JPH08319300A - Immobilization of lectin and base for cell using the same - Google Patents
Immobilization of lectin and base for cell using the sameInfo
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- JPH08319300A JPH08319300A JP8059695A JP5969596A JPH08319300A JP H08319300 A JPH08319300 A JP H08319300A JP 8059695 A JP8059695 A JP 8059695A JP 5969596 A JP5969596 A JP 5969596A JP H08319300 A JPH08319300 A JP H08319300A
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Abstract
Description
【０００１】[0001]
【発明の属する技術分野】本発明は、レクチンの固定化
法、特にレクチンと糖鎖との特異的結合性を利用した固
定化法、及びこの固定化法を用いてレクチンを固定化し
た細胞用基材に関する。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a method for immobilizing a lectin, particularly an immobilization method utilizing the specific binding property between a lectin and a sugar chain, and a cell for immobilizing a lectin using the immobilization method. Regarding the substrate.
【０００２】[0002]
【従来の技術】生体内には、酵素反応、抗原−抗体反応
等の様々な特異的反応が存在し、精致な生体系をかたち
づくっているが、今日それらの生体反応をモデルとする
バイオミメティックなシステムの研究が種々の分野で盛
んに行われている。2. Description of the Related Art Various specific reactions such as enzyme reaction and antigen-antibody reaction exist in the living body to form a delicate biological system. Today, biomimetic analysis using these biological reactions as a model. Research on high-quality systems is actively carried out in various fields.
【０００３】中でも、近年の糖鎖工学の進歩には目ざま
しいものがあり、例えば、糖鎖を有する生体高分子とし
ては、細胞の安定化に寄与する植物細胞の細胞壁のプロ
テオグリカン、細胞の分化、増殖、接着、移動等に影響
を与える糖脂質、及び細胞間相互作用や細胞認識に関与
している糖タンパク質等が挙げられるが、これらの高分
子の糖鎖が、互いに機能を代行、補助、増幅、調節、あ
るいは阻害しあいながら高度で精密な生体反応を制御す
る機構が次第に明らかにされつつある。Among them, there have been remarkable advances in sugar chain engineering in recent years. For example, as a biopolymer having a sugar chain, a proteoglycan in the cell wall of a plant cell that contributes to cell stabilization, differentiation and proliferation of cells. , Glycolipids that affect adhesion, migration, etc., and glycoproteins that are involved in cell-cell interaction and cell recognition, etc. Mechanisms that control advanced and precise biological reactions while regulating, or interfering with each other are gradually being clarified.
【０００４】その一例として、細胞表面の糖鎖や、糖鎖
-レセプター間の相互作用異常による疾病の発生、ある
いはエイズなどのウイルス感染における糖鎖の役割等に
関する研究が活発化してきている。また、細胞-細胞間
相互作用、細胞-マトリックス間相互作用における糖鎖
の関与に関する研究も、生体反応を理解する上で重要に
なってきている。[0004] As one example, sugar chains on the cell surface and sugar chains
-Research on the role of sugar chains in the occurrence of diseases caused by abnormal interactions between receptors or in the infection of viruses such as AIDS is becoming active. In addition, studies on the involvement of sugar chains in cell-cell interactions and cell-matrix interactions have also become important for understanding biological reactions.
【０００５】本発明者らは、従来から糖鎖の特異的な親
和力に着目し鋭意研究を行ってきており、例えば、アシ
アロ糖タンパク質（ＡＳＧＰと略記）レセプターに対す
るリガンドのモデルとして、ガラクトースを側鎖に有す
るポリマーであるポリ（Ｎ-ｐ-ビニルベンジル-［Ｏ-β
-ガラクトピラノシル-（１→４）-Ｄ-グルコンアミ
ド］）（通称：ポリビニルベンジルラクトンアミド、以
後ＰＶ-ＬＡと略記）を設計・合成した。The inventors of the present invention have been conducting intensive research focusing on the specific affinity of sugar chains. For example, galactose is used as a model of a ligand for an asialoglycoprotein (abbreviated as ASGP) receptor. (N-p-vinylbenzyl- [O-β
-Galactopyranosyl- (1 → 4) -D-gluconamide]) (common name: polyvinylbenzyl lactone amide, hereinafter abbreviated as PV-LA) was designed and synthesized.
【０００６】上記のＰＶ-ＬＡを被覆したシャーレを用
いることにより、ＰＶ-ＬＡと肝実質細胞表面のアシア
ロ糖タンパク質レセプターとの特異的親和力を介して肝
実質細胞が選択的に接着され、しかもその接着形態が特
徴的であって三次元の自己集合体が導かれることを見い
だした。これらの現象は、例えばコラーゲン、ファイブ
ロネクチン等の従来の接着タンパク質を被覆したシャー
レでは観察されないものである（由良洋文、赤池敏宏、
「細胞培養」、第１９巻、３１７−３２２頁、１９９３
年）。[0006] By using the above petri dish coated with PV-LA, hepatocytes are selectively adhered to each other through the specific affinity between PV-LA and the asialoglycoprotein receptor on the surface of hepatocytes. We found that the adhesive morphology is characteristic and leads to a three-dimensional self-assembly. These phenomena are not observed in a petri dish coated with a conventional adhesive protein such as collagen or fibronectin (Yoshifumi Yura, Toshihiro Akaike,
"Cell Culture", Vol. 19, pp. 317-322, 1993.
Year).
【０００７】一方、主に植物を起源とするレクチンは、
多糖類や複合糖類を沈降させる等の糖鎖に対する特異的
結合性を有することがしられており、不溶化レクチンを
用いて複合糖類を分離する試みなどが行われている。し
かしながら従来は、レクチンを固定化する際に、基材に
レクチンを単純に吸着させるか、基材に共有結合させる
等の方法が用いられていた。単に吸着させただけでは、
レクチンを安定かつ強固に固定化することは困難であ
り、共有結合させる場合は、手間のかかる化学反応を経
なければならなかった。そこで本発明者らは、上記の事
情に鑑み、糖鎖高分子を用いてレクチンを安定かつ強固
に固定化する方法を見いだし本発明をなすに至った。On the other hand, lectins mainly originating from plants are
It is known to have specific binding properties to sugar chains such as precipitation of polysaccharides and complex saccharides, and attempts have been made to separate complex saccharides using an insolubilized lectin. However, conventionally, when immobilizing the lectin, a method has been used in which the lectin is simply adsorbed on the substrate or covalently bound to the substrate. Simply by adsorbing,
It was difficult to immobilize the lectin stably and firmly, and when covalently binding it, a complicated chemical reaction had to be performed. Therefore, in view of the above circumstances, the present inventors have found a method of stably and firmly immobilizing a lectin using a sugar chain polymer, and completed the present invention.
【０００８】[0008]
【発明が解決しようとする課題】よって、本発明の課題
は、レクチンを効率よく安定に固定化または濃縮できる
新規な方法を提供し、加えてその固定化法を用いてレク
チンを固定化した細胞用基材を提供することにある。Therefore, an object of the present invention is to provide a novel method capable of efficiently and stably immobilizing or concentrating a lectin, and in addition, a cell to which a lectin is immobilized by using the immobilization method. The purpose is to provide a substrate for use.
