合（例えば、キナーゼ-エフェクタータンパク質の相互作用、又はキナーゼ-リガンドの相互作用）、このタンパク質を用いて結合対象/リガンドを特定し、結合相互作用の阻害因子を同定するシステムを開発することができる。これらの一部又はすべての使用により、商業製品として製品化するための試薬グレードまたはキット形式へと発展させることが可能となる。
【００５５】
上に列記した使用を実施する方法は、当業者に周知である。このような方法を開示している参考文献としては、「分子クローニング：実験マニュアル（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）」、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Sambrook, J.、E. F. FritschおよびT. Maniatis編、1989、ならびに「酵素学の方法：分子クローニング技術へのガイド（Methods in Enzymology: Guide to Molecular Cloning Techniques）」、Academic Press、Berger, S. L.およびA. R. Kimmel編、1987がある。
【００５６】
本発明のペプチドの潜在的な用途は、第一に、タンパク質の起源、及びタンパク質の種類/作用に基づいている。例えば、ヒトから単離されたキナーゼ、及びそれらのヒト/哺乳類オルソログは、哺乳類の治療用の適用、例えば、ヒト用の薬物、特に、キナーゼを発現する細胞又は組織での生物学的反応又は病理学的反応の調節に用いられる物質を同定するための標的として有用である。図1の実験データにより、本発明のキナーゼタンパク質は、ヒトにおいて喉頭、腎臓（成人および胎児）、膵臓、胎児の心臓、子宮、及び前立腺における発現が示されている。特に、バーチャル・ノーザンブロット解析により、喉頭、腎臓、および膵臓における発現が示されている。加えて、PCRに基づく組織スクリーニングパネルにより、胎児の心臓、胎児の腎臓、子宮、前立腺、および膵臓における発現が示されている。キナーゼタンパク質、特に、MAP/細胞外シグナル調節キナーゼサブファミリーメンバーの活性を調節する薬物の多くは、現在開発中である（発明の背景を参照）。発明の背景及び図面に記載される構造情報及び機能情報は、特に、図1の発現情報と組み合わせることによって、本発明の分子の特異的及び実質的な使用が提供される。図1の実験データにより、ヒトにおいて喉頭、腎臓（成人および胎児）、膵臓、胎児の心臓、子宮、及び前立腺における発現が示されている。このような使用は、本明細書で提供される情報、当技術分野に既知の情報、及び日常的な実験を用いて、容易に決定することができる。
【００５７】
本発明のタンパク質（本発明以前に開示されている変異体及び断片を含む）は、MAP/細胞外シグナル調節キナーゼサブファミリーメンバーに関連付けられるキナーゼに関する生物学的アッセイ法に有用である。このようなアッセイ法は、任意の公知のキナーゼの機能もしくは活性、又は、特にキナーゼを発現する細胞及び組織における本発明の一つが属するキナーゼサブファミリーに特有のキナーゼに関連する症状の診断及び治療に有用な性質に関連している。図1の実験データにより、本発明のキナーゼタンパク質は、ヒトにおいて喉頭、腎臓（成人および胎児）、膵臓、胎児の心臓、子宮、及び前立腺における発現が示されている。特に、バーチャル・ノーザンブロット解析により、喉頭、腎臓、および膵臓における発現が示されている。加えて、PCRに基づく組織スクリーニングパネルにより、胎児の心臓、胎児の腎臓、子宮、前立腺、および膵臓における発現が示されている。
【００５８】
本発明のタンパク質は、細胞ベース系又は無細胞系における薬物スクリーニングアッセイ法においても有用である。細胞ベース系は、天然型、すなわち、生検材料又は増殖する細胞培地中において、キナーゼを正常に発現する細胞である。図1の実験データにより、ヒトにおいて喉頭、腎臓（成人および胎児）、膵臓、胎児の心臓、子宮、及び前立腺における発現が示されている。代替的な態様において、細胞ベースのアッセイ法は、キナーゼタンパク質を発現する組換え宿主細胞に関係している。
【００５９】
ポリペプチドは、天然の状態、又はキナーゼに関連する特定の疾患もしくは症状を引き起こす改変された形態におけるタンパク質のキナーゼ活性を調節する化合物を同定するために用いることができる。本発明のキナーゼ、ならびに適当な変異体および断片はいずれも、このキナーゼに対して結合能力を持つ候補化合物をアッセイするためのハイスループット・スクリーニングにおいて使用することができる。これらの化合物は、さらに、これらのキナーゼ活性に対する化合物の作用を判定するために、機能性のキナーゼに対してスクリーニングを行うことができる。さらにこれらの化合物は、動物又は無脊椎動物系において、活性/効果を判定するために試験することができる。化合物は、キナーゼを望ましい程度まで活性化（アゴニスト）又は不活化（アンタゴニスト）するかどうかが同定される。
【００６０】
さらに、本発明のタンパク質は、キナーゼタンパク質と、該キナーゼタンパク質と通常相互作用する分子（例えば、キナーゼタンパク質が通常相互作用するシグナル経路の基質又は構成要素（例えば別のキナーゼ））との間での相互作用を刺激又は阻害する能力について化合物をスクリーニングするために用いることができる。このようなアッセイ法には、一般的に、キナーゼタンパク質もしくは断片が標的分子と相互作用し、且つタンパク質と標的との複合物形成を検出することが可能な条件、又はタンパク質リン酸化、cAMP回転、及びアデニル酸シクラーゼ活性などのシグナル伝達に関連する作用のような、キナーゼタンパク質と標的との相互作用の生化学的結果を検出することが可能な条件で、キナーゼタンパク質と候補化合物が結合される工程が含まれる。
【００６１】
候補化合物としては、例えば、1)最終部がIgの融合ペプチド、及びランダムペプチドライブラリーのメンバーを含む可溶性ペプチド（例えば、Lamら、Nature 354:82-84 (1991); Houghtenら、Nature 354:84-86 (1991)参照）、ならびにD型及び/又はL型アミノ酸から構成されるコンビナトリアルケミストリーに由来の分子ライブラリーのメンバーを含むペプチド；2)ホスホペプチド（例えば、ランダムおよび部分的に変更されたホスホペプチドライブラリーのメンバー；例えば、Songyangら、Cell 72:767-778 (1993)参照）；3)抗体（例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、抗イディオタイプ抗体、キメラ抗体、及び単鎖抗体、ならびにFab、F(ab')₂、Fab発現ライブラリー断片、及び抗体のエピトープ結合断片）；ならびに4)小型の有機分子及び無機分子（例えば、コンビナトリアル及び天然生成物ライブラリーから得られる分子）が含まれる。
【００６２】
ある候補化合物は、基質結合において競合する受容体の可溶性断片である。他の候補化合物には、変異キナーゼ、又はキナーゼ機能に影響を及ぼす変異を含む適切な断片が含まれ、このため、基質と競合する。したがって、例えば高い親和性を有するか、又は断片が基質と結合し解離しないような、基質と競合する断片が本発明に包含される。
【００６３】
本発明はさらに、キナーゼ活性を調節（刺激又は阻害）する化合物を同定するための、他のエンドポイントアッセイ法を含む。このアッセイ法は、一般的に、キナーゼ活性を示すシグナル伝達経路における事象のアッセイに関連している。このため、キナーゼタンパク質依存性シグナルカスケードに対する応答を促進又は抑制するよう調節される、基質のリン酸化、タンパク質の活性化、遺伝子発現の変化についてのアッセイが行われる。
【００６４】
キナーゼにより媒介される生物学的又は生化学的な機能は、いずれもエンドポイントアッセイ法として使用されうる。これらは、本明細書に記載されている全ての生化学的又は生化学的/生物学的な事象を含み、本明細書に引用される文献には、これらのエンドポイントアッセイ法の標的が参照として本明細書に組み入れられ、また、これらは、当業者に公知であるか、又は図面、特に図2の情報を用いて、容易に同定することができる他の機能を含む。特に、キナーゼを発現する細胞又は組織の生物学的機能についてアッセイを行うことができる。図1の実験データにより、ヒトにおいて喉頭、腎臓（成人および胎児）、膵臓、胎児の心臓、子宮、及び前立腺における発現が示されている。特に、バーチャル・ノーザンブロット解析により、喉頭、腎臓、および膵臓における発現が示されている。加えて、PCRに基づく組織スクリーニングパネルにより、胎児の心臓、胎児の腎臓、子宮、前立腺、および膵臓における発現が示されている。
【００６５】
結合及び/又は活性化化合物はまた、キメラキナーゼタンパク質を用いることによりスクリーニングを行うことができ、それはアミノ末端細胞外ドメイン又はその一部、7回膜貫通セグメント又は細胞内もしくは細胞外ループのような膜貫通ドメイン全体又は小領域、及びカルボキシル末端細胞内ドメイン又はその一部において、異種ドメインもしくは小領域に置換され得る。例えば、基質結合領域を、異なる基質と相互作用するものとして用いることができ、さらに未処理のキナーゼによって認識される。したがって、異なるセットのシグナル伝達構成要素を活性化のエンドポイントアッセイ法として利用することができる。このような方法により、キナーゼが由来する特定の宿主細胞以外でアッセイを行うことが可能となる。
【００６６】
本発明のタンパク質はまた、キナーゼと相互作用する化合物（例えば、結合対象及び/又はリガンド）を発見するために設計された方法である、競争結合アッセイ法にも有用である。このために、化合物がポリペプチドと結合又は相互作用可能な条件下で、化合物をキナーゼポリペプチドと接触させる。可溶性キナーゼポリペプチドもまた混合物中に加えられる。試験化合物が可溶性キナーゼポリペプチドと相互作用する場合、キナーゼ標的から形成される複合体の量、又は活性は減少する。このタイプのアッセイ法は特にキナーゼの特定領域と相互作用する化合物を検索する場合に有用である。したがって、標的のキナーゼ領域と競合する可溶性ポリペプチドは、対象となる領域に対応したペプチド配列を含むように設計されている。
【００６７】
無細胞系の薬物スクリーニングアッセイを行うためには、タンパク質の一方又は両方の非複合形態からの複合体の分離を促進し、アッセイの自動化に適応させるために、キナーゼタンパク質もしくは断片、またはその標的分子のいずれかを固定化することが望ましい場合がある。
【００６８】
薬物スクリーニングアッセイ法においては、マトリックスにタンパク質を固定化する技術を使用することができる。ある態様では、融合タンパク質にはタンパク質をマトリックスに結合することのできるドメインを付加することができる。例えばグルタチオン-S-トランスフェラーゼ融合タンパク質を、グルタチオンセファロースビーズ（Sigma Chemica1、St. Louis、M0）又はグルタチオン誘導マイクロタイタープレート上に吸着することができ、次いで細胞溶解物（例えば、³⁵S標識）と候補化合物とが結合され、複合体形成誘導条件（例えば、塩及びpHの生理学的条件）の下で混合物がインキュベーションされる。インキュベーションの後、非結合標識の除去のためにビーズを洗浄し、マトリックスを固定化して、放射性標識を直接、又は複合体を分離した後の上澄みを測定する。あるいは、複合体はSDS-PAGEによりマトリックスから分離することができ、標準の電気泳動技術を用いることによって、ゲルからビーズ画分中のキナーゼ結合タンパク質のレベルを定量することができる。例えば、ポリペプチド又はその標的分子のいずれかは、当技術分野に周知の技術を利用して、ビオチン及びストレプトアビジンの結合を用いて固定化される。あるいは、タンパク質と反応し、タンパク質と標的分子との結合を妨げない抗体は、プレートのウェルに誘導化され、このタンパク質は抗体との結合によりそのウェルの中に捕らえられる。キナーゼ結合タンパク質および候補化合物の調製物は、キナーゼタンパク質の存在するウェル中で培養され、ウェルに捕らえられた複合体の量を定量することができる。このような複合体を検出する方法としては、GST固定複合体による前述の方法に加えて、キナーゼタンパク質標的分子に反応性のある抗体、又は、キナーゼタンパク質に反応性があり標的分子と競合する抗体を用いた複合体の免疫検出法、及び標的分子と関連する酵素活性の検出に基づく酵素結合アッセイ法が含まれる。
【００６９】
本発明のキナーゼのうちの1つを調節する物質は、上述のアッセイ法の1つまたは複数を単独または組み合わせて用いることにより同定することができる。一般的には、最初に細胞ベース系又は無細胞系を用い、次に動物又は他のモデル系における活性を確認することが好ましい。このようなモデル系は、当技術分野に周知であり、本記載において容易に用いることができる。
【００７０】
これらの薬物スクリーニングアッセイ法によって同定されるキナーゼタンパク質活性のモジュレータは、キナーゼを発現する細胞又は組織に処理することによって、キナーゼ経路により媒介される疾患に罹患する患者の治療に用いることができる。図1の実験データにより、ヒトにおいて喉頭、腎臓（成人および胎児）、膵臓、胎児の心臓、子宮、及び前立腺における発現が示されている。これらの治療方法には、薬学的組成物中のキナーゼ活性のモジュレータを患者の治療に必要な量投与する工程が含まれており、このモジュレータは本明細書に記載のようにして同定される。
【００７１】
本発明の他の観点では、キナーゼと結合又は相互作用し、キナーゼ活性に関連している他のタンパク質を同定するために、2-ハイブリッドアッセイ法又は3-ハイブリッドアッセイ法 (米国特許第5,283,317号; Zervosら、(1993) Cell 72:223-232; Maduraら、(1993) J. Biol. Chem. 268:12046-12054; Bartelら、(1993) Biotechniques 14:920-924; Iwabuchiら、(1993) Oncogene 8:1693-1696;およびBrent国際公開公報第94/10300号参照）においてキナーゼタンパク質を「ベイト（bait）タンパク質」として使用することができる。このようなキナーゼ結合タンパク質は、例えば、キナーゼ媒介シグナル伝達経路の下流要素としてのキナーゼタンパク質、又はキナーゼ標的によるシグナル伝達に関与している可能性がある。あるいは、このようなキナーゼ結合タンパク質は、キナーゼ阻害因子である可能性も考えられる。
【００７２】
2-ハイブリッドシステムは、分離可能なDNA結合ドメイン及び活性化ドメインからなる大部分の転写因子のモジュラー性に基づいている。簡単に言うと、このアッセイ法では2つの異なるDNA構造を利用する。一方の構造においては、キナーゼタンパク質をコードする遺伝子は、既知の転写因子（例えばGAL4）のDNA結合ドメインをコードする遺伝子に融合される。他方の構造においては、DNA配列ライブラリーから得られ、未知のタンパク質（「プレイ（pray）」又は「サンプル（sample）」）をコードするDNA配列が既知の転写因子の活性化ドメインをコードする遺伝子に融合される。「ベイトタンパク質」及び「プレイタンパク質」がインビボで相互作用することができ、キナーゼ依存性の複合体を形成する場合、転写因子のDNA結合ドメイン及び活性化ドメインは近接する。この近接により、転写因子に反応する転写調節部位に機能的に結合するレポーター遺伝子（例えばLacZ）の転写を行うことができる。レポーター遺伝子の発現を検出することが可能であり、機能的転写調節因子を含む細胞コロニーを単離及び使用して、キナーゼタンパク質と相互作用するタンパク質をコードするクローン遺伝子を得ることができる。
【００７３】
本発明はさらに、前述のスクリーニングアッセイ法によって同定される新規の物質にも関係する。したがって、本明細書に記載されるようにして同定された物質を適当な動物のモデルに使用することも本発明の範囲内である。例えば、本明細書に記載のように同定された物質（例えばキナーゼ調節物質、アンチセンスキナーゼ核酸分子、キナーゼ特異的抗体、又はキナーゼ結合対象）を、これらの物質による治療の有効性、毒性、または副作用を判定するために、動物、又は他のモデルで用いることができる。あるいは、本明細書に記載のように同定された物質を、このような物質の作用メカニズムを決定するために、動物又は他のモデルで用いることができる。さらに、本発明は、本明細書に記載のように治療のための前記スクリーニングアッセイ法により同定された新規の薬物の使用に関する。
【００７４】
本発明のキナーゼタンパク質は、ペプチドにより媒介される疾患又は素因の診断のための標的を提供するのに有用である。したがって、本発明は、細胞、組織、もしくは生体中のタンパク質（又はコードするmRNA）の存在、またはそのレベルを検出する方法を提供するものである。図1の実験データにより、ヒトにおいて喉頭、腎臓（成人および胎児）、膵臓、胎児の心臓、子宮、及び前立腺における発現が示されている。方法には、キナーゼタンパク質との相互作用能力を有し、その相互作用が検出可能な化合物と生物試料とを接触させる工程が含まれる。このようなアッセイ法は、単一の検出形態、又は抗体チップアレイのようなマルチ検出形態で提供される。
【００７５】
試料中のタンパク質を検出する1つの物質は、タンパク質に選択的に結合することのできる抗体である。生物試料には、被験者から単離された組織、細胞、及び体液、ならびに被験者の内部に存在する組織、細胞、及び体液が含まれる。
【００７６】
本発明のペプチドはまた、変異ペプチドを持つ患者における、タンパク質の活性、疾患又は素因、特に現存するタンパク質ファミリーの他のメンバーで知られる活性及び症状の診断に用いるための標的を提供するものである。したがって、ペプチドを生物試料から単離することができ、且つ異常ペプチドを生じる遺伝子突然変異の存在についてアッセイを行うことができる。これは、アミノ酸の置換、欠失、挿入、再配置（異常なスプライシング事象の結果生じる）、及び不適当な翻訳後の修飾を含む。分析方法としては、電気泳動移動度の変化、トリプシンペプチド消化の変化、細胞ベース又は無細胞のアッセイ法によるキナーゼ活性の変化、基質又は抗体の結合パターンの変化、等電点の変化、直接アミノ酸配列決定、及びタンパク質の変異の検出に有用な他の公知のアッセイ技術を含む。このようなアッセイ法は、単一の検出形態、又は抗体チップアレイのような、マルチ検出形態で提供される。
【００７７】
ペプチドのインビトロ検出技術としては、酵素結合免疫吸着アッセイ法（ELISA）、ウェスタンブロット、抗体、又はタンパク質結合剤のような検出試薬を用いた免疫沈降及び免疫蛍光検査法を含む。あるいは、標識された抗ペプチド抗体、又は他のタイプの検出物質を被験者に導入することにより、被験者中でペプチドのインビボ検出を行うことができる、例えば、抗体は放射性マーカーにより標識することができ、被験者中のこのマーカーの存在及び位置は、標準画像化技術によって検出することができる。被験者において発現されたペプチドの対立遺伝子変異体を検出する方法、及び試料中のペプチド断片を検出する方法は、特に有用である。
【００７８】
ペプチドはまた、薬理遺伝学的分析においても有用である。薬理遺伝学では、薬物の変化の傾向と、影響を受けたヒトの異常作用に従って、薬物に対する応答における臨床的に著しい遺伝的変異について取り扱う。例えば、Eichelbaum, M. (Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 23(10-11):983-985 (1996))、およびLinder, M.W. (Clin. Chem. 43(2):254-266 (1997))参照。これらの変異の臨床的な結果は、個体の代謝変異の結果として、ある個体に対しては治療薬物が重い毒性をもたらし、又はある個体に対しては治療の失敗に終わる。このように、個体の遺伝子型は、体内で治療化合物を作用させる方法、又は体が化合物を代謝する方法を決定することができる。さらに、酵素を代謝させる薬物の活性は、薬物作用の強度と期間の両方に影響する。このように、個体の薬理遺伝学は、個体の遺伝子型に基づいた予防、又は治療的な処置において、効果的な化合物、及びこのような化合物の効果的な投与量の選択を可能とする。酵素代謝性の薬物における、遺伝子多形性の発見により、ある患者は期待される薬効を得られない、過度の薬効を示す、又は標準の投薬量から重大な毒性を被るといったことの理由を説明することができる。多形性は、代謝能の高い個体(extensive metabolizer)の表現型と代謝能の低い個体(poor metabolizer)の表現型で表されることができる。したがって、遺伝子の多形性は、ある集団のキナーゼ機能の1つまたは複数が他の集団のそれと異なるような、キナーゼタンパク質の対立遺伝子タンパク質変異に至るかもしれない。このように、ペプチドは治療法に影響しうる遺伝子の素因を確認するための標的となり得る。このため、リガンドベースの治療において、多形性により、基質結合活性及びキナーゼ活性がより高い又はより低いアミノ末端細胞外ドメイン及び/又は他の基質結合領域が生じうる。したがって、多形性を含む所与の集団においては、治療効果を最大にするように、基質投薬量は必然的に修正されると考えられる。遺伝子型同定に代わるものとしては、特定の多形性のペプチドを同定することができる。
【００７９】
ペプチドはまた、タンパク質の発現がない、タンパク質の発現が不適当である、又はタンパク質の発現が望ましくないことによって特徴づけられる障害を治療するために有用である。図1の実験データにより、ヒトにおいて喉頭、腎臓（成人および胎児）、膵臓、胎児の心臓、子宮、及び前立腺における発現が示されている。したがって、治療方法には、キナーゼタンパク質又は断片の使用が含まれる。
【００８０】
抗体
本発明はまた、本発明のペプチド、このようなペプチドを含むタンパク質、それらの変異体及びその断片の1つに選択的に結合する抗体を提供するものである。本明細書で用いられているように、抗体が標的ペプチドと結合し、無関係なタンパク質と強く結合しないような場合、抗体は標的ペプチドと選択的に結合している。標的ペプチドと実質的に相同性の無い他のタンパク質と結合していても、そのタンパク質が抗体の標的となるペプチドの断片又はドメインと相同性を有している限り、抗体は選択的にペプチドと結合すると考えられる。この場合、ペプチドに結合している抗体は、ある程度の交差反応性を持つにも関わらず、なお選択的であると理解される。
【００８１】
本明細書で用いられるように、抗体は当技術分野で認められているものと同じ用語で定義され、これらは、抗原の投与に応答して哺乳類生物により生成されるマルチサブユニットタンパク質である。本発明の抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、及びこれらの抗体の断片を含み、Fab又はF(ab')₂、及びFv断片を含むが、これに限定されるものではない。
【００８２】
所与の標的ペプチドに対する抗体の生成及び/又は同定について、多くの方法が知られている。このような方法のいくつかは、Harlow、「抗体（Antibodies）」、Cold Spring Harbor Press、(1989) に記載されている。
【００８３】
一般に、抗体を生成するためには、単離ペプチドを免疫原として用い、例えばラット、ウサギ、又はマウスのような哺乳類生物に投与する。全長タンパク質、抗原性ペプチド断片又は融合タンパク質を用いることができる。特に重要な断片は、図2において同定されるドメインのような、機能ドメインを含むものであり、タンパク質アライメント方法を使用して容易に同定することができ、図面に示されているようなファミリーと配列相同性又は相違性を持つドメインである。
【００８４】
抗体は、好ましくはキナーゼタンパク質の領域、又は単離された断片から調製される。抗体は、本明細書に記載されるように、ペプチドのいかなる領城からでも調製することができる。しかしながら、好ましい領域には、機能/活性、及び/又はキナーゼ/結合対象の相互作用に関係している領域が含まれると考えられる。図2は特に重要な領域を同定するのに用いることができ、この時、配列アライメントは保存された特有の配列断片を同定するのに用いることができる。
【００８５】
抗原性断片は、一般的に、少なくとも8個の連続するアミノ酸残基を含むと考えられる。抗原性ペプチドは、少なくとも10個、12個、14個、16個またはそれ以上のアミノ酸残基を含むことができる。このような断片は、例えば、タンパク質の表面上に位置する領域、例えば、親水性の領域に対応する断片のような物理的な性質、または配列の特異性（図2参照）に基づいて選択することができる。
【００８６】
本発明の抗体の検出は、検出可能な物質と抗体とのカップリング（すなわち、物理的な結合）によって容易に行うことができる。検出可能な物質の例としては、種々の酵素、補欠分子族、蛍光性物質、発光性物質、生物発光性物質、及び放射性物質が含まれる。好適な酵素の例としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、βガラクトシダーゼ、又はアセチルコリンエステラーゼを含み、好適な補欠分子族複合体の例としては、ストレプトアピジン/ビオチン、及びアビジン/ビオチンを含み、好適な蛍光性物質の例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセイン・イソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロライド、又はフィコエリトリンを含み、発光性物質の例としては、ルミノールを含み、生物発光性物質の例としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、及びエクオリンを含み、ならびに好適な放射性物質の例として、は¹²⁵I、¹³¹I、³⁵S、又は³Hを含む。
【００８７】
抗体の使用
抗体は、本発明のタンパク質の1つを、アフィニティクロマトグラフィ、又は免疫沈降のような標準の技術によって単離するために用いることができる。抗体は、細胞からの天然型タンパク質、及び宿主細胞で発現される組換えによって生産されたタンパク質の精製を容易にすることができる。さらに、このような抗体は、生体内の様々な組織又は通常の発達工程におけるタンパク質の発現パターンを決定するため、細胞又は組織内における本発明のタンパク質の存在の検出に有用である。図1の実験データにより、本発明のキナーゼタンパク質は、ヒトにおいて喉頭、腎臓（成人および胎児）、膵臓、胎児の心臓、子宮、及び前立腺における発現が示されている。特に、バーチャル・ノーザンブロット解析により、喉頭、腎臓、および膵臓における発現が示されている。加えて、PCRに基づく組織スクリーニングパネルにより、胎児の心臓、胎児の腎臓、子宮、前立腺、および膵臓における発現が示されている。さらに、このような抗体は、発現の量及びパターンを評価するための、インサイチュー、インビトロ、細胞溶解物中、及び上澄み中でのタンパク質の検出に用いることができる。また、このような抗体は、生物学的状態の発達又は進行の間、異常な組織分布又は異常な発現を評価するのに用いることができる。全長タンパク質の循環断片における抗体検出は、代謝回転を同定するのに用いることができる。
【００８８】
さらに、抗体は、タンパク質に関連した疾患の活発な段階、又は該疾患素因を持つ個体などの、疾患状態における発現を評価するのに用いることができる。障害が不適当な組織分布、発生における発現、タンパク質の発現レベル、又は発現/進行状態に起因する場合、抗体は通常のタンパク質に対して調製される。図1の実験データにより、ヒトにおいて喉頭、腎臓（成人および胎児）、膵臓、胎児の心臓、子宮、及び前立腺における発現が示されている。障害がタンパク質の特定の変異により特徴づけられる場合、この変異タンパク質に特異的な抗体を、特定の変異タンパク質の存在についてアッセイするために用いることができる。
【００８９】
抗体はまた、生体内の各種組織における、細胞の正常又は異常な細胞内局在を評価するのに用いることができる。図1の実験データにより、ヒトにおいて喉頭、腎臓（成人および胎児）、膵臓、胎児の心臓、子宮、及び前立腺における発現が示されている。診断としての使用は、遺伝子の試験だけでなく、治療法をモニターすることにも適用することができる。したがって、治療が最終的に、発現レベル、又は異常配列及び異常組織分布の存在、又は発生における発現を修正することを目指すものである場合、タンパク質又は関連する断片に対して誘導された抗体を、治療の有効性をモニターするのに用いることができる。
【００９０】
さらに、抗体は薬理遺伝学的分析に有用である。このように、多形性のタンパク質に対して調製される抗体は、治療法の修正を必要とする個体を特定するために用いることができる。抗体は、また、電気泳動移動度、等電点、トリプシンペプチド消化、及び当業者に周知の他の物理的なアッセイ法によって分析される異常タンパク質の免疫学的なマーカーのような診断上のツールとしても有用である。
【００９１】
抗体はまた、組織型の分類にも有用である。図1の実験データにより、ヒトにおいて喉頭、腎臓（成人および胎児）、膵臓、胎児の心臓、子宮、及び前立腺における発現が示されている。このように、特定のタンパク質が特定の組織中の発現と相関していた場合、このタンパク質に特異的である抗体を、組織型を同定するために用いることができる。
【００９２】
抗体はまた、タンパク質機能を阻害するのに有用であり、例えば、基質のような結合対象へのキナーゼペプチドの結合を妨害する。これらの使用はタンパク質の機能阻害に関連する治療状況において適用されることができる。抗体は、例えば、結合を妨害し、ペプチド活性を調節（アゴナイズ又はアンタゴナイズ）することに用いることができる。抗体は、機能のために必要な部位を含む特定の断片に対して、又は細胞もしくは細胞膜と関係している完全タンパク質に対して調製される。図2に、本発明のタンパク質に関する構造情報を示す。
【００９３】
本発明はまた、生物試料中のタンパク質の存在を検出するために抗体を用いたキットを包含する。キットには、標識された抗体又は標識可能な抗体、及び生物試料中でタンパク質を検出するための化合物又は試薬；試料中のタンパク質量を決定する手段；試料中のタンパク質量と標準の量とを比較する手段；ならびに使用のための説明を含む。このようなキットは、単一のタンパク質もしくはエピトープを検出するために提供されるか、又は抗体検出アレイのように、多数のエピトープのうちの1つを検出するように設定されることができる。アレイとしては、核酸アレイが詳細に後述され、抗体アレイのための同様の方法も開発されている。
【００９４】
核酸分子
本発明は、さらに本発明のキナーゼペプチド又はタンパク質をコードする単離核酸分子（cDNA、転写、及びゲノム配列）を提供するものである。このような核酸分子は、本発明のキナーゼペプチドの1つをコードするヌクレオチド配列、これらの対立遺伝子変異体、又はこれらのオルソログもしくはパラログからなる、本質的になる、又は含むと考えられる。
【００９５】
本明細書に用いられているように、「単離された」核酸分子は、核酸の天然起源に存在する他の核酸から分離されたものである。好ましくは、「単離」核酸はその核酸の由来となる生物のゲノムDNAにおいて、核酸に天然に隣接する配列（すなわち、核酸の5'末端及び3'末端に位置する配列）は含まない。しかしながら、例えば、約5KB、4KB、3KB、2KB又は1KB未満まで、特に連続するペプチドをコードする配列、及び同一遺伝子内であるが、ゲノム配列中のイントロンにより分離されているペプチドをコードする配列のような、いくつかの隣接ヌクレオチド配列がある。重要な点は、核酸が、本明細書に記載されるような特定の操作、例えば、組換え発現、プローブやプライマ一の調製、及び核酸配列のための他の特定の使用等に取り扱うことができるように、離れた重要でない隣接配列から分離されているということである。
【００９６】
さらに、例えば、転写/cDNA分子のような「単離」核酸分子は、他の細胞物質、組換え技術により製造される場合には培地、または化学的に合成される場合には化学前駆体もしくは他の化学物質を、実質的に含まない。しかしながら、この核酸分子は、他のコード配列又は他の調節配列に融合されることができるが、これは単離されたものとして考えられる。
【００９７】
例えば、ベクターに含まれる組換えDNA分子は、単離されたものとして考えられる。さらなる単離DNA分子の例には、非相同性の宿主細胞中に保持された組換えDNA分子、又は溶液中の精製（部分的又は実質的に）されたDNA分子が含まれる。単離されたRNA分子は、本発明の単離DNA分子の、インビボ又はインビトロでのRNA転写産物を含む。本発明による単離核酸分子としては、合成的に製造された分子をさらに含む。
【００９８】
したがって、本発明は、図1又は図3（配列番号：1、転写配列、及び配列番号：3、ゲノム配列）に記載のヌクレオチド配列からなる核酸分子、又は図2（配列番号：2）に記載のタンパク質をコードする任意の核酸分子を提供するものである。ヌクレオチド配列がこの核酸分子の完全なヌクレオチド配列であるとき、核酸分子はヌクレオチド配列からなる。
【００９９】
本発明はさらに、図1又は図3（配列番号：1、転写配列、及び配列番号：3、ゲノム配列）に記載のヌクレオチド配列から実質的になる核酸分子、又は図2（配列番号：2）に記載のタンパク質をコードする任意の核酸分子を提供するものである。最終的な核酸分子において、このようなヌクレオチド配列がごくわずかの付加核酸残基とともに存在するとき、核酸分子はヌクレオチド配列から実質的になる。
【０１００】
本発明はさらに、図1又は図3（配列番号：1、転写配列、及び配列番号：3、ゲノム配列）に記載のヌクレオチド配列を含む核酸分子、又は図2（配列番号：2）に記載のタンパク質をコードする任意の核酸分子を提供するものである。ヌクレオチド配列が核酸分子の最終的なヌクレオチド配列の少なくとも一部である場合、核酸分子はヌクレオチド配列を含む。これによると、核酸分子は、そのヌクレオチド配列だけであるか、又は付加的な核酸残基、例えば、それに天然に関連する核酸残基、又は非相同性のヌクレオチド配列を有することもできる。このような核酸分子は、ごくわずかの付加的なヌクレオチドを有するか、又は数百もしくはそれ以上の付加的なヌクレオチドを含むこともできる。これらの種々のタイプの核酸分子を容易に生成/単離する方法について、以下に簡単に述べる。
【０１０１】
図1及び図3に、コード配列及び非コードの配列の両者が示される。本発明の起源である、ヒトゲノム配列（図3）、及びcDNA/転写配列（図1）のため、図面中の核酸分子は、ゲノムイントロン配列、5'と3'の非コード配列、遺伝子調節領城、及び非コード遺伝子間配列を含むと考えられる。一般に、このような配列の特徴は、図1および図3の両方において記載されているか、または当技術分野において公知の計算ツールを用いて容易に同定することができる。以下で議論されるように、いくつかの非コード領域、特にプロモーターのような遺伝子調節要素は、例えば、非相同性の遺伝子発現の制御、遺伝子活性を調節する化合物同定のための標的等の種々の目的にとって有用であり、また特に、本明細書で提供されるゲノム配列の断片として主張されている。
【０１０２】
単離核酸分子は、成熟したタンパク質と付加的アミノ末端もしくはカルボキシル未端アミノ酸、又は成熟ペプチド内のアミノ酸（例えば、成熟形態が1つより多くのペプチド鎖を有する場合）をコードすることができる。このような配列は、前駆体から成熟した形態へのタンパク質のプロセシングにおいて、タンパク質搬送の促進、タンパク質半減期の延長もしくは短縮、又はタンパク質のアッセイもしくは製造の際の操作の効率化、又は他の事象における役割を果たし得る。一般に、インサイチューの場合、付加アミノ酸は細胞酵素によって成熟したタンパク質へとプロセシングされてもよい。
【０１０３】
上述したように、単離核酸分子は、キナーゼペプチドのみをコードする配列、成熟したペプチドをコードする配列、及びリーダー配列又は分泌配列（例えば、プレ-プロ（pre-pro）、プロ-タンパク質（pro-protein）配列）のような付加的なコード配列を含むが、これに限定されるものではなく、付加的なコード配列及び付加的な非コード配列、例えば、イントロンと非コード5'配列及び3'配列のような、転写されるが翻訳はされない、転写、mRNAプロセシング（スプライシング及びポリアデニル化シグナルを含む）、リボソームの結合、及びmRNAの安定性の役割を果たすものを含んでも含まなくても良い。加えて、核酸分子は、例えば、精製を容易にするペプチドをコードするマーカー配列と融合されることもできる。
【０１０４】
単離核酸分子は、mRNAのようなRNAの形態、又はクローニングによって得られるかもしくは化学合成技術もしくはその組み合わせによって生成されるcDNA及びゲノムDNAを含む、DNAの形態をとり得る。核酸、特にDNAは、二本鎖、又は一本鎖であり得る。一本鎖の核酸は、コード鎖（センス鎖）、又は非コード鎖（アンチセンス鎖）であり得る。
【０１０５】
本発明はさらに、本発明のペプチドの断片をコードする核酸分子と同様に、上記したような本発明のキナーゼタンパク質の明らかな変異体をコードする核酸分子を提供するものである。このような核酸分子は、対立遺伝子変異体（同一遺伝子座）、パラログ（異なる遺伝子座）、及びオルソログ（異なる生物）のように天然に発生するか、又は組換えDNA法もしくは化学合成によって生成され得る。このような非天然に発生する変異体は、核酸分子、細胞又は生物に適用される技術を含む突然変異誘発技術によって生成され得る。したがって、上述したように、変異体にはヌクレオチドの置換、欠失、反転、及び挿入が含まれうる。変異は、コード領域及び非コード領域のいずれか、又は両方で起こりうる。変異は、保存的アミノ酸置換及び非保存的アミノ酸置換の両方を生じることができる。
【０１０６】
本発明はさらに、図1及び図3に示される核酸分子の非コードの断片を提供するものである。好ましい非コードの断片としては、プロモーター配列、エンハンサー配列、遺伝子調節配列、及び遺伝子終結配列が含まれるが、これに限定されるものではない。このような断片は、非相同性の遺伝子発現の制御、及び遺伝子調節物質の同定を行うためのスクリーニングの開発において有用である。プロモーターは、図3のゲノム配列における5'からATG開始部位において容易に同定される。
【０１０７】
断片は、12個又はそれ以上のヌクレオチドの連続するヌクレオチド配列を含む。さらに、断片は少なくとも30個、40個、50個、100個、250個、又は500個のヌクレオチド長であり得る。断片の長さは使用目的に基づく。例えば断片は、ペプチドのエピトープ関連領域をコードすることができるか、又はDNAプローブ及びDNAプライマーとして有用である。このような断片は、オリゴヌクレオチドプローブを合成するための既知のヌクレオチド配列を用いて単離することができる。標識されたプローブは、コード領域と対応する核酸を単離するため、cDNAライブラリー、ゲノムDNAライブラリー、又はmRNAのスクリーニングに用いることができる。さらに、プライマーは、遺伝子の特定領域をクローニングするためのPCR反応に用いることができる。
【０１０８】
プローブ/プライマーは一般的に、実質的に精製されたオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド対を含む。オリゴヌクレオチドは、一般に、少なくとも約12個、20個、25個、40個、50個又はそれ以上の連続するヌクレオチドに、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズされたヌクレオチド配列領域を含む。
【０１０９】
オルソログ、ホモログ、及び対立遺伝子変異体は、当技術分野において周知の方法を用いて同定することができる。ペプチドの項で述べたように、これらの変異体は、ペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、図面に示されるヌクレオチド配列、又はこの配列の断片に対して、典型的には、60〜70％、70〜80％、80〜90％、より典型的には、少なくとも約90〜95％またはそれ以上の相同性を有するものである。このような核酸分子は、穏やかな条件からストリンジェントな条件の下で、図面に示されるヌクレオチド配列又はこの配列の断片に対してハイブリダイズが可能なものとして、容易に同定することができる。対立遺伝子変異体は、コードする遺伝子の遺伝子座で容易に決定されることができる。本発明で提供される遺伝子は、STSおよびBACのマップデータなどの様々な方面からの証拠に基づき、ヒト第8染色体にマッピングされたゲノム構成要素上に位置することが示されている（図3に示す）。
【０１１０】
図3に、本発明のキナーゼタンパク質をコードする遺伝子中に見出されたSNPについての情報が示される。同定されたのは以下の変異である；T1004G、G1822T、A2023G、A2562G、及びC6624A 。イントロン、及びORFの5'側のSNPは、制御/調節要素に影響を与える可能性がある。
【０１１１】
本明細書に用いられるように、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」という用語は、ペプチドをコードするヌクレオチド配列が、互いに少なくとも60〜70％の相同性を有し、互いにハイブリダイズしたままである程度にハイブリダイズ及び洗浄が行われる条件を意味している。この条件は、互いに少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、又はそれ以上の配列相同性を有するような配列が、典型的には互いにハイブリダイズしたままであるような条件でありうる。このようなストリンジェントな条件は、当業者に周知であり、「分子生物学の最新プロトコール（Current Protocols in Molecular Biology）」、John Wiley & Sons、N.Y. (1989)、6.3.1-6.3.6. に記載されている。ストリンジェントなハイブリダイズ条件の1つの例では、6×塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム（SSC）中、約45℃でハイブリダイズし、その後、0.2×SSC、0.1％ SDS中、50〜65℃で1回または複数回洗浄する。穏やかな、低ストリンジェントのハイブリダイズ条件の例は、当業者において周知である。
【０１１２】
核酸分子の使用
本発明の核酸分子は、プローブ、プライマー、化学合成中間体、及び生物学的アッセイ法において有用である。核酸分子は、図2に示されているペプチドをコードする全長cDNA及びゲノムクローンを単離するため、ならびに図2に示すペプチドと同一又は関連したペプチドを生成する変異体（対立遺伝子、オルソログ等）に対応するcDNA及びゲノムクローンを単離するために、メッセンジャーRNA、転写/cDNA、及びゲノムDNAのハイブリダイゼーションプローブとして有用である。図3に示されるように、SNPは5カ所で同定され、そのうちの1つは制御/調節要素に影響を与える可能性があるORFの5'側のSNPである。
【０１１３】
プローブは、図面に示されている核酸分子の全長において、いかなる配列とも対応することができる。したがって、それは5'非コード領域、コード領域、及び3'非コード領域から誘導することができる。しかしながら、すでに述べたように、断片は、本発明以前に開示された断片を含むものとして見なされることはない。
【０１１４】
核酸分子はまた、核酸分子のいずれかの所与の領域を増幅するPCRのプライマーとしても有用であり、所望の長さ及び配列のアンチセンス分子の合成においても有用である。
【０１１５】
核酸分子はまた、組換えベクターの構築にも有用である。このようなベクターには、ペプチド配列の一部又は全部を発現する発現ベクターが含まれる。ベクターはまた、挿入ベクターも含み、これは例えば細胞ゲノム中のような他の核酸分子中に組み込まれ、遺伝子及び/又は遺伝子産物のインサイチュー発現を変化させるために用いられる。例えば、内因性コード配列では、1つまたは複数の特異的に導入された変異を含むコード領域の全部又は一部との相同組換えを経て置換され得る。
【０１１６】
核酸分子はまた、タンパク質の抗原部分を発現するためにも有用である。
【０１１７】
核酸分子はまた、インサイチューハイブリダイゼーション法により、核酸分子の染色***置を決定するためのプローブとしても有用である。本発明で提供される遺伝子は、STSおよびBACのマップデータなどの様々な方面からの証拠に基づき、ヒト第8染色体にマッピングされたゲノム構成要素上に位置することが示されている（図3に示す）。
【０１１８】
核酸分子はまた、本発明の核酸分子の遺伝子調節領域を含むベクターの製造にも有用である。
【０１１９】
核酸分子はまた、本明細書に記載される核酸分子から生成されるmRNAの全部又は一部と対応しているリボザイムの設計にも有用である。
【０１２０】
核酸分子はまた、ペプチドの一部又は全部を発現するベクターの製造にも有用である。
【０１２１】
核酸分子はまた、核酸分子及びペプチドの一部又は全部を発現する宿主細胞の構築にも有用である。
【０１２２】
核酸分子はまた、核酸分子及びペプチドの一部又は全部を発現する遺伝子導入動物の製造にも有用である。
【０１２３】
核酸分子はまた、核酸発現の存在、レベル、形態、及び分布を決定するためのハイブリダイゼーションプローブとしても有用である。図1の実験データにより、本発明のキナーゼタンパク質は、ヒトにおいて喉頭、腎臓（成人および胎児）、膵臓、胎児の心臓、子宮、及び前立腺における発現が示されている。特に、バーチャル・ノーザンブロット解析により、喉頭、腎臓、および膵臓における発現が示されている。加えて、PCRに基づく組織スクリーニングパネルにより、胎児の心臓、胎児の腎臓、子宮、前立腺、および膵臓における発現が示されている。したがって、このプローブは、細胞、組織及び生物中での特定の核酸分子の存在を検出するか、またはそのレベルを測定するために使用することができる。レベルが測定される核酸は、DNAまたはRNAでありうる。したがって、本明細書で述べられるペプチドに対応するプローブは、所与の細胞、組織及び生物における発現、ならびに/または遺伝子コピー数の評価に用いることができる。これらの使用は、正常値と比較して上昇または低下しているキナーゼタンパク質の発現を含む障害の診断に適当である。
【０１２４】
mRNAを検出するインビトロの技術には、ノーザンハイブリダイゼーション及びインサイチューハイブリダイゼーションが含まれる。DNAを検出するインビトロの技術には、サザンハイブリダイゼーション及びインサイチューハイブリダイゼーションが含まれる。
【０１２５】
プローブは、例えばmRNAもしくはゲノムDNAなどの被験者由来の試料細胞中でキナーゼをコードする核酸のレベルを測定したり、又はキナーゼ遺伝子が変異しているかどうかを確認することにより、キナーゼタンパク質を発現する細胞もしくは組織を同定する診断試験キットの一部として使用することができる。図1の実験データにより、本発明のキナーゼタンパク質は、ヒトにおいて喉頭、腎臓（成人および胎児）、膵臓、胎児の心臓、子宮、及び前立腺における発現が示されている。特に、バーチャル・ノーザンブロット解析により、喉頭、腎臓、および膵臓における発現が示されている。加えて、PCRに基づく組織スクリーニングパネルにより、胎児の心臓、胎児の腎臓、子宮、前立腺、および膵臓における発現が示されている。
【０１２６】
核酸発現アッセイ法は、キナーゼの核酸発現を調節する化合物を同定する薬物スクリーニングに有用である。
【０１２７】
したがって、本発明は、キナーゼ遺伝子の核酸発現に関連した障害、特にそれを発現する細胞及び組織においてキナーゼが媒介する生物学的過程及び病理学的過程に関連した障害の治療に使用可能な化合物を同定する方法を提供するものである。図1の実験データにより、ヒトにおいて喉頭、腎臓（成人および胎児）、膵臓、胎児の心臓、子宮、及び前立腺における発現が示されている。この方法は、典型的には、キナーゼ核酸の発現を調節する化合物の能力についてアッセイを行う工程、及び望ましくないキナーゼ核酸発現により特徴づけられる障害を治療するのに用いることができる化合物を同定する工程を含む。このアッセイ法は、細胞ベース系及び無細胞系において実施することができる。細胞ベースのアッセイ法には、天然にキナーゼ核酸を発現する細胞、又は特定の核酸配列を発現するために遺伝子操作された組換え細胞が含まれる。
【０１２８】
キナーゼ核酸発現のアッセイ法は、例えばmRNAレベルのような核酸レベル、又はシグナル経路に関連する副次化合物の直接的なアッセイ法と関連している。さらに、キナーゼタンパク質シグナル経路における応答性を上方調節又は下方調節する遺伝子の発現についてもアッセイされる。この態様において、これらの遺伝子調節領域は、ルシフェラーゼのようなレポーター遺伝子に機能的に結合することができる。
【０１２９】
したがって、キナーゼ遺伝子発現のモジュレータは、細胞と候補化合物とを接触させ、mRNAの発現を判定する方法により同定されうる。候補化合物の存在下でのキナーゼmRNAの発現レベルは、候補化合物非存在下でのキナーゼmRNAの発現レベルと比較される。この比較に基づいて、候補化合物は核酸発現のモジュレータとして同定され、例えば、異常核酸発現により特徴付けられる障害の治療に用いることができる。候補化合物存在下でのmRNAの発現が、非存在下のものと比較して統計的に有意に大きい場合、候補化合物は核酸発現の刺激因子として同定される。候補化合物存在下での核酸発現が、非存在下のものと比較して統計的に有意に小さい場合、候補化合物は核酸発現の阻害因子として同定される。
【０１３０】
本発明はさらに、キナーゼを発現する細胞及び組織においてキナーゼ核酸発現を調節する遺伝子モジュレータとしての薬物スクリーニングを経て同定された化合物を用い、標的として核酸を用いる治療方法を提供するものである。図1の実験データにより、本発明のキナーゼタンパク質は、ヒトにおいて喉頭、腎臓（成人および胎児）、膵臓、胎児の心臓、子宮、及び前立腺における発現が示されている。特に、バーチャル・ノーザンブロット解析により、喉頭、腎臓、および膵臓における発現が示されている。加えて、PCRに基づく組織スクリーニングパネルにより、胎児の心臓、胎児の腎臓、子宮、前立腺、および膵臓における発現が示されている。調節は、上方調節（即ち、活性化もしくはアゴニゼーション）もしくは下方調節（抑制もしくはアンタゴニゼーション）の両者、又は核酸発現を含む。
【０１３１】
あるいは、薬物又は小分子がタンパク質を発現する細胞及び組織中でキナーゼ核酸発現を阻害するものである限り、キナーゼ核酸発現のモジュレータは、本明細書に記載されるスクリーニングアッセイ法を用いて同定される小分子又は薬物であり得る。図1の実験データにより、ヒトにおいて喉頭、腎臓（成人および胎児）、膵臓、胎児の心臓、子宮、及び前立腺における発現が示されている。
【０１３２】
核酸分子はまた、臨床試験又は治療方法において、キナーゼ遺伝子の発現又は活性に対する調節化合物の効果をモニターするのに有用である。したがって、遺伝子発現パターンは、化合物、特に患者の耐性を向上させる化合物を用いた治療における、継続的効果のバロメータとなり得る。遺伝子発現パターンはまた、化合物に対して影響を受けた細胞の生理的反応を示すマーカーとなり得る。したがって、このようなモニタリングにより、化合物の投与量の増加、又は患者が耐性を示さない代替化合物の投与を行うことができる。同様に、核酸発現のレベルが望ましいレベルまで低下した場合には、化合物の投与をこれに比例して減少することができる。
【０１３３】
核酸分子はまた、キナーゼ核酸発現の質的変化、特に疾患に至る質的変化の診断アッセイ法にも有用である。核酸分子は、キナーゼ遺伝子及びmRNAのような遺伝子発現産物における突然変異の検出に用いることができる。核酸分子は、キナーゼ遺伝子において天然に発生した遺伝子突然変異を検出し、それによって、その変異を持つ被験者が変異により生じる障害の危険性を有しているかどうかを判定するためのハイブリダイゼーションプローブとして用いることができる。突然変異は、遺伝子中の1つもしくは複数のヌクレオチドの欠失、付加、又は置換、反転もしくは転位のような染色体の再編成、異常メチル化パターンのようなゲノムDNAの修飾、又は増幅のような遺伝子コピー数の変化を含む。機能障害に関連するキナーゼ遺伝子の変異体の検出は、疾患がキナーゼタンパク質の過剰発現、過小発現、又は変化した発現の結果生じる場合に、疾患の活性又は感受性の診断ツールを提供するものである。
【０１３４】
キナーゼ遺伝子中に突然変異を有する個体は、種々の技術によって核酸レベルにおいて検出されうる。図3に、本発明のキナーゼタンパク質をコードする遺伝子中に見出されたSNPについての情報が示される。同定されたのは以下の変異である；T1004G、G1822T、A2023G、A2562G、及びC6624A 。イントロン、及びORFの5'側のSNPは、制御/調節要素に影響を与える可能性がある。本発明で提供される遺伝子は、STSおよびBACのマップデータなどの様々な方面からの証拠に基づき、ヒト第8染色体にマッピングされたゲノム構成要素上に位置することが示されている（図3に示す）。ゲノムDNAは直接分析してもよく、又は予めPCRを用いて増幅した後で分析してもよい。RNA又はcDNAも、同様に用いることができる。ある使用においては、突然変異の検出は、アンカーPCRもしくはRACE PCRのような、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）（例えば、米国特許第4,683,195号および同第4,683,202号参照）、又は他のものとして、ライゲーション連鎖反応（LCR）（例えば、Landegranら、Science 241:1077-1080 (1988);およびNakazawaら、PNAS 91:360-364 (1994) 参照）において、プローブ/プライマーの使用に関連し、後者は遺伝子中の点突然変異の検出に特に有用である（Abravayaら、Nucleic Acids Res. 23:675-682 (1995)参照）。この方法には、患者から細胞試料を回収する工程；試料細胞から核酸（例えば、ゲノム、mRNA、又はその両方）を単離する工程；遺伝子（存在する場合）のハイブリダイズ及び増幅が起こる条件下で遺伝子に特異的にハイブリダイズする1つ又は複数のプライマーと、核酸試料とを接触させる工程；ならびに増幅産物の存在の有無を検出するか、又は増幅産物のサイズを検出し、対照試料の長さと比較する工程を含む。欠失及び挿入は、増幅産物のサイズの変化を、正常な遺伝子型のものと比較することにより検出することができる。点突然変異は、増幅DNAと正常なRNA又はアンチセンスDNA配列とハイブリダイズすることによって同定することができる。
【０１３５】
あるいは、キナーゼ遺伝子の突然変異は、例えば、ゲル電気泳動により決定される制限酵素消化パターンの変化により、直接的に同定することができる。
【０１３６】
さらに、配列特異的リボザイム（米国特許第5,498,531号）を、リボザイム開裂部位の発生又は滅少により、特定の変異の存在のスコア化に用いることができる。完全に一致する配列は、ヌクレアーゼ開裂消化アッセイ法、又は融解温度の違いによって、不一致の配列から識別することができる。
【０１３７】
