JP2004520006A

JP2004520006A - Nucleic acid comprising a region of rat PEG-3 promoter and use thereof

Info

Publication number: JP2004520006A
Application number: JP2002514147A
Authority: JP
Inventors: フィッシャー，ポール，ビー．; ス，ザオ−ゾン
Original assignee: ザトラスティースオブコロンビアユニバーシティインザシティオブニューヨーク
Priority date: 2000-07-21
Filing date: 2001-07-20
Publication date: 2004-07-08
Also published as: WO2002008242A1; CA2416676A1; EP1309603A1; AU2001277094A1; EP1309603A4

Abstract

本発明は、配列番号１の位置−２７０のグアノシン（Ｇ）で始まりかつ位置＋１９４のシトシン（Ｃ）で終わるヌクレオチド配列を含有するＰＥＧ−３プロモーターを含んでなる、単離した核酸を提供する。本発明はまた、細胞内のＰＥＧ−３プロモーター活性をモジュレートする薬剤を同定する方法も提供する。本発明はまた、被験者の癌を治療する方法も提供する。The present invention provides an isolated nucleic acid comprising a PEG-3 promoter containing a nucleotide sequence beginning with a guanosine (G) at position -270 of SEQ ID NO: 1 and ending with a cytosine (C) at position +194. The invention also provides a method for identifying an agent that modulates PEG-3 promoter activity in a cell. The invention also provides a method of treating cancer in a subject.

Description

【０００１】
本明細書に開示する発明は、米国健康福祉局（Ｕ．Ｓ．ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＨｅａｌｔｈａｎｄＨｕｍａｎＳｅｒｖｉｃｅｓ）からの国立癌研究所（ＮａｔｉｏｎａｌＣａｎｃｅｒＩｎｓｔｉｔｕｔｅ）認可番号ＣＡ３５６７５およびＣＡ７４４６８のもとでの政府支援によってなされた。従って、米国政府は本発明にある一定の権利を有する。
【０００２】
発明の背景
本出願書全体にわたって、様々な出版物を著者と日付によって本文内で参照している。これらの出版物の全ての引用はアルファベット順に本明細書末尾に掲げられている。前後を問わず、本明細書に引用した全ての特許、特許明細書および出版物は、その全文が参照により本明細書に組み入れられる。本明細書に記載しかつ請求した本発明の日付において当業者に公知である当技術分野の技術水準をさらに詳細に記載する目的で、これらの出版物の全体の開示がこれによって参照により本特許出願書中に組み入れられる。
【０００３】
発明の概要
本発明は、配列番号１の位置−２７０のグアノシン（Ｇ）で始まりかつ位置＋１９４のシトシン（Ｃ）で終わるヌクレオチド配列を含有するＰＥＧ−３プロモーターを含んでなる、単離した核酸を提供する。本発明はまた、細胞内のＰＥＧ−３プロモーター活性をモジュレートする薬剤を同定する方法であって：（ａ）レポーター遺伝子と機能的に連結されたＰＥＧ−３プロモーターを含んでなる核酸を含有する細胞を、薬剤と接触させること；（ｂ）細胞内のレポーター遺伝子発現のレベルを測定すること；および（ｃ）工程（ｂ）で測定した発現レベルを、薬剤の不存在下で同一細胞で測定したレポーター遺伝子発現レベルと比較することからなり、薬剤の存在下で測定されたより低い発現レベルはＰＥＧ−３プロモーター活性を抑制する薬剤を示しかつ薬剤の存在下で測定されたより高いレベルはＰＥＧ−３プロモーター活性を増大する薬剤を示し、それによって細胞内でＰＥＧ−３プロモーター活性をモジュレートする薬剤を同定する方法を提供する。本発明は、被験者の癌を治療する方法であって、目的の遺伝子と機能的に連結されたＰＥＧ−３プロモーターを含んでなる核酸を投与することからなり、目的の遺伝子が被験者の癌細胞に選択的に発現されかつその発現がＰＥＧ−３の発現を調節して癌細胞の増殖を抑制または死滅してそれによって被験者の癌を治療することを特徴とする、前記方法を提供する。
【０００４】
発明の詳細な説明
本明細書では次の複数の省略語を使用する：進行上昇遺伝子（ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎｅｌｅｖａｔｅｄｇｅｎｅ）−３（ＰＥＧ−３）；ラット胚細胞（ＲＥ細胞）；ＰＥＧ−プロモーター（ＰＥＧ−Ｐｒｏｍ）；キロ塩基（ｋｂ）。本特許出願全体にわたって、特定のヌクレオチドに対する参照は、核酸のコード鎖上に存在するヌクレオチドに対するものである。本明細書全体にわたって次の標準略語を用いて特定のヌクレオチドを示す：
Ｃ＝シトシンＡ＝アデノシン
Ｔ＝チミジンＧ＝グアノシン
本発明は、配列番号１の位置−２７０のグアノシン（Ｇ）で始まりかつ位置＋１９４のシトシン（Ｃ）で終わるヌクレオチド配列を含有するＰＥＧ−３プロモーターを含んでなる、単離した核酸を提供する。
【０００５】
本発明はまた、少なくとも１５ヌクレオチド長の請求項１のヌクレオチド配列の断片を含んでなる、単離した核酸も提供する。
【０００６】
一実施形態においては、核酸断片は、
（ｉ）配列番号１の位置−１０５のチミジン（Ｔ）で始まりかつ位置−１００のチミジン（Ｔ）で終わるヌクレオチド配列からなるＰＥＡ３タンパク質結合配列、
（ｉｉ）配列番号１の位置−２９のチミジン（Ｔ）で始まりかつ位置−２４のアデノシン（Ｔ）で終わるヌクレオチド配列からなるＴＡＴＡ配列、または
（ｉｉｉ）配列番号１に示したヌクレオチド配列の位置＋６のチミジン（Ｔ）で始まりかつ位置＋１２のチミジン（Ｔ）で終わるヌクレオチド配列からなるＡＰ１タンパク質結合配列を含んでなる。
【０００７】
他の実施形態においては、核酸は上記の３つのヌクレオチド配列（ｉ）〜（ｉｉｉ）の少なくとも２つを含んでなる。
【０００８】
他の実施形態においては、核酸は上記の３つのヌクレオチド配列（ｉ）〜（ｉｉｉ）を含んでなる。
【０００９】
他の実施形態においては、断片はプロモーター活性を有する。
【００１０】
他の実施形態においては、断片は目的の遺伝子と機能的に連結されている。他の実施形態においては、目的の遺伝子はレポーター遺伝子である。
【００１１】
他の実施形態においては、レポーター遺伝子はβ−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコールトランスフェラーゼまたはアルカリホスファターゼをコードする。
【００１２】
他の実施形態においては、目的の遺伝子は、癌抑制遺伝子、発現すると細胞のアポトーシスを引き起こす遺伝子、または細胞傷害性遺伝子である。
【００１３】
本発明は、少なくとも１つの本明細書に記載の核酸を含んでなるベクターを提供する。本発明はまた、このベクターを含んでなる宿主細胞も提供する。
【００１４】
他の実施形態においては、宿主細胞は腫瘍細胞である。他の実施形態においては、腫瘍細胞は黒色腫細胞、神経芽細胞腫細胞、子宮頚癌細胞、乳癌細胞、肺癌細胞、前立腺癌細胞、大腸癌細胞、またはグリア芽細胞腫多型細胞である。
【００１５】
本発明はまた、細胞内でＰＥＧ−３プロモーター活性をモジュレートする薬剤を同定する方法であって：
（ａ）レポーター遺伝子と機能的に連結されたＰＥＧ−３プロモーターを含んでなる核酸を含有する細胞を、薬剤と接触させること；（ｂ）細胞内のレポーター遺伝子発現のレベルを測定すること；および（ｃ）工程（ｂ）で測定した発現レベルを、薬剤の不存在下で同一細胞で測定したレポーター遺伝子発現レベルと比較することからなり、薬剤の存在下で測定されたより低い発現レベルはＰＥＧ−３プロモーター活性を抑制する薬剤を示しかつ薬剤の存在下で測定されたより高いレベルはＰＥＧ−３プロモーター活性を増大する薬剤を示し、それによって細胞内でＰＥＧ−３プロモーター活性をモジュレートする薬剤を同定する方法を提供する。
【００１６】
他の実施形態においては、細胞は、黒色腫細胞、神経芽細胞腫細胞、子宮頚癌細胞、乳癌細胞、肺癌細胞、前立腺癌細胞、大腸癌細胞、またはグリア芽細胞腫多型細胞である。
【００１７】
他の実施形態においては、薬剤は約７キロダルトン以下の分子量を有する分子を含んでなる。
【００１８】
他の実施形態においては、薬剤は、配列番号１に示した配列の少なくとも一部分と相補的なヌクレオチド配列を含んでなるアンチセンス核酸でありかつ長さが少なくとも１５ヌクレオチドである。
【００１９】
他の実施形態においては、薬剤は、ＤＮＡ分子、炭水化物、糖タンパク質、転写因子タンパク質または二本鎖ＲＮＡ分子である。
【００２０】
他の実施形態においては、薬剤は、０．１キロダルトンから１０キロダルトンまでの分子量を有する合成ヌクレオチド配列、ペプチド模倣物、または有機分子である。
【００２１】
他の実施形態においては、レポーター遺伝子は、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコールトランスフェラーゼまたはアルカリホスファターゼをコードする。
【００２２】
他の実施形態においては、測定されるＰＥＧ−３プロモーター活性の発現は２．５〜３．５倍以上の増加または減少である。
【００２３】
本発明は、被験者の癌を治療する方法であって、目的の遺伝子と機能的に連結されたＰＥＧ−３プロモーターを含んでなる核酸を投与することからなり、目的の遺伝子が被験者の癌細胞中で選択的に発現されかつその発現がＰＥＧ−３の発現を調節して癌細胞の増殖の抑制または死滅をもたらし、それによって被験者の癌を治療することを特徴とする、前記方法を提供する。
【００２４】
本発明の一実施形態においては、核酸は本質的に、（ｉ）配列番号１の位置−１０５のチミジン（Ｔ）で始まりかつ位置−１００のチミジン（Ｔ）で終わるヌクレオチド配列からなるＰＥＡ３タンパク質結合配列、（ｉｉ）配列番号１の位置−２９のチミジン（Ｔ）で始まりかつ位置−２４のアデノシン（Ｔ）で終わるヌクレオチド配列からなるＴＡＴＡ配列、および（ｉｉｉ）配列番号１に示したヌクレオチド配列の位置＋６のチミジン（Ｔ）で始まりかつ位置＋１２のチミジン（Ｔ）で終わるヌクレオチド配列からなるＡＰ１タンパク質結合配列からなる。
【００２５】
他の実施形態においては、核酸は、少なくとも２５ヌクレオチド長の配列番号１の少なくとも一部分と相補的な配列を有する。
【００２６】
他の実施形態においては、癌は、黒色腫、神経芽細胞腫、星状細胞腫、グリア芽細胞腫多型、子宮頚癌、乳癌、大腸癌、前立腺癌、骨肉腫または軟骨肉腫である。
【００２７】
他の実施形態においては、投与は、注射、経口投与、局所投与、アデノウイルス感染、リポソームを介する導入、被験者の細胞への局所応用、またはマイクロインジェクションを経由して実施する。
【００２８】
他の実施形態においては、被験者は哺乳類である。他の実施形態においては、哺乳類はヒトである。他の実施形態においては、目的の遺伝子は、発現すると細胞のアポトーシスを引き起こす遺伝子である。
【００２９】
他の実施形態においては、遺伝子はＭｄａ−７遺伝子またはｐ５３遺伝子を含んでなる。他の実施形態においては、目的の遺伝子は腫瘍抑制遺伝子である。他の実施形態においては、抑制遺伝子はｍｄａ−７である。他の実施形態においては、目的の遺伝子は細胞傷害性遺伝子である。他の実施形態においては、細胞傷害性遺伝子の発現は細胞死を引き起こす。
【００３０】
他の実施形態においては、細胞傷害性遺伝子は、ＨＳＶ−ＴＫ、ｐ２１、ｐ２７、およびｐ１０からなる群から選択される。
【００３１】
本発明の実施は、他に示さない限り、当技術分野の範囲内である通常の分子生物学、微生物学、ウイルス学、組換えＤＮＡ技術、および免疫学の技術を採用しうる。そのような技術は、全て文献に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ＆Ｍａｎｉａｔｉｓ，「分子クローニング：研究室マニュアル（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ）」，ＳｅｃｏｎｄＥｄｉｔｉｏｎ（１９８９）；「ＤＮＡクローニング（ＤＮＡＣｌｏｎｉｎｇ）」，Ｖｏｌｓ．ＩおよびＩＩ（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ編、１９８５）；「オリゴヌクレオチド合成（ＯｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓ）」（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編、１９８４）；「核酸ハイブリダイゼーション（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）」（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編、１９８４）；「動物細胞培養（ＡｎｉｍａｌＣｅｌｌＣｕｌｔｕｒｅ）」（Ｒ．Ｋ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編、１９８６）；「固定細胞と酵素（ＩｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄＣｅｌｌｓａｎｄＥｎｚｙｍｅｓ）」（ＩＲＬｐｒｅｓｓ、１９８６）；Ｐｅｒｂａｌ，Ｂ．，「分子クローニングへの実用的手引き（ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＧｕｉｄｅｔｏＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ）」（１９８４）；シリーズ「酵素学の方法（ＭｅｔｈｏｄｓＩｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）」（Ｓ．ＣｏｌｏｗｉｃｋおよびＮ．Ｋａｐｌａｎ編、ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；ならびに「実験免疫学ハンドブック（ＨａｎｄｂｏｏｋｏｆＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」，Ｖｏｌｓ．Ｉ−ＩＶ（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編、１９８６、ＢｌａｃｋｗｅｌｌＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＰｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）を参照。
【００３２】
本明細書および付加した請求の範囲に使用している、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、内容が明白に他を規定しない限り、複数の参照を含む。
【００３３】
本発明は、本明細書に記載の組換え発現構築物を含んでなる宿主細胞を提供する。
【００３４】
本発明の他の実施形態においては、宿主細胞は本明細書に記載の組換え発現構築物を用いて安定してトランスフォームされている。本発明の他の実施形態においては、宿主細胞は腫瘍細胞である。
【００３５】
本発明の他の実施形態においては、宿主細胞はメラニン形成細胞である。本発明の他の実施形態においては、細胞は不死化細胞である。
【００３６】
本発明の他の実施形態においては、腫瘍細胞は黒色腫細胞、神経芽細胞腫細胞、星状細胞腫細胞、グリア芽細胞腫多型細胞、子宮頚癌細胞、乳癌細胞、肺癌細胞または前立腺癌細胞である。
【００３７】
本発明は、宿主細胞内で外来ＤＮＡを発現する方法であって：所望のポリペプチドまたはＲＮＡをコードする外来ＤＮＡと機能的に連結されたＰＥＧ−３プロモーターヌクレオチド配列を含んでなる遺伝子導入ベクターを宿主細胞中に導入して外来遺伝子を発現することを特徴とする前記方法を提供する。
【００３８】
本発明の他の実施形態においては、遺伝子導入ベクターはレポーター分子をコードしかつ発現する。
【００３９】
本発明の他の実施形態においては、レポーター遺伝子はβ−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼおよびクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼからなる群から選択される。
【００４０】
本発明の他の実施形態においては、「導入（ｉｎｔｒｏｄｕｃｉｎｇ）」は、アデノウイルス感染、リポソームを介する導入、細胞への局所応用、およびマイクロインジェクションからなる群から選択される方法によって実施される。
【００４１】
本発明の他の実施形態においては、癌は黒色腫、神経芽細胞腫、星状細胞腫、グリア芽細胞腫多型、子宮頚癌、乳癌、大腸癌、前立腺癌、骨肉腫または軟骨肉腫である。
【００４２】
本発明の他の実施形態においては、癌は被験者の中枢神経系の癌である。
【００４３】
本発明の他の実施形態においては、投与は注射、経口投与、または局所投与を経由して実施される。
【００４４】
本発明の他の実施形態においては、担体は水性担体、リポソーム、または脂質担体である。
【００４５】
定義
本明細書に使用される「治療遺伝子」は、癌細胞に治療効果を与えることができるかまたは細胞内で機能する遺伝子の発現に調節効果を有する機能性タンパク質に対応する、アミノ酸配列をコードするＤＮＡを意味する。
【００４６】
本明細書に使用される「核酸分子」はＤＮＡとＲＮＡの両方であって、他に規定しない限り、二本鎖および一本鎖核酸分子の両方を含む。また、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドなどのハイブリッドも含む。核酸配列への参照はまた、改変した塩基も、その改変が核酸とタンパク質などのリガンドとの結合またはワットソン−クリック塩基対合のいずれかを有意に妨害しない限り、含むことができる。
【００４７】
本明細書に使用される「エンハンサーエレメント」は、治療遺伝子または目的の遺伝子の転写速度を増加するがプロモーター活性を有しないヌクレオチド配列である。エンハンサーは、活性の有意な損失を伴うことなく、プロモーターの上流、下流、および反対側に移動することができる。
【００４８】
２つのＤＮＡまたはポリペプチド配列が「実質的に相同的」であるというのは、ヌクレオチドまたはアミノ酸の少なくともほぼ８０％（好ましくは少なくともほぼ９０％、そして最も好ましくは少なくとも９５％〜９９％）が分子の特定の長さにわたって対合するときである。本明細書に使用される「実質的に相同的」はまた、特定のＤＮＡまたはポリペプチド配列に対して同一性（１００％同一な配列）を示す配列も意味する。実質的に相同的なＤＮＡ配列は、例えば、特定の系についての特定されたストリンジェントな条件下のサザンハイブリダイゼーション実験によって同定することができる。適当なハイブリダイゼーション条件の規定は当技術分野の範囲内である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前掲；「ＤＮＡクローニング（ＤＮＡＣｌｏｎｉｎｇ）」，ｖｏｌｓＩ＆ＩＩ、前掲；「核酸ハイブリダイゼーション（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）」、前掲を参照。
【００４９】
ＰＥＧ−３プロモーター配列と「機能的に等価な」配列は、ＰＥＧ−３プロモーター配列と同じ様式で機能する配列である。従って、本明細書に記載のＰＥＧ−３プロモーターと「機能的に等価な」プロモーター配列は、ＰＥＧ−３プロモーター配列と実質的に類似した発現の時間枠でおよび実質的に類似の量でならびに実質的に類似した組織特異性をもって、下流コード配列の転写を指令できる配列である。
【００５０】
ＤＮＡ「コード配列」または特定のタンパク質を「コードするヌクレオチド配列」は、適当な調節配列の制御下に置かれるとｉｎｖｉｖｏまたはｉｎｖｉｔｒｏで転写されかつポリペプチドに翻訳されるＤＮＡ配列である。コード配列の境界は、５’−（アミノ）末端の開始コドンおよび３’−（カルボキシ）末端の翻訳停止コドンによって決定される。コード配列は、限定されるものでないが、原核生物配列、真核生物ｍＲＮＡからのｃＤＮＡ、真核生物（例えば哺乳類）源からのゲノムＤＮＡ配列、ウイルスＲＮＡまたはＤＮＡ、およびさらに合成ヌクレオチド配列が挙げられる。転写末端配列は通常、コード配列の３’に位置するであろう。
【００５１】
ＤＮＡ「制御配列」は集合的にプロモーター配列、ポリアデニル化シグナル、転写終結配列、上流調節ドメイン、エンハンサーなどの５’−ＵＴＲ（未翻訳領域）および３’−ＵＴＲを含む非翻訳領域を意味し、宿主細胞においてコード配列の転写と翻訳を集合的に提供する。
【００５２】
「機能的に連結された」は、そこに記載された諸成分がその通常の機能を果たすように構成された、ヌクレオチド配列エレメントの配置を意味する。従って、コード配列と機能的に連結された制御配列は、コード配列の発現を果たすことができる。制御配列は、コード配列の発現を指令するよう機能するのであれば、コード配列に近接する必要はない。従って、例えば、介在する未翻訳であるが転写済みの配列がプロモーター配列とコード配列の間に存在してもよく、プロモーター配列はまだコード配列と「機能的に連結されている」と考えることができる。
【００５３】
制御配列は細胞内のコード配列の「転写を指令」するとは、ＲＮＡポリメラーゼがプロモーター配列と結合してコード配列をｍＲＮＡに転写するときであり、次いでｍＲＮＡはコード配列がコードするポリペプチドに翻訳される。
【００５４】
細胞は外因性ＤＮＡによって「トランスフォーム」されているとは、その外因性ＤＮＡが細胞膜内に導入されているときである。外因性ＤＮＡは、細胞のゲノムを構成する染色体ＤＮＡ中に組み込まれて（共有結合で連結されて）いてもまたはいなくてもよい。原核生物および酵母においては、例えば、外因性ＤＮＡはプラスミドなどのエピソームエレメントに維持されてもよい。真核細胞においては、安定してトランスフォームされた細胞は、一般的に外因性ＤＮＡを染色体に組込んでいて染色体複製を通して娘細胞に継承する細胞か、または安定して維持された染色体外プラスミドを含有する細胞である。この安定性は、外因性ＤＮＡを含有する娘細胞集団からなる細胞系またはクローンを確立する真核生物細胞の能力によって実証される。
【００５５】
ＤＮＡ構築物の「異種」領域は、他ＤＮＡ分子内にあるかまたは他分子と結合したＤＮＡの同定しうるセグメントであって、自然では該他分子と会合して見出されない前記セグメントである。例えば、ＰＥＧ−３タンパク質以外のタンパク質をコードする配列は、ＰＥＧ−３プロモーターと連結されると、異種配列とみなされる。異種コード配列の他の例は、コード配列それ自身が自然で見出されない構築物（例えば、自然の遺伝子と異なるコドンを有する合成配列）である。同様に、ＰＥＧ−３プロモーターと連結した異種遺伝子を含んでなるキメラ配列は、かかるキメラ構築物が通常自然で見出されないので、異種であると考えられる。対立遺伝子変異または自然に存在する突然変異事象は、本明細書に使用される意味での、ＤＮＡの異種領域を生じない。
【００５６】
ベクター
特に好ましいのはウイルス系のベクターである。真核細胞の場合には、レトロウイルスまたはアデノウイルス系のベクターが好ましい。そのようなベクターは、ウイルスゲノムの全体または一部分、例えば長末端反復配列（「ＬＴＲ」）、プロモーター（例えばＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＲＳＶプロモーター）、エンハンサーその他を、含有する。宿主細胞が原核生物であれば、細菌ウイルス、すなわちファージが好ましい。そのようなベクターの例は、例えば、λファージ系のベクターである。いずれの場合もベクターは２以上のウイルスのエレメントを含んでなってもよい。
【００５７】
得られるベクターを、真核生物または原核生物のいずれであってもよい宿主細胞中にトランスフェクトまたはトランスフォームする。
【００５８】
本発明の遺伝子導入ベクターはさらに、ベクターの発現をより容易に追跡するためのマーカーまたはレポーター分子をコードする遺伝子を含んでいてもよい。
【００５９】
本発明に使用しうる特定のレポーター分子は本発明においては重要でない。本発明に使用しうるそのようなレポーター分子の例は、当技術分野で周知であり、βガラクトシダーゼ（Ｆｏｗｌｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，７４：１５０７（１９７７））、ルシフェラーゼ（Ｔｕら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１４：１９７０（１９７５））、およびクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（Ｇｏｒｍａｎら，Ｍｏｌ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．，２：１０４４−１０５１（１９８２））が挙げられる。
【００６０】
遺伝子導入ベクターは、同じもしくは異なる外来のポリペプチドまたはＲＮＡをコードする２以上の遺伝子を含有してもよい。
【００６１】
遺伝子導入ベクターは、宿主細胞内で複製しうるいずれの構築物であってもよく、プラスミド、ＤＮＡウイルス、レトロウイルス、ならびに単離したヌクレオチド分子が挙げられる。遺伝子導入ベクターのリポソームを介する導入も、本発明で実施しうる。
【００６２】
本発明に使用しうる前記プラスミドの例は、ｐＧＬ３−系のプラスミド（Ｐｒｏｍｅｇａ^ＴＭ）が挙げられる。本発明に使用しうる前記ＤＮＡウイルスの例はアデノウイルスである。
【００６３】
アデノウイルスは、発現ベクター、特にヒト遺伝子治療用の発現ベクターとして一層注目されている（Ｂｅｒｋｎｅｒ，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５８：３９−６６（１９９２））
本発明に使用しうる前記アデノウイルスの血清型の例は、当技術分野で周知であり、４０種を超えるさまざまなヒトアデノウイルス、例えば、Ａｄ１２（Ａ亜属）、Ａｄ３およびＡｄ７（Ｂ亜属）、Ａｄ２およびＡｄ５（Ｃ亜属）、Ａｄ８（Ｄ亜属）、Ａｄ４（Ｅ亜属）、Ａｄ４０（Ｆ亜属）が挙げられる（Ｗｉｇａｎｄら，「アデノウイルスＤＮＡ（ＡｄｅｎｏｖｉｒｕｓＤＮＡ）」，Ｄｏｅｒｆｌｅｒ編，ＭａｒｔｉｎｕｓＮｉｊｈｏｆｆＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｂｏｓｔｏｎ，ｐｐ．４０８−４４１（１９８６））。Ｃ亜属のＡｄ５が本発明において好適に使用されるアデノウイルスである。これは、Ａｄ５が、多くの生化学的および遺伝学的情報が既知であるヒトアデノウイルスであり、かつ歴史的にアデノウイルスをベクターとして使用する構築物の大部分において使用されてきたからである。また、アデノウイルスは市販されていて、例えばｐＣＡ３（ＭｉｃｒｏｂｉｘＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓＩｎｃ．）がある。
【００６４】
アデノウイルスベクターを作製する方法は当技術分野で周知である（Ｂｅｒｋｎｅｒら，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，１１：６００３−６０２０（１９８３）；ｖａｎＤｏｒｅｎら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，４：１６５３−１６５６（１９８４）；Ｇｈｏｓｈ−Ｃｈｏｕｄｈｕｒｙら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１４７：９６４−９７３（１９８７）；ＭｃＧｒｏｒｙら，Ｖｉｒｏｌ．，１６３：６１４−６１７（１９８８）；およびＧｌｕｚｍａｎら，「真核生物ウイルスベクター（ＥｕｒｋａｒｙｏｔｉｃＶｉｒａｌＶｅｃｔｏｒｓ）」，Ｇｌｕｚｍａｎ，Ｙ．編，１８７−１９２頁，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８２））。
【００６５】
誘導体核酸分子
誘導体分子はＰＥＧ−３プロモーターの機能的特性を保持しうる、すなわち、上記のような置換を有する分子であっても目的の遺伝子の組織特異的発現が可能でありうる。改変は、誘導体分子の効力がＰＥＧ−３プロモーター単独と比較して増加しており、かつ誘導体分子がその組織特異性を保持している限り、許容される。
【００６６】
