JP2004525632A - 転写による増幅を使用したhbvdnaの増幅及び検出法 - Google Patents
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Abstract
Description
【0001】
本発明はHBV DNAを増幅するための転写による増幅方法に関する。
【背景技術】
【0002】
分子生物学及び組換えDNA技術の分野では核酸増幅法が使用されている。これらの方法はRNAとDNAの両者を含めた多様な他の核酸配列が共存する環境に存在することが多い少量の特定核酸配列のコピー数を増すために使用される。特に、核酸増幅法は核酸の検出又は定量を容易にするために使用され、例えば感染症、遺伝病及び各種癌の診断に重要である。核酸増幅法は法医化学、考古学又は父子鑑定のように核酸が微量に存在している可能性のある試料を調査する他の分野でも利用されている。
【0003】
作用メカニズムの異なる数種の核酸増幅法が知られている。核酸増幅法の1例は「ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)」として知られ、ヨーロッパ特許出願第EP200362号及びEP201148号に記載されている。
【0004】
本発明は別種の核酸増幅法、即ち「転写による増幅法」に関する。これらの方法では、RNAポリメラーゼにより認識される機能プロモーターを含むDNA鋳型から多重RNAコピーが得られる。これらのRNAコピーをターゲットとして使用すると、新たにDNA鋳型等が得られる。Gingerasら(WO88/10315)とBurgら(WO89/1050)がこのような方法を記載している。DaveyはEP323822(NASBA法に関する)、GingerasらはEP373960及びKacianらはEP408295に等温転写による増幅法を記載している。熱安定酵素を用いて転写による増幅反応を実施することもできる。転写による増幅は一般に41℃前後の温度で実施される。熱安定酵素を使用すると、より高温で反応を行うことができる。このような熱安定法は東洋紡名義で出願されたEP682121に記載されている。
【0005】
EP323822、EP373960及びEP408295に記載されているような方法は等温連続法である。これらの方法では増幅を行うためにRNA依存性DNAポリメラーゼ活性、DNA依存性DNAポリメラーゼ活性、RNアーゼ(H)活性及びRNAポリメラーゼ活性の4種の酵素活性が必要である。これらの活性のいくつかを1種の酵素で兼備できるので、通常は2、3種の酵素ですむ。AMV(鳥類筋芽細胞腫ウイルス)又はMMLV(モロニーマウス白血病ウイルス)逆転写酵素等の逆転写酵素はRNAとDNAの両者に依存性のDNAポリメラーゼ活性に加え、固有RNアーゼH活性ももつ。更に、転写による増幅反応の反応混合物に大腸菌RNアーゼH等のRNアーゼを加えてもよい。
【0006】
DNA依存性RNAポリメラーゼはRNAポリメラーゼにより認識されるプロモーターを含むDNA鋳型から多重RNAコピーを合成する。RNAポリメラーゼの例は大腸菌とバクテリオファージT7、T3及びSP6に由来するポリメラーゼである。転写による増幅法で一般に使用されるRNAポリメラーゼの1例はT7ポリメラーゼである。従って、この場合にRNAの多重コピーを生産するために使用する鋳型に組込むプロモーターはT7プロモーターである。一般に、プロモーターを含む鋳型はターゲット配列を含む核酸から出発して作製すべきである。この核酸は増幅反応の原料として使用する出発材料に存在していてもよい。出発材料に存在する核酸は一般にずっと長い配列の一部としてターゲット配列を含む。ターゲット配列の3’及び5’末端の両方に付加核酸配列が存在していてもよい。増幅反応は出発材料からのこの核酸と、上記活性を提供する適切な酵素組合せと、少なくとも1種、通常は2種のオリゴヌクレオチドを混合することにより開始することができる。これらのオリゴヌクレオチドの少なくとも1種はRNAポリメラーゼプロモーターの配列を含んでいる必要がある。転写による増幅反応は原料が一本鎖RNAである場合に特に有用であるが、一本鎖又は二本鎖DNAも原料として使用できる。ターゲット配列の3’末端と5’末端の両方に付加配列をもつ一本鎖RNAを含む試料で転写による増幅法を実施する場合、従来技術に記載されているような方法で簡便に使用されるオリゴヌクレオチド対は、
−ターゲット配列の3’末端にハイブリダイズすることが可能であり、その5’末端に結合したプロモーター(好ましくはT7プロモーター)の配列をもつ第1のオリゴヌクレオチド(一般に「プロモータープライマー」又は「フォワードプライマー」と言う)(このオリゴヌクレオチドのハイブリダイジング部分は原料として使用するターゲットRNAと逆極性である)と、
−ターゲット配列の5’末端を含む第2のオリゴヌクレオチド(一般に「リバースプライマー」と言う)(このオリゴヌクレオチドはターゲットRNAと同一極性である)から構成される。
【0007】
このようなオリゴヌクレオチド対と適切な活性をもつ全酵素と十分な量の必要なリボヌクレオチド及びデオキシリボヌクレオチドを1つの反応混合物とし、適切な条件(即ち適切な緩衝液条件と適切な温度)に十分な時間維持すると、等温連続増幅反応が開始する。上記趣旨の多数の変形が従来技術に記載されている。転写による増幅反応はRNAポリメラーゼ(例えばT7 RNAポリメラーゼ)により認識されるプロモーター(例えばT7プロモーター)を含む鋳型から一本鎖RNA転写産物を合成する。プロモーター配列を含むフォワードプライマーはターゲットRNAに相補的なDNA鎖の合成を開始するプライマーとして機能する。
【0008】
プライマーはRNA依存性DNAポリメラーゼ活性により伸長する。形成されたRNA−cDNAハイブリッドはRNアーゼHにより分解される。こうして特定リバースプライマーをcDNAにハイブリダイズさせることができる。このプライマーがRNA依存性DNAポリメラーゼによりcDNAの5’末端まで伸長すると二本鎖プロモーター配列が形成され、こうしてフォワードプライマーの一部であったプロモーター配列が鋳型として使用される。この二本鎖プロモーターは更にDNA依存性RNAポリメラーゼにより使用され、ターゲットRNAに相補的な多数の新規RNA分子を生じる。この開始期後、増幅は循環期に入る。