特定位置での配列変化はまた、RNase及びS1保護、又は化学開裂法のようなヌクレアーゼ保護アッセイ法によって評価することができる。さらに、変異キナーゼ遺伝子と野生型遺伝子との配列の相違は、直接DNA配列決定によって決定することができる。種々の自動化された配列決定手段は、診断アッセイ法（Naeve, C.W.、(1995) Biotechniques 19:448）の実施に有用することができ、これらには、質量分析による配列決定（例えば、国際公開公報第94/16101号; Cohenら、Adv. Chromatogr. 36:127-162 (1996);およびGriffinら、Appl. Biochem. Biotechnol. 38:147-159 (1993) 参照）も含まれる。
【０１３８】
遺伝子中の突然変異を検出する他の方法には、RNA/RNA又はRNA/DNA二本鎖から不一致の塩基を検出するために使用される、開裂試薬から保護する方法（Myersら、Science 230:1242 (1985)）; Cottonら、PNAS 85:4397 (1988); Saleebaら、Meth. Enzymol. 217:286-295 (1992)）、変異体と野生型の核酸の電気泳動移動度を比較する方法（Oritaら、PNAS 86:2766 (1989); Cottonら、Mutat. Res. 285:125-144 (1993);およびHayashiら、Genet. Anal. Tech. Appl. 9:73-79 (1992)）、及び変性剤の勾配を含むポリアクリルアミドゲル中での変異体又は野生型の断片の動きを、変性勾配ゲル電気泳動を用いてアッセイする方法（Myersら、Nature 313:495 (1985)）が含まれる。点突然変異を検出する他の技術の例としては、選択的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、選択的増幅、及び選択的プライマー伸長が含まれる。
【０１３９】
核酸分子は、治療方法としての効果を持つにも関わらず、必ずしも疾患を引き起こすわけではない遺伝子型のための個体試験においても有用である。このため、核酸分子は、個体の遺伝子型と、治療に用いられる化合物に対する個体の応答との相関（薬理遺伝学的相関）についての研究に用いることができる。したがって、本明細書に記載される核酸分子は、治療のための適切な化合物又は投与計画を選択するために、個体におけるキナーゼ遺伝子の変異含量の評価に用いることができる。図3に、本発明のキナーゼタンパク質をコードする遺伝子中に見出されたSNPについての情報が示される。同定されたのは以下の変異である；T1004G、G1822T、A2023G、A2562G、及びC6624A 。イントロン、及びORFの5'側のSNPは、制御/調節要素に影響を与える可能性がある。
【０１４０】
このように、治療に影響する遺伝子変異を示す核酸分子は、個体における目的に適合させた治療に使用可能な診断標的を提供するものである。したがって、これらの多形性を含む組換え細胞及び組換え動物の製造は、治療化合物及び投与計画についての効果的な臨床設計を可能とする。
【０１４１】
したがって、核酸分子は、細胞、組織、及び生物におけるキナーゼ遺伝子発現を制御するためのアンチセンス構築物として有用である。DNAアンチセンス核酸分子は、転写に関連する遺伝子領域に対して相補的になるよう設計され、それ故に、キナーゼタンパク質の転写及び産生が阻害される。アンチセンスRNA又はDNA核酸分子はmRNAとハイブリダイズし、これによりキナーゼタンパク質中へのmRNAの翻訳が妨害される。
【０１４２】
あるいは、あるクラスのアンチセンス分子は、キナーゼ核酸の発現を減少させるためのmRNAの不活性化に用いることができる。したがって、これらの分子は、異常又は望ましくないキナーゼ核酸の発現により特徴づけられる障害の治療に用いることができる。この技術は、mRNAの翻訳能力を減少させるような、mRNAの1つ又は複数の領域に相補的なヌクレオチド配列を含むリボザイム手段による開裂に関連している。可能な領域としては、コード領域、特に、基質結合のようなキナーゼタンパク質の触媒活性及び他の機能活性に対応したコード領域を含む。
【０１４３】
核酸分子はまた、キナーゼ遺伝子発現において異常な細胞を持つ患者の遺伝子治療のためのベクターを提供するものである。エクスビボで操作され患者に戻される患者の細胞を含む組換え細胞は、個体の体内に導入され、個体細胞内で、個体の治療のために所望のキナーゼタンパク質を生産する。
【０１４４】
本発明は、生物試料中のキナーゼ核酸の存在を検出するためのキットも包含する。図1の実験データにより、本発明のキナーゼタンパク質は、ヒトにおいて喉頭、腎臓（成人および胎児）、膵臓、胎児の心臓、子宮、及び前立腺における発現が示されている。特に、バーチャル・ノーザンブロット解析により、喉頭、腎臓、および膵臓における発現が示されている。加えて、PCRに基づく組織スクリーニングパネルにより、胎児の心臓、胎児の腎臓、子宮、前立腺、および膵臓における発現が示されている。例えば、キットは、標識された核酸もしくは標識可能な核酸、又は生物試料中でキナーゼ核酸を検出可能な物質を含む試薬；試料中のキナーゼ核酸量を決定する手段；及び試料中のキナーゼ核酸量と標準の量とを比較する手段を含むことができる。この化合物又は物質は適当な容器に封入することができる。このキットは、キナーゼタンパク質mRNA又はDNAの検出キットとして使用するための説明をさらに含むことができる。
【０１４５】
核酸アレイ
本発明はさらに、核酸検出キットを提供するものであり、これらは、例えば、図1及び図3（配列番号：1及び3）に示される配列情報に基づいた核酸分子のアレイ又はマイクロアレイである。
【０１４６】
本明細書に用いられる「アレイ」又は「マイクロアレイ」は、紙、ナイロン又は他のタイプの膜、フィルタ、チップ、ガラススライド、又は他の適当な固形支持体のような基板上で合成された異なるポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドのアレイを意味する。1つの態様において、マイクロアレイは、米国特許第5,837,832号、Cheeら、国際公開公報第95/11995号(Cheeら)、Lockhart, D. J.ら(1996; Nat. Biotech. 14: 1675-1680)、およびSchena, M.ら(1996; Proc. Natl. Acad. Sci. 93: 10614-10619)に記載される方法にしたがって調製及び使用され、これらの全ては参照として本明細書に組み入れられる。他の態様において、このようなアレイは、Brownら、米国特許第5,807,522号に記載される方法により製造される。
【０１４７】
マイクロアレイ又は検出キットは、好ましくは、多数の特有の一本鎖核酸配列により構成され、通常は合成アンチセンスオリゴヌクレオチドか、又はcDNAの断片のいずれかが固体支持体上に固定される。オリゴヌクレオチドは、好ましくは約6〜60個のヌクレオチド長、より好ましくは15〜30個のヌクレオチド長、最も好ましくは約20〜25個のヌクレオチド長である。あるタイプのマイクロアレイ又は検出キットのためには、7〜20個のみのヌクレオチド長であるオリゴヌクレオチドを使うことが好適であり得る。マイクロアレイ又は検出キットは、既知の5'配列又は3'配列を含むオリゴヌクレオチド、全長配列を含む連続的なオリゴヌクレオチド、又は配列の長さにおいて特定領域から選択された特有のオリゴヌクレオチドを含むものであり得る。マイクロアレイ又は検出キットにおいて用いられるポリヌクレオチドは、遺伝子又は対象となる遺伝子に対して特異的なオリゴヌクレオチドであり得る。
【０１４８】
マイクロアレイ又は検出キットのための既知の配列のオリゴヌクレオチドを製造するために、対象となる遺伝子（又は本発明のコンティグから同定されたORF）は典型的にはコンピュータアルゴリズムを用いて試験され、ヌクレオチド配列の5'末端又は3'末端から開始される。典型的なアルゴリズムでは、遺伝子に特有である規定された長さのオリゴマーが同定され、ハイブリダイゼーションに好適な範囲のGC含量を持ち、ハイブリダイゼーションを妨害しうる予測される二次構造を持たない。ある条件では、マイクロアレイ又は検出キットにおいて、オリゴヌクレオチド対を用いることが好適であり得る。オリゴヌクレオチドの「対」は、好ましくは、配列の中央に位置する1つのヌクレオチドを除いて、同一である。第二の対のオリゴヌクレオチド（一方とは不一致）は対照として用いられる。オリゴヌクレオチド対の数は、2から100万の間でありうる。オリゴマーは、光誘導化学プロセスを用いて、基板上の指定領域で合成される。基板は、紙、ナイロン又は他のタイプの膜、フィルタ、チップ、ガラススライド、又は他の適当な固形支持体である。
【０１４９】
他の観点において、オリゴヌクレオチドは、国際公開公報第95/251116号(Baldeschweilerら)に記載されるように、化学カップリング手段、及びインクジェットアプリケーション装置を用いて基板の表面上で合成され、これらの全ては参照として本明細書に組み入れられる。他の観点において、ドット（又はスロット）ブロットと類似した「グリッド」アレイでは、真空システム、加熱、UV、力学的又は化学的結合工程を用いて、cDNA断片、又はオリゴヌクレオチドを基板の表面上に配列し、結合させることができる。上記のようなアレイは、手工又は利用可能な装置（スロットブロット、又はドットブロット装置）、材料（任意の適当な固形支持体）、及び機械（ロボット装置を含む）を用いて製造され、8、24、96、384、1536、6144もしくはこれ以上、又は市販の装置に効果的に使用される2から100万の間の他の数のオリゴヌクレオチドを含んでもいても良い。
【０１５０】
マイクロアレイ又は検出キットを用いて試料の分析を行うために、生物試料から得られたRNA又はDNAは、ハイブリダイゼーションプローブに調製される。mRNAが単離され、cDNAが調製され、アンチセンスのRNA（aRNA）を調製するためのテンプレートとして用いられる。aRNAを蛍光性ヌクレオチドの存在下で増幅し、標識されたプローブをマイクロアレイ又は検出キットと共にインキュベートし、プローブの配列がマイクロアレイ又は検出キット中の相補的なオリゴヌクレオチドとハイブリダイズする。インキュベーション条件は、正確に相補的に一致しているか、又は様々な程度のより低い相補性でハイブリダイゼーションが起こるように調節される。ハイブリダイズしていないプローブを除去した後、蛍光のレベルおよびパターンを判定するためにスキャナが用いられる。スキャンされた画像は、マイクロアレイ又は検出キット上の、相補性の程度及び各々のオリゴヌクレオチド配列の相補性の程度及び相対的な量を決定するために試験される。生物試料は、任意の体液（例えば血、尿、唾液、痰、胃液など）、培養細胞、生検材料、又は他の組織調製物から得られる。検出システムでは、全ての異なる配列において、ハイブリダイゼーションの存在、非存在、及び量を、同時に測定するために用いられる。このデータは、試料間での、配列、発現パターン、変異、変異体、又は多形性といった、大規模な相関性の研究に用いられる。
【０１５１】
本発明は、このようなアレイを用いて、本発明のキナーゼタンパク質/ペプチドの発現を同定するための方法を提供するものである。詳細には、このような方法は、試験試料と1つ又は複数の核酸分子とをインキュベートする工程、及び試験試料中の構成要素と核酸分子との結合についてアッセイを行う工程を含む。このようなアッセイ法は、典型的には、遺伝子の少なくとも1つが本発明の遺伝子及び/又は本発明のキナーゼ遺伝子の対立遺伝子である、多くの遺伝子を含むアレイに関連している。図3に、本発明のキナーゼタンパク質をコードする遺伝子中に見出されたSNPについての情報が示される。同定されたのは以下の変異である；T1004G、G1822T、A2023G、A2562G、及びC6624A 。イントロン、及びORFの5'側のSNPは、制御/調節要素に影響を与える可能性がある。
【０１５２】
試験試料と核酸分子のインキュベーション条件は変化する。インキュベーション条件は、使用されるアッセイ法の形式、使用される検出方法、及びアッセイ法に使用される核酸分子のタイプ及び性質に依存する。当業者は、一般的に利用可能なハイブリダイゼーション、増幅、又はアレイアッセイ法の形式を認識していると思われ、これらは本明細書に開示されるヒトゲノムの新規断片を使用するために容易に適用することができる。このようなアッセイ法の例は、Chard, T、「放射標識免疫アッセイ法および関連する技術の概論（An Introduction to Radioimmunoassay and Related Techniques）」、Elsevier Science Publishers、Amsterdam、The Netherlands (1986); Bullock, G. R. ら、「免疫細胞化学における技術（Techniques in Immunocytochemistry）」、Academic Press、Orlando, FL、第1巻(1982)、第2巻(1983)、第3巻(1985); Tijssen, P.、「酵素免疫アッセイ法の実践と理論：生化学および分子生物学の実験技術（Practice and Theory of Enzyme Immunoassays: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology）」、Elsevier Science Publishers、Amsterdam、The Netherlands (1985) に記載されている。
【０１５３】
本発明の試験試料は、細胞、タンパク質、又は細胞からの膜抽出物を含む。上記の方法に用いられる試験試料は、アッセイ法の形式、検出方法の性質、及びアッセイ法の試料として用いられる組織、細胞、又はその抽出物に基づいて変化する。核酸抽出物又は細胞抽出物の調製方法は当技術分野において周知であり、使用されるシステムと適合する試料を得られるように、容易に適用させることができる。
【０１５４】
本発明の他の態様としては、本発明のアッセイを行うために必要な試薬を含むキットが提供される。
【０１５５】
特に、本発明は、（a）本明細書に開示されるヒトゲノムの断片と結合可能な核酸分子を含む第一の容器と、（b）1つまたは複数の洗浄試薬、結合核酸の存在を検出可能な試薬を含む、1つまたは複数の他の容器とを含む、1つまたは複数の容器に閉鎖的に封入され、区分されたキットを提供するものである。
【０１５６】
詳細には、区分されたキットには、試薬が別々の容器に含まれている任意のキットを含む。このような容器としては、小さいガラスの容器、プラスチック容器、帯状のプラスチック、ガラスもしくは紙、又は二酸化ケイ素のようなアレイ材料を含む。このような容器は、試料と試薬が交叉汚染しないように、1つの区分から他の区分へと試薬を効率的に移動させることができ、それぞれの容器の試薬又は溶液は、1つの区分から他の区分へと定量的に添加されることができる。このような容器には、試験試料を入れる容器、核酸プローブを含む容器、洗浄試薬（例えば、リン酸緩衝食塩水、トリス緩衝液等）を含む容器、及び結合プローブの検出に用いられる試薬を含む容器を含むと考えられる。当業者は、本発明にかかる従来より未知のキナーゼ遺伝子を認識し、本明細書に開示される配列情報を用いて日常的に同定することができ、さらにこれを当技術分野において周知の確立されたキット形式、特に発現アレイに容易に組み込むことができる。
【０１５７】
ベクター / 宿主細胞
本発明はまた、本明細書に記載される核酸分子を含むベクターを提供するものである。「ベクター」という用語は、ビヒクルのことを言い、好ましくは核酸分子であり、核酸分子を輸送することができるものである。ベクターが核酸分子である場合、核酸分子はベクターの核酸と共有結合している。本発明のこの観点では、ベクターは、プラスミド、一本鎖もしくは二本鎖のファージ、一本鎖もしくは二本鎖のDNAもしくはRNAウイルスベクター、又はBAC、PAC、YACもしくはMACのような人工染色体を含む。
【０１５８】
ベクターは宿主細胞中に染色体外の要素として保持されてもよく、そこで核酸分子の付加的なコピーを複製及び生成する。あるいは、ベクターは宿主細胞のゲノム中に組み込まれてもよく、宿主細胞の複製の際に核酸分子の付加的なコピーを生成する。
【０１５９】
本発明は、核酸分子の維持のためのベクター（クローニングベクター）、又は核酸分子の発現のためのベクター（発現ベクター）を提供するものである。このベクターは、原核生物細胞もしくは真核生物細胞、又はその両方で機能することができる（シヤトルベクター）。
【０１６０】
発現ベクターは、ベクター中で核酸分子と機能的に結合されたシス作用性調節領域を含み、これにより宿主細胞中での核酸分子の転写が可能となる。この核酸分子は転写に影響を及ぼしうる核酸分子と別々に、宿主細胞に導入されることができる。したがって、第二の核酸分子は、ベクターからの核酸分子の転写を可能にするシス調節制御領域と相互作用するトランス作用性因子を提供するものである。あるいは、トランス作用性因子は宿主細胞により提供されてもよい。最終的に、トランス作用性因子は、ベクター自身から作り出すことができる。しかし、いくつかの態様では、核酸分子の転写及び/又は翻訳は無細胞系でも起こり得ることが理解される。
【０１６１】
本明細書に記載される核酸分子が機能的に結合できる調節配列は、mRNA転写を誘導するためのプロモーターを含む。これらには、パクテリオファージλからの左部プロモーター、大腸菌（E. coli）から得られたlac、TRP、及びTACプロモーター、SV40から得られた初期及び後期プロモーター、CMV極初期プロモーター、アデノウイルス初期及び後期プロモーター、ならびにレトロウイルスの末端反復配列が含まれるが、これに限定されるものではない。
【０１６２】
転写を促進する制御領域に加えて、発現ベクターはまた、リプレッサー結合部位及びエンハンサーのような転写を調節する領域を含むものであり得る。この例としては、SV40エンハンサー、サイトメガロウイルスの極初期のエンハンサー、ポリオーマエンハンサー、アデノウイルスエンハンサー、及びレトロウイルスLTRエンハンサーが含まれる。
【０１６３】
転写の開始及び制御部位に加えて、発現ベクターはまた、転写終了のために必要な配列、及び転写領域における転写のためのリボソーム結合部位を含むことができる。他の発現調節制御要素としては、ポリアデニル化シグナルと同様に、開始及び終止コドンが含まれる。当業者には、発現ベクターに有用な多数の調節配列が既知であると思われる。このような調節配列は、例えば、Sambrookら、「分子クローニング：実験マニュアル（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）」、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、NY、(1989) に記載されている。
【０１６４】
各種発現ベクターは、核酸分子の発現に用いることができる。このようなベクターには、染色体、エピソーム、及びウイルス由来のベクターが含まれ、これらは例えば、細菌プラスミド、バクテリオファージ、酵母エピソーム、人工酵母染色体を含む酵母染色体要素、バキュロウイルス、SV40のようなパポバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、ポックスウイルス、仮性狂犬病ウイルス、及びレトロウイルスのようなウイルス由来のベクターである。ベクターはまた、これらの起源の組み合わせから得ることができ、例えば、コスミドとファージミドのようなプラスミドとバクテリオファージの遺伝子要素から得ることができる。原核及び真核生物の宿主細胞のための適切なクローニングベクター及び発現ベクターは、Sambrookら、「分子クローニング：実験マニュアル（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）」、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、NY、(1989) に記載されている。
【０１６５】
調節配列は、1つもしくは複数の宿主細胞の構成的な発現（すなわち組織特異性）又は、温度、養分添加、又はホルモンもしくは他のリガンドのような外因性因子による1つもしくは複数の細胞タイプでの誘導性の発現を提供するものである。原核及び真核生物の宿主細胞において構成的及び誘導的に発現する種々のベクターは、当業者に周知である。
【０１６６】
核酸分子を、周知の方法によってベクター核酸内に導入することができる。一般に、最終的に発現するDNA配列は、1つ又は複数の制限酵素によりDNA配列と発現ベクターとが開裂し、断片が互いにライゲーションすることによって、発現べクターと結合される。制限酵素の消化及びライゲーションの手順は、当業者に周知である。
【０１６７】
適切な核酸分子を含むベクターは、公知の技術を用いて、増殖又は発現のために適切な宿主細胞内へ導入することができる。細菌細胞には、大腸菌、放線菌（Streptomyces）、及びネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）が含まれるが、これに限定されるものではない。真核生物細胞には、酵母、ショウジョウバエ（Drosophila）のような昆虫細胞、COS及びCHO細胞のような動物細胞、ならびに植物細胞が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０１６８】
本明細書に記載のように、融合タンパク質としてのペプチドの発現が望ましいと考えられる。したがって、本発明はペプチドの生産を可能にする融合ベクターを提供するものである。融合ベクターは組換えタンパク質の発現及び組換えタンパク質の溶解性を向上させることができ、また、例えば、アフィニティ精製のためのリガンドの作用によってタンパク質精製を促進することができる。タンパク質分解性開裂部位は、融合部分との結合位置に導入され、このために、所望のペプチドを最終的に融合部分から分離することができる。タンパク質分解酵素としては、ファクターXa、トロンビン、及びエンテロキナーゼを含むが、これに限定されるものではない。典型的な融合発現ベクターとしては、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST）、マルトースE結合タンパク質、又はタンパク質Aのそれぞれを、標的組換えタンパク質に融合した、pGEX (Smithら、Gene 67:31-40 (1988))、pMAL (New England Biolabs、Beverly、MA)、およびpRIT5 (Pharmacia、Piscataway、NJ) が含まれるが、これに限定されるものではない。好適な誘導性の非融合大腸菌発現ベクターの例としては、pTrc (Amannら、Gene 69:301-315 (1988))、およびpET 11d (Studierら、「遺伝子発現技術：酵素学における方法（Gene Expression Technology: Methods in Enzymology）」、185:60-89 (1990))が含まれる。
【０１６９】
組換えタンパク質の発現は、宿主細胞において、組換えタンパク質のタンパク質分解性の開裂欠損能力を持つ遺伝的背景を提供することによって、宿主細菌において最大化することができる (Gottesman, S.、「遺伝子発現技術：酵素学における方法（Gene Expression Technology: Methods in Enzymology）」、185、Academic Press、San Diego、California (1990) 119-128)。あるいは、対象となる核酸分子の配列は、例えば、大腸菌のような特定の宿主細胞のために優先的に使用されるコドンとなるように変更されることができる (Wadaら、Nucleic Acids Res. 20:2111-2118 (1992))。
【０１７０】
核酸分子はまた、酵母において作用する発現ベクターにより発現されることもできる。S.セレビシエ（S. cerevisiae）のような酵母中で発現するベクターの例としては、pYepSec1 (Baldariら、EMBO J. 6:229-234 (1987))、pMFa (Kurjanら、Cell 30:933-943(1982))、pJRY88 (Schultzら、Gene 54:113-123 (1987))、およびpYES2 (Invitrogen Corporation、San Diego、CA) を含む。
【０１７１】
核酸分子はまた、例えば、バキュロウイルス発現ベクターを用いて、昆虫細胞内で発現されることもできる。培養昆虫細胞（例えば、Sf9細胞）中のタンパク質の発現に利用されるバキュロウイルスベクターは、pAcシリーズ (Smithら、Mol. Cell Biol. 3:2156-2165 (1983)) およびpVLシリーズ (Lucklowら、Virology 170:31-39 (1989))を含む。
【０１７２】
本発明のある態様においては、本明細書に記載される核酸分子は、哺乳類発現ベクターを用いて哺乳類細胞内で発現される。哺乳類発現ベクターの例としては、pCDM8 (Seed, B. Nature 329:840(1987))およびpMT2PC (Kaufmanら、EMBO J. 6:187-195 (1987)) を含む。
【０１７３】
本明細書に列記されている発現ベクターとしては、核酸分子を発現するために有用であり、当業者が利用可能な周知のベクターのみが例示されている。本明細書に記載される核酸分子の維持増殖又は発現において、好適な他のベクターは、当業者に周知であると思われる。これらは、例えば、Sambrook, J.、Fritsh, E. F.,およびManiatis, T.、「分子クローニング：実験マニュアル（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）」、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、NY、1989に記載されている。
【０１７４】
本発明はまた、本明細書に記載される核酸配列がベクター中に逆方向にクローニングされたベクターを含むものであり、このベクターは、アンチセンスRNAの転写を可能にする調節配列と機能的に結合される。このように、アンチセンス転写は、コード領域及び非コード領域の両方が含まれ、本明細書に記載される核酸分子配列の全部又は一部を生産することができる。このアンチセンスRNAの発現は、センスRNAの発現（調節配列、構成的又は誘導性の発現、組織特異的発現）に関して、前記した各パラメータに対応する。
【０１７５】
本発明はまた、本明細書に記載されるベクターを含む組換え宿主細胞に関連するものである。したがって、宿主細胞は、原核生物細胞、酵母のような下等真核生物細胞、昆虫細胞のような他の真核生物細胞、及び哺乳類細胞のような高等真核生物細胞を含む。
【０１７６】
組換え宿主細胞は、当業者が容易に利用可能な技術により、本明細書に記載されるベクター構築物を細胞中に導入することにより調製することができる。これらには、リン酸カルシウムトランスフェクション、DEAEデキストラン媒介トランスフェクション、陽イオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、トランスダクション、インフェクション、リポフェクション、及びSambrookら、(「分子クローニング：実験マニュアル（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）」、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、NY、1989) に記載されるような他の技術が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０１７７】
宿主細胞は、1つ又は複数のベクターを含むことができる。このため、異なるヌクレオチド配列が、同じ細胞の異なるベクター中に導入されることができる。同様に、核酸分子は、単独で、又は発現ベクターのトランス作用性因子を提供しているような関連のない他の核酸分子と共に導入されることができる。1つまたは複数のベクターが細胞内に導入される場合、ベクターは単独で導入されるか、共に導入されるか、又は核酸分子ベクターに結合して導入されることができる。
【０１７８】
バクテリオファージ及びウイルスベクターの場合、これらはインフェクション及びトランスダクションの標準的な操作により、封入又はカプセル化されたウイルスとして細胞内に導入されることができる。ウイルスベクターは、複製可能、又は複製欠陥であり得る。ウイルスの複製に欠陥がある場合、複製は欠陥を相補する機能が提供される宿主細胞内で起こり得る。
【０１７９】
ベクターは一般に、組換えベクターの構築物を含む細胞の部分母集団の選択を可能とする選択マーカーを含む。このマーカーは、本明細書に記載される核酸分子を含む同一のベクター内か、又は別のベクター中に含まれることができる。マーカーは、原核生物宿主細胞のためのテトラサイクリン又はアンピシリン耐性遺伝子、及び真核生物宿主細胞のためのジヒドロ葉酸還元酵素又はネオマイシン耐性を含む。しかしながら、表現型特性の選択性を提供するマーカーはいずれも有効であると考えられる。
【０１８０】
成熟タンパク質は、適切な調節配列の制御下で、細菌、酵母、哺乳類細胞、及び他の細胞で生産されることができるが、無細胞転写系及び翻訳系もまた、本明細書に記載されるDNA構築物に由来のRNAを用い、これらのタンパク質を生産するために用いることができる。
【０１８１】
ペプチドの分泌が必要とされる場合、キナーゼのようなタンパク質を含む複数回膜貫通ドメインで達成することは困難であり、適切な分泌シグナルがベクター中に組み込まれる。シグナル配列は、これらのペプチドに対して内因性であるか、又はペプチドに対して非相同性であり得る。
【０１８２】
ペプチドが培地中に分泌されない場合、典型的にはキナーゼの場合、タンパク質を、凍結融解、超音波処理、機械的破壊、分解物質の使用等を含む標準的な破壊操作によって、宿主細胞から単離することができる。ペプチドは、硫酸アンモニウム沈殿、酸抽出、又は陰イオンもしくは陽イオン交換クロマトグラフィ、ホスホセルロースクロマトグラフィ、疎水性相互作用クロマトグラフィ、アフィニティクロマトグラフィ、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィ、レクチンクロマトグラフィ、又は高速液体クロマトグラフィを含む、公知の精製方法によって、回収及び精製されることができる。
【０１８３】
また、本明細書に記載されるペプチドの組換え産生においては宿主細胞に依存しており、ペプチドは細胞に依存して種々のグリコシル化パターンを持ち、細菌内で産生される場合にはグリコシル化されないであろうことが理解される。さらに、ペプチドは、宿主を媒介する過程の結果として、いくつかの場合で最初に修飾されたメチオニンを含むものであり得る。
【０１８４】
ベクター及び宿主細胞の使用
本明細書に記載されるペプチドを発現する組換え宿主細胞には、種々の用途がある。まず、この細胞は、所望の量のキナーゼタンパク質又は断片を生産するため、さらに精製を行うことのできるキナーゼタンパク質又はペプチドの生産に有用である。このため、発現ベクターを含む宿主細胞は、ペプチドの生産に有用である。
【０１８５】
宿主細胞はまた、キナーゼタンパク質又はキナーゼタンパク質断片に関連している細胞ベースのアッセイ法、例えば上記したもの及び当技術分野に周知の他の形態のものの実施において有用である。このため、天然のキナーゼタンパク質を発現する組換え宿主細胞は、キナーゼタンパク質機能を刺激又は阻害する化合物のアッセイに有用である。
【０１８６】
宿主細胞はまた、機能が影響を受けるキナーゼタンパク質変異体を同定するために有用である。変異が天然に生じ病理を引き起こすような場合、突然変異を含む宿主細胞は、天然のキナーゼタンパク質の効果を示さずに、キナーゼタンパク質変異体に望ましい効果（例えば、機能を刺激又は阻害）を持つ化合物のアッセイに有用である。
【０１８７】
遺伝的に操作された宿主細胞は、さらにヒト以外のトランスジェニック動物を生産するために用いることができる。遺伝子組換え動物は、好ましくは哺乳類であり、例えば、この動物の1つ又は複数の細胞が導入遺伝子を含むラット又はマウスのような齧歯類動物である。導入遺伝子は発達中のトランスジェニック動物の細胞のゲノムに組み込まれ、1つ又は複数の細胞型又は組織において、成熟した動物のゲノム中に残存する外因性のDNAである。これらの動物は、キナーゼタンパク質の機能の研究、ならびにキナーゼタンパク質活性のモジュレータの同定及び評価に有用である。トランスジェニック動物の他の例としては、ヒト以外の霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ヤギ、ニワトリ、及び両生類が含まれる。
【０１８８】
トランスジェニック動物は、例えば、マイクロインジェクション、レトロウイルス感染によって、受精卵母細胞の雄性前核内に核酸を導入し、卵母細胞を偽妊娠性の雌性育成動物中で発達させることにより作製される。任意のキナーゼタンパク質ヌクレオチド配列を、マウスのようなヒト以外の動物のゲノム中に導入遺伝子として導入することができる。
【０１８９】
発現ベクターに有用な調節配列又は他の配列は、いずれも導入遺伝子配列の一部分を形成することができる。これには、既に含まれない場合、イントロン配列及びポリアデニル化シグナルが含まれる。組織特異性調節配列は、特定の細胞に対しキナーゼタンパク質が直接発現するために、導入遺伝子に機能的に結合されることができる。
【０１９０】
胚操作及びマイクロインジェクションを通して、トランスジェニック動物を生産する方法、特にマウスのような動物を用いる方法は、当技術分野において一般化されており、例えば、Lederらの米国特許第4,736,866号および同第4,870,009号、Wagnerらの米国特許第4,873,191号、およびHogan, B.、「マウス胚の操作（Manipulating the Mouse Embryo）」、(Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、N.Y.、1986) に記載されている。同様の方法が、他のトランスジェニック動物の生産のために用いられている。トランスジェニック創始動物を、ゲノム中の導入遺伝子の存在及び/又は動物の組織もしくは細胞内でのトランスジェニックmRNAの発現に基づいて確認することができる。その後、トランスジェニック創始動物を、さらに導入遺伝子を有する動物を繋殖させるために用いることができる。さらに、導入遺伝子を有するトランスジェニック動物を、さらに他の導入遺伝子を有する他のトランスジェニック動物と交配することができる。トランスジェニック動物はまた、動物全体又は動物の組織が本明細書に記載される相同的な組換え宿主細胞を用いて作製された動物を含む。
【０１９１】
他の態様では、ヒト以外のトランスジェニック動物は、導入遺伝子の調節された発現を行う選択システムを含むものとして生産されることができる。このようなシステムの1つの例は、バクテリオファージP1のcre/loxPリコンビナーゼシステムである。cre/loxPリコンビナーゼシステムについての記載は、例えば、Laksoら、 PNAS 89:6232-6236 (1992) 参照。リコンビナーゼシステムのもう一つの例は、S.セレビシエのFLPリコンビナーゼシステムである (O'Gormanら、Science 251:1351-1355 (1991)。cre/loxPリコンビナーゼシステムが導入遺伝子の発現の調節に用いられる場合は、動物において、creリコンビナーゼ及び選択されたタンパク質の両者をコードする導入遺伝子が含まれていることが必要である。このような動物は、例えば、一方は選択されたタンパク質をコードする導入遺伝子を持ち、他方はリコンビナーゼをコードする導入遺伝子を持った2つのトランスジェニック動物を交配させることにより、「二重」トランスジェニック動物を作製することによって提供される。
【０１９２】
本明細書に記載されるヒト以外の遺伝子組換え動物のクローンはまた、Wilmut, I.ら、Nature 385:810-813 (1997)および国際公開公報第97/07668号および国際公開公報第97/07669号に記載される方法に従って生産されることができる。簡単に述べると、トランスジェニック動物からの細胞、例えば体細胞を単離し、増殖周期から出てG₀期に入るように誘導することができる。静止細胞を、例えば電気パルスの使用によって、静止細胞を単離した動物と同種の動物の除核した卵母細胞と融合することができる。再構成された卵母細胞は、桑実胚又は胚盤胞に発達するよう培養され、その後、偽妊娠性の雌性育成動物中に移される。この雌性育成動物から誕生する子孫は、細胞、例えば体細胞を単離した動物のクローンとなる。
【０１９３】
本明細書に記載されるペプチドを発現する組換え細胞を含むトランスジェニック動物は、インビボの環境で、本明細書に記載したようなアッセイを行うために有用である。したがって、インビボに存在し、基質結合、キナーゼタンパク質活性化、シグナル伝達に影響を与えうる各種の生理学的因子は、インビトロの無細胞又は細胞ベースのアッセイ法では明らかにならない可能性がある。したがって、これらは、基質相互作用、キナーゼタンパク質機能及び基質相互作用に対する特定の変異体キナーゼタンパク質の影響、ならびにキメラキナーゼタンパク質の影響を含むキナーゼタンパク質機能を、インビボでアッセイするための、ヒト以外のトランスジェニック動物を提供するために有用である。また、実質的に又は完全に1つ又は複数のキナーゼタンパク質機能を除去する突然変異である、ヌル変異の影響を評価することも可能である。
【０１９４】
本明細書において、上記の全ての刊行物及び特許は参照として本明細書に組み入れられる。本発明に記載された方法及びシステムの各種修正及び変形は、本発明の範囲及び精神から逸脱しない限り、当業者において明らかなものであると思われる。本発明は、特定の好ましい態様に関連して記述されているが、特許請求の範囲に記載された発明は、このような特定の態様に不当に限定されないと理解されるべきである。実際に、本発明を実施するための上記方法の各種変形は、分子生物学又は関連する分野の業者において明らかであり、このようなものも特許請求の範囲に含まれることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【０１９５】
【図１】本発明のキナーゼタンパク質をコードするcDNA分子のヌクレオチド配列を示す（配列番号：1）。さらに、ATG開始、終結、及び組織分布のような構造及び機能情報が利用可能に提供され、この分子配列に基づく本発明の特定用途を容易に決定することが可能となる。図1の実験データにより、ヒトにおいて喉頭、腎臓（成人および胎児）、膵臓、胎児の心臓、子宮、及び前立腺における発現が示されている。
【図２】本発明のキナーゼの推定アミノ酸配列を示す（配列番号：2）。さらに、タンパク質ファミリー、機能、及び修飾部位のような構造及び機能情報が利用可能に提供され、この分子配列に基づく本発明の特定用途を容易に決定することが可能となる。
【図３】本発明のキナーゼタンパク質をコードする遺伝子のゲノム配列を示す（配列番号：3）。さらに、イントロン/エクソン構造、プロモーター位置などのような構造及び機能情報が利用可能に提供され、この分子配列に基づく本発明の特定用途を容易に決定することが可能となる。図3に示されるように、SNPは5カ所で同定され、そのうちの1つは制御/調節要素に影響を与える可能性があるORFの5'側のSNPである。【Technical field】
[0001]
Field of Invention
The present invention relates to the field of production of kinase proteins, recombinant DNA molecules, and proteins related to the MAP / extracellular signal-regulated kinase subfamily. In particular, the present invention provides novel peptides and proteins that affect protein phosphorylation, and nucleic acid molecules encoding these peptides and protein molecules. All of these are useful in the development of human therapeutic and diagnostic compositions and methods.
[Background]
[0002]
Background of the Invention
Protein kinase
Kinases regulate the growth, differentiation, and signaling of various cells by adding phosphate groups to proteins. Dysregulation of signal transduction has been found to be involved in various pathologies including inflammation, cancer, arteriosclerosis, and psoriasis. Reversible protein phosphorylation is the primary method of controlling eukaryotic cell activation. In a typical mammalian cell, it is estimated that more than 1,000 of 10,000 active proteins are phosphorylated. The high energy phosphate that controls activation is usually transferred from the adenosine triphosphate molecule (ATP) to a specific protein by a protein kinase and removed from the protein by a protein phosphatase. Phosphorylation occurs in response to extracellular signals (such as hormones, neurotransmitters, growth factors, and differentiation factors), cell cycle checkpoints, environmental stress, or nutrient stress, and is similar to turning on a molecular switch. ing. When the switch is turned on, appropriate protein kinases activate metabolic enzymes, regulatory proteins, receptors, cytoskeletal proteins, ion channels or pumps, or transcription factors.
[0003]
Kinases contain the largest protein family known to date and are a superfamily of enzymes with a wide variety of functions and specificities. Kinases are usually named after certain phenotypes indicated by their substrates, regulatory molecules, or variants. Based on substrates, protein kinases are roughly divided into two groups: kinases that phosphorylate tyrosine residues (protein tyrosine kinases, PTK) and kinases that phosphorylate serine or threonine residues (serine / threonine kinases, STK). Can be classified. Some protein kinases have both specificities and phosphorylate threonine and tyrosine residues. Almost all kinases contain a similar 250-300 amino acid catalytic domain. The N-terminal region containing subdomains I-IV is usually folded into a bilobal structure and is bound and oriented with an ATP (or GTP) donor molecule. The larger C-terminal region (lobe) containing subdomain VI A-XI binds to the protein substrate and performs the task of transferring the γ-phosphate from ATP to the hydroxyl group of a serine, threonine, or tyrosine residue. Subdomain V spans both regions.
[0004]
Kinases may be classified into families depending on the difference in the amino acid sequence (usually 5-100 residues) that is present at one end of the kinase domain or inserted into the loop of the kinase domain. These additional amino acid sequences recognize the kinase target protein and interact with it, allowing for kinase-specific regulation. The primary structure of the kinase domain is conserved and can be further classified into 11 subdomains. Eleven subdomains are characteristic of each subdomain and contain specific amino acid residues and motifs or amino acid patterns that are highly conserved (Hardie, G. and Hanks, S., (1995), `` The Protein Kinase Facts Books, Volume I: 7-20 Academic Press, San Diego, Calif.).
[0005]
Secondary messenger-dependent protein kinases are mainly cyclic AMP (cAMP), cyclic GMP, inositol triphosphate, phosphatidylinositol, 3,4,5-triphosphate, cyclic ADP ribose, arachidonic acid, diacylglycerol And mediates the action of second messengers such as calcium-calmodulin. Cyclic AMP-dependent protein kinase (PKA) is an important member of the STK family. Cyclic AMP is an intracellular mediator of hormonal action in all prokaryotic and animal cells examined so far. Such hormone-induced cellular responses include thyroid hormone secretion, cortisol secretion, progesterone secretion, glycogenolysis, bone resorption, and regulation of heart rate and myocardial contractility. PKA is present in all animal cells and is thought to be involved in the action of cyclic AMP in the majority of these cells. Abnormal PKA expression has been implicated in various disorders and diseases including cancer, thyroid disorders, diabetes, atherosclerosis, and cardiovascular disease (Isselbacher, KJ et al. (1994), “Harrison's Internal Medicine. (Harrison's Principles of Internal Medicine), McGraw-Hill, New York, NY, pp. 416-431, 1887).
[0006]
Calcium-calmodulin (CaM) -dependent protein kinase is also a member of the STK family. Calmodulin is a calcium receptor that mediates many calcium-regulated processes by binding to target proteins in response to binding to calcium. The first target protein in these processes is CaM-dependent protein kinase. CaM kinase is involved in the regulation of smooth muscle contraction (MLC kinase), glycogenolysis (phosphorylase kinase), and neurotransmission (CaM kinase I and CaM kinase II). CaM kinase I phosphorylates a variety of substrates including neurotransmission-related proteins synapsin I and II, gene transcription regulator CREB, and cystic fibrosis transmembrane regulatory protein CFTR (Haribabu, B. et al. (1995) EMBO Journal 14: 3679-86). CaM II kinase regulates catecholamine synthesis in the brain by phosphorylating synapsin at another site and phosphorylating and activating tyrosine hydroxylase. Many of the CaM kinases are activated by phosphorylation in addition to binding to CaM. This kinase may be autophosphorylated or may be phosphorylated by another kinase as part of a “kinase cascade”.
[0007]
Another ligand activated protein kinase is 5′-AMP activated protein kinase (AMPK) (Gao, G. et al. (1996) J. Biol Chem. 15: 8675-81). Mammalian AMPK is a regulator of fatty acid and sterol synthesis by phosphorylation of acetyl-CoA carboxylase and hydroxymethylglutaryl-CoA reductase, and response of these pathways to heat shock and cellular stress such as glucose and ATP deficiency Mediate. AMPK is a heterotrimer containing an alpha subunit with catalytic activity and two beta and gamma subunits without catalytic activity. The latter is thought to regulate the activity of the alpha subunit. Yes. AMPK subunits are more widely distributed than expected in tissues such as the brain, heart, spleen, and lungs where there is no lipogenesis. This wide distribution suggests that there are other effects besides the regulation of lipid metabolism.
[0008]
PRK (proliferation-related kinase) is a serum / cytokine-induced STK and is involved in the regulation of the cell cycle and proliferation of human megakaryocyte cells (Li, B. et al. (1996) J. Biol. Chem. 271 : 19402-8). PRK is related to the polo (derived from the human polo gene) family of STKs involved in cell division. The expression of PRK is down-regulated in lung tumor tissues, which may be a proto-oncogene that causes oncogenic transformation by deregulated expression in normal tissues.