治療遺伝子の例としては自殺遺伝子が挙げられる。これらの遺伝子配列が発現すると、黒色腫腫瘍細胞増殖を抑制するかまたは黒色腫腫瘍細胞死を誘発するタンパク質または薬剤が産生される。自殺遺伝子としては、酵素をコードする遺伝子、癌遺伝子、癌抑制遺伝子、毒素をコードする遺伝子、サイトカインをコードする遺伝子、またはオンコスタチンをコードする遺伝子が挙げられる。治療遺伝子の目的は皮膚癌細胞の増殖を抑制もしくは該細胞を死滅させるか、または直接もしくは間接に癌細胞の増殖を抑制するかもしくは該細胞を死滅させるサイトカインもしくは他の細胞傷害性薬剤を産生することである。
【００６７】
適当な酵素は、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来のキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＧＰＴ）遺伝子もしくは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）シトシンデアミナーゼ（ＣＤ）、またはヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）が挙げられる。
【００６８】
適当な癌遺伝子および癌抑制遺伝子は、ｎｅｕ、ＥＧＦ、ｒａｓ（Ｈ、Ｋ、およびＮｒａｓを含む）、ｐ５３、網膜芽細胞腫抑制遺伝子（Ｒｂ）、ウィルムス腫遺伝子産物、ホスホチロシンホスファターゼ（ＰＴＰアーゼ）、およびｎｍ２３が挙げられる。適当な毒素は、シュードモナス外毒素ＡおよびＳ；ジフテリア毒素（ＤＴ）；大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＬＴ毒素、志賀毒素、志賀様毒素（ＳＬＴ−１、−２）、リシン、アブリン、サポリン（ｓｕｐｐｏｒｉｎ）、およびゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）が挙げられる。
【００６９】
適当なサイトカインは、インターフェロン、ＧＭ−ＣＳＦインターロイキン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）が挙げられる（ＷｏｎｇＧら，「ヒトＧＭ−ＣＳＦ：相補的ＤＮＡの分子クローニングならびに天然および組換えタンパク質の精製（ＨｕｍａｎＧＭ−ＣＳＦ：ＭｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｇｏｆｔｈｅｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙＤＮＡａｎｄｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｎａｔｕｒａｌａｎｄｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｒｏｔｅｉｎｓ）」，Ｓｃｉｅｎｃｅ１９８５；２２８：８１０）；ＷＯ９３２３０３４（１９９３）；ＨｏｒｉｓｂｅｒｇｅｒＭ．Ａ．ら，「インターフェロン−βおよびウイルス誘導ヒトＭｘタンパク質のｃＤＮＡのクローニングと配列分析は、それらが推定グアニンヌクレオチド結合部位を含有することを示す：当該遺伝子プロモーターの機能性研究（ＣｌｏｎｉｎｇａｎｄｓｅｑｕｅｎｃｅａｎａｌｙｓｅｓｏｆｃＤＮＡｓｆｏｒｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ｂｅｔａａｎｄｖｉｒｕｓ−ｉｎｄｕｃｅｄｈｕｍａｎＭｘｐｒｏｔｅｉｎｓｒｅｖｅａｌｔｈａｔｔｈｅｙｃｏｎｔａｉｎｐｕｔａｔｉｖｅｇｕａｎｉｎｅｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｂｉｎｄｉｎｇｓｉｔｅｓ：ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｓｔｕｄｙｏｆｔｈｅｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇｇｅｎｅｐｒｏｍｏｔｅｒ）」，ＪｏｕｒｎａｌｏｆＶｉｒｏｌｏｇｙ，１９９０Ｍａｒ，６４（３）：１１７１−８１；ＬｉＹＰら，「前炎症性サイトカイン腫瘍壊死因子−αおよびＩＬ−６はオステオカルシン遺伝子プロモーターをダウンレギュレートするが、ＩＬ−１はその機能をもたない（Ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙｃｙｔｏｋｉｎｅｓｔｕｍｏｒｎｅｃｒｏｓｉｓｆａｃｔｏｒ−ａｌｐｈａａｎｄＩＬ−６，ｂｕｔｎｏｔＩＬ−１，ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｅｔｈｅｏｓｔｅｏｃａｌｃｉｎｇｅｎｅｐｒｏｍｏｔｅｒ）」，ＪｏｕｒｎａｌｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｆｅｂ．１，１９９２，１４８（３）：７８８−９４；ＰｉｚａｒｒｏＴ．Ｔ．ら．「同種移植拒絶の際のラット心臓移植体におけるＴＮＦαおよびＴＮＦβ遺伝子発現の誘導（ＩｎｄｕｃｔｉｏｎｏｆＴＮＦａｌｐｈａａｎｄＴＮＦｂｅｔａｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｒａｔｃａｒｄｉａｃｔｒａｎｓｐｌａｎｔｓｄｕｒｉｎｇａｌｌｏｇｒａｆｔｒｅｊｅｃｔｉｏｎ）」，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，１９９３Ａｕｇ．，５６（２）：３９９−４０４）；ＢｒｅｖｉａｒｉｏＦら，「内皮細胞中のインターロイキン−１誘導遺伝子：Ｃ反応性タンパク質および血清アミロイドＰ成分に関係する新しい遺伝子のクローニング（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅｇｅｎｅｓｉｎｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｓ．ＣｌｏｎｉｎｇｏｆａｎｅｗｇｅｎｅｒｅｌａｔｅｄｔｏＣ−ｒｅａｃｔｉｖｅｐｒｏｔｅｉｎａｎｄｓｅｒｕｍａｍｙｌｏｉｄＰｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）」，ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｎｏｖ．５，１９９２，２６７（３１）：２２１９０−７；Ｅｓｐｉｎｏｚａ−ＤｅｌｇａｄｏＩ．ら，「ヒト単球のＩＬ−２受容体サブユニット遺伝子の調節：ＩＬ−２とＩＦＮ−γの示差的作用（ＲｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆＩＬ−２ｒｅｃｅｐｔｏｒｓｕｂｕｎｉｔｇｅｎｅｓｉｎｈｕｍａｎｍｏｎｏｃｙｔｅｓ．ＤｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｅｆｆｅｃｔｓｏｆＩＬ−２ａｎｄＩＦＮ−ｇａｍｍａ）」，ＪｏｕｒｎａｌｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｎｏｖ．１，１９９２，１４９（９）：２９６１−８；ＡｌｇａｔｅＰ．Ａ．ら，「胎児肝由来のＦＬ５．１２細胞系における、ＩＬ−３によるインターロイキン−３（ＩＬ−３）受容体の調節（Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−３（ＩＬ−３）ｒｅｃｅｐｔｏｒｂｙＩＬ−３ｉｎｔｈｅｆｅｔａｌｌｉｖｅｒ−ｄｅｒｉｖｅｄＦＬ５．１２ｃｅｌｌｌｉｎｅ）」，Ｂｌｏｏｄ，１９９４Ｍａｙ１，８３（９）：２４５９−６８；ＣｌｕｉｔｍａｎｓＦ．Ｈ．ら，「ＩＬ−４は、ＩＬ−２−、ＩＬ−３−、およびＧＭ−ＣＳＦ−が誘導する末梢血単球におけるサイトカイン遺伝子発現をダウンレギュレートする（ＩＬ−４ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｅｓＩＬ−２−，ＩＬ−３−，ａｎｄＧＭ−ＣＳＦ−ｉｎｄｕｃｅｄｃｙｔｏｋｉｎｅｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｐｅｒｉｐｈｅｒａｌｂｌｏｏｄｍｏｎｏｃｙｔｅｓ）」，ＡｎｎａｌｓｏｆＨｅｍａｔｏｌｏｇｙ，１９９４Ｊｕｎ．，６８（６）：２９３−８；Ｌａｇｏｏ，Ａ．Ｓ．ら，「スーパー抗原活性化Ｔ細胞におけるＩＬ−２、ＩＬ−４およびＩＦＮ−γ遺伝子発現とそれに対するそれらの分泌接着分子を介しての同時刺激シグナルの明確な必要性（ＩＬ−２，ＩＬ−４，ａｎｄＩＦＮ−ｇａｍｍａｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｒｓｕｓｓｅｃｒｅｔｉｏｎｉｎｓｕｐｅｒａｎｔｉｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄＴｃｅｌｌｓ．Ｄｉｓｔｉｎｃｔｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｆｏｒｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙｓｉｇｎａｌｓｔｈｒｏｕｇｈａｄｈｅｓｉｏｎｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）」，ＪｏｕｒｎａｌｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｆｅｂ．１５，１９９４，１５２（４）：１６４１−５２；ＭａｒｔｉｎｅｚＯ．Ｍ．ら，「肝同種移植片受容者およびｉｎｖｉｔｒｏにおける、同種抗原に応答したＩＬ−２およびＩＬ−５遺伝子発現（ＩＬ−２ａｎｄＩＬ−５ｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｒｅｓｐｏｎｓｅｔｏａｌｌｏａｎｔｉｇｅｎｉｎｌｉｖｅｒａｌｌｏｇｒａｆｔｒｅｃｉｐｉｅｎｔｓａｎｄｉｎｖｉｔｒｏ）」，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，１９９３Ｍａｙ，５５（５）：１１５９−６６；ＰａｎｇＧら，「リポ多糖、ＩＬ−１αおよびＴＮＦ−αにより刺激されたヒト十二指腸繊維芽細胞におけるＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＣＡＭ−１およびＶＣＡＭ−１遺伝子発現とサイトカイン産生（ＧＭ−ＣＳＦ，ＩＬ−１ａｌｐｈａ，ＩＬ−１ｂｅｔａ，ＩＬ−６，ＩＬ−８，ＩＬ−１０，ＩＣＡＭ−１ａｎｄＶＣＡＭ−１ｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄｃｙｔｏｋｉｎｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｉｎｈｕｍａｎｄｕｏｄｅｎａｌｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓｓｔｉｍｕｌａｔｅｄｗｉｔｈｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ，ＩＬ−１ａｌｐｈａａｎｄＴＮＦ−ａｌｐｈａ）」，ＣｌｉｎｉｃａｌａｎｄＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９９４Ｊｕｎ．，９６（３）：４３７−４３；ＵｌｉｃｈＴ．Ｒ．ら，「内毒素誘導性サイトカイン遺伝子のｉｎｖｉｖｏ発現ＩＩＩＩＬ−６ｍＲＮＡおよび血清タンパク質発現ならびにＩＬ−６のｉｎｖｉｖｏ血液学的作用（Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ−ｉｎｄｕｃｅｄｃｙｔｏｋｉｎｅｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｖｉｖｏ．ＩＩＩ．ＩＬ−６ｍＲＮＡａｎｄｓｅｒｕｍｐｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄｔｈｅｉｎｖｉｖｏｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｃｅｆｆｅｃｔｓｏｆＩＬ−６）」，ＪｏｕｒｎａｌｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ａｐｒ．１，１９９１，１４６（７）：２３１６−２３；ＭａｕｖｉｅｌＡ．ら，「Ｔ細胞産生サイトカインであるロイコレギュリンは、ＩＬ−８遺伝子発現およびヒト皮膚繊維芽細胞における分泌を誘導する。ヒト皮膚繊維芽細胞における実証と分泌。ＮＦ−κ Ｂ結合およびＮＦ−κ Ｂ−駆動プロモーター活性の実証。（Ｌｅｕｋｏｒｅｇｕｌｉｎ，ａＴｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄｃｙｔｏｋｉｎｅ，ｉｎｄｕｃｅｓＩＬ−８ｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄｓｅｃｒｅｔｉｏｎｉｎｈｕｍａｎｓｋｉｎｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ．Ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｉｏｎａｎｄｓｅｃｒｅｔｉｏｎｉｎｈｕｍａｎｓｋｉｎｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ．ＤｅｍｏｎｓｔｒａｔｉｏｎｏｆｅｎｈａｎｃｅｄＮＦ−ｋａｐｐａＢｂｉｎｄｉｎｇａｎｄＮＦ−ｋａｐｐａＢ−ｄｒｉｖｅｎｐｒｏｍｏｔｅｒａｃｔｉｖｉｔｙ．）」，ＪｏｕｒｎａｌｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｎｏｖ．１，１９９２，１４９（９）：２９６９−７６）。
【００７０】
増殖因子は、トランスフォーミング増殖因子−α（ＴＧＦ−α）およびβ（ＴＧＦ−β）、サイトカインコロニー刺激因子が挙げられる（ＳｈｉｍａｎｅＭ．ら，「Ｇ−ＣＳＦ誘導性遺伝子ｃＤＮＡの分子クローニングと特性決定（ＭｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｇａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆＧ−ＣＳＦｉｎｄｕｃｅｄｇｅｎｅｃＤＮＡ）」，ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌａｎｄＢｉｏｐｈｙｓｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈＣｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｆｅｂ．２８，１９９４，１９９（１）：２６−３２；ＫａｙＡ．Ｂ．ら，「アトピー被験者のアレルゲン誘導遅発型皮膚反応における、サイトカイン遺伝子クラスター、インターロイキン３（ＩＬ−３）、ＩＬ−４、ＩＬ−５、および顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子のメッセンジャーＲＮＡ発現（ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＲＮＡｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｔｈｅｃｙｔｏｋｉｎｅｇｅｎｅｃｌｕｓｔｅｒ，ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ３（ＩＬ−３），ＩＬ−４，ＩＬ−５，ａｎｄｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ／ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇｆａｃｔｏｒ，ｉｎａｌｌｅｒｇｅｎ−ｉｎｄｕｃｅｄｌａｔｅ−ｐｈａｓｅｃｕｔａｎｅｏｕｓｒｅａｃｔｉｏｎｓｉｎａｔｏｐｉｃｓｕｂｊｅｃｔｓ）」，ＪｏｕｒｎａｌｏｆＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＭｅｄｉｃｉｎｅ，Ｍａｒ．１，１９９１，１７３（３）：７７５−８；ｄｅＷｉｔＨら，「単球細胞におけるＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−６遺伝子発現の示差的調節（ＤｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆＭ−ＣＳＦａｎｄＩＬ−６ｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｍｏｎｏｃｙｔｉｃｃｅｌｌｓ）」，ＢｒｉｔｉｓｈＪｏｕｒｎａｌｏｆＨａｅｍａｔｏｌｏｇｙ，１９９４Ｆｅｂ．，８６（２）：２５９−６４；ＳｐｒｅｃｈｅｒＥ．ら，「ポリメラーゼ連鎖反応による、単純ヘルペスウイルス−１による感染の際のケラチノサイト、ランゲルハンス細胞および腹腔滲出細胞中のＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、およびＩＬ−６遺伝子転写物の検出（ＤｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＩＬ−１β，ＴＮＦ−α，ａｎｄＩＬ−６ｇｅｎｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｂｙｔｈｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎｉｎｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ，Ｌａｎｇｅｒｈａｎｓｃｅｌｌｓａｎｄｐｅｒｉｔｏｎｅａｌｅｘｕｄａｔｅｃｅｌｌｓｄｕｒｉｎｇｉｎｆｅｃｔｉｏｎｗｉｔｈｈｅｒｐｅｓｓｉｍｐｌｅｘｖｉｒｕｓ−１）」，ＡｒｃｈｉｖｅｓｏｆＶｉｒｏｌｏｇｙ，１９９２，１２６（１−４）：２５３−６９）。
【００７１】
本発明の方法に利用する好適なベクターは、アデノウイルス、レトロウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターなどのウイルスベクターが挙げられる。
【００７２】
選択されるウイルスベクターは次の判定基準に適合すべきである：１）ベクターは腫瘍細胞に感染できなければならないので、適当な宿主範囲を有するウイルスベクターを選択すること；２）導入した遺伝子は存続して長時間にわたり細胞内で発現すること；そして３）ベクターは宿主に対して安全であって最小限の細胞トランスフォームを起こすこと。レトロウイルスベクターとアデノウイルスは、効率的、有用、かつ現在最も良く特性決定された、外来遺伝子を効率的に哺乳類細胞に導入し発現させる手段を提供する。これらのベクターは、非常に広い宿主および細胞型範囲を有し、遺伝子を安定して効率よく発現する。これらのベクターの安全性は多くの研究グループによって証明されている。実際、多数が臨床試験に使われている。
【００７３】
障害を矯正するために細胞中への遺伝子導入に利用しうる他のウイルスベクターとしては、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭｕＬＶ）などのレトロウイルス；ＪＣ、ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルスなどのパポバウイルス；エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）；乳頭腫ウイルス、例えばウシ乳頭腫ウイルスＩ型（ＢＰＶ）；ワクシニアおよびポリオウイルスならびに他のヒトおよび動物ウイルスが挙げられる。
【００７４】
アデノウイルスは、クローニング運搬体として魅力的ないくつかの性質をもつ（Ｂａｃｈｅｔｔｉｓら：「精製単純ヘルペスウイルスＤＮＡによる、チミジンキナーゼ欠損ヒト細胞への遺伝子導入（Ｔｒａｎｓｆｅｒｏｆｇｅｎｅｆｏｒｔｈｙｍｉｄｉｎｅｋｉｎａｓｅ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔｈｕｍａｎｃｅｌｌｓｂｙｐｕｒｉｆｉｅｄｈｅｒｐｅｓｓｉｍｐｌｅｘｖｉｒａｌＤＮＡ）」，ＰＮＡＳＵＳＡ，１９７７７４：１５９０；Ｂｅｒｋｎｅｒ，Ｋ．Ｌ．：「異種遺伝子発現用のアデノウイルスベクターの開発（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｖｅｃｔｏｒｓｆｏｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓｇｅｎｅｓ）」，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１９８８６：６１６；ＧｈｏｓｈＣｈｏｕｄｈｕｒｙＧ．ら，「感染性細菌プラスミドに基づくヒトアデノウイルスクローニングベクター（Ｈｕｍａｎａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｃｌｏｎｉｎｇｖｅｃｔｏｒｓｂａｓｅｄｏｎｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓｂａｃｔｅｒｉａｌｐｌａｓｍｉｄｓ）」，Ｇｅｎｅ１９８６；５０：１６１；ＨａｇＡｈｍａｎｄＹ．ら，「ヘルパー非依存性ヒトアデノウイルスベクターの開発と単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子の導入におけるその利用（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆａｈｅｌｐｅｒ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｈｕｍａｎａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｖｅｃｔｏｒａｎｄｉｔｓｕｓｅｉｎｔｈｅｔｒａｎｓｆｅｒｏｆｔｈｅｈｅｒｐｅｓｓｉｍｐｌｅｘｖｉｒｕｓｔｈｙｍｉｄｉｎｅｋｉｎａｓｅｇｅｎｅ）」，ＪＶｉｒｏｌ１９８６；５７：２５７；ＲｏｓｅｎｆｅｌｄＭ．ら，「ｉｎｖｉｖｏでの、肺上皮への組換えα_１−アンチトリプシン遺伝子のアデノウイルスを介する導入（Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ−ｍｅｄｉａｔｅｄｔｒａｎｓｆｅｒｏｆａｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ．ａｌｐｈａ．．ｓｕｂ．１ −ａｎｔｉｔｒｙｐｓｉｎｇｅｎｅｔｏｔｈｅｌｕｎｇｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍｉｎｖｉｖｏ）」．Ｓｃｉｅｎｃｅ１９９１；２５２：４３１））。
【００７５】
例えば、アデノウイルスは、細胞核内で複製する中間サイズのゲノムを有し；多くの血清型は臨床的に無害であり；アデノウイルスゲノムは外来遺伝子を挿入しても安定と考えられ；外来遺伝子が損失または再配置なく維持されるようであり；そしてアデノウイルスは４週間〜数ヶ月間の発現期間をもつ高レベルの一過性発現ベクターとして利用しうる。広範な生化学的および遺伝学的研究は、７〜７．５ｋｂの異種配列を天然のアデノウイルス配列と置き換えて、生存可能な条件付きのヘルパー非依存性ベクターを作製することが可能であることを示唆する（ＫａｕｆｍａｎＲ．Ｊ．；「アデノウイルス翻訳制御に必要な構成要素の同定とｃＤＮＡ発現ベクターにおけるそれらの利用（ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｃｏｍｐｏｎｅｎｔｎｅｃｅｓｓａｒｙｆｏｒａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌｃｏｎｔｒｏｌａｎｄｔｈｅｉｒｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎｉｎｃＤＮＡｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｓ）」，ＰＮＡＳＵＳＡ，１９８５８２：６８９）。
【００７６】
ＡＡＶは、ほぼ５ｋｂの一本鎖ＤＮＡゲノムをもつ小さいヒトパルボウイルスである。このウイルスは、複数のヒト細胞型に組み込まれたプロウイルスとして伝播することができる。ＡＡＶベクターはヒト遺伝子治療用にいくつかの利点がある。例えば、これらはヒト細胞に対し栄養依存性であるが、他の哺乳類細胞にも感染しうる；（２）ヒトまたは他の動物においてＡＡＶに関連する疾患はない；（３）組み込まれたＡＡＶゲノムはその宿主細胞内で安定であると思われる；（４）ＡＡＶの組込みが宿主遺伝子もしくはプロモーターの発現を改変するかまたはそれらの再配置を促進することは示されていない；（５）導入した遺伝子は、アデノウイルスなどのヘルパーウイルスを用いる感染によって、宿主細胞からレスキューしうる。
【００７７】
ＨＳＶ−１ベクター系は、非***細胞中への実質的にすべての遺伝子の導入を容易なものにする（Ｇｅｌｌｅｒら，「欠陥単純ヘルペスウイルスベクターのための効率的な欠失突然変異パッケージングシステム：ヒト遺伝子治療および神経生理学への応用可能性（ａｎｅｆｆｉｃｉｅｎｔｄｅｌｅｔｉｏｎｍｕｔａｎｔｐａｃｋａｇｉｎｇｓｙｓｔｅｍｆｏｒａｄｅｆｅｃｔｉｖｅｈｅｒｐｅｓｓｉｍｐｌｅｘｖｉｒｕｓｖｅｃｔｏｒｓ：Ｐｏｔｅｎｔｉａｌａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｔｏｈｕｍａｎｇｅｎｅｔｈｅｒａｐｙａｎｄｎｅｕｒｏｎａｌｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ）」，ＰＮＡＳＵＳＡ，１９９０８７：８９５０）。
【００７８】
哺乳類遺伝子導入用の他のベクターは、ウシ乳頭腫ウイルスに基づくベクターである（ＳａｒｖｅｒＮ，ら，「ウシ乳頭腫ウイルスＤＮＡ：新規の真核生物クローニングベクター（ＢｏｖｉｎｅｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓＤＮＡ：Ａｎｏｖｅｌｅｕｋａｒｙｏｔｉｃｃｌｏｎｉｎｇｖｅｃｔｏｒ）」．ＭｏｌＣｅｌｌＢｉｏｌ１９８１；１：４８６）。
【００７９】
ワクシニアおよび他のポックスウイルスに基づくベクターは、哺乳類遺伝子導入系を提供する。ワクシニアウイルスは、１２０キロダルトン（ｋｄ）ゲノムサイズの大きな二本鎖ＤＮＡウイルスである（ＰａｎｉｃａｌｉＤ，ら，「クローニングベクターとしてのポックスウイルスの構築：単純ヘルペスウイルスから感染性ワクチンウイルスのＤＮＡ中へのチミジンキナーゼ遺伝子の挿入（Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆｐｏｘｖｉｒｕｓａｓｃｌｏｎｉｎｇｖｅｃｔｏｒｓ：ＩｎｓｅｒｔｉｏｎｏｆｔｈｅｔｈｙｍｉｄｉｎｅｋｉｎａｓｅｇｅｎｅｆｒｏｍｈｅｒｐｅｓｓｉｍｐｌｅｘｖｉｒｕｓｉｎｔｏｔｈｅＤＮＡｏｆｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓｖａｃｃｉｎｅｖｉｒｕｓ）」，ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ１９８２；７９：４９２７；Ｓｍｉｔｈら「Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原を発現する感染性ワクシニアウイルス組換え体（ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓｖａｃｃｉｎｉａｖｉｒｕｓｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｓｔｈａｔｅｘｐｒｅｓｓｈｅｐａｔｉｔｉｓＢｖｉｒｕｓｓｕｒｆａｃｅａｎｔｉｇｅｎｓ）」，Ｎａｔｕｒｅ，１９８３３０２：４９０．）。
【００８０】
レトロウイルスはウイルス遺伝子を宿主細胞中に挿入するように設計したパッケージである（ＧｕｉｌｄＢら，「ｉｎｖｉｖｏでの培養マウス胚細胞および造血細胞における遺伝子発現に有用なレトロウイルスベクターの開発（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｖｅｃｔｏｒｓｕｓｅｆｕｌｆｏｒｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇｇｅｎｅｓｉｎｃｕｌｔｕｒｅｄｍｕｒｉｎｅｅｍｂｒｙｏｎｉｃｃｅｌｌｓａｎｄｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃｃｅｌｌｓｉｎｖｉｖｏ）」，ＪＶｉｒｏｌ１９８８；６２：７９５；ＨｏｃｋＲ．Ａ．ら，「ヒト造血前駆細胞における、薬物耐性遺伝子のレトロウイルスを介する導入と発現（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｍｅｄｉａｔｅｄｔｒａｎｓｆｅｒａｎｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｄｒｕｇｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｇｅｎｅｓｉｎｈｕｍａｎｈｅｍｏｐｏｉｅｔｉｃｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｃｅｌｌｓ）」，Ｎａｔｕｒｅ１９８６；３２０：２７５）。基本レトロウイルスは、プロウイルスタンパク質にパッケージされた２つの同一のＲＮＡ鎖からなる。そのコアはエンベロープと呼ばれる保護コートにより囲まれ、該エンベロープは先の宿主の膜に由来するがウイルスの寄与による糖タンパク質を用いて改変されている。