【0009】
実際に、試料中の一本鎖RNAから出発するイベントシーケンス全体は全成分を混合するとすぐに始まり、混合物は全酵素を活性にするのに適した温度となる。この方法の実施者はこれらの段階を行うために介入する必要がない。
【0010】
上述のように、転写による増幅法は一本鎖RNAから出発する増幅に特に有用である。増幅しようとする核酸を含む出発材料は規定長のRNAとしてターゲット核酸を含んでいなくてもよい。環状又は線状二本鎖DNAとしてしかターゲット配列を含まない出発材料で転写による増幅法を実施する場合には、DNAを一本鎖核酸にする必要がある。これは高温(100℃まで)を加えて二本鎖DNAの鎖を分離することにより実施することができる。このとき、増幅プライマーとして使用する第1のオリゴヌクレオチドが一本鎖の一方にアニールする可能性がある。現状の転写による増幅法で使用されている酵素はこのような高温に耐えられないので、DNA鎖を分離した後にしか加えることができない。オリゴヌクレオチドの一方が一本鎖DNAにアニールして伸長すると、再び二本鎖DNAが生成され、二本鎖DNAを別々の鎖に再び融解するために十分な高温を反応混合物に加えなければならない。再び酵素を失活させ、熱段階を行った後に新たに酵素を加えなければならない。漸く第2のオリゴヌクレオチドを加え、第1段階で伸長した第1のオリゴヌクレオチドから生成された鎖にアニールすることができる。オリゴヌクレオチドの一方はDNA依存性RNAポリメラーゼ(上記参照)の5’プロモーター配列を含んでいるので、二本鎖機能プロモーターを含む二本鎖DNA鋳型が得られ、この鋳型からRNA生産の第1段階を実施することができる。得られたRNA転写産物は増幅の循環期に入り、プロセスは更に等温になる。
【0011】
上記から明らかなように、二本鎖DNAから転写による増幅法を開始するのは冗長な方法であると思われる。実施者は特定操作を数回実施する必要があり、試料を繰返し加熱冷却しなければならず、各加熱段階後に酵素を補充しなければならない。
【0012】
二本鎖DNAを循環等温転写による増幅の原料として使用可能な一本鎖RNAに変換するのに上記のような冗長な手順を使用せずに二本鎖DNAから出発することができる転写による増幅法の開発に向けて既にいくつかの研究が進められている。
【0013】
かなり単純な二本鎖DNAの転写による増幅法はWO9925868に開示されている。
【0014】
WO9925868に記載されている方法によると、(90℃を上回る)熱処理段階を全く介さないか、あるいは好適態様では1段階の初期加熱段階しか介さずに転写による増幅プロトコールにより試料中の二本鎖DNAを直接増幅することができる。この方法では比較的短い二本鎖DNAが好ましいとされている。しかし、この方法は実際には一本鎖RNAを増幅する慣用の転写による増幅プロトコールと本質的に変わらない。
【0015】
また、増幅の開始前に出発材料中の二本鎖DNAをRNAに転写することも考えられる。このような付加段階は例えばプロモーター配列(ポリメラーゼ結合部位とも言う)が存在しなくても二本鎖DNAをRNAに転写する酵素(例えば大腸菌RNAポリメラーゼ)を利用して実施することができる。転写による増幅法による二本鎖DNAの増幅を容易にするために付加段階を実施するこのような方法はPCT特許出願第WO9602668号に記載されている。この方法に記載されている付加段階は処理段階と処理時間を増すだけでなく、付加成分(即ち大腸菌RNAポリメラーゼ)も必要である。
【0016】
二本鎖DNAの転写による増幅法に適した鋳型を作製する別の方法はEP397269に記載されている。
【0017】
この特許には、二本鎖DNAを制限酵素で前処理する方法が記載されている。制限酵素で処理後に1段階の熱分離段階だけで一本鎖DNA(ssDNA)を生成できる。この方法では一本鎖DNAの一方の厳密な3’末端に相補的な配列を含む3’部分と、RNAポリメラーゼ(例えばT7 RNAポリメラーゼ)により認識されるプロモーター配列を含む5’末端をもつフォワードプライマー(プロモータープライマー)を使用する。プロモータープライマーを一本鎖DNAの3’末端にハイブリダイズさせると、二本鎖複合体が形成され、フォワードプライマーの5’プロモーター配列をDNA鎖の3’末端から開始する伸長反応の鋳型として利用することができる。従って、DNA依存性DNAポリメラーゼにより二本鎖プロモーターが形成され、得られる複合体をDNA依存性RNAポリメラーゼの鋳型として利用し、RNAの多重コピーを合成することができる。
【0018】
WO9104340にも一本鎖DNAの転写による増幅反応を開始するための数種の方法が開示されている。ここでもプロモータープライマーの3’配列にハイブリダイズすることができるDNAの適切な3’末端を生成するために制限酵素を使用している。
【0019】
WO9104340には一本鎖DNAを切断する制限酵素を使用して一本鎖DNAの規定3’末端を生成する方法が開示されている。同一方法の別態様では、ターゲット一本鎖DNAにハイブリダイズする制限オリゴヌクレオチドと共に二本鎖DNAを切断する制限酵素を使用し、適切な3’末端を生成するために制限酵素により切断可能な二本鎖DNAフラグメントを生成している。この方法では、制限酵素が二本鎖複合体を切断した後に制限オリゴヌクレオチドの小フラグメントが残存する。しかし、WO9104340の開示によると、消化後の残存フラグメントが一本鎖DNAの3’末端にハイブリダイズしたままの状態を続けるには小さ過ぎてプロモーターオリゴヌクレオチドの場所を取れないように制限オリゴヌクレオチドを選択しているように思われる。一方、従来技術の方法で使用されているような制限酵素で前処理すると、高感度な転写アッセイとなるかもしれないが、多数の余分な処理段階及び処理時間が必要である。
【0020】
ヒトのB型肝炎ウイルス(HBV)感染は広範囲に見られる。B型肝炎の原因となるウイルスはヒトとチンパンジーにしか感染しないように思われる。
