JP2004524038A - End-group activated polymers with oligonucleotide ligands - Google Patents
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Abstract
Description
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞応答の制御、および細胞の培養と解析のために材料の表面を修飾する方法に関する。より具体的には、本発明は、細胞培養、医療用デバイスおよび細胞の解析において使用するための基材上に規定の比率で複数の生体分子を固定化する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生物における正常な発生と機能には、細胞とその周囲の環境との間の相互作用が必要である。細胞が相互作用する１つの方法は、膜貫通タンパク質と呼ばれる細胞膜に存在する分子を介することである。膜貫通タンパク質の細胞の外側にある部分が周囲の環境の特定の分子に遭遇すると、その膜貫通タンパク質は細胞内部の生物学的相互作用を誘発する構成上および立体構造上の変化を起こす。
【０００３】
生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）の細胞は、最終的に組織および器官を形成する複雑な多層構造を形成する。しかしながら、組織および器官の形成には細胞とその周囲の環境との間の特異的な接触が必要である。正確に発生するために周囲の環境との接触を必要とする細胞は、他の細胞、細胞外マトリクス（ＥＣＭ）、またはその他の面に固定されなければ仮に生育しても正しくは生育しないため、「足場依存性」と称される。
【０００４】
ＥＣＭは、コラーゲン、グリコサミノグリカン、プロテオグリカン、および糖タンパク質のような、細胞により分泌される複雑かつ様々な分子群である。これらの細胞の生成物は共に、組織と器官とにその形状と強度とを付与する基底層、骨および軟骨を形成する。実際、多くの事例における足場依存性の細胞とＥＣＭとの接触は、細胞の形状、位置、代謝、分化および増殖を決定付ける非常に大きな役割を果たしている。
【０００５】
細胞の接触は、免疫応答の活性化などのその他の生物学的機能においても重要である。免疫系は、ウイルス、細菌および寄生生物のような外来物質を認識して体から除去する機能を有する複雑な細胞ネットワークである。外来物質を除去するために免疫系が用いる１つの機構は、液性応答である。液性応答は、Ｂ細胞リンパ球と呼ばれる特定の細胞の活性化を伴う。Ｂ細胞は、その表面にある膜貫通タンパク質が抗原と呼ばれる外来物質に結合すると活性化される。具体的には、Ｂ細胞の抗原への結合によりＢ細胞が刺激されて増殖し、免疫グロブリンまたは抗体を産生するプラズマ細胞に分化する。
【０００６】
プラズマ細胞により産生された抗体は病原体や外来物質に結合しつつ体中を移動する。抗体の外来物質への結合により「補体」経路を含む他のいくつかの免疫学的経路が活性化される。補体経路は、外来物質を破壊し生物に炎症反応を起こさせるように定められている。
【０００７】
細胞が他の細胞および環境と接触することは生物の総体的な健康および生物学的機能にとって重要であるが、一方でこのことは生物科学における独特の問題を生んでいる。組織または細胞の培養物は、植物または動物由来の、元の生物の外側で生育された細胞から成る。これらの細胞は、例えばペトリディッシュ内で特定の環境条件下で培養されることが多い。細胞培養物は、成長因子、抗体、ウイルスなどの生物学的生成物を大量に生産可能な生物学的「工場」に相当するので、非常に重要である。次いでこれらの産物は細胞培養物から単離され、治療目的で、さらなる探索のため、またはその他の用途に使用可能である。
【０００８】
細胞培養物は、生物への移植に使用可能な組織の供給源にもなりうる。例えば、細胞培養された皮膚の細胞を病変または損傷した皮膚と交換する皮膚移植において使用可能かもしれない。細胞培養物は通常わずか１種もしくは数種の組織または器官に由来する細胞から成る。その結果、細胞培養物は、科学者達が生物体全体について取り組むという複雑な問題とリスクとを伴わずに個々の細胞タイプの性質を研究するためのシステムを提供している。例えば、ある種の細胞に対する医薬の効果を、その薬物による健康上のリスクを評価するための臨床試験に先立って細胞培養物について試験することができる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）におけるほとんどの細胞と同じように、培養により生育した細胞はＥＣＭまたは別の細胞のいずれかに固着される。循環系の細胞（例えばリンパ球および赤血球）だけが試験管内（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で付着せずに溶液中に浮遊した状態で生育する。多くの足場依存性細胞は、ガラス表面またはポリスチレンのようなプラスチック表面上で生育可能である。しかしながら、これらの細胞は本来の構造を失っていることが多く正常に機能しない。培養された細胞はしばしば分化能やホルモンへの応答能を失う。従って、培養された細胞は生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）における細胞の生物学的機能を正確には模倣せず、よって潜在能力にも限界がある。
【００１０】
このような理由から、ガラスまたはプラスチック製の細胞培養用ディッシュは、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニンなどのＥＣＭタンパク質でコーティングされることが多い。これらのタンパク質は吸着として知られるプロセスにより、ポリスチレンなどの表面に結合する。ＥＣＭでコーティングされた細胞培養用の表面は培養条件を向上させているが、理想からはほど遠い。
【００１１】
第１に、タンパク質のような生体分子は疎水性の表面に吸着すると不活性化することが多い。タンパク質の生物学的活性は、その独特の構造と、物質への結合またはその他の生理学的な事象の際に立体構造上の変化を起こす能力とにより与えられる。ある研究では、タンパク質の構造がマイクロカロリメトリーと呼ばれる技術を用いて測定された。マイクロカロリメトリーによる研究から、疎水性表面に結合したタンパク質は溶液中の同じタンパク質に比べて、協調的に折りたたまれた構造を事実上全て失っているということが示された。タンパク質の構造とタンパク質が立体構造上の変化を起こす能力とは生物学的活性と強く相関しているので、上記のデータは疎水性表面に吸着されたタンパク質のほとんどが生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）における生物学的活性を失うということを示唆している。
【００１２】
第２に、固定化されたタンパク質の立体構造と配向とは、タンパク質が細胞と相互作用するという性質に重大な影響を与える。ディ ジェイ ジュリアーノ（Ｄ．Ｊ．Ｊｕｌｉａｎｏ）、エス エス サードラ（Ｓ．Ｓ．Ｓａａｅｄｒａ）およびジー エー トラスキー（Ｇ．Ａ．Ｔｒｕｓｋｅｙ）、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、第２７巻、１１０３−１１１３ページ、１９９３年。両方とも、その下にある基材の化学的性質および物理的性質ならびに固定化の方法により影響を受ける。ケイ レワンドウスカ（Ｋ．Ｌｅｗａｎｄｏｗｓｋａ）、イー ペルガメント（Ｅ．Ｐｅｒｇａｍｅｎｔ）、エヌ スケニク（Ｎ．Ｓｕｋｅｎｉｋ）およびエル エー カルプ（Ｌ．Ａ．Ｃｕｌｐ）、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、第２１巻、１３４３−１３６３ページ、１９９２年。
【００１３】
第３に、生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）における細胞と同じように、培養物中の細胞は血清タンパク質や成長因子のような分子を培地中に放出する。上述のように、培地中におけるこれらの分子の分泌と集積とは、隣り合う細胞が正しく生物学的に機能するために必要である。現在の細胞培養の条件下では、分泌された分子が細胞培養容器の表面に吸着されるので、分泌された分子の綿密なバランスと濃度とが乱される。従って、現在の細胞培養技術のもとで培養された細胞のコミュニケーション機能および生物学的機能は生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）の環境を模倣するものではない。
【００１４】
最後に、表面におけるＥＣＭ構成成分の濃度は細胞の挙動を制御する要因である。表面における生体分子の濃度を調節し変化させる能力は、固定化の方法および一部の場合においては土台となる材料の物理的性質によって変わる。細胞培養用の基材に単にＥＣＭを吸着させるだけではこれらの要件を満たさない。
【００１５】
さらに、タンパク質、ホルモンなどの複雑な種々の生体分子が細胞の正常な増殖と発生とに必要である。生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）においてこれらの分子は特定の濃度と比率とで存在している。生体分子の比率が変化すると、細胞の増殖、代謝、および機能が変化する可能性がある。１つの基材上に２つ以上の生体分子を規定の比率で共に固定化できることは、生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）の環境をより適切に模倣するために有用であろう。生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）における細胞の増殖、高速大量（ハイスループット）スクリーニング、生体分子の探索と開発、診断学、医療用デバイスまたはバイオリアクタのために材料の表面に生体分子を固定化するべく現在使用されている方法には、直接的な吸着および共有結合がある。これらの方法では、１つの基材上に２つ以上の生体分子を容易に変更可能な規定の比率で共に固定化することは不可能である。
【００１６】
以上のことに照らせば、細胞の生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）の環境をより適切に模倣する、生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で細胞を培養するシステムを提供することは、当業界における重大な進歩であろう。生体分子の生物学的活性を破壊せず、生体分子で組織培養容器の表面をコーティングする方法を提供することは、当業界におけるさらなる進歩であろう。周囲の環境に由来するタンパク質が非特異的に吸着するのを防止する、組織培養容器の表面をコーティングする方法を提供することも、当業界における進歩であろう。２つ以上の生体分子を表面へ規定の比率で固定する方法を提供することは、当業界におけるまた別の進歩であろう。生体分子でコーティングされた表面が原核細胞および真核細胞、ウイルス、ならびに生物学的アッセイのための分子を接着させるために使用することができれば、そのことは当業界におけるさらなる進歩であろう。生体分子でコーティングされた材料により細胞の挙動を方向付けられれば、そのことは当業界におけるなお一層の進歩であろう。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明の方法及び装置は、当業界の現在の状況に応じて、特に、細胞および生体分子を表面に付着させるために現在使用可能な方法およびシステムでは未だ十分に解決されていない、当業界における問題点とニーズとに応じて開発された。現在の方法およびシステムの欠点を克服するために、本発明は生体分子を規定の比率で表面に結合可能な方法とシステムとを示す。これは、細胞の培養と解析、医療用デバイスに対する細胞応答の制御、および組織工学的な用途における細胞の挙動の制御において有用である。
【００１８】