【００８１】
マーカーや増幅体も被験者発現系に使用することができる。トランスフォーム細胞系を選択するのに有用である様々なマーカーが知られていて、マーカーは一般的に、細胞が適当な選択培地で増殖されると発現してトランスフォーム細胞に選択可能な表現型を与える遺伝子を含んでなる。哺乳類細胞系に対するそのようなマーカーは、例えば、マイコフェノール酸およびキサンチンを含有する培地中で選択できる、細菌キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（Ｍｕｌｌｉｇａｎら，（１９８１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７８：２０７２−２０７６）、および哺乳類細胞に通常は毒性があるＧ４１８などのネオマイシン誘導体を含有する培地を用いて選択できる、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ネオマイシン／カナマイシン誘導体の抗菌作用を不活化するタンパク質を規定する）（Ｃｏｌｂｅｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎら，（１９８１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５０：１−１４）が挙げられる。他の真核生物発現系に有用なマーカーは、当業者に周知である。
【００８２】
感染はｉｎｖｉｔｒｏまたはｉｎｖｉｖｏで実施しうる。細胞のｉｎｖｉｔｒｏ感染は、遺伝子導入ベクターを細胞培養培地に加えることによって実施する。感染をｉｎｖｉｖｏで実施するときは、遺伝子導入ベクターを含有する溶液を、感染させる組織に依存して様々な方法で投与することができる。そのような投与方法の例は、遺伝子導入ベクターの皮膚への注射、皮膚上の局所適用、上皮表面への直接適用、または器官中への滴下注入（例えば、皮膚下または腫瘍中への経時放出パッチまたはカプセル）が挙げられる。
【００８３】
発現は、マウスジヒドロ葉酸レダクターゼ（ｄｈｆｒ）遺伝子などの増幅可能な遺伝子をコード配列に隣接して配置することによって増幅してもよい。その後、細胞をｄｈｆｒ欠損細胞におけるメトトレキセート耐性に対して選択することができる。例えば、Ｕｒｌａｕｂら，（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７７：４２１６−４２２０；Ｒｕｎｇｏｌｄら，（１９８１）Ｊ．Ｍｏｌ．ａｎｄＡｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１：１６５−１７５を参照。
【００８４】
上記の系は、様々な原核生物性、真核生物性およびウイルスタンパク質の発現を指令するために利用することができ、例えば、ワクチン抗原として利用するのに適当なウイルス糖タンパク質、免疫応答を調節するための免疫調節物質、ホルモン、サイトカインおよび増殖因子、ならびに他の生物医薬品の生産に有用であるタンパク質が挙げられる。
【００８５】
また、目的のタンパク質の突然変異体または類似体を作ることも所望されよう。突然変異体または類似体は、タンパク質をコードする配列の一部分の欠失によって、ある配列の挿入によって、および／またはその配列内の１以上のヌクレオチドの置換によって、作製することができる。位置指定突然変異誘発などのヌクレオチド配列を改変するための技術は、当業者に周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，前掲；「ＤＮＡクローニング（ＤＮＡＣｌｏｎｉｎｇ）」，ＩおよびＩＩ巻，前掲；「核酸ハイブリダイゼーション（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）」，前掲を参照。
【００８６】
本発明の目的にとって、宿主生物からポリペプチドの分泌をもたらすようにコード配列をさらに遺伝子操作することが特に望ましい。これはクローン安定性を増強しかつ宿主細胞内のタンパク質の有害なビルドアップを防止することにより、発現をさらに効率よく進行することができるようにする。この目的のために、相同シグナル配列を、シグナル配列と関連して通常見出されるタンパク質とともに利用することができる。さらに、タンパク質を分泌させる異種リーダー配列を構築物に加えることができる。好ましくは、プロセシング部位は、リーダー断片が、一緒に発現されるタンパク質から切断されるように含まれるであろう（例えば、そのような切断部位を導入する方法の考察については米国特許第４，３３６，２４６号を参照）。リーダー配列断片は、典型的には疎水性アミノ酸を含んでなるシグナルペプチドをコードする。
【００８７】
本発明の一実施形態においては、異種遺伝子配列、すなわち治療遺伝子を本発明の核酸分子中に挿入する。本発明の単離した核酸分子の他の実施形態としては、組織特異性を損なうことなく異種治療遺伝子の発現を増幅する単一エンハンサーエレメントまたは複数のエンハンサーエレメントの付加が挙げられる。
【００８８】
利用するトランスフォーム方法は、トランスフォームする宿主に依存する。哺乳類細胞をトランスフォームするのに利用できる好都合な方法は、例えばＤＥＡＥ−デキストランに基づく方法、リン酸カルシウム沈殿（Ｇｒａｈａｍ，Ｆ．Ｌ．およびＶａｎｄｅｒＥｂ，Ａ．Ｊ．（１９７３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ５２：４５６−４６７）、プロトプラスト融合、リポソームを介する導入、ポリブレンを介するトランスフェクション、および核中へのＤＮＡ直接マイクロインジェクションである。細菌細胞は、一般的に塩化カルシウムを用いて、単独でまたは他の２価カチオンおよびＤＭＳＯと組合せてトランスフォームしうる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ＆Ｍａｎｉａｔｉｓ，「分子クローニング：研究室マニュアル（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ）」，ＳｅｃｏｎｄＥｄｉｔｉｏｎ（１９８９））。ＤＮＡはまた、エレクトロポレーションによって細菌細胞中に導入することもできる。外因性ＤＮＡを酵母宿主中に導入する方法は、典型的にはスフェロプラストのトランスフォームまたはアルカリカチオンによって処理した無傷の酵母細胞のトランスフォームのいずれかが挙げられる。
【００８９】
構築物はまた、遺伝子治療または核酸免疫感作に利用して、発現構築物を被験者に直接投与することによりｉｎｖｉｖｏで所望の遺伝子産物の産生を指令してｉｎｖｉｖｏでそれを翻訳させることもできる。例えば、ＥＰＡ公開番号第３３６，５２３号（Ｄｒｅａｎｏら、１９８９年１０月１１日公開）を参照。あるいは、遺伝子導入は、被験者の細胞または組織をｅｘｖｉｖｏで発現構築物を用いてトランスフェクトし、トランスフォームした材料を宿主中に再導入することによって実施してもよい。構築物を宿主生物中に直接、すなわち、注射によって導入してもよい（例えば、国際公開番号ＷＯ／９０／１１０９２；およびＷｏｌｆｆら，（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４７：１４６５−１４６８を参照）。リポソームを介する遺伝子導入は公知の方法を用いて実施してもよい。例えば、Ｈａｚｉｎｓｋｉら，（１９９１）Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．ＣｅｌｌＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．４：２０６−２０９；Ｂｒｉｇｈａｍら，（１９８９）Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．２９８：２７８−２８１；Ｃａｎｏｎｉｃｏら，（１９９１）Ｃｌｉｎ．Ｒｅｓ．３９：２１９Ａ；およびＮａｂｅｌら，（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４９：１２８５−１２８８を参照。特定の細胞型上に発現される表面抗原に対する抗体などのターゲッティング薬剤は、核酸を特定の組織および細胞に送達して局所投与できるように、リポソーム表面と共有結合させてもよい。
【００９０】
ヒト遺伝子治療とベクターの診断利用
組換えＲＮＡ勧告委員会（ＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＤＮＡＡｄｖｉｓｏｒｙＣｏｍｍｉｔｔｅｅ）（ＲＡＣ）によって利用が承認されている複数のヒト遺伝子治療用プロトコルは、標的細胞感染およびトランスフェクト細胞投与の一般プロトコルと適合する（例えば、Ｂｌａｅｓｅ，Ｒ．Ｍら、１９９０；Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｗ．Ｆ．、１９９２；Ｃｕｌｖｅｒ，Ｋ．Ｗ．ら、１９９１参照）。さらに、米国特許第５，３９９，３４６号（Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｗ．Ｆ．ら、１９９５年３月２１日、米国特許出願第２２０，１７５号）はレトロウイルス遺伝子導入の方法を記載する。これらの裏付けとなる参照文献の内容はその全文が本特許出願に組み入れられる。レトロウイルスを介する遺伝子導入は、安定した組込みを達成するために細胞***が進行中の標的細胞を必要とするので、被験者からしばしば血液または骨髄を採取することにより細胞を採集する。感染プロトコルで利用するために、元来集めた細胞の特定亜集団を選択する必要のあることがある。次いで、目的の遺伝子を含有するレトロウイルスベクターを培地に混合する。ベクターは被験者の細胞の表面と結合して細胞に進入し、そして目的の遺伝子を無作為に染色体中に挿入する。目的の遺伝子は今や安定して組込まれ、定位置に残り、そして細胞数が増えると全ての娘細胞に受け継がれる。細胞は再注入まで培養して全９〜１０日間増殖させればよい（Ｃｕｌｖｅｒら、１９９１）。標的細胞を培養させる時間が長くなるほど、異物混入の可能性も増加するので、プロトコルは短いほど好ましいであろう。
【００９１】
本発明は、遺伝子治療用途または診断利用のために、目的の遺伝子と連結したＰＥＧ−３プロモーターまたはその機能的等価物を含有するレトロウイルスベクターの構築を提供する。これらのベクターの形質導入効率は細胞培養系で試験することができる。
【００９２】
本発明の組成物の利用
本発明は、目的の遺伝子を癌細胞に標的化してその遺伝子がコードするタンパク質を発現させ、そして直接または間接に病状を改善することを伴う。ＰＥＧ−３プロモーターは、癌進行中の癌細胞に特異的に活性があるので、組織特異的な（癌細胞に対して特異的な）プロモーターとして作用しうる。
【００９３】
感受性細胞に感染した後、ベクターの特異的プロモーターにより駆動されるトランスジーンはその遺伝子がコードするタンパク質を発現する。高度に特異的な遺伝子ベクターを利用すると、癌細胞における特異的遺伝子の選択的発現が可能になる。本発明の方法の基本的な仕事は、目的の遺伝子を単離し、目的の遺伝子を身体に送達するのに適当なベクター運搬体を選択し、目的の遺伝子を有するベクターを身体内に投与し、そして目的の遺伝子の適当な発現を達成することである。本発明は、それを必要とする患者の血流または関係器官中に直接注入しうる方法で、クローニングした遺伝子、すなわち目的の遺伝子のパッケージングを提供する。該パッケージングは、外来ＤＮＡを免疫系による排除から保護して適当な組織または細胞へ導く。
【００９４】
本発明の一実施形態においては、目的の遺伝子（所望のコード配列）は癌抑制遺伝子である。癌抑制遺伝子は、ｐ２１、ＲＢ（網膜芽細胞腫）またはｐ５３であってもよい。当業者であれば、他の癌抑制遺伝子にも精通しているであろう。癌抑制遺伝子に関する当技術分野の状況をさらに明白に記載するため、最近の米国特許第６，０２５，１２７号および第５，９１２，２３６号が本明細書に参照により組み入れられる。
【００９５】
ヒトまたは動物の目的の遺伝子とともに、他の遺伝子、例えば選択マーカーを挿入して、改変したレトロウイルスを組込んでいる細胞の同定を容易にすることができる。遺伝子治療の方法の最も重要な点は、新しい遺伝子を標的細胞内に適当なレベルで満足すべき発現期間にわたって発現しなければならないことである。
【００９６】
ベクターを改変しかつその改変ベクターを皮膚中に投与するための以下に記載した方法は、単に説明の目的のためでありかつ利用しうる方法の典型である。しかし、当技術分野で理解されている他の方法も使用することができる。
【００９７】
ベクターなどを構築するために利用するほとんどの技術は、当技術分野で広範に実施されていて、ほとんどの当業者は、特定の条件と方法を記載する標準的な資料を精通している。しかし以下の章は、便宜上、ガイドラインとなるであろう。
【００９８】
ベクター構築の一般的方法
所望の治療遺伝子のコード配列および制御配列を含有する適当なベクターの構築は、当技術分野で十分理解されている標準のライゲーションと制限酵素技術を使用する（Ｍａｎｉａｔｉｓら，「分子クローニング：研究室マニュアル（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ）」，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮｅｗＹｏｒｋ（１９８２）を参照）。単離したプラスミド、ＤＮＡ配列、または合成オリゴヌクレオチドを切断し、仕立て、そして所望の形に再ライゲートする。
【００９９】
位置指定ＤＮＡ切断は、適当な１以上の制限酵素を用いて、一般的に当技術分野で理解されかつ個々については市販制限酵素の製造業者が規定する条件（例えば、ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ製品カタログ）のもとで処理することによって実施する。一般的に、ほぼ１μｇのプラスミドまたはＤＮＡ配列を、ほぼ２０μｌのバッファー溶液中の１単位の酵素によって切断する。典型的には、過剰の制限酵素を利用してＤＮＡ基質の完全な消化を保証する。
【０１００】
３７℃にてほぼ１〜２時間のインキュベーション時間で処理できるが、変更もありうる。それぞれのインキュベーション後に、タンパク質をフェノール／クロロホルムを用いる抽出によって除去し、次いでエーテル抽出し、そして核酸を水性画分からエタノールを用いる沈殿によって回収する。もし所望であれば、切断断片のサイズ分離を、ポリアクリルアミドゲルまたはアガロースゲル電気泳動により、標準技術を用いて実施してもよい。サイズ分離の一般的記載は、ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ６５：４９９−５６０（１９８０）に見出される。
【０１０１】
制限酵素切断断片は、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩの大断片（クレノウ（Ｋｒｅｎｏｗ））を用いて、４種のデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰｓ）の存在のもとで処理することにより平滑末端化することができ、この処理は、ほぼ１５〜２５分のインキュベーション時間、２０℃〜２５℃の条件を用いて５０ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ７．６）５０ｍＭＮａＣｌ、６ｍＭＭｇＣｌ_２、６ｍＭＤＴＴおよび５−１０μＭｄＮＴＰｓ中で実施する。４種のｄＮＴＰｓが存在しても、クレノウフラグメントは５’粘着末端を充填するが、３’突出一本鎖は削り込む。もし所望であれば、選択的修復を、ｄＮＴＰｓの１種を供給するかまたは選択したｄＮＴＰｓを用いて、粘着末端の特性により規定される制限内で実施してもよい。クレノウによる処理の後、混合物をフェノール／クロロホルムを用いて抽出し、エタノールで沈殿させる。適当な条件下でＳ１ヌクレアーゼまたはＢａｌ−３１を用いて処理すると、任意の一本鎖部分の加水分解が起こる。
【０１０２】
ライゲーションは、次の標準条件と温度のもとでＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて、１０−５０μｌ容積で実施する。ライゲーションのプロトコルは標準である（Ｄ．Ｇｏｅｄｄｅｌ（編）「遺伝子発現技術：酵素学の方法（ＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）」（１９９１））。「ベクター断片」を使用するベクター構築において、ベクター断片は、５’リン酸を除去してベクターの再ライゲーションを防止するために、通常、細菌アルカリホスファターゼ（ＢＡＰ）または子ウシ腸アルカリホスファターゼ（ＣＩＰ）を用いて処理する。代わりに、望ましくない断片を追加の制限酵素消化によって二重消化しておいたベクターで、再ライゲーションを防止してもよい。
【０１０３】
適当なベクターは、ウイルスベクターシステム、例えばＡＤＶ、ＲＶ、およびＡＡＶが挙げられる（Ｒ．Ｊ．Ｋａｕｆｍａｎ「「哺乳類細胞における発現に用いるベクター（Ｖｅｃｔｏｒｓｕｓｅｄｆｏｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｍａｍｍａｌｉａｎｃｅｌｌｓ）」，ＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｄ．Ｖ．Ｇｏｅｄｄｅｌ編（１９９１））。
【０１０４】
機能性ＤＮＡトランスジーンを細胞中に挿入する多数の方法が当技術分野では知られている。例えば、非ベクター法は、細胞中へのＤＮＡの非ウイルス性物理的トランスフェクション；例えば、マイクロインジェクション（（ＤｅＰａｍｐｈｉｌｉｓら，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅ６：６６２−６８０（１９８８））；リポソームを介するトランスフェクション（Ｆｅｌｇｎｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４：７４１３−７４１７（１９８７）、ＦｅｌｇｎｅｒおよびＨｏｌｍ，Ｆｏｃｕｓ１１：２１−２５（１９８９）ならびにＦｅｌｇｎｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｗｅｓｔ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｏｃ．３２：１１５−１２１（１９８９））、ならびに当技術分野で知られる他の方法が挙げられる。
【０１０５】
改変したベクターの被験者への投与
ＤＮＡを標的細胞中に入れる１つの方法は、ＤＮＡをスフェロプラストもしくはリポソームなどの膜に囲まれた嚢もしくは小胞内に置くか、またはリン酸カルシウム沈殿（ＣａＰＯ_４）による（ＧｒａｈａｍＦ．およびＶａｎｄｅｒＥｂ，Ａ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ５２：４５６１９７３；Ｓｃｈａｅｆｅｒ−ＲｉｄｄｅｒＭ．ら，「遺伝子担体としてのリポソーム：チミジンキナーゼ遺伝子によるマウスＬ細胞の効率的な形質導入（Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓａｓｇｅｎｅｃａｒｒｉｅｒｓ：ＥｆｆｉｃｉｅｎｔｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎｏｆｍｏｕｓｅＬｃｅｌｌｓｂｙｔｈｙｍｉｄｉｎｅｋｉｎａｓｅｇｅｎｅ）」，Ｓｃｉｅｎｃｅ１９８２，２１５：１６６；ＳｔａｖｒｉｄｉｓＪ．Ｃ．ら，「外因性ＤＮＡをウサギの骨髄赤芽球へｉｎｖｉｖｏ輸送するためのトランスフェリンコートしたリポソームの構築（Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ−ｃｏａｔｅｄｌｉｐｏｓｏｍｅｓｆｏｒｉｎｖｉｖｏｔｒａｎｓｐｏｒｔｏｆｅｘｏｇｅｎｏｕｓＤＮＡｔｏｂｏｎｅｍａｒｒｏｗｅｒｙｔｈｒｏｂｌａｓｔｓｉｎｒａｂｂｉｔｓ）」，ＥｘｐＣｅｌｌＲｅｓ１９８６；１６４：５６８−５７２）。
【０１０６】
小胞は、その膜が標的細胞の外膜と融合するように構築することができる。小胞中の本発明のベクターは癌細胞中に辿り着くことができる。
【０１０７】
スフェロプラストは、ポリエチレングリコールなどの融合促進物質（ｆｕｓｏｇｅｎ）を用いて哺乳類標的細胞へ融合されうるまで、高イオン強度バッファー中で維持する。
【０１０８】
リポソームは人工リン脂質小胞である。小胞はサイズが０．２〜４．０ミクロンであり、巨大分子を含有する１０％〜４０％のバッファー水溶液を封じこめることができる。リポソームはＤＮＡをヌクレアーゼから保護し、標的細胞中への導入を容易にする。トランスフェクションはまた、エレクトロポレーションによっても起こりうる。
【０１０９】
投与前に、改変したベクターを、完全ＰＢＳ中に注射のために選択した密度で懸濁する。ＰＢＳに加えて、任意に浸透圧を平衡化しかつ生理学的に被験者と適合しうる溶液を用いて懸濁し、その上で改変ベクターを宿主中に注入してもよい。
【０１１０】
注射には、細胞懸濁液を注射器内に引きこんで、そして麻酔した受給者に投与する。この方法を用いて多重注射を行うことができる。このようにして、ウイルス懸濁方法によって、遺伝子操作的に改変したベクターを皮膚の任意の予め決めた部位に投与することが可能であり、比較的傷付けることなく、同じウイルス懸濁液を用いて、複数の異なる部位または同じ部位に同時に多重投与することを可能にする。多重注射は治療遺伝子の混合物からなってもよい。
【０１１１】
このように投与した改変ベクターの生存
遺伝子の発現は、転写、翻訳または翻訳後のレベルで制御される。転写開始は、遺伝子発現における早期の重要な事象である。これはプロモーターおよびエンハンサー配列に依存しかつこれらの配列と相互作用する特定の細胞因子の影響を受ける。多くの原核生物遺伝子の転写単位はプロモーターおよび複数の事例ではエンハンサーまたはレギュレーターエレメントからなる（Ｂａｎｅｒｊｉら，Ｃｅｌｌ２７：２９９（１９８１）；Ｃｏｒｄｅｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ２０９：１４０６（１９８０）；ならびにＢｒｅａｔｈｎａｃｈおよびＣｈａｍｂｏｎ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５０：３４９（１９８１））。
【０１１２】
レトロウイルスでは、レトロウイルスゲノムの複製に関わる制御エレメントは長末端反復配列（ＬＴＲ）に存在する（Ｗｅｉｓｓら編，「腫瘍ウイルスの分子生物学：ＲＮＡ腫瘍ウイルス（Ｔｈｅｍｏｌｅｃｕｌａｒｂｉｏｌｏｇｙｏｆｔｕｍｏｒｖｉｒｕｓｅｓ：ＲＮＡｔｕｍｏｒｖｉｒｕｓｅｓ）」，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８２））
モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）およびラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲは、プロモーターおよびエンハンサー配列を含有する（Ｊｏｌｌｙら，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１１：１８５５（１９８３）；Ｃａｐｅｃｃｈｉら，「エンハンサーと真核生物遺伝子発現（Ｅｎｈａｎｃｅｒａｎｄｅｕｋａｒｙｏｔｉｃｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）」，ＧｕｌｚｍａｎおよびＳｈｅｎｋ編，ｐｐ．１０１−１０２，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）。
【０１１３】
複数の非ウイルスプロモーターのプロモーターとエンハンサー領域も記載されている（Ｓｃｈｍｉｄｔら，Ｎａｔｕｒｅ３１４：２８５（１９８５）；ＲｏｓｓｉおよびｄｅＣｒｏｍｂｒｕｇｇｈｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８４：５５９０−５５９４（１９８７））。
【０１１４】
ウイルスおよび非ウイルスのプロモーターを用いて治療遺伝子発現を駆動するのに加えて、エンハンサー配列を用いて治療遺伝子発現のレベルを増加してもよい。エンハンサーは、それらの天然の遺伝子の転写活性だけでなく複数の外来遺伝子の転写活性も同様に増加させることができる（Ａｒｍｅｌｏｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７０：２７０２（１９７３））。
【０１１５】
治療遺伝子発現はまた、プロモーター活性をモジュレートするサイトカインを用いて、注入後の長期間にわたる安定した発現を増加させることもできる。
【０１１６】
本発明の方法を、治療遺伝子を担持する改変したベクターを被験者の脳内に注入する好ましい実施形態によって例示する。
【０１１７】
本発明の分子に対する投与および投与量計画の最も効果的な様式は、治療する癌の正確な位置、癌の重篤度および経過、被験者の健康および治療に対する応答、ならびに治療医師の判断に依存する。従って、分子の投与量は個々の被験者に対して滴定すべきである。分子は、直接または他細胞を経由して間接に送達することができ、自己細胞が好ましいが、異種細胞も本発明の範囲に包含される。
【０１１８】
様々なサイズおよび種の動物ならびにヒトに対する投与量とそれが基づく表面積１ｍ^２当たりのｍｇとの相互関係は、Ｆｒｅｉｒｅｉｃｈ，Ｅ．Ｊ．ら，ＣａｎｃｅｒＣｈｅｍｏｔｈｅｒ．，Ｒｅｐ．５０（４）：２１９−２４４（１９６６）に記載されている。投与量計画を調節して、腫瘍細胞増殖を抑制および死滅させる応答を最適化してもよく、例えば、投与量を分割して日単位で投与するかまたは状況に応じて比例的に減少させた量で投与してもよい（例えば、複数に分割した投与量を毎日投与するかまたは特定の治療状況に応じて比例的に減少させて投与してもよい）。
【０１１９】
治癒を達成するのに必要な本発明の分子の投与量を、スケジュール最適化によってさらに削減しうることは明らかであろう。
【０１２０】
癌細胞における異種遺伝子の高発現を指令するためのＰＥＧ− プロモーターの利用
本発明の一実施形態は、癌細胞内で内因的に発現されない目的の遺伝子を発現する方法であって、ａ）目的の遺伝子と機能的に連結されているＰＥＧ−３プロモーターを含む核酸を構築し；ｂ）この核酸を、ＰＥＧ−３を発現する癌細胞中に導入し、それによって癌細胞内でＰＥＧ−３プロモーターに目的の遺伝子の発現を指令させることを含む前記方法を提供する。一実施形態においては、目的の遺伝子は、癌細胞に対して細胞傷害性をもつタンパク質をコードし、癌細胞のアポトーシスを引き起こし、癌細胞の増殖を遅延させ、または癌細胞の***を停止する。目的の遺伝子は、その発現が癌細胞内に、増殖の低減または癌表現型進行の低減もしくは抑制などの所望の生化学的または生理学的効果を起こしうるいずれの遺伝子であってもよい。
【０１２１】
本発明の核酸構築物を被験者の癌を治療する前記方法に利用する１つの利点は、核酸を癌細胞および正常細胞の両方に投与できることにある。しかし、ＰＥＧ−３プロモーターは癌細胞においてのみ活性があるので、正常細胞で目的の遺伝子は発現しないのに対して癌細胞では目的の遺伝子の高発現が起こる。従ってこの核酸構築物によって、目的の遺伝子の特異的発現を特異的に癌細胞に標的化することが可能になる。
【０１２２】
リポソームを送達薬剤として利用して核酸構築物を治療すべき被験者の細胞に導入することができる。勿論、そのような核酸構築物を送達する多数の方法が存在し、当業者にはそれらは周知である（例えば、マイクロインジェクション；局所適用；化学運搬体の利用；腫瘍中への直接注入；など）。
【０１２３】
本発明を次の実験の詳細の節において説明する。これらの節は本発明の理解を助けるために記載するものであって、本願の請求の範囲に記載した本発明をいずれの方法であれ限定すると解釈されるべきものではない。
【０１２４】
実験の詳細
実施例１：トランスフォーメーション進行中の示差発現の原因になる、進行上昇遺伝子 −３プロモーター内の領域の規定
癌は進行性疾患であり、腫瘍細胞は、質的に新しいトランスフォーメーションに関係する表現型または現存トランスフォーメーションに関連する特性のさらなる生成を経時的に発生する。げっ歯類動物細胞培養モデル系を用いて癌進行に関連しかつ制御する遺伝子を規定する。サブトラクションハイブリダイゼーションによって、突然変異体アデノウイルス５型、Ｈ５ｔｓ１２５でトランスフォームした（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ）ラット胚細胞におけるトランスフォーメーション進行の誘導に機能的に関わる新規遺伝子を同定し、これを進行上昇遺伝子−３（ＰＥＧ−３）と呼んだ。ほぼ２．１キロ塩基の５’−フランキングプロモーター領域、ＰＥＧ−プロモーターを単離し、クローニングして特性を決定した。ＰＥＧ−プロモーターの全長および様々な突然変異領域をルシフェラーゼレポーター構築物と連結して、癌進行中のプロモーター活性を一過性トランスフェクションアッセイを用いて評価した。これらの実験は、非進行性Ｈ５ｔｓｌ２５−トランスフォームラット胚細胞と対比して、ＰＥＧ−３発現増大に介在するＰＥＧ−３のＴＡＴＡボックス領域に隣接するＡＰ−１とＰＥＡ−３部位の必要性を実証した。ＰＥＧ−３調節に対するＡＰ−１およびＰＥＡ−３の関わりはまた、タンパク質ブロッティング、電気泳動移動度シフト（ＥＭＳＡ）アッセイならびにＰＥＡ−３およびｃ−Ｊｕｍ発現ベクターを用いたトランスフェクション研究によっても実証された。本発明者らの発見は、攻撃的かつ進行性癌表現型を提示するＨ５ｔｓｌ２５トランスフォームラット胚細胞における、ＰＥＧ−３発現上昇に介在するＡＰ−１とＰＥＡ−３転写因子の重要性を立証する。