【0021】
肝炎感染は(1)輸血のように大量な場合や不慮の皮膚刺し傷による少量の場合の感染血液又は体液の腸管外移入、(2)緊密な家族又は性的接触、及び(3)母体から新生児へのウイルス感染の主に3種のメカニズムにより伝染する。自然条件下ではHBVの伝染性は高くない。吸入による感染は起こるとしても稀である。人体の健康を最も脅すのは汚染血液又は血液製剤による感染経路である。
【0022】
HBV感染は無症状性又は急性自己制限肝疾患に至ることが多く、慢性長期感染となる場合もある。慢性HBV感染は最重篤形態の慢性活性肝炎から重篤度の低い慢性持続性肝炎、更には無症状キャリヤー状態に至る一連の病態を誘発する。臨床医がB型肝炎ウイルス感染を他の形態のウイルス性肝炎(即ちA型肝炎、C型肝炎又はE型肝炎)から区別し易くするために一連の診断アッセイが最近開発されている。しかし、急性B型肝炎感染と症候性慢性B型肝炎感染を区別できるようにするにはまだ問題がある。これは特に、慢性活性肝炎患者と慢性持続性肝炎患者のいずれも肝傷害の急性増悪と正常肝機能が交互に現れる周期的肝炎パターンを示すことが多いためである。
【0023】
HBV感染後は大量のウイルスと会合粒子が血清中に存在する。感染症候期には急性及び慢性HBV患者のいずれも肝酵素値が上がり、その血清中にB型肝炎表面抗原(HBsAg)をもち、ヌクレオキャプシド抗原(HBcAg)に対する抗体を産生する。HBsAg又はB型肝炎e抗原(HBeAg)に特異的な抗体は検出されない。HBsAgに対する抗体の出現は通常は循環HBsAgの消滅後約2カ月まで認められない。血清中に存在するウイルス粒子はその表面コートを脱落してコア抗原(HBcAg)として知られるヌクレオキャプシドを露出させることが知られている。HBcAgの抗体産生はHBV感染の急性期の初期に生じ、多年間持続することもあり、慢性感染患者は高力価の抗HBc抗体を産生することができる。
【0024】
HBsAgは感染個体の血清中に検出可能な急性又は慢性B型肝炎感染の最重要マーカーとして認められている。B型肝炎の感染を避けるには例えばドナー血液のHBsAgスクリーニングが不可欠である。診断HBVアッセイでは感度が最も重要であることは明白である。
【0025】
HBVは最小の公知DNAウイルスであり、そのゲノムは高密度配置を示す。HBVの複製サイクルのユニークな側面の1つは、プレゲノムmRNAが最初のウイルスDNA鎖の合成の鋳型として機能することである。その後、HBV DNAポリメラーゼのRNアーゼH活性はmRNAを除去した後、相補的DNA鎖を合成し、ビリオンにパッケージするための部分二本鎖DNA分子を生成する。ウイルス導入に成功すると、部分二本鎖DNA分子は完全二本鎖DNA分子に変換される。
【0026】
HBsAg及びHBeAg陽性感染宿主の血液中には90%を越える症例でHBV DNAを検出することができる。感染性粒子の量を測定する最新方法は複製ウイルスの量を最も確実に反映するという理由で血清又は血漿中のウイルスDNAの量を測定することにより実施されている。この目的には数種のアッセイを利用でき、例えば分岐DNA(bDNA)アッセイ(Hendricks DA,Stowe BJ,Hoo BS,Kolberg J,Irvine BD,Neuwald PD,Urdea MS,Perrillo RP,1995,Quantitation of HBV DNA in human serum using a branched DNA (bDNA) signal amplification assay.Am J Clin Pathol 104:537−546)、DNAハイブリダイゼーションアッセイ及び定量的PCR(Pawlotsky JM,Bastie A,Lonjon I,Remire J,Darthuy F,Soussy CJ,Dhumeaux D,1997.What technique should be used for routine detection and quantification of HBV DNA in clinical samples? Journal of Virological Methods 65:245−253.;Zaaijer HL,ter Borg F,Cuypers HT,Hermus MC,Lelie PN,1994.Comparison of methods for detection of hepatitis B virus DNA,J Clin Microbiol 32:2088−2091.)が挙げられる。しかし、これらのアッセイの殆どは感度が限られている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【0027】
本発明は制限酵素消化を含む転写による増幅法に関する。本方法はB型肝炎ウイルスのDNAを高感度で特異的に増幅(及びその後に検出)することができる。本発明の方法では、従来技術の転写による増幅法よりも効率的にHBV DNAを増幅及び検出することができる。従来技術の方法とは対照的に、制限酵素を使用しても本発明の方法で使用する手順は煩瑣にならない。
【課題を解決するための手段】
【0028】
本発明は、
−HBVを含む疑いのある試料を、
選択した制限部位でHBV DNAを解裂することができ、前記HBV DNA鎖の規定3’末端を生成する1またはそれ以上の制限酵素、
DNA依存性RNAポリメラーゼにより認識されるプロモーターの配列を含む5’領域およびDNA鎖の3’末端に相補的な3’領域を有するプロモータープライマー、
プロモータープライマーと逆極性であり、前記ターゲット配列の5’末端を含む第2またはリバースプライマー、および
ターゲット配列がHBV一本鎖DNAの場合には制限プライマーと共に、
増幅緩衝液中にてインキュベートする段階、
−こうして生成した反応混合物を、制限酵素により消化させるために十分な時間適切な条件下に維持する段階、
−試料を制限酵素を失活させるため及び/又は少なくとも部分的に二本鎖を一本鎖にするために十分な温度と時間熱処理する段階、