【０００９】[0009]
【課題を解決するための手段】かかる課題は、固定化す
べきレクチンと特異的に結合する糖鎖を有する糖鎖高分
子を基材に吸着させ、その糖鎖高分子を介して該レクチ
ンを固定化することからなるレクチンの固定化法によっ
て解決できる。[Means for Solving the Problems] This problem is caused by adsorbing a sugar chain polymer having a sugar chain that specifically binds to a lectin to be immobilized on a substrate and immobilizing the lectin via the sugar chain polymer. It can be solved by a method of immobilizing lectin, which comprises
【００１０】[0010]
【発明の実施の形態】以下に、本発明のレクチン固定化
法を図面を参照して詳細に説明する。図１に示すよう
に、本発明の固定化法では、まず基材１表面に、糖鎖２
１が高分子主鎖２２に結合されてなる糖鎖高分子２を吸
着させる。ここで用いられる糖鎖高分子２は、合成高分
子主鎖２２とそれに結合された糖鎖２１とから構成され
ている。次に、糖鎖高分子２の糖鎖２１に固定化すべき
レクチン３を特異的に結合させる。BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION The lectin immobilization method of the present invention will be described in detail below with reference to the drawings. As shown in FIG. 1, in the immobilization method of the present invention, first, a sugar chain 2 is formed on the surface of the substrate 1.
The sugar chain polymer 2 in which 1 is bonded to the polymer main chain 22 is adsorbed. The sugar chain polymer 2 used here is composed of a synthetic polymer main chain 22 and a sugar chain 21 bonded thereto. Next, the lectin 3 to be immobilized is specifically bound to the sugar chain 21 of the sugar chain polymer 2.
【００１１】本発明で使用される糖鎖高分子の主鎖は、
側鎖として糖鎖を導入でき、通常の方法で重合可能なも
のならば特に限られないが、例えばポリスチレン、塩化
ビニル、ポリエチレン、ポリエチレンテレフタレート、
ポリプロピレン、またはそれらの誘導体等のビニル系の
高分子を用いるのが好ましい。特に、シャーレ等の材料
として広く使用されているポリスチレンまたはその誘導
体からなる合成高分子を使用した場合には、そのシャー
レ等の表面に対する吸着性が向上するので好ましい。The main chain of the sugar chain polymer used in the present invention is
A sugar chain can be introduced as a side chain, and it is not particularly limited as long as it can be polymerized by an ordinary method, for example, polystyrene, vinyl chloride, polyethylene, polyethylene terephthalate,
It is preferable to use a vinyl polymer such as polypropylene or a derivative thereof. In particular, it is preferable to use a synthetic polymer composed of polystyrene or a derivative thereof which is widely used as a material for petri dishes because the adsorptivity to the surfaces of petri dishes and the like is improved.
【００１２】また、この糖鎖高分子をなす糖鎖として
は、グルコース、ガラクトース、ラクトース、マンノー
ス、Ｎ-アセチルグルコサミン、ラミナリビオース、ウ
ロン酸関連物質、硫酸糖等の単糖類、オリゴ糖類等がい
ずれも使用でき、上記合成高分子に側鎖として結合した
状態で、レクチンと特異的に結合する糖残基を保持でき
るものならば、特に限定されるものではない。As the sugar chain forming the sugar chain polymer, glucose, galactose, lactose, mannose, N-acetylglucosamine, laminaribiose, uronic acid-related substances, monosaccharides such as sulfated sugars, oligosaccharides, etc. Any of them can be used, and is not particularly limited as long as it can retain a sugar residue that specifically binds to a lectin in a state of being bound as a side chain to the synthetic polymer.
【００１３】本発明で用いる糖鎖高分子２において、高
分子主鎖２２と糖鎖２１との結合方法は、アミド結合、
エーテル結合、エステル結合等の共有結合とするのが好
ましい。例えば、ｐ-アミノメチルスチレンのアミノ基
と、ラクトン化した糖の末端カルボニル基間でアミド結
合を形成するのが好ましい。また、この高分子主鎖と糖
鎖とは、合成高分子をなすモノマーと糖鎖分子とを結合
させてから重合してもよいし、結合可能な官能基を有す
るモノマーを重合した後に糖鎖を結合させてもよい。但
し、１分子中に導入される糖鎖の数を制御できることか
ら、糖鎖を結合させたモノマーを重合するのが好まし
い。In the sugar chain polymer 2 used in the present invention, the polymer main chain 22 and the sugar chain 21 are bound by an amide bond,
A covalent bond such as an ether bond or an ester bond is preferable. For example, it is preferable to form an amide bond between the amino group of p-aminomethylstyrene and the terminal carbonyl group of the lactonized sugar. Further, the polymer main chain and the sugar chain may be polymerized after the monomer forming the synthetic polymer and the sugar chain molecule are bonded, or the sugar chain may be polymerized after the monomer having a functional group capable of being bonded is polymerized. May be combined. However, since the number of sugar chains introduced into one molecule can be controlled, it is preferable to polymerize a monomer having a sugar chain bonded thereto.
【００１４】また、この糖鎖高分子は、レクチンを高濃
度に固定化、濃縮する場合は、糖鎖を結合させたモノマ
ーを単独重合させたホモポリマーとし、吸着する糖鎖密
度を高くするのが好ましく、逆に、レクチンを疎に固定
化したい場合は、他のモノマーと共重合体として糖鎖の
数を減らしてもよい。さらに、親水性等の他の性質を有
する他のモノマーとの共重合体とすることにより、吸着
した基材表面に親水性等の他の性質を付与するようにし
てもよい。Further, in the case of immobilizing and concentrating lectin at a high concentration, the sugar chain polymer is a homopolymer obtained by homopolymerizing a monomer to which a sugar chain is bound to increase the density of adsorbed sugar chains. On the contrary, when it is desired to immobilize the lectin loosely, the number of sugar chains may be reduced as a copolymer with another monomer. Further, by forming a copolymer with another monomer having other properties such as hydrophilicity, other properties such as hydrophilicity may be imparted to the surface of the adsorbed substrate.
【００１５】本発明の固定化法にあっては、上記のよう
な糖鎖高分子の中で、例えば、下記式（１）から（１
０）で表される糖鎖高分子が特に好適に用いられる。In the immobilization method of the present invention, among the above sugar chain polymers, for example, the following formulas (1) to (1)
The sugar chain polymer represented by 0) is particularly preferably used.
【００１６】[0016]
【化１】 Embedded image
【００１７】[0017]
【化２】 Embedded image
【００１８】[0018]
【化３】 Embedded image
【００１９】[0019]
【化４】 [Chemical 4]
【００２０】[0020]
【化５】 Embedded image
【００２１】[0021]
【化６】 [Chemical 6]
【００２２】[0022]
【化７】 [Chemical 7]
【００２３】[0023]
【化８】 Embedded image
【００２４】[0024]
【化９】 [Chemical 9]
【００２５】[0025]
【化１０】 [Chemical 10]
【００２６】上記式（１）で表されるポリ（Ｎ-ｐ-ビニ
ルベンジル-［Ｏ-β-Ｄ-ガラクトピラノシル-（１→
４）-Ｄ-グルコンアミド］）（以後、ＰＶ-ＬＡと略記
する）は、ｐ-アミノメチルスチレンとラクトースとか
ら合成されたモノマーを単独重合して得られるもので、
β-ガラクトース残基を有する。Poly (Np-vinylbenzyl- [O-β-D-galactopyranosyl- (1 →
4) -D-Gluconamide]) (hereinafter abbreviated as PV-LA) is obtained by homopolymerizing a monomer synthesized from p-aminomethylstyrene and lactose,
It has a β-galactose residue.