[0009]
Cyclin-dependent protein kinases (CDKs) are another group of STKs that control cell development throughout the cell cycle. Cyclins are small regulatory proteins that act as activators that bind to CDK and then move through various processes in the cell cycle by phosphorylating and activating specific proteins involved in the cell division process . CDK is unique in that it requires a variety of stimuli to be activated. In addition to cyclin binding, CDK activation requires phosphorylation of specific threonine residues and dephosphorylation of specific tyrosine residues.
[0010]
Protein tyrosine kinases (PTKs) specifically phosphorylate tyrosine residues of target proteins and can be classified into transmembrane receptor PTKs and non-transmembrane non-receptor PTKs. Transmembrane protein tyrosine kinases are the receptors for most growth factors. When the growth factor binds to the receptor, the phosphate group from ATP is transferred to a specific tyrosine side chain of the receptor and other specific proteins. Growth factors (GF) involved in receptor type PTK include epidermal growth factor, platelet-derived growth factor, fibroblast growth factor, hepatocyte growth factor, insulin and insulin-like growth factor, nerve growth factor, vascular endothelial growth factor As well as macrophage colony stimulating factor.
[0011]
Non-receptor PTK lacks a transmembrane region and binds to the intracellular region of the cell surface receptor to form a complex. Receptors that exert their functions through non-receptor type PTK in this way include cytokine receptors, hormone (growth hormone and prolactin) receptors, and antigen-specific receptors for T lymphocytes and B lymphocytes.
[0012]
Many of these PTKs were first identified as mutant oncogene products in cancer cells, and PTK activation in cancer cells no longer provides normal cellular control. In fact, about 1/3 of the known oncogenes encode PTK, and it is well known that cell transformation often involves increased tyrosine phosphorylation activity ( Carbonneau H and Tonks NK (1992) Annu. Rev. Cell. Biol. 8: 463-93). That is, modulation of PTK activity can be an important strategy for controlling certain types of cancer.
[0013]
Extracellular signal-regulated kinase (ERK) / Mitogen-activated protein (MAP) Kinase
The protein provided in the present invention is a novel human mitogen-activated protein (MAP) kinase and is also referred to as an extracellular signal-regulated kinase (ERK). MAP kinase is a member of the STK family. MAP kinases regulate vast cell signaling pathways and mediate signal transduction from the cell surface into the nucleus through a phosphorylation cascade. Several subgroups have been identified so far, each with different substrate specificity and responsive to different extracellular stimuli (Egan, S. E. and Weinberg, R. A. (1993) Nature 365: 781-783). The MAP kinase signaling pathway is also present in mammalian cells and yeast. Extracellular stimuli that activate mammalian pathways include epidermal growth factor (EGF), ultraviolet light, hypertonic medium, heat shock, endotoxin lipopolysaccharide (LPS), and tumor necrosis factor (TNF) and interleukins Proinflammatory cytokines such as 1 (IL-1) are included. Abnormal expression of MAP kinase has been implicated in a variety of pathologies such as cancer, inflammation, immune abnormalities, and diseases that affect growth and development.
[0014]
MAP kinase is activated by a wide range of extracellular signals, threonine and tyrosine residues are highly phosphorylated, and highly conserved across species, resulting in a huge integration of biochemical signals (Crews et al., Science 258: 478-480, 1992).
[0015]
MEK1 and MEK2 are also ERK / MAP kinases. The constitutive activation of MEK1 causes cellular transformation and therefore MEK1 is an ideal drug target in the treatment of proliferative diseases. In addition, MEK1 inhibition has resulted in a reduction of colon cancer growth to 80% without toxic side effects (Sebolt-Leopold et al., Nature Med. 5: 810-816, 1999). Therefore, MEK and other inhibitors of ERK / MAP kinase are useful as safe and effective therapeutic agents for cancers including colon cancer.
[0016]
The ERK protein provided by the present invention shows a high degree of structural similarity with ERK7. ERK7 is constitutively activated in serum-deprived cells. This activity is dependent on the nuclear localization of ERK7 and the presence of a C-terminal tail that regulates growth inhibitory function. Thus, ERK7 is characterized by its interaction with its own C-terminal tail rather than extracellular signal-mediated activation in regulating its activation, localization, and function A type of MAP kinase is shown (Abe et al., Mol Cell Biol 1999 Feb; 19 (2): 1301-12).
[0017]
A more detailed review on ERK / MAP kinases can be found in Crews et al., Science 258: 478-480, 1992; Orth et al., Science 285: 1920-1923, 1999; Rampoldi et al., Cytogenet. Cell Genet. Ryan et al., Nature 404: 892-897, 2000; Sebolt-Leopold et al., Nature Med. 5: 810-816, 1999; Seger et al., FASEB J. 9: 726-735, 1995; Seger et al., J. Biol. Chem. 267: 25628-25631, 1992; and Zheng et al., J. Biol. Chem. 268: 11435-11439, 1993.
[0018]
Kinase proteins, particularly members of the MAP / extracellular signal-regulated kinase subfamily, are major targets for drug action and drug development. Therefore, identifying and characterizing previously unknown members belonging to this subfamily of kinase proteins is valuable in the field of pharmaceutical development. The present invention facilitates the state of the art in that it provides previously unknown human kinase proteins that have homology to members of the MAP / extracellular signal-regulated kinase subfamily.
DISCLOSURE OF THE INVENTION
[0019]
Summary of the Invention
The present invention is based on part of the amino acid sequence identification of human kinase peptides and proteins related to the MAP / extracellular signal-regulated kinase subfamily, these allelic variants, and these orthologs in other mammals. is there. These unique peptide sequences and the nucleic acid sequences encoding these peptides can be used as models for human therapeutic target development, helping to identify proteins used for therapy, in cells and tissues that express kinases It may be a target in the development of human therapeutics that modulate the kinase activity of The experimental data in FIG. 1 shows expression in the larynx, kidney (adult and fetus), pancreas, fetal heart, uterus, and prostate in humans.
[0020]
Detailed Description of the Invention
Introduction
The present invention is based on the sequencing of the human genome. Proteins identified and characterized in the art as kinase proteins, or parts thereof, and associated with the MAP / extracellular signal-regulated kinase subfamily by analyzing sequence information during human genome sequencing and construction An unidentified fragment of the human genome has been revealed that encodes a peptide having structural and / or sequence homology to the / peptide / domain. These sequences were used to construct, transcribe additional genomic sequences, and / or to isolate and characterize cDNA sequences. Based on this analysis, the present invention provides the amino acid sequences of human kinase peptides and proteins related to the MAP / extracellular signal-regulated kinase subfamily, transcription sequences, cDNA sequences, and / or genomic sequences encoding these kinase peptides and proteins. Nucleic acid sequence in form, nucleic acid variation (allelic information), tissue distribution of expression, as well as information on the most relevant known proteins / peptides / domains that have structural or sequence homology to the kinases of the invention It is to provide.
[0021]
Peptides provided in the present invention can be selected based on their ability to be useful for the development of commercially important products and services in addition to being previously unknown. In particular, the peptides of the present invention have homology and / or structural correlation to known kinase proteins in the MAP / extracellular signal-regulated kinase subfamily and are based on the observed expression pattern Selected. The experimental data in FIG. 1 shows expression in the larynx, kidney (adult and fetus), pancreas, fetal heart, uterus, and prostate in humans. This technology clearly establishes the commercial importance of this family of proteins and proteins with expression patterns similar to the genes of the present invention. More specific properties for the peptides of the present invention and their use are described herein, particularly in the background of the invention, in the annotations of the drawings, and / or in the known MAP / extracellular signal-regulated kinase family or kinase protein Each of the subfamilies is well known in the art.
[0022]
Specific aspects
Peptide molecule
The present invention provides nucleic acid sequences encoding protein molecules identified as members of the kinase family of proteins, which are MAP / extracellular signal-regulated kinase subfamily (FIG. 2 protein sequences, FIG. Transcribed / cDNA sequence, and FIG. 3 shows the genomic sequence). FIG. 2 describes the peptide sequence and also describes obvious variants, in particular allelic variants identified using the information in this specification and FIG. 3, which are described herein in the present invention. Called the kinase peptide, kinase peptide, or peptide / protein of the invention.
[0023]
The invention consists of, consists essentially of, or includes the amino acid sequence of the kinase peptide shown in FIG. 2 (encoded by the transcription / cDNA of FIG. 1 or the nucleic acid molecule shown in the genomic sequence of FIG. 3). In addition to providing isolated peptides and protein molecules, all obvious variants of these peptides that are included and made and used in the present technology are provided. These variants are described in detail below.
[0024]
As used herein, a peptide is said to be “isolated” or “purified” when it is substantially free of cellular material or free of chemical precursors or other chemicals. . The peptides of the invention can be purified to homogeneity or other purity. The level of purification will depend on the intended use. An important property is that the function of the desired peptide can be exerted even if other components are present in large amounts in the preparation (the properties of the isolated nucleic acid molecule will be described later).
[0025]
For some uses, “substantially free of cellular material” means less than about 30% (dry weight) of other proteins (ie, contaminating proteins), less than about 20% of other proteins, Peptide preparations having less than about 10% or less than about 5% of other proteins are included. If the peptide is produced recombinantly, it can be substantially free of medium if the medium is less than 20% relative to the volume of the protein preparation.
[0026]
The term “substantially free of chemical precursors or other chemicals” includes peptide preparations separated from chemical precursors or other chemicals involved in the synthesis. In some embodiments, the term “substantially free of chemical precursors or other chemicals” refers to chemical precursors or other chemicals less than about 30% (dry weight), chemical precursors or other chemicals. Kinase peptide preparations having less than about 20% substance, less than about 10% chemical precursor or other chemical, or less than about 5% chemical precursor or other chemical.
[0027]
An isolated kinase peptide can be purified from cells that naturally express it, cells that have been altered (recombined) to express it, or can be synthesized using known protein synthesis methods . The experimental data in FIG. 1 shows expression in the larynx, kidney (adult and fetus), pancreas, fetal heart, uterus, and prostate in humans. For example, a nucleic acid molecule encoding a kinase peptide is cloned into an expression vector, which is further introduced into the host cell and the protein is expressed in the host cell. The protein can then be isolated from the cells by an appropriate purification scheme using standard protein purification techniques. Many of these techniques are described in detail below.
[0028]
Accordingly, the present invention relates to a protein comprising the amino acid sequence shown in FIG. 2 (SEQ ID NO: 2), for example, the transcription / cDNA nucleic acid sequence shown in FIG. 1 (SEQ ID NO: 1) and the genomic sequence shown in FIG. The protein encoded by SEQ ID NO: 3) is provided. The amino acid sequence of such a protein is shown in FIG. When the final amino acid sequence of such a protein is this amino acid sequence, the protein consists of the amino acid sequence.
[0029]
The present invention further includes a protein consisting essentially of the amino acid sequence shown in FIG. 2 (SEQ ID NO: 2), such as the transcription / cDNA nucleic acid sequence shown in FIG. 1 (SEQ ID NO: 1) and the genome shown in FIG. The protein encoded by the sequence (SEQ ID NO: 3) is provided. There are several additional amino acid residues in such an amino acid sequence, for example, about 1 to about 100 additional residues in the final protein, generally 1 to about 20 additional residues. In that case, the protein consists essentially of the amino acid sequence.
[0030]
The present invention further includes a protein comprising the amino acid sequence shown in FIG. 2 (SEQ ID NO: 2), such as the transcription / cDNA nucleic acid sequence shown in FIG. 1 (SEQ ID NO: 1) and the genomic sequence shown in FIG. The protein encoded by No. 3) is provided. A protein comprises an amino acid sequence when this amino acid sequence is at least part of the final amino acid sequence of the protein. In such cases, the protein may be a peptide only or may have additional amino acid molecules such as amino acid residues (contiguous coding sequence) or heterologous amino acid residues / peptide sequences that are naturally associated with the protein. it can. Such proteins can have several additional amino acid residues or can contain hundreds or more additional amino acids. A preferred species of protein comprising the kinase peptide of the invention is a naturally occurring mature protein. Methods for preparing / isolating these various types of proteins are briefly described below.
[0031]
The kinase peptides of the invention can be linked to non-homologous sequences to form chimeric or fusion proteins. Such chimeric and fusion proteins include a kinase peptide that is operably linked to a heterologous protein having an amino acid sequence that is substantially non-homologous to the kinase peptide. “Functionally linked” means that the kinase peptide and the heterologous protein are fused in frame. The heterologous protein can be fused to the N-terminus or C-terminus of the kinase peptide.
[0032]
In some uses, the fusion protein does not affect the activity of the kinase peptide itself. For example, fusion proteins include, but are not limited to, enzyme fusion proteins such as β-galactosidase fusion, yeast 2-hybrid GAL fusion, poly-His fusion, MYC label, HI label and Ig fusion. Such fusion proteins, particularly poly-His fusions, can facilitate the purification of recombinant kinase peptides. In certain host cells (eg, mammalian host cells), protein expression and / or secretion can be increased by using heterologous signal sequences.
[0033]
Chimeric or fusion proteins can be produced by standard recombinant DNA techniques. For example, DNA fragments encoding different protein sequences are ligated together in frame according to conventional techniques. In other embodiments, the fusion gene can be synthesized by conventional techniques including automated DNA synthesizers. Alternatively, anchor primers can be used for PCR amplification of gene fragments to form complementary overhangs between two consecutive gene fragments, which are then annealed and re-amplified to create a chimeric gene sequence ( Ausubel et al., “Current Protocols in Molecular Biology”, 1992). In addition, many expression vectors that already encode a fusion moiety (eg, a GST protein) are commercially available. Nucleic acids encoding kinase peptides can be cloned into such expression vectors such that the fusion moiety binds to the kinase peptide in frame.
[0034]
As explained above, the present invention also includes naturally occurring peptide mature forms, allelic / sequence variants of peptides, recombinantly induced variants of non-natural peptides, and orthologs and paralogs of peptides. Clear variations in amino acid sequences are provided and made feasible. Such mutants can be easily generated by using techniques known in the field of nucleic acid recombination techniques and protein biochemistry. However, it will be appreciated that this variant does not include any of the amino acid sequences disclosed prior to the present invention.
[0035]
Such mutants can be easily identified / manufactured using the molecular techniques and sequence information provided herein. Furthermore, such variants can be easily distinguished from other peptides based on sequence and / or structural homology to the kinase peptides of the present invention. This degree of homology / identity is mainly based on whether the peptide is a functional or non-functional variant, the amount of differences present in the paralog family, and the evolutionary distance between orthologs. Is judged.
[0036]
To determine the percent identity between two amino acid sequences or two nucleic acid sequences, the sequences are aligned for the purpose of making an optimal comparison (eg, for optimal alignment, the gap is first and Non-homologous sequences introduced into one or both of the second amino acid or nucleic acid sequences can be ignored for purposes of comparison). In a preferred embodiment, at least 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% or more of the length of the reference sequence is aligned for comparison purposes. The amino acid residues or nucleotides at corresponding amino acid positions or nucleotide positions are then compared. When a position in the first sequence is occupied by the same amino acid residue or nucleotide as the corresponding position in the second sequence, the molecule is identical to that position (the “identity of the amino acid or nucleic acid used herein). “Sex” is equivalent to “homology” of amino acids or nucleic acids). The percent identity between two sequences is a function of the number of identical arrangements shared in the sequence, taking into account the number of gaps and the length of each gap, gaps introduced for optimal alignment of the two sequences Need to be done.
[0037]
Comparison of sequences between two sequences and determination of percent identity and percent similarity can be performed using mathematical algorithms ("Computational Molecular Biology", Lesk, AM, Oxford University Press, New York, 1988; “Biocomputing: Informatics and Genome Projects”, Smith, DW, Academic Press, New York, 1993; “Sequence Data” Computer Analysis of Sequence Data, Part 1 ”, Griffin, AM, and Griffin, HG, Humana Press, New Jersey, 1994;“ Sequence Analysis in Molecular Biology ” Von Heinje, G., Academic Press, 1987; and "Sequence Analysis Primer", edited by Gribskov, M. and Devereux, J., M Stockton Press, New York, 1991). In a preferred embodiment, the percent identity between two amino acid sequences is determined by the GCG software package (http://www.gcg.comThe Needleman and Wunsch algorithm (J. Mol. Biol. (48): 444-453 (1970)) incorporated into the GAP program of GAP program, and either a Blossom62 matrix or a PAM250 matrix, and a gap weight of 16, Determined using 14, 12, 10, 8, 6 or 4 and length weight 1, 2, 3, 4, 5 or 6. In a further preferred embodiment, the percent identity between two nucleotide sequences is determined by the GCG software package (http://www.gcg.comAvailable from the GAP program (Devereux, J., et al. (Nucleic Acids Res. 12 (1): 387 (1984))), NWSgapdna.CMP matrix, and gap weights 40, 50, 60, 70 or 80 , And a length weight of 1, 2, 3, 4, 5 or 6. In other embodiments, the percent identity between two amino acid or nucleotide sequences can be determined using the ALIGN program (version 2.0). ) And E. Myers and W. Miller algorithm (CABIOS, 4: 11-17 (1989)) incorporated into the PAM120 weight residue table, gap length penalty 12, and gap penalty 4. .
[0038]
The nucleic acid and protein sequences of the present invention can further be used as “query sequences” that perform searches against sequence databases, eg, to identify other families or related sequences. Such searches can be performed using Altschul et al.'S NBLAST and XBLAST programs (version 2.0) (J. Mol. Biol. 215: 403-10 (1990)). A BLAST nucleotide search can be performed with a score = 100 and wordlength = 12, using the NBLAST program to obtain a nucleotide sequence homologous to the nucleic acid molecule of the present invention. The BLAST protein search can be performed using the XBLAST program with a score of 50 and a word length of 3 in order to obtain an amino acid sequence homologous to the protein of the present invention. In order to obtain a gap alignment for comparative purposes, the gap BLAST (Gapped BLAST) (Nucleic Acids Res. 25 (17): 3389-3402 (1997)) can be used as described by Altschul et al. When using BLAST and gap BLAST programs, the default parameters of each program (eg, XBLAST and NBLAST) can be used.
[0039]
In a protein comprising one of the peptides of the present invention, the full form of the pre-mature processed and processed forms is the complete sequence identity to one of the kinase peptides of the present invention. And can be readily identified as being encoded by the same locus as the kinase peptide provided herein. The genes provided by the present invention have been shown to be located on genomic components mapped to human chromosome 8 based on evidence from various directions such as STS and BAC map data (FIG. 3). To show).
[0040]
An allelic variant of a kinase peptide is a human protein that has a high (significant) sequence homology / identity to at least a portion of the kinase peptide, as well as the same gene as the kinase peptide provided herein It can be easily identified as being encoded in the locus. The locus can be easily determined based on the genomic information shown in FIG. 3, such as a genomic sequence mapped to a reference human. The genes provided by the present invention have been shown to be located on genomic components mapped to human chromosome 8 based on evidence from various directions such as STS and BAC map data (FIG. 3). To show). As used herein, the amino acid sequence typically has at least about 70-80%, 80-90%, more typically at least about 90-95%, or more homology. In some cases, two proteins (or protein regions) have significant homology. According to the present invention, an amino acid sequence having significant homology is encoded by a nucleic acid sequence that hybridizes with a nucleic acid molecule encoding a kinase peptide under stringent conditions as described in more detail below. Conceivable.
[0041]
FIG. 3 shows information about SNPs found in the gene encoding the kinase protein of the present invention. The following mutations have been identified; T1004G, G1822T, A2023G, A2562G, and C6624A. Introns and SNPs 5 'to the ORF may affect regulatory / regulatory elements.
[0042]
A kinase peptide paralog has some significant sequence homology / identity to at least a portion of the kinase peptide, is encoded by a human-derived gene, and has similar activity or function Can be easily identified. If the amino acid sequence has a homology of typically at least about 60% or more, more typically at least about 70% or more, through a given region or domain, the two proteins are typically It is considered a paralog. Such paralogs are believed to be encoded by nucleic acid sequences that hybridize with nucleic acid molecules encoding kinase peptides under mild to stringent conditions, as described in more detail below.
[0043]