−RNA依存性DNAポリメラーゼ活性をもつ酵素と、DNA依存性DNAポリメラーゼ活性をもつ酵素と、RNアーゼH活性をもつ酵素と、RNAポリメラーゼ活性をもつ酵素を試料に加える段階、および
−こうして生成した反応混合物を増幅させるために十分な時間適切な条件下に維持する段階
を含む試料中に場合により存在するHBV DNAから出発するターゲットHBV核酸配列の転写による増幅方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【0029】
(適切な増幅のために)必要な(適切な)ヌクレオシド三リン酸はインキュベーション段階中に1種以上の制限酵素と共に例えば前記増幅緩衝液の一部として予め存在していてもよい。他方、工程の後期に例えば熱処理後に酵素と共に加えてもよい。
【0030】
転写による増幅法に使用する酵素と転写による増幅法の実施条件は当業者に公知であり、転写による増幅反応を最適化するために実施可能な全通常改変も当業者に公知である。例えば、フォワードプライマーであるプロモータープライマーはプライマーの5’末端のプロモーター配列とプライマーの3’末端のハイブリダイジング配列の間にプリン領域を加えてもよい。
【0031】
プライマーの配列は主に選択した制限部位の位置により決定される。フォワードプライマーの3’末端は制限部位のすぐ隣りのターゲット配列にアニールすべきである。プライマーは増幅反応で使用する条件下でハイブリダイズするために十分な長さである限り、任意長とすることができる。一般に、プライマーのハイブリダイジング部分は約10〜約35ヌクレオチドから構成される。
【0032】
本発明の方法で使用される制限プライマーは、ターゲットが一本鎖DNAの場合には、フォワードプライマーとのオーバーラップが最小となること、および制限酵素が実際にDNAを効率的に切断するように制限部位の配列を組込むことが必要である。
【0033】
制限酵素は選択部位(即ち酵素により認識される特定ヌクレオチド配列)で二本鎖DNAを切断することができる酵素である。本発明の方法に適した制限酵素を選択するにあたっては、HBV DNAの全変異体に存在する制限部位(例えば、試料中の全ウイルスHBV DNAを検出するために増幅を行う場合にはB型肝炎ウイルスの全遺伝子型に存在する制限部位)を選択するように注意すべきである。制限部位は使用するフォワードプライマーとリバースプライマーの間のDNA配列に存在すべきではない。
【0034】
制限酵素を加えると、DNAのターゲット鎖の規定3’末端が生成され、その後、プロモータープライマーのハイブリダイジング部分に結合するために利用することができる。付加側面として、消化によりDNAのこの部分の変性が改善されるのでプライマー結合が容易になる。
【0035】
T7プロモーター配列を含むプロモーターオリゴヌクレオチドはハイブリダイジング部分が制限部位のすぐ上流の鋳型と相互作用するように設計すべきである。DNA依存性DNAポリメラーゼ活性をもつ酵素(通常はMMLV−RTやAMV−RT等の逆転写酵素)は、プライマーを鋳型として使用して、制限酵素消化により生成されたDNAのターゲット鎖の3’末端を伸長させることができる。二本鎖T7プロモーター配列が形成され、アンプリコンRNAの産生を開始することができる。
【0036】
驚くべきことに、転写によるHBV DNA増幅法に適するように改変した環境で制限酵素を効率的に使用できることが判明した。換言するならば、転写による増幅の原料として使用するHBV DNAを切断するために制限酵素を使用しても試料の処理が煩瑣になったり、増えたりしないことが判明した。制限酵素の使用は通常転写によるDNA増幅プロトコールの既存部分である段階に組込まれ、その一部を構成する。
【0037】
すべての全従来技術の方法は実際の転写による増幅に先立つ別個の前処理として、転写による増幅に用いるDNA鋳型の作製に制限酵素を使用すると記載している。従って、従来技術はDNA鋳型の作製に制限酵素を使用するので、制限酵素を別途失活させたり、DNAを別途精製するなど試料の処理が増す。従って、増幅手順全体、特に自動工程が煩瑣になり、汚染の危険が増す。
【0038】
制限酵素と共に制限オリゴヌクレオチドを加えることは既にWO9104340に開示されているが、どのようにすれば転写による増幅に制限酵素(及びオリゴヌクレオチド)の使用を効率的に組合せることができるかについては本発明以前には開示されていない。
【0039】
どのようにすれば試料処理段階や試薬添加段階を増やさずに転写による増幅に制限酵素の使用を組合せることができるかについて従来技術には開示されていない。
【0040】
本発明の方法は従来技術の転写によるDNA増幅法を複雑にせずにこの組合せを実現する。
【0041】
本発明の方法は通常の転写による増幅法と殆ど変わらない。必要な付加段階は試料と制限酵素の「ビルトインインキュベーション」だけであり、即ち試料の実際の処理が慣用/従来技術の転写によるDNA増幅法と変わらないように制限酵素を使用する。
【0042】
本発明の方法で使用する好適制限酵素は当然のことながら比較的安定しており、(比較的高濃度の塩を含有する)増幅緩衝液を含む反応混合物に加える条件下で高活性を維持する酵素である。
【0043】
制限酵素の添加後、酵素を活性にするのに適した条件下で適切な時間にわたって試料をインキュベートする必要がある。使用する制限酵素の種類により当然異なるが、約35〜約45℃、より特定的には約37〜41℃の温度で比較的短時間、好ましくは約10〜20分間、より好ましくは約15分間試料を制限酵素と共にインキュベートすればよい。実際に、従来の転写によるDNA増幅法に追加する段階はこれだけである。
【0044】
本発明の方法は制限酵素と共にインキュベーション後に試料を加熱する段階を含む。この加熱中に制限酵素を失活させ、二本鎖DNAを(少なくとも部分的に)一本鎖にする。この加熱段階は転写による増幅法を実施するためのプロトコールの既存部分である。これらの方法はプライマー添加後に試料を熱処理し、プライマーアニーリングに最適な状況を作る(核酸を伸長させ、核酸の鎖又は内部ループを分離し、冷却中にプライマーを鋳型にハイブリダイズし易くする)。
【0045】