【００２７】上記式（２）で表されるポリ（Ｎ-ｐ-ビニ
ルベンジル-［Ｏ-α-Ｄ-グルコピラノシル-（１→４）-
Ｄ-グルコンアミド］）（以後、ＰＶ-ＭＡと略記する）
は、ｐ-アミノメチルスチレンとマルトースとから合成
されたモノマーを単独重合して得られるもので、グルコ
ース残基を有する。Poly (N-p-vinylbenzyl- [O-α-D-glucopyranosyl- (1 → 4)-] represented by the above formula (2)
D-Gluconamide]) (hereinafter abbreviated as PV-MA)
Is obtained by homopolymerizing a monomer synthesized from p-aminomethylstyrene and maltose, and has a glucose residue.
【００２８】上記式（３）で表されるポリ（Ｎ-ｐ-ビニ
ルベンジル-［Ｏ-β-Ｄ-マンノピラノシル-（１→４）-
Ｄ-マンナミド］）（以後、ＰＶ-Ｍａｎと略記する）
は、ｐ-アミノメチルスチレンとマンノビオースとから
合成されたモノマーを単独重合して得られるもので、マ
ンノース残基を有する。Poly (Np-vinylbenzyl- [O-β-D-mannopyranosyl- (1 → 4)-] represented by the above formula (3)
D-mannamide]) (hereinafter abbreviated as PV-Man)
Is obtained by homopolymerizing a monomer synthesized from p-aminomethylstyrene and mannobiose, and has a mannose residue.
【００２９】上記式（４）で表されるポリ（Ｎ-ｐ-ビニ
ルベンジル-［Ｏ-α-Ｄ-ガラクトピラノシル-（１→
６）-Ｄ-グルコンアミド］）（以後、ＰＶ-ＭｅＡと略
記する）は、ｐ-アミノメチルスチレンとＯ-α-Ｄ-ガタ
クトピラノシル-（１→６）-Ｄ-グルコースとから合成
されたモノマーを単独重合して得られるもので、α-ガ
ラクトース残基を有する。Poly (Np-vinylbenzyl- [O-α-D-galactopyranosyl- (1 →
6) -D-Gluconamide]) (hereinafter abbreviated as PV-MeA) is composed of p-aminomethylstyrene and O-α-D-galactopyranosyl- (1 → 6) -D-glucose. It is obtained by homopolymerizing a synthesized monomer and has an α-galactose residue.
【００３０】上記式（５）で表されるポリ（Ｎ-ｐ-ビニ
ルベンジル-［Ｏ-６-カルボキシメチル-β-Ｄ-ガラクト
ピラノシル-（１→４）-Ｏ-Ｄ-６-カルボキシメチル-グ
ルコンアミド］）（以後、ＰＶ-ＬＡＣＯＯＨと略記す
る）は、ｐ-アミノメチルスチレンとラクトースとから
合成されたモノマーを単独重合して得られたＰＶ-ＬＡ
をカルボキシルメチル化したもので、カルボキシメチル
化-β-ガラクトース残基を有する。Poly (N-p-vinylbenzyl- [O-6-carboxymethyl-β-D-galactopyranosyl- (1 → 4) -OD-6-represented by the above formula (5) Carboxymethyl-gluconamide]) (hereinafter abbreviated as PV-LACOOH) is PV-LA obtained by homopolymerizing a monomer synthesized from p-aminomethylstyrene and lactose.
Carboxymethylated with carboxymethylated-β-galactose residue.
【００３１】上記式（６）で表されるポリ（３-Ｏ-４’
-ビニルベンジル-Ｄ-グルコース）（以後、ＰＶ-Ｇと略
記する）は、ｐ-クロロメチルスチレンとグルコースと
から合成されたモノマーを単独重合して得られるもの
で、グルコース残基を有する。Poly (3-O-4 'represented by the above formula (6)
-Vinylbenzyl-D-glucose) (hereinafter abbreviated as PV-G) is obtained by homopolymerizing a monomer synthesized from p-chloromethylstyrene and glucose, and has a glucose residue.
【００３２】上記式（７）で表されるポリ（Ｎ-ｐ-ビニ
ルベンジル-［Ｏ-２-アセトアミド-２-デオキシ-β-Ｄ-
グルコピラノシル-（１→４）-Ｏ-Ｄ-２-アセトアミド-
２-デオキシ-β-Ｄ-グルコピラノシル-（１→４）-Ｏ-
Ｄ-２-アセトアミド-２-デオキシ-β-Ｄ-グルコンアミ
ド］）、上記式（８）で表されるポリ（Ｎ-ｐ-ビニルベ
ンジル-［Ｏ-Ｄ-２-アセトアミド-２-デオキシ-β-Ｄ-
グルコピラノシル-（１→４）-Ｏ-Ｄ-２-アセトアミド-
２-デオキシ-β-Ｄ-グルコンアミド］）、またはそれら
の混合物（以後、いずれもＰＶ-ＧｌｃＮａｃと略記す
る）は、ともにＮ-アセチルグルコサミン残基を有す
る。Poly (Np-vinylbenzyl- [O-2-acetamido-2-deoxy-β-D-represented by the above formula (7)
Glucopyranosyl- (1 → 4) -OD-2-acetamido-
2-deoxy-β-D-glucopyranosyl- (1 → 4) -O-
D-2-acetamido-2-deoxy-β-D-gluconamide]), poly (Np-vinylbenzyl- [O-D-2-acetamido-2-deoxy-] represented by the above formula (8). β-D-
Glucopyranosyl- (1 → 4) -OD-2-acetamido-
2-deoxy-β-D-gluconamide]), or a mixture thereof (hereinafter abbreviated as PV-GlcNac) both have N-acetylglucosamine residues.
【００３３】上記式（９）で表されるポリ（Ｎ-ｐ-ビニ
ルベンジル-Ｄ-グルコンアミド）（以後、ＰＶ-ＧＡと
略記する）は、Ｄ-グルコースを開環させてｐ-アミノメ
チルスチレンと結合させたモノマーを単独重合して得ら
れるものである。The poly (N-p-vinylbenzyl-D-gluconamide) represented by the above formula (9) (hereinafter abbreviated as PV-GA) is prepared by opening D-glucose to form p-aminomethyl. It is obtained by homopolymerizing a monomer bound to styrene.
【００３４】上記式（１０）で表されるポリ（Ｎ-ｐ-ビ
ニルベンジル-［Ｏ-β-Ｄ-グルコピラノシル-（１→
３）-Ｄ-グルコンアミド］）（以後、ＰＶ-Ｌａｍと略
記する）は、ｐ-アミノメチルスチレンとラミナリビオ
ースとから合成されたモノマーを単独重合して得られる
もので、β１→３グルコース残基を有する。Poly (Np-vinylbenzyl- [O-β-D-glucopyranosyl- (1 →
3) -D-Gluconamide]) (hereinafter abbreviated as PV-Lam) is obtained by homopolymerizing a monomer synthesized from p-aminomethylstyrene and laminaribiose, and β1 → 3 glucose Have residues.