Orthologs of kinase peptides can be readily identified as having some significant sequence homology / identity to at least a portion of the kinase peptide and being encoded by genes from other organisms. Preferred orthologs are isolated from mammals, preferably primates, and used for the development of human therapeutic targets and therapeutic agents. Such orthologs are believed to be encoded by a nucleic acid sequence that hybridizes with a nucleic acid molecule encoding a kinase peptide under mild to stringent conditions, as described in more detail below. This depends on the degree of association between the two organisms that produce the protein.
[0044]
Non-natural variants of the kinase peptides of the present invention can be readily generated using recombinant techniques. Such variants include, but are not limited to, those resulting from deletions, additions and substitutions in the amino acid sequence of the kinase peptide. For example, one type of substitution includes conservative amino acid substitution. This substitution is one in which a given amino acid in the kinase peptide is replaced by another amino acid with similar characteristics. Typical conservative substitutions include substitution from one of the aliphatic amino acids Ala, Val, Leu and Ile to the other, substitution between the hydroxyl residues Ser and Thr, acidic residues There are substitutions of the groups Asp and Glu, substitutions between the amide residues Asn and Gln, substitutions of the basic residues Lys and Arg, and substitutions of the aromatic residues Phe and Tyr. Guidance on which amino acid changes have the potential to be phenotypically silent is described in Bowie et al., Science 247: 1306-1310 (1990).
[0045]
Mutant kinase peptides may be fully functional or may lack function in one or more activities such as, for example, substrate binding ability, substrate phosphorylation ability, signal transduction regulation ability, and the like. Fully functional variants typically include only conservative mutations, or mutations at non-fatal residues or within non-fatal regions. FIG. 2 shows the results of protein analysis and can be used to identify lethal domains / regions. Functional variants may also include substitutions of similar amino acids that do not change function or have no significant change in function. On the other hand, such substitutions may have some positive or negative effect on function.
[0046]
Non-functional variants typically include one or more non-conservative amino acid substitutions, deletions, insertions, inversions or truncations, or substitutions within a critical residue or critical region, Insertion, inversion or deletion is included.
[0047]
Amino acids essential for function can be obtained by methods known in the art, such as, for example, site-directed mutagenesis, or alanine scanning mutagenesis (Cunningham et al., Science 244: 1081-1085 (1989)). It can identify using the result shown in. Alanine scanning mutagenesis introduces a single alanine mutation at every residue in the molecule. The resulting mutant molecules are then tested for assays such as biological activity, such as kinase activity, or in vitro proliferative activity analysis. Sites important for binding / substrate binding are determined by structural analysis such as crystallization, nuclear magnetic resonance, or optical affinity labeling (Smith et al., J. Mol. Biol. 224: 899-904 (1992) de Vos et al., Science 255: 306-312 (1992)).
[0048]
The present invention further provides fragments of kinase peptides, in addition to proteins and peptides comprising and consisting of such fragments, in particular proteins and peptides comprising the residues identified in FIG. Is. However, fragments relevant to the present invention are not considered to include fragments published prior to the present invention.
[0049]
As used herein, a fragment comprises at least 8, 10, 12, 14, 16, or more consecutive amino acids of a kinase peptide. Such fragments can be selected based on their ability to retain one or more biological activities of the kinase peptide, or by their ability to perform functions such as binding to a substrate or acting as an antigen. A particularly important fragment is a biologically active fragment, for example a peptide of about 8 or more amino acids in length. Such a fragment is typically considered to contain a domain or motif of a kinase peptide, such as an active site, a transmembrane domain or a substrate binding domain. Further possible fragments include, but are not limited to, domain or motif-containing fragments, soluble peptide fragments, immunogenic structure-containing fragments. The putative domain and functional site can be easily confirmed by a known computer program (for example, PROSITE analysis) that is readily available to those skilled in the art. The results from one such analysis are shown in FIG.
[0050]
Polypeptides often contain amino acids other than the 20 amino acids commonly referred to as the 20 natural amino acids. In addition, many amino acids, including terminal amino acids, can be modified by natural processes such as processing and other post-translational modifications, or chemical modification techniques known in the art. General modifications that occur naturally in kinase peptides are described in basic texts, detailed literature and research papers, which are well known to those skilled in the art. (Some of these properties are confirmed in Figure 2).
[0051]
Known modifications include acetylation, acylation, ADP ribosylation, amidation, covalent addition of flavins, covalent addition of heme moieties, covalent addition of nucleotides or nucleotide derivatives, covalent addition of lipids or lipid derivatives, Phosphatidylinositol covalent addition, cross-linking, cyclization, disulfide bond formation, demethylation, covalent cross-linking formation, cystine formation, pyroglutamate formation, formylation, γ-carboxylation, glycosylation, GPI anchor Transcription RNA-mediated addition of amino acids to proteins such as formation, hydroxylation, iodination, methylation, myristoylation, oxidation, proteolytic processing, phosphorylation, prenylation, racemization, selenoylation, sulfation, arginylation, and Including but not limited to ubiquitination
[0052]
Such modifications are well known to those skilled in the art and have been described in great detail in the scientific literature. Some particularly common modifications, such as glycosylation, lipidation, sulfation, γ-carboxylation of glutamic acid residues, hydroxylation, and ADP ribosylation, are described in “Proteins-Structure and Molecular Properties”. Properties), 2nd edition, TE Creighton, WH Freeman and Company, New York (1993). For a detailed review on this point, see Wold, F., “Posttranslational Covalent Modification of Proteins,” BC Johnson, Academic Press, New York 1-12 (1983); Seifter et al., Many reviews are available such as (Meth. Enzymol. 182: 626-646 (1990)) and Rattan et al. (Ann. NY Acad. Sci. 663: 48-62 (1992)).
[0053]
Therefore, the kinase peptide of the present invention also encompasses derivatives or analogs, in which the substituted amino acid residue is not encoded by the genetic code, includes a substituent, and a mature kinase peptide Are fused with other compounds such as compounds that increase the half-life of the kinase peptide (eg, polyethylene glycol), or additional amino acids are added to the leader sequence, secretory sequence, purified sequence of the mature kinase peptide, or preprotein sequence Fusion with a mature kinase peptide such as
[0054]
protein / Use of peptides
The proteins of the present invention can be used in substantial and specific assays related to the functional information shown in the drawings, for example to produce antibodies or induce other immune responses; As a reagent (including a labeling reagent) used in an assay for quantification of its binding target or ligand) level; and selectively expresses the corresponding protein (in tissue differentiation or development or disease state) Alternatively, it can be used as a tissue marker (expressed at any particular stage). If a protein binds or has the potential to bind to another protein or ligand (eg, kinase-effector protein interaction, or kinase-ligand interaction), this protein is used to bind / ligand And a system can be developed that identifies inhibitors of binding interactions. Some or all of these can be developed into reagent grade or kit formats for commercialization.
[0055]
Methods of implementing the uses listed above are well known to those skilled in the art. References disclosing such methods include "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Sambrook, J., EF Fritsch and T. Maniatis, 1989, and “Methods in Enzymology: Guide to Molecular Cloning Techniques”, Academic Press, Berger, SL and AR Kimmel, 1987.
[0056]
Potential uses of the peptides of the invention are based primarily on the origin of the protein and the type / action of the protein. For example, kinases isolated from humans and their human / mammalian orthologs are used in mammalian therapeutic applications, such as biological reactions or diseases in human drugs, particularly cells or tissues expressing the kinase. It is useful as a target for identifying substances that are used in the modulation of physical responses. The experimental data in FIG. 1 shows that the kinase protein of the present invention is expressed in the larynx, kidney (adult and fetus), pancreas, fetal heart, uterus, and prostate in humans. In particular, virtual Northern blot analysis shows expression in the larynx, kidney, and pancreas. In addition, PCR-based tissue screening panels have shown expression in fetal heart, fetal kidney, uterus, prostate, and pancreas. Many of the drugs that modulate the activity of kinase proteins, particularly MAP / extracellular signal-regulated kinase subfamily members, are currently under development (see background of the invention). The structural and functional information described in the background and drawings of the invention, in particular in combination with the expression information of FIG. 1, provides specific and substantial use of the molecules of the invention. The experimental data in FIG. 1 shows expression in the larynx, kidney (adult and fetus), pancreas, fetal heart, uterus, and prostate in humans. Such use can be readily determined using the information provided herein, information known in the art, and routine experimentation.
[0057]
The proteins of the present invention (including variants and fragments disclosed prior to the present invention) are useful in biological assays for kinases associated with MAP / extracellular signal-regulated kinase subfamily members. Such assays are useful for the diagnosis and treatment of any known kinase function or activity, or in particular the symptoms associated with kinases unique to the kinase subfamily to which one of the invention belongs, in cells and tissues that express the kinase. Related to useful properties. The experimental data in FIG. 1 shows that the kinase protein of the present invention is expressed in the larynx, kidney (adult and fetus), pancreas, fetal heart, uterus, and prostate in humans. In particular, virtual Northern blot analysis shows expression in the larynx, kidney, and pancreas. In addition, PCR-based tissue screening panels have shown expression in fetal heart, fetal kidney, uterus, prostate, and pancreas.
[0058]
The proteins of the present invention are also useful in drug screening assays in cell-based or cell-free systems. A cell-based system is a cell that normally expresses a kinase in its natural form, ie, in biopsy material or in growing cell culture medium. The experimental data in FIG. 1 shows expression in the larynx, kidney (adult and fetus), pancreas, fetal heart, uterus, and prostate in humans. In an alternative embodiment, the cell-based assay involves a recombinant host cell that expresses a kinase protein.
[0059]
The polypeptides can be used to identify compounds that modulate the kinase activity of the protein in its native state or in a modified form that causes a particular disease or condition associated with the kinase. Any of the kinases of the invention, as well as suitable variants and fragments, can be used in high throughput screens to assay candidate compounds capable of binding to the kinase. These compounds can be further screened for functional kinases to determine the effect of the compound on these kinase activities. In addition, these compounds can be tested to determine activity / effect in animal or invertebrate systems. A compound is identified whether it activates (agonist) or inactivates (antagonist) the kinase to a desired extent.
[0060]
Furthermore, the protein of the present invention comprises a kinase protein and a molecule that normally interacts with the kinase protein (eg, a signal pathway substrate or component that the kinase protein normally interacts with (eg, another kinase)). It can be used to screen compounds for the ability to stimulate or inhibit an interaction. Such assays generally include conditions under which a kinase protein or fragment can interact with a target molecule and detect complex formation between the protein and the target, or protein phosphorylation, cAMP rotation, And the step of binding the kinase protein to the candidate compound under conditions that allow detection of the biochemical consequences of the interaction between the kinase protein and the target, such as actions associated with signal transduction such as adenylate cyclase activity. Is included.
[0061]
Candidate compounds include, for example, 1) soluble peptides comprising a fusion peptide whose final portion is Ig and a random peptide library (eg, Lam et al., Nature 354: 82-84 (1991); Houghten et al., Nature 354: 84-86 (1991)), and peptides comprising members of molecular libraries derived from combinatorial chemistry composed of D-type and / or L-type amino acids; 2) phosphopeptides (eg, randomly and partially altered Phosphopeptide library members; see, eg, Songyang et al., Cell 72: 767-778 (1993)); 3) antibodies (eg, polyclonal antibodies, monoclonal antibodies, humanized antibodies, anti-idiotype antibodies, chimeric antibodies, and Single-chain antibodies, as well as Fab and F (ab ')₂, Fab expression library fragments, and epitope binding fragments of antibodies); and 4) small organic and inorganic molecules (eg, molecules from combinatorial and natural product libraries).
[0062]
Some candidate compounds are soluble fragments of the receptor that compete for substrate binding. Other candidate compounds include mutated kinases or appropriate fragments containing mutations that affect kinase function and thus compete with the substrate. Thus, for example, fragments that compete with the substrate are included in the present invention, eg, have high affinity or the fragment binds to the substrate and does not dissociate.
[0063]
The invention further includes other endpoint assays for identifying compounds that modulate (stimulate or inhibit) kinase activity. This assay is generally associated with the assay of events in signal transduction pathways that exhibit kinase activity. For this, assays for substrate phosphorylation, protein activation, and gene expression changes that are regulated to promote or suppress responses to kinase protein-dependent signal cascades are performed.
[0064]
Any biological or biochemical function mediated by the kinase can be used as an endpoint assay. These include all biochemical or biochemical / biological events described herein, and references cited herein reference these endpoint assay targets. These are incorporated herein by reference and include other functions that are known to those skilled in the art or that can be readily identified using the information in the drawings, particularly FIG. In particular, assays can be performed for the biological function of cells or tissues that express the kinase. The experimental data in FIG. 1 shows expression in the larynx, kidney (adult and fetus), pancreas, fetal heart, uterus, and prostate in humans. In particular, virtual Northern blot analysis shows expression in the larynx, kidney, and pancreas. In addition, PCR-based tissue screening panels have shown expression in fetal heart, fetal kidney, uterus, prostate, and pancreas.
[0065]
Binding and / or activating compounds can also be screened by using chimeric kinase proteins, such as amino-terminal extracellular domain or part thereof, seven transmembrane segments or intracellular or extracellular loops. It can be replaced with a heterologous domain or subregion in the entire transmembrane domain or subregion and in the carboxyl-terminal intracellular domain or part thereof. For example, the substrate binding region can be used to interact with a different substrate and is further recognized by an untreated kinase. Thus, different sets of signaling components can be utilized as activation endpoint assays. Such a method allows the assay to be performed outside the specific host cell from which the kinase is derived.
[0066]
The proteins of the invention are also useful in competitive binding assays, which are methods designed to discover compounds that interact with kinases (eg, binding targets and / or ligands). To this end, the compound is contacted with the kinase polypeptide under conditions that allow the compound to bind or interact with the polypeptide. Soluble kinase polypeptide is also added to the mixture. When the test compound interacts with a soluble kinase polypeptide, the amount or activity of the complex formed from the kinase target is decreased. This type of assay is particularly useful when searching for compounds that interact with specific regions of the kinase. Accordingly, soluble polypeptides that compete with the target kinase region are designed to include a peptide sequence corresponding to the region of interest.
[0067]
To perform a cell-free drug screening assay, a kinase protein or fragment, or target molecule thereof, to facilitate separation of the complex from one or both uncomplexed forms of the protein and to accommodate assay automation It may be desirable to immobilize either of these.
[0068]
In drug screening assays, techniques for immobilizing proteins on a matrix can be used. In some embodiments, the fusion protein can be added with a domain that can bind the protein to a matrix. For example, glutathione-S-transferase fusion proteins can be adsorbed onto glutathione sepharose beads (Sigma Chemica 1, St. Louis, M0) or glutathione-derived microtiter plates and then cell lysates (eg,³⁵S-label) and the candidate compound are combined and the mixture is incubated under complex formation-inducing conditions (eg, physiological conditions of salt and pH). After incubation, the beads are washed to remove unbound label, the matrix is immobilized, and the radiolabel is measured directly or the supernatant after separation of the complex is measured. Alternatively, the complex can be separated from the matrix by SDS-PAGE, and the level of kinase binding protein in the bead fraction can be quantified from the gel by using standard electrophoresis techniques. For example, either the polypeptide or its target molecule is immobilized using biotin and streptavidin binding utilizing techniques well known in the art. Alternatively, antibodies that react with the protein and do not interfere with the binding of the protein to the target molecule are derivatized into the wells of the plate, and the protein is trapped in the wells by binding to the antibody. The preparation of kinase binding protein and candidate compound can be cultured in wells where the kinase protein is present and the amount of complexes trapped in the wells can be quantified. As a method for detecting such a complex, in addition to the above-described method using a GST-immobilized complex, an antibody reactive to a kinase protein target molecule, or an antibody reactive to a kinase protein and competing with a target molecule And immunoassay of the complex using and an enzyme binding assay based on the detection of enzyme activity associated with the target molecule.
[0069]
An agent that modulates one of the kinases of the invention can be identified by using one or more of the above-described assays, alone or in combination. In general, it is preferable to first use a cell-based or cell-free system and then confirm activity in an animal or other model system. Such model systems are well known in the art and can be readily used in this description.
[0070]
Modulators of kinase protein activity identified by these drug screening assays can be used to treat patients suffering from diseases mediated by the kinase pathway by processing the cells or tissues that express the kinase. The experimental data in FIG. 1 shows expression in the larynx, kidney (adult and fetus), pancreas, fetal heart, uterus, and prostate in humans. These methods of treatment include administering a modulator of kinase activity in a pharmaceutical composition in an amount necessary to treat the patient, and the modulator is identified as described herein.
[0071]
In another aspect of the invention, a two-hybrid assay or a three-hybrid assay (US Pat.No. 5,283,317) is used to identify other proteins that bind or interact with kinases and are associated with kinase activity. Zervos et al. (1993) Cell 72: 223-232; Madura et al. (1993) J. Biol. Chem. 268: 12046-12054; Bartel et al. (1993) Biotechniques 14: 920-924; Iwabuchi et al. (1993) Oncogene 8: 1693-1696; and Brent WO 94/10300), kinase proteins can be used as “bait proteins”. Such a kinase binding protein may be involved in, for example, a kinase protein as a downstream element of a kinase-mediated signal transduction pathway or signal transduction by a kinase target. Alternatively, such a kinase binding protein may be a kinase inhibitor.
[0072]
The two-hybrid system is based on the modular nature of most transcription factors that consist of separable DNA binding and activation domains. Simply put, this assay utilizes two different DNA structures. In one structure, the gene encoding the kinase protein is fused to a gene encoding the DNA binding domain of a known transcription factor (eg, GAL4). In the other structure, a gene obtained from a DNA sequence library and whose DNA sequence encoding an unknown protein ("pray" or "sample") encodes an activation domain of a known transcription factor Is fused. When the “bait protein” and “prey protein” can interact in vivo and form a kinase-dependent complex, the DNA binding and activation domains of the transcription factor are in close proximity. This proximity allows transcription of a reporter gene (eg, LacZ) that functionally binds to a transcriptional regulatory site that responds to transcription factors. Reporter gene expression can be detected and cell colonies containing functional transcriptional regulators can be isolated and used to obtain cloned genes that encode proteins that interact with kinase proteins.
[0073]
The invention further relates to novel substances identified by the aforementioned screening assays. Accordingly, it is within the scope of the present invention to use substances identified as described herein in appropriate animal models. For example, agents identified as described herein (eg, kinase modulators, antisense kinase nucleic acid molecules, kinase specific antibodies, or kinase binding targets) can be treated with the efficacy, toxicity, or It can be used in animals or other models to determine side effects. Alternatively, substances identified as described herein can be used in animals or other models to determine the mechanism of action of such substances. Furthermore, the present invention relates to the use of novel drugs identified by said screening assays for treatment as described herein.
[0074]
The kinase proteins of the invention are useful for providing targets for diagnosis of diseases or predispositions mediated by peptides. Accordingly, the present invention provides a method for detecting the presence or level of a protein (or encoded mRNA) in a cell, tissue or organism. The experimental data in FIG. 1 shows expression in the larynx, kidney (adult and fetus), pancreas, fetal heart, uterus, and prostate in humans. The method includes contacting a biological sample with a compound that has the ability to interact with a kinase protein and the interaction is detectable. Such assays are provided in a single detection format or a multiple detection format such as an antibody chip array.
[0075]
One substance that detects a protein in a sample is an antibody that can selectively bind to the protein. Biological samples include tissues, cells, and body fluids isolated from a subject, as well as tissues, cells, and body fluids present within the subject.