【０１２５】
実施例２：進行上昇遺伝子 −３（ＰＥＧ−３）プロモーター内のＡＰ−１とＰＥＡ−３部位間の協同作用が、トランスフォームしたラット胚細胞における腫瘍形成表現型進行中のＰＥＧ−３の基底および示差発現を調節する
発癌プロセスは、一連の細胞表現型の逐次変化に関わり、腫瘍細胞を発展することによって新しい特性またはトランスフォーメーションに関連する形質のさらなる生成をもたらす（Ｆｉｓｈｅｒ、１９８４；Ｂｉｓｈｏｐ、１９９１；Ｋｎｕｄｓｏｎ、１９９３；ＶｏｇｅｌｓｔｅｉｎおよびＫｉｎｚｌｅｒ、１９９３）。広範囲の研究が行われているが、ほとんどのヒト癌発生中の腫瘍細胞進行の根底にある正確な遺伝機構は未だわかっていない。実験的確証は、多数の多様な作用をする遺伝子エレメントが癌発生とトランスフォーメーション進行に寄与しうることを示す（Ｆｉｓｈｅｒ、１９８４；Ｂｉｓｈｏｐ、１９９１；Ｌｉｏｔｔａら、１９９１；Ｋｎｕｄｓｏｎ、１９９３；Ｌｅｖｉｎｅ、１９９３；ＨａｒｔｗｅｌｌおよびＫａｓｔａｎ、１９９４；Ｋａｎｇら、１９９８ａ；ＶｏｇｅｌｓｔｅｉｎおよびＫｉｎｚｌｅｒ、１９９３；Ｓｕら、１９９７；１９９９）。これらのプロセスに関わる重要な標的遺伝子としては、発癌遺伝子、癌抑制遺伝子ならびにゲノム安定性、癌攻撃性および血管形成を調節する遺伝子が挙げられる（Ｆｉｓｈｅｒ、１９８４；Ｂｉｓｈｏｐ、１９９１；Ｌｉｏｔｔａら、１９９１；Ｋｎｕｄｓｏｎ、１９９３；Ｌｅｖｉｎｅ、１９９３；ＨａｒｔｗｅｌｌおよびＫａｓｔａｎ、１９９４；Ｋａｎｇら、１９９８ａ；ＶｏｇｅｌｓｔｅｉｎおよびＫｉｎｚｌｅｒ、１９９３；Ｓｕら、１９９７，１９９９）。最近、癌攻撃性に関連するかまたは特定の事例では直接調節するいくつかの新規の遺伝子エレメント、すなわち進行上昇（ＰＥＧｅｎ）および進行抑制（ＰＳＧｅｎ）遺伝子が同定された（Ｋａｎｇら、１９９８ａ；Ｓｕら、１９９７，１９９９）。これらの異なる遺伝子が癌進行の複雑なプロセスを編成する正確な機構は重要な研究分野であって、癌に対する新しい診断および治療手法をもたらしうる新規の経路および標的分子を規定する可能性を有する。
【０１２６】
腫瘍進行に介在する遺伝的および生化学的変化を規定する有用なモデルは、Ａｄ５／初期継代ＲＥ細胞培養系である（Ｆｉｓｈｅｒ、１９８４；Ｂａｂｉｓｓら、１９８５；Ｄｕｉｇｏｕら、１９８９、１９９０、１９９１；Ｆｉｓｈｅｒら、１９７９ａ，ｂ，ｃ；Ｒｅｄｄｙら、１９９３；Ｓｕら、１９９４、１９９７；Ｋａｎｇら、１９９８ａ）。二次ラット胚（ＲＥ）細胞のＡｄ５によるトランスフォーメーションはしばしば逐次プロセスであって、非トランスフォーム細胞によって特異的表現型のさらなる生成の取得が起こる（Ｆｉｓｈｅｒら、１９７９ａ、ｂ、ｃ；Ｂａｂｉｓｓら、１９８５）。Ａｄ５トランスフォーメーションモデルにおける進行は、足場非依存性増大および腫瘍形成能の発生（ヌードマウスにおける形成として）によって特徴づけられる（Ｆｉｓｈｅｒ、１９８４；Ｂａｂｉｓｓら、１９８５）。Ａｄ５トランスフォームＲＥ細胞の進行表現型は、寒天における増殖またはヌードマウスにおける腫瘍形成についての選択（Ｆｉｓｈｅｒら、１９７９ａ、ｂ、ｃ；Ｂａｂｉｓｓら、１９８５）により、Ｈａ−ｒａｓ、ｖ−ｓｒｃ、ｖ−ｒａｆまたはヒト乳頭腫ウイルス１８型のＥ６／Ｅ７領域などの発癌遺伝子を用いたトランスフェクション（Ｄｕｉｇｏｕら、１９８９；Ｒｅｄｄｙら、１９９３）により、またはタンパク質キナーゼＣなどの特定のシグナル伝達遺伝子を用いたトランスフェクション（Ｓｕら、１９９４）により誘導することができる。
【０１２７】
自発性または遺伝子導入後に誘発した進行は安定な細胞形質であって、単層培養中で多回継代（＞１００）後でもＡｄ５トランスフォームＲＥ細胞内で消滅することなく残存する（Ｆｉｓｈｅｒ、１９８４；Ｂａｂｉｓｓら、１９８５；Ｒｅｄｄｙら、１９９３）。しかし、脱メチル化剤５−アザシチジン（ＡＺＡ）を用いた１回の処理では、細胞クローンの＞９５％においてトランスフォーメーション進行の復帰が安定して起こる（Ｆｉｓｈｅｒ、１９８４；Ｂａｂｉｓｓら、１９８５；Ｄｕｉｇｏｕら、１９８９；Ｒｅｄｄｙら、１９９３；Ｓｕら、１９９４）。進行表現型はまた、正常もしくは非進行性トランスフォーム細胞と進行性細胞との間で形成された体細胞ハイブリッドでも抑制される（Ｄｕｉｇｏｕら、１９９０、１９９１；Ｒｅｄｄｙら、１９９３）。これらの知見は、進行が特定の進行促進（進行上昇）遺伝子の活性化もしくは進行抑制（進行抑制）遺伝子の選択的阻害、または恐らく両方のプロセスの組合せにより生じうることを示唆する（Ｆｉｓｈｅｒ、１９８４；Ｂａｂｉｓｓら、１９８５；Ｓｕら、１９９７；Ｋａｎｇら、１９９８ａ）。非進行性Ａｄ５トランスフォーム細胞と対比して進行性Ａｄ５トランスフォーム細胞において発現が上昇する潜在的進行誘導遺伝子を同定するために、本発明者らはサブトラクションハイブリダイゼーションおよび相互サブトラクションディファレンシャルＲＮＡディスプレイ（ｒｅｃｉｐｒｏｃａｌｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌＲＮＡｄｉｓｐｌａｙ；ＲＳＤＤ）手法を利用している（ＪｉａｎｇおよびＦｉｓｈｅｒ、１９９３；Ｒｅｄｄｙら、１９９３；Ｓｕら、１９９７；Ｋａｎｇら、１９９８ａ）。サブトラクションハイブリダイゼーション手法により、進行性細胞（自発性、癌遺伝子で誘導したまたは増殖因子関連遺伝子で誘導した）において、非進行性細胞（親Ａｄ５でトランスフォームした、ＡＺＡ−抑制した、および抑制された体細胞ハイブリッド）よりも上昇した発現を提示するＰＥＧ−３クローンを得た（Ｓｕら、１９９７）。これらの知見は、このラット胚モデル系におけるＰＥＧ−３発現と進行表現型の間の直接的な相関を立証する。
【０１２８】
核ランオンアッセイ（ｎｕｃｌｅａｒｒｕｎ−ｏｎａｓｓａｙ）は、ＰＥＧ−３発現とこの遺伝子のＲＮＡ転写速度増加との間の直接的な相関を確証する（Ｓｕら、１９９７）。トランスフォーメーション進行中のＰＥＧ−３の示差的発現の根底にある機構を解明するために、該プロモーター（ＰＥＧ−Ｐｒｏｍ）を含有するこの遺伝子の５’−フランキング領域を単離して特性を決定した。全長ほぼ２．０ｋｂＰＥＧ−ＰｒｏｍおよびＰＥＧ−Ｐｒｏｍ中の様々な突然変異（欠失および点突然変異を含む）を構築して分析した。この究明の結果は、ＡＰ１とＰＥＡ３転写因子が進行性Ａｄ５トランスフォームＲＥ細胞におけるＰＥＧ−３発現上昇の主要な決定因子であることを実証する。この結論を電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）ならびにｃ−ＪｕｎおよびＰＥＡ３発現ベクターを用いたトランスフェクション研究によって立証する。
【０１２９】
結果
ＰＥＧ３発現はトランスフォーメーション進行と直接的に相関する
ＰＥＧ−３発現とトランスフォーメーション進行との間の関係を評価するために、本発明者らは正常から高度進行性までの全範囲にわたる一連のげっ歯類動物細胞系を利用した（Ｆｉｓｈｅｒら、１９８７；Ｂａｂｉｓｓら、１９８５；Ｄｕｉｇｏｕら、１９８９；Ｒｅｄｄｙら、１９９３；Ｓｕら、１９９７，１９９９）。このげっ歯類動物モデルの進行表現型の特徴は、足場非依存性で増大した効率にて増殖しかつ腫瘍をヌードマウスにおいて短い腫瘍潜伏時間（それぞれ、３８〜４４日に対して１８〜２１日）で誘導する能力である（Ｂａｂｉｓｓら、１９８５；Ｓｕら、１９９９）。特定のＨ５ｔｓｌ２５でトランスフォームした二次スプラーグ・ドーリー（ＳｐｒａｇｕｅＤａｗｌｅｙ）ＲＥクローンであるＥ１１は寒天中で低効率（ほぼ２〜４％）で増殖する（進行性陰性）が、高度進行性ヌードマウス腫瘍から誘導したＥ１１サブクローンであるＥ１１−ＮＭＴは寒天中で高効率（ほぼ３０〜４５％）で増殖する（図１Ａ）。Ｅ１１細胞、代表クローンとしてＥ１１−ｒａｓＲ１２中のＨＡ−ｒａｓ発癌遺伝子を強制発現させると、足場非依存性増殖（図１Ａ）とヌードマウスにおける腫瘍潜伏時間の両方により示される進行表現型を獲得する（Ｒｅｄｄｙら、１９９３）。ノーザンハイブリダイゼーション（図１Ｂ）によってＰＥＧ−３ｍＲＮＡレベルを、およびウェスタンブロッティング（図１Ｃ）によってＰＥＧ−３タンパク質レベルを定量すると、ＰＥＧ−３発現（すなわち、Ｅ１１−ＮＭＴおよびＥ１１−ｒａｓＲ１２における上昇ならびにＥ１１における低下）と進行表現型（足場非依存性増殖により示される）との間に直接的な相関を示す。
【０１３０】
ＰＥＧ−３発現と進行との間の関係をさらに究明するために、Ｅ１１、Ｅｌｌ−ＮＭＴおよびＥ１１−ｒａｓＲ１２細胞で測定したのと同じ３つのパラメーターを用いて、Ｅ１１−ＮＭＴとＣＲＥＦ細胞との間で形成した一連の体細胞ハイブリッドを比較した（図１）。ＣＲＥＦ細胞は、寒天中で増殖するとコロニーを形成しない不死ラット胚細胞であって、無胸腺ヌードマウス中に皮下接種しても腫瘍形成能力をもたない（Ｆｉｓｈｅｒら、１９８２；Ｄｕｉｇｏｕら、１９９０）。同様に、Ｆ１およびＦ２などの膨れた（ｆａｔ）形態を提示するＥ１１−ＮＭＴとＣＲＥＦ細胞との間で形成した体細胞ハイブリッドもヌードマウスにおいて腫瘍を形成しない（Ｄｕｉｇｏｕら、１９９０）が、これらは寒天中でＥ１１細胞に類似した低い効率で増殖する（図１Ａ）。対照的に、Ｒ１およびＲ２などの円形の形態を示す特定のＥ１１−ＮＭＴＸＣＲＥＦ体細胞ハイブリッドは寒天中で高効率で増殖してＥ１１−ＮＭＴの効率すら超え（図１Ａ）、そしてヌードマウスにおいて迅速に腫瘍を形成する（Ｄｕｉｇｏｕら、１９９０）。Ｅ１１細胞で観察されたように、Ｆ１とＦ２細胞においてＰＥＧ−３ｍＲＮＡとタンパク質のレベルは低下するが、Ｒ１とＲ２はＥ１１−ＮＭＴおよびＥ１１−ｒａｓＲ１２細胞（図１Ｂ、１Ｃ）に類似するＰＥＧ−３の上昇した発現を提示する。ＣＲＥＦ細胞の場合には、ＰＥＧ−３ｍＲＮＡはノーザンブロッティング（図１Ｂ）により非常に低いレベルで検出されかつＰＥＧ−３タンパク質はウェスタンブロッティング（図１Ｃ）で辛うじて検出可能である。これらの結果は、Ｈ５ｔｓｌ２５トランスフォームＲＥ細胞におけるＰＥＧ−３発現と進行表現型との間の直接的一致を示す。
【０１３１】
ＰＥＧ−３プロモーターの単離とその転写開始部位の同定
ＰＥＧ−３ｃＤＮＡの配列に基づき、ＰＥＧ−３ＣＤＮＡの５’領域からゲノムウォーキング手法を用いて、ＰＥＧ−３遺伝子の５’フランキング領域を表す２．０−ｋｂラットゲノム断片を同定した。推定ＦＬ−ＰＥＧ−Ｐｒｏｍの配列を図２に示す。ＰＥＧ−３遺伝子の転写開始部位を、Ｅ１１およびＥ１１−ＮＭＴ細胞から単離したＲＮＡを用いてプライマー伸長によりマッピングした（図３）。ＰＥＧ−ＰｒｏｍのＧＣＧソフトウエアを用いたコンピューター解析は、ＲＮＡキャップ部位の上流、位置−１０７１および−２４にそれぞれ位置する２つのＴＡＴＡボックスの存在を示す。−１０７１の配列はＲＮＡキャップ部位からの距離が大きく離れているので、恐らく非機能性である。２つのＰＥＡ３−結合部位、ＡＧＧＡＡＡおよびＴＴＴＣＣＴは、位置−１６４４および−１０１に位置する。位置−１０１のＰＥＡ３部位はＴＡＴＡボックスの７６ｎｔ上流にある。ＡＰ１部位は位置＋８に存在する。さらなる潜在的ＤＮＡ結合エレメントもＰＥＧ−Ｐｒｏｍ中に見られ、Ｓｐｌ、急性期反応エレメント、ＮＦκＢ１、Ｅ２Ｆ、Ｅ２Ａ、ＧＲＥ、ＴＲＥおよびＣＲＥＢが挙げられる。
【０１３２】
ＰＥＧ−３プロモーター中のＴＡＴＡボックスに隣接するＡＰ１とＰＥＡ３部位は、進行性および非進行性Ｈ５ｔｓｌ２５トランスフォームＲＥ細胞における基底および増大したプロモーター活性に関わる。
【０１３３】
ＦＬ−ＰＥＧ−Ｐｒｏｍルシフェラーゼ構築物の様々な細胞型へのトランスフェクションは、進行表現型の発現とプロモーター活性上昇との間の直接的関係を実証した（図４）。進行性細胞はルシフェラーゼ活性において２．５〜３．５倍増加を提示し、この値はＰＥＧ−３ノーザンブロッティングおよびウェスタンブロッティングデータ（図１Ｂおよび１Ｃ）と十分に匹敵する。Ｅ１１細胞におけるルシフェラーゼ活性のレベルは、Ｆ１およびＦ２ＣＲＥＦＸＥ１１−ＮＭＴ体細胞ハイブリッドで観察されたレベルと類似した。活性があって増殖しているＣＲＥＦ細胞の場合、ＰＥＧ−Ｐｒｏｍは無視し得る活性しか示さなかった。
【０１３４】
Ｈ５ｔｓｌ２５トランスフォーム細胞のトランスフォームした表現型の進行中のＰＥＧ−３遺伝子の示差発現に関わるＦＬ−ＰＥＧ−Ｐｒｏｍの領域を規定するために、一連のＰＥＧ−Ｐｒｏｍ欠失構築物を遺伝子工学的に操作し、ルシフェラーゼ遺伝子の前に配置した（図５および６）。位置−１６４５のＰＥＡ３部位および位置−１０７２のＴＡＴＡボックスの欠失は、Ｅ１１またはＥ１１−ＮＭＴのいずれのＰＥＧプロモーター活性にも影響を与えず、このことはプロモーターのこれらの領域はＥ１１またはＥ１１−ＮＭＴ細胞のＰＥＧ−Ｐｒｏｍの基底または増大した発現に寄与しないことを示唆した（図５）。位置−２７０でのさらなる欠失はＥ１１−ＮＭＴ細胞のプロモーター活性を僅かに阻害した（ＦＬ−ＰＥＧ−Ｐｒｏｍの活性と対比してほぼ１９％低下）が、Ｅ１１細胞のＰＥＧ−Ｐｒｏｍの活性を有意に改変することはなかった。対照的に、−１０４ｎｔのＰＥＡ３部位を除去して位置−２４のＴＡＴＡボックスと＋８ｂｐのＡＰ１部位を保持すると、Ｅ１１およびＥ１１−ＮＭＴ細胞の両方において基底プロモーター活性が低下した。この突然変異体ＰＥＧ−Ｐｒｏｍの活性は、Ｅ１１−ＮＭＴおよびＥ１１細胞のＦＬ−ＰＥＧ−Ｐｒｏｍの活性よりそれぞれ１５および４倍低かった。実際、このプロモーター欠失は、Ｅ１１細胞と対比してＥ１１−ＮＭＴ中のＰＥＧ−Ｐｒｏｍの増大した発現を消滅させ、このことは、−１０４のＰＥＡ３部位は進行性Ｈ５ｔｓｌ２５トランスフォームＲＥ細胞におけるＰＥＧ−３の増大した活性の主要な決定因子であることを示した。位置−１１６７〜−５３６および−１２６７〜−５３６の内部欠失は、Ｅ１１−ＮＭＴおよびＥ１１細胞において位置−２７０での欠失を含有する欠失突然変異体で観察されたルシフェラーゼ活性と類似のレベルを与えた。−１１６７〜−１４２および−１５９０〜−１４２の間に遺伝子工学的に操作した内部欠失は、Ｅ１１とＥ１１−ＮＭＴ細胞の両方でさらなるプロモーター活性の低下を生じ、最も大きな影響はＥ１１−ＮＭＴ細胞に見られた（ＦＬ−ＰＥＧ−Ｐｒｏｍと比較して活性がほぼ４１％低下）。対照的に、−１４２、−５３６または−１２８７からのプロモーター領域を欠失してＰＥＧ−Ｐｒｏｍの残りを保持すると、ＰＥＧプロモーター活性は完全に消滅した（図５）。これらの結果は、ＰＥＡ３転写部位（位置−１０４）、ＡＰ１転写部位（位置＋８）およびＴＡＴＡボックス（位置−２４）がＥ１１およびＥ１１−ＮＭＴ細胞における基底ＰＥＧ−Ｐｒｏｍ活性の主要な決定因子であることを意味する。
【０１３５】
位置−１０４のＰＥＡ３部位、位置−２４のＴＡＴＡボックスおよび位置＋８のＡＰ１部位の、Ｅ１１およびＥ１１−ＮＭＴ細胞中のＰＥＧ−３プロモーター活性調節における役割をさらに検証するために、さらなる一連の突然変異体ＰＥＧ−３プロモータールシフェラーゼ構築物を作製した（図６）。ＡＰ１部位に突然変異があって野生型ＰＥＡ３およびＴＡＴＡ部位を保持すると、Ｅ１１およびＥ１１−ＮＭＴ細胞において等価のプロモーター活性をもたらした。この観察は、ＰＥＧ−３プロモーターの位置＋８のＡＰ１部位の、Ｅ１１細胞と対比したＥ１１−ＮＭＴ細胞のＰＥＧ−３転写活性上昇を調節する上での重要性を強調するものである。位置−１０４のＰＥＡ３部位のＰＥＧプロモーター活性を規定する上での関わりはまた、−１０４に突然変異ＰＥＡ３部位を含有して野生型ＴＡＴＡ（位置−２４）とＡＰ１（位置＋８）部位をもつ構築物の分析によっても実証された（図６）。この突然変異体においては、プロモーターの活性レベルは基底レベルであり、その活性はＥ１１およびＥ１１−ＮＭＴ細胞で類似した。類似の基底プロモーター活性はまた、２つの追加の突然変異体でも観察され、その１つは突然変異体ＡＰ１とＰＥＡ３部位ならびに野生型ＴＡＴＡボックスを含有するもので、他の１つは位置−１０４のＰＥＡ３部位を欠いて野生型ＴＡＴＡとＡＰ１部位を有する突然変異体であった。対照的に、位置−１０４のＰＥＡ３を欠いて突然変異ＴＡＴＡ部位と位置＋８の野生型ＡＰ１部位をもつ突然変異体はプロモーター活性を提示しなかった。これらの結果は、＋８に位置するＡＰ１部位と位置−１０４のＰＥＡ３部位の両方が、Ｅ１１細胞と対比したＥ１１−ＮＭＴ細胞におけるＰＥＧ−Ｐｒｏｍの示差発現に関わることを立証する。ＡＰ１とＰＥＡ３は、Ｅ１１細胞と対比したＥ１１−ＮＭＴ細胞におけるＰＥＧ−Ｐｒｏｍの示差発現、ならびにＥ１１細胞およびＥ１１−ＮＭＴ細胞における基底ＰＥＧ−Ｐｒｏｍ活性の主要な決定因子である。
【０１３６】
進行性Ｅ１１−ＮＭＴ細胞は増大した核転写因子結合を提示する
ウェスタンブロッティング分析を実施して、Ｅ１１とＥ１１−ＮＭＴ細胞中のＡＰ１／ｃＪｕｎおよびＰＥＡ３タンパク質レベルを決定した。両方のタンパク質のｄｅｎｏｖｏ発現レベルは、Ｅ１１細胞と対比してＥ１１−ＮＭＴ細胞においてほぼ１．５〜２倍高かった（データは示してない）。ＥＭＳＡを実施し、ＡＰ１およびＰＥＡ３タンパク質のＤＮＡ結合可能性ならびにＥ１１細胞と対比してＥ１１−ＮＭＴ細胞において結合複合体レベルの差が存在するかを決定した（それぞれ、図７Ａおよび７Ｂ）。野生型ＡＰ１オリゴヌクレオチドを用いると、ＡＰ１との結合レベルはＥ１１と対比してＥ１１−ＮＭＴにおいてより高かった（図７Ａ）。このＡＰ１との結合の特異性は、１０および１００倍モル過剰の無標識競合体との競合ならびに突然変異体ＡＰ１オリゴヌクレオチドを用いたときのＤＮＡ−タンパク質複合体の不在によって実証された（図７Ａ）。核抽出物とＡＰ１との結合の直接的立証は、ｃＪｕｎ（ＡＰ１）抗体を用いたスーパーシフトアッセイによって提供された（図７Ａ）。対照的にｃＪｕｎ（ＡＰ１）抗体の代わりに抗アクチン抗体を用いるとＤＮＡ−タンパク質複合体のスーパーシフトは観察されなかった。ゲル遅延アッセイでＰＥＡ３オリゴヌクレオチドを用いると、類似の結果が得られた（図７Ｂ）。ＰＥＡ３との増大した結合が、Ｅ１１細胞と対比してＥ１１−ＮＭＴ細胞からの抽出物に観察された。ＥＭＳＡにおいて、突然変異ＰＥＡ３オリゴヌクレオチドとの結合は観察されず、無標識ＰＥＡ３競合体はＰＥＡ３との結合を効果的に阻害し、かつＰＥＡ３特異的抗体はスーパーシフトＤＮＡタンパク質複合体を生じたが、抗アクチン抗体は生じなかった（図７Ｂ）。これらの実験は、Ｅ１１−ＮＭＴ細胞がＰＥＧ−３のプロモーター内にそれぞれの部位と結合する能力をもつＡＰ１およびＰＥＡ３の上昇したレベルを含有することを実証する。
【０１３７】
Ｅ１１細胞におけるｃＪｕｎ（ＡＰ１）とＰＥＡ３の異所発現は、独立しておよび協同してＰＥＧ−Ｐｒｏｍ活性を増大する
上記の研究は、ＰＥＧ−Ｐｒｏｍ中のＡＰ１とＰＥＡ３部位が、Ｅ１１細胞と対比したＥ１１−ＮＭＴ細胞におけるこのプロモーターの示差活性に関わることを示唆した。これらの転写因子によりコードされたタンパク質がＥ１１細胞中のＦＬ−ＰＥＧ−Ｐｒｏｍの発現を改変しうるかを直接決定するために、一過性トランスフェクションおよびプロモータールシフェラーゼアッセイを実施した（図８）。ｃＪｕｎを産生する発現ベクターによるＥ１１細胞のトランスフェクションは、Ｅ１１細胞において用量依存的にＦＬ−ＰＥＧ−Ｐｒｏｍ活性の増加をもたらした。得た最大の効果は小さく、ｃＪｕｎ発現プラスミドを発現しない細胞のほぼ１．５倍の増加に等しいだけであった。この刺激効果は、対照ベクター（ｐｃＤＮＡ３．１）または突然変異体ｃＪｕｎタンパク質をコードするベクター（ＴＡＭ６７）によりトランスフェクトした細胞では明らかではなかった。Ｅ１１細胞におけるＰＥＡ３の強制発現も、用量依存的にＦＬ−ＰＥＧ−Ｐｒｏｍ活性の増加をもたらし、再び、ほぼ１．５倍の最大値に到達した。プロモーター活性の増大は、対照ｐＲＣ／ＲＳＶベクターを用いてトランスフェクトしたＥ１１細胞では観察されなかった。Ｅ１１細胞をｃＪｕｎとＰＥＡ３を産生する発現ベクターの組合せを用いて同時トランスフェクトすると、ＦＬ−ＰＥＧ−Ｐｒｏｍ活性はＥ１１−ＮＭＴ細胞で観察した活性に匹敵した。この効果は、対照ベクターの組合せをＥ１１細胞中にトランスフェクトしたときには見られなかった（図８）。これらの結果は、Ｅ１１細胞と対比してＥ１１−ＮＭＴ細胞におけるＰＥＧ−Ｐｒｏｍの示差発現が進行性Ｅ１１−ＮＭＴ細胞におけるｃＪｕｎ（ＡＰ１）およびＰＥＡ３転写因子の発現上昇の結果であるという仮説を支持するものである。
【０１３８】
考察
トランスフォームした表現型の増大した発現の取得、すなわちトランスフォーメーション進行は、癌パラダイムの重要な構成成分を表す。げっ歯類動物細胞におけるトランスフォームした表現型、腫瘍形成トランスフォーメーションおよびＤＮＡ損傷の進行の関数として示差発現を提示する新規のＣＤＮＡ、ＰＥＧ−３を、サブトラクションハイブリダイゼーション（Ｓｕら、１９９７）によって同定した。最近の研究はＰＥＧ−３が原因として癌進行に関係することを立証し、その理由はトランスフォームしたげっ歯類動物またはヒト腫瘍細胞を無胸腺ヌードマウスに皮下注射すると、これらの細胞中のこの遺伝子が異所発現して攻撃的腫瘍表現型を生じることに因る（Ｓｕら、１９９９）。これらの観察は、ＰＥＧ−３がトランスフォーメーション進行にとって重要な一因であることを示唆する。非進行性（Ｅ１１）と対比した進行性（Ｅ１１−ＮＭＴ）Ａｄ５トランスフォームラット胚細胞におけるＰＥＧ−３の示差発現に介在する機構を規定するために、この遺伝子のプロモーター領域を同定し、単離しかつ試験した。プロモーター分析、ＥＭＳＡおよび一過性トランスフェクションアッセイを利用して、本発明者らは本明細書で、ＴＡＴＡ領域に隣接するＰＥＧ−Ｐｒｏｍ中のＡＰ１およびＰＥＡ３転写因子部位の組み合わせが、Ｈ５ｔｓｌ２５トランスフォームＲＥ細胞の基底および増大したプロモーター活性に寄与することを実証する。
【０１３９】
プロモーター欠失アッセイは、ＰＥＧ−３遺伝子の−２７０／＋１９４を含有するＰＥＧ−Ｐｒｏｍの領域がＥ１１およびＥ１１−ＮＭＴ細胞におけるＰＥＧ−３転写活性に必須であることを示す（図５および６）。さらに、このＰＥＧ−Ｐｒｏｍの領域はまた、Ｅ１１細胞と対比したＥ１１−ＮＭＴ細胞におけるＰＥＧ−Ｐｒｏｍの示差プロモーター活性にも関わる。配列分析は、ＰＥＧ−Ｐｒｏｍのこの部分がＡＰ１（＋８）、ＴＡＴＡ（−２４）およびＰＥＡ３（−１０４）エレメントを含有することを示す（図２）。＋８のＡＰ１部位に突然変異がある一方、野生型ＴＡＴＡおよびＰＥＡ３配列を保持すると、Ｅ１１細胞と対比してＥ１１−ＮＭＴ細胞におけるＰＥＧ−Ｐｒｏｍ欠失構築物（−２７０／＋１９４）の活性を低下する（図６Ｂ）。この知見は、＋８のＡＰ１部位が、Ｅ１１細胞と対比したＥ１１−ＮＭＴ細胞におけるＰＥＧ−Ｐｒｏｍの示差発現の主要な決定因子であることを示唆する。ＰＥＧ−Ｐｒｏｍ活性におけるＴＡＴＡおよびＰＥＡ３部位の重要性はまた、さらなる突然変異体を用いて立証される（図６Ｂ）。野生型ＴＡＴＡ（−２４）およびＡＰ１（＋８）部位の存在のもとでのＰＥＡ３部位（−１０４）の突然変異は、Ｅ１１およびＥ１１−ＮＭＴにおけるプロモーター活性を低下してＥ１１−ＮＭＴにおけるＰＥＧ−Ｐｒｏｍの増大した活性を効果的に消失させる。類似のレベルのＰＥＧ−Ｐｒｏｍ活性低下は、ＡＰ１（＋８）部位が単独でまたは突然変異ＰＥＡ３（＋８）部位と組合せて突然変異を受けたときに、Ｅ１１とＥ１１−ＮＭＴ細胞の両方において見られる。これらの背景において、ＡＰ１（＋８）とＰＥＡ３（１０４）部位を単独でまたは組合せて改変すると、基底および増大したＰＥＧ−Ｐｒｏｍ活性の両方に影響を与える。さらに、ＴＡＴＡ領域（−２４）の突然変異は、野生型ＡＰ１（＋８）部位が存在しても、プロモーター活性を消滅させる。これらの結果は、ＰＥＧ−Ｐｒｏｍ内の無傷ＴＡＴＡ領域に隣接するＡＰ１とＰＥＡ３部位の両方が、Ｅ１１およびＥ１１−ＮＭＴ細胞における基底プロモーター活性ならびにＥ１１−ＮＭＴ細胞における上昇したプロモーター活性の両方に寄与することを実証する。
【０１４０】
ＦＬ−ＰＥＧ−ＰｒｏｍにおけるＡＰ１とＰＥＡ３部位の間の機能的相互作用および核タンパク質の結合を、ＥＭＳＡにより適当なオリゴヌクレオチドプローブおよびモノクローナル抗体を用いて確認した（図７）。Ｅ１１とＥ１１−ＮＭＴ細胞からの核抽出物を用いたＥＭＳＡは、ＡＰ１またはＰＥＡ３オリゴヌクレオチドを用いてインキュベートしたときに、移動性のより遅いＤＮＡタンパク質複合体を生じた（図７Ａおよび図７Ｂ）。アッセイで１０または１００倍モル過剰の無標識オリゴヌクレオチドをそれぞれ加えると、これらの複合体の量は低下するかまたは消失した。突然変異したＡＰ１またはＰＥＡ３オリゴヌクレオチドを結合アッセイに用いると、ＤＮＡタンパク質複合体は観察されなかった。核タンパク質結合の特異性を、ｃＪｕｎ（ＡＰ１）またはＰＥＡ３に特異的な抗体を用いてＥＭＳＡにおいて実証した。これらの実験においては、ＤＮＡタンパク質複合体との抗体相互作用からスーパーシフトした移動性の遅いＤＮＡタンパク質複合体が明らかに生じた。Ｅ１１−ＮＭＴ細胞内に存在するＡＰ１とＰＥＡ３複合体の量は、Ｅ１１細胞内に見出される量を超える（図７Ａおよび７Ｂ）。さらに、Ｅ１１細胞と対比したＥ１１−ＮＭＴ細胞のウェスタンブロッティングによって、ＡＰ１／ｃＪｕｎとＰＥＡ３タンパク質のレベルに、小さいが有意な増加（ほぼ１．５〜２倍）も検出された（データは開示してない）。ｃＪｕｎとＰＥＡ３発現ベクターの一過性トランスフェクションによって、進行性細胞内の上昇したＰＥＧ−３プロモーター活性の調節に対するＥ１１細胞と対比してＥ１１−ＮＭＴ細胞内の上昇したＡＰ１およびＰＥＡ３タンパク質の機能的意義を立証した（図８）。これらの実験は、一過性のｃＪｕｎ（ＡＰ１）とＰＥＡ３の異所発現は個々にＥ１１細胞内のＰＥＧ−Ｐｒｏｍ活性を上昇させ、そして両方の転写因子を組合せるとさらなる効果をもたらし、Ｅ１１−ＮＭＴ細胞内で観察されたのと同様なＰＥＧ−Ｐｒｏｍ活性まで達しうることを実証した（図８）。ＥＭＳＡにおける結合活性の増加、ウェスタンブロットにおけるタンパク質レベルの増加、および同時トランスフェクションアッセイに基づくと、ＰＥＧ−３発現とＡＰ１／ＰＥＡ３活性との間に強い相関があるようである。
【０１４１】
ＡＰ１転写因子は、規定の配列モチーフ（ＴＰＡ応答エレメント、ＴＲＥ）を含有する標的遺伝子プロモーターのサブセットの発現を調節する前初期応答遺伝子である（ＡｎｇｅｌおよびＫａｒｉｎ、１９９１）。ＡＰ１複合体は、ＦｏｓファミリーのメンバーおよびＪｕｎファミリーのメンバーのヘテロ二量体またはＪｕｎファミリーのメンバーのホモ二量体を含む（ＡｎｇｅｌおよびＫａｒｉｎ、１９９１、Ｋａｒｉｎら、１９９７）。ＡＰ１は、細胞増殖、トランスフォーメーション、腫瘍形成、分化およびアポトーシスを含む多くの重要かつ多様な生物学的プロセスに寄与する（ＡｎｇｅｌおよびＫａｒｉｎ、１９９１；Ｋａｒｉｎら、１９９７；Ｏｌｉｖｅら、１９９７；Ｋａｎｇら、１９９８ｂ）。ｅｔｓ遺伝子ファミリーのメンバーである転写因子ＰＥＡ３も、細胞トランスフォーメーションおよび腫瘍形成に対する主要な一因である（ＢｒｏｗｎおよびＭｃＫｎｉｇｈｔ、１９９２）。ＰＥＡ３タンパク質は、標的遺伝子のプロモーター内のほぼ１０塩基対ＤＮＡ配列と相互作用して転写を調節する（Ｍａｃｌｅｏｄら、１９９２；Ｓｅｔｈら、１９９２；Ｗａｓｙｌｙｋら、１９９３）。推定の候補ＰＥＡ３標的遺伝子には、細胞外マトリックスの分解に必要なプロテイナーゼが含まれ、セリンウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーター（Ｎｅｒｌｏｖら、１９９２）ならびにマトリックスメタロプロテイナーゼであるゼラチナーゼＢ、間質コラゲナーゼ、ストロメライシン−３およびマトリライシン（ＭａｔｒｉｓｉａｎおよびＢｏｗｄｅｎ、１９９０；Ｍａｔｒｉｓｉａｎ、１９９４；Ｈｉｇａｓｈｉｎｏら、１９９５）が挙げられ、これらは癌転移に寄与する重要な因子である（Ｌｉｏｔｔａら、１９９１；ＫｏｈｎおよびＬｉｏｔｔａ、１９９５）。これらの細胞外マトリックス分解遺伝子の多くはまた、それらのプロモーターにＡＰ１部位も含有する（ＡｎｇｅｌおよびＫａｒｉｎ、１９９１；Ｋａｒｉｎら、１９９７）。複数の細胞プロモーターを調節する上でＡＰ１とＰＥＡ３部位間の協同が立証されている。これらとしては、メタロプロテイナーゼ−１の組織インヒビター（ＴＩＭＰ−１）遺伝子の血清増殖因子応答（Ｅｄｗａｒｄｓら、１９９２）ならびにウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーター遺伝子の１２−Ｏテトラデカノイルホルボール１３−アセテート（ＴＰＡ）、繊維芽細胞増殖因子−２（ＦＧＦ−２）およびマクロファージコロニー刺激因子誘導が挙げられる（Ｎｅｒｉｏｖら、１９９２；Ｓｔａｃｅｙら、１９９５；ＤｅＣｅｓａｒｅら、１９９６；Ｄ’Ｏｒａｚｉｏら、１９９７）。さらに、ＰＥＡ３およびＡＰ１エレメントはまた、ストロメライシンおよびコラゲナーゼ遺伝子のプロモーター内にも存在し（ＧｕｔｍａｎおよびＷａｓｙｌｙｋ、１９９０；Ｓｉｒｕｍ−ＣｏｎｏｌｌｙおよびＢｒｉｎｃｋｅｒｈｏｆｆ、１９９１）、これらのエレメントは特異的トランスフォーミング発癌遺伝子による転写活性化に対する標的を提供する（Ｗａｓｙｌｙｋら、１９８９、１９９３）。これらの背景において、Ｅ１１細胞と対比してＥ１１−ＮＭＴ細胞内の増加したＡＰ１とＰＥＡ３の活性は、上昇したＰＥＧ−Ｐｒｏｍ活性をもたらすことができ、それによって癌攻撃性に直接寄与しうる増加したＰＥＧ−３タンパク質をもたらし、そして、ｉｎｖｉｖｏでヌードマウスにおける増大した腫瘍増殖、進行性腫瘍細胞をもたらす。またＥ１１−ＮＭＴ細胞内のＡＰ１とＰＥＡ３の活性増加は恐らく、癌表現型を促進しうるさらなる下流遺伝子も活性化するであろう。