【００３５】本発明の固定化法では、これらの糖鎖高分
子の中で、固定化したいレクチンと特異的結合する糖鎖
を有する糖鎖高分子を選択して吸着させる。用いる糖鎖
高分子は、１種のみでも２種以上を混合して用いてもよ
く、その使用目的に応じて適宜選択できる。In the immobilization method of the present invention, of these sugar chain polymers, a sugar chain polymer having a sugar chain that specifically binds to the lectin to be immobilized is selected and adsorbed. The sugar chain polymer to be used may be used alone or in combination of two or more, and can be appropriately selected according to the purpose of use.
【００３６】これらの糖鎖高分子を基材に吸着させるに
は、シャーレ等の基材１表面に糖鎖高分子溶液を適用
し、溶媒を留去することにより容易に吸着させることが
できる。例えば、蒸留水を溶媒とする糖鎖高分子溶液
を、ろ過、滅菌した後、シャーレ等に注入し、室温で２
時間程度放置するだけでよい。吸着後、好ましくは、蒸
留水で数回洗浄し、平衡塩溶液等で置換しておく。糖鎖
高分子を溶解する溶媒としては水が好ましいが、用いる
糖鎖高分子によっては、ジメチルホルムアミド、ジメチ
ルスルホキシド、エタノール、メタノール等の有機溶媒
やそれらと水との混合溶媒も使用できる。In order to adsorb these sugar chain macromolecules on the base material, a sugar chain macromolecule solution is applied to the surface of the base material 1 such as a petri dish and the solvent is distilled off, whereby the sugar chain macromolecules can be easily adsorbed. For example, a sugar chain polymer solution using distilled water as a solvent is filtered and sterilized, and then poured into a petri dish or the like, and the solution is allowed to stand at room temperature for 2 hours.
All you have to do is leave it for about an hour. After adsorption, it is preferably washed several times with distilled water and replaced with a balanced salt solution or the like. Water is preferable as the solvent for dissolving the sugar chain polymer, but depending on the sugar chain polymer to be used, an organic solvent such as dimethylformamide, dimethylsulfoxide, ethanol, methanol, or a mixed solvent thereof with water can also be used.
【００３７】上記の糖鎖高分子溶液の濃度は、固定化し
たいレクチンの密度に応じて適宜選択されるが、通常
は、０．００１から１．０ｍｇ／ｍｌ程度とされる。ま
た、この糖鎖高分子溶液は、その都度調整してもよい
が、ストック溶液として保存しておいたものを使用すれ
ば、さらに手間を省くことができる。その場合は、スト
ック溶液中の糖鎖高分子が会合している場合があるの
で、使用前に適度な超音波処理等を施すのが好ましい。The concentration of the sugar chain polymer solution is appropriately selected depending on the density of the lectin to be immobilized, but is usually about 0.001 to 1.0 mg / ml. Further, this sugar chain polymer solution may be adjusted each time, but if the stock solution stored is used, the labor can be further saved. In that case, sugar chain macromolecules in the stock solution may be associated with each other, and therefore, it is preferable to perform appropriate ultrasonic treatment before use.
【００３８】このようにして糖鎖高分子２を吸着させた
基材１表面は、選択した糖鎖高分子２に固有の糖鎖２１
で修飾されている。次に、この糖鎖２１で修飾された基
材１にレクチン３を固定化する。これを行うには、レク
チンの水溶液を糖鎖高分子吸着させた基材に適用し、溶
媒を留去すればよい。The surface of the substrate 1 on which the sugar chain polymer 2 is adsorbed in this manner is a sugar chain 21 specific to the selected sugar chain polymer 2.
Is qualified with. Next, the lectin 3 is immobilized on the base material 1 modified with the sugar chain 21. To do this, an aqueous solution of lectin may be applied to the base material on which the sugar chain polymer is adsorbed, and the solvent may be distilled off.
【００３９】レクチン水溶液を糖鎖高分子修飾基材に適
用すると、水溶液中のレクチン３が、基材１表面に吸着
された糖鎖高分子２の糖鎖２１に到達する。この糖鎖２
１は、該レクチンと特異的に結合するものが選択されて
いるため、該レクチン３は、この糖鎖２１と強固に結合
して固定化される。When the aqueous lectin solution is applied to the sugar chain polymer-modified substrate, the lectin 3 in the aqueous solution reaches the sugar chain 21 of the sugar chain polymer 2 adsorbed on the surface of the substrate 1. This sugar chain 2
Since 1 is selected to specifically bind to the lectin, the lectin 3 is firmly bound to the sugar chain 21 and immobilized.
【００４０】本発明で固定化されるレクチンは、何ら限
定されるものではなく、各レクチンと特異的に結合する
糖鎖を有する糖鎖高分子を介して良好に固定化される。
例えば、ガラクトース残基を有するＰＶ-ＬＡを吸着さ
せた基材には、ガラクトース結合性レクチンであるＳＢ
Ａ、ＥＣＬ、Ａｌｌｏ Ａ、ＶＡＡ等のレクチンを選択
的に固定化することができ、グルコース残基を有するＰ
Ｖ-ＭＡを吸着させた基材には、ＧＮＬ、ＬｃＨ、ＰＳ
Ａ等のレクチンを、マンノース残基を有するＰＶ-Ｍａ
ｎを吸着させた基材には、ＬＣＡ、ＧＮＡ、ＣＰＡ等の
レクチンを選択的に固定化できる。即ち、異なる種類の
レクチンを含む溶液を適用したとしても、吸着させた糖
鎖に特異的に結合するレクチンのみを選択的に固定化す
ることも可能である。The lectin to be immobilized in the present invention is not limited at all, and is favorably immobilized via a sugar chain polymer having a sugar chain that specifically binds to each lectin.
For example, the substrate on which PV-LA having a galactose residue is adsorbed is SB which is a galactose-binding lectin.
P that has a glucose residue and can selectively immobilize lectins such as A, ECL, Allo A, and VAA.
The base material on which V-MA is adsorbed includes GNL, LcH, PS
PV-Ma having a mannose residue for lectins such as A
Lectins such as LCA, GNA, and CPA can be selectively immobilized on the substrate on which n is adsorbed. That is, even if a solution containing different types of lectins is applied, it is possible to selectively immobilize only the lectins that specifically bind to the adsorbed sugar chains.
【００４１】本発明は、上記の固定化法で表面にレクチ
ンを固定化した細胞用基材にも関する。レクチンを固定
化する基材としては、シャーレ、フラスコ、プレート、
キュベット、フィルム、ファイバー、またはビーズ等の
従来から細胞培養に用いられている基材が好ましいが、
それらに限られず、用途に応じていかなる形状の基材も
使用できる。これらの基材は、ガラス、石英等の無機材
料、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン等の
有機材料のいずれからなっていてもよいが、滅菌可能な
程度の耐熱性及び耐水性を有している材料からなるのが
好ましい。The present invention also relates to a cell substrate having a lectin immobilized on its surface by the above-mentioned immobilization method. As a substrate for immobilizing the lectin, a petri dish, a flask, a plate,
Base materials conventionally used for cell culture such as cuvettes, films, fibers, or beads are preferable,
Not limited to these, a base material having any shape can be used depending on the application. These base materials may be made of any of inorganic materials such as glass and quartz, and organic materials such as polystyrene, polypropylene, and polyethylene, but from materials having heat resistance and water resistance that are sterilizable. Preferably.