本発明は、複数（Ｎ種）のタイプの生体分子を基材上に規定の比率で共に固定化する方法に関する。基材は例えばポリマー粒子、磁性粒子、ペトリディッシュ、マルチウェルプレート、ティーフラスコ、ローラーボトル、アレイチップ、試料採取用コンテナ、アッセイ用チューブ、繊維、膜、支持材、医療用デバイスなどでありうる。基材を、タンパク質を修飾し結合するためのペンダント基を提供する１つ以上の親水性部分と結合された少なくとも１つの疎水性部分を有する共重合体に接触させることができる。ＰＥＯ−およびＰＰＯ−含有トリブロックまたはジブロック共重合体が現在好ましいが、他の多くの共重合体を本発明に従って使用してもよい。種々の異なるＰＥＯ−およびＰＰＯ−含有共重合体を本発明の方法により使用してもよい。例えば、ポリブタジエンとＰＥＯ、ポリイミドとＰＥＯ、ポリメチルメタクリレートとＰＥＯ、ポリスチレンとＰＥＯ、ポリブチレンオキサイドとＰＥＯ、ポリ−Ｌ−リシン（ｌｙｓｉｎｅ）とＰＥＯ、ポリジメチルシロキサンとＰＥＯ、ポリ（ｔ−ブチルメタクリレート）とＰＥＯ、およびＰＥＯを含んだ炭化水素、の共重合体を使用してもよい。使用可能な目下のところ好ましい共重合体の１つは、ＢＡＳＦ社より入手可能なＰｌｕｒｏｎｉｃ（商標登録）Ｆ１０８である。Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（商標登録）ブランドの共重合体と同様に、上記の他の多くの共重合体が疎水性の材料によく吸着することが示されており、また表面に非特異的なタンパク質の吸着を抑制し得る適切なＰＥＯの層を形成することが示されている。ＰＥＯとは別に、使用可能な他の親水性部分はセファロースタイプの素材および他の多糖ならびにポリウレタンである。共重合体を、基材に吸着させるために十分長い時間表面に接触させることができる。例えば、引用により本願に組み込まれる米国特許第６，２８４，５０３号、第５，７２８，５８８号および第５，５１６，７０３号の開示を参照のこと。
【００１９】
共重合体は活性化された末端基を有する。活性化された末端基は、オリゴヌクレオチドを重合体に結合させ得る多数の基から選択可能である。例えば、活性化された末端基は２−ピリジルジスルフィド基を有しても良い。活性化された末端基にＮ種のオリゴヌクレオチドを結合し、共重合体結合オリゴヌクレオチドを形成することが可能である。各タイプの共重合体結合オリゴヌクレオチドがＮ種の生体分子の１つに相当する。すなわち、Ｎ種の共重合体結合オリゴヌクレオチドを、規定の比率を達成するために所定の比率で混合する。
【００２０】
生体分子を、生体分子結合オリゴヌクレオチドを形成するために相補的オリゴヌクレオチドに結合することが可能である。各タイプの生体分子を、対応する共重合体結合オリゴヌクレオチドに相補的なオリゴヌクレオチドに結合させることが可能である。
【００２１】
生体分子結合オリゴヌクレオチドは共重合体結合オリゴヌクレオチドとハイブリッド形成することができる。そのようなハイブリッド形成により、複数の生体分子が規定の比率で共に固定化された基材が創られる。共重合体の末端基にオリゴヌクレオチドを結合させるステップ、基材をオリゴヌクレオチド修飾された共重合体に接触させるステップ、および相補的なオリゴヌクレオチドに生体分子を結合させるステップは、任意の順序で実施可能である。
【００２２】
種々の生体分子を、開示の方法により基材に共に固定化することができる。そのような生体分子には、タンパク質、糖タンパク質、ペプチド、成長因子、サイトカイン、付着因子、細胞外マトリクス因子、抗体、抗体フラグメント、分化因子、レクチン、多糖、受容体、受容体フラグメント、膜貫通タンパク質、膜貫通タンパク質のフラグメントなどがありうるがこれらに限定されない。
【００２３】
本発明の方法は、該方法のステップを任意の順序で実施することを可能にする別の実施形態を有しうる。そのような１つの実施形態では、該方法は、Ｎ種の第１のオリゴヌクレオチドを共重合体に結合させるステップ；Ｎ種のオリゴヌクレオチド修飾された共重合体を溶液中で規定の比率で混合するステップ；基材を前記オリゴヌクレオチド修飾された共重合体の溶液に接触させるステップ；Ｎ種の生体分子を第２のオリゴヌクレオチドに結合させるステップ；および第２のオリゴヌクレオチドを第１のオリゴヌクレオチドとハイブリッド形成させるステップを含む。本発明の方法の他の実施形態のように、共重合体は活性化された末端基を有する。活性化された末端基は２−ピリジルジスルフィド基または他の基を含みうるが、それにより共重合体を第１のオリゴヌクレオチドに結合させることが可能となる。基材を、共重合体が基材表面に吸着されるのに十分な時間だけ共重合体に接触させる。
【００２４】
本発明は、付着、増殖、細胞の挙動の制御、または細胞の解析のための表面の作製にも関する。第１のオリゴヌクレオチドはＰＥＯを含有するトリブロック共重合体またはジブロック共重合体に結合可能である。共重合体は、例えばＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１０８でよい。オリゴヌクレオチド修飾された共重合体を上記の表面に吸着可能である。第２のオリゴヌクレオチドを生体分子に結合することができる。生体分子は、細胞接着を促進し、細胞増殖を促進し、細胞の分化状態を制御し、または細胞の解析において有用な種々の生体分子から選択可能である。第２のオリゴヌクレオチドは、第２のオリゴヌクレオチドを第１のオリゴヌクレオチドとハイブリッド形成させうるように、通常第１のオリゴヌクレオチドに相補的である。表面を、複数（Ｎ種）のタイプの生体分子を規定の比率で含むように作製することも可能である。これは、ＰＥＯ−およびＰＰＯ−含有トリブロック共重合体またはジブロック共重合体に結合した相補的オリゴヌクレオチドとハイブリッド形成するオリゴヌクレオチドに生体分子を結合させることにより実施可能である。生体分子は、例えばタンパク質、糖タンパク質、ペプチド、成長因子、サイトカイン、付着因子、細胞外マトリクス因子、抗体、抗体フラグメント、分化因子、レクチン、多糖、受容体、受容体フラグメント、膜貫通タンパク質、膜貫通タンパク質のフラグメントなどがありうる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
本発明を、添付の図面を用いてさらに具体的かつ詳細に記述し説明する。
【００２６】
本発明は、基材に複数（Ｎ種）のタイプの生体分子を規定の比率で共に固定化する方法に関する。基材は例えばポリマー粒子、磁性粒子、ペトリディッシュ、マルチウェルプレート、ティーフラスコ、ローラーボトル、アレイチップ、試料採取用チューブ、アッセイ用チューブ、繊維、膜、支持材、医療用デバイス、医療用インプラントなどでありうる。基材を、タンパク質を修飾し結合するためのペンダント基を提供する１つ以上の親水性部分と組み合わされた少なくとも１つの疎水性部分を有する共重合体に接触させることができる。共重合体は、生体分子を基材の表面に連結させる繋ぎの部分として用いられる。ＰＥＯ−およびＰＰＯ−含有トリブロックまたはジブロック共重合体が現在のところ好ましい。本発明の方法と共に使用可能な共重合体の１つはＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１０８であり、これは（ポリエチレンオキサイド）１２９−（ポリプロピレンオキサイド）５６−（ポリエチレンオキサイド）１２９という構造を有するトリブロック共重合体である。基材を、共重合体が基材に吸着されるのに十分な時間だけ表面に接触させる。
【００２７】
共重合体の末端の水酸基が活性化されて共重合体のオリゴヌクレオチドへの結合が可能となる。本明細書で用いられているように、オリゴヌクレオチドには、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）の重合体、および修飾塩基または標準的でない塩基を含む核酸の重合体がある。Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１０８のような共重合体の末端基を、リら（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．）、Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．第７巻、５９２−５９９ページ、１９９６年の手法を用いて活性化してピリジルジスルフィド部分を組み込むことが可能である。この手法では、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１０８を最初にｐ−ニトロフェノールクロロホルメートで活性化する。次いでｐ−ニトロフェノールで活性化されたＦ１０８を２−（２−ピリジルジチオ）エチルアンモニウムクロライドと反応させてＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１０８の２−ピリジルジスルフィド誘導体を生成させる。次にこの活性化されたＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）を、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）のピリジルジスルフィド基を介して、末端にチオール基を有するオリゴヌクレオチド配列に結合させる。
【００２８】
対象のタンパク質または他の生体分子を相補的なオリゴヌクレオチド配列に結合させる。オリゴヌクレオチド修飾された共重合体は中央のポリプロピレンオキサイドのブロックを介して疎水性表面に結合することになる。修飾共重合体が表面に結合されれば、相補的オリゴヌクレオチド配列に結合させた生体分子を添加することができる。生体分子は、共重合体に結合されたオリゴヌクレオチド配列と対象のタンパク質または他の分子上の相補的オリゴヌクレオチド配列との間の塩基対形成の結果、高い親和力で表面に結合される。
【００２９】
この手法を用いて、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１０８のような共重合体を、自身に相補的な配列にのみ高度で特異的な結合親和力を有する多数の異なるオリゴヌクレオチド配列で修飾することが可能である。同様に、タンパク質および他の分子を多数の異なる相補的ＤＮＡ配列で修飾することが可能である。複数のタイプのＯＬＩＧＯ修飾（オリゴヌクレオチド修飾）共重合体を溶液中で規定の比率で混合し、この溶液を表面のコーティングに使用することにより、複数の異なる化学物質が結合し、各タイプの化学物質の相対量を容易に調節可能かつ体系的に変更可能な表面を生産することができる。
【００３０】
続いて相補的オリゴヌクレオチド配列を有する生体分子を添加することができるが、これらの生体分子は固定化された相補的な配列に選択的に結合することになる。このようにして、表面に共に固定化される各タイプのタンパク質の相対量を厳密に調整することができる。事実上、使用可能なオリゴヌクレオチド対の数は無限である。従って、１つの表面に選ばれた比率で共に固定化可能な異なる因子の数には限界はない。
【００３１】
多様な生体分子を、開示の方法を用いて基材上に共に固定化することができる。そのような生体分子には、タンパク質、糖タンパク質、ペプチド、成長因子、サイトカイン、付着因子、細胞外マトリクス因子、抗体、抗体フラグメント、分化因子、レクチン、多糖、受容体、受容体フラグメント、膜貫通タンパク質、膜貫通タンパク質のフラグメント、ＤＮＡ、ＲＮＡなどがありうるがこれらに限定されない。
【００３２】
図３Ａおよび３Ｂは本発明の範囲内にある実行可能な１つの実施形態を示すが、該実施形態は、Ｎ種のタイプの第１のオリゴヌクレオチドを共重合体に結合させるステップと；Ｎ種のタイプのオリゴヌクレオチドで修飾された共重合体を溶液中で規定の比率で混合するステップと；該オリゴヌクレオチド修飾共重合体の溶液に基材を接触させるステップと；Ｎ種のタイプの生体分子を第２のオリゴヌクレオチドに結合させるステップと；第２のオリゴヌクレオチドを第１のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせるステップとを含む。ステップの順序は変更可能である。
【００３３】
本発明は、細胞選別用に基材に生体分子を固定化するために使用可能である。例えば、ポリマー粒子、磁性粒子、ペトリディッシュ、マルチウェルプレート、ティーフラスコ、ローラーボトル、アレイチップ、試料採取用チューブおよびアッセイ用チューブなどの多数の異なるタイプの基材を修飾可能である。基材を、共重合体結合オリゴヌクレオチドを用いて、対象とする細胞のタイプに高度かつ特異的な親和力を有することが知られている１つ以上のタイプの生体分子が提示されるように修飾する。対象の細胞タイプを含む試料を修飾された基材とともにインキュベートし、標的の細胞を、特異的親和性を有する固定化生体分子に結合させる。基材を洗浄して不要な細胞とタンパク質を除去し、標的の細胞だけを残す。次いで細胞を種々の用途のために培養しても、基材上で解析してもよく、または単に還元剤を添加することにより基材からハーベストすることも可能である。還元剤は、固定化された共重合体分子とオリゴヌクレオチドとの間の結合を切断し、その結果生体分子および付着した細胞を解放する。この手法は、マルチウェルプレートの修飾、または異なるタイプの細胞のアレイを提示するチップの生産に有用である。例えば、９６ウェルプレートを、１つの組織試料または患者の試料から１つのタイプの細胞アレイを作製するために使用し、診断用試験に使用することが可能であろう。