【０１４２】
ＰＥＧ−３がトランスフォームした表現型の発現を促進する機構は現在判っていない。げっ歯類動物およびヒトの癌細胞の両方におけるラットＰＥＧ−３遺伝子の強制発現は、足場非依存性増殖と腫瘍形成可能性の増加をもたらす（Ｓｕら、１９９７、１９９９）。ＰＥＧ−３にとって１つの推定の標的は、血管形成誘導分子、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）である（Ｓｕら、１９９９）。Ｅ１１細胞におけるＰＥＧ−３の安定して上昇した発現は、ＶＥＧＦＲＮＡ転写、定常状態ｍＲＮＡおよび分泌タンパク質の増加をもたらす。さらに、ＰＥＧ−３を発現する細胞において、ＶＥＧＦ−ルシフェラーゼレポーター構築物は増大した活性を提示する。さらにＶＥＧＦ発現の調節におけるＰＥＧ−３の機能的役割は、安定なアンチセンスＰＥＧ−３発現ベクターを用いてＥ１１−ＮＭＴ細胞内のＰＥＧ−３発現を阻害するとＶＥＧＦｍＲＮＡおよび分泌タンパク質が減少することによって実証される。ＶＥＧＦ発現の誘導におけるＰＥＧ−３タンパク質の必要性は、ＰＥＧ−３でトランスフェクトした細胞をタンパク質合成インヒビターであるシクロヘキシミドを用いて同時処理することにより実証された（Ｓｕら、１９９９）。この実験において、トランスフェクトしたＰＥＧ−３遺伝子はＰＥＧ−３ｍＲＮＡとしては発現されたが、ＶＥＧＦｍＲＮＡはシクロヘキシミドに曝されなかった細胞にだけ存在した。ＰＥＧ−３がＶＥＧＦプロモーターと直接結合するのかまたはＶＥＧＦ転写の活性化が追加の分子によって起こるのかは現在判っていないが、これらの研究はＰＥＧ−３発現、血管形成の誘導、および癌状態発現の促進の間の関連を示唆する。
【０１４３】
ＰＥＧ−３発現の結果としてモジュレートされる下流遺伝子のレパートリーを同定しかつ特性決定して、それらの癌攻撃性と血管形成の促進に果たす役割を決定するために、さらなる研究が必要である。これらの研究は重要であり、癌表現型の重要な決定因子である遺伝子エレメントを規定する可能性を提供する。この情報を用いて、可能性のある標的を識別しかつ癌発生と進行を阻害または防止するためのアンチセンスもしくは小分子アンタゴニストなどの適当な試薬を規定することが可能であろう。
【０１４４】
材料と方法
細胞培養物
Ｅ１１は、Ｈ５ｔｓｌ２５でトランスフォームしたスプラーグ・ドーリー二次ＲＥ細胞の単一細胞クローンである（Ｆｉｓｈｅｒら、１９７８）。Ｅ１１−ＮＭＴは、Ｅ１１細胞系に誘発されたヌードマウス腫瘍由来のＥ１１細胞のサブクローンである（Ｂａｂｉｓｓら、１９８５）。Ｒ１２はＨａ−ｒａｓ発癌遺伝子でトランスフォームしたＥ１１クローンである（Ｄｕｉｇｏｕら、１９８９）。Ｆ１とＦ２は、Ｅ１１−ＮＭＴとＣＲＥＦ細胞との間で形成された平たい形態をもつ抑制された体細胞ハイブリッドである（Ｄｕｉｇｏｕら、１９９０）。Ｒ１とＲ２は、Ｅ１１−ＮＭＴとＣＲＥＦ細胞を融合することによって作製した円形の形態をもつ進行性体細胞ハイブリッドである（Ｄｕｉｇｏｕら、１９９０）。ＣＲＥＦはフィッシャー（Ｆｉｓｃｈｅｒ）ラット胚繊維芽細胞の特定の不死、非トランスフォームのかつ非腫瘍形成のクローンである（Ｆｉｓｈｅｒら、１９８２）。全ての培養物は、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）に５％ＦＢＳを補充した培地（ＤＭＥＭ−５）で、３７℃にて加湿した５％ＣＯ_２で９５％空気のインキュベーター内で増殖させた。
【０１４５】
ノーザンブロッティングよびウェスタンブロッティングアッセイ
全細胞ＲＮＡを、グアニジニウム／フェノール抽出法によって単離し、ノーザンブロッティングを記載（Ｓｕら、１９９４、１９９７）の通り実施した。ＲＮＡ１５μｇを変性して３％ホルムアルデヒドを加えた１．２％アガロースゲル中で電気泳動し、ナイロンメンブランに転写し、続いて先に記載（Ｓｕら、１９９４、１９９７）の通り^３２Ｐ標識したｃＤＮＡプローブを用いてハイブリダイズした。ハイブリダイゼーションの後に、フィルターを洗浄してオートラジオグラフィーに露出した。ウェスタンブロッティング分析（Ｓｕら、１９９５）によってｃＪｕｎ（ＡＰ１）、ＰＥＡ３、ＰＥＧ−３およびアクチンタンパク質を検出した。５００万個の細胞を１００−ｍｍプレートにまき、２４時間、３７℃にてインキュベートした。培地（ＤＭＥＭ−５）を除去し、細胞を冷ＰＢＳを用いて３回洗浄し、次いでＲＩＰＣバッファー（０．５ＭＮａＣｌ、０．５％ＮＰ４０、２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ、ｐＨ８、１ｍＭＰＭＳＦ）中に溶解した。タンパク質レベルはＥＣＬキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ）およびそれぞれの抗体（ＳａｎｔａＣｒｕｚ）を用いて測定した。細胞溶解物はまた、Ｃ末端ペプチドに対するウサギ抗ＰＥＧ−３ポリクローナル抗体を用いて分析した。
【０１４６】
ＰＥＧ−３プロモーターの単離と分析
ＰＥＧ−３ｃＤＮＡの５’配列に基づいて、配列ＧＡＴＣＴＡＧＧＧＴＧＴＴＧＴＧＡＧＡＧＧＡＴＣＧＧＡＧ（配列番号２）およびＴＣＧＧＴＴＴＧＣＣＡＡＡＡＧＣＧＡＴＣＧＴＧＧＧ（配列番号３）をもつ２つのネステッド（ｎｅｓｔｅｄ）プライマーをゲノムウォーカーキット（ＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒＫｉｔ）（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）とともに用いてＰＥＧ−３の推定プロモーターを含有するゲノム配列を得た。この手法を用いて、同一かつ重複したヌクレオチド配列をもつそれぞれ２．０−、１．６−および１．０−ｋｂの３つのＤＮＡ断片を得た。プロモーター活性を分析するため、２．０−ｋｂＰＥＧ−３断片（ＦＬ−ＰＥＧ−Ｐｒｏｍと呼ぶ）をｐＧＬ３−基本ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）中にクローニングした。ＦＬ−ＰＥＧ−Ｐｒｏｍの５’欠失突然変異は、エキソヌクレアーゼＩＩＩ消化によりＥｒａｓｅ−Ａ−Ｂａｓｅシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて作製した。ＦＬ−ＰＥＧ−Ｐｒｏｍの３’欠失突然変異は、ＢｓｔＥｌｌ／Ｘｈｏｌ、Ｓａｃｌｌ／ＸｈｏｌおよびＮｄｅｌ／Ｘｈｏｌをそれぞれ用いて消化して作製した。ＢｓｔＥｌｌ、ＳａｃｌｌおよびＮｄｅｌはＦＬ−ＰＥＧ−ＰｒｏｍのＤＮＡ配列を認識する２０単一カット制限エンドヌクレアーゼであり、Ｘｈｏｌ制限部位はｐＧＬ３ベクターのＭＣＳ中でＦＬ−ＰＥＧ−Ｐｒｏｍの３’末端近くに位置する。内部欠失は、ＦＬ−ＰＥＧ−ＰｒｏｍをＮｄｅｌ／Ｓａｃｌｌ、Ｎｄｅｌ／ＢｓｔＥｌｌ、Ｓｔｕｌ／ＢｓｔＥｌｌおよびＢｓｔＸｌをそれぞれ用いて消化することによって実施した。ＡＰ１結合部位、ＰＥＡ３結合部位およびＴＡＴＡボックスの突然変異は、改変部位１１ＩｎＶｉｔｒｏ突然変異誘発システム（ＡｌｔｅｒｅｄＳｉｔｅｓ１１ＩｎＶｉｔｒｏＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓＳｙｓｔｅｍ）（Ｐｒｏｍｅｇａ）を利用し、部位特異的突然変異誘発法を用いて作製した。ＰＥＧ−Ｐｒｏｍ欠失突然変異体をｐＧＬ３−基本ルシフェラーゼレポーターベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）中にクローニングした。様々なＰＥＧ−Ｐｒｏｍ−ルシフェラーゼ構築物の活性を評価するために細胞を２Ｘ１０^５／３５−ｍｍ組織培養プレートにまいて、ほぼ２４時間後に、様々なＰＥＧ−Ｐｒｏｍ−ルシフェラーゼ構築物５μｇ＋ＳＶ４０−β−ｇａｌベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）１μｇをリポフェクタミン試薬（Ｇｉｂｃｏ）１０μｌと無血清培地２００μｌ中で混合したものを用いてトランスフェクトした。室温にて２０分後、無血清培地８００μｌを加えて最終容積を１ｍｌとした。トランスフェクション混合物を１４時間後に除去し、細胞を３回、無血清培地を用いて洗浄し、３７℃にてさらに４８時間、完全増殖培地中でインキュベートした。細胞を回収し、溶解して抽出物を作製し（Ｇｏｐａｌｋｒｉｓｈｎａｎら、１９９９）、β−ｇａｌおよびルシフェラーゼレポーターアッセイに利用した。ルシフェラーゼおよびβ−ｇａｌ活性のルミノメトリー（Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｒｉｃ）測定は市販キット（それぞれＰｒｏｍｅｇａおよびＴｒｏｐｉｘ）を用いて実施した。ルシフェラーゼアッセイでは、細胞溶解物１０μｌをルシフェラーゼアッセイ基質（Ｐｒｏｍｅｇａ）４０μｌと混合した。β−ｇａｌアッセイでは、細胞溶解物１０μｌを、希釈したＧａｌｅｃｔｏｎ−Ｐｌｕｓ１００μｌおよび促進剤（Ｔｒｏｐｉｘ）１５０μｌと混合した。プロモーター分析データは各実験点に対し三重サンプルを用いて最低限３回収集し、そのデータをβ−ｇａｌデータを用いて標準化した。
【０１４７】
Ｅ１１およびＥ１１−ＮＭＴｍＲＮＡのプライマー伸長
ＰＥＧ−３ｃＤＮＡの５’ＵＴＲ配列と相補的な配列５’ ＧＧＣＡＡＡＧＧＧＡＴＧＣＧＧＡＧＴＣＧＣＧＣＧＧＧＴＣＴＣＧＣＡＴＧ３’（配列番号４）をもつプライマーを、Ｅ１１またはＥ１１−ＮＭＴ細胞からのポリＡ^＋ＲＮＡ４μｇとアニーリングし、これを逆転写酵素によるプライマー伸長用の鋳型として利用した。簡単に説明すると、脱リン酸化オリゴＤＮＡ２０ｐｍｏｌを、γ−^３２ＰＡＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）およびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて末端標識した。標識したオリゴヌクレオチド（５Ｘ１０^５ｃｐｍ）を、ポリＡ^＋ＲＮＡ４μｇとインキュベートし、沈殿物をＤＥＰＣ処理したＨ_２０中に再懸濁した。逆転写反応物は、２００ｕ／μｌのスーパースクリプト逆転写酵素ＩＩ（Ｇｉｂｃｏ）、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、４０ｍＭＫＣｌ、６ｍＭＭｇＣｌ_２、１ｍＭＤＴＴ、１ｍＭｄＮＴＰ、および０．１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを含有した。該混合物を４２℃にて１時間インキュベートし、次いで０．５ＭＥＤＴＡ（ｐＨ８）１ｍｌを添加して反応を停止した。ＤＮアーゼを含まないＲＮアーゼによる処理の後、反応混合物を、同じプライマーと鋳型を用いたＤＮＡ配列決定反応物と平行して、５％尿素ポリアクリルアミド配列決定ゲル上にローディングした。
【０１４８】
電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）
核抽出物を、２〜５Ｘ１０^８の細胞からＤｉｇｎａｍら（１９８３）が記載した通り調製した。プローブの配列は次の通りであった：野生型ＡＰ１、５’ＣＧＣＡＧＡＴＴＧＡＣＴＣＡＧＴＴＣＧＣ３’ （配列番号５）／５’ＧＣＧＴＣＴＡＡＣＴＧＡＧＴＣＡＡＧＣＧ３’（配列番号６）；突然変異体ＡＰ１、５’ＣＧＣＡＧＡＴＡＡＡＣＴＡＣＧＴＴＣＧＣ３’（配列番号７）／５’ＧＣＧＴＣＴＡＴＴＴＧＡＴＧＣＡＡＧＣＧ３’（配列番号８）；野生型ＰＥＡ３、５’ＧＴＧＴＴＧＴＴＴＴＣＣＴＣＴＣＴＣＣＡ３’（配列番号９）／５’ ＣＡＣＡＡＣＡＡＡＡＧＧＡＧＡＧＡＧＧＴ３’（配列番号１０）；および突然変異体ＰＥＡ３’、５’ＧＴＧＴＴＧＴＴＣＣＣＡＴＣＴＣＴＣＣＡ３’（配列番号１１）／５’ＣＡＣＡＡＣＡＡＧＧＧＴＡＧＡＧＡＧＧＴ３’（配列番号１２）。二本鎖オリゴヌクレオチドを、^３２Ｐ−ＡＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）およびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて標識した。次いで標識したプローブを室温にて３０分間、核抽出物とともにインキュベートした。反応混合物は、^３２Ｐ−標識したデオキシオリゴヌクレオチド（＞５０００ｃｐｍ）、ポリ（ｄｌ−ｄｃ）２μｇおよび核タンパク質抽出物１０μｇ、ならびに１０ｍＭＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、５０ｍＭＫＣｌ、５ｍＭＭｇＣｌ_２、０．５ｍＭＥＤＴＡ、１ｍＭＤＴＴおよび１２．５％グリセロールからなった。３０分間、室温にてインキュベーションの後、反応混合物を０．５ＸＴＢＥを用いて５％ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動した（１６０Ｖ、３時間）。ゲルを乾燥しオートラジオグラフィーに供した。核抽出物はまた、^３２Ｐ標識プローブと一緒に、１０もしくは１００倍モル過剰の冷競合体オリゴヌクレオチドまたはｃＪｕｎ（ＡＰ１）、ＰＥＡ３もしくはアクチン抗体（１または５μｇ）とインキュベートした。
【０１４９】
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３４．Ｏｌｉｖｅ，Ｍ．，Ｋｒｙｌｏｖ，Ｄ．，Ｅｃｈｌｉｎ，Ｄ．Ｒ．，Ｇａｒｄｎｅｒ，Ｋ．，Ｔａｐａｒｏｗｓｋｙ，Ｅ．＆Ｖｉｎｓｏｎ，Ｃ．（１９９７）．Ｊ．ＢｉｏＬＣｈｅｍ．，２７２，１８５８６−１８５９４
３５．Ｒｅｄｄｙ，Ｐ．Ｇ．，Ｓｕ，Ｚ．−ｚ．＆Ｆｉｓｈｅｒ，Ｐ．Ｂ．（１９９３）．「染色体と遺伝子分析、分子遺伝学の方法（ＣｈｒｏｍｏｓｏｍｅａｎｄＧｅｎｅｔｉｃＡｎａｌｙｓｉｓ，ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＧｅｎｅｔｉｃｓ）」中、ＡｄｏｌｐｈＫ．Ｗ．（編）Ｖｏｌ１．ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｏｒｌａｎｄｏ，ＦＬ，ｐｐ．６８−１０２．
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３９．Ｓｕ，Ｚ．−ｚ．，Ｓｈｅｎ，Ｒ．，Ｏ’Ｂｒｉａｎ，Ｃ．Ａ．＆Ｆｉｓｈｅｒ，Ｐ．Ｂ．（１９９４）．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，９，１１２３−１１３２．
４０．Ｓｕ，Ｚ．−ｚ．，Ｙｅｍｕｌ，Ｓ．，Ｅｓｔａｂｒｏｏｋ，Ａ．，Ｚｉｍｍｅｒ，Ｓ．Ｇ．，Ｆｒｉｅｄｍａｎ，Ｒ．Ｍ．＆Ｆｉｓｈｅｒ，Ｐ．Ｂ．（１９９５）．Ｉｎｔｌ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，７，１２７９−１２８４．
４１．Ｓｕ，Ｚ．−ｚ．，Ｓｈｉ，Ｙ．＆Ｆｉｓｈｅｒ，Ｐ．Ｂ．（１９９７）．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９４，９１２５−９１３０．
４２．Ｓｕ，Ｚ．−ｚ．，Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ，Ｎ．Ｉ．，Ｊｉａｎｇ，Ｈ．，Ｗａｎｇ，Ｍ．−Ｎ．，Ｄｕｉｇｏｕ，
４３．Ｇ．Ｊ．，Ｙｏｕｎｇ，Ｃ．Ｓ．Ｈ．＆Ｆｉｓｈｅｒ，Ｐ．Ｂ．（１９９９）．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９６，１５１１５−１５１２０．
４４．Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ，Ｂ．＆Ｋｉｎｚｉｅｒ，Ｋ．Ｗ．（１９９３）．ＴｒｅｎｄｓＧｅｎｅｔ．，９，１３８−１４１．
４５．Ｗａｓｙｌｙｋ，Ｃ．，Ｆｌｏｒｅｓ，Ｐ．，Ｇｕｔｍａｎ，Ａ．＆Ｗａｓｙｌｙｋ，Ｂ．（１９８９）．ＥＭＢＯＪ．，８，３３７１−３３７８．
４６．Ｗａｓｙｌｙｋ，Ｂ．，Ｈａｈｎ，Ｓ．Ｌ．＆Ｇｉｏｖａｎｅ，Ａ．（１９９３）．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２１１，７−１８．

【図面の簡単な説明】
【図１】図１Ａ−１Ｃ：正常、アデノウイルストランスフォームおよび体細胞ハイブリッドのげっ歯類細胞における、足場非依存性増殖ならびにＰＥＧ−３ｍＲＮＡおよびタンパク質発現を示す。（図１Ａ）足場非依存性増殖アッセイは、５Ｘ１０^３または１Ｘ１０^４細胞を含有する０．４％寒天含有培地を、０．８％寒天含有培地基底層の表面にまいて測定した。２週後に、コロニー≧０．１ｍｍを倒立顕微鏡を用いて数えた。結果は、三重サンプルを用いた３つの独立実験の平均であり、実験値±ＳＤで表した。（図１Ｂ）ＰＥＧ−３ｍＲＮＡレベルは、１５μｇの全細胞ＲＮＡを含む１．２％アガロースゲルを電気泳動することによって測定した。ＲＮＡをナイロンメンブランに移して^３２Ｐ標識したＰＥＧ−３ｃＤＮＡプローブとハイブリダイズし、ブロットを剥がして次いで^３２Ｐ標識したＧＡＰＤＨプローブと再ハイブリダイズした。（図１ｃ）ＰＥＧ−３とアクチンタンパク質レベルは、ウェスタンブロットによって測定した。それぞれの細胞型からのタンパク質１０μｇを１０％変性ポリアミドゲル上に供給して３時間電気泳動し、次いでニトロセルロースメンブランに移した。ＰＥＧ−３は抗ＰＥＧ−３抗体を用いて検出しかつアクチンタンパク質は抗アクチン抗体によって検出した。レーン記号：１Ｅ１１；２Ｅ１１−ＮＭＴ；３Ｅ１１−Ｈａ−ｒａｓＲ１２；４Ｅ１１−ＮＭＴＸＣＲＥＦＲ１；５Ｅ１１−ＮＭＴＸＣＲＥＦＲ２；６Ｅ１１−ＮＭＴＸＣＲＥＦＦ１；７Ｅ１１−ＮＭＴＸＣＲＥＦＦ２；および８ＣＲＥＦ。
【図２】２．０−ｋｂＰＥＧ−３プロモーターの配列を示す。（配列番号１）この断片は、材料と方法の項に記載の通り、５’ＤＮＡウォーキングによって同定した。ＰＥＡ−３およびＡＰ１エレメントおよびＴＡＴＡボックスの位置を示した。
【図３】ＰＥＧ−３プロモーターの転写開始部位の決定を示す。ＰＥＧ−３ｍＲＮＡの５’ＵＴＲ領域と相補的なプライマー（下記の材料と方法の項を参照）を、Ｅ１１−ＮＭＴまたはＥ１１細胞からのポリＡ^＋ＲＮＡの４μｇとアニーリングし、プライマー伸長アッセイ用のテンプレートとして用いた。逆転写に用いた条件は材料と方法の項に記載の通りであった。同じプライマーを用いかつＰＥＧ−３プロモーターをテンプレートとしたＤＮＡ配列決定反応物を、プライマー伸長反応物と平行して同じゲルで電気泳動した。
【図４】正常、トランスフォームアデノウイルスおよび体細胞ハイブリッドのげっ歯類細胞における、全長ＰＥＧ−３プロモーター−ルシフェラーゼ活性を示す。様々な細胞型を、５μｇのＦＬＰＥＧ−Ｐｒｏｍおよび１μｇのｐＳＶ−β−ガラクトシダーゼプラスミドを用いて同時トランスフォームし、４８時間後にルシフェラーゼ活性を材料と方法の項に記載の通り測定した。結果をβ−ガラクトシダーゼ活性によって標準化し、３つの独立実験の平均±ＳＤで示す。結果は、Ｅ１１と比較して、Ｅ１１を１倍活性とした倍数活性で表現した。
【図５】図５Ａ−５Ｂは、Ｅ１１およびＥ１１−ＮＭＴ細胞における、基底および増大したＰＥＧ−Ｐｒｏｍ発現に必要なＰＥＧ−３プロモーターの領域のマッピングを示す。（図５Ａ）ＰＥＧ−Ｐｒｏの欠失突然変異体の模式図による表現である。突然変異体は材料と方法の項に記載の通り構築した。（図５Ｂ）Ｅ１１およびＥ１１−ＮＭＴ細胞における、ＦＬ−ＰＥＧ−Ｐｒｏｍ（レーン１）および様々なＰＥＧ−Ｐｒｏｍ欠失突然変異体（レーン２〜１１）の倍数活性である。倍数活性は、ＦＬ−ＰＥＧ−Ｐｒｏｍと様々なＰＥＧ−Ｐｒｏｍ欠失突然変異体を、ＴＡＴＡボックスおよびＡＰＩエレメントを含有する特定のＰＥＧ−Ｐｒｏｍ欠失構築物（位置−４０にて欠失）と対比して、比較する。後者の欠失構築物は任意に１の値を与える。プロモーター−ルシフェラーゼアッセイは材料と方法の項に記載の通り実施した。
【図６】図６Ａ−６Ｂは、ＰＥＧ−Ｐｒｏｍ中のＰＥＡ３およびＡＰ１部位ならびにＴＡＴＡボックスの突然変異分析である。（図６Ａ）Ｅ１１およびＥ１１−ＮＭＴ細胞における活性について分析したＰＥＧ−Ｐｒｏｍ中の特異的突然変異体の模式図的表現である。点突然変異体は、材料と方法の項に記載した位置指定突然変異誘発を利用して実施した。（図６Ｂ）Ｅ１１およびＥ１１−ＮＭＴ細胞における様々なＰＥＧ−Ｐｒｏｍ突然変異体の倍数活性である。倍数活性は、ＰＥＧ−Ｐｒｏｍ突然変異体（位置−１１８にて欠失した）ならびにさらにＰＥＡ３、ＡＰ１部位および／またはＴＡＴＡボックス領域に影響を与える点または欠失突然変異を有する突然変異体を、野生型ＴＡＴＡボックスおよびＡＰ１エレメントを含有する特定のＰＥＧ−Ｐｒｏｍ欠失構築物（位置−４０にて欠失した）と対比して比較する。後者の欠失構築物は任意に１の値を与える。プロモーター−ルシフェラーゼアッセイは材料と方法の項に記載の通り実施した。
【図７】図７Ａ−７Ｂは、ＥＭＳＡによる、ＡＰ１およびＰＥＡ３エレメントへの核タンパク質結合の分析である。Ｅ１１およびＥ１１−ＮＭＴ細胞における（図７Ａ）ＡＰ１および（図７Ｂ）ＰＥＡ３核タンパク質複合体を、ＥＭＳＡを用いて同定した。核抽出物は２つの細胞型から調製し、γ^３２Ｐ−ＡＴＰおよびＴ４ＤＮＡキナーゼを使って^３２Ｐにより標識したＡＰ１およびＰＥＡ３プローブとインキュベートした。反応混合物を、材料と方法の項に記載の５％未変性ポリアクリルアミドゲル中で電気泳動した。Ｅ１１およびＥ１１−ＮＭＴ細胞において、矢印１はスーパーシフトしたＡＰ１（図７Ａ）またはＰＥＡ３（図７Ｂ）ＤＮＡ−タンパク質−抗体複合体を示し、矢印２はＡＰ１（図７Ａ）またはＰＥＡ３（図７Ｂ）ＤＮＡタンパク質複合体を示す。全てのサンプルはＥ１１またはＥ１１−ＮＭＴ細胞のいずれか由来の核抽出物を含有する。Ｍｕｔ−オリゴサンプルは突然変異ＡＰ１（図７Ａ）またはＰＥＡ３（図７Ｂ）オリゴヌクレオチドを含有する。ＷＴ−オリゴサンプルは野生型ＡＰ１（図７Ａ）またはＰＥＡ３（図７Ｂ）オリゴヌクレオチドを含有する。競合体は、非標識競合体オリゴヌクレオチドの１０Ｘ（１０倍）または１００Ｘ（１００倍）モル過剰の存在を意味する。ｃＪｕｎ−Ａｂ（図７Ａ）およびＰＥＡ３−Ａｂ（図７Ｂ）サンプルはそれぞれの抗体の１または５μｇを含有する。Ａｃｔｉｎ−Ａｂは抗アクチン抗体５μｇを含有する。
【図８】Ｅ１１細胞における、ｃＪｕｎ（ＡＰ１）およびＰＥＡ３の単独および組合せでの異所発現がＦＬ−ＰＥＧ−Ｐｒｏｍ活性に及ぼす影響を示す。様々な量（５０〜５００ｎｇ）の野生型ｃＪｕｎ（ｗｔｃｊｕｎ）、突然変異ＴＡＭ６７ｃＪｕｎ（ｍｕｔｃｊｕｎ）、ｐｃＤＮＡ３．１（対照ベクター）、ＰＥＡ３（ｐＥＡ３）、ｐＲＣ／ＲＳＶ（対照ベクター）、ＰＥＡ３および野生型ｃＪｕｎ（ｐＥＡ３＋ｗｔｃｊｕｎ）の組合せまたは対照ベクター（ｐＲＣ／ＲＳＶ＋ｐＣＤＮＡ３．１）の組合せを、５μｇのｐＧＬ３／ＰＥＧ−Ｐｒｏｍおよび１μｇのｐＳＶ−β−ガラクトシダーゼベクターとともにＥ１１細胞にトランスフェクトした。結果は、ベクターでトランスフェクトしたＥ１１細胞と比較して、２つの独立実験の三重サンプルについての平均倍数活性を実験値±ＳＤで示す。[0001]
The invention disclosed herein is made with government support under the National Cancer Institute grant numbers CA35675 and CA74468 from the US Department of Health and Human Services. Was. Accordingly, the United States government has certain rights in the invention.
[0002]
Background of the Invention
Throughout this application, various publications are referred to in the text by author and date. All citations for these publications are listed alphabetically at the end of this specification. All patents, patent specifications and publications, cited herein, whether before or after, are hereby incorporated by reference in their entirety. The entire disclosure of these publications is hereby incorporated by reference into this patent for purposes of further detailing the state of the art, which is known to those skilled in the art at the date of the invention described and claimed herein. Incorporated into the application.
[0003]
Summary of the Invention
The present invention provides an isolated nucleic acid comprising a PEG-3 promoter containing a nucleotide sequence beginning with a guanosine (G) at position -270 of SEQ ID NO: 1 and ending with a cytosine (C) at position +194. The present invention also provides a method of identifying an agent that modulates PEG-3 promoter activity in a cell, comprising: (a) a nucleic acid comprising a PEG-3 promoter operably linked to a reporter gene. Contacting the cell with a drug; (b) measuring the level of reporter gene expression in the cell; and (c) measuring the expression level measured in step (b) on the same cell in the absence of the drug The lower expression level measured in the presence of the drug indicates an agent that suppresses PEG-3 promoter activity and the higher level measured in the presence of the drug is PEG-3 Show agents that increase promoter activity, thereby identifying agents that modulate PEG-3 promoter activity in cells The law provides. The present invention is a method of treating cancer in a subject, comprising administering a nucleic acid comprising a PEG-3 promoter operably linked to a gene of interest, wherein the gene of interest is administered to cancer cells of the subject. Such a method is provided, wherein said method is selectively expressed and its expression regulates the expression of PEG-3 to suppress or kill cancer cell growth, thereby treating cancer in a subject.