【００４２】特に合成高分子材料は、価格や成形性の点
から好ましく、糖鎖高分子の吸着性から疎水性のものが
好ましい。例えば、ポリスチレンやその誘導体を主鎖と
する糖鎖高分子を用いる場合には、ポリスチレン及びそ
の誘導体を主原料とする基材を使用するのが好ましい。Particularly, the synthetic polymer material is preferable in terms of cost and moldability, and is preferably hydrophobic because of sugar chain polymer adsorption. For example, when a sugar chain polymer having polystyrene or a derivative thereof as a main chain is used, it is preferable to use a base material having polystyrene or a derivative thereof as a main raw material.
【００４３】本発明の細胞用基材は、例えば図１に示す
ように、基材１表面に糖鎖高分子２が吸着され、その糖
鎖高分子２の糖鎖２１にレクチン３が固定化されてい
る。従って、この細胞用基材表面は、固定化されたレク
チンの種類によって異なる糖への特異的結合性を有して
いる。例えば、ガラクトース残基を有する糖鎖高分子で
あるＰＶ-ＬＡを介してガラクトース結合性レクチンを
固定化した細胞用基材上には、表面にガラクトースを表
現している成熟Ｔ-細胞等を選択的に接着させることが
できる。In the cell substrate of the present invention, for example, as shown in FIG. 1, the sugar chain polymer 2 is adsorbed on the surface of the substrate 1 and the lectin 3 is immobilized on the sugar chain 21 of the sugar chain polymer 2. Has been done. Therefore, the surface of the base material for cells has specific binding properties to sugars that differ depending on the type of immobilized lectin. For example, on a substrate for cells on which a galactose-binding lectin is immobilized via PV-LA which is a sugar chain polymer having a galactose residue, mature T-cells expressing galactose on the surface are selected. Can be adhered to each other.
【００４４】このような細胞用基材にあっては、例え
ば、吸着させる糖鎖高分子の濃度や組成を変えることに
よって、固定化するレクチンの密度を容易に調整するこ
とができる。また、レクチンは基材表面に濃縮され、そ
の活性サイトが集中しているので、例えば細胞を効果的
に凝集させたり活性化したりすることができる。In such a cell substrate, the density of the immobilized lectin can be easily adjusted by changing the concentration or composition of the sugar chain polymer to be adsorbed. In addition, since the lectin is concentrated on the surface of the base material and its active sites are concentrated, it is possible to effectively aggregate or activate cells, for example.
【００４５】[0045]
（実施例１）上記式（１）に示す糖鎖高分子（ＰＶ-Ｌ
Ａ）を合成し、それに黄色蛍光色素であるフルオレセイ
ンイソチオシアネート（ＦＩＴＣと略記）を導入した。
即ち、３滴のピリジンを添加した５ｍｌの乾燥ジメチル
スルホキシドに５００ｍｇのＰＶ-ＬＡ（１０×１０-3
モルのモノマーユニットに対応する）を溶解した。その
溶液に５０ｍｇのＦＩＴＣ（和光純薬工業製）加え、さ
らに１５ｍｇのジブチルスズジラウレートを加えた後、
９０℃で２時間加熱した。得られた反応混合液からエタ
ノール中で数回再結晶させて濾過することにより、ＦＩ
ＴＣ標識ＰＶ-ＬＡを得た。Example 1 A sugar chain polymer (PV-L represented by the above formula (1)
A) was synthesized, and fluorescein isothiocyanate (abbreviated as FITC) which is a yellow fluorescent dye was introduced thereinto.
That is, 500 mg of PV-LA (10 × 10 −3 was added to 5 ml of dry dimethyl sulfoxide added with 3 drops of pyridine.
(Corresponding to moles of monomer units). After adding 50 mg of FITC (manufactured by Wako Pure Chemical Industries) to the solution, and further adding 15 mg of dibutyltin dilaurate,
Heated at 90 ° C. for 2 hours. FI was recrystallized from the obtained reaction mixture several times and filtered to obtain FI.
TC-labeled PV-LA was obtained.
【００４６】上記ＦＩＴＣ標識ＰＶ-ＬＡを１００μｇ
／ｍｌ含む水溶液を作製し、その水溶液中に直径０．６
μｍのポリスチレン製ビーズラテックス（Polybead、ポ
リサイエンス社製）を加え、室温で２時間処理して、ポ
リスチレン製ビーズにＦＩＴＣ標識ＰＶ-ＬＡを吸着さ
せた。次に、上記液にガラクトース認識性レクチンであ
るＳＢＡ（１ｍｇ／ｍｌ）を添加して室温で保存し、Ｐ
Ｖ-ＬＡのガラクトース残基にＳＢＡを結合させてＳＢ
Ａ修飾ビーズとした。100 μg of the above-mentioned FITC-labeled PV-LA
/ Ml to prepare an aqueous solution containing 0.6
A polystyrene bead latex (Polybead, manufactured by Polyscience) having a diameter of μm was added and treated at room temperature for 2 hours to adsorb FITC-labeled PV-LA to the polystyrene beads. Next, SBA (1 mg / ml), which is a galactose-recognizing lectin, was added to the above solution and stored at room temperature.
SB by binding SBA to the galactose residue of V-LA
A modified beads were used.
【００４７】上記の液を、蒸留水を加えて１５００ｒｐ
ｍで１０分間遠心して上清みを取り除く操作により洗浄
し、１００ｎｇ／ｍｌのＳＢＡ修飾ビーズを含む液を作
製した。別に調整したヒトの末梢血単核球（ＰＢＭＣ）
懸濁液（１×１０6細胞）に、ＳＢＡ修飾ビーズ液５０
μｌを添加し、冷暗所で３０分間インキュベーションし
た。さらに、ＰＢＳを加えて１５００ｒｐｍで１０分間
遠心して上清みを取り除く操作により洗浄した後、赤色
蛍光物質であるピコエリスリン（ＰＥ）を導入した抗Ｃ
Ｄ３抗体を添加し、ＣＤ３細胞をＰＥ標識して試料とし
た。Distilled water was added to the above liquid to obtain 1500 rp.
It was washed by centrifugation for 10 minutes at m to remove the supernatant to prepare a liquid containing 100 ng / ml SBA-modified beads. Separately prepared human peripheral blood mononuclear cells (PBMC)
SBA-modified bead solution 50 was added to the suspension (1 × 10 6 cells).
μl was added and incubated for 30 minutes in the cold and dark. Furthermore, PBS was added and the mixture was centrifuged at 1500 rpm for 10 minutes to remove the supernatant, followed by washing, and then anti-C in which picoerythrin (PE), which is a red fluorescent substance, was introduced.
D3 antibody was added, and CD3 cells were PE-labeled to prepare a sample.
【００４８】比較のため、ＰＶ-ＬＡの代わりにＰＶ-Ｍ
Ａを吸着させたビーズ、またはＰＶ-ＬＡを吸着させた
後にＳＢＡを添加しなかったビーズを用いた以外は上記
と同様の処理を施して比較用の試料を用意した。各試料
の蛍光強度を、フローサイトメーター（ＦＡＣＳｃａ
ｎ、ベクトン・ディッキンソン・イムノサイトメトリー
・システム社製）で測定した。結果を図３に示す。For comparison, PV-M instead of PV-LA
A sample for comparison was prepared by performing the same treatment as above except that the beads to which A was adsorbed or the beads to which PV-LA was adsorbed and then SBA were not added were used. The fluorescence intensity of each sample was measured using a flow cytometer (FACSca
n, Becton Dickinson Immunocytometry System). The results are shown in Fig. 3.