【００３４】
本発明の方法を、共に固定化された生体分子を用いて表面を作製するために使用しうる。そのようなコーティング面は、細胞付着用または細胞が付着しないための異なるドメインを備えて作製することができる。従って、基材を、細胞の付着を促進するドメインと細胞の付着を阻害するドメインとを備えて作製可能である。例えば、基材のあるドメインには第１の共重合体結合オリゴヌクレオチドが吸着され、基材の別のドメインには第２の共重合体結合オリゴヌクレオチドが吸着されてもよい。第１の共重合体結合オリゴヌクレオチドに相補的なオリゴヌクレオチドは細胞の付着を促進する生体分子に結合し、第２の共重合体結合オリゴヌクレオチドに相補的なオリゴヌクレオチドは細胞の付着を妨げる生体分子に結合しうる。従って、相補的なオリゴヌクレオチドと細胞とが添加されると、細胞が付着していないドメインができる。
【００３５】
本発明を、２つ以上のタイプのドメインを有し各タイプのドメインが異なる生物学的活性を有する細胞培養用のパターン加工された基材の作製に使用することもできる。各タイプのドメインを、１種の共重合体結合オリゴヌクレオチドまたは複数種の共重合体結合オリゴヌクレオチドの混合物を所望の領域に吸着させ、続いて相補的オリゴヌクレオチドを有する生体分子を添加することにより作製する。そのような基材は、人工的な基材及び支持材（足場）上で組織の構造をより適切に模倣するために有用である。
【００３６】
本発明を、生体医用インプラントおよびデバイスをコーティングしてそれらが細胞や組織とより相互作用しやすくするために使用してもよい。コーティング物は、特定のタイプの細胞がインプラント上に付着して増殖するのを促進したり、またはインプラントに付着する細胞の挙動を制御するために使用可能である。コーティング物を、反応のカスケードを阻害する因子を組み込むことによりインプラントにとって不都合な反応を防止するために使用してもよく、例えば心血管用デバイス上での血栓形成を防止するために、コーティング物を抗血栓因子を組み込むために用いてもよい。コーティング物を、縫合糸または傷の回復を早める熱傷創保護物のような一時的に使用する補助材料の表面に治療用因子を提示するために使用してもよい。
【００３７】
本発明は、試験管内（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）における薬物の開発及び毒性試験のための基材も提供可能である。例えば、小分子薬物を、試験管内（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）における薬物の開発及び毒性試験を容易にするために対象の生体分子と共に固定化してもよい。
【００３８】
細胞をトランスフェクションし、その後細胞のトランスフェクション効率とタンパク質の発現レベルを評価するために細胞の組換えタンパク質発現産物を検出するためのコンテナを本発明の方法により作製可能である。例えば、基材を、細胞が基材に付着するのを促進すると思われる１タイプのタンパク質と、対象の細胞による発現産物を捕捉するであろう第２のタイプのタンパク質とを提示するように修飾すればよい。これは、本明細書に記載のとおりに作製された２つの異なるタイプの共重合体結合オリゴヌクレオチドを用いて実施される。これらのタイプの共重合体結合オリゴヌクレオチドをここではａおよびｂと称する。細胞の付着を促進するために用いられるタンパク質（ここではＡとする）および組換えにより発現されたタンパク質を捕捉するために用いられるタンパク質（ここではＢとする）を、それぞれ共重合体結合オリゴヌクレオチドａ，ｂのオリゴヌクレオチド配列に相補的なオリゴヌクレオチド配列を結合させることにより修飾する。Ａ：Ｂの所望の比率が１：３である場合、共重合体結合オリゴヌクレオチドａ １に対し共重合体結合オリゴヌクレオチドｂ ３を水中で混合し、生じた溶液をトランスフェクション用コンテナのコーティングに使用する。異なるタイプの共重合体結合オリゴヌクレオチドは同じように同程度に吸着し、その結果表面におけるａ：ｂは１：３となるであろう。コーティング後、コンテナを洗浄し、次いでタンパク質ＡおよびＢとともにインキュベートする。タンパク質は自身に相補的なオリゴヌクレオチド配列のハイブリッド形成により固定化された共重合体結合オリゴヌクレオチドに結合し、その結果生じる表面密度は共重合体結合オリゴヌクレオチドａ，ｂの表面における比率を反映することになる。細胞を修飾された基材上に播き、細胞がタンパク質Ａを介して付着する。細胞は基材上に播く前または後のいずれかの時点でトランスフェクション可能である。細胞をタンパク質発現に十分な時間おき、次いで溶解して組換え発現タンパク質を放出させる。このタンパク質は、タンパク質Ｂを介して表面と結合する。表面を洗浄して細胞片を除去し、その後発現タンパク質を分析する。
【００３９】
本発明は、細胞をトランスフェクションし、その後、発現タンパク質の活性、発現タンパク質の安定性、および発現タンパク質の翻訳後修飾を測定するべく該細胞による組換えタンパク質発現産物を検出するためのコンテナを生産するためにも有用である。そのようなコンテナは、過酷な環境においてより頑強であるかまたはその天然型に比べて高い生物活性を示すタンパク質を産生する突然変異体の発見を容易にするであろう。
【００４０】
基材を、その表面に吸着させた２つのタイプの共重合体結合オリゴヌクレオチド（タイプａ，タイプｂ）を用いて上述のように作製してもよい。細胞を修飾された基材に播き、タンパク質Ａを介して付着させる。細胞は基材上に播く前または後のいずれかの時点でトランスフェクション可能である。細胞をタンパク質発現に十分な時間おき、次いで溶解して組換え発現タンパク質を放出させる。このタンパク質をタンパク質Ｂを介して表面に結合させ、表面を洗浄して細胞片を除去する。ここで、Ｂは（１）タンパク質に結合してその後活性、安定性、もしくは翻訳後修飾の存在を二次的な方法により検出できるようにする、（２）発現タンパク質が何らかの必須な構造もしくは翻訳後修飾を有する場合にのみ該タンパク質に結合する、または（３）切断されると検出可能な産物を生じる、発現タンパク質の基質として作用する、のいずれかの役割を果たす。もう１つの例では、表面上の発現タンパク質の存在をその後イムノアッセイにより検出することも可能であろう。
【００４１】
本発明は、細胞外の生体分子、薬物、またはその組合せの、トランスフェクション細胞における組換えタンパク質の発現効率に対する影響を評価する方法、および細胞バイオリアクタのための最適な環境を作り出す方法も提供する。例えば、基材を本発明の方法により作製するが、その方法は１つの因子または複数の因子の組合せ（Ａとする）を表面に固定して、細胞の組換えタンパク質発現能に影響を及ぼすと考えられるシグナルを発生させる方法である。ここで（１つまたは複数の）因子とは、細胞外マトリクスの接着タンパク質、サイトカイン、成長因子、プロテオグリカン、構造タンパク質、細胞接着分子、抗体、抗原、阻害因子、薬物、またはそれらの任意の組合せでありうる。上記の因子に加えて、組換え発現タンパク質に結合すると考えられる生体分子（Ｂとする）を表面に共に固定化することもできる。細胞を修飾された基材に播き、タンパク質Ａを介して表面に付着させる。細胞は基材上に播く前または後のいずれかの時点でトランスフェクション可能である。細胞をタンパク質発現に十分な時間おき、次いで溶解して組換え発現タンパク質を放出させる。表面がタンパク質Ｂで修飾されているこの例では、発現タンパク質はＢを介して表面に結合し、表面は洗浄されて細胞片を除去される。ここで、Ｂは該タンパク質に結合して活性、安定性、もしくは翻訳後修飾の存在を検出できるようにする役割を果たす。代替例として、組換えタンパク質が細胞により分泌される場合は、組換え発現タンパク質を検出するために溶液を用いたアッセイを使用可能である。
【００４２】
本発明の方法により、細胞のトランスフェクションの結果細胞の生理現象に生じた変化をモニターすることを可能にする基材を作製可能である。従って、細胞の結合を容易にするタンパク質Ａと、組換えタンパク質以外の細胞の産物に結合するタンパク質Ｂとを用いて基材を作製すればよい。この基材は、トランスフェクションの結果細胞の生理現象に生じた変化をモニターすることにより、遺伝子治療の安全性および効果を評価するのに有用であろう。この例では、タンパク質Ａは細胞外マトリクスの接着タンパク質、サイトカイン、成長因子、プロテオグリカン、構造タンパク質、細胞接着分子、抗体、薬物またはそれらの任意の組合せでありうる。細胞を基材に播き、ある一定時間（この間に細胞がタンパク質Ａの作用を受ける）インキュベートする。次いで細胞を溶解すると対象のタンパク質はタンパク質Ｂにより基材に結合する。細胞片を洗浄により除去し、固定化された対象タンパク質の量および／または性質をアッセイする。
【００４３】
基材に複数の生体分子を共に固定化する方法は足場依存性でない細胞の産物を評価するために用いることができる。そのような細胞をトランスフェクションして組換えタンパク質を分泌させることが可能である。これらの細胞を、本発明を用いて、組換え発現タンパク質を解析するためのツールとして役に立つタンパク質を提示するように修飾されたコンテナ内に入れる。このタンパク質は、組換え発現された酵素またはキナーゼの基質、組換え発現タンパク質により活性化もしくは阻害されるタンパク質、または抗体でありうる。これらのコンテナは、試料間で、タンパク質発現レベル、タンパク質の活性、翻訳後修飾、または本来の遺伝子の突然変異によるタンパク質の性質の変化を評価し比較するのに有用であろう。
【００４４】
本発明の方法を、ウイルスによる細胞のトランスフェクションを容易にするために使用してもよい。例えば、細胞のトランスフェクション用のコンテナを、２つ以上のタイプの生体分子を提示するように修飾することができる。生体分子の１つは細胞のトランスフェクションに使用されるウイルスに結合しうる接着配列を含む。別の生体分子はトランスフェクションされる細胞に対する接着配列を有する。このようにして修飾されたコンテナにウイルスを添加すると、ウイルスはウイルス結合生体分子を介して表面に結合する。次いで細胞を添加すると細胞は細胞結合分子に結合する。これにより細胞とウイルスとが互いに非常に近接して固定化され、その結果細胞のトランスフェクション率が増大する。
【００４５】
本発明の方法を、タンパク質、ペプチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、小分子または薬物の生体分子アレイを作製するために使用することもできる。そのようなアレイは、１つの表面またはチップ上に微細パターン化して固定化された多数の異なるタイプのタンパク質、ペプチド、ＤＮＡ、またはＲＮＡを有しうる。そのような生体分子アレイは、組織試料または培養細胞をスクリーニングして差次的なタンパク質発現パターンおよび受容体の活性化などのその他の細胞生理現象における変化を測定する、ゲノム研究、トランスクリプトーム研究、およびプロテオーム研究、並びに診断学および薬物開発研究において、試料の高速大量処理を容易にするであろう。
【００４６】
例えば、共重合体結合オリゴヌクレオチドを作製し水溶液中に溶解させる。該溶液の微小な水滴をチップに移して結合アッセイを実施することができる。チップを洗浄し、次いで非修飾共重合体結合オリゴヌクレオチドの溶液に曝露すると、共重合体結合オリゴヌクレオチド部分の周囲の領域がコーティングされ、非特異的な吸着が防止される。チップを洗浄し、次に、相補的なオリゴヌクレオチド配列、または共重合体を介して表面に固定された配列に相補的な配列を一方の末端に含むＤＮＡもしくはＲＮＡ分子を組み込むように修飾された、タンパク質またはペプチドのいずれかとともにインキュベートする。各タイプのタンパク質またはＤＮＡは、相補的な共重合体結合オリゴヌクレオチドを有する部分に結合する。このようにして、生体分子アレイをチップ表面上に作製する。そのようなアレイは、ゲノム研究、トランスクリプトーム研究、およびプロテオーム研究に有用である。タンパク質のアッセイの場合、タンパク質は、抗体、抗原、酵素、レクチン、細胞外マトリクス分子、成長因子、サイトカイン、受容体、リガンド、細胞接着分子、活性化因子または阻害因子でありうる。チップの基材はガラス、疎水処理されたガラス、金属、疎水処理された金属、固体ポリマー、多孔質ポリマー、またはポリマーの薄膜を有するガラスもしくは金属でありうる。
【００４７】