酵素と共にインキュベーション後の加熱は約50℃以上の低温で実施してもよいが、90℃を上回る温度、好ましくは95±3℃で短時間(約5〜10分間)のインキュベーションにより実施することが好ましい。
【0046】
その後、転写による増幅反応を生じるのに適した温度(通常は約41℃)まで試料を冷却させればよい。
【0047】
加熱により、二本鎖DNAの少なくとも一部が一本鎖になる。プライマー、特にプロモーターオリゴヌクレオチドは試料の加熱前に既に存在しているので、熱処理はプライマーがDNAにアニールするのも助長できる。
【0048】
従って、制限酵素処理後に試料からDNAを増幅する必要がない。既に転写による増幅法の一部であった熱処理で酵素を失活させるだけである。本発明の方法では、制限酵素が実際の転写による増幅反応を妨げる危険をなくすためにはこれで十分であることが分かった。
【0049】
熱処理後に転写による増幅に用いる付加増幅試薬を常法で加え、当業者に公知の常法で転写による増幅を実施することができる。
【0050】
(当然のことながら熱安定性酵素を使用しないという条件で)熱処理中の酵素の劣化を防ぐためには熱処理後に増幅酵素を加えるだけでよい。
【0051】
本発明の方法の主要な利点は、付加試薬(例えば制限酵素)を使用するとしても、付加(別の)反応段階又は活性が必要ないことである。
【0052】
特に増幅反応では汚染の危険を絶対に避けなければならないが試料の付加処理は常に汚染の危険を増すので、試料の付加処理が不要であるという事実は特に重要である。更に、試料の付加処理段階が必要であると、方法の自動化も複雑になる。
【0053】
本発明の方法は一本鎖DNAにも使用することができる。DNAが一本鎖の場合には、ターゲットDNAの制限部位を含む領域に相補的な配列を含む制限オリゴヌクレオチド又は制限プライマーを制限酵素と共に加える。
【0054】
制限オリゴヌクレオチド(制限プライマー)は一本鎖DNAにハイブリダイズし、制限酵素で切断することができる二本鎖複合体を形成する。更に別の試薬(制限オリゴヌクレオチド)を加えても実施者が実施する段階は増えない。制限オリゴヌクレオチドを制限酵素及び増幅に必要な他のオリゴヌクレオチドと共に加えるだけでよい。従って、試薬を別に加えるために増幅システムを開く必要がない。
【0055】
本発明の1好適態様では、DNA依存性RNAポリメラーゼにより認識されるプロモーターの配列も含むオリゴヌクレオチドに制限オリゴヌクレオチドの機能を組込むことができる(プロモーター兼制限プライマー)。このように、制限部位を含むターゲット領域に相補的な配列を組込んだプロモーター(又はフォワード)プライマーと、第2の(又はリバース)プライマーの2種のオリゴヌクレオチドしか増幅に必要としない。この好適(プロモーター兼制限)プライマーの制限部位を含む配列は、
−消化後、プライマーの残存部分が加熱段階中にターゲットから変性するように、
−ターゲットのハイブリダイジング配列の残存部分が新規プロモーター兼制限プライマーを結合させるに十分な長さであるように、
−制限酵素の活性に必要な場合には制限部位の周囲の付加ヌクレオチドをハイブリダイゼーションに加えるように、配置することが好ましい。
【0056】
従って、プロモーター兼制限プライマーの一部は制限オリゴヌクレオチドとして機能し、ターゲットDNAにアニールし、制限酵素により認識される制限部位を含む二本鎖DNAとなる。その後、制限酵素は前記二本鎖DNAを切断し、DNAの規定3’末端を提供する。
【0057】
転写による増幅反応において慣用プロモータープライマーについて既に一般的なように、ターゲットDNAの量に対して少なくとも1000倍のこのプロモーター兼制限プライマーが存在すべきである。
【0058】
本発明の方法は特に本明細書に記載するようなHBVプライマーとHBVプローブを使用してB型肝炎ウイルス(HBV)を含む疑いのある試料中のウイルスDNAを増幅及び検出するための効率的で高感度の方法を提供する。従って、これらのHBVプライマーとHBVプローブは本発明の別の態様に相当する。
【0059】
本発明の方法で選択される制限部位はHBVの種々の遺伝子型で保存された制限部位であることが好ましい。
【0060】
表面抗原をコードするHBVゲノムの部分にターゲット配列と制限部位を配置した場合に良好な結果が得られた。
【0061】
(これらの部位で切断する制限酵素と組合せて)本発明の方法で特に有用なHBsAgコーディング領域の保存制限部位は、EcoRI部位を基準にヌクレオチド247〜252に位置するXbaI部位、EcoRI部位を基準にヌクレオチド253〜258に位置するBssSI部位及びEcoRI部位を基準にヌクレオチド178〜183に位置するAvrII部位である。
【0062】
プライマーのオリゴヌクレオチド配列は当然のことながら主に選択される制限部位の位置により決定される。プライマーは増幅反応で使用する条件下でハイブリダイズするために十分な長さである限り、任意長とすることができる。一般に、プライマーのハイブリダイジング部分は約10〜約35ヌクレオチド、より好ましくは約15〜約30ヌクレオチドから構成される。
【0063】
フォワードプライマーの5’末端は制限部位のすぐ隣りのターゲット配列にアニールすべきである。
【0064】
リバースプライマーの位置はさほど重要でないが、プローブをフォワードプライマー領域とリバースプライマー領域の間の領域で増幅ターゲット配列にハイブリダイズさせることができるように保存領域の一部の配列がフォワードプライマーの位置から十分離れていることが好ましい。
【0065】
好適制限プライマーは、フォワードプライマーとのオーバーラップが最小であり、制限酵素がこうして形成された二本鎖DNAを実際に切断できるような切断部位の配列を含み、HBV DNAに十分にハイブリダイズするように十分長い、オリゴヌクレオチドである。
【0066】