【００４９】図３において、（Ａ）はＰＶ-ＬＡで処理
した後、ＳＢＡを添加しなかったビーズで処理した細胞
試料、（Ｂ）は本発明に従ってＰＶ-ＬＡ及びＳＢＡを
固定化したビーズで処理した細胞試料、（Ｃ）はＰＶ-
ＭＡとＳＢＡで処理したビーズで処理した細胞試料から
得られた結果である。縦軸は、抗ＣＤ３抗体に導入した
蛍光物質（ＰＥ）に基づく赤色蛍光強度を示し、横軸
は、ＰＶ-ＬＡまたはＰＶ-ＭＡに導入した蛍光物質（Ｆ
ＩＴＣ）に基づく黄色蛍光強度である。In FIG. 3, (A) is a cell sample treated with PV-LA and then treated with beads to which SBA was not added, and (B) is beads immobilized with PV-LA and SBA according to the present invention. Treated cell sample, (C) PV-
Results from cell samples treated with beads treated with MA and SBA. The vertical axis represents the red fluorescence intensity based on the fluorescent substance (PE) introduced into the anti-CD3 antibody, and the horizontal axis represents the fluorescent substance introduced into PV-LA or PV-MA (F
It is the yellow fluorescence intensity based on ITC).
【００５０】各細胞試料ともＰＥに基づく蛍光強度は強
く、即ちこれらの細胞がＴ細胞のＣＤ３細胞であること
が確認される。しかし、ＦＩＴＣに基づく蛍光強度は、
ＰＶ-ＬＡ及びＳＢＡで処理した細胞試料では強いが、
ＰＶ-ＬＡのみ、あるいはＰＶ-ＭＡ及びＳＢＡで処理し
た細胞試料ではほとんど観測されなかった。The fluorescence intensity based on PE is strong in each cell sample, that is, it is confirmed that these cells are T3 CD3 cells. However, the fluorescence intensity based on FITC is
Strong in cell samples treated with PV-LA and SBA,
Little was observed in cell samples treated with PV-LA alone or PV-MA and SBA.
【００５１】成熟したＴ細胞は、その表面にガラクトー
スを表現していることが知られている。図２に示すよう
に、本発明の固定化法によって、ビーズ６０にＰＶ-Ｌ
Ａを介してＳＢＡ３０を固定化させたＳＢＡ修飾ビーズ
は、ＳＢＡのガラクトース認識性によってＣＤ３細胞５
０の表面に存在するガラクトース残基２５に特異的に結
合する。従って、このような細胞試料では、抗ＣＤ３抗
体５１に導入したＰＥ及びＰＶ-ＬＡに導入したＦＩＴ
Ｃの両方に基づく蛍光が観察されることが証明された。It is known that mature T cells express galactose on their surface. As shown in FIG. 2, PV-L was added to the beads 60 by the immobilization method of the present invention.
The SBA-modified beads on which SBA30 was immobilized via A were detected in CD3 cells 5 by the galactose recognition property of SBA.
It specifically binds to the galactose residue 25 present on the surface of 0. Therefore, in such cell samples, PE introduced into anti-CD3 antibody 51 and FIT introduced into PV-LA.
It was demonstrated that fluorescence based on both C was observed.
【００５２】一方、ＰＶ-ＬＡを吸着させたのみでＳＢ
Ａを欠くビーズ（図３（Ａ））、及びグルコース残基を
有するＰＶ-ＭＡを吸着させ、よってＳＢＡが固定化さ
れていないビーズ（図３（Ｃ））は、ＣＤ３細胞に結合
せず、ＦＩＴＣに基づく蛍光が観察されなかったものと
考えられる。言い換えれば、本発明に従ってレクチンを
固定化した蛍光性ビーズは、表面にガラクトースを表現
している細胞に対し、そのガラクトースに特異的に結合
する標識剤として利用できることが示唆されている。On the other hand, only by adsorbing PV-LA, SB
Beads lacking A (FIG. 3 (A)) and PV-MA with glucose residues adsorbed, thus beads without SBA immobilized (FIG. 3 (C)) did not bind to CD3 cells, It is considered that no fluorescence based on FITC was observed. In other words, it is suggested that the lectin-immobilized fluorescent beads according to the present invention can be used as a labeling agent that specifically binds to galactose expressing cells on the surface of which galactose is expressed.
【００５３】（実施例２）ポリスチレン製キュベット
に、糖鎖高分子であるＰＶ-ＬＡ及びＰＶ-ＭＡを各々
１．０ｍｇ／ｍｌまでの種々の濃度で含む水溶液を一定
量注入し、室温で２時間放置することによりキュベット
表面に糖鎖高分子を吸着させた。洗浄後、ＦＩＴＣ標識
したガラクトース認識性レクチンであるＰＮＡの水溶液
（０．１％のＢＳＡ、及びＰＢＳを含む）を、各キュベ
ットに同量注入した。Example 2 A polystyrene cuvette was charged with a certain amount of an aqueous solution containing sugar chain polymers PV-LA and PV-MA at various concentrations up to 1.0 mg / ml, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 2 hours. The sugar chain polymer was adsorbed on the surface of the cuvette by leaving it for a while. After washing, an equal amount of an aqueous solution of FITC-labeled galactose-recognizing lectin PNA (containing 0.1% BSA and PBS) was injected into each cuvette.
【００５４】２時間経過後に洗浄し、２０ｍＭのガラク
トース及び５ｍＭのＥＤＴＡを含むＰＢＳを添加して３
０分間放置した。その後、キュベット表面から脱離した
ＰＮＡ量を蛍光光度計で測定し、固定化されたＰＮＡ量
を見積もった。結果を図４に示す。横軸は、糖鎖高分子
吸着時の糖鎖高分子水溶液濃度を示し、縦軸は、単位面
積当たりに固定化されたＰＮＡ量を示す。After the lapse of 2 hours, the plate was washed, and PBS containing 20 mM galactose and 5 mM EDTA was added for 3
It was left for 0 minutes. Then, the amount of PNA desorbed from the surface of the cuvette was measured with a fluorometer to estimate the amount of immobilized PNA. FIG. 4 shows the results. The horizontal axis represents the concentration of the sugar chain polymer aqueous solution at the time of adsorption of the sugar chain polymer, and the vertical axis represents the amount of PNA immobilized per unit area.
【００５５】同じくガラクトース認識性レクチンである
ＥＣＬを用い、上記と同様にしてキュベット表面に固定
化されたＥＣＬ量を見積もった。結果を図５に示す。図
４及び図５から明らかなように、ガラクトース認識性レ
クチンであるＰＮＡ及びＥＣＬは、ガラクトース残基を
有するＰＶ-ＬＡを吸着させたキュベットに優先的に固
定化される。さらに、ＰＶ-ＬＡ吸着量が多くなるにし
たがい、固定化されるレクチンの量も増加する。The amount of ECL immobilized on the surface of the cuvette was estimated in the same manner as above using ECL, which is also a galactose-recognizing lectin. Results are shown in FIG. As is clear from FIGS. 4 and 5, the galactose-recognizing lectins PNA and ECL are preferentially immobilized in the cuvette to which PV-LA having a galactose residue is adsorbed. Furthermore, as the amount of PV-LA adsorbed increases, the amount of immobilized lectin also increases.