本発明はタンパク質の複合体を提示する表面を作製するのに有用である。細胞内では、多くのタンパク質が他のタンパク質と互いに結合し、シグナル伝達において機能する複合体を形成する。どのタンパク質が相互に作用し、 タンパク質複合体がどのようにしてシグナル伝達機能を為すかを理解することは、正常な細胞生理現象および異常な細胞の挙動を理解するうえで重要である。今日では、多くのタンパク質の機能が未知である。研究者が未知のタンパク質機能について洞察を得ることができる１つの方法は、そのタンパク質が相互作用する他のタンパク質またはタンパク質複合体が何かを調べることである。タンパク質の複合体を提示する表面はこの目的に有用であろうし、また本発明の方法を用いて作製可能である。この用途については、固定化されるタンパク質が相互作用できるように十分可動的でかつ互いに近接していることが重要である。本発明は、（１）Ｆ１０８のポリエチレンオキサイド鎖のような共重合体の末端が表面に結合されたとき高度な可動性を維持している（リら（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．）上述）、および（２）Ｆ１０８−ＯＬＩＧＯのような共重合体結合オリゴヌクレオチドが十分高い密度で表面に吸着し、相補的なオリゴヌクレオチドのタグを介してタンパク質が近接して密集可能である、という理由で上記の用途にとって理想的である。タンパク質の複合体を提示するように修飾された基材を対象のタンパク質とともにインキュベートし、対象のタンパク質が例えばタンパク質Ｂ，Ｃ，Ｄを含む複合体またはタンパク質Ｂ，Ｅ，Ｇを含む複合体に結合するかどうかを調べることができよう。そのような基材を、リン酸化などのシグナル伝達の事象があるタンパク質複合体内で起きるためにはどのタンパク質または環境因子が必要であるかを調べるために使用することもできる。
【００４８】
本発明の方法を用いて、様々なタイプの生体分子を様々な比率で備えたほぼ無限の種類の基材を作製可能であることが理解されよう。これらの基材は、上述の目的、または他の多くの目的のために使用される基材を作製するために使用可能である。従って、微小粒子上の微小管モータータンパク質などの生体分子とその他の生体分子とを、微量輸送用デバイスおよび微量分離用デバイスとともに使用するために基材上に固定化することができる。本発明は、オリゴヌクレオチド配列とともに固定化された生体分子を有し、該オリゴヌクレオチド配列が粒子のタイプに特有で特定用タグまたはアドレス指定用ツールとして働く微小粒子を作製するために有用であろう。本発明の方法を、共役酵素アッセイ用に酵素を共に固定化するために使用してもよい。
【００４９】
本発明は、本明細書中で広範に記述し請求の範囲において主張したように、本発明の構成、方法、またはその他の必須の特徴から逸脱することなく、他の特定の形式で実施可能である。記載された実施形態は、全てにおいて単なる例示として、かつ限定的なものではないとみなされるべきである。従って本発明の範囲は先の記述ではなく請求項により示される。請求項の意味するものおよび同等の範囲内に入る全ての変更形態は請求項の範囲内に含まれる。本願に引用された全ての刊行物、特許、および特許出願は引用により本願に組み込まれる。
【実施例】
【００５０】
以下の実施例を、本発明の範囲内で作製されたいくつかの実施形態を例示するために記載する。これらの実施例は、本発明により作製可能な多くのタイプの実施形態を包括するものでも網羅するものでもない。
（実施例１−オリゴヌクレオチドのＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１０８への結合）
Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１０８の２−ピリジルジスルフィド誘導体（ＥＧＡＰ）を、リら（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．）、上述、の手法に従って合成する（図１）。最初にＦ１０８（６ｇ）を、ベンゼン（３６ｍＬ）中でｐ−ニトロフェニルクロロホルメート（０．５ｇ）を用いて活性化する。エチルエーテル沈殿と真空条件下での乾燥により生成物を回収する。メルカプトエチルアミン塩酸塩（３．４ｇ）を、メタノール（６ｍＬ）と酢酸（２．４ｍＬ）の混合物に溶解する。これをメタノール（９０ｍＬ）中の２，２’−ジチオピリジン（２０ｇ）と反応させて２−（２−ピリジルジチオ）エチルアンモニウムクロライドを得る。エーテル沈殿と真空条件下での乾燥により生成物を回収する。ｐ−ニトロフェニルクロロホルメートにより活性化されたＦ１０８（３ｇ）をメタノール（９ｍＬ）に溶解し、ＴＥＡ（１．２４ｍＬ）を含むメタノール（９ｍＬ）に溶解した２−（２−ピリジルジチオ）エチルアンモニウムクロライド（１．８ｇ）に加え、室温で１５−２０時間反応させる。この反応の終了後にＨＣｌを用いてＴＥＡを中和する。生成物（Ｆ１０８ ２−ピリジルジスルフィド誘導体）を透析により精製し、凍結乾燥により回収する。置換率をカールソンら（Ｃａｒｌｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．）、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．第１７３巻、７２３−７３７ページ、１９７８年の方法に従って測定する。この方法には、リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．４（ＰＢＳ）に溶解した正確に計量したＥＧＡＰの一部の３４３ｎｍにおけるＵＶ吸光度を、ＰＢＳを対照として測定する。続いて２５ｍＭ ＤＴＴの０．１ｍＬアリコートを試料と対照のキュベットの両方に添加する。ＤＴＴ添加の１０分後に吸光度を３４３ｎｍについて再測定する。解離した２−チオピリドンの濃度を測定するため、ＤＴＴの添加前後の吸光度の差をとり、モル吸光係数８０６０ｃｍ−１Ｍ−１を使用する。８個またはそれ以上のヌクレオチドと末端のチオール基とを含むオリゴヌクレオチドをＰＢＳに溶解する。Ｆ１０８−ＰＤＳをＰＢＳに溶解し前記オリゴヌクレオチド溶液とあわせる（図２）。反応混合物を室温で一晩振とう機上に置く。反応の効率を３４３ｎｍにおけるＵＶ吸光度を測定することによりモニターし、解離したピリジル２−チオンの量を測定する。この結果生じたオリゴヌクレオチド活性化Ｆ１０８（Ｆ１０８−ＯＬＩＧＯ）を透析により精製し凍結乾燥により回収する。
（実施例２−細胞付着のための基材の修飾）
本発明を細胞付着のための人工基材を修飾するために使用してもよい。これらの基材は、様々な生体分子および生体分子の特定の組合せが、胚発生および正常組織と罹患組織の双方の発生においてどのように機能して細胞の増殖と分化とを制御するかを研究するために使用することができる。同基材を、薬物スクリーニング、毒性試験および薬物開発のために試験管内（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で細胞を増殖させるために使用可能である。同基材を、診断または環境モニタリング用デバイスのために試験管内（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で細胞を増殖させるために使用可能である。同基材を、バイオリアクタ、喪失した組織もしくは損傷を受けた組織を取り替えるための組織工学的に作製されたデバイス、または構造的支持体として、送達デバイスとして、再建の際、もしくは再生の際に機能する埋め込み（インプラント）可能な材料に使用可能である。細胞の分化状態がその微小環境により制御されることはよく知られている。生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）の細胞の微小環境には多数の生体分子が存在し、存在する生体分子のタイプと濃度の両方ならびにこれらの環境における細胞間相互作用が細胞の挙動の制御に貢献している。所望の増殖パターンまたは分化レベルを維持して生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で細胞を培養するためには、細胞を適切な微小環境に置かなければならない。多くのタイプの細胞について、それにはさらにある種の生体分子を提示する表面で、かつ各生体分子の表面密度が制御されている表面が必要となる。これは本発明を用いて達成可能である。一例として、本明細書ではＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄと称する４つの異なる生体分子（Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄは細胞外マトリクス接着タンパク質、構造タンパク質、プロテオグリカン、サイトカイン、成長因子、レクチン、受容体、リガンド、細胞接着分子、抗体、抗原、阻害因子または治療用物質でありうる）を共に固定化することが可能である。この例を実施するため、本明細書ではａ，ｂ，ｃ，ｄと称する４つの異なるＦ１０８−ＯＬＩＧＯを実施例１に記載されているように作製する。生体分子Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄを修飾してそれぞれＦ１０８−ＯＬＩＧＯａ，ｂ，ｃ，ｄのオリゴヌクレオチド配列に相補的なオリゴヌクレオチド配列を組み込む。これは、最初にＮ−［α−マレイミドアセトキシ］スクシンイミドエステル（ＡＭＡＳ）などの架橋剤を用いて生体分子に反応性のスルフヒドリル部分を組み込み、その後チオール化されたオリゴヌクレオチドと反応させる。最終的な表面におけるＡ：Ｂ：Ｃ：Ｄの比率１：２：３：４を得るためには、ａ１に対しｂを２、ｃを３、ｄを４だけ溶液中であわせることになる。従って表面に吸着されるＦ１０８−ＯＬＩＧＯの全体の濃度はこの溶液に非修飾Ｆ１０８を添加することにより調節される。Ｆ１０８−ＯＬＩＧＯ溶液を対象の材料の基材とともにインキュベートし、トリブロック共重合体を材料の表面に吸着させる。異なるタイプのＦ１０８−ＯＬＩＧＯと非修飾Ｆ１０８は同じように同程度に吸着し、その結果表面における比率ａ：ｂ：ｃ：ｄは１：２：３：４となる。基材は通常ポリスチレンの表面であるが、疎水性表面の性質を示すように修飾された材料を含む、任意の十分に疎水的な材料でありうる。基材を洗浄した後、生体分子Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄとともにインキュベートする。生体分子Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄに結合したオリゴヌクレオチド配列は、それぞれ固定化Ｆ１０８−ＯＬＩＧＯ ａ，ｂ，ｃ，ｄ上の自身に相補的な配列にハイブリダイズするであろう。基材を洗浄し、得られた表面における生体分子の濃度は、固定化された様々なＦ１０８−ＯＬＩＧＯの表面濃度を反映することになる。該修飾基材上に細胞を播き、生体分子Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄの性質と濃度とにより生じたシグナルに対して応答させる。グルタチオンやＤＴＴなどの穏やかな還元剤を添加することにより該表面から細胞をハーベストすることが可能である。還元剤は固定化Ｆ１０８とＯＬＩＧＯとの間の結合を切断し、その結果生体分子と付着していた細胞とを解放する。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１０８の２−ピリジルジスルフィド誘導体（ＥＧＡＰ）の合成について示す略図。
【図２】本発明の方法とともに使用可能な代表的な共重合体結合オリゴヌクレオチドの合成について示す略図。
【図３Ａ】２種の異なる共重合体結合オリゴヌクレオチドと非修飾共重合体とを用いて２種の異なるタンパク質を所定の量だけ共に固定化するために使用されるステップを示す略図。
【図３Ｂ】２種の異なる共重合体結合オリゴヌクレオチドと非修飾共重合体とを用いて２種の異なるタンパク質を所定の量だけ共に固定化するために使用されるステップを示す略図。【Technical field】
[0001]
The present invention relates to a method for controlling the cellular response and modifying the surface of a material for cell culture and analysis. More specifically, the present invention relates to a method for immobilizing a plurality of biomolecules at a defined ratio on a substrate for use in cell culture, medical devices and cell analysis.