[0076]
The peptides of the invention also provide targets for use in diagnosing protein activity, disease or predisposition, particularly activity and symptoms known to other members of the existing protein family, in patients with mutant peptides. . Thus, peptides can be isolated from biological samples and assayed for the presence of genetic mutations that result in abnormal peptides. This includes amino acid substitutions, deletions, insertions, rearrangements (resulting from abnormal splicing events), and inappropriate post-translational modifications. Analysis methods include changes in electrophoretic mobility, changes in tryptic peptide digestion, changes in kinase activity by cell-based or cell-free assays, changes in substrate or antibody binding patterns, changes in isoelectric point, direct amino acid sequence Other known assay techniques useful for determination and detection of protein mutations. Such assays are provided in a single detection format or a multiple detection format, such as an antibody chip array.
[0077]
Peptide in vitro detection techniques include enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), immunoprecipitation using detection reagents such as Western blots, antibodies, or protein binders and immunofluorescence. Alternatively, in vivo detection of a peptide can be performed in a subject by introducing a labeled anti-peptide antibody, or other type of detection agent, into the subject, for example, the antibody can be labeled with a radioactive marker, The presence and location of this marker in the subject can be detected by standard imaging techniques. Methods for detecting allelic variants of peptides expressed in a subject and methods for detecting peptide fragments in a sample are particularly useful.
[0078]
The peptides are also useful in pharmacogenetic analysis. Pharmacogenetics deals with clinically significant genetic variation in response to drugs according to the trend of drug changes and the abnormal effects of affected humans. For example, Eichelbaum, M. (Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 23 (10-11): 983-985 (1996)), and Linder, MW (Clin. Chem. 43 (2): 254-266 (1997) )reference. The clinical consequences of these mutations, as a result of the individual's metabolic mutation, result in severe toxicity of the therapeutic drug for some individuals, or the failure of treatment for some individuals. Thus, the genotype of an individual can determine how the therapeutic compound acts in the body or how the body metabolizes the compound. In addition, the activity of drugs that metabolize enzymes affects both the intensity and duration of drug action. Thus, the pharmacogenetics of an individual allows the selection of effective compounds and effective dosages of such compounds in prophylactic or therapeutic treatment based on the individual's genotype. Explain why discovery of genetic polymorphism in an enzyme-metabolizing drug does not allow a patient to achieve the expected efficacy, exhibits excessive efficacy, or suffers significant toxicity from standard dosages can do. Polymorphism can be represented by the phenotype of an extensive metabolizer and the poor metabolizer phenotype. Thus, polymorphism of a gene may lead to allelic protein mutations in the kinase protein such that one or more of the kinase functions of one population is different from that of the other population. Thus, peptides can serve as targets for confirming predisposition of genes that can affect therapy. Thus, in ligand-based therapy, polymorphism can result in amino-terminal extracellular domains and / or other substrate-binding regions with higher or lower substrate-binding activity and kinase activity. Thus, in a given population containing polymorphisms, the substrate dosage will necessarily be modified to maximize the therapeutic effect. As an alternative to genotyping, specific polymorphic peptides can be identified.
[0079]
Peptides are also useful for treating disorders characterized by lack of protein expression, inappropriate protein expression, or undesirable protein expression. The experimental data in FIG. 1 shows expression in the larynx, kidney (adult and fetus), pancreas, fetal heart, uterus, and prostate in humans. Accordingly, therapeutic methods include the use of kinase proteins or fragments.
[0080]
antibody
The present invention also provides an antibody that selectively binds to one of the peptides of the present invention, proteins containing such peptides, variants thereof and fragments thereof. As used herein, an antibody selectively binds to a target peptide when the antibody binds to the target peptide and does not bind strongly to unrelated proteins. As long as the protein binds to another protein that is not substantially homologous to the target peptide, as long as the protein has homology with a fragment or domain of the peptide targeted by the antibody, the antibody selectively binds to the peptide. It is thought to combine. In this case, it is understood that the antibody bound to the peptide is still selective despite having some degree of cross-reactivity.
[0081]
As used herein, antibodies are defined by the same terms as those recognized in the art, and these are multi-subunit proteins produced by a mammalian organism in response to administration of an antigen. The antibodies of the present invention include polyclonal antibodies, monoclonal antibodies, and fragments of these antibodies, and Fab or F (ab ′)₂, And Fv fragments, but not limited thereto.
[0082]
Many methods are known for generating and / or identifying antibodies against a given target peptide. Some of such methods are described in Harlow, “Antibodies”, Cold Spring Harbor Press, (1989).
[0083]
In general, to generate antibodies, the isolated peptide is used as an immunogen and administered to a mammalian organism such as a rat, rabbit, or mouse. Full length proteins, antigenic peptide fragments or fusion proteins can be used. Particularly important fragments are those that contain a functional domain, such as the domain identified in FIG. 2, that can be easily identified using protein alignment methods and that have a family as shown in the figure. Domain with sequence homology or dissimilarity.
[0084]
The antibody is preferably prepared from a region of the kinase protein, or an isolated fragment. Antibodies can be prepared from any region of the peptide, as described herein. However, preferred regions will include regions that are involved in function / activity and / or kinase / binding target interactions. FIG. 2 can be used to identify particularly important regions, where sequence alignment can be used to identify conserved unique sequence fragments.
[0085]
Antigenic fragments are generally considered to comprise at least 8 consecutive amino acid residues. An antigenic peptide can comprise at least 10, 12, 14, 16, or more amino acid residues. Such fragments are selected based on physical properties such as, for example, a region located on the surface of the protein, eg, a fragment corresponding to a hydrophilic region, or sequence specificity (see FIG. 2). be able to.
[0086]
Detection of the antibody of the present invention can be easily performed by coupling (ie, physical binding) of a detectable substance and the antibody. Examples of detectable substances include various enzymes, prosthetic groups, fluorescent materials, luminescent materials, bioluminescent materials, and radioactive materials. Examples of suitable enzymes include horseradish peroxidase, alkaline phosphatase, β-galactosidase, or acetylcholinesterase, and examples of suitable prosthetic group complexes include streptapidin / biotin and avidin / biotin. Examples of such fluorescent materials include umbelliferone, fluorescein, fluorescein isothiocyanate, rhodamine, dichlorotriazinylamine fluorescein, dansyl chloride, or phycoerythrin. Examples of luminescent materials include luminol and bioluminescence. Examples of radioactive substances include luciferase, luciferin, and aequorin, and examples of suitable radioactive substances include¹²⁵I,¹³¹I,³⁵S or^ThreeContains H.
[0087]
Use of antibodies
The antibodies can be used to isolate one of the proteins of the invention by standard techniques such as affinity chromatography or immunoprecipitation. Antibodies can facilitate the purification of native proteins from cells and recombinantly produced proteins expressed in host cells. Furthermore, such antibodies are useful for detecting the presence of the protein of the present invention in cells or tissues because they determine the expression pattern of proteins in various tissues or normal developmental processes in vivo. The experimental data in FIG. 1 shows that the kinase protein of the present invention is expressed in the larynx, kidney (adult and fetus), pancreas, fetal heart, uterus, and prostate in humans. In particular, virtual Northern blot analysis shows expression in the larynx, kidney, and pancreas. In addition, PCR-based tissue screening panels have shown expression in fetal heart, fetal kidney, uterus, prostate, and pancreas. Furthermore, such antibodies can be used for the detection of proteins in situ, in vitro, in cell lysates, and in the supernatant to assess the amount and pattern of expression. Such antibodies can also be used to assess abnormal tissue distribution or expression during the development or progression of a biological state. Antibody detection in circulating fragments of the full-length protein can be used to identify turnover.
[0088]
In addition, antibodies can be used to assess expression in an active stage of a protein-related disease, or disease state, such as an individual with a predisposition to the disease. If the disorder is due to inappropriate tissue distribution, developmental expression, protein expression levels, or expression / progression status, antibodies are prepared against normal proteins. The experimental data in FIG. 1 shows expression in the larynx, kidney (adult and fetus), pancreas, fetal heart, uterus, and prostate in humans. If the disorder is characterized by a specific mutation in the protein, an antibody specific for this mutant protein can be used to assay for the presence of the specific mutant protein.
[0089]
Antibodies can also be used to assess normal or abnormal subcellular localization of cells in various tissues in vivo. The experimental data in FIG. 1 shows expression in the larynx, kidney (adult and fetus), pancreas, fetal heart, uterus, and prostate in humans. Use as a diagnostic can be applied not only to testing genes, but also to monitoring therapy. Thus, if treatment is ultimately aimed at correcting expression levels, or the presence of abnormal sequences and abnormal tissue distributions, or expression in development, antibodies directed against proteins or related fragments may be It can be used to monitor the effectiveness of treatment.
[0090]
In addition, antibodies are useful for pharmacogenetic analysis. Thus, antibodies prepared against polymorphic proteins can be used to identify individuals in need of treatment modification. Antibodies are also diagnostic tools such as electrophoretic mobility, isoelectric point, tryptic peptide digestion, and immunological markers of abnormal proteins that are analyzed by other physical assays known to those skilled in the art. It is also useful.
[0091]
Antibodies are also useful for classification of tissue types. The experimental data in FIG. 1 shows expression in the larynx, kidney (adult and fetus), pancreas, fetal heart, uterus, and prostate in humans. Thus, if a particular protein has been correlated with expression in a particular tissue, an antibody specific for this protein can be used to identify the tissue type.
[0092]
Antibodies are also useful for inhibiting protein function, for example, preventing the binding of kinase peptides to binding targets such as substrates. These uses can be applied in therapeutic situations related to protein function inhibition. The antibodies can be used, for example, to interfere with binding and to modulate (agonize or antagonize) peptide activity. Antibodies are prepared against specific fragments that contain the site necessary for function, or against the complete protein associated with the cell or cell membrane. FIG. 2 shows structural information relating to the protein of the present invention.
[0093]
The present invention also includes a kit that uses an antibody to detect the presence of a protein in a biological sample. The kit includes a labeled antibody or a labelable antibody, and a compound or reagent for detecting the protein in the biological sample; means for determining the amount of protein in the sample; the amount of protein in the sample and a standard amount Means for comparison; as well as instructions for use. Such a kit can be provided to detect a single protein or epitope, or can be configured to detect one of a number of epitopes, such as an antibody detection array. As arrays, nucleic acid arrays are described in detail below, and similar methods for antibody arrays have been developed.
[0094]
Nucleic acid molecule
The present invention further provides isolated nucleic acid molecules (cDNA, transcription, and genomic sequences) that encode the kinase peptides or proteins of the present invention. Such a nucleic acid molecule is considered to consist of, consist essentially of, or comprise a nucleotide sequence encoding one of the kinase peptides of the invention, an allelic variant thereof, or an ortholog or paralog thereof.
[0095]
As used herein, an “isolated” nucleic acid molecule is one that is separated from other nucleic acids present in the natural source of the nucleic acid. Preferably, an “isolated” nucleic acid does not include sequences that naturally flank the nucleic acid (ie, sequences located at the 5 ′ and 3 ′ ends of the nucleic acid) in the genomic DNA of the organism from which the nucleic acid is derived. However, for example, up to about 5 KB, 4 KB, 3 KB, 2 KB, or less than 1 KB, particularly sequences encoding peptides that are contiguous, and sequences encoding peptides that are within the same gene but separated by introns in the genomic sequence. There are several adjacent nucleotide sequences. It is important to note that nucleic acids are handled in certain operations as described herein, such as recombinant expression, probe and primer preparation, and other specific uses for nucleic acid sequences. It is separated from distant and unimportant contiguous sequences as possible.
[0096]
In addition, "isolated" nucleic acid molecules, such as, for example, transcription / cDNA molecules, can be synthesized from other cellular materials, media if recombinantly produced, or chemical precursors if chemically synthesized, or It is substantially free of other chemicals. However, the nucleic acid molecule can be fused to other coding sequences or other regulatory sequences, which are considered isolated.
[0097]
For example, a recombinant DNA molecule contained in a vector is considered isolated. Examples of additional isolated DNA molecules include recombinant DNA molecules retained in heterologous host cells, or purified (partially or substantially) DNA molecules in solution. Isolated RNA molecules include in vivo or in vitro RNA transcripts of the isolated DNA molecules of the present invention. Isolated nucleic acid molecules according to the present invention further include synthetically produced molecules.
[0098]
Accordingly, the present invention is a nucleic acid molecule comprising the nucleotide sequence shown in FIG. 1 or FIG. 3 (SEQ ID NO: 1, transcription sequence, and SEQ ID NO: 3, genomic sequence), or FIG. 2 (SEQ ID NO: 2). Any nucleic acid molecule encoding the protein of is provided. A nucleic acid molecule consists of a nucleotide sequence when the nucleotide sequence is the complete nucleotide sequence of the nucleic acid molecule.
[0099]
The present invention further relates to a nucleic acid molecule consisting essentially of the nucleotide sequence shown in FIG. 1 or FIG. 3 (SEQ ID NO: 1, transcription sequence, and SEQ ID NO: 3, genomic sequence), or FIG. 2 (SEQ ID NO: 2) Any nucleic acid molecule encoding the protein described in 1) is provided. When such a nucleotide sequence is present in the final nucleic acid molecule with only a few additional nucleic acid residues, the nucleic acid molecule consists essentially of the nucleotide sequence.
[0100]
The present invention further includes a nucleic acid molecule comprising the nucleotide sequence described in FIG. 1 or FIG. 3 (SEQ ID NO: 1, transcription sequence, and SEQ ID NO: 3, genomic sequence), or FIG. 2 (SEQ ID NO: 2). Any nucleic acid molecule that encodes a protein is provided. A nucleic acid molecule comprises a nucleotide sequence if the nucleotide sequence is at least part of the final nucleotide sequence of the nucleic acid molecule. According to this, a nucleic acid molecule can have only its nucleotide sequence, or it can have additional nucleic acid residues, for example, nucleic acid residues that are naturally associated with it, or heterologous nucleotide sequences. Such nucleic acid molecules can have only a few additional nucleotides, or can contain hundreds or more additional nucleotides. Methods for easily generating / isolating these various types of nucleic acid molecules are briefly described below.
[0101]
Figures 1 and 3 show both the coding and non-coding sequences. Because of the human genome sequence (FIG. 3) and cDNA / transcription sequence (FIG. 1) that are the origin of the present invention, the nucleic acid molecules in the figure are genomic intron sequences, 5 ′ and 3 ′ non-coding sequences, gene regulatory regions. It is thought to contain castle and non-coding intergenic sequences. In general, such sequence features are described in both FIG. 1 and FIG. 3, or can be readily identified using computational tools known in the art. As discussed below, several non-coding regions, particularly gene regulatory elements such as promoters, can be used for various purposes such as controlling heterologous gene expression, identifying targets that modulate gene activity, etc. Are particularly useful and are claimed as fragments of the genomic sequence provided herein.
[0102]
An isolated nucleic acid molecule can encode a mature protein and additional amino-terminal or carboxyl-terminal amino acids, or amino acids within a mature peptide (eg, when the mature form has more than one peptide chain). Such sequences may facilitate protein transport, prolong or shorten protein half-life, or streamline operations during protein assay or production, or other events in the processing of proteins from precursors to mature forms. Can play a role in In general, in situ, additional amino acids may be processed into mature proteins by cellular enzymes.
[0103]
As described above, an isolated nucleic acid molecule can contain sequences encoding only kinase peptides, sequences encoding mature peptides, and leader or secretory sequences (eg, pre-pro, pro-protein (pro -protein) sequences), including, but not limited to, additional coding sequences and additional non-coding sequences, such as introns and non-coding 5 'sequences and 3 'Sequenced but not translated, such as sequences that play a role in transcription, mRNA processing (including splicing and polyadenylation signals), ribosome binding, and mRNA stability . In addition, the nucleic acid molecule can be fused, for example, with a marker sequence encoding a peptide that facilitates purification.
[0104]
Isolated nucleic acid molecules can take the form of RNA, such as mRNA, or DNA, including cDNA and genomic DNA obtained by cloning or produced by chemical synthesis techniques or combinations thereof. Nucleic acids, particularly DNA, can be double-stranded or single-stranded. A single-stranded nucleic acid can be a coding strand (sense strand) or a non-coding strand (antisense strand).
[0105]
The present invention further provides nucleic acid molecules that encode obvious variants of the kinase protein of the present invention as described above, as well as nucleic acid molecules that encode fragments of the peptides of the present invention. Such nucleic acid molecules occur naturally, such as allelic variants (identical loci), paralogs (different loci), and orthologs (different organisms), or are produced by recombinant DNA methods or chemical synthesis. obtain. Such non-naturally occurring variants can be generated by mutagenesis techniques including those applied to nucleic acid molecules, cells or organisms. Thus, as described above, variants can include nucleotide substitutions, deletions, inversions, and insertions. Mutations can occur in either the coding region and the non-coding region, or both. Mutations can result in both conservative and non-conservative amino acid substitutions.
[0106]
The present invention further provides non-coding fragments of the nucleic acid molecules shown in FIGS. Preferred non-coding fragments include, but are not limited to, promoter sequences, enhancer sequences, gene regulatory sequences, and gene termination sequences. Such fragments are useful in the development of screens for controlling heterologous gene expression and identifying gene regulators. Promoters are easily identified from the 5 ′ to ATG start site in the genomic sequence of FIG.
[0107]
A fragment comprises a contiguous nucleotide sequence of 12 or more nucleotides. Further, the fragments can be at least 30, 40, 50, 100, 250, or 500 nucleotides in length. The length of the fragment is based on the intended use. For example, the fragments can encode epitope-related regions of the peptide or are useful as DNA probes and DNA primers. Such fragments can be isolated using known nucleotide sequences for synthesizing oligonucleotide probes. The labeled probe can be used to screen a cDNA library, genomic DNA library, or mRNA in order to isolate the nucleic acid corresponding to the coding region. Furthermore, primers can be used in PCR reactions for cloning specific regions of genes.
[0108]
The probe / primer generally comprises a substantially purified oligonucleotide or oligonucleotide pair. Oligonucleotides generally comprise a nucleotide sequence region that is hybridized under stringent conditions to at least about 12, 20, 25, 40, 50 or more consecutive nucleotides.
[0109]
Orthologs, homologs, and allelic variants can be identified using methods well known in the art. As stated in the peptide section, these variants comprise a nucleotide sequence encoding the peptide, typically 60-70% relative to the nucleotide sequence shown in the drawing, or a fragment of this sequence, 70-80%, 80-90%, more typically those having at least about 90-95% or more homology. Such a nucleic acid molecule can be easily identified as being capable of hybridizing to the nucleotide sequence shown in the drawing or a fragment of this sequence under mild to stringent conditions. Allelic variants can be readily determined at the locus of the encoding gene. The genes provided by the present invention have been shown to be located on genomic components mapped to human chromosome 8 based on evidence from various directions such as STS and BAC map data (FIG. 3). To show).
[0110]
FIG. 3 shows information about SNPs found in the gene encoding the kinase protein of the present invention. The following mutations have been identified; T1004G, G1822T, A2023G, A2562G, and C6624A. Introns and SNPs 5 'to the ORF may affect regulatory / regulatory elements.
[0111]
As used herein, the term “hybridizes under stringent conditions” means that the nucleotide sequences encoding the peptides have at least 60-70% homology to each other and remain hybridized to each other. It means the conditions under which hybridization and washing are performed to some extent. This condition is such that sequences having at least about 60%, at least about 70%, at least about 80%, or more sequence homology to each other typically remain hybridized to each other. sell. Such stringent conditions are well known to those skilled in the art and are described in “Current Protocols in Molecular Biology”, John Wiley & Sons, NY (1989), 6.3.1-6.3.6. It is described in. One example of stringent hybridization conditions is to hybridize at about 45 ° C. in 6 × sodium chloride / sodium citrate (SSC), then 1 in 50 × 65 ° C. in 0.2 × SSC, 0.1% SDS. Wash once or several times. Examples of mild, low stringency hybridization conditions are well known to those skilled in the art.