XbaI、AvrII及び/又はBssSI制限酵素と組合せた場合に特に有用なオリゴヌクレオチドフォワードプライマーが本発明の好適態様である。特に、制限酵素XbaIと組合せた配列番号1のHBVハイブリダイジング部分(前記ハイブリダイジング部分自体は配列番号10)、BssSIと組合せた配列番号2のHBVハイブリダイジング部分(前記ハイブリダイジング部分自体は配列番号11)及び/又はAvrIIと組合せた配列番号3のハイブリダイジング部分(前記ハイブリダイジング部分自体は配列番号12)の(開裂部位から数えて)少なくとも10、好ましくは16以上のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドが好ましい。
【0067】
制限プライマーとして使用することができるオリゴヌクレオチドは該当HBV DNA制限部位の「両側」、特にEcoRI部位を基準にヌクレオチド247〜252に位置するXbaI部位、EcoRI部位を基準にヌクレオチド253〜258に位置するBssSI部位及びEcoRI部位を基準にヌクレオチド178〜183に位置するAvrII部位の「両側の」少なくとも10、好ましくは16以上のヌクレオチドを含む。
【0068】
特に適切な制限プライマーは配列番号8及び配列番号9に示すオリゴヌクレオチド配列をもつ。
【0069】
増幅HBVターゲットの検出に適したプローブは、増幅HBVターゲットにハイブリダイズする10〜約35、より好ましくは約15〜約30ヌクレオチドを含み、配列番号6及び配列番号7のHBVハイブリダイジング部分の少なくとも10、好ましくは16以上のヌクレオチドを含む。(これらの配列のHBVハイブリダイジング部分を表1に示し、夫々配列番号13と配列番号14に示す。表1に示すプローブは完全に又は場合により数個のHBVヌクレオチドと共にプローブの「ステム」を形成する非HBVヌクレオチドを両端に更にもち、前記ステムは選択される検出システムの一部である)。
【0070】
適切なリバースプライマーはHBVの保存領域の約10〜約35、より好ましくは約15〜約30ヌクレオチドを含む。好適リバースプライマーは配列番号4及び配列番号5の少なくとも10、好ましくは16以上のヌクレオチドを含む。
【0071】
本発明の別の態様は、
−本明細書に記載するような制限酵素と、
−本明細書に記載するように選択した制限酵素の開裂部位に対応し、プロモーター配列を備えるフォワードプライマーと、
−転写による増幅反応を実施するための他の試薬と、
−増幅したHBV DNAを検出するための手段と、
−使用説明書とを含む、本発明によりHBV DNAの転写による増幅及び検出を実施するのに適したテストキットである。
【0072】
以下、実施例により本発明を更に説明する。
【0073】
(実施例1)
HBV DNAの増幅
HBV DNAのS−genの保存領域(EcoRI部位を基準にnt244〜285)では2つの保存制限部位(XbaIとBssSI)がコードされている。S領域のこの部分は負極性の一本鎖DNAであり得るので、制限部位配列を含む領域に相補的なオリゴヌクレオチド(「制限プライマー」(RP))を加え、存在する全ゲノムDNAに二本鎖制限部位を生成した。NucliSens Extractor(Organon Teknika)を使用して3×108geq/mlのHBV遺伝子型Aを感染させた血漿の連続希釈液からHBV DNAを単離した。RNA単離について記載されているような標準手順(Operator Manual Extractor,41001−9,rev A,1999)に従い、抽出液50μlを得た。アッセイ当たり5μlの抽出液を使用する。NASBA緩衝液(40mM Tris−HCl,pH8.5,12mM MgCl2,70mM KCl,15%v/vDMSO,5mM DTT,1mM各dNTP,2mM ATP,2mM CTP,2mM UTP,1.5mM GTP,0.5mM ITP,0.2μMフォワードプライマー(XbaIにはS−p3.8、BssSIにはS−p3.10、表1),0.2μMリバースプライマー(S−p4.5、表1),0.1μM分子ビーコンプローブ(S−WT2、表1),0.17μM制限プライマー(RP−3、表1))に制限酵素BssSI(New England Biolabs,Inc.,Beverly,MA,米国)0.2単位又は制限酵素XbaI(New England Biolabs,Inc.,Beverly,MA,米国)3.0単位を加えて制限酵素消化を実施した。15分間41℃でインキュベーション後に制限酵素を熱失活させ、DNA鋳型を95℃で5分間変性させた。3分間で41℃まで冷却する間にプライマーのハイブリダイゼーションが生じた。次に、NASBA酵素(BSA2.1μg、RNアーゼH0.08単位、T7 RNAポリメラーゼ32単位及びAMV逆転写酵素6.4単位)を加え、軽くタッピングして短時間遠心分離することにより反応混合物を混合し、増幅とリアルタイム検出を開始した。反応混合物をNucliSens EasyQ Analyzer(Organon Teknika)で1分毎に蛍光モニターしながら120分間41℃でインキュベートした。反応は485nmで励起し、発光シグナルを518nmで測定した。
【0074】
(実施例1.1)
XbaI消化を含むHBV DNAの増幅
制限酵素XbaIで処理する場合としない場合とでNASBAアッセイを実施した。HBV DNAのアンプリコン領域を含むPCRフラグメント109コピーの消化によりNASBA条件下でXbaIの最適濃度を測定した処、3単位であることが分かった。S−p3.8をフォワードプライマーとして使用すると、AMV RTにより鋳型として使用され、XbaI消化後に鋳型DNAを伸長することができる。消化しない場合に得られる感度は3×106geq/mlであるが、消化後の感度は3×103geq/mlであり、感度は1000倍に増加する(図2)。更に、消化しない場合には陽性までの時間(TTP)は約16分間であるが、XbaI消化後には約6分間となり、TTPは約10分間短くなる(図2)。どちらも増幅反応の改善を表す。
【0075】
(実施例1.2)
BssSI消化を含むHBV DNAの増幅