[Background Art]
[0002]
Normal development and function in an organism requires interaction between the cell and its surrounding environment. One way that cells interact is through a molecule present in the cell membrane called a transmembrane protein. When the extracellular portion of the transmembrane protein encounters certain molecules of the surrounding environment, the transmembrane protein undergoes structural and conformational changes that trigger biological interactions inside the cell.
[0003]
Cells in vivo form a complex multilayer structure that ultimately forms tissues and organs. However, the formation of tissues and organs requires specific contact between cells and their surrounding environment. Cells that require contact with the surrounding environment for accurate development will not grow properly if grown, unless fixed to other cells, extracellular matrix (ECM), or other surfaces, It is referred to as "scaffold dependency."
[0004]
ECM is a complex and diverse group of molecules secreted by cells, such as collagen, glycosaminoglycans, proteoglycans, and glycoproteins. The products of these cells together form the basal layer, bone and cartilage, which give tissues and organs their shape and strength. In fact, anchorage-dependent cell contact with the ECM in many cases plays a very large role in determining cell shape, location, metabolism, differentiation and proliferation.
[0005]
Cell contact is also important in other biological functions, such as activating an immune response. The immune system is a complex cellular network that has the function of recognizing and removing foreign substances such as viruses, bacteria and parasites from the body. One mechanism used by the immune system to remove foreign substances is a humoral response. The humoral response involves the activation of certain cells called B cell lymphocytes. B cells are activated when a transmembrane protein on their surface binds to a foreign substance called an antigen. Specifically, the B cells are stimulated by the binding of the B cells to the antigen, proliferate, and differentiate into plasma cells that produce immunoglobulins or antibodies.
[0006]
Antibodies produced by plasma cells move throughout the body while binding to pathogens and foreign substances. Binding of the antibody to foreign substances activates several other immunological pathways, including the "complement" pathway. The complement pathway has been defined to destroy foreign substances and cause an inflammatory response in an organism.
[0007]
While contact of cells with other cells and the environment is important for the overall health and biological function of the organism, this has created unique problems in biological science. A tissue or cell culture consists of cells, derived from plants or animals, grown outside the original organism. These cells are often cultured under specific environmental conditions, for example, in a petri dish. Cell culture is very important because it represents a biological "factory" capable of producing large amounts of biological products such as growth factors, antibodies, viruses, and the like. These products are then isolated from the cell culture and can be used for therapeutic purposes, for further exploration, or for other uses.
[0008]
Cell cultures can also be a source of tissue that can be used for transplantation into an organism. For example, it could be used in skin transplants to replace cells in cell-cultured skin with lesioned or damaged skin. Cell cultures usually consist of cells from only one or several tissues or organs. As a result, cell cultures provide a system for studying the properties of individual cell types without the complexities and risks of scientists working on whole organisms. For example, the effect of a drug on certain cells can be tested on cell cultures prior to clinical trials to assess the health risks of the drug.
DISCLOSURE OF THE INVENTION
[Problems to be solved by the invention]
[0009]
Like most cells in vivo, cells grown in culture are anchored to either the ECM or another cell. Only cells of the circulatory system (eg, lymphocytes and erythrocytes) grow in suspension in solution without adhering in vitro. Many anchorage-dependent cells can grow on glass surfaces or plastic surfaces such as polystyrene. However, these cells often lose their original structure and do not function properly. Cultured cells often lose their ability to differentiate and respond to hormones. Thus, cultured cells do not accurately mimic the biological function of cells in vivo, and thus have limited potential.
[0010]
For this reason, glass or plastic cell culture dishes are often coated with ECM proteins such as collagen, fibronectin, laminin and the like. These proteins bind to surfaces such as polystyrene by a process known as adsorption. ECM-coated cell culture surfaces have improved culture conditions, but are far from ideal.
[0011]
First, biomolecules such as proteins are often inactivated when adsorbed on hydrophobic surfaces. The biological activity of a protein is provided by its unique structure and the ability to undergo conformational changes upon binding to a substance or other physiological event. In one study, protein structure was measured using a technique called microcalorimetry. Microcalorimetric studies have shown that proteins bound to a hydrophobic surface have lost virtually all of their cooperatively folded structures compared to the same protein in solution. Since the structure of a protein and the ability of the protein to undergo conformational changes are strongly correlated with biological activity, the above data indicate that most of the protein adsorbed on hydrophobic surfaces is in vivo. It suggests a loss of biological activity.
[0012]
Second, the conformation and orientation of the immobilized protein has a significant effect on the nature of the protein interacting with cells. DJ Juliano, SS Saadra and GA Truskey, Journal of Biomedical Materials Research, 27, 1103-1113, 1993 . Both are affected by the chemical and physical properties of the underlying substrate and the method of immobilization. K. Lewandska, E. Pergament, N. Sukenik and LA Cup, The Journal of Biomedical, vol. , 1992.
[0013]
Third, cells in culture, like cells in vivo, release molecules such as serum proteins and growth factors into the medium. As mentioned above, secretion and accumulation of these molecules in the medium is necessary for the adjacent cells to function properly and biologically. Under current cell culture conditions, the secreted molecules are adsorbed on the surface of the cell culture vessel, which disrupts the close balance and concentration of secreted molecules. Thus, the communication and biological functions of cells cultured under current cell culture techniques do not mimic the in vivo environment.
[0014]
Finally, the concentration of ECM components at the surface is a factor that controls cell behavior. The ability to modulate and vary the concentration of biomolecules on a surface depends on the method of immobilization and, in some cases, the physical properties of the underlying material. Simply adsorbing ECM to a cell culture substrate does not meet these requirements.
[0015]
In addition, various complex biomolecules, such as proteins and hormones, are required for normal cell growth and development. In vivo, these molecules are present at specific concentrations and ratios. Changes in the proportion of biomolecules can alter cell growth, metabolism, and function. The ability to immobilize two or more biomolecules together in a defined ratio on a single substrate would be useful for better mimicking the in vivo environment. Immobilization of biomolecules on the surface of materials for in vitro cell growth, high-throughput (high-throughput) screening, biomolecule discovery and development, diagnostics, medical devices or bioreactors. Methods used include direct adsorption and covalent bonding. With these methods, it is not possible to immobilize two or more biomolecules together on a single substrate at a predetermined ratio that can be easily changed.
[0016]
In light of the above, it is a significant advance in the art to provide a system for culturing cells in vitro that better mimics the in vivo environment of the cells. Would. It would be a further advance in the art to provide a method of coating the surface of a tissue culture vessel with a biomolecule without destroying the biological activity of the biomolecule. It would also be an advance in the art to provide a method of coating the surface of a tissue culture vessel that prevents non-specific adsorption of proteins from the surrounding environment. Providing a method of immobilizing two or more biomolecules on a surface in a defined ratio would be another advance in the art. It would be a further advance in the art if biomolecule-coated surfaces could be used to attach molecules for prokaryotic and eukaryotic cells, viruses, and biological assays. It would be a further advance in the art if the behavior of cells could be directed by materials coated with biomolecules.
[Means for Solving the Problems]
[0017]
The methods and devices of the present invention will depend on the current state of the art, especially in the art, where methods and systems currently available for attaching cells and biomolecules to surfaces have not yet been fully solved. Developed according to the issues and needs. To overcome the shortcomings of current methods and systems, the present invention provides methods and systems that can bind biomolecules to surfaces in a defined ratio. This is useful in culturing and analyzing cells, controlling cell responses to medical devices, and controlling cell behavior in tissue engineering applications.
[0018]
The present invention relates to a method for immobilizing a plurality (N types) of biomolecules together on a substrate at a predetermined ratio. Substrates can be, for example, polymer particles, magnetic particles, petri dishes, multiwell plates, tea flasks, roller bottles, array chips, sampling containers, assay tubes, fibers, membranes, supports, medical devices, and the like. The substrate can be contacted with a copolymer having at least one hydrophobic moiety associated with one or more hydrophilic moieties that provide pendant groups for modifying and attaching the protein. While PEO- and PPO-containing triblock or diblock copolymers are presently preferred, many other copolymers may be used in accordance with the present invention. A variety of different PEO- and PPO-containing copolymers may be used according to the method of the present invention. For example, polybutadiene and PEO, polyimide and PEO, polymethyl methacrylate and PEO, polystyrene and PEO, polybutylene oxide and PEO, poly-L-lysine (lysine) and PEO, polydimethylsiloxane and PEO, poly (t-butyl methacrylate) A copolymer of PEO and PEO, and a hydrocarbon containing PEO may be used. One currently preferred copolymer that can be used is Pluronic® F108 available from BASF. Like the Pluronic (R) brand copolymer, many of the other copolymers described above have been shown to adsorb well to hydrophobic materials, and also exhibit non-specific protein adsorption on the surface. It has been shown to form a suitable layer of PEO that can be suppressed. Apart from PEO, other hydrophilic moieties that can be used are sepharose-type materials and other polysaccharides and polyurethanes. The copolymer can be contacted with the surface for a sufficiently long time to adsorb to the substrate. See, for example, the disclosures of U.S. Patent Nos. 6,284,503, 5,728,588 and 5,516,703, which are incorporated herein by reference.
[0019]
The copolymer has activated end groups. The activated end group can be selected from a number of groups that can attach the oligonucleotide to the polymer. For example, an activated terminal group may have a 2-pyridyl disulfide group. It is possible to attach N oligonucleotides to the activated end groups to form a copolymer-bound oligonucleotide. Each type of copolymer-bound oligonucleotide corresponds to one of the N biomolecules. That is, N types of copolymer-bound oligonucleotides are mixed at a predetermined ratio to achieve a specified ratio.
[0020]
Biomolecules can be linked to complementary oligonucleotides to form biomolecule binding oligonucleotides. Each type of biomolecule can be attached to an oligonucleotide that is complementary to the corresponding copolymer-bound oligonucleotide.
[0021]
Biomolecule-linked oligonucleotides can hybridize to copolymer-linked oligonucleotides. Such hybridization creates a substrate in which multiple biomolecules are immobilized together in a defined ratio. The steps of attaching the oligonucleotide to the end groups of the copolymer, contacting the substrate with the oligonucleotide-modified copolymer, and attaching the biomolecule to the complementary oligonucleotide are performed in any order. It is possible.