[0112]
Use of nucleic acid molecules
The nucleic acid molecules of the invention are useful in probes, primers, chemical synthesis intermediates, and biological assays. Nucleic acid molecules are used to isolate full-length cDNAs and genomic clones that encode the peptides shown in FIG. 2 and variants that generate peptides identical or related to the peptides shown in FIG. 2 (alleles, orthologs, etc.) Is useful as a messenger RNA, transcription / cDNA, and genomic DNA hybridization probe. As shown in FIG. 3, SNPs are identified in five locations, one of which is the 5 ′ SNP of the ORF that may affect regulatory / regulatory elements.
[0113]
The probe can correspond to any sequence over the entire length of the nucleic acid molecule shown in the drawing. Thus, it can be derived from the 5 ′ non-coding region, the coding region, and the 3 ′ non-coding region. However, as already mentioned, fragments are not considered to include fragments disclosed prior to the present invention.
[0114]
The nucleic acid molecules are also useful as primers for PCR to amplify any given region of the nucleic acid molecule, and are also useful in the synthesis of antisense molecules of the desired length and sequence.
[0115]
Nucleic acid molecules are also useful for the construction of recombinant vectors. Such vectors include expression vectors that express part or all of the peptide sequence. Vectors also include insertion vectors, which are incorporated into other nucleic acid molecules, such as in the cell genome, and used to alter the in situ expression of genes and / or gene products. For example, an endogenous coding sequence can be replaced via homologous recombination with all or part of the coding region containing one or more specifically introduced mutations.
[0116]
Nucleic acid molecules are also useful for expressing the antigenic portion of a protein.
[0117]
The nucleic acid molecule is also useful as a probe for determining the chromosomal location of the nucleic acid molecule by in situ hybridization methods. The genes provided by the present invention have been shown to be located on genomic components mapped to human chromosome 8 based on evidence from various directions such as STS and BAC map data (FIG. 3). To show).
[0118]
The nucleic acid molecules are also useful for the production of vectors containing the gene regulatory regions of the nucleic acid molecules of the present invention.
[0119]
The nucleic acid molecules are also useful for designing ribozymes that correspond to all or part of the mRNA produced from the nucleic acid molecules described herein.
[0120]
Nucleic acid molecules are also useful for the production of vectors that express some or all of the peptides.
[0121]
Nucleic acid molecules are also useful in the construction of host cells that express some or all of the nucleic acid molecules and peptides.
[0122]
The nucleic acid molecules are also useful for the production of transgenic animals that express some or all of the nucleic acid molecules and peptides.
[0123]
Nucleic acid molecules are also useful as hybridization probes to determine the presence, level, form, and distribution of nucleic acid expression. The experimental data in FIG. 1 shows that the kinase protein of the invention is expressed in the larynx, kidney (adult and fetus), pancreas, fetal heart, uterus, and prostate in humans. In particular, virtual Northern blot analysis shows expression in the larynx, kidney, and pancreas. In addition, PCR-based tissue screening panels have shown expression in fetal heart, fetal kidney, uterus, prostate, and pancreas. Thus, this probe can be used to detect or measure the level of a particular nucleic acid molecule in cells, tissues and organisms. The nucleic acid whose level is measured can be DNA or RNA. Accordingly, probes corresponding to the peptides described herein can be used for expression in a given cell, tissue and organism, and / or assessment of gene copy number. These uses are suitable for the diagnosis of disorders involving the expression of kinase proteins that are elevated or decreased compared to normal values.
[0124]
In vitro techniques for detecting mRNA include Northern hybridization and in situ hybridization. In vitro techniques for detecting DNA include Southern hybridization and in situ hybridization.
[0125]
A probe is a cell that expresses a kinase protein, for example, by measuring the level of a nucleic acid encoding a kinase in a sample cell derived from a subject such as mRNA or genomic DNA, or by checking whether the kinase gene is mutated. Alternatively, it can be used as part of a diagnostic test kit to identify tissue. The experimental data in FIG. 1 show that the kinase protein of the present invention is expressed in the larynx, kidney (adult and fetus), pancreas, fetal heart, uterus, and prostate in humans. In particular, virtual Northern blot analysis shows expression in the larynx, kidney, and pancreas. In addition, PCR-based tissue screening panels have shown expression in fetal heart, fetal kidney, uterus, prostate, and pancreas.
[0126]
Nucleic acid expression assays are useful for drug screening to identify compounds that modulate kinase nucleic acid expression.
[0127]
Accordingly, the present invention provides compounds that can be used in the treatment of disorders associated with nucleic acid expression of a kinase gene, particularly disorders associated with kinase-mediated biological and pathological processes in cells and tissues that express it. A method for identification is provided. The experimental data in FIG. 1 shows expression in the larynx, kidney (adult and fetus), pancreas, fetal heart, uterus, and prostate in humans. The method typically involves assaying for the ability of a compound to modulate kinase nucleic acid expression and identifying a compound that can be used to treat a disorder characterized by unwanted kinase nucleic acid expression. including. This assay can be performed in cell-based and cell-free systems. Cell-based assays include cells that naturally express kinase nucleic acids, or recombinant cells that have been genetically engineered to express specific nucleic acid sequences.
[0128]
Assays for kinase nucleic acid expression relate to direct assays for secondary compounds associated with nucleic acid levels, such as mRNA levels, or signaling pathways. In addition, the expression of genes that upregulate or downregulate responsiveness in the kinase protein signaling pathway is also assayed. In this embodiment, these gene regulatory regions can be operably linked to a reporter gene such as luciferase.
[0129]
Thus, a modulator of kinase gene expression can be identified by a method of contacting a cell with a candidate compound and determining mRNA expression. The expression level of the kinase mRNA in the presence of the candidate compound is compared with the expression level of the kinase mRNA in the absence of the candidate compound. Based on this comparison, candidate compounds are identified as modulators of nucleic acid expression and can be used, for example, in the treatment of disorders characterized by abnormal nucleic acid expression. A candidate compound is identified as a stimulator of nucleic acid expression if the expression of mRNA in the presence of the candidate compound is statistically significantly greater than that in the absence. A candidate compound is identified as an inhibitor of nucleic acid expression if the nucleic acid expression in the presence of the candidate compound is statistically significantly less than that in the absence.
[0130]
The present invention further provides therapeutic methods using compounds identified through drug screening as gene modulators that regulate kinase nucleic acid expression in cells and tissues that express kinases, and using nucleic acids as targets. The experimental data in FIG. 1 shows that the kinase protein of the present invention is expressed in the larynx, kidney (adult and fetus), pancreas, fetal heart, uterus, and prostate in humans. In particular, virtual Northern blot analysis shows expression in the larynx, kidney, and pancreas. In addition, PCR-based tissue screening panels have shown expression in fetal heart, fetal kidney, uterus, prostate, and pancreas. Modulation includes both upregulation (ie, activation or agonization) or downregulation (suppression or antagonization), or nucleic acid expression.
[0131]
Alternatively, as long as the drug or small molecule inhibits kinase nucleic acid expression in cells and tissues that express the protein, the modulator of kinase nucleic acid expression is identified using the screening assays described herein. It can be a small molecule or a drug. The experimental data in FIG. 1 shows expression in the larynx, kidney (adult and fetus), pancreas, fetal heart, uterus, and prostate in humans.
[0132]
The nucleic acid molecules are also useful for monitoring the effect of regulatory compounds on the expression or activity of kinase genes in clinical trials or therapeutic methods. Thus, gene expression patterns can be a barometer of continuous effects in treatment with compounds, particularly compounds that improve patient tolerance. Gene expression patterns can also be markers that indicate the physiological response of cells affected to the compound. Thus, such monitoring can increase the dose of the compound or administer an alternative compound that the patient does not tolerate. Similarly, if the level of nucleic acid expression drops to a desired level, compound administration can be reduced proportionally.
[0133]
The nucleic acid molecules are also useful in diagnostic assays for qualitative changes in kinase nucleic acid expression, particularly qualitative changes leading to disease. Nucleic acid molecules can be used to detect mutations in gene expression products such as kinase genes and mRNA. The nucleic acid molecule is used as a hybridization probe to detect a naturally occurring genetic mutation in the kinase gene, thereby determining whether a subject with the mutation is at risk for a disorder caused by the mutation be able to. Mutations are such as deletions, additions or substitutions of one or more nucleotides in a gene, chromosomal rearrangements such as inversions or transpositions, modification of genomic DNA such as aberrant methylation patterns, or amplification Includes changes in gene copy number. Detection of kinase gene variants associated with dysfunction provides a diagnostic tool for disease activity or susceptibility when the disease results from kinase protein overexpression, underexpression, or altered expression.
[0134]
Individuals with mutations in the kinase gene can be detected at the nucleic acid level by a variety of techniques. FIG. 3 shows information about SNPs found in the gene encoding the kinase protein of the present invention. The following mutations have been identified; T1004G, G1822T, A2023G, A2562G, and C6624A. Introns and SNPs 5 'to the ORF may affect regulatory / regulatory elements. The genes provided by the present invention have been shown to be located on genomic components mapped to human chromosome 8 based on evidence from various directions such as STS and BAC map data (FIG. 3). To show). Genomic DNA may be analyzed directly or after being previously amplified using PCR. RNA or cDNA can be used as well. In some uses, mutation detection can be accomplished by polymerase chain reaction (PCR), such as anchor PCR or RACE PCR (see, eg, US Pat. Nos. 4,683,195 and 4,683,202), or as other ligation linkages. In reactions (LCR) (see, for example, Landegran et al., Science 241: 1077-1080 (1988); and Nakazawa et al., PNAS 91: 360-364 (1994)), the latter is related to the use of probes / primers It is particularly useful for the detection of point mutations (see Abravaya et al., Nucleic Acids Res. 23: 675-682 (1995)). The method includes recovering a cell sample from a patient; isolating nucleic acid (eg, genome, mRNA, or both) from the sample cell; conditions under which hybridization (and presence) of the gene (if any) occurs. Contacting the nucleic acid sample with one or more primers that specifically hybridize to the gene at; and detecting the presence or absence of the amplification product or detecting the size of the amplification product and the length of the control sample And a step of comparing with. Deletions and insertions can be detected by comparing the change in size of the amplified product with that of the normal genotype. Point mutations can be identified by hybridizing amplified DNA to normal RNA or antisense DNA sequences.
[0135]
Alternatively, mutations in the kinase gene can be identified directly by, for example, changes in restriction enzyme digestion patterns determined by gel electrophoresis.
[0136]
In addition, sequence-specific ribozymes (US Pat. No. 5,498,531) can be used to score for the presence of specific mutations due to the occurrence or loss of ribozyme cleavage sites. Perfectly matched sequences can be distinguished from mismatched sequences by nuclease cleavage digestion assays or differences in melting temperatures.
[0137]
Sequence changes at specific positions can also be assessed by RNase and S1 protection, or nuclease protection assays such as chemical cleavage methods. Furthermore, sequence differences between the mutant kinase gene and the wild type gene can be determined directly by DNA sequencing. A variety of automated sequencing tools can be useful in performing diagnostic assays (Naeve, CW, (1995) Biotechniques 19: 448), including sequencing by mass spectrometry (eg, International Publication 94/16101; Cohen et al., Adv. Chromatogr. 36: 127-162 (1996); and Griffin et al., Appl. Biochem. Biotechnol. 38: 147-159 (1993)).
[0138]
Other methods for detecting mutations in genes include methods that protect against cleavage reagents used to detect mismatched bases from RNA / RNA or RNA / DNA duplexes (Myers et al., Science 230: 1242 (1985)); Cotton et al., PNAS 85: 4397 (1988); Saleeba et al., Meth. Enzymol. 217: 286-295 (1992)), a method for comparing the electrophoretic mobility of mutant and wild-type nucleic acids. (Orita et al., PNAS 86: 2766 (1989); Cotton et al., Mutat. Res. 285: 125-144 (1993); and Hayashi et al., Genet. Anal. Tech. Appl. 9: 73-79 (1992)), And methods for assaying the movement of mutant or wild-type fragments in polyacrylamide gels containing a gradient of denaturing agents using denaturing gradient gel electrophoresis (Myers et al., Nature 313: 495 (1985)). . Examples of other techniques for detecting point mutations include selective oligonucleotide hybridization, selective amplification, and selective primer extension.
[0139]
Nucleic acid molecules are also useful in individual tests for genotypes that have therapeutic effects but do not necessarily cause disease. For this reason, nucleic acid molecules can be used in studies on the correlation (pharmacogenetic correlation) between an individual's genotype and an individual's response to a compound used for treatment. Accordingly, the nucleic acid molecules described herein can be used to assess the mutational content of a kinase gene in an individual to select an appropriate compound or regimen for treatment. FIG. 3 shows information about SNPs found in the gene encoding the kinase protein of the present invention. The following mutations have been identified; T1004G, G1822T, A2023G, A2562G, and C6624A. Introns and SNPs 5 'to the ORF may affect regulatory / regulatory elements.
[0140]
Thus, a nucleic acid molecule that exhibits a genetic mutation that affects treatment provides a diagnostic target that can be used for treatment tailored to the purpose in the individual. Thus, the production of recombinant cells and animals containing these polymorphisms allows for effective clinical design for therapeutic compounds and dosing regimens.
[0141]
Thus, nucleic acid molecules are useful as antisense constructs for controlling kinase gene expression in cells, tissues, and organisms. DNA antisense nucleic acid molecules are designed to be complementary to gene regions involved in transcription, and therefore inhibit transcription and production of kinase proteins. Antisense RNA or DNA nucleic acid molecules hybridize to the mRNA, thereby preventing translation of the mRNA into the kinase protein.
[0142]
Alternatively, a class of antisense molecules can be used to inactivate mRNA to reduce kinase nucleic acid expression. Thus, these molecules can be used to treat disorders characterized by abnormal or unwanted expression of kinase nucleic acids. This technique is associated with cleavage by ribozyme means that include nucleotide sequences that are complementary to one or more regions of the mRNA, which reduces the translational ability of the mRNA. Possible regions include coding regions, particularly coding regions corresponding to the catalytic activity and other functional activities of kinase proteins such as substrate binding.
[0143]
The nucleic acid molecule also provides a vector for gene therapy of patients with abnormal cells in kinase gene expression. Recombinant cells, including patient cells that are manipulated ex vivo and returned to the patient, are introduced into the individual's body to produce the desired kinase protein for treatment of the individual within the individual cell.
[0144]
The invention also includes a kit for detecting the presence of a kinase nucleic acid in a biological sample. The experimental data in FIG. 1 shows that the kinase protein of the invention is expressed in the larynx, kidney (adult and fetus), pancreas, fetal heart, uterus, and prostate in humans. In particular, virtual Northern blot analysis shows expression in the larynx, kidney, and pancreas. In addition, PCR-based tissue screening panels have shown expression in fetal heart, fetal kidney, uterus, prostate, and pancreas. For example, the kit comprises a labeled nucleic acid or a labelable nucleic acid, or a reagent comprising a substance capable of detecting kinase nucleic acid in a biological sample; means for determining the amount of kinase nucleic acid in the sample; and the amount of kinase nucleic acid in the sample; Means for comparing to a standard amount can be included. The compound or substance can be enclosed in a suitable container. The kit can further include instructions for use as a detection kit for kinase protein mRNA or DNA.
[0145]
Nucleic acid array
The present invention further provides nucleic acid detection kits, which are, for example, arrays or microarrays of nucleic acid molecules based on the sequence information shown in FIGS. 1 and 3 (SEQ ID NOs: 1 and 3).
[0146]
An “array” or “microarray” as used herein is a different synthesized on a substrate such as paper, nylon or other type of membrane, filter, chip, glass slide, or other suitable solid support. Means an array of polynucleotides or oligonucleotides. In one embodiment, the microarray is a U.S. Pat.No. 5,837,832, Chee et al., WO 95/11995 (Chee et al.), Lockhart, DJ et al. (1996; Nat. Biotech. 14: 1675-1680), and Schena. , M. et al. (1996; Proc. Natl. Acad. Sci. 93: 10614-10619), all of which are incorporated herein by reference. In other embodiments, such arrays are manufactured by the method described in Brown et al., US Pat. No. 5,807,522.
[0147]
The microarray or detection kit is preferably composed of a number of unique single stranded nucleic acid sequences, usually either synthetic antisense oligonucleotides or fragments of cDNA immobilized on a solid support. Oligonucleotides are preferably about 6-60 nucleotides long, more preferably 15-30 nucleotides long, and most preferably about 20-25 nucleotides long. For certain types of microarrays or detection kits, it may be preferable to use oligonucleotides that are only 7-20 nucleotides in length. A microarray or detection kit contains oligonucleotides containing known 5 'or 3' sequences, continuous oligonucleotides containing full-length sequences, or unique oligonucleotides selected from specific regions in sequence length. possible. The polynucleotide used in the microarray or detection kit can be a gene or an oligonucleotide specific for the gene of interest.
[0148]
In order to produce oligonucleotides of known sequence for microarrays or detection kits, the gene of interest (or the ORF identified from the contig of the present invention) is typically tested using a computer algorithm to determine the nucleotide sequence. Starting from the 5 'end or 3' end. A typical algorithm identifies a defined length of oligomer that is unique to a gene, has a GC content in a range suitable for hybridization, and does not have a predicted secondary structure that can interfere with hybridization. Under certain conditions, it may be preferable to use oligonucleotide pairs in a microarray or detection kit. The “pair” of oligonucleotides is preferably identical except for one nucleotide located in the middle of the sequence. A second pair of oligonucleotides (not consistent with one) is used as a control. The number of oligonucleotide pairs can be between 2 and 1 million. Oligomers are synthesized at designated areas on the substrate using a light induced chemical process. The substrate is paper, nylon or other type of membrane, filter, chip, glass slide, or other suitable solid support.
[0149]
In another aspect, oligonucleotides are synthesized on the surface of a substrate using chemical coupling means and inkjet application equipment, as described in WO 95/251116 (Baldeschweiler et al.). All are hereby incorporated by reference. In other respects, a “grid” array, similar to a dot (or slot) blot, uses a vacuum system, heating, UV, mechanical or chemical binding process to place cDNA fragments or oligonucleotides on the surface of a substrate. Can be arranged and combined. Arrays as described above are manufactured using manual or available equipment (slot blot or dot blot equipment), materials (any suitable solid support), and machines (including robotic equipment) 8, It may include 24, 96, 384, 1536, 6144 or more, or any other number between 2 and 1 million oligonucleotides that are effectively used in commercial equipment.
[0150]
To perform sample analysis using a microarray or detection kit, RNA or DNA obtained from a biological sample is prepared into a hybridization probe. mRNA is isolated, cDNA is prepared and used as a template for preparing antisense RNA (aRNA). The aRNA is amplified in the presence of fluorescent nucleotides, the labeled probe is incubated with the microarray or detection kit, and the sequence of the probe hybridizes with a complementary oligonucleotide in the microarray or detection kit. Incubation conditions are adjusted so that hybridization occurs with exact complementary match or with varying degrees of lower complementarity. After removing unhybridized probes, a scanner is used to determine the level and pattern of fluorescence. The scanned image is examined to determine the degree of complementarity and the degree and relative amount of complementarity of each oligonucleotide sequence on the microarray or detection kit. The biological sample is obtained from any bodily fluid (eg, blood, urine, saliva, sputum, gastric fluid, etc.), cultured cells, biopsy material, or other tissue preparation. In the detection system, the presence, absence and amount of hybridization are used simultaneously in all the different sequences. This data is used for large-scale correlation studies such as sequences, expression patterns, mutations, variants, or polymorphisms between samples.
[0151]
The present invention provides a method for identifying the expression of the kinase protein / peptide of the present invention using such an array. Specifically, such methods include the steps of incubating the test sample with one or more nucleic acid molecules and assaying for binding of the components in the test sample to the nucleic acid molecules. Such assays are typically associated with arrays containing many genes, where at least one of the genes is an allele of the gene of the invention and / or the kinase gene of the invention. FIG. 3 shows information about SNPs found in the gene encoding the kinase protein of the present invention. The following mutations have been identified; T1004G, G1822T, A2023G, A2562G, and C6624A. Introns and SNPs 5 'to the ORF may affect regulatory / regulatory elements.
[0152]