上記と同一HBV DNA抽出液と同等の反応条件を使用して制限酵素BssSIで処理する場合としない場合とでNASBA反応を実施した。HBV DNAのアンプリコン領域を含むPCRフラグメント109コピーの消化によりNASBA条件下でBssSIの最適濃度を測定した処、0.2単位であることが分かった。S−p3.10をフォワードプライマーとして使用すると、AMV RTにより鋳型として使用され、BssSI消化後に鋳型DNAを伸長することができる。この場合も制限酵素BssSI処理の結果として顕著な試験改善が得られた(図3)。消化しない場合に得られる感度は3×107geq/mlに過ぎないが、消化後の感度は3×104geq/mlであり、この場合も感度は1000倍に増加する(図3)。更に、消化しない場合には陽性までの時間(TTP)は約21分間であるが、BssSI消化後には約11分間となり、TTPは約10分間短くなる(図3)。以上の結果から明らかなように、NASBA反応前にHBV DNAを制限酵素で消化するとHBV DNAの増幅と検出を著しく改善できる。
【0076】
(実施例1.3)
XbaI消化を含むHBV DNAの増幅−2
アッセイ結果の改善が消化自体によるのかあるいは選択したプライマーと制限酵素の組合せによるのかを試験するために、プライマーS−p3.8の代わりにS−p3.10を使用してXbaI消化を含むアッセイを繰返した。AMV RTはXbaI消化後にターゲット配列を伸長するためにS−p3.10を鋳型として使用することができない。図4から明らかなように、S−p3.10と組合せてXbaI消化後に感度は僅かしか増加せず(10倍)、TTP短縮も少ない(21分から16分への約5分間)。これは、XbaIとプライマーS−p3.8及びBssSIとプライマーS−p3.10で得られる結果の改善がNASBAの開始中の鋳型の伸長によるものであることを示している。
【0077】
(実施例1.4)
BssSI消化を含むHBV DNAの増幅−2
アッセイ結果の改善が確かにターゲットの伸長によるものであるかを試験するために、プライマーS−p3.10の代わりにS−p3.8を使用してBssSI消化を含むアッセイを繰返した。AMV RTはBssSI消化後にターゲット配列を伸長するためにS−p3.8を鋳型として使用することができる。しかし、プライマーとターゲット配列のハイブリダイゼーションには加わるヌクレオチドは通常は約20であるが、BssSI消化後には17ヌクレオチドしかない。この差にも拘わらず、BssSI消化後にやはり明白な試験改善が得られた(図5)。プライマーS−p3.8とS−p4.5、制限プライマーRT−3及び分子ビーコンS−WT2を使用するNASBAではXbaIとBssSIの両者で二重消化を実施することができ、単独消化NASBAアッセイに比較して増幅効率は低下しない。
【0078】
(実施例1.5)
AvrII消化を含むHBV DNAの増幅
制限部位(AvrII)はHBV DNAのS−genの別の保存領域(EcoRI部位を基準にnt177〜192)でコードされる。フォワードプライマーS−p3.5、リバースプライマーS−p4.4、分子ビーコンS−WT4及び制限プライマーRP−1(表1)をNASBAで使用した。AMV RTはS−p3.5を鋳型として使用してAvrII消化後にHBV DNAのターゲット鎖を伸長することができる。上記と同一の反応条件を使用した。1反応当たり2単位のAvrIIを使用して上記と同一HBV DNA抽出液で制限酵素AvrIIで処理する場合と処理しない場合とでNASBA反応を実施した。消化しない場合に得られる感度は>108geq/mlであるが、消化後の感度は1×105geq/mlであり、消化の結果として感度は>103倍増加した(図6)。この場合もこれらの結果はNASBA反応に加える制限酵素でHBV DNAを消化するとHBV DNAの増幅を著しく改善できることを立証している。
【0079】
【表1】
【図面の簡単な説明】
【0080】
【図1】制限酵素消化を含むDNA NASBAの概念図。制限酵素(矢印)はNASBAの開始期のみ活性である。消化後、フォワードプライマーを鋳型にハイブリダイズさせる。AMV RTはT7プロモーター配列(濃灰色)を鋳型として含むフォワードプライマーを使用してDNAのターゲット鎖の3’末端(黒)を伸長する。T7 DdRpは二本鎖T7プロモーター配列を認識し、RNAアンプリコン(薄灰色)産生が開始する。RNAアンプリコン配列はターゲットDNA鎖に相補的である。循環期にRNAアンプリコンが増幅され、分子ビーコン技術により検出される。循環期にはRNアーゼHとリバースプライマーしか必要としない。
【図2】フォワードプライマーS−p3.8と組合せてXbaIで消化した場合としない場合のHBV DNAのNASBA。XbaIで消化後にS−p3.8はターゲットDNAの伸長用鋳型として使用することができる。プライマーS−p4.5をリバースプライマーとして使用し、分子ビーコンS−WT2をプローブとして使用する。鋳型なしの試料(NT)を陰性対照として使用する。
【図3】フォワードプライマーS−p3.10と組合せてBssSIで消化した場合としない場合のHBV DNAのNASBA。BssSIで消化後にS−p3.10はターゲットDNAの伸長用鋳型として使用することができる。プライマーS−p4.5をリバースプライマーとして使用し、分子ビーコンS−WT2をプローブとして使用する。鋳型なしの試料(NT)を陰性対照として使用する。
【図4】フォワードプライマーS−p3.10と組合せてXbaIで消化した場合としない場合のHBV DNAのNASBA。XbaIで消化後にS−p3.10はターゲットDNAの伸長用鋳型として使用することができない。プライマーS−p4.5をリバースプライマーとして使用し、分子ビーコンS−WT2をプローブとして使用する。鋳型なしの試料(NT)を陰性対照として使用する。
【図5】フォワードプライマーS−p3.8と組合せてBssSIで消化した場合としない場合のHBV DNAのNASBA。BssSIで消化後にS−p3.8はターゲットDNAの伸長用鋳型として使用することができる。プライマーS−p4.5をリバースプライマーとして使用し、分子ビーコンS−WT2をプローブとして使用する。鋳型なしの試料(NT)を陰性対照として使用する。