【００５６】次に、１２穴マルチウェル（住友ベークラ
イト社製）に、０．２ｍｇ／ｍｌのＰＶ-ＬＡ水溶液を
注入して室温で２時間放置することにより、各ウェルに
ＰＶ-ＬＡを吸着させた後、１００ｎｇ／ｍｌのＥＣＬ
水溶液で処理した。それらのウェルに、５０、１００、
及び２００×１０4細胞／ｍｌのＰＢＭＣ懸濁液（１０
％のウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含むＲＰＭＩ１６４０
中）を各々１ｍｌずつ添加し、３７℃で３０分間インキ
ュベーションした。洗浄後、蛍光標識した抗体で処理
し、細胞の接着率を算出した。標識剤としては、ＦＩＴ
Ｃ標識抗ＣＤ１６抗体、及びＰＥ標識抗ＣＤ３抗体を用
いた。Next, PV-LA was adsorbed to each well by injecting a 0.2 mg / ml PV-LA aqueous solution into a 12-well multiwell (manufactured by Sumitomo Bakelite Co., Ltd.) and allowing it to stand at room temperature for 2 hours. Then 100 ng / ml ECL
Treated with aqueous solution. 50, 100,
And 200 × 10 4 cells / ml PBMC suspension (10
RPMI 1640 with% fetal calf serum (FCS)
1 ml each was added and the mixture was incubated at 37 ° C. for 30 minutes. After washing, the cells were treated with a fluorescently labeled antibody, and the cell adhesion rate was calculated. As a labeling agent, FIT
C-labeled anti-CD16 antibody and PE-labeled anti-CD3 antibody were used.
【００５７】同様に０．１ｍｇ／ｍｌのＰＶ-ＬＡ及び
０．１ｍｇ／ｍｌのＰＶ-ＭＡの混合水溶液から吸着さ
せたウェル、及び未被覆のウェルにおけるＰＢＭＣの接
着率を測定した。結果を表１に示す。但し、ＣＤ１６は
ナチュラル・キラー細胞、ＣＤ３はＴ細胞である。Similarly, the adhesion ratio of PBMC in wells adsorbed from a mixed aqueous solution of 0.1 mg / ml PV-LA and 0.1 mg / ml PV-MA and in uncoated wells was measured. The results are shown in Table 1. However, CD16 is a natural killer cell and CD3 is a T cell.
【００５８】[0058]
【表１】 [Table 1]
【００５９】以上の結果から、ＰＶ-ＬＡを介してＥＣ
Ｌを固定化したウェルには、表面にガラクトースを表現
したＴ細胞が選択的に接着されることがわかる。即ち、
本発明の固定化法に従ってレクチンを固定化された基材
は、細胞が選択的に接着する高機能な細胞培養基材とし
て使用できる。さらに、ＰＶ-ＬＡとＰＶ-ＭＡとを混合
して被覆したものでは、ナチュラル・キラー細胞の接着
が完全に阻害されており、本発明の固定化法を用いた細
胞培養基材が、細胞の接着性を高度にコントロールでき
る可能性が示唆されている。From the above results, EC was measured via PV-LA.
It can be seen that T cells expressing galactose on the surface are selectively adhered to the L-immobilized well. That is,
The substrate on which the lectin is immobilized according to the immobilization method of the present invention can be used as a highly functional cell culture substrate to which cells selectively adhere. Furthermore, in the case where PV-LA and PV-MA are mixed and coated, adhesion of natural killer cells is completely inhibited, and the cell culture substrate using the immobilization method of the present invention It has been suggested that the adhesiveness can be highly controlled.
【００６０】（実施例３）直径３５ｍｍのポリスチレン
製シャーレに、ＰＶ-ＬＡを１００μｇ／ｍｌ含む水溶
液を加え、室温で２時間処理してＰＶ-ＬＡを吸着させ
た。次に、ガラクトース認識性レクチンであるＡｌｌｏ
Ａ（２０μｇ／ｍｌ）１．５ｍｌを添加して室温で２
時間保存した後洗浄し、本発明によるＡｌｌｏ Ａの固
定化を行った。Example 3 An aqueous solution containing 100 μg / ml of PV-LA was added to a polystyrene petri dish having a diameter of 35 mm and treated at room temperature for 2 hours to adsorb PV-LA. Next, the galactose-recognizing lectin Allo
1.5 ml of A (20 μg / ml) was added and 2 at room temperature.
After being stored for a time, it was washed to immobilize Allo A according to the present invention.
【００６１】比較のため、同様のポリスチレン製シャー
レに、Ａｌｌｏ Ａ（２０μｇ／ｍｌ）１．５ｍｌを添
加して室温で２時間保存した後洗浄し、従来法によるＡ
ｌｌｏ Ａの固定化を行った。さらに、未被覆のポリス
チレン製シャーレ、及びＰＶ-ＬＡのみを吸着させ、Ａ
ｌｌｏ Ａで処理しなかったシャーレも用意した。For comparison, 1.5 ml of Allo A (20 μg / ml) was added to the same polystyrene petri dish, stored at room temperature for 2 hours, and then washed, followed by A by the conventional method.
Immobilization of Ilo A was performed. Furthermore, only the uncoated polystyrene dish and PV-LA are adsorbed, and A
A Petri dish not treated with Ilo A was also prepared.
【００６２】各シャーレに、２００×１０4細胞のヒト
赤血球（ＲＢＣ）を懸濁したＰＢＳ（0.2%ＢＳＡを含
む）を１．５ｍｌずつ添加し、３７℃で６０分間インキ
ュベーションした。その後、非接着ＲＢＣ数をコールタ
ーカウンターで計数し、ＲＢＣの接着率を算出した。こ
こで、接着率は下式に従って計算し、結果を表２に示
す。接着率（％）＝｛（播き込み数（200×104）−非接
着細胞数）／播き込み数｝×１００To each dish, 1.5 ml of PBS (containing 0.2% BSA) in which 200 × 10 4 human red blood cells (RBC) were suspended was added and incubated at 37 ° C. for 60 minutes. After that, the number of non-adhesive RBCs was counted by a Coulter counter to calculate the RBC adhesion rate. Here, the adhesion rate was calculated according to the following formula, and the results are shown in Table 2. Adhesion rate (%) = {(the number of seeds (200 × 10 4 ) −the number of non-adherent cells) / the number of seeds} × 100
【００６３】[0063]
【表２】 [Table 2]
【００６４】糖鎖高分子（ＰＶ-ＬＡ）を介してレクチ
ン（Ａｌｌｏ Ａ）を固定化したシャーレ上には、まき
込んだ細胞のほとんど全部が接着したが、シャーレ表面
にＡｌｌｏ Ａを吸着させただけのシャーレでは、Ａｌ
ｌｏ Ａを固定化していないシャーレと同程度の接着率
しか得られなかった。即ち、本発明の固定化法で固定化
したレクチンは、従来法に比較して強固に固定化するこ
とが可能であり、さらにその活性も向上しているものと
考えられる。Almost all the seeded cells adhered to the petri dish on which the lectin (Allo A) was immobilized via the sugar chain polymer (PV-LA), but the Allo A was adsorbed on the surface of the petri dish. Only petri dish with Al
Only an adhesion rate similar to that of a petri dish on which lo A was not immobilized was obtained. That is, it is considered that the lectin immobilized by the immobilization method of the present invention can be immobilized more firmly than the conventional method, and the activity thereof is also improved.