[0004]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The following abbreviations are used herein: progress elevated gene-3 (PEG-3); rat embryonic cells (RE cells); PEG-promoter (PEG-Prom); kilobases ( kb). Throughout this patent application, references to particular nucleotides are to nucleotides present on the coding strand of the nucleic acid. The following standard abbreviations are used throughout this specification to indicate particular nucleotides:
C = cytosine A = adenosine
T = thymidine G = guanosine
The present invention provides an isolated nucleic acid comprising a PEG-3 promoter containing a nucleotide sequence beginning with a guanosine (G) at position -270 of SEQ ID NO: 1 and ending with a cytosine (C) at position +194.
[0005]
The present invention also provides an isolated nucleic acid comprising a fragment of the nucleotide sequence of claim 1 that is at least 15 nucleotides in length.
[0006]
In one embodiment, the nucleic acid fragment is
(I) a PEA3 protein binding sequence consisting of a nucleotide sequence beginning with a thymidine (T) at position -105 and ending with a thymidine (T) at position -100 in SEQ ID NO: 1,
(Ii) a TATA sequence consisting of a nucleotide sequence beginning with thymidine (T) at position -29 and ending with adenosine (T) at position -24 of SEQ ID NO: 1, or
(Iii) an AP1 protein binding sequence consisting of a nucleotide sequence beginning with a thymidine (T) at position +6 and ending with a thymidine (T) at position +12 of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1.
[0007]
In another embodiment, the nucleic acid comprises at least two of the three nucleotide sequences (i)-(iii) described above.
[0008]
In another embodiment, the nucleic acid comprises the three nucleotide sequences (i)-(iii) described above.
[0009]
In another embodiment, the fragment has promoter activity.
[0010]
In another embodiment, the fragment is operably linked to the gene of interest. In another embodiment, the gene of interest is a reporter gene.
[0011]
In other embodiments, the reporter gene encodes β-galactosidase, luciferase, chloramphenicol transferase, or alkaline phosphatase.
[0012]
In other embodiments, the gene of interest is a tumor suppressor gene, a gene that causes apoptosis of cells when expressed, or a cytotoxic gene.
[0013]
The invention provides a vector comprising at least one of the nucleic acids described herein. The invention also provides a host cell comprising the vector.
[0014]
In another embodiment, the host cell is a tumor cell. In other embodiments, the tumor cells are melanoma cells, neuroblastoma cells, cervical cancer cells, breast cancer cells, lung cancer cells, prostate cancer cells, colon cancer cells, or glioblastoma polymorphism cells.
[0015]
The present invention also provides a method of identifying an agent that modulates PEG-3 promoter activity in a cell, comprising:
(A) contacting a cell containing a nucleic acid comprising a PEG-3 promoter operably linked to a reporter gene with an agent; (b) measuring the level of reporter gene expression in the cell; and (C) comparing the expression level measured in step (b) to a reporter gene expression level measured in the same cell in the absence of the drug, wherein the lower expression level measured in the presence of the drug is PEG- 3 indicates an agent that suppresses promoter activity and higher levels measured in the presence of the agent indicate agents that increase PEG-3 promoter activity, thereby identifying agents that modulate PEG-3 promoter activity in cells Provide a way to
[0016]
In other embodiments, the cells are melanoma cells, neuroblastoma cells, cervical cancer cells, breast cancer cells, lung cancer cells, prostate cancer cells, colon cancer cells, or glioblastoma polymorphism cells.
[0017]
In other embodiments, the agent comprises a molecule having a molecular weight of about 7 kilodaltons or less.
[0018]
In another embodiment, the agent is an antisense nucleic acid comprising a nucleotide sequence complementary to at least a portion of the sequence set forth in SEQ ID NO: 1 and is at least 15 nucleotides in length.
[0019]
In other embodiments, the agent is a DNA molecule, carbohydrate, glycoprotein, transcription factor protein or double stranded RNA molecule.
[0020]
In other embodiments, the agent is a synthetic nucleotide sequence, peptidomimetic, or organic molecule having a molecular weight from 0.1 kilodalton to 10 kilodalton.
[0021]
In other embodiments, the reporter gene encodes β-galactosidase, luciferase, chloramphenicol transferase, or alkaline phosphatase.
[0022]
In another embodiment, the expression of the PEG-3 promoter activity measured is a 2.5-3.5 fold or greater increase or decrease.
[0023]
The present invention is a method of treating cancer in a subject, comprising administering a nucleic acid comprising a PEG-3 promoter operably linked to a gene of interest, wherein the gene of interest is contained in cancer cells of the subject. And the expression of PEG-3 regulates the expression of PEG-3 to suppress or kill cancer cells, thereby treating cancer in a subject.
[0024]
In one embodiment of the invention, the nucleic acid consists essentially of (i) a PEA3 protein binding consisting of a nucleotide sequence beginning with a thymidine (T) at position -105 and ending with a thymidine (T) at position -100 of SEQ ID NO: 1. The sequence, (ii) a TATA sequence consisting of a nucleotide sequence beginning with thymidine (T) at position -29 and ending with adenosine (T) at position -24 of SEQ ID NO: 1, and (iii) the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1. Consists of an AP1 protein binding sequence consisting of a nucleotide sequence beginning with a thymidine (T) at position +6 and ending with a thymidine (T) at position +12.
[0025]
In another embodiment, the nucleic acid has a sequence that is complementary to at least a portion of SEQ ID NO: 1 that is at least 25 nucleotides in length.
[0026]
In other embodiments, the cancer is a melanoma, neuroblastoma, astrocytoma, glioblastoma polymorphism, cervical cancer, breast cancer, colon cancer, prostate cancer, osteosarcoma or chondrosarcoma.
[0027]
In other embodiments, administration is performed via injection, oral administration, topical administration, adenovirus infection, liposome-mediated transduction, topical application to cells of a subject, or microinjection.
[0028]
In another embodiment, the subject is a mammal. In another embodiment, the mammal is a human. In another embodiment, the gene of interest is a gene that, when expressed, causes apoptosis of the cell.
[0029]
In another embodiment, the gene comprises the Mda-7 gene or the p53 gene. In another embodiment, the gene of interest is a tumor suppressor gene. In another embodiment, the suppressor gene is mda-7. In another embodiment, the gene of interest is a cytotoxic gene. In another embodiment, expression of the cytotoxic gene causes cell death.
[0030]
In another embodiment, the cytotoxic gene is selected from the group consisting of HSV-TK, p21, p27, and p10.
[0031]
The practice of the present invention will employ, unless otherwise indicated, conventional techniques of molecular biology, microbiology, virology, recombinant DNA technology, and immunology, which are within the skill of the art. All such techniques are explained in the literature. For example, see Sambrook, Fritsch & Maniatis, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Second Edition (1989); "DNA Cloning", Vols. I and II (edited by DN Glover, 1985); "Oligonucleotide Synthesis" (edited by MJ Gait, 1984); "Nucleic Acid Hybridization" (BD Hames). & SJ Higgins, eds., 1984); "Animal Cell Culture" (RK, Freshney, eds., 1986); "Immobilized Cells and Enzymes" (IRL press, 1986). Perbal, B .; , “A Practical Guide to Molecular Cloning” (1984); Series “Methods in Enzymology” (S. Clowick and N. Kaplan, Ed., Academic. And "Handbook of Experimental Immunology", Vols. See I-IV (DM Weir and CC Blackwell eds., 1986, Blackwell Scientific Publications).
[0032]
As used in this specification and the appended claims, the singular forms “a,” “an,” and “the” mean, unless the content clearly dictates otherwise. , Including multiple references.
[0033]
The present invention provides a host cell comprising a recombinant expression construct described herein.
[0034]
In another embodiment of the present invention, the host cells have been stably transformed using the recombinant expression constructs described herein. In another embodiment of the present invention, the host cell is a tumor cell.
[0035]
In another embodiment of the present invention, the host cell is a melanocyte. In another embodiment of the invention, the cells are immortalized cells.
[0036]
In other embodiments of the invention, the tumor cells are melanoma cells, neuroblastoma cells, astrocytoma cells, glioblastoma polymorphism cells, cervical cancer cells, breast cancer cells, lung cancer cells or prostate cancer. Cells.
[0037]
The present invention is a method of expressing foreign DNA in a host cell comprising: providing a gene transfer vector comprising a PEG-3 promoter nucleotide sequence operably linked to the foreign DNA encoding the desired polypeptide or RNA. The above method is provided, wherein the exogenous gene is expressed by introducing the gene into a host cell.
[0038]
In another embodiment of the present invention, the gene transfer vector encodes and expresses a reporter molecule.
[0039]
In another embodiment of the present invention, the reporter gene is selected from the group consisting of β-galactosidase, luciferase and chloramphenicol acetyltransferase.
[0040]
In another embodiment of the present invention, "introducing" is performed by a method selected from the group consisting of adenovirus infection, liposome-mediated transduction, topical application to cells, and microinjection.
[0041]
In another embodiment of the invention, the cancer is melanoma, neuroblastoma, astrocytoma, glioblastoma polymorphism, cervical cancer, breast cancer, colon cancer, prostate cancer, osteosarcoma or chondrosarcoma. is there.
[0042]
In another embodiment of the invention, the cancer is a cancer of the central nervous system of the subject.
[0043]
In other embodiments of the present invention, administration is performed via injection, oral administration, or topical administration.
[0044]
In other embodiments of the invention, the carrier is an aqueous carrier, liposome, or lipid carrier.
[0045]
Definition
As used herein, a "therapeutic gene" encodes an amino acid sequence corresponding to a functional protein capable of providing a therapeutic effect to a cancer cell or having a regulatory effect on the expression of a gene that functions in a cell. Means DNA.
[0046]
As used herein, "nucleic acid molecule" is both DNA and RNA, and unless otherwise specified, includes both double-stranded and single-stranded nucleic acid molecules. It also includes hybrids such as DNA-RNA hybrids. A reference to a nucleic acid sequence can also include modified bases, as long as the modification does not significantly interfere with either the binding of the nucleic acid to a ligand, such as a protein, or Watson-Crick base pairing.
[0047]
As used herein, an “enhancer element” is a nucleotide sequence that increases the rate of transcription of a therapeutic or gene of interest but has no promoter activity. Enhancers can move upstream, downstream, and opposite the promoter without significant loss of activity.
[0048]
Two DNA or polypeptide sequences are "substantially homologous" when at least about 80% (preferably at least about 90%, and most preferably at least 95% to 99%) of the nucleotides or amino acids are molecules. It is time to pair over a specific length of As used herein, "substantially homologous" also refers to sequences that show identity (100% identity) to a particular DNA or polypeptide sequence. Substantially homologous DNA sequences can be identified, for example, by Southern hybridization experiments under specified stringent conditions for a particular system. Defining appropriate hybridization conditions is within the skill of the art. See, eg, Sambrook et al., Supra; "DNA Cloning", vols I & II, supra; "Nucleic Acid Hybridization", supra.
[0049]
A sequence that is “functionally equivalent” to a PEG-3 promoter sequence is a sequence that functions in the same manner as the PEG-3 promoter sequence. Accordingly, a promoter sequence "functionally equivalent" to a PEG-3 promoter as described herein will have a substantially similar time frame of expression and substantially similar amounts and substantially similar to the PEG-3 promoter sequence. It is a sequence that can direct the transcription of a downstream coding sequence with similar tissue specificity.
[0050]
A DNA "coding sequence" or "nucleotide sequence encoding a particular protein" is a DNA sequence that is transcribed in vivo or in vitro and translated into a polypeptide when placed under the control of appropriate regulatory sequences. The boundaries of the coding sequence are determined by a start codon at the 5 '-(amino) terminus and a translation stop codon at the 3'-(carboxy) terminus. Coding sequences include, but are not limited to, prokaryotic sequences, cDNA from eukaryotic mRNA, genomic DNA sequences from eukaryotic (eg, mammalian) sources, viral RNA or DNA, and even synthetic nucleotide sequences. . The transcribed end sequence will usually be located 3 'to the coding sequence.
[0051]
DNA "control sequences" collectively refer to untranslated regions that include the 5'-UTR (untranslated region) and 3'-UTR, such as promoter sequences, polyadenylation signals, transcription termination sequences, upstream regulatory domains, enhancers, and the like; Collectively provides transcription and translation of the coding sequence in the host cell.
[0052]
"Operably linked" refers to an arrangement of nucleotide sequence elements wherein the components described therein are configured to perform their normal function. Thus, a control sequence operably linked to a coding sequence is capable of effecting the expression of the coding sequence. The control sequence need not be proximate to the coding sequence if it functions to direct the expression of the coding sequence. Thus, for example, an intervening untranslated but transcribed sequence may be present between the promoter sequence and the coding sequence, and the promoter sequence may still be considered "operably linked" to the coding sequence. it can.
[0053]
A control sequence "directs the transcription" of a coding sequence in a cell when RNA polymerase binds to a promoter sequence and transcribes the coding sequence into mRNA, which is then translated into the polypeptide encoded by the coding sequence. You.
[0054]
A cell has been "transformed" by exogenous DNA when the exogenous DNA has been introduced inside the cell membrane. Exogenous DNA may or may not be integrated (covalently linked) into chromosomal DNA making up the genome of the cell. In prokaryotes and yeast, for example, exogenous DNA may be maintained on episomal elements such as plasmids. In eukaryotic cells, a stably transformed cell is generally a cell that integrates exogenous DNA into the chromosome and inherits it through chromosome replication to daughter cells, or a stably maintained extrachromosomal plasmid. Is a cell containing This stability is demonstrated by the ability of eukaryotic cells to establish cell lines or clones consisting of a daughter cell population containing exogenous DNA.
[0055]
A "heterologous" region of a DNA construct is an identifiable segment of DNA that is within or associated with another DNA molecule and is not found in association with the other molecule in nature. For example, a sequence encoding a protein other than a PEG-3 protein is considered a heterologous sequence when linked to a PEG-3 promoter. Another example of a heterologous coding sequence is a construct in which the coding sequence itself is not found in nature (eg, a synthetic sequence having codons that differ from the native gene). Similarly, chimeric sequences comprising a heterologous gene linked to a PEG-3 promoter are considered heterologous, as such chimeric constructs are not normally found in nature. Allelic variation or a naturally occurring mutation event does not result in a heterologous region of DNA, as used herein.
[0056]
vector
Particularly preferred are viral vectors. For eukaryotic cells, retroviral or adenoviral vectors are preferred. Such vectors contain all or part of the viral genome, eg, long terminal repeats (“LTRs”), promoters (eg, CMV promoter, SV40 promoter, RSV promoter), enhancers, and the like. If the host cell is a prokaryote, a bacterial virus, ie, a phage, is preferred. Examples of such vectors are, for example, λ phage-based vectors. In each case, the vector may comprise more than one viral element.
[0057]
The resulting vector is transfected or transformed into a host cell, which can be either eukaryotic or prokaryotic.
[0058]
The gene transfer vector of the present invention may further include a gene encoding a marker or a reporter molecule to more easily track the expression of the vector.
[0059]
The particular reporter molecule that can be used in the present invention is not important in the present invention. Examples of such reporter molecules that can be used in the present invention are well known in the art and include β-galactosidase (Fowler et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 74: 1507 (1977)), luciferase ( Tu et al., Biochem., 14: 1970 (1975)), and chloramphenicol acetyltransferase (Gorman et al., Mol. Cell Biol., 2: 1044-1051 (1982)).
[0060]
A gene transfer vector may contain two or more genes encoding the same or different foreign polypeptides or RNAs.
[0061]
A gene transfer vector can be any construct that can replicate in a host cell, including plasmids, DNA viruses, retroviruses, and isolated nucleotide molecules. Introduction of a gene transfer vector via a liposome can also be performed in the present invention.
[0062]
Examples of the plasmid that can be used in the present invention include a pGL3-based plasmid (Promega).^TM). An example of said DNA virus that can be used in the present invention is an adenovirus.
[0063]
Adenoviruses are receiving more attention as expression vectors, especially as expression vectors for human gene therapy (Berkner, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158: 39-66 (1992)).
Examples of said adenovirus serotypes that may be used in the present invention are well known in the art and include more than 40 different human adenoviruses, such as Ad12 (subgenus A), Ad3 and Ad7 (subgenus B). ), Ad2 and Ad5 (subgenus C), Ad8 (subgenus D), Ad4 (subgenus E), Ad40 (subgenus F) (Wigand et al., "Adenovirus DNA", edited by Doerfler). , Martinus Nijoff Publishing, Boston, pp. 408-441 (1986)). Ad5 of subgenus C is an adenovirus preferably used in the present invention. This is because Ad5 is a human adenovirus for which much biochemical and genetic information is known, and has historically been used in most constructs that use adenovirus as a vector. In addition, adenovirus is commercially available, for example, pCA3 (Microbix Biosystems Inc.).
[0064]
Methods for making adenoviral vectors are well known in the art (Berkner et al., Nucleic Acids Res., 11: 6003-6020 (1983); van Doren et al., Mol. Cell. Biol., 4: 1653-1656 ( 1984); Ghosh-Choudhury et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 147: 964-973 (1987); McGrory et al., Virol., 163: 614-617 (1988); and Gluzman et al. Vectors (Eurkariotic Viral Vectors) ", Gluzman, Y. Ed., Pp. 187-192, Cold Spring Harbor Laboratory (1982)).
[0065]
Derivative nucleic acid molecule
Derivative molecules may retain the functional properties of the PEG-3 promoter, ie, may have tissue-specific expression of the gene of interest, even with a substitution as described above. Modifications are tolerated as long as the potency of the derivative molecule is increased compared to the PEG-3 promoter alone and the derivative molecule retains its tissue specificity.
[0066]
Examples of therapeutic genes include suicide genes. Expression of these gene sequences produces proteins or agents that suppress melanoma tumor cell growth or induce melanoma tumor cell death. Suicide genes include genes encoding enzymes, oncogenes, tumor suppressor genes, genes encoding toxins, genes encoding cytokines, or genes encoding oncostatin. The purpose of the therapeutic gene is to suppress or kill the growth of skin cancer cells, or to produce cytokines or other cytotoxic drugs that directly or indirectly suppress the growth of cancer cells or kill the cells That is.
[0067]
Suitable enzymes include thymidine kinase (TK), the xanthine-guanine phosphoribosyltransferase (GPT) gene from E. coli or E. coli cytosine deaminase (CD), or hypoxanthine phosphoribosyltransferase (HPRT). ).
[0068]
Suitable oncogenes and tumor suppressor genes are neu, EGF, ras (including H, K, and Nras), p53, retinoblastoma suppressor gene (Rb), Wilmsoma gene product, phosphotyrosine phosphatase (PTPase) , And nm23. Suitable toxins are Pseudomonas exotoxins A and S; diphtheria toxin (DT); E. coli LT toxin, Shiga toxin, Shiga-like toxin (SLT-1, -2), ricin, abrin, supporin. , And gelonin.
[0069]
Suitable cytokines include interferon, GM-CSF interleukin, tumor necrosis factor (TNF) (Wong G et al., "Human GM-CSF: Molecular Cloning of Complementary DNA and Purification of Native and Recombinant Proteins (Human GM). -CSF: Molecular cloning of the completion of DNA and purification of the natural and recombinant proteins), Science 1985; 228: 810); WO93230Her. A. "Cloning and sequence analysis of cDNAs for interferon-β and virus-derived human Mx protein show that they contain a putative guanine nucleotide binding site: Functionality study of the gene promoter (Cloning and sequence analysis of cDNAs for cDNAs). interferon-beta and virus-induced human Mx proteins reveal that they contain putative guanine nucleotide-binding sites: functional study of the corresponding gene promoter) ", Journal of Virology, 1990 Mar, 64 (3): 1 71-81; Li YP et al., "Pro-inflammatory cytokine tumor necrosis factor-α and IL-6 downregulate the osteocalcin gene promoter, but IL-1 has no function (Proinflammation cytokines tumor necrosis factor- alpha and IL-6, but not IL-1, downregulated the osteocalcin gene promoter), Journal of Immunology, Feb. 1, 1992, 148 (3): 788-94; T. Et al. "Induction of TNFα and TNFβ Gene Expression in Rat Heart Transplants upon Allograft Rejection (Induction of TNF alpha and TNF beta gene expression in ratcarditransaction transagreementaltranslationlog.org. , 56 (2): 399-404); Breviario F, et al., "Interleukin-1 Inducible Gene in Endothelial Cells: Cloning of a New Gene Related to C-Reactive Protein and Serum Amyloid P Component (Interleukin-1-inducible genes). Cloning of a new gene related to C-reactive protein and serum amyloid P component), Journal of Biological Chemistry, in endothelial cells. 5, 1992, 267 (31): 22190-7; Espinoza-Delgado I. et al. "Regulation of IL-2 receptor subunit gene in human monocytes: Differential effects of IL-2 and IFN-γ (Regulation of IL-2 receptor subunit genes in human monocytoses. Differential effects of IF-2 and IFN-γ). -Gamma) ", Journal of Immunology, Nov. 1, 1992, 149 (9): 2961-8; A. Et al., "Regulation of the interleukin-3 (IL-3) receptor by IL-3 in the IL-5 in the FL5.12 cell line derived from fetal liver. Fetal liver-derived FL5.12 cell line), Blood, 1994 May 1, 83 (9): 2459-68; Cluitmans F. et al. H. "IL-4 down regulates IL-2-, IL-3-, and GM-CSF- induced cytokine gene expression in peripheral blood monocytes (IL-4 downregules IL-2-, IL -3-, and GM-CSF-induced cytokine gene expression in peripheral blood monotes), Annals of Hematology, 1994 Jun. Lagoo, A., 68 (6): 293-8; S. Et al., "Expression of IL-2, IL-4 and IFN-γ genes in superantigen-activated T cells and their secretion. Clear requirement for costimulatory signals via adhesion molecules (IL-2, IL- 4, and IFN-gamma gene expression versus secretion in superantigen-activated T cells. Distinct recruitment foremost slogan. 15, 1994, 152 (4): 1641-52; Martinez O. et al. M. Et al., "IL-2 and IL-5 gene expression in response to alloantigens in liver allograft recipients and in vitro (IL-2 and IL-5 gene expression in response to allogengen in river allografites in vitro). Transplantation, 1993 May, 55 (5): 1159-66; Pang G et al., GM-CSF, IL-1α, IL in human duodenal fibroblasts stimulated by lipopolysaccharide, IL-1α and TNF-α. -1β, IL-6, IL-8, IL-10, ICAM-1 and VCAM-1 gene expression and cytokine production (GM-CSF, IL-1 alpha, IL-1 beta, IL-6, IL -8, IL-10, ICAM-1 and VCAM-1 gene expression and cytokine production in human duodenal fibroblasts stimulated with lipopolysaccharide, IL-1 alpha and TNF-alpha) ", Clinical and Experimental Immunology, 1994 Jun. Urich T., 96 (3): 437-43; R. Et al., "In Vivo Expression of Endotoxin-Induced Cytokine Genes III. IL-6 mRNA and Serum Protein Expression and In Vivo Hematological Effects of IL-6 (Endotoxin-induced cytokine gene expression in vivo. III. IL-6 mRNA and serum protein expression and the in vivo hematologic effects of IL-6) ", Journal of Immunology, Apr. Maubiel A. 1, 1991, 146 (7): 2316-23; "Leukoregulin, a T-cell producing cytokine, induces IL-8 gene expression and secretion in human dermal fibroblasts. Demonstration and secretion in human dermal fibroblasts. NF-κB binding and NF-κ. B- demonstration of driving promoter activity. (Leukoregulin, a T cell-derived cytokine, induces IL-8 gene expression and secretion in human skin fibroblasts. demonstration and secretion in human skin fibroblasts. demonstration of enhanced NF-kappa B binding and NF- kappa B-driven promoter ac ivity.) ", Journal of Immunology, Nov. 1, 1992, 149 (9): 2969-76).
[0070]
Growth factors include transforming growth factor-α (TGF-α) and β (TGF-β), cytokine colony stimulating factor (Shimane M. et al., “Molecular cloning and characterization of G-CSF inducible gene cDNA. (Molecular Cloning and Characterization of G-CSF Induced Gene cDNA) ", Biochemical and Biophysical Research Communications, Feb. 28, 1994, A. et al. Cytokine gene cluster, interleukin 3 (IL-3), IL-4, IL-5, and granulocyte / macropha Messenger RNA expression of the cytokine gene cluster, interleukin 3 (IL-3), IL-4, IL-5, and regulatory chemistry / macrophage colony-logologigraphy / macrophage colony-logology-logologigraphy / macrophage-logologigraphy / macrophage-logologigraphy / macrophage / logologigraphy / macrophage / logologigraphy / macrophage / logologigraphy / macrophage / logologigraphy / macrophage / logologigraphy / macrophage / logologigraphy / macrophage / logologigraphy / macrophage / logologigraphy / macrophage / logochemistry / macrophage / logonology / logochemistry / macrophage / logonology / micrography / micrographe reactions, in atopic subjects), Journal of Experimental Medicine, Mar. 1, 1991, 173 (3): 775-8; de Wit H et al., "Differential regulation of M-CSF and IL-6 gene expression in monocytes. (Differential Egulation of M-CSF and IL-6 gene expression in monocytic cells), British Journal of Haematology, 1994 Feb., 86 Feb., pp. 259-64; 1. Detection of IL-1β, TNF-α, and IL-6 gene transcripts in keratinocytes, Langerhans cells, and peritoneal exudate cells upon infection with No.1 (Detection of IL-1β, TNF-α, and IL-6 gene transcription) by the polymerase chain reaction in keratinocytes, Langerhans cells and per toneal exudate cells during infection with herpes simplex virus-1) ", Archives of Virology, 1992, 126 (1-4): 253-69).
[0071]
Suitable vectors for use in the method of the present invention include viral vectors such as adenovirus, retrovirus vector, adeno-associated virus (AAV) vector, and the like.
[0072]
The viral vector selected should meet the following criteria: 1) Since the vector must be able to infect tumor cells, select a viral vector that has an appropriate host range; 3) The vector must be safe for the host and undergo minimal cell transformation, and must be expressed in cells for long periods of time. Retroviral vectors and adenoviruses provide an efficient, useful, and currently best characterized means for efficiently introducing and expressing foreign genes in mammalian cells. These vectors have a very wide range of hosts and cell types, and stably and efficiently express genes. The safety of these vectors has been proven by a number of research groups. In fact, many are used in clinical trials.
[0073]
Other viral vectors that can be used for gene transfer into cells to correct the disorder include retroviruses such as Moloney murine leukemia virus (MoMuLV); Papovaviruses such as JC, SV40, polyoma, adenovirus; Epstein Barr Virus (EBV); papilloma virus, such as bovine papilloma virus type I (BPV); vaccinia and poliovirus, and other human and animal viruses.
[0074]
Adenoviruses have several properties that make them attractive as cloning vehicles (Bachettis et al .: "Transfer of gene for thymidine kinase-deficient human cells by purified herpes simplex virus DNA. Purified herpes simplex viral DNA) ", PNAS USA, 1977 74: 1590; Berkner, KL:" Development of adenoviral vectors for expression of heterologous genes (development of biotechnology, adventoresforce.com). 6: 616; G Osh Choudhury G., et al., "Human adenovirus cloning vectors based on infectious bacterial plasmids", Gene 1986, H. et al .; Development of an Adenovirus Vector and Its Use in the Introduction of the Herpes Simplex Virus Thymidine Kinase Gene (Development of a helper-independent human adenovirus vector and its uses in the transfer of the medicines) e) ", J Virol 1986; 57: 257; Rosenfeld M. et al., in" in vivo, recombination into lung epithelial α₁Adenovirus-mediated transfer of a recombinant.alpha..sub.1 -antitrypsin gene to the long epithelium in vivo. Science 1991; 252: 431)).
[0075]
For example, adenoviruses have a medium-sized genome that replicates in the cell nucleus; many serotypes are clinically harmless; the adenovirus genome is considered stable when foreign genes are inserted; It appears to be maintained without loss or rearrangement; and adenovirus can be used as a high level transient expression vector with an expression period of 4 weeks to several months. Extensive biochemical and genetic studies have been able to replace the 7-7.5 kb heterologous sequence with native adenovirus sequences to create viable, conditional helper-independent vectors. (Kaufman RJ; "Identification of components necessary for control of adenovirus translation and their use in cDNA expression vectors") (identification of the component access for adenovirus transduction translation control and cDNA exchange vector). , PNAS USA, 1985 82: 689).
[0076]
AAV is a small human parvovirus with a single-stranded DNA genome of approximately 5 kb. This virus can be transmitted as a provirus integrated into multiple human cell types. AAV vectors have several advantages for human gene therapy. For example, they are nutritionally dependent on human cells but can also infect other mammalian cells; (2) no disease associated with AAV in humans or other animals; (3) integrated AAV genome Does not appear to be stable in its host cell; (4) it has not been shown that AAV integration alters the expression of the host gene or promoter or promotes their rearrangement; (5) introduced Genes can be rescued from host cells by infection with a helper virus, such as an adenovirus.
[0077]
The HSV-1 vector system facilitates the transfer of virtually all genes into non-dividing cells (Geller et al., "An Efficient Deletion Mutation Packaging System for Defective Herpes Simplex Virus Vectors." : human gene therapy and the applicability of the neurophysiological (an efficient deletion mutant packaging system for a defective herpes simplex virus vectors: potential applications to human gene therapy and neuronal physiology) ", PNAS USA, 1990 87: 8950).
[0078]
Other vectors for mammalian gene transfer are vectors based on bovine papilloma virus (Sarver N, et al., "Bovine papilloma virus DNA: a novel eukaryotic cloning vector: Anovel eukaryotic cloning vector. ) ". Mol Cell Biol 1981; 1: 486).