【図6】フォワードプライマーS−p3.5と組合せてAvrIIで消化した場合としない場合のHBV DNAのNASBA。AvrIIで消化後にS−p3.5はターゲットDNAの伸長用鋳型として使用することができる。プライマーS−p4.4をリバースプライマーとして使用し、分子ビーコンS−WT4をプローブとして使用する。鋳型なしの試料(NT)を陰性対照として使用する。
Claims (21)
- 試料中に場合により存在するHBV DNAから出発するターゲットHBV核酸配列の転写による増幅方法であって、
−HBVを含む疑いのある試料を、
選択した制限部位でHBV DNAを解裂することができ、前記HBV DNA鎖の規定3’末端を生成する1またはそれ以上の制限酵素、
DNA依存性RNAポリメラーゼにより認識されるプロモーターの配列を含む5’領域およびDNA鎖の3’末端に相補的な3’領域を有するプロモータープライマー、
プロモータープライマーと逆極性であり、前記ターゲット配列の5’末端を含む第2またはリバースプライマー、および
ターゲット配列がHBV一本鎖DNAの場合には制限プライマーと共に、
増幅緩衝液中にてインキュベートする段階、
−こうして生成した反応混合物を、制限酵素により消化させるために十分な時間適切な条件下に維持する段階、
−こうして得られた試料を、制限酵素を失活させるため及び/又は少なくとも部分的に二本鎖を一本鎖にするために十分な温度と時間熱処理する段階、
−RNA依存性DNAポリメラーゼ活性をもつ酵素と、DNA依存性DNAポリメラーゼ活性をもつ酵素と、RNアーゼH活性をもつ酵素と、RNAポリメラーゼ活性をもつ酵素を試料に加える段階、および
−こうして生成した反応混合物を、増幅させるために十分な時間適切な条件下に維持する段階
を含む前記方法。 - DNAが二本鎖HBV DNAである請求項1に記載の方法。
- DNAが一本鎖であり、ターゲット一本鎖DNAの制限部位を含む領域に相補的な配列とDNA依存性RNAポリメラーゼにより認識されるプロモーターの配列とを含むプロモーター兼制限プライマーを使用することにより、プロモータープライマーの機能と制限プライマーの機能を兼備する請求項1に記載の方法。
- 熱処理前の初期インキュベーション混合物に適切なヌクレオシド三リン酸を加える請求項1に記載の方法。
- RNA依存性DNAポリメラーゼ活性をもつ酵素とDNA依存性DNA活性をもつ酵素の活性を兼備する逆転写酵素とを使用する請求項1に記載の方法。
- RNA依存性DNAポリメラーゼ活性をもつ酵素と、DNA依存性DNA活性をもつ酵素と、RNアーゼH活性をもつ酵素の3種の酵素に代用する固有RNアーゼH活性をもつ逆転写酵素とを使用する請求項1に記載の方法。
- インキュベーション温度が35℃〜約45℃、好ましくは約37〜41℃である請求項1に記載の方法。
- 加熱段階を92℃〜98℃、好ましくは約95℃の温度で実施する請求項1に記載の方法。
- HBVの各種遺伝子型間で保存された部位でHBV DNAを切断する制限酵素を使用する請求項1に記載の方法。
- 表面抗原をコードするHBVゲノムの部分に制限部位が位置する請求項1に記載の方法。
- 制限部位が、EcoRI部位を基準にヌクレオチド247〜252に位置するXbaI部位、EcoRI部位を基準にヌクレオチド253〜258に位置するBssSI部位又はEcoRI部位を基準にヌクレオチド178〜183に位置するAvrII部位であり、使用する制限酵素が夫々XbaI、BssSI又はAvrII制限酵素である請求項10に記載の方法。
- 制限プライマーが、HBVターゲットにハイブリダイズするヌクレオチド数10から約35、より好ましくは約15から約30のオリゴヌクレオチドであり、EcoRI部位を基準にヌクレオチド247〜252に位置するXbaI部位、EcoRI部位を基準にヌクレオチド253〜258に位置するBssSI部位又はEcoRI部位を基準にヌクレオチド178〜183に位置するAvrII部位の「両側」の少なくとも10、好ましくは16以上のヌクレオチドを含む請求項1に記載の方法。
- 制限プライマーが配列番号8及び配列番号9に示すオリゴヌクレオチド配列をもつ請求項12に記載の方法。
- プロモーター又はフォワードプライマーが、HBVターゲットにハイブリダイズし、制限酵素XbaIと組合せた配列番号10又はBssSIと組合せた配列番号11又はAvrIIと組合せた配列番号12の(開裂部位から数えて)少なくとも10、好ましくは16以上のヌクレオチドを含むヌクレオチド数10から約35、より好ましくは約15から約30のオリゴヌクレオチドである請求項1に記載の方法。
- プロモーターオリゴヌクレオチドが、夫々配列番号1、配列番号2又は配列番号3に示すヌクレオチド配列をもつ請求項14に記載の方法。
- 増幅HBVターゲットとハイブリダイズし、配列番号13及び配列番号14の少なくとも10、好ましくは16以上のヌクレオチドを含むヌクレオチド数10から約35、より好ましくは約15から約30のオリゴヌクレオチド配列を含むハイブリダイゼーションプローブを使用して増幅HBV核酸を更に検出する請求項1に記載の方法。
- プローブが配列番号6及び配列番号7のオリゴヌクレオチド配列をもつ請求項16に記載の方法。
- 第2又はリバースプライマーが、配列番号4及び配列番号5の少なくとも10、より好ましくは16以上のヌクレオチドを含むヌクレオチド数10から約35、より好ましくは約15から約30のオリゴヌクレオチドである請求項1に記載の方法。
- 配列番号1から配列番号14から選択されるヌクレオチド配列をもつオリゴヌクレオチド。
- 請求項14に記載のプロモータープライマーと請求項18に記載のリバースプライマーを含む、請求項1に記載のHBV核酸の増幅で使用するのに適したオリゴヌクレオチドプライマーセット。
- 本明細書に記載するような制限酵素と、本明細書に記載するように選択した制限酵素の開裂部位に対応し、プロモーター配列を備えるフォワードプライマーと、転写による増幅反応を実施するための他の試薬と、増幅したHBV DNAを検出するための手段と、使用説明書を含む、請求項1に記載のHBV DNAの転写による増幅及び検出を実施するのに適したテストキット。
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