【００６５】[0065]
【発明の効果】本発明のレクチン固定化法によれば、吸
着性の良好な糖鎖高分子を基材に吸着させ、その糖鎖高
分子の糖鎖にレクチンを結合させるため、極めて安定
に、なおかつ強固にレクチンを固定化することができ
る。また、糖鎖とレクチンとの特異的結合性を利用して
固定化するため、例えば複数のレクチンを含む混合溶液
からでも、目的とするレクチンを選択的に固定化でき
る。EFFECTS OF THE INVENTION According to the lectin immobilization method of the present invention, a sugar chain polymer having good adsorptivity is adsorbed on a base material, and the lectin is bound to the sugar chain of the sugar chain polymer, so that it is extremely stable. In addition, the lectin can be firmly immobilized. Further, since the immobilization is performed by utilizing the specific binding property between the sugar chain and the lectin, the target lectin can be selectively immobilized even from a mixed solution containing a plurality of lectins, for example.
【００６６】本発明の固定化法に従ってレクチンを固定
化した細胞用基材では、固定化、濃縮されたレクチンに
よって効果的に機能が発揮され、例えば選択的に細胞を
凝集させたり活性化させることができる。The lectin-immobilized cell substrate according to the immobilization method of the present invention effectively exhibits its function by the immobilized and concentrated lectin, and for example, selectively aggregates or activates the cells. You can
【図１】 本発明のレクチンの固定化法を説明するため
の模式図である。FIG. 1 is a schematic diagram for explaining the lectin immobilization method of the present invention.
【図２】 実施例１の細胞の標識法を説明するための図
である。FIG. 2 is a diagram for explaining the cell labeling method of Example 1.
【図３】 実施例１で処理した細胞のフローサイトメト
リーの結果を示すグラフである。FIG. 3 is a graph showing the results of flow cytometry of the cells treated in Example 1.
【図４】 糖鎖高分子の吸着量と、それに対するＰＮＡ
固定化量の関係を示すグラフである。FIG. 4 Adsorption amount of sugar chain polymer and PNA corresponding thereto
It is a graph which shows the relationship of the amount of immobilization.
【図５】 糖鎖高分子の吸着量と、それに対するＥＣＬ
固定化量の関係を示すグラフである。FIG. 5: Adsorption amount of sugar chain polymer and ECL corresponding thereto
It is a graph which shows the relationship of the amount of immobilization.
１…基材、２…糖鎖高分子、３…レクチン、２１…糖
鎖、２２…高分子主鎖、２５…ガラクトース残基、３０
…ＳＢＡ、４０…細胞、５０…ＣＤ３細胞、５１…抗Ｃ
Ｄ３抗体、６０…ポリスチレン製ビーズ。1 ... Substrate, 2 ... Sugar chain polymer, 3 ... Lectin, 21 ... Sugar chain, 22 ... Polymer main chain, 25 ... Galactose residue, 30
… SBA, 40… cells, 50… CD3 cells, 51… anti-C
D3 antibody, 60 ... Polystyrene beads.
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/566 Ｇ０１Ｎ 33/566 Continuation of the front page (51) Int.Cl. 6 Identification code Office reference number FI Technical display location G01N 33/566 G01N 33/566
Claims (4)
る糖鎖を有する糖鎖高分子を基材に吸着させ、その糖鎖
高分子を介して該レクチンを固定化することからなるレ
クチンの固定化法。1. Immobilization of a lectin, which comprises adsorbing a sugar chain polymer having a sugar chain that specifically binds to a lectin to be immobilized on a substrate and immobilizing the lectin via the sugar chain polymer. Chemical method.
ノシル-（１→４）-Ｄ-グルコンアミド］）、 ポリ（Ｎ-ｐ-ビニルベンジル-［Ｏ-α-Ｄ-グルコピラノ
シル-（１→４）-Ｄ-グルコンアミド］）、 ポリ（Ｎ-ｐ-ビニルベンジル-［Ｏ-β-Ｏ-マンノピラノ
シル-（１→４）-Ｄ-マンナミド］）、 ポリ（Ｎ-ｐ-ビニルベンジル-［Ｏ-α-Ｄ-ガラクトピラ
ノシル-（１→６）-Ｄ-グルコンアミド］）、 ポリ（Ｎ-ｐ-ビニルベンジル-［Ｏ-６-カルボキシメチ
ル-β-Ｄ-ガラクトピラノシル-（１→４）-Ｏ-Ｄ-６-カ
ルボキシメチル-グルコンアミド］）、 ポリ（３-Ｏ-４’-ビニルベンジル-Ｄ-グルコース）、 ポリ（Ｎ-ｐ-ビニルベンジル-［Ｏ-２-アセトアミド-２
-デオキシ-β-Ｄ-グルコピラノシル-（１→４）-Ｏ-Ｄ-
２-アセトアミド-２-デオキシ-β-Ｄ-グルコピラノシル
-（１→４）-Ｏ-Ｄ-２-アセトアミド-２-デオキシ-β-
Ｄ-グルコンアミド］）及び／またはポリ（Ｎ-ｐ-ビニ
ルベンジル-［Ｏ-２-アセトアミド-２-デオキシ-β-Ｄ-
グルコピラノシル-（１→４）-Ｏ-Ｄ-２-アセトアミド-
２-デオキシ-β-Ｄ-グルコンアミド］）、 ポリ（Ｎ-ｐ-ビニルベンジル-Ｄ-グルコンアミド）、及
び、 ポリ（Ｎ-ｐ-ビニルベンジル-［Ｏ-β-Ｄ-グルコピラノ
シル-（１→３）-Ｄ-グルコンアミド］から選択される
少なくとも１つであることを特徴とする請求項１記載の
固定化法。2. The sugar chain polymer is poly (N-p-vinylbenzyl- [O-β-D-galactopyranosyl- (1 → 4) -D-gluconamide]), poly (N- p-vinylbenzyl- [O-α-D-glucopyranosyl- (1 → 4) -D-gluconamide]), poly (Np-vinylbenzyl- [O-β-O-mannopyranosyl- (1 → 4)) -D-mannamide]), poly (Np-vinylbenzyl- [O-α-D-galactopyranosyl- (1 → 6) -D-gluconamide]), poly (Np-vinylbenzyl-) [O-6-carboxymethyl-β-D-galactopyranosyl- (1 → 4) -OD-6-carboxymethyl-gluconamide]), poly (3-O-4′-vinylbenzyl-D -Glucose), poly (Np-vinylbenzyl- [O-2-acetamide-2
-Deoxy-β-D-glucopyranosyl- (1 → 4) -OD-
2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl
-(1 → 4) -OD-2-acetamido-2-deoxy-β-
D-Gluconamide]) and / or poly (Np-vinylbenzyl- [O-2-acetamido-2-deoxy-β-D-
Glucopyranosyl- (1 → 4) -OD-2-acetamido-
2-deoxy-β-D-gluconamide]), poly (Np-vinylbenzyl-D-gluconamide), and poly (Np-vinylbenzyl- [O-β-D-glucopyranosyl- (1 → 3) -D-Gluconamide], the immobilization method according to claim 1, wherein the immobilization method is at least one.
面に糖鎖高分子を介してレクチンを固定化した細胞用基
材。3. A substrate for cells having a lectin immobilized on the surface thereof via a sugar chain polymer using the immobilization method according to claim 1 or 2.
ート、キュベット、フィルム、ファイバー、またはビー
ズから選択されることを特徴とする請求項３記載の細胞
用基材。4. The substrate for cells according to claim 3, wherein the substrate is selected from a petri dish, a flask, a plate, a cuvette, a film, a fiber, or beads.
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