Incubation conditions for the test sample and the nucleic acid molecule vary. Incubation conditions depend on the format of the assay used, the detection method used, and the type and nature of the nucleic acid molecule used in the assay. Those of skill in the art will be aware of commonly available hybridization, amplification, or array assay formats that are readily available to use the novel fragments of the human genome disclosed herein. Can be applied. Examples of such assays are Char, T, “An Introduction to Radioimmunoassay and Related Techniques”, Elsevier Science Publishers, Amsterdam, The Netherlands (1986); Bullock, GR et al., “Techniques in Immunocytochemistry”, Academic Press, Orlando, FL, Volume 1 (1982), Volume 2 (1983), Volume 3 (1985); Tijssen, P., “ Enzyme immunoassay practice and theory: described in "Practice and Theory of Enzyme Immunoassays: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology", Elsevier Science Publishers, Amsterdam, The Netherlands (1985). ing.
[0153]
The test sample of the present invention includes cells, proteins, or membrane extracts from cells. The test sample used in the above method will vary based on the assay format, the nature of the detection method, and the tissue, cells, or extract thereof used as the assay sample. Methods for preparing nucleic acid extracts or cell extracts are well known in the art and can be readily applied to obtain a sample that is compatible with the system used.
[0154]
In another embodiment of the present invention, a kit is provided that contains the reagents necessary to perform the assay of the present invention.
[0155]
In particular, the present invention includes (a) a first container containing a nucleic acid molecule capable of binding to a human genome fragment disclosed herein, and (b) detecting the presence of one or more wash reagents, bound nucleic acids. It is intended to provide a kit enclosed and sectioned in one or more containers, including one or more other containers containing possible reagents.
[0156]
Specifically, a compartmentalized kit includes any kit in which reagents are contained in separate containers. Such containers include small glass containers, plastic containers, strip plastic, glass or paper, or array materials such as silicon dioxide. Such containers can efficiently move reagents from one section to another so that the sample and reagent are not cross-contaminated, and the reagents or solutions in each container can be transferred from one section to the other. Can be quantitatively added to the categories. Such containers include containers containing test samples, containers containing nucleic acid probes, containers containing washing reagents (eg, phosphate buffered saline, Tris buffer, etc.), and reagents used to detect bound probes. It is considered to contain a container. One skilled in the art can recognize previously known kinase genes according to the present invention and routinely identify them using the sequence information disclosed herein, which are well-established well-known in the art. Can be easily incorporated into kit formats, particularly expression arrays.
[0157]
vector / Host cell
The present invention also provides a vector comprising a nucleic acid molecule described herein. The term “vector” refers to a vehicle, preferably a nucleic acid molecule, capable of transporting a nucleic acid molecule. When the vector is a nucleic acid molecule, the nucleic acid molecule is covalently linked to the nucleic acid of the vector. In this aspect of the invention, the vector is a plasmid, a single or double stranded phage, a single or double stranded DNA or RNA viral vector, or an artificial chromosome such as BAC, PAC, YAC or MAC. Including.
[0158]
The vector may be retained as an extrachromosomal element in the host cell where it replicates and generates additional copies of the nucleic acid molecule. Alternatively, the vector may be integrated into the genome of the host cell, producing an additional copy of the nucleic acid molecule upon replication of the host cell.
[0159]
The present invention provides a vector for maintaining a nucleic acid molecule (cloning vector) or a vector for expressing a nucleic acid molecule (expression vector). This vector can function in prokaryotic cells or eukaryotic cells, or both (shatter vector).
[0160]
An expression vector includes a cis-acting regulatory region operably linked to a nucleic acid molecule in the vector, thereby allowing transcription of the nucleic acid molecule in a host cell. The nucleic acid molecule can be introduced into the host cell separately from the nucleic acid molecule that can affect transcription. Accordingly, the second nucleic acid molecule provides a trans-acting factor that interacts with a cis-regulatory control region that allows transcription of the nucleic acid molecule from the vector. Alternatively, the trans-acting factor may be provided by the host cell. Finally, trans-acting factors can be created from the vector itself. However, it is understood that in some embodiments, transcription and / or translation of nucleic acid molecules can occur in a cell-free system.
[0161]
Regulatory sequences to which the nucleic acid molecules described herein can be operably linked include a promoter for inducing mRNA transcription. These include the left promoter from Pacteriophage λ, the lac, TRP, and TAC promoters obtained from E. coli, the early and late promoters obtained from SV40, the CMV immediate early promoter, the adenovirus early promoter And late promoters, as well as, but not limited to, retroviral terminal repeats.
[0162]
In addition to control regions that promote transcription, expression vectors may also include regions that regulate transcription, such as repressor binding sites and enhancers. Examples of this include the SV40 enhancer, the cytomegalovirus immediate early enhancer, the polyoma enhancer, the adenovirus enhancer, and the retroviral LTR enhancer.
[0163]
In addition to transcription initiation and control sites, expression vectors may also contain sequences necessary for transcription termination and ribosome binding sites for transcription in the transcription region. Other expression control elements include start and stop codons as well as polyadenylation signals. One skilled in the art would know many regulatory sequences useful for expression vectors. Such regulatory sequences are described, for example, in Sambrook et al., “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, (1989). ing.
[0164]
Various expression vectors can be used for the expression of nucleic acid molecules. Such vectors include chromosomal, episomal, and viral vectors, such as bacterial plasmids, bacteriophages, yeast episomes, yeast chromosomal elements including artificial yeast chromosomes, baculoviruses, papoviruses such as SV40. Vectors derived from viruses such as vaccinia virus, adenovirus, poxvirus, pseudorabies virus, and retrovirus. Vectors can also be obtained from combinations of these sources, for example from plasmids and bacteriophage genetic elements such as cosmids and phagemids. Suitable cloning and expression vectors for prokaryotic and eukaryotic host cells are described by Sambrook et al., “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, (1989).
[0165]
Regulatory sequences can be expressed in one or more cell types by constitutive expression of one or more host cells (ie tissue specificity) or by exogenous factors such as temperature, nutrient addition, or hormones or other ligands. Provides inducible expression of. Various vectors that are constitutively and inducibly expressed in prokaryotic and eukaryotic host cells are well known to those of skill in the art.
[0166]
Nucleic acid molecules can be introduced into vector nucleic acids by well-known methods. Generally, a DNA sequence to be finally expressed is bound to an expression vector by cleaving the DNA sequence and the expression vector with one or more restriction enzymes and ligating the fragments to each other. Restriction enzyme digestion and ligation procedures are well known to those of skill in the art.
[0167]
A vector containing the appropriate nucleic acid molecule can be introduced into an appropriate host cell for propagation or expression using known techniques. Bacterial cells include, but are not limited to, E. coli, Streptomyces, and Salmonella typhimurium. Eukaryotic cells include, but are not limited to, yeast, insect cells such as Drosophila, animal cells such as COS and CHO cells, and plant cells.
[0168]
As described herein, expression of the peptide as a fusion protein may be desirable. Accordingly, the present invention provides a fusion vector that enables the production of peptides. The fusion vector can improve the expression of the recombinant protein and the solubility of the recombinant protein, and can facilitate protein purification, for example, by the action of a ligand for affinity purification. A proteolytic cleavage site is introduced at the point of attachment with the fusion moiety, so that the desired peptide can ultimately be separated from the fusion moiety. Proteolytic enzymes include, but are not limited to, factor Xa, thrombin, and enterokinase. Typical fusion expression vectors include pGEX (Smith et al., Gene 67: 31-40 (Gut), each of glutathione-S-transferase (GST), maltose E binding protein, or protein A fused to a target recombinant protein. 1988)), pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA), and pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ). Examples of suitable inducible non-fused E. coli expression vectors include pTrc (Amann et al., Gene 69: 301-315 (1988)), and pET 11d (Studier et al., “Gene Expression Techniques: Methods in Enzymology (Gene Expression Technology: Methods in Enzymology) ”, 185: 60-89 (1990)).
[0169]
Recombinant protein expression can be maximized in host bacteria by providing a genetic background in the host cell that has the proteolytic cleavage-defective ability of the recombinant protein (Gottesman, S., "Gene. Expression technology: Methods in Enzymology ", 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 119-128). Alternatively, the sequence of the nucleic acid molecule of interest can be altered to be a codon that is preferentially used for a particular host cell such as, for example, E. coli (Wada et al., Nucleic Acids Res. 20 : 2111-2118 (1992)).
[0170]
Nucleic acid molecules can also be expressed by expression vectors that act in yeast. Examples of vectors expressed in yeast such as S. cerevisiae include pYepSec1 (Baldari et al., EMBO J. 6: 229-234 (1987)), pMFa (Kurjan et al., Cell 30: 933- 943 (1982)), pJRY88 (Schultz et al., Gene 54: 113-123 (1987)), and pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, Calif.).
[0171]
Nucleic acid molecules can also be expressed in insect cells using, for example, baculovirus expression vectors. Baculovirus vectors utilized for expression of proteins in cultured insect cells (eg, Sf9 cells) include the pAc series (Smith et al., Mol. Cell Biol. 3: 2156-2165 (1983)) and the pVL series (Lucklow et al., Virology 170: 31-39 (1989)).
[0172]
In certain embodiments of the invention, the nucleic acid molecules described herein are expressed in mammalian cells using mammalian expression vectors. Examples of mammalian expression vectors include pCDM8 (Seed, B. Nature 329: 840 (1987)) and pMT2PC (Kaufman et al., EMBO J. 6: 187-195 (1987)).
[0173]
The expression vectors listed herein are only examples of well-known vectors that are useful for expressing nucleic acid molecules and are available to those skilled in the art. Other vectors suitable for maintenance propagation or expression of the nucleic acid molecules described herein will be well known to those skilled in the art. These include, for example, Sambrook, J., Fritsh, EF, and Maniatis, T., “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press. , Cold Spring Harbor, NY, 1989.
[0174]
The present invention also includes vectors in which the nucleic acid sequences described herein are cloned in the reverse orientation into the vector, which vector is functionally combined with regulatory sequences that allow transcription of the antisense RNA. Combined. Thus, antisense transcription includes both coding and non-coding regions and can produce all or part of the nucleic acid molecule sequences described herein. The expression of the antisense RNA corresponds to each parameter described above with respect to the expression of the sense RNA (regulatory sequence, constitutive or inducible expression, tissue-specific expression).
[0175]
The invention also relates to recombinant host cells comprising the vectors described herein. Thus, host cells include prokaryotic cells, lower eukaryotic cells such as yeast, other eukaryotic cells such as insect cells, and higher eukaryotic cells such as mammalian cells.
[0176]
Recombinant host cells can be prepared by introducing the vector constructs described herein into the cells by techniques readily available to those skilled in the art. These include calcium phosphate transfection, DEAE dextran mediated transfection, cationic lipid mediated transfection, electroporation, transduction, infection, lipofection, and Sambrook et al. ("Molecular Cloning: A Laboratory Manual) ”, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989), but are not limited to these.
[0177]
A host cell can contain one or more vectors. Thus, different nucleotide sequences can be introduced into different vectors in the same cell. Similarly, a nucleic acid molecule can be introduced alone or with other unrelated nucleic acid molecules such as providing a trans-acting factor for an expression vector. When one or more vectors are introduced into a cell, the vectors can be introduced alone, introduced together, or linked to a nucleic acid molecule vector.
[0178]
In the case of bacteriophage and viral vectors, these can be introduced into cells as encapsulated or encapsulated virus by standard procedures of infection and transduction. Viral vectors can be replicable or replication defective. If viral replication is defective, replication can occur in a host cell that is provided with a function that complements the defect.
[0179]
Vectors generally contain a selectable marker that allows for selection of a subpopulation of cells containing the recombinant vector construct. This marker can be contained within the same vector containing the nucleic acid molecules described herein or in a separate vector. Markers include tetracycline or ampicillin resistance genes for prokaryotic host cells and dihydrofolate reductase or neomycin resistance for eukaryotic host cells. However, any marker that provides selectivity for phenotypic characteristics is considered effective.
[0180]
Mature proteins can be produced in bacteria, yeast, mammalian cells, and other cells under the control of appropriate regulatory sequences, although cell-free transcription and translation systems are also described herein. RNA derived from DNA constructs can be used to produce these proteins.
[0181]
Where peptide secretion is required, it is difficult to achieve with multiple transmembrane domains including proteins such as kinases, and an appropriate secretion signal is incorporated into the vector. The signal sequence can be endogenous to these peptides or heterologous to the peptides.
[0182]
If the peptide is not secreted into the medium, typically in the case of a kinase, the protein is isolated from the host cell by standard disruption procedures, including freeze thawing, sonication, mechanical disruption, use of degradants, etc. can do. Peptides can be purified by known purification methods including ammonium sulfate precipitation, acid extraction, or anion or cation exchange chromatography, phosphocellulose chromatography, hydrophobic interaction chromatography, affinity chromatography, hydroxylapatite chromatography, lectin chromatography, or high performance liquid chromatography. Can be recovered and purified.
[0183]
Recombinant production of the peptides described herein also depends on the host cell, and the peptides have different glycosylation patterns depending on the cell, and glycosylation when produced in bacteria. It will be understood that it will not. In addition, the peptides may include methionine that is first modified in some cases as a result of host-mediated processes.
[0184]
Use of vectors and host cells
Recombinant host cells that express the peptides described herein have a variety of uses. First, the cells are useful for the production of kinase proteins or peptides that can be further purified to produce the desired amount of kinase protein or fragment. For this reason, host cells containing expression vectors are useful for the production of peptides.
[0185]
Host cells are also useful in the practice of cell-based assays related to kinase proteins or kinase protein fragments, such as those described above and other forms well known in the art. Thus, recombinant host cells that express native kinase proteins are useful for assaying compounds that stimulate or inhibit kinase protein function.
[0186]
Host cells are also useful for identifying kinase protein variants whose function is affected. Where the mutation occurs naturally and causes pathology, the host cell containing the mutation does not show the effect of the natural kinase protein, but has a desired effect (eg, stimulates or inhibits function) on the kinase protein variant. It is useful for the assay.
[0187]
Genetically engineered host cells can also be used to produce transgenic non-human animals. The transgenic animal is preferably a mammal, for example a rodent such as a rat or mouse in which one or more cells of the animal contain a transgene. A transgene is exogenous DNA that is integrated into the genome of a developing transgenic animal's cell and remains in the genome of a mature animal in one or more cell types or tissues. These animals are useful for studying the function of kinase proteins and for identifying and evaluating modulators of kinase protein activity. Other examples of transgenic animals include non-human primates, sheep, dogs, cows, goats, chickens, and amphibians.
[0188]
Transgenic animals are produced by introducing nucleic acids into the male pronucleus of fertilized oocytes, for example, by microinjection, retroviral infection, and developing the oocytes in pseudopregnant female breeders . Any kinase protein nucleotide sequence can be introduced as a transgene into the genome of a non-human animal such as a mouse.
[0189]
Any regulatory or other sequence useful in the expression vector can form part of the transgene sequence. This includes intron sequences and polyadenylation signals, if not already included. Tissue-specific regulatory sequences can be operably linked to the transgene for direct expression of the kinase protein to specific cells.
[0190]
Methods for producing transgenic animals through embryo manipulation and microinjection, particularly using animals such as mice, have been generalized in the art, for example, US Pat. Nos. 4,736,866 and 4,870,009 to Leder et al. No. 4, Wagner et al., US Pat. No. 4,873,191, and Hogan, B., “Manipulating the Mouse Embryo”, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1986). . Similar methods have been used for the production of other transgenic animals. Transgenic founder animals can be identified based on the presence of the transgene in the genome and / or the expression of the transgenic mRNA in animal tissues or cells. The transgenic founder animal can then be used to breed animals with additional transgenes. In addition, transgenic animals with transgenes can be bred with other transgenic animals with further transgenes. Transgenic animals also include animals in which the entire animal or animal tissue has been produced using homologous recombinant host cells as described herein.
[0191]
In other embodiments, non-human transgenic animals can be produced that include a selection system that provides for regulated expression of the transgene. One example of such a system is the cre / loxP recombinase system of bacteriophage P1. For a description of the cre / loxP recombinase system, see, eg, Lakso et al., PNAS 89: 6232-6236 (1992). Another example of a recombinase system is the S. cerevisiae FLP recombinase system (O'Gorman et al., Science 251: 1351-1355 (1991). When the cre / loxP recombinase system is used to regulate transgene expression. Requires that the animal contain a transgene that encodes both the cre recombinase and the selected protein, such as a transgene encoding one of the selected proteins. The other is provided by creating a “double” transgenic animal by mating two transgenic animals with a transgene encoding a recombinase.
[0192]
Non-human transgenic animal clones described herein are also described by Wilmut, I., et al., Nature 385: 810-813 (1997) and WO 97/07668 and WO 97 / It can be produced according to the method described in 07669. Briefly, cells from a transgenic animal, such as somatic cells, are isolated from the growth cycle and₀Can be guided to enter the period. Quiescent cells can be fused with enucleated oocytes from animals of the same species as the animal from which the quiescent cells were isolated, for example, by use of electric pulses. The reconstituted oocyte is cultured to develop into a morula or blastocyst and then transferred into a pseudopregnant female breeder. The offspring born from this female breeding animal becomes a clone of an animal from which a cell, for example, a somatic cell is isolated.
[0193]
Transgenic animals comprising recombinant cells that express the peptides described herein are useful for performing assays as described herein in an in vivo environment. Thus, various physiological factors that exist in vivo and can affect substrate binding, kinase protein activation, and signal transduction may not be revealed by in vitro cell-free or cell-based assays. Thus, these are non-human trans for assaying in vivo the kinase protein function, including substrate interactions, the effects of specific mutant kinase proteins on kinase protein functions and substrate interactions, and the effects of chimeric kinase proteins. Useful for providing transgenic animals. It is also possible to assess the effects of null mutations, mutations that substantially or completely eliminate one or more kinase protein functions.
[0194]
In this specification, all the above publications and patents are incorporated herein by reference. Various modifications and variations of the method and system described in the present invention will be apparent to those skilled in the art without departing from the scope and spirit of the invention. Although the invention has been described in connection with specific preferred embodiments, it should be understood that the invention as claimed should not be unduly limited to such specific embodiments. Indeed, various modifications of the described methods for practicing the invention will be apparent to those skilled in molecular biology or related fields, and are intended to be within the scope of the claims.
[Brief description of the drawings]
[0195]
FIG. 1 shows the nucleotide sequence of a cDNA molecule encoding the kinase protein of the present invention (SEQ ID NO: 1). In addition, structural and functional information such as ATG initiation, termination, and tissue distribution is available, making it possible to easily determine the specific application of the present invention based on this molecular sequence. The experimental data in FIG. 1 shows expression in the larynx, kidney (adult and fetus), pancreas, fetal heart, uterus, and prostate in humans.
FIG. 2 shows the deduced amino acid sequence of the kinase of the present invention (SEQ ID NO: 2). In addition, structural and functional information such as protein family, function, and modification site is provided, making it possible to easily determine the specific application of the present invention based on this molecular sequence.
FIG. 3 shows the genomic sequence of the gene encoding the kinase protein of the present invention (SEQ ID NO: 3). In addition, structural and functional information such as intron / exon structure, promoter position, etc. is provided, making it possible to easily determine the specific application of the present invention based on this molecular sequence. As shown in FIG. 3, SNPs are identified in five locations, one of which is the 5 ′ SNP of the ORF that may affect regulatory / regulatory elements.