[0022]
Various biomolecules can be immobilized together on a substrate by the disclosed methods. Such biomolecules include proteins, glycoproteins, peptides, growth factors, cytokines, adhesion factors, extracellular matrix factors, antibodies, antibody fragments, differentiation factors, lectins, polysaccharides, receptors, receptor fragments, transmembrane proteins And fragments of transmembrane proteins, but are not limited thereto.
[0023]
The method of the present invention may have other embodiments that enable the steps of the method to be performed in any order. In one such embodiment, the method comprises the steps of attaching the N first oligonucleotides to the copolymer; mixing the N oligonucleotide modified copolymers in solution at a prescribed ratio. Contacting a substrate with a solution of the oligonucleotide-modified copolymer; binding N biomolecules to a second oligonucleotide; and linking the second oligonucleotide to the first oligonucleotide And hybridization. As in other embodiments of the method of the present invention, the copolymer has activated end groups. The activated end group may include a 2-pyridyl disulfide group or other group, which allows the copolymer to be attached to the first oligonucleotide. The substrate is contacted with the copolymer for a time sufficient for the copolymer to be adsorbed on the substrate surface.
[0024]
The invention also relates to the preparation of surfaces for attachment, growth, control of cell behavior, or analysis of cells. The first oligonucleotide is capable of binding to a triblock or diblock copolymer containing PEO. The copolymer may be, for example, Pluronic® F108. The oligonucleotide-modified copolymer can be adsorbed on the surface. A second oligonucleotide can be linked to the biomolecule. The biomolecules can be selected from a variety of biomolecules that promote cell adhesion, promote cell proliferation, control the state of differentiation of cells, or are useful in analyzing cells. The second oligonucleotide is usually complementary to the first oligonucleotide so that the second oligonucleotide can hybridize to the first oligonucleotide. The surface can also be made to include a plurality (N types) of biomolecules in defined proportions. This can be accomplished by attaching the biomolecule to an oligonucleotide that hybridizes to a complementary oligonucleotide attached to the PEO- and PPO-containing triblock or diblock copolymer. Biomolecules include, for example, proteins, glycoproteins, peptides, growth factors, cytokines, adhesion factors, extracellular matrix factors, antibodies, antibody fragments, differentiation factors, lectins, polysaccharides, receptors, receptor fragments, transmembrane proteins, transmembrane There may be a fragment of a protein and the like.
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
[0025]
The present invention is described and described in more detail and in detail with reference to the accompanying drawings.
[0026]
The present invention relates to a method for immobilizing a plurality (N types) of biomolecules together on a substrate at a prescribed ratio. Substrates include, for example, polymer particles, magnetic particles, petri dishes, multiwell plates, tea flasks, roller bottles, array chips, sampling tubes, assay tubes, fibers, membranes, supports, medical devices, medical implants, etc. It can be. The substrate can be contacted with a copolymer having at least one hydrophobic moiety combined with one or more hydrophilic moieties that provide pendant groups for modifying and attaching proteins. The copolymer is used as a connecting portion for connecting a biomolecule to the surface of the base material. PEO- and PPO-containing triblock or diblock copolymers are presently preferred. One copolymer that can be used with the method of the present invention is Pluronic® F108, which comprises (polyethylene oxide) 129 -(Polypropylene oxide) 56 -(Polyethylene oxide) 129 Is a triblock copolymer having the structure: The substrate is brought into contact with the surface for a time sufficient for the copolymer to be adsorbed to the substrate.
[0027]
The terminal hydroxyl group of the copolymer is activated, and the copolymer can be bound to the oligonucleotide. As used herein, oligonucleotides include polymers of deoxyribonucleic acid (DNA), ribonucleic acid (RNA), peptide nucleic acid (PNA), and nucleic acids containing modified or non-standard bases. There is coalescence. The end groups of the copolymer, such as Pluronic® F108, can be modified by the method of Li et al., Bioconj. Chem. 7, pages 592-599, 1996, and can be activated to incorporate the pyridyl disulfide moiety. In this approach, Pluronic® F108 is first activated with p-nitrophenol chloroformate. The F108 activated with p-nitrophenol is then reacted with 2- (2-pyridyldithio) ethylammonium chloride to produce the 2-pyridyldisulfide derivative of Pluronic® F108. The activated Pluronic® is then attached to the oligonucleotide sequence having a thiol group at the end via the Pluronic® pyridyl disulfide group.
[0028]
The protein or other biomolecule of interest is attached to a complementary oligonucleotide sequence. The oligonucleotide-modified copolymer will bind to the hydrophobic surface via a central block of polypropylene oxide. Once the modified copolymer has been attached to the surface, biomolecules attached to complementary oligonucleotide sequences can be added. Biomolecules are bound to the surface with high affinity as a result of base pairing between the oligonucleotide sequence bound to the copolymer and the complementary oligonucleotide sequence on the protein or other molecule of interest.
[0029]
Using this approach, it is possible to modify a copolymer such as Pluronic® F108 with a number of different oligonucleotide sequences that have a high and specific binding affinity only to the sequence complementary to itself. is there. Similarly, proteins and other molecules can be modified with a number of different complementary DNA sequences. By mixing a plurality of types of OLIGO-modified (oligonucleotide-modified) copolymers in a prescribed ratio in a solution and using this solution for coating the surface, a plurality of different chemical substances are bound to each other, and each type of chemical A surface can be produced in which the relative amounts of the substances can be easily adjusted and systematically varied.
[0030]
Subsequently, biomolecules having complementary oligonucleotide sequences can be added, which will selectively bind to the immobilized complementary sequences. In this way, the relative amount of each type of protein that is immobilized together on the surface can be strictly adjusted. In fact, the number of oligonucleotide pairs that can be used is infinite. Thus, there is no limit to the number of different factors that can be immobilized together at a chosen ratio on one surface.
[0031]
A variety of biomolecules can be co-immobilized on a substrate using the disclosed methods. Such biomolecules include proteins, glycoproteins, peptides, growth factors, cytokines, adhesion factors, extracellular matrix factors, antibodies, antibody fragments, differentiation factors, lectins, polysaccharides, receptors, receptor fragments, transmembrane proteins , Transmembrane protein fragments, DNA, RNA and the like, but are not limited thereto.
[0032]
FIGS. 3A and 3B show one possible embodiment within the scope of the present invention, which comprises attaching N types of first oligonucleotides to the copolymer; Mixing in a solution a copolymer modified with an oligonucleotide of the type A in a defined ratio; contacting a substrate with a solution of the oligonucleotide-modified copolymer; N types of biomolecules To the second oligonucleotide; and hybridizing the second oligonucleotide to the first oligonucleotide. The order of the steps can be changed.
[0033]
The present invention can be used to immobilize biomolecules on a substrate for cell sorting. For example, many different types of substrates can be modified, such as polymer particles, magnetic particles, petri dishes, multiwell plates, tea flasks, roller bottles, array chips, sampling tubes and assay tubes. Substrates are modified using copolymer-linked oligonucleotides to present one or more types of biomolecules known to have a high and specific affinity for the cell type of interest I do. A sample containing the cell type of interest is incubated with the modified substrate and the target cells are allowed to bind to the immobilized biomolecules with specific affinity. The substrate is washed to remove unwanted cells and proteins, leaving only target cells. The cells can then be cultured for various uses, analyzed on a substrate, or harvested from the substrate simply by adding a reducing agent. The reducing agent breaks the bond between the immobilized copolymer molecule and the oligonucleotide, thereby releasing the biomolecule and the attached cells. This approach is useful for modifying multiwell plates or for producing chips that present arrays of different types of cells. For example, a 96-well plate could be used to generate one type of cell array from one tissue sample or patient sample and used for diagnostic tests.
[0034]
The method of the present invention may be used to create a surface using biomolecules co-immobilized. Such coated surfaces can be made with different domains for cell attachment or for cells not attached. Therefore, the substrate can be prepared with a domain that promotes cell adhesion and a domain that inhibits cell adhesion. For example, one domain of the substrate may adsorb a first copolymer-linked oligonucleotide and another domain of the substrate may adsorb a second copolymer-linked oligonucleotide. Oligonucleotides complementary to the first copolymer-bound oligonucleotide bind to biomolecules that promote cell attachment, and oligonucleotides complementary to the second copolymer-bound oligonucleotide bind to biomolecules that prevent cell attachment. Can bind to a molecule. Thus, when a complementary oligonucleotide and a cell are added, a domain to which no cell is attached is created.
[0035]
The present invention can also be used to make patterned substrates for cell culture having two or more types of domains, each type of domain having a different biological activity. Each type of domain can be prepared by adsorbing one copolymer-bound oligonucleotide or a mixture of copolymer-bound oligonucleotides to a desired region, followed by addition of a biomolecule having a complementary oligonucleotide. Make it. Such substrates are useful for better mimicking the structure of tissue on artificial substrates and supports (scaffolds).
[0036]
The present invention may be used to coat biomedical implants and devices to make them more interact with cells and tissues. The coating can be used to promote specific types of cells to adhere to and proliferate on the implant, or to control the behavior of cells that adhere to the implant. Coatings may be used to prevent adverse reactions to the implant by incorporating factors that inhibit the cascade of reactions, e.g., to prevent thrombus formation on cardiovascular devices. It may be used to incorporate antithrombotic factors. The coating may be used to present a therapeutic agent to the surface of a temporary use of an auxiliary material such as a suture or a burn wound protector that hastens wound healing.
[0037]
The present invention can also provide a substrate for drug development and toxicity testing in vitro. For example, a small molecule drug may be immobilized with a biomolecule of interest to facilitate drug development and toxicity testing in vitro.
[0038]
Cells can be transfected and then a container for detecting the recombinant protein expression product of the cell to evaluate the transfection efficiency and protein expression level of the cell can be made by the method of the present invention. For example, a substrate may be modified to present one type of protein that will facilitate the attachment of cells to the substrate and a second type of protein that will capture the expression product by the cell of interest. do it. This is performed using two different types of copolymer-linked oligonucleotides made as described herein. These types of copolymer-linked oligonucleotides are referred to herein as a and b. The protein used to promote cell attachment (herein A) and the protein used to capture the recombinantly expressed protein (here B) are each a copolymer-bound oligonucleotide Modification is performed by binding a complementary oligonucleotide sequence to the oligonucleotide sequences a and b. If the desired ratio of A: B is 1: 3, copolymer-bound oligonucleotide b3 is mixed with copolymer-bound oligonucleotide a1 in water, and the resulting solution is coated on the transfection container coating. use. Different types of copolymer-bound oligonucleotides will also adsorb to the same extent, resulting in a: b at the surface of 1: 3. After coating, the container is washed and then incubated with proteins A and B. The protein binds to the immobilized copolymer-bound oligonucleotide by hybridization of its complementary oligonucleotide sequence, and the resulting surface density reflects the ratio of copolymer-bound oligonucleotides a and b at the surface Will be. Cells are seeded on a modified substrate and cells attach via protein A. Cells can be transfected either before or after plating on the substrate. The cells are allowed sufficient time for protein expression and then lysed to release the recombinantly expressed protein. This protein binds to the surface via protein B. The surface is washed to remove cell debris, and then the expressed protein is analyzed.