[0079]
Vaccinia and other poxvirus-based vectors provide a mammalian gene transfer system. Vaccinia virus is a double-stranded DNA virus with a large 120 kilodalton (kd) genome size (Panicali D, et al., "Construction of poxvirus as a cloning vector: from herpes simplex virus to DNA of infectious vaccine virus. insertion of the thymidine kinase gene (Construction of poxvirus as cloning vectors: insertion of the thymidine kinase gene from herpes simplex virus into the DNA of infectious vaccine virus) ", Proc Natl Acad Sci USA 1982; 79: 4927; Smith et al.," hepatitis B Infectious vaccine expressing virus surface antigen Recombinant senior virus (infectious vaccinia virus recombinants that express hepatisis B virus surface antigens), Nature, 1983 302: 490.).
[0080]
Retroviruses are packages designed to insert viral genes into host cells (Guild B et al., "Development of retroviral vectors useful for gene expression in cultured mouse embryonic cells and hematopoietic cells in vivo" (Development of). "Retrovirus vectors useful for expressing genes in cultured murine embryonic cells and hematopoietic cells of a retroviral gene," Human A. R .; And expression (Retrovirus mediated transfer and expression) f drug resistance genes in human hemopoietic progenitor cells) ", Nature 1986; 320: 275). A basic retrovirus consists of two identical RNA strands packaged in a proviral protein. The core is surrounded by a protective coat called the envelope, which is derived from the membrane of the previous host but has been modified with glycoproteins contributed by the virus.
[0081]
Markers and amplicons can also be used in subject expression systems. A variety of markers are known that are useful for selecting transform cell lines, and the markers are generally expressed when the cells are grown in a suitable selection medium and are capable of selecting phenotypes for transformed cells. A gene that gives Such markers for mammalian cell lines include, for example, the bacterial xanthine-guanine phosphoribosyltransferase gene (Mulligan et al., (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA), which can be selected in media containing mycophenolic acid and xanthine. 78: 2072-2076), and the aminoglycoside phosphotransferase gene (which defines a protein that inactivates the antibacterial action of a neomycin / kanamycin derivative), which can be selected using a medium containing a neomycin derivative such as G418, which is normally toxic to mammalian cells. (Colbere-Garapin et al., (1981) J. Mol. Biol. 150: 1-14). Markers useful for other eukaryotic expression systems are well known to those of skill in the art.
[0082]
Infection can be performed in vitro or in vivo. In vitro infection of cells is performed by adding the gene transfer vector to the cell culture medium. When the infection is performed in vivo, the solution containing the gene transfer vector can be administered in various ways depending on the tissue to be infected. Examples of such methods of administration include injection of the gene transfer vector into the skin, topical application on the skin, direct application to epithelial surfaces, or instillation into organs (eg, time release under the skin or into a tumor) Patches or capsules).
[0083]
Expression may be amplified by placing an amplifiable gene, such as the mouse dihydrofolate reductase (dhfr) gene, adjacent to the coding sequence. The cells can then be selected for methotrexate resistance in dhfr-deficient cells. See, eg, Urlaub et al., (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216-4220; Rungold et al., (1981) J. Am. Mol. and Appl. Genet. 1: 165-175.
[0084]
The systems described above can be used to direct the expression of various prokaryotic, eukaryotic and viral proteins, for example, viral glycoproteins suitable for use as vaccine antigens, modulating immune responses Immunomodulators, hormones, cytokines and growth factors, as well as proteins that are useful in the production of other biopharmaceuticals.
[0085]
It would also be desirable to make mutants or analogs of the protein of interest. Mutants or analogs can be made by deleting portions of the sequence encoding the protein, by inserting a sequence, and / or by replacing one or more nucleotides within the sequence. Techniques for modifying nucleotide sequences, such as site-directed mutagenesis, are well known to those of skill in the art. See, e.g., Sambrook et al., Supra; "DNA Cloning", Volumes I and II, supra; "Nucleic Acid Hybridization", supra.
[0086]
For the purposes of the present invention, it is particularly desirable to further engineer the coding sequence to effect secretion of the polypeptide from the host organism. This allows expression to proceed more efficiently by enhancing clonal stability and preventing deleterious build-up of the protein in the host cell. For this purpose, homologous signal sequences can be utilized with proteins normally found in connection with the signal sequence. In addition, a heterologous leader sequence that secretes the protein can be added to the construct. Preferably, the processing site will be included such that the leader fragment is cleaved from the co-expressed protein (eg, see US Pat. No. 4,336, for a discussion of how to introduce such a cleavage site). , 246). The leader sequence fragment typically encodes a signal peptide comprising hydrophobic amino acids.
[0087]
In one embodiment of the invention, a heterologous gene sequence, ie, a therapeutic gene, is inserted into a nucleic acid molecule of the invention. Other embodiments of the isolated nucleic acid molecules of the present invention include the addition of a single enhancer element or multiple enhancer elements that amplify the expression of a heterologous therapeutic gene without compromising tissue specificity.
[0088]
The transformation method used depends on the host to be transformed. Convenient methods that can be used to transform mammalian cells include, for example, DEAE-dextran based methods, calcium phosphate precipitation (Graham, FL and Van der Eb, AJ (1973) Virology 52: 456-467). ), Protoplast fusion, liposome-mediated transfection, polybrene-mediated transfection, and direct DNA microinjection into the nucleus. Bacterial cells can be transformed, generally using calcium chloride, alone or in combination with other divalent cations and DMSO (Sambrook, Fritsch & Maniatis, "Molecular Cloning: A Laboratory"). Manual) ", Second Edition (1989)). DNA can also be introduced into bacterial cells by electroporation. Methods for introducing exogenous DNA into yeast hosts typically include either transforming spheroplasts or transforming intact yeast cells treated with alkali cations.
[0089]
The construct can also be used in gene therapy or nucleic acid immunization to direct the production of the desired gene product in vivo by direct administration of the expression construct to a subject, causing it to be translated in vivo. See, for example, EPA Publication No. 336,523 (Dreano et al., Published October 11, 1989). Alternatively, gene transfer may be performed by transfecting the subject's cells or tissue ex vivo with the expression construct and reintroducing the transformed material into a host. The construct may be introduced directly into the host organism, ie, by injection (see, eg, International Publication No. WO / 90/11092; and Wolff et al., (1990) Science 247: 1465-1468). Gene transfer via a liposome may be performed using a known method. See, for example, Hazinski et al., (1991) Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 4: 206-209; Briham et al., (1989) Am. J. Med. Sci. 298: 278-281; Canonico et al., (1991) Clin. Res. 39: 219A; and Nabel et al., (1990) Science 249: 1285-1288. A targeting agent, such as an antibody to a surface antigen expressed on a particular cell type, may be covalently attached to the liposome surface so that the nucleic acid can be delivered to particular tissues and cells for local administration.
[0090]
Human gene therapy and diagnostic use of vectors
Several human gene therapy protocols that have been approved for use by the Recombinant DNA Advisory Committee (RAC) are compatible with general protocols for target cell infection and transfected cell administration (eg, Blaese, RM et al., 1990; Anderson, WF, 1992; Culver, KW et al., 1991). Further, U.S. Patent No. 5,399,346 (Anderson, WF, et al., Mar. 21, 1995, U.S. Patent Application No. 220,175) describes a method for retroviral gene transfer. The contents of these supporting references are incorporated in their entirety into this patent application. Since retroviral-mediated gene transfer requires target cells undergoing cell division to achieve stable integration, cells are often collected by collecting blood or bone marrow from the subject. It may be necessary to select a particular subpopulation of cells originally collected for use in an infection protocol. Next, a retroviral vector containing the gene of interest is mixed with the medium. The vector binds to and enters the cell surface of the subject's cells and inserts the gene of interest randomly into the chromosome. The gene of interest is now stably integrated, remains in place, and is inherited by all daughter cells as cell numbers increase. Cells may be cultured until reinfusion and grown for a total of 9-10 days (Culver et al., 1991). The shorter the protocol, the better the longer the time for culturing the target cells, the greater the potential for contamination.
[0091]
The present invention provides for the construction of retroviral vectors containing a PEG-3 promoter or a functional equivalent thereof linked to a gene of interest for gene therapy or diagnostic use. The transduction efficiency of these vectors can be tested in cell culture systems.
[0092]
Use of the composition of the present invention
The present invention involves targeting a gene of interest to cancer cells to express the protein encoded by the gene, and directly or indirectly ameliorating the condition. Since the PEG-3 promoter is specifically active in cancer cells undergoing cancer progression, it can act as a tissue-specific (cancer-cell specific) promoter.
[0093]
After infecting susceptible cells, the transgene driven by the vector's specific promoter expresses the protein encoded by the gene. Utilization of highly specific gene vectors allows for selective expression of specific genes in cancer cells. The basic task of the method of the present invention is to isolate a gene of interest, select an appropriate vector carrier to deliver the gene of interest to the body, administer a vector having the gene of interest into the body, The purpose is to achieve appropriate expression of the target gene. The present invention provides for the packaging of a cloned gene, ie, the gene of interest, in a manner that can be injected directly into the blood stream or organ of interest of a patient in need thereof. The packaging protects the foreign DNA from being eliminated by the immune system and directs it to the appropriate tissue or cell.
[0094]
In one embodiment of the present invention, the gene of interest (the desired coding sequence) is a tumor suppressor gene. The tumor suppressor gene may be p21, RB (retinoblastoma) or p53. One of skill in the art would be familiar with other tumor suppressor genes. To more clearly describe the state of the art regarding tumor suppressor genes, recent US Pat. Nos. 6,025,127 and 5,912,236 are incorporated herein by reference.
[0095]
Along with the gene of interest in humans or animals, other genes, such as a selectable marker, can be inserted to facilitate identification of cells that have incorporated the modified retrovirus. The most important point of the method of gene therapy is that a new gene must be expressed in target cells at an appropriate level over a satisfactory expression period.
[0096]
The methods described below for modifying a vector and administering the modified vector into the skin are merely for illustrative purposes and are exemplary of the methods that can be used. However, other methods understood in the art can also be used.
[0097]
Most of the techniques utilized to construct vectors and the like are widely practiced in the art, and most skilled persons are familiar with standard materials describing particular conditions and methods. However, the following sections will be guidelines for convenience.
[0098]
General methods for vector construction
Construction of suitable vectors containing the coding and regulatory sequences for the desired therapeutic gene uses standard ligation and restriction enzyme techniques that are well understood in the art (Maniatis et al., Molecular Cloning: Laboratory Manual). (Molecular Cloning: A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1982)). The isolated plasmid, DNA sequence, or synthetic oligonucleotide is cut, tailored, and religated into the desired shape.
[0099]
Site-directed DNA cleavage may be performed using appropriate restriction enzyme (s) under conditions generally understood in the art and individually as specified by the commercial restriction enzyme manufacturer (eg, New England Biolabs product catalog). It is performed by processing in the original. In general, approximately 1 μg of plasmid or DNA sequence is cleaved by approximately 1 unit of enzyme in approximately 20 μl of buffer solution. Typically, an excess of restriction enzyme is utilized to ensure complete digestion of the DNA substrate.
[0100]
Incubation times of approximately 1-2 hours at 37 ° C. can be used, but variations are possible. After each incubation, the proteins are removed by extraction with phenol / chloroform, followed by ether extraction, and the nucleic acids are recovered from the aqueous fraction by precipitation with ethanol. If desired, size separation of the cleavage fragments may be performed by polyacrylamide gel or agarose gel electrophoresis using standard techniques. A general description of size separation can be found in Methods in Enzymology 65: 499-560 (1980).
[0101]
The restriction fragment can be blunt-ended by treating it with a large fragment of E. coli DNA polymerase I (Krenow) in the presence of four types of deoxynucleotide triphosphates (dNTPs). This treatment can be performed using 50 mM Tris (pH 7.6) 50 mM NaCl, 6 mM MgCl 2 using an incubation time of approximately 15-25 minutes, using conditions of 20 ° C. to 25 ° C.₂, 6 mM DTT and 5-10 μM dNTPs. In the presence of four dNTPs, the Klenow fragment fills in the 5 'sticky ends, but truncates the 3' overhanging single strand. If desired, selective repair may be provided with one of the dNTPs or performed with the selected dNTPs, within the limits defined by the properties of the sticky ends. After treatment with Klenow, the mixture is extracted with phenol / chloroform and precipitated with ethanol. Treatment with S1 nuclease or Bal-31 under appropriate conditions results in hydrolysis of any single-stranded portion.
[0102]
Ligation is performed in a volume of 10-50 μl using T4 DNA ligase under the following standard conditions and temperatures. The ligation protocol is standard (D. Goeddel (eds.) "Gene Expression Technology: Methods in Enzymology" (1991)). In vector construction using "vector fragments", the vector fragments are usually bacterial alkaline phosphatase (BAP) or calf intestinal alkaline phosphatase (CIP) to remove the 5 'phosphate and prevent re-ligation of the vector. Process using. Alternatively, re-ligation may be prevented with a vector in which the undesired fragment has been double digested by additional restriction enzyme digestion.
[0103]
Suitable vectors include viral vector systems, such as ADV, RV, and AAV (RJ Kaufman, "Vectors used for expression in mammalian cells", Gene Expression Technology, Gene Expression Technology, V. Goeddel (ed. (1991)).
[0104]
Numerous methods for inserting functional DNA transgenes into cells are known in the art. For example, non-vector methods involve non-viral physical transfection of DNA into cells; for example, microinjection ((DePamphilis et al., BioTechnique 6: 662-680 (1988)); transfection via liposomes (Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84: 7413-7417 (1987), Felgner and Holm, Focus 11: 21-25 (1989) and Felgner et al., Proc. West. Pharmacol. Soc. 32: 115-121. 1989)), as well as other methods known in the art.
[0105]
Administration of the modified vector to the subject
One method of introducing DNA into target cells is to place the DNA in membrane-enclosed sacs or vesicles such as spheroplasts or liposomes, or to use calcium phosphate precipitation (CaPO₄(Graham F. and Van der Eb, A., Virology 52: 456 1973; Schaefer-Rider M. et al., "Liposomes as gene carriers: efficient transduction of mouse L cells with the thymidine kinase gene (Liposomes as Gene carriers: Efficient transduction of mouse L cells by thymidine kinase gene), Science 1982, 215: 166; Of Construction of Transferrin-coated Liposomes for in vivo transport of exogenous DNA to bone marrow erythroblasts in rabbits) ", Exp Cell Res 1986; 164: 568-572).
[0106]
Vesicles can be constructed such that their membranes fuse with the outer membrane of the target cell. Vectors of the invention in vesicles can reach cancer cells.
[0107]
Spheroplasts are maintained in a high ionic strength buffer until they can be fused to a mammalian target cell using a fusogen such as polyethylene glycol.
[0108]
Liposomes are artificial phospholipid vesicles. Vesicles are 0.2-4.0 microns in size and can contain 10% -40% aqueous buffer containing macromolecules. Liposomes protect DNA from nucleases and facilitate introduction into target cells. Transfection can also occur by electroporation.
[0109]
Prior to administration, the modified vector is suspended in complete PBS at the density chosen for injection. In addition to PBS, the osmotic pressure may optionally be equilibrated and suspended using a solution that is physiologically compatible with the subject, before the modified vector is injected into the host.
[0110]
For injection, the cell suspension is drawn into a syringe and administered to an anesthetized recipient. Multiple injections can be performed using this method. In this way, the virus suspension method allows the genetically engineered vector to be administered to any predetermined site in the skin, using the same virus suspension relatively intact. Allows multiple administrations to multiple different sites or the same site simultaneously. Multiple injections may consist of a mixture of therapeutic genes.
[0111]
Survival of the modified vector thus administered
Gene expression is controlled at the transcriptional, translational, or post-translational level. Transcription initiation is an early important event in gene expression. It depends on promoter and enhancer sequences and is affected by specific cellular factors that interact with these sequences. The transcription unit of many prokaryotic genes consists of a promoter and, in some cases, an enhancer or regulator element (Banerji et al., Cell 27: 299 (1981); Corden et al., Science 209: 1406 (1980); and Breathnach and Chambon, Ann. Rev. Biochem. 50: 349 (1981)).
[0112]
In retroviruses, the regulatory elements involved in the replication of the retroviral genome are present in the long terminal repeat (LTR) (see Weiss et al., Eds., "Molecular biology of tumor viruses: RNA tumors." viruses), "Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1982)).
Moloney murine leukemia virus (MLV) and Rous sarcoma virus (RSV) LTRs contain promoter and enhancer sequences (Jolly et al., Nucleic Acids Res. 11: 1855 (1983); Capecchi et al., "Enhancer and eukaryotic gene expression." (Enhancer and eukaryotic gene expression), Gulzman and Shenk, eds., Pp. 101-102, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, N.Y.).
[0113]
The promoter and enhancer regions of several non-viral promoters have also been described (Schmidt et al., Nature 314: 285 (1985); Rossi and de Crombrugge, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 5590-5594 (1987)). .
[0114]
In addition to using viral and non-viral promoters to drive therapeutic gene expression, enhancer sequences may be used to increase the level of therapeutic gene expression. Enhancers can increase the transcriptional activity of multiple foreign genes as well as their native genes (Armelor, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 70: 2702 (1973)).
[0115]
Therapeutic gene expression can also use cytokines that modulate promoter activity to increase stable expression over time after injection.
[0116]
The method of the present invention is illustrated by a preferred embodiment in which a modified vector carrying a therapeutic gene is injected into the brain of a subject.
[0117]
The most effective mode of administration and dosage regimen for the molecules of the present invention will depend on the exact location of the cancer being treated, the severity and course of the cancer, the health of the subject and the response to treatment, and the judgment of the treating physician. . Therefore, the dose of the molecule should be titrated to the individual subject. Molecules can be delivered directly or indirectly via other cells, with autologous cells being preferred, but heterologous cells are also within the scope of the invention.
[0118]
Dosage for animals and humans of various sizes and species and the surface area 1 m on which it is based²The correlation with mg per mg is described in Freireich, E. et al. J. Et al., Cancer Chemother. , Rep. 50 (4): 219-244 (1966). Dosage regimens may be adjusted to optimize the response to suppress and kill tumor cells, such as divided doses administered daily or proportionately reduced as appropriate. (E.g., divided doses may be administered daily or in proportionately reduced doses depending on the particular therapeutic situation).
[0119]
It will be apparent that the dosage of the molecules of the invention required to achieve healing can be further reduced by schedule optimization.
[0120]
To direct high expression of heterologous genes in cancer cells PEG- Use of promoter
One embodiment of the invention is a method of expressing a gene of interest that is not endogenously expressed in a cancer cell, comprising: a) constructing a nucleic acid comprising a PEG-3 promoter operably linked to the gene of interest. B) introducing the nucleic acid into a cancer cell expressing PEG-3, whereby the PEG-3 promoter directs the expression of the gene of interest in the cancer cell. In one embodiment, the gene of interest encodes a protein that is cytotoxic to cancer cells, causes apoptosis of the cancer cells, slows the growth of the cancer cells, or stops the division of the cancer cells. The gene of interest may be any gene whose expression can cause a desired biochemical or physiological effect in the cancer cell, such as a reduction in proliferation or a reduction or suppression of the progression of the cancer phenotype.
[0121]
One advantage of utilizing the nucleic acid constructs of the present invention in the above method of treating cancer in a subject is that the nucleic acid can be administered to both cancer cells and normal cells. However, since the PEG-3 promoter is active only in cancer cells, the gene of interest is not expressed in normal cells, whereas the gene of interest is highly expressed in cancer cells. Thus, this nucleic acid construct allows the specific expression of the gene of interest to be specifically targeted to cancer cells.
[0122]
Liposomes can be utilized as delivery agents to introduce the nucleic acid construct into cells of the subject to be treated. Of course, there are numerous methods for delivering such nucleic acid constructs, which are well known to those skilled in the art (eg, microinjection; topical application; use of chemical carriers; direct injection into tumors; etc.). .
[0123]
The invention is described in the following experimental details section. These sections are included to aid in understanding the invention and should not be construed as limiting the invention described in the claims herein in any way.
[0124]
Experimental details
Example 1: Progress Up Genes That Cause Differential Expression During Transformation -3 Definition of the region within the promoter
Cancer is a progressive disease, and tumor cells develop over time a qualitatively new transformation-related phenotype or additional generation of existing transformation-related properties. A rodent cell culture model system is used to define genes associated with and controlling cancer progression. By subtraction hybridization, a novel gene functionally involved in inducing transformation progression in rat embryo cells transformed with mutant adenovirus type 5, H5ts125 was identified, and this was identified as progression-enhancing gene-3 (PEG -3). The PEG-promoter, a 5'-flanking promoter region of approximately 2.1 kilobases, was isolated, cloned and characterized. The full length of the PEG-promoter and the various mutated regions were ligated with a luciferase reporter construct, and promoter activity during cancer progression was assessed using a transient transfection assay. These experiments demonstrate the need for AP-1 and PEA-3 sites adjacent to the PEG-3 TATA box region to mediate increased PEG-3 expression as compared to non-progressive H5ts125-transformed rat embryonic cells. Proven. The involvement of AP-1 and PEA-3 in PEG-3 regulation has also been demonstrated by protein blotting, electrophoretic mobility shift (EMSA) assays and transfection studies with PEA-3 and c-Jum expression vectors. . Our findings demonstrate the importance of AP-1 and PEA-3 transcription factors in mediating increased PEG-3 expression in H5ts125 transformed rat embryonic cells displaying an aggressive and progressive cancer phenotype. .
[0125]
Example 2: Progression-enhancing gene -3 ( PEG-3 ) Within the promoter AP-1 When PEA-3 Site-to-site cooperation indicates that the oncogenic phenotype in transformed rat germ cells is ongoing PEG-3 Regulates basal and differential expression of
The oncogenic process involves a series of sequential changes in cellular phenotype, resulting in the further generation of new properties or transformation-related traits by developing tumor cells (Fisher, 1984; Bishop, 1991; Knudson, 1993; Vogelstein). And Kinzler, 1993). Despite extensive research, the exact genetic mechanisms underlying tumor cell progression during most human cancer developments remain unknown. Experimental confirmation indicates that a number of diversely acting genetic elements can contribute to cancer development and transformation progression (Fisher, 1984; Bishop, 1991; Liotta et al., 1991; Knudson, 1993; Levine, 1993; Hartwell and Kastan, 1994; Kang et al., 1998a; Vogelstein and Kinzler, 1993; Su et al., 1997; 1999). Important target genes involved in these processes include oncogenes, tumor suppressor genes and genes that regulate genomic stability, cancer aggressiveness and angiogenesis (Fisher, 1984; Bishop, 1991; Liotta et al., 1991; Knudson, 1993; Levine, 1993; Hartwell and Kastan, 1994; Kang et al., 1998a; Vogelstein and Kinzler, 1993; Su et al., 1997, 1999). Recently, several novel genetic elements have been identified that are associated with cancer aggressiveness or directly regulate in certain cases, namely, the enhanced progression (PEGen) and suppression of progression (PSGen) genes (Kang et al., 1998a; Su et al.). , 1997, 1999). The precise mechanism by which these different genes orchestrate the complex processes of cancer progression is an important area of research and has the potential to define new pathways and target molecules that could provide new diagnostic and therapeutic approaches to cancer.
[0126]
A useful model to define the genetic and biochemical changes that mediate tumor progression is the Ad5 / early passage RE cell culture system (Fisher, 1984; Babiss et al., 1985; Duigou et al., 1989, 1990, 1991; Fisher et al., 1979a, b, c; Reddy et al., 1993; Su et al., 1994, 1997; Kang et al., 1998a). Transformation of secondary rat embryo (RE) cells by Ad5 is often a sequential process, with non-transformed cells resulting in the acquisition of further generation of a specific phenotype (Fisher et al., 1979 a, b, c; Babess et al. , 1985). Progress in the Ad5 transformation model is characterized by an anchorage-independent increase and development of tumorigenicity (as formation in nude mice) (Fisher, 1984; Babess et al., 1985). The progressive phenotype of Ad5 transformed RE cells was determined by Ha-ras, v-src, v- by selection for growth on agar or tumor formation in nude mice (Fisher et al., 1979a, b, c; Babiss et al., 1985). raf or transfection with an oncogene such as the human papillomavirus type 18 E6 / E7 region (Duigou et al., 1989; Reddy et al., 1993) or transfection using a specific signaling gene such as protein kinase C. (Su et al., 1994).
[0127]
The progression induced spontaneously or following gene transfer is a stable cytoplasm that remains in Ad5 transformed RE cells without extinction after multiple passages (> 100) in monolayer culture (Fisher, 1984). Babiss et al., 1985; Reddy et al., 1993). However, with a single treatment with the demethylating agent 5-azacytidine (AZA),> 95% of the cell clones have a stable return of transformation progression (Fisher, 1984; Babess et al., 1985; Duigou et al.). Reddy et al., 1993; Su et al., 1994). The progressive phenotype is also suppressed in somatic cell hybrids formed between normal or non-progressive transformed cells and progressive cells (Duigo et al., 1990, 1991; Reddy et al., 1993). These findings suggest that progression can be caused by activation of specific promoters (elevation of progression) or selective inhibition of genes that inhibit progression (repression of progression), or perhaps a combination of both processes (Fisher, 1984). Babiss et al., 1985; Su et al., 1997; Kang et al., 1998a). To identify potential progression-inducing genes that are up-regulated in progressive Ad5 transformed cells as compared to non-progressive Ad5 transformed cells, we have performed subtraction hybridization and reciprocal subtraction RNA display. A differential RNA display (RSDD) technique is used (Jiang and Fisher, 1993; Reddy et al., 1993; Su et al., 1997; Kang et al., 1998a). The subtractive hybridization technique resulted in non-progressive cells (transformed with parental Ad5, AZA-suppressed, and repressed in progressive cells (spontaneous, induced by oncogenes or induced by growth factor-related genes). A PEG-3 clone displaying increased expression over somatic cell hybrids) was obtained (Su et al., 1997). These findings demonstrate a direct correlation between PEG-3 expression and the advanced phenotype in this rat embryo model system.
[0128]
A nuclear run-on assay confirms a direct correlation between PEG-3 expression and increased RNA transcription rate of this gene (Su et al., 1997). To elucidate the mechanism underlying the differential expression of PEG-3 during transformation, the 5'-flanking region of this gene containing the promoter (PEG-Prom) was isolated and characterized. . The full length approximately 2.0 kb PEG-Prom and various mutations in the PEG-Prom (including deletions and point mutations) were constructed and analyzed. The results of this investigation demonstrate that AP1 and PEA3 transcription factors are major determinants of increased PEG-3 expression in progressive Ad5 transformed RE cells. This conclusion is substantiated by electrophoretic mobility shift assay (EMSA) and transfection studies with c-Jun and PEA3 expression vectors.
[0129]
result
PEG3 Expression directly correlates with transformation progress
To assess the relationship between PEG-3 expression and transformation progress, we utilized a range of rodent cell lines ranging from normal to highly progressive (Fisher et al., 1987). Babiss et al., 1985; Duigou et al., 1989; Reddy et al., 1993; Su et al., 1997, 1999). The advanced phenotypic features of this rodent model are that they grow in an anchorage-independent manner with increased efficiency and allow tumors to grow in nude mice with short tumor latencies (18-21 days versus 38-44 days, respectively). ) (Babiss et al., 1985; Su et al., 1999). E11, a secondary Sprague Dawley RE clone transformed with specific H5ts125, grows in agar with low efficiency (approximately 2-4%) (progressive negative), but highly progressive nude mouse tumors E11-NMT, an E11 subclone derived from E. coli, grows with high efficiency (almost 30-45%) in agar (FIG. 1A). Forced expression of the HA-ras oncogene in E11 cells, a representative clone, E11-ras R12, acquires a progressive phenotype as indicated by both anchorage-independent growth (FIG. 1A) and tumor latency in nude mice. (Reddy et al., 1993). Quantification of PEG-3 mRNA levels by Northern hybridization (FIG. 1B) and PEG-3 protein levels by Western blotting (FIG. 1C) showed an increase in PEG-3 expression (ie, E11-NMT and E11-ras R12 and It shows a direct correlation between the reduction in E11) and the progressive phenotype (indicated by anchorage-independent growth).
[0130]
To further explore the relationship between PEG-3 expression and progression, the same three parameters as measured in E11, Ell-NMT and E11-ras R12 cells were used to compare E11-NMT with CREF cells. A series of somatic cell hybrids formed between them were compared (FIG. 1). CREF cells are immortalized rat germ cells that do not form colonies when grown on agar and have no tumorigenic potential when subcutaneously inoculated into athymic nude mice (Fisher et al., 1982; Duigou et al., 1990). . Similarly, somatic cell hybrids formed between E11-NMT and CREF cells, which exhibit a fat morphology such as F1 and F2, also do not form tumors in nude mice (Duigou et al., 1990), It grows in agar at a low efficiency similar to E11 cells (FIG. 1A). In contrast, certain E11-NMT X CREF somatic cell hybrids exhibiting circular morphology, such as R1 and R2, grow with high efficiency in agar to even exceed the efficiency of E11-NMT (FIG. 1A), and in nude mice. Rapidly forms tumors (Duigou et al., 1990). As observed in E11 cells, PEG-3 mRNA and protein levels are reduced in F1 and F2 cells, but R1 and R2 are PEG similar to E11-NMT and E11-ras R12 cells (FIGS. 1B, 1C). -3 presents elevated expression. In the case of CREF cells, PEG-3 mRNA is detected at very low levels by Northern blotting (FIG. 1B) and PEG-3 protein is barely detectable by Western blotting (FIG. 1C). These results indicate a direct match between PEG-3 expression and the advanced phenotype in H5ts125 transformed RE cells.