Claims

下記の群より選択されるアミノ酸配列からなる単離ペプチド：
(a)配列番号：2に記載のアミノ酸配列；
(b)配列番号：2に記載のアミノ酸配列の対立変異体のアミノ酸配列であって、該対立変異体が、配列番号：1または3に記載の核酸分子の対向鎖に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされたアミノ酸配列；
(c)配列番号：2に記載のアミノ酸配列のオルソログのアミノ酸配列であって、該オルソログが、配列番号：1または3に記載の核酸分子の対向鎖に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされたアミノ酸配列；及び
(d)配列番号：2に記載のアミノ酸配列の断片であって、少なくとも10個の連続するアミノ酸を含むアミノ酸配列の断片。An isolated peptide consisting of an amino acid sequence selected from the following group:
(a) the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2;
(b) the amino acid sequence of an allelic variant of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2, wherein the allelic variant is under stringent conditions on the opposite strand of the nucleic acid molecule set forth in SEQ ID NO: 1 or 3 An amino acid sequence encoded by a nucleic acid molecule that hybridizes with;
(c) an amino acid sequence of an ortholog of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2, wherein the ortholog hybridizes to the opposite strand of the nucleic acid molecule described in SEQ ID NO: 1 or 3 under stringent conditions An amino acid sequence encoded by the nucleic acid molecule; and
(d) A fragment of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2, comprising at least 10 consecutive amino acids.

下記の群より選択されるアミノ酸配列を含む単離ペプチド：
(a)配列番号：2に記載のアミノ酸配列；
(b)配列番号：2に記載のアミノ酸配列の対立変異体のアミノ酸配列であって、該対立変異体が、配列番号：1または3に記載の核酸分子の対向鎖に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされたアミノ酸配列；
(c)配列番号：2に記載のアミノ酸配列のオルソログのアミノ酸配列であって、該オルソログが、配列番号：1または3に記載の核酸分子の対向鎖に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされたアミノ酸配列；及び
(d)配列番号：2に記載のアミノ酸配列の断片であって、少なくとも10個の連続するアミノ酸を含むアミノ酸配列の断片。An isolated peptide comprising an amino acid sequence selected from the following group:
(a) the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2;
(b) the amino acid sequence of an allelic variant of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2, wherein the allelic variant is under stringent conditions on the opposite strand of the nucleic acid molecule set forth in SEQ ID NO: 1 or 3 An amino acid sequence encoded by a nucleic acid molecule that hybridizes with;
(c) an amino acid sequence of an ortholog of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2, wherein the ortholog hybridizes to the opposite strand of the nucleic acid molecule described in SEQ ID NO: 1 or 3 under stringent conditions An amino acid sequence encoded by the nucleic acid molecule; and
(d) A fragment of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, comprising at least 10 consecutive amino acids.

請求項2記載のペプチドに選択的に結合する単離抗体。3. An isolated antibody that selectively binds to the peptide of claim 2.

下記の群より選択されるヌクレオチド配列からなる単離核酸分子：
(a)配列番号：2に記載のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；
(b)配列番号：2に記載のアミノ酸配列の対立変異体のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列であって、配列番号：1または3に記載の核酸分子の対向鎖に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列；
(c)配列番号：2に記載のアミノ酸配列のオルソログをコードするヌクレオチド配列であって、配列番号：1または3に記載の核酸分子の対向鎖に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列；
(d)配列番号：2に記載のアミノ酸配列の断片をコードするヌクレオチド配列であって、該断片が、少なくとも10個の連続するアミノ酸を含むヌクレオチド配列；および
(e)(a)〜(d)のヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列。An isolated nucleic acid molecule consisting of a nucleotide sequence selected from the following group:
(a) a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2;
(b) a nucleotide sequence that encodes the amino acid sequence of an allelic variant of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 under stringent conditions on the opposite strand of the nucleic acid molecule set forth in SEQ ID NO: 1 or 3 A hybridizing nucleotide sequence;
(c) a nucleotide sequence that encodes an ortholog of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 and that hybridizes to the opposite strand of the nucleic acid molecule set forth in SEQ ID NO: 1 or 3 under stringent conditions ;
(d) a nucleotide sequence encoding a fragment of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2, wherein the fragment comprises at least 10 consecutive amino acids; and
(e) a nucleotide sequence that is complementary to the nucleotide sequence of (a)-(d).

下記の群より選択されるヌクレオチド配列を含む単離核酸分子：
(a)配列番号：2に記載のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；
(b)配列番号：2に記載のアミノ酸配列の対立変異体のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列であって、配列番号：1または3に記載の核酸分子の対向鎖に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列；
(c)配列番号：2に記載のアミノ酸配列のオルソログをコードするヌクレオチド配列であって、配列番号：1または3に記載の核酸分子の対向鎖に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列；
(d)配列番号：2に記載のアミノ酸配列の断片をコードするヌクレオチド配列であって、該断片が、少なくとも10個の連続するアミノ酸を含むヌクレオチド配列；および
(e) (a)〜(d)のヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列。An isolated nucleic acid molecule comprising a nucleotide sequence selected from the following group:
(a) a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2;
(b) a nucleotide sequence that encodes the amino acid sequence of an allelic variant of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 under stringent conditions on the opposite strand of the nucleic acid molecule set forth in SEQ ID NO: 1 or 3 A hybridizing nucleotide sequence;
(c) a nucleotide sequence that encodes an ortholog of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 and that hybridizes to the opposite strand of the nucleic acid molecule set forth in SEQ ID NO: 1 or 3 under stringent conditions ;
(d) a nucleotide sequence encoding a fragment of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2, wherein the fragment comprises at least 10 consecutive amino acids; and
(e) A nucleotide sequence that is complementary to the nucleotide sequence of (a)-(d).

請求項5記載の核酸分子を含む遺伝子チップ。6. A gene chip comprising the nucleic acid molecule according to claim 5.

請求項5記載の核酸分子を含むヒト以外のトランスジェニック動物。A transgenic non-human animal comprising the nucleic acid molecule according to claim 5.

請求項5記載の核酸分子を含む核酸ベクター。A nucleic acid vector comprising the nucleic acid molecule according to claim 5.

請求項8記載のベクターを含む宿主細胞。A host cell comprising the vector of claim 8.

請求項1記載のいずれかのペプチドを製造する方法であって、(a)〜(d)のいずれかのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を宿主細胞内に導入する段階、およびペプチドがヌクレオチド配列から発現される条件下で宿主細胞を培養する段階を含む方法。A method for producing any of the peptides according to claim 1, wherein a nucleotide sequence encoding any one of the amino acid sequences of (a) to (d) is introduced into a host cell, and the peptide is derived from the nucleotide sequence. Culturing the host cell under conditions to be expressed.

請求項2記載のいずれかのペプチドを製造する方法であって、(a)〜(d)のいずれかのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を宿主細胞に導入する段階、およびペプチドがヌクレオチド配列から発現される条件下で宿主細胞を培養する段階を含む方法。A method for producing any of the peptides according to claim 2, wherein a nucleotide sequence encoding any one of the amino acid sequences (a) to (d) is introduced into a host cell, and the peptide is expressed from the nucleotide sequence. Culturing the host cell under the conditions provided.

試料中における請求項2記載のいずれかのペプチドの存在を検出する方法であって、試料中における該ペプチドの存在を特異的に検出する検出試薬と試料を接触させる段階、および該ペプチドの存在を検出する段階を含む方法。A method for detecting the presence of any of the peptides of claim 2 in a sample, comprising the step of contacting the sample with a detection reagent that specifically detects the presence of the peptide in the sample, and the presence of the peptide. A method comprising the step of detecting.

試料中における請求項5記載の核酸分子の存在を検出する方法であって、ストリンジェントな条件下で該核酸分子にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドと試料を接触させる段階、および試料中の該核酸分子とオリゴヌクレオチドが結合するかどうかを判定する段階を含む方法。A method for detecting the presence of a nucleic acid molecule according to claim 5 in a sample comprising contacting the sample with an oligonucleotide that hybridizes to the nucleic acid molecule under stringent conditions, and the nucleic acid molecule in the sample Determining whether the oligonucleotide binds.

請求項2記載のペプチドのモジュレータを同定する方法であって、該ペプチドを試薬と接触させる段階、および該試薬が該ペプチドの機能又は活性を調節したかどうかを判定する段階を含む方法。3. A method of identifying a modulator of a peptide according to claim 2, comprising contacting the peptide with a reagent and determining whether the reagent has modulated the function or activity of the peptide.

前記試薬が前記ペプチドを発現する発現ベクターを含む宿主細胞に投与される、請求項14記載の方法。15. The method of claim 14, wherein the reagent is administered to a host cell comprising an expression vector that expresses the peptide.

請求項2記載のいずれかのペプチドに結合する試薬を同定する方法であって、ペプチドと試薬を接触させる段階、および接触混合物をアッセイして、ペプチドと試薬との複合体が形成されるかどうかを判定する段階を含む方法。A method for identifying a reagent that binds to any of the peptides of claim 2, wherein the step of contacting the peptide with the reagent, and whether the contact mixture is assayed to form a peptide-reagent complex. Determining.

請求項16記載の方法により同定された試薬と、薬学的に許容されるそれらの担体とを含む薬学的組成物。17. A pharmaceutical composition comprising a reagent identified by the method of claim 16 and a pharmaceutically acceptable carrier thereof.

ヒトキナーゼタンパク質により媒介される疾患又は症状を治療する方法であって、薬学的に有効な量の請求項16記載の方法で同定された試薬を患者に投与する段階を含む方法。17. A method of treating a disease or condition mediated by human kinase protein, comprising administering to a patient a pharmaceutically effective amount of a reagent identified by the method of claim 16.

請求項2記載のペプチドの発現のモジュレータを同定する方法であって、該ペプチドを発現する細胞と試薬とを接触させる段階、および該試薬が該ペプチドの発現を調節したかどうかを判定する段階を含む方法。A method for identifying a modulator of peptide expression according to claim 2, comprising the step of contacting a cell expressing the peptide with a reagent, and determining whether the reagent modulates the expression of the peptide. Including methods.

配列番号：2に記載のアミノ酸配列と少なくとも70％の相同性を持つアミノ酸配列を有する単離ヒトキナーゼペプチド。An isolated human kinase peptide having an amino acid sequence having at least 70% homology with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2.

配列番号：2に記載のアミノ酸配列と少なくとも90％の相同性を持つアミノ酸配列を有する、請求項20記載のペプチド。21. The peptide of claim 20, having an amino acid sequence having at least 90% homology with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2.

ヒトキナーゼペプチドをコードする単離核酸分子であって、配列番号：1または3に記載の核酸分子と少なくとも80％の相同性を有する核酸分子。An isolated nucleic acid molecule encoding a human kinase peptide, wherein the nucleic acid molecule has at least 80% homology with the nucleic acid molecule set forth in SEQ ID NO: 1 or 3.

配列番号：1または3に記載の核酸分子と少なくとも90％の相同性を有している、請求項22記載の核酸分子。23. The nucleic acid molecule of claim 22, having at least 90% homology with the nucleic acid molecule set forth in SEQ ID NO: 1 or 3.