[0039]
The present invention transfects a cell and then produces a container for detecting the recombinant protein expression product by the cell to determine the activity of the expressed protein, the stability of the expressed protein, and post-translational modification of the expressed protein. It is also useful for Such a container would facilitate the discovery of mutants that produce proteins that are more robust in harsh environments or that exhibit increased biological activity relative to their native form.
[0040]
A substrate may be made as described above using two types of copolymer-bound oligonucleotides (type a, type b) adsorbed on its surface. Cells are seeded on a modified substrate and attached via protein A. Cells can be transfected either before or after plating on the substrate. The cells are allowed sufficient time for protein expression and then lysed to release the recombinantly expressed protein. The protein is bound to the surface via protein B, and the surface is washed to remove cell debris. Here, B represents (1) the ability to bind to the protein and subsequently detect the presence of activity, stability, or post-translational modifications by secondary methods, and (2) that the expressed protein has any essential structure or translation. It will either bind to the protein only if it has a post-modification, or (3) act as a substrate for the expressed protein, resulting in a detectable product when cleaved. In another example, the presence of the expressed protein on the surface could then be detected by an immunoassay.
[0041]
The present invention also provides methods for assessing the effect of extracellular biomolecules, drugs, or combinations thereof on the expression efficiency of recombinant proteins in transfected cells, and for creating an optimal environment for a cell bioreactor. . For example, a substrate is prepared by the method of the present invention, and the method involves immobilizing one factor or a combination of multiple factors (referred to as A) on the surface and affecting the ability of a cell to express a recombinant protein. A way to generate a possible signal. The factor (s) herein refers to extracellular matrix adhesion proteins, cytokines, growth factors, proteoglycans, structural proteins, cell adhesion molecules, antibodies, antigens, inhibitors, drugs, or any combination thereof. It is possible. In addition to the above factors, a biomolecule (referred to as B) which is considered to bind to the recombinantly expressed protein can also be immobilized on the surface. Cells are seeded on a modified substrate and attached to the surface via protein A. Cells can be transfected either before or after plating on the substrate. The cells are allowed sufficient time for protein expression and then lysed to release the recombinantly expressed protein. In this example, where the surface is modified with protein B, the expressed protein binds to the surface via B, and the surface is washed to remove cell debris. Here, B plays a role in binding to the protein to enable detection of activity, stability, or the presence of post-translational modifications. Alternatively, if the recombinant protein is secreted by cells, a solution-based assay can be used to detect the recombinantly expressed protein.
[0042]
By the method of the present invention, it is possible to prepare a substrate that allows to monitor changes in the physiology of a cell as a result of transfection of the cell. Therefore, a substrate may be prepared using protein A, which facilitates cell binding, and protein B, which binds to cell products other than the recombinant protein. This substrate would be useful in assessing the safety and efficacy of gene therapy by monitoring changes in the physiology of cells as a result of transfection. In this example, protein A can be an extracellular matrix adhesion protein, cytokine, growth factor, proteoglycan, structural protein, cell adhesion molecule, antibody, drug or any combination thereof. The cells are seeded on a substrate and incubated for a certain period of time (during which the cells are affected by protein A). Then, when the cells are lysed, the protein of interest binds to the substrate by protein B. Cell debris is removed by washing and the amount and / or nature of the immobilized target protein is assayed.
[0043]
The method of immobilizing a plurality of biomolecules together on a substrate can be used to evaluate products of cells that are not anchorage-dependent. Such cells can be transfected to secrete the recombinant protein. These cells are placed, using the present invention, in a container that has been modified to present a protein that serves as a tool for analyzing the recombinantly expressed protein. The protein can be a substrate for a recombinantly expressed enzyme or kinase, a protein activated or inhibited by the recombinantly expressed protein, or an antibody. These containers will be useful in assessing and comparing changes in protein properties between samples due to protein expression levels, protein activity, post-translational modifications, or mutations of the native gene.
[0044]
The method of the invention may be used to facilitate transfection of cells with a virus. For example, a container for transfection of cells can be modified to present more than one type of biomolecule. One of the biomolecules contains an adhesion sequence that can bind to the virus used to transfect the cells. Another biomolecule has an adhesion sequence for the cell to be transfected. When a virus is added to the container thus modified, the virus binds to the surface via a virus-binding biomolecule. The cells then bind to the cell binding molecule upon addition of the cells. This immobilizes the cells and virus in close proximity to each other, thereby increasing the transfection rate of the cells.
[0045]
The method of the invention can also be used to generate biomolecular arrays of proteins, peptides, DNA, RNA, small molecules or drugs. Such an array may have a number of different types of proteins, peptides, DNAs, or RNAs immobilized in micropatterns on one surface or chip. Such biomolecular arrays screen tissue samples or cultured cells to measure changes in differential protein expression patterns and other cellular physiology, such as receptor activation, genomic studies, transcriptome studies And will facilitate high-throughput processing of samples in proteome research, and diagnostic and drug development research.
[0046]
For example, a copolymer-bound oligonucleotide is prepared and dissolved in an aqueous solution. A small water droplet of the solution can be transferred to a chip to perform a binding assay. When the chip is washed and then exposed to a solution of the unmodified copolymer-bound oligonucleotide, the area around the copolymer-bound oligonucleotide portion is coated, preventing non-specific adsorption. The chip was washed and then modified to incorporate a DNA or RNA molecule containing at one end a complementary oligonucleotide sequence or a sequence complementary to the surface immobilized via a copolymer. Incubate with either protein or peptide. Each type of protein or DNA binds to a moiety having a complementary copolymer binding oligonucleotide. In this way, a biomolecule array is produced on the chip surface. Such arrays are useful for genomic, transcriptomic, and proteomic studies. For protein assays, the protein may be an antibody, antigen, enzyme, lectin, extracellular matrix molecule, growth factor, cytokine, receptor, ligand, cell adhesion molecule, activator or inhibitor. The substrate of the chip can be glass, hydrophobically treated glass, metal, hydrophobically treated metal, solid polymer, porous polymer, or glass or metal with a thin film of polymer.
[0047]
The present invention is useful for creating a surface displaying a complex of proteins. In cells, many proteins associate with each other and form complexes that function in signal transduction. Understanding which proteins interact and how protein complexes perform signaling functions is important to understanding normal cell physiology and abnormal cell behavior. Today, the functions of many proteins are unknown. One way researchers can gain insight into unknown protein function is to look at what other proteins or protein complexes the protein interacts with. Surfaces displaying protein complexes may be useful for this purpose and can be made using the methods of the present invention. For this use, it is important that the proteins to be immobilized are sufficiently mobile and close to each other that they can interact. The present invention (1) maintains a high degree of mobility when the ends of the copolymer, such as the polyethylene oxide chain of F108, are attached to the surface (Li et al., Supra), and ( 2) The above use because copolymer-bound oligonucleotides such as F108-OLIGO are adsorbed on the surface at a sufficiently high density and proteins can be closely packed together via complementary oligonucleotide tags. Ideal for A substrate modified to display a complex of proteins is incubated with the protein of interest and the protein of interest binds to a complex comprising, for example, proteins B, C, D or a complex comprising proteins B, E, G You can find out if you want to. Such substrates can also be used to determine which proteins or environmental factors are required for a signal transduction event, such as phosphorylation, to occur in a protein complex.
[0048]
It will be appreciated that the method of the present invention can be used to make an almost infinite variety of substrates with various types of biomolecules in various ratios. These substrates can be used to make substrates used for the purposes described above, or many other purposes. Thus, biomolecules such as microtubule motor proteins on microparticles and other biomolecules can be immobilized on a substrate for use with micro-transport and micro-separation devices. The present invention will be useful for making microparticles having a biomolecule immobilized with an oligonucleotide sequence, wherein the oligonucleotide sequence is specific to the type of particle and serves as an identifying tag or addressing tool. . The method of the invention may be used to co-immobilize enzymes for a coupled enzyme assay.
[0049]
The present invention may be embodied in other specific forms without departing from the structure, method or other essential features of the invention, as broadly described herein and claimed in the following claims. is there. The described embodiments are to be considered in all respects only as illustrative and not restrictive. The scope of the invention is, therefore, indicated by the appended claims rather than by the foregoing description. All modifications that come within the meaning and equivalency of the claims are included within the scope of the claims. All publications, patents, and patent applications cited in this application are incorporated herein by reference.
【Example】
[0050]
The following examples are set forth to illustrate some embodiments made within the scope of the present invention. These examples are not intended to be exhaustive or exhaustive of the many types of embodiments that can be made with the present invention.
Example 1-Binding of oligonucleotides to Pluronic (R) F108
The 2-pyridyl disulfide derivative of Pluronic® F108 (EGAP) is synthesized according to the procedure described above by Li et al., Li et al. (FIG. 1). First, F108 (6 g) is activated with p-nitrophenyl chloroformate (0.5 g) in benzene (36 mL). The product is recovered by ethyl ether precipitation and drying under vacuum. Mercaptoethylamine hydrochloride (3.4 g) is dissolved in a mixture of methanol (6 mL) and acetic acid (2.4 mL). This is reacted with 2,2′-dithiopyridine (20 g) in methanol (90 mL) to give 2- (2-pyridyldithio) ethylammonium chloride. The product is recovered by ether precipitation and drying under vacuum. F108 (3 g) activated by p-nitrophenyl chloroformate was dissolved in methanol (9 mL) and 2- (2-pyridyldithio) ethylammonium was dissolved in methanol (9 mL) containing TEA (1.24 mL). Chloride (1.8 g) is added and reacted at room temperature for 15-20 hours. After the end of the reaction, the TEA is neutralized with HCl. The product (F108 2-pyridyl disulfide derivative) is purified by dialysis and recovered by lyophilization. The substitution rate was determined by Carlsson et al. Biochem. Vol. 173, pages 723-737, measured according to the method of 1978. In this method, the UV absorbance at 343 nm of a precisely weighed portion of EGAP dissolved in phosphate buffered saline, pH 7.4 (PBS) is measured using PBS as a control. Subsequently, a 0.1 mL aliquot of 25 mM DTT is added to both the sample and control cuvettes. The absorbance is read again at 343 nm 10 minutes after DTT addition. To measure the concentration of dissociated 2-thiopyridone, the difference in absorbance before and after the addition of DTT was taken and the molar extinction coefficient was 8060 cm. -1 M -1 Use An oligonucleotide containing eight or more nucleotides and a terminal thiol group is dissolved in PBS. F108-PDS is dissolved in PBS and combined with the oligonucleotide solution (FIG. 2). The reaction mixture is placed on a shaker at room temperature overnight. The efficiency of the reaction is monitored by measuring the UV absorbance at 343 nm to determine the amount of dissociated pyridyl 2-thione. The resulting oligonucleotide-activated F108 (F108-OLIGO) is purified by dialysis and recovered by lyophilization.
Example 2 Modification of Substrate for Cell Attachment
The present invention may be used to modify artificial substrates for cell attachment. These substrates study how various biomolecules and specific combinations of biomolecules function in embryonic development and in both normal and diseased tissues to control cell growth and differentiation. Can be used to The substrate can be used to grow cells in vitro for drug screening, toxicity testing and drug development. The substrate can be used to grow cells in vitro for diagnostic or environmental monitoring devices. The substrate can be used as a bioreactor, a tissue engineered device to replace lost or damaged tissue, or as a structural support, as a delivery device, during reconstruction, or during regeneration. It can be used for functional implantable materials. It is well known that the differentiation state of a cell is controlled by its microenvironment. There are a large number of biomolecules in the microenvironment of cells in vivo, and both the type and concentration of biomolecules present and cell-cell interactions in these environments contribute to the control of cell behavior. I have. In order to culture cells in vitro while maintaining a desired growth pattern or level of differentiation, the cells must be placed in a suitable microenvironment. For many types of cells, it also requires a surface that presents certain biomolecules and that has a controlled surface density for each biomolecule. This can be achieved using the present invention. By way of example, four different biomolecules, referred to herein as A, B, C and D, where A, B, C and D are extracellular matrix adhesion proteins, structural proteins, proteoglycans, cytokines, growth factors, lectins, receptors , Ligands, cell adhesion molecules, antibodies, antigens, inhibitors or therapeutic substances) can be immobilized together. To implement this example, four different F108-OLIGOs, referred to herein as a, b, c, and d, are made as described in Example 1. The biomolecules A, B, C, D are modified to incorporate oligonucleotide sequences complementary to the oligonucleotide sequences of F108-OLIGOa, b, c, d, respectively. This involves first incorporating a reactive sulfhydryl moiety into the biomolecule using a crosslinker such as N- [α-maleimidoacetoxy] succinimide ester (AMAS) and then reacting with the thiolated oligonucleotide. In order to obtain the ratio of A: B: C: D of 1: 2: 3: 4 on the final surface, the amount of a1, the amount of b, the amount of c, the amount of d, and the amount of d are adjusted to a1 in the solution. Thus, the overall concentration of F108-OLIGO adsorbed on the surface is adjusted by adding unmodified F108 to this solution. The F108-OLIGO solution is incubated with the substrate of the material of interest and the triblock copolymer is adsorbed on the surface of the material. The different types of F108-OLIGO and unmodified F108 also adsorb to the same extent, resulting in a ratio a: b: c: d on the surface of 1: 2: 3: 4. The substrate is usually a polystyrene surface, but can be any sufficiently hydrophobic material, including materials that have been modified to exhibit hydrophobic surface properties. After washing the substrate, it is incubated with biomolecules A, B, C, D. Oligonucleotide sequences attached to biomolecules A, B, C, D will hybridize to their complementary sequences on immobilized F108-OLIGO a, b, c, d, respectively. The substrate is washed and the resulting concentration of biomolecules on the surface will reflect the surface concentration of the various immobilized F108-OLIGO. Cells are seeded on the modified substrate and respond to signals generated by the nature and concentration of biomolecules A, B, C, D. Cells can be harvested from the surface by adding a mild reducing agent such as glutathione or DTT. The reducing agent breaks the bond between the immobilized F108 and OLIGO, thereby releasing the biomolecule and the attached cells.
[Brief description of the drawings]
[0051]
FIG. 1 is a schematic showing the synthesis of a 2-pyridyl disulfide derivative of Pluronic® F108 (EGAP).
FIG. 2 is a schematic diagram illustrating the synthesis of a representative copolymer-linked oligonucleotide that can be used with the methods of the present invention.
FIG. 3A is a schematic diagram showing the steps used to immobilize two different proteins together in predetermined amounts using two different copolymer-linked oligonucleotides and an unmodified copolymer.
FIG. 3B is a schematic diagram illustrating the steps used to immobilize two different proteins together in predetermined amounts using two different copolymer-linked oligonucleotides and an unmodified copolymer.
Claims (41)
（ａ）Ｎ種のタイプのオリゴヌクレオチドのうちの１つを、活性化された末端基を有するＰＥＯ−およびＰＰＯ−含有トリブロックまたはジブロック共重合体に結合し、Ｎ種のタイプの共重合体結合オリゴヌクレオチドを形成させるステップ；
（ｂ）Ｎ種のタイプの共重合体結合オリゴヌクレオチドを溶液中で混合するステップであって、各タイプの共重合体結合オリゴヌクレオチドの数が規定の比率に相当するように、各タイプの共重合体結合オリゴヌクレオチドが生体分子の１タイプに対応するステップ；
（ｃ）基材を、前記共重合体が基材に吸着されるために十分な時間だけ共重合体結合オリゴヌクレオチドの混合物に接触させるステップ；
（ｄ）Ｎ種のタイプの生体分子を相補的オリゴヌクレオチドに結合させて生体分子結合オリゴヌクレオチドを形成させるステップであって、各タイプの生体分子が対応する共重合体結合オリゴヌクレオチドに相補的なオリゴヌクレオチドに結合されるステップ；および
（ｅ）生体分子結合オリゴヌクレオチドを共重合体結合オリゴヌクレオチドとハイブリッド形成させるステップ；
からなり、ステップ（ａ）〜（ｄ）を任意の順序で実施可能な方法。A method of immobilizing a plurality (N types) of biomolecules together on a substrate at a prescribed ratio,
(A) attaching one of the N types of oligonucleotides to PEO- and PPO-containing triblock or diblock copolymers having activated end groups to form N types of copolymers; Forming a coalesced binding oligonucleotide;
(B) mixing N types of copolymer-bound oligonucleotides in a solution, wherein each type of copolymer-bound oligonucleotides corresponds to a specified ratio; The polymer-linked oligonucleotide corresponds to one type of biomolecule;
(C) contacting the substrate with the mixture of copolymer-bound oligonucleotides for a time sufficient for the copolymer to be adsorbed to the substrate;
(D) binding the N types of biomolecules to complementary oligonucleotides to form biomolecule-bound oligonucleotides, wherein each type of biomolecule is complementary to a corresponding copolymer-bound oligonucleotide; Being bound to the oligonucleotide; and (e) hybridizing the biomolecule-bound oligonucleotide with the copolymer-bound oligonucleotide;
And wherein steps (a) to (d) can be performed in any order.
（ａ）基材を、活性化された末端基を有するＰＥＯ−およびＰＰＯ−含有トリブロックまたはジブロック共重合体に、該共重合体が基材に吸着されるために十分な時間だけ接触させるステップ；
（ｂ）Ｎ種のタイプの第１のオリゴヌクレオチドのうちの１つを、前記共重合体の各々の活性化された末端基に結合するステップであって、各タイプの第１のオリゴヌクレオチドの数が規定の比率に相当するように、各タイプの第１のオリゴヌクレオチドが生体分子の１タイプに対応するステップ；
（ｃ）生体分子を第２のオリゴヌクレオチドに結合するステップであって、各タイプの生体分子が、対応する第１のオリゴヌクレオチドに相補的な第２のオリゴヌクレオチドに結合されるステップ；および
（ｄ）第２のオリゴヌクレオチドを第１のオリゴヌクレオチドとハイブリッド形成させるステップ；
からなり、ステップ（ａ）〜（ｄ）を任意の順序で実施可能な方法。A method of immobilizing a plurality (N types) of biomolecules together on a substrate at a prescribed ratio,
(A) contacting a substrate with a PEO- and PPO-containing triblock or diblock copolymer having activated end groups for a time sufficient for the copolymer to be adsorbed to the substrate; Steps;
(B) attaching one of the N types of first oligonucleotides to an activated end group of each of said copolymers, wherein each type of first oligonucleotides comprises A first oligonucleotide of each type corresponding to one type of biomolecule such that the number corresponds to a defined ratio;
(C) binding a biomolecule to a second oligonucleotide, wherein each type of biomolecule is bound to a second oligonucleotide complementary to the corresponding first oligonucleotide; and d) hybridizing the second oligonucleotide with the first oligonucleotide;
And wherein steps (a) to (d) can be performed in any order.
（ａ）基材；
（ｂ）基材に吸着されたＰＥＯ−およびＰＰＯ−含有トリブロックまたはジブロック共重合体；
（ｃ）共重合体に結合される第１のオリゴヌクレオチド；および
（ｄ）第１のオリゴヌクレオチドとハイブリッド形成する第２のオリゴヌクレオチド；
からなり、
第２のオリゴヌクレオチドが細胞の付着を促進する生体分子に結合される表面。A surface to which cells attach,
(A) a substrate;
(B) PEO- and PPO-containing triblock or diblock copolymers adsorbed on a substrate;
(C) a first oligonucleotide that is bound to the copolymer; and (d) a second oligonucleotide that hybridizes with the first oligonucleotide;
Consisting of
A surface to which a second oligonucleotide is attached to a biomolecule that promotes cell attachment.
（ａ）Ｎ種のタイプのオリゴヌクレオチドのうちの１つを、活性化された末端基を有するＰＥＯ−およびＰＰＯ−含有トリブロックまたはジブロック共重合体に結合し、Ｎ種のタイプの共重合体結合オリゴヌクレオチドを形成させるステップと；
（ｂ）Ｎ種のタイプの共重合体結合オリゴヌクレオチドを溶液中で混合するステップであって、各タイプの共重合体結合オリゴヌクレオチドの数が規定の比率に相当するように、各タイプの共重合体結合オリゴヌクレオチドが生体分子の１タイプに対応するステップと；
（ｃ）基材を、前記共重合体が基材に吸着されるために十分な時間だけ共重合体結合オリゴヌクレオチドの混合物に接触させるステップと；
（ｄ）Ｎ種のタイプの生体分子を相補的オリゴヌクレオチドに結合させて生体分子結合オリゴヌクレオチドを形成させるステップであって、各タイプの生体分子が対応する共重合体結合オリゴヌクレオチドに相補的なオリゴヌクレオチドに結合されるステップと；
からなる方法。A method of producing a surface for growth, directing cell behavior, or analyzing cells, comprising a plurality of (N species) types of biomolecules in a defined ratio,
(A) attaching one of the N types of oligonucleotides to PEO- and PPO-containing triblock or diblock copolymers having activated end groups to form N types of copolymers; Forming a coalesced binding oligonucleotide;
(B) mixing N types of copolymer-bound oligonucleotides in a solution, wherein each type of copolymer-bound oligonucleotides corresponds to a specified ratio; The polymer-linked oligonucleotide corresponds to one type of biomolecule;
(C) contacting the substrate with the mixture of copolymer-bound oligonucleotides for a time sufficient for the copolymer to be adsorbed to the substrate;
(D) binding the N types of biomolecules to complementary oligonucleotides to form biomolecule-bound oligonucleotides, wherein each type of biomolecule is complementary to a corresponding copolymer-bound oligonucleotide; Being bound to an oligonucleotide;
Method consisting of.
（ｂ）基材に吸着されるＰＥＯ−およびＰＰＯ−含有トリブロックまたはジブロック共重合体；
（ｃ）共重合体に結合される第１のオリゴヌクレオチド；および
（ｄ）第１のオリゴヌクレオチドとハイブリッド形成する第２のオリゴヌクレオチド；
からなる表面であって、
第２のオリゴヌクレオチドが生体分子に結合される表面。(A) a substrate;
(B) PEO- and PPO-containing triblock or diblock copolymers adsorbed on the substrate;
(C) a first oligonucleotide that is bound to the copolymer; and (d) a second oligonucleotide that hybridizes with the first oligonucleotide;
A surface consisting of
A surface to which a second oligonucleotide is attached to a biomolecule.
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