[0131]
PEG-3 Isolation of promoter and identification of its transcription start site
Based on the sequence of the PEG-3 cDNA, a 2.0-kb rat genomic fragment representing the 5 'flanking region of the PEG-3 gene was identified from the 5' region of the PEG-3 cDNA using a genome walking technique. The sequence of the putative FL-PEG-Prom is shown in FIG. The transcription start site of the PEG-3 gene was mapped by primer extension using RNA isolated from E11 and E11-NMT cells (FIG. 3). Computer analysis using PEG-Prom's GCG software showed that two upstream and two positions, −1071 and −24, respectively, of the RNA cap site.TATAIndicates the presence of a box. The sequence of -1071 is probably non-functional because of its great distance from the RNA cap site. Two PEA3-binding sites, AGGAAA and TTTCCT, are located at positions -1644 and -101. The PEA3 site at position -101 is 76 nt upstream of the TATA box. The AP1 site is at position +8. Additional potential DNA binding elements are also found in PEG-Prom, including Spl, acute phase response element, NFκB1, E2F, E2A, GRE, TRE and CREB.
[0132]
The AP1 and PEA3 sites adjacent to the TATA box in the PEG-3 promoter are responsible for basal and increased promoter activity in progressive and non-progressive H5ts125 transformed RE cells.
[0133]
Transfection of the FL-PEG-Prom luciferase construct into various cell types demonstrated a direct relationship between progressive phenotypic expression and increased promoter activity (FIG. 4). Progressive cells display a 2.5-3.5 fold increase in luciferase activity, which compares well with PEG-3 Northern and Western blotting data (FIGS. 1B and 1C). The levels of luciferase activity in E11 cells were similar to those observed with F1 and F2 CREF X E11-NMT somatic cell hybrids. In the case of active and growing CREF cells, PEG-Prom showed only negligible activity.
[0134]
A series of PEG-Prom deletion constructs have been engineered to define regions of the FL-PEG-Prom that are involved in the ongoing differential expression of the PEG-3 gene in the transformed phenotype of H5ts125 transformed cells. And placed before the luciferase gene (FIGS. 5 and 6). Deletion of the PEA3 site at position −1645 and the TATA box at position −1072 did not affect the PEG promoter activity of either E11 or E11-NMT, indicating that these regions of the promoter were E11 or E11-NMT. It did not contribute to basal or increased expression of PEG-Prom in cells (FIG. 5). Further deletion at position -270 slightly inhibited the promoter activity of E11-NMT cells (approximately 19% reduced compared to the activity of FL-PEG-Prom), but significantly reduced the activity of PEG-Prom in E11 cells. Was not modified. In contrast, removal of the -104 nt PEA3 site to retain the TATA box at position -24 and the +8 bp AP1 site reduced basal promoter activity in both E11 and E11-NMT cells. The activity of this mutant PEG-Prom was 15 and 4 times lower than the activity of FL-PEG-Prom in E11-NMT and E11 cells, respectively. Indeed, this promoter deletion abolished the increased expression of PEG-Prom in E11-NMT compared to E11 cells, indicating that the PEA3 site at -104 was PEG-promoted in progressive H5ts125 transformed RE cells. 3 were shown to be major determinants of increased activity. Internal deletions at positions -1167 to -536 and -1267 to -536 are at levels similar to luciferase activity observed in deletion mutants containing a deletion at position -270 in E11-NMT and E11 cells. Gave. Genetically engineered internal deletions between -1167 and -142 and between -1590 and -142 result in further loss of promoter activity in both E11 and E11-NMT cells, with the greatest effect being on E11-NMT cells (The activity was reduced by almost 41% compared to FL-PEG-Prom). In contrast, deletion of the promoter region from -142, -536, or -1287 and retention of the rest of the PEG-Prom completely abolished PEG promoter activity (Figure 5). These results indicate that the PEA3 transcription site (position -104), the AP1 transcription site (position +8) and the TATA box (position -24) are major determinants of basal PEG-Prom activity in E11 and E11-NMT cells. Means
[0135]
To further examine the role of the PEA3 site at position -104, the TATA box at position -24 and the AP1 site at position +8 in regulating PEG-3 promoter activity in E11 and E11-NMT cells, a further series of mutants A PEG-3 promoter luciferase construct was made (FIG. 6). Mutations at the AP1 site and retention of the wild-type PEA3 and TATA sites resulted in equivalent promoter activity in E11 and E11-NMT cells. This observation underscores the importance of the AP1 site at position +8 of the PEG-3 promoter in regulating increased PEG-3 transcriptional activity in E11-NMT cells as compared to E11 cells. The implications for defining the PEG promoter activity of the PEA3 site at position -104 also include the construction of a construct containing a wild-type TATA (position-24) and an AP1 (position +8) site containing a mutant PEA3 site at -104. This was also demonstrated by analysis (FIG. 6). In this mutant, the activity level of the promoter was basal and its activity was similar in E11 and E11-NMT cells. Similar basal promoter activity was also observed with two additional mutants, one containing the mutant AP1 and PEA3 sites as well as the wild-type TATA box, and the other at position -104. A mutant lacking the PEA3 site and having a wild-type TATA and an AP1 site. In contrast, mutants lacking PEA3 at position -104 and having a mutant TATA site and a wild-type AP1 site at position +8 did not display promoter activity. These results demonstrate that both the AP1 site located at +8 and the PEA3 site at position −104 are involved in differential expression of PEG-Prom in E11-NMT cells compared to E11 cells. AP1 and PEA3 are major determinants of differential expression of PEG-Prom in E11-NMT cells compared to E11 cells, and basal PEG-Prom activity in E11 and E11-NMT cells.
[0136]
Progressive E11-NMT Cells display increased nuclear transcription factor binding
Western blot analysis was performed to determine AP1 / cJun and PEA3 protein levels in E11 and E11-NMT cells. The de novo expression levels of both proteins were approximately 1.5-2 fold higher in E11-NMT cells compared to E11 cells (data not shown). EMSA was performed to determine the DNA binding potential of the AP1 and PEA3 proteins and whether there were differences in binding complex levels in E11-NMT cells compared to E11 cells (FIGS. 7A and 7B, respectively). Using the wild-type AP1 oligonucleotide, the level of binding to AP1 was higher in E11-NMT compared to E11 (FIG. 7A). The specificity of this binding to AP1 was demonstrated by competition with a 10- and 100-fold molar excess of unlabeled competitor and the absence of the DNA-protein complex when using the mutant AP1 oligonucleotide (FIG. 7A). ). Direct evidence of binding of nuclear extracts to AP1 was provided by a supershift assay using the cJun (AP1) antibody (FIG. 7A). In contrast, no supershift of the DNA-protein complex was observed when the anti-actin antibody was used in place of the cJun (AP1) antibody. Similar results were obtained using the PEA3 oligonucleotide in a gel retardation assay (FIG. 7B). Increased binding to PEA3 was observed in extracts from E11-NMT cells as compared to E11 cells. In EMSA, no binding to the mutant PEA3 oligonucleotide was observed, unlabeled PEA3 competitors effectively inhibited binding to PEA3, and PEA3-specific antibodies produced supershift DNA protein complexes, No anti-actin antibody was generated (FIG. 7B). These experiments demonstrate that E11-NMT cells contain elevated levels of AP1 and PEA3 with the ability to bind their respective sites within the promoter of PEG-3.
[0137]
E11 In cells cJun ( AP1 )When PEA3 Ectopic expression is independent and cooperative PEG-Prom Increase activity
The above studies suggested that the AP1 and PEA3 sites in PEG-Prom are involved in the differential activity of this promoter in E11-NMT cells compared to E11 cells. To directly determine whether the proteins encoded by these transcription factors could alter the expression of FL-PEG-Prom in E11 cells, transient transfection and promoter luciferase assays were performed (FIG. 8). Transfection of E11 cells with an expression vector producing c Jun resulted in a dose-dependent increase in FL-PEG-Prom activity in E11 cells. The maximum effect obtained was small, only equivalent to an approximately 1.5-fold increase in cells not expressing the cJun expression plasmid. This stimulatory effect was not evident in cells transfected with the control vector (pcDNA3.1) or the vector encoding the mutant cJun protein (TAM67). Forced expression of PEA3 in E11 cells also resulted in a dose-dependent increase in FL-PEG-Prom activity, again reaching an approximately 1.5-fold maximum. No increase in promoter activity was observed in E11 cells transfected with the control pRC / RSV vector. When E11 cells were co-transfected with a combination of cJun and an expression vector producing PEA3, FL-PEG-Prom activity was comparable to that observed in E11-NMT cells. This effect was not seen when the control vector combination was transfected into E11 cells (FIG. 8). These results support the hypothesis that differential expression of PEG-Prom in E11-NMT cells as compared to E11 cells is the result of increased expression of cJun (AP1) and PEA3 transcription factors in progressive E11-NMT cells. Things.
[0138]
Consideration
Obtaining increased expression of the transformed phenotype, ie, transformation progress, represents an important component of the cancer paradigm. A novel cDNA, PEG-3, displaying differential expression as a function of transformed phenotype, tumorigenic transformation and progression of DNA damage in rodent cells, was identified by subtraction hybridization (Su et al., 1997). . Recent studies have demonstrated that PEG-3 has been implicated in cancer progression because subcutaneous injection of transformed rodent or human tumor cells into athymic nude mice resulted in the presence of PEG-3 in these cells. Genes are ectopically expressed resulting in an aggressive tumor phenotype (Su et al., 1999). These observations suggest that PEG-3 is an important contributor to transformation progress. To define the mechanism that mediates the differential expression of PEG-3 in advanced (E11-NMT) Ad5 transformed rat embryonic cells as opposed to non-progressive (E11), the promoter region of this gene was identified and isolated. And tested. Utilizing promoter analysis, EMSA and transient transfection assays, we herein demonstrate that the combination of the AP1 and PEA3 transcription factor sites in the PEG-Prom flanked by the TATA region is the H5ts125 transform RE Demonstrates contributing to basal and increased promoter activity of cells.
[0139]
Promoter deletion assays indicate that the region of PEG-Prom containing -270 / + 194 of the PEG-3 gene is essential for PEG-3 transcriptional activity in E11 and E11-NMT cells (FIGS. 5 and 6). Furthermore, this PEG-Prom region is also involved in the differential promoter activity of PEG-Prom in E11-NMT cells compared to E11 cells. Sequence analysis shows that this part of the PEG-Prom contains the AP1 (+8), TATA (-24) and PEA3 (-104) elements (FIG. 2). Mutation of the +8 AP1 site while retaining wild-type TATA and PEA3 sequences reduces the activity of the PEG-Prom deletion construct (-270 / + 194) in E11-NMT cells compared to E11 cells ( (FIG. 6B). This finding suggests that the +8 AP1 site is a major determinant of the differential expression of PEG-Prom in E11-NMT cells compared to E11 cells. The importance of the TATA and PEA3 sites in PEG-Prom activity is also demonstrated with additional mutants (FIG. 6B). Mutation of the PEA3 site (-104) in the presence of wild-type TATA (-24) and AP1 (+8) sites reduces promoter activity at E11 and E11-NMT and reduces PEG-Prom at E11-NMT. Effectively eliminates the increased activity. A similar level of reduced PEG-Prom activity is found in both E11 and E11-NMT cells when the AP1 (+8) site has been mutated alone or in combination with a mutated PEA3 (+8) site. In these contexts, altering the AP1 (+8) and PEA3 (104) sites alone or in combination affects both basal and increased PEG-Prom activity. In addition, mutations in the TATA region (-24) abolish promoter activity even in the presence of the wild-type AP1 (+8) site. These results indicate that both the AP1 and PEA3 sites flanking the intact TATA region within the PEG-Prom contribute both to basal promoter activity in E11 and E11-NMT cells and to elevated promoter activity in E11-NMT cells. Demonstrate.
[0140]
Functional interaction and nuclear protein binding between AP1 and PEA3 sites in FL-PEG-Prom was confirmed by EMSA using appropriate oligonucleotide probes and monoclonal antibodies (FIG. 7). EMSA with nuclear extracts from E11 and E11-NMT cells resulted in slower migrating DNA protein complexes when incubated with AP1 or PEA3 oligonucleotides (FIGS. 7A and 7B). Addition of a 10- or 100-fold molar excess of unlabeled oligonucleotide in the assay, respectively, reduced or eliminated the amount of these complexes. No DNA protein complexes were observed when the mutated AP1 or PEA3 oligonucleotide was used in the binding assay. The specificity of nucleoprotein binding was demonstrated in EMSA using antibodies specific for cJun (AP1) or PEA3. In these experiments, a supershifted, slow-moving DNA-protein complex clearly emerged from antibody interaction with the DNA-protein complex. The amount of AP1 and PEA3 complexes present in E11-NMT cells exceeds that found in E11 cells (FIGS. 7A and 7B). In addition, Western blotting of E11-NMT cells versus E11 cells also detected a small but significant increase (approximately 1.5- to 2-fold) in AP1 / cJun and PEA3 protein levels (data disclosed). Absent). Functional significance of elevated AP1 and PEA3 proteins in E11-NMT cells compared to E11 cells for the regulation of elevated PEG-3 promoter activity in progressive cells by transient transfection of cJun and PEA3 expression vector (FIG. 8). These experiments show that transient ectopic expression of cJun (AP1) and PEA3 individually increases PEG-Prom activity in E11 cells, and that combining both transcription factors has further effects, It was demonstrated that PEG-Prom activity similar to that observed in NMT cells could be reached (FIG. 8). Based on increased binding activity in EMSA, increased protein levels in Western blots, and co-transfection assays, there appears to be a strong correlation between PEG-3 expression and AP1 / PEA3 activity.
[0141]
The AP1 transcription factor is an immediate early response gene that regulates the expression of a subset of target gene promoters containing a defined sequence motif (TPA response element, TRE) (Angel and Karin, 1991). The AP1 complex includes heterodimers of Fos and Jun family members or homodimers of Jun family members (Angel and Karin, 1991; Karin et al., 1997). AP1 contributes to many important and diverse biological processes including cell proliferation, transformation, tumorigenesis, differentiation and apoptosis (Angel and Karin, 1991; Karin et al., 1997; Olive et al., 1997; Kang et al., 1998b). The transcription factor PEA3, a member of the ets gene family, is also a major contributor to cell transformation and tumorigenesis (Brown and McKnight, 1992). The PEA3 protein interacts with nearly a 10 base pair DNA sequence within the promoter of the target gene to regulate transcription (Macleod et al., 1992; Seth et al., 1992; Waslyk et al., 1993). Putative candidate PEA3 target genes include proteinases required for extracellular matrix degradation, including serine urokinase-type plasminogen activator (Nerlov et al., 1992) and the matrix metalloproteinases gelatinase B, stromal collagenase, Tromelysin-3 and matrilysin (Matrisian and Bowden, 1990; Matrisian, 1994; Higasino et al., 1995), which are important factors contributing to cancer metastasis (Liotta et al., 1991; Kohn and Liotta, 1995). . Many of these extracellular matrix degradation genes also contain an AP1 site in their promoters (Angel and Karin, 1991; Karin et al., 1997). Cooperation between the AP1 and PEA3 sites in regulating multiple cellular promoters has been demonstrated. These include the serum growth factor response of the tissue inhibitor of metalloproteinase-1 (TIMP-1) gene (Edwards et al., 1992) and the 12-O-tetradecanoylphorbol 13-acetate of the urokinase-type plasminogen activator gene ( TPA), fibroblast growth factor-2 (FGF-2) and macrophage colony stimulating factor induction (Neriov et al., 1992; Sacey et al., 1995; De Cesare et al., 1996; D'Orazio et al., 1997). In addition, the PEA3 and AP1 elements are also present within the promoter of the stromelysin and collagenase genes (Gutman and Wasylyk, 1990; Sirum-Conlyly and Brinkerhoff, 1991), and these elements are transcribed by specific transforming oncogenes. Provides a target for activation (Washlyk et al., 1989, 1993). In these contexts, increased AP1 and PEA3 activity in E11-NMT cells as compared to E11 cells can result in increased PEG-Prom activity, thereby directly contributing to cancer aggressiveness Provides PEG-3 protein and results in increased tumor growth in nude mice, progressive tumor cells in vivo. Also, increased activity of AP1 and PEA3 in E11-NMT cells probably activates further downstream genes that can promote the cancer phenotype.
[0142]
The mechanism by which PEG-3 promotes the expression of the transformed phenotype is currently unknown. Forced expression of the rat PEG-3 gene in both rodent and human cancer cells results in anchorage-independent growth and increased tumorigenicity (Su et al., 1997, 1999). One putative target for PEG-3 is the angiogenesis-inducing molecule, vascular endothelial growth factor (VEGF) (Su et al., 1999). Stable elevated expression of PEG-3 in E11 cells results in increased VEGF RNA transcription, steady state mRNA and secreted proteins. Furthermore, in cells expressing PEG-3, the VEGF-luciferase reporter construct exhibits increased activity. Furthermore, the functional role of PEG-3 in regulating VEGF expression is attributed to the inhibition of PEG-3 expression in E11-NMT cells using a stable antisense PEG-3 expression vector, resulting in a decrease in VEGF mRNA and secreted proteins. Proven. The need for PEG-3 protein in the induction of VEGF expression was demonstrated by co-treatment of PEG-3 transfected cells with the protein synthesis inhibitor cycloheximide (Su et al., 1999). In this experiment, the transfected PEG-3 gene was expressed as PEG-3 mRNA, but VEGF mRNA was only present in cells that were not exposed to cycloheximide. Although it is currently unknown whether PEG-3 binds directly to the VEGF promoter or whether activation of VEGF transcription is caused by additional molecules, these studies indicate that PEG-3 expression, induction of angiogenesis, and oncogenic status expression were not observed. Suggest an association between facilitation.
[0143]
Further studies are needed to identify and characterize the repertoire of downstream genes that are modulated as a result of PEG-3 expression and determine their role in promoting cancer aggression and angiogenesis. These studies are important and offer the possibility to define genetic elements that are important determinants of the cancer phenotype. With this information, it would be possible to identify potential targets and to define appropriate reagents, such as antisense or small molecule antagonists, to inhibit or prevent cancer development and progression.
[0144]
Materials and methods
Cell culture
E11 is a single cell clone of Sprague-Dawley secondary RE cells transformed with H5ts125 (Fisher et al., 1978). E11-NMT is a subclone of E11 cells from nude mouse tumors induced in the E11 cell line (Babiss et al., 1985). R12 is an E11 clone transformed with the Ha-ras oncogene (Duigou et al., 1989). F1 and F2 are flat somatic, suppressed somatic hybrids formed between E11-NMT and CREF cells (Duigou et al., 1990). R1 and R2 are progressive somatic hybrids with circular morphology created by fusing E11-NMT with CREF cells (Duigou et al., 1990). CREF is a specific immortal, non-transformed and non-tumorigenic clone of Fischer rat embryo fibroblasts (Fisher et al., 1982). All cultures were grown in Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) supplemented with 5% FBS (DMEM-5) at 37 ° C. in humidified 5% CO 2.₂At 95% air in an incubator.
[0145]
Northern and Western blotting assays
Total cellular RNA was isolated by the guanidinium / phenol extraction method and Northern blotting was performed as described (Su et al., 1994, 1997). 15 μg of RNA is denatured and electrophoresed in a 1.2% agarose gel supplemented with 3% formaldehyde, transferred to a nylon membrane, and subsequently described as previously (Su et al., 1994, 1997).³²Hybridization was performed using a P-labeled cDNA probe. After hybridization, the filters were washed and exposed to autoradiography. CJun (AP1), PEA3, PEG-3 and actin proteins were detected by Western blot analysis (Su et al., 1995). Five million cells were plated on 100-mm plates and incubated for 24 hours at 37 ° C. The medium (DMEM-5) is removed and the cells are washed three times with cold PBS and then placed in RIPC buffer (0.5 M NaCl, 0.5% NP40, 20 mM Tris-HCI, pH 8, 1 mM PMSF). Dissolved. Protein levels were measured using an ECL kit (Amersham) and the respective antibodies (Santa Cruz). Cell lysates were also analyzed using a rabbit anti-PEG-3 polyclonal antibody against the C-terminal peptide.
[0146]
PEG-3 Promoter isolation and analysis
Based on the 5 'sequence of the PEG-3 cDNA, two nested primers with the sequences GATCTAGGGTGTTGTGAGAGGATCGGAG (SEQ ID NO: 2) and TCGGTTTGCCAAAAGCGATCGTGGGG (SEQ ID NO: 3) were used with the Genome Walker kit (Genome Walkerte kit). A genomic sequence containing the putative promoter of PEG-3 was obtained. Using this technique, three DNA fragments of 2.0-, 1.6- and 1.0-kb each having identical and overlapping nucleotide sequences were obtained. To analyze promoter activity, a 2.0-kb PEG-3 fragment (designated FL-PEG-Prom) was cloned into the pGL3-basic vector (Promega). The 5 'deletion mutation of FL-PEG-Prom was created using the Erase-A-Base system (Promega) by exonuclease III digestion. FL-PEG-Prom 3 'deletion mutations were made by digestion with BstEll / Xhol, Sacll / Xhol and Ndel / Xhol, respectively. BstEll, Sacll and Ndel are 20 single cut restriction endonucleases that recognize the DNA sequence of FL-PEG-Prom and the Xhol restriction site is located near the 3 'end of FL-PEG-Prom in the MCS of the pGL3 vector. . The internal deletion was performed by digesting FL-PEG-Prom with Ndel / Sacll, Ndel / BstEll, StuI / BstEll and BstXl, respectively. Mutations in the AP1 binding site, the PEA3 binding site, and the TATA box were performed using site-directed mutagenesis using the Altered Sites 11 In Vitro Mutagenesis System (Promega). Produced. The PEG-Prom deletion mutant was cloned into the pGL3-basic luciferase reporter vector (Promega). Cells were evaluated at 2 x 10 to assess the activity of various PEG-Prom-luciferase constructs.⁵Approximately 24 hours after plating on a / 35-mm tissue culture plate, 5 μg of various PEG-Prom-luciferase constructs + 1 μg of SV40-β-gal vector (Promega) were mixed with 10 μl of lipofectamine reagent (Gibco) in 200 μl of serum-free medium. And transfected. After 20 minutes at room temperature, 800 μl of serum-free medium was added to a final volume of 1 ml. The transfection mixture was removed after 14 hours and the cells were washed three times with serum-free medium and incubated at 37 ° C. for an additional 48 hours in complete growth medium. Cells were harvested and lysed to produce an extract (Gopalkrishnan et al., 1999) and used for β-gal and luciferase reporter assays. Luminometric measurements of luciferase and β-gal activity were performed using commercial kits (Promega and Tropix, respectively). For the luciferase assay, 10 μl of cell lysate was mixed with 40 μl of luciferase assay substrate (Promega). For the β-gal assay, 10 μl of cell lysate was mixed with 100 μl of diluted Galecton-Plus and 150 μl of enhancer (Tropix). Promoter analysis data was collected at least three times using triplicate samples for each experimental point, and the data was normalized using β-gal data.
[0147]
E11 and E11-NMT mRNA Primer extension
A primer having a sequence 5 'GGCAAAGGGATGCGGAGTCGCGCGGGTCTCCGCATG 3' (SEQ ID NO: 4) complementary to the 5 'UTR sequence of PEG-3 cDNA was prepared using poly A from E11 or E11-NMT cells.⁺ Annealed with 4 μg of RNA and used as a template for primer extension by reverse transcriptase. Briefly, 20 pmol of dephosphorylated oligo DNA was converted to γ-³²End-labeled with PATP (Amersham) and T4 polynucleotide kinase. Labeled oligonucleotides (5 X 10⁵ cpm) with poly A⁺ H was incubated with 4 μg of RNA and the precipitate was treated with DEPC.₂Resuspended in 0. The reverse transcription reaction was performed with 200 u / μl of Superscript Reverse Transcriptase II (Gibco), 50 mM Tris-HCl (pH 8.3), 40 mM KCl, 6 mM MgCl.₂, 1 mM DTT, 1 mM dNTP, and 0.1 mg / ml BSA. The mixture was incubated at 42 ° C. for 1 hour, and then the reaction was stopped by adding 1 ml of 0.5 M EDTA (pH 8). After treatment with RNase without DNase, the reaction mixture was loaded on a 5% urea polyacrylamide sequencing gel in parallel with a DNA sequencing reaction using the same primers and template.
[0148]
Electrophoretic mobility shift assay ( EMSA )
The nuclear extract was used for 2-5 X 10⁸Were prepared as described by Diginam et al. (1983). The sequence of the probe was as follows: wild-type AP1, 5'CGCAGATTGACTCAGTTCGC3 '(SEQ ID NO: 5) / 5'GC GTCTAACTGAGTCAAGCG3 '(SEQ ID NO: 6); mutant AP1, 5'CGCAGATAAAACTACGTTCGC3 '(SEQ ID NO: 7) / 5'GCGTCTTATTTGATGCAAGCG3 '(SEQ ID NO: 8); wild-type PEA3, 5'GTGTTTGTTTTCCTCTCTCCA3 '(SEQ ID NO: 9) / 5' CACAACAAAAAGGAGAGAGGT3 '(SEQ ID NO: 10); and mutant PEA3', 5'GTGTTTGTTCCCATCTCTCCA3 '(SEQ ID NO: 11) / 5' CACAACAAGGGTAGAGAGGT3 '(SEQ ID NO: 12). A double-stranded oligonucleotide,³²Labeled with P-ATP (Amersham) and T4 polynucleotide kinase. The labeled probe was then incubated with the nuclear extract for 30 minutes at room temperature. The reaction mixture is³²P-labeled deoxyoligonucleotide (> 5000 cpm), 2 μg of poly (dl-dc) and 10 μg of nuclear protein extract, and 10 mM HEPES (pH 7.5), 50 mM KCl, 5 mM MgCl₂, 0.5 mM EDTA, 1 mM DTT and 12.5% glycerol. After incubation for 30 minutes at room temperature, the reaction mixture was electrophoresed on 0.5% TBE on a 5% polyacrylamide gel (160 V, 3 hours). The gel was dried and subjected to autoradiography. The nuclear extract also³²Incubation with 10- or 100-fold molar excess of cold competitor oligonucleotide or cJun (AP1), PEA3 or actin antibody (1 or 5 μg) with P-labeled probe.
[0149]
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[Brief description of the drawings]
FIG. 1A-1C: Anchorage-independent growth and PEG-3 mRNA and protein expression in normal, adenovirus transform and somatic cell hybrid rodent cells. (FIG. 1A) Anchorage-independent proliferation assay is 5 × 10³Or 1 X 10⁴The medium containing 0.4% agar containing the cells was spread on the surface of the basal layer of the medium containing 0.8% agar and measured. Two weeks later, colonies ≧ 0.1 mm were counted using an inverted microscope. The results are the average of three independent experiments using triplicate samples and were expressed as experimental values ± SD. (FIG. 1B) PEG-3 mRNA levels were measured by electrophoresis on a 1.2% agarose gel containing 15 μg of total cellular RNA. Transfer the RNA to a nylon membrane³²Hybridize with a P-labeled PEG-3 cDNA probe, strip the blot and then³²Rehybridized with the P-labeled GAPDH probe. (FIG. 1c) PEG-3 and actin protein levels were measured by Western blot. 10 μg of protein from each cell type was loaded on a 10% denaturing polyamide gel and electrophoresed for 3 hours, then transferred to a nitrocellulose membrane. PEG-3 was detected with an anti-PEG-3 antibody and actin protein was detected with an anti-actin antibody. Lane symbol:1 E11;2 E11-NMT;3 E11-Ha-ras R12;4 E11-NMT X CREF R1;5 E11-NMT X CREF R2;6 E11-NMT X CREF F1;7 E11-NMT X CREF F2;8 CREF.
FIG. 2 shows the sequence of the 2.0-kb PEG-3 promoter. (SEQ ID NO: 1) This fragment was identified by 5 'DNA walking as described in Materials and Methods. The locations of the PEA-3 and AP1 elements and the TATA box are indicated.
FIG. 3 shows the determination of the transcription start site of the PEG-3 promoter. Primers complementary to the 5 'UTR region of PEG-3 mRNA (see Materials and Methods section below) were prepared using polyA from E11-NMT or E11 cells.⁺ Annealed with 4 μg of RNA and used as template for primer extension assay. The conditions used for reverse transfer were as described in Materials and Methods. DNA sequencing reactions using the same primers and using the PEG-3 promoter as a template were electrophoresed on the same gel in parallel with the primer extension reactions.
FIG. 4 shows full-length PEG-3 promoter-luciferase activity in normal, transformed adenovirus and somatic cell hybrid rodent cells. Various cell types were co-transformed with 5 μg of FL PEG-Prom and 1 μg of pSV-β-galactosidase plasmid, and after 48 hours luciferase activity was measured as described in Materials and Methods. The results were normalized by β-galactosidase activity and are shown as the mean ± SD of three independent experiments. The results were expressed as a multiple activity in which E11 was one-fold active compared to E11.
FIGS. 5A-5B show mapping of regions of the PEG-3 promoter required for basal and increased PEG-Prom expression in E11 and E11-NMT cells. (FIG. 5A) Schematic representation of a deletion mutant of PEG-Pro. Mutants were constructed as described in Materials and Methods. (FIG. 5B) Fold activity of FL-PEG-Prom (lane 1) and various PEG-Prom deletion mutants (lanes 2-11) in E11 and E11-NMT cells. Fold activity contrasts FL-PEG-Prom and various PEG-Prom deletion mutants with a specific PEG-Prom deletion construct containing the TATA box and API element (deleted at position -40). And compare. The latter deletion construct arbitrarily gives a value of 1. The promoter-luciferase assay was performed as described in Materials and Methods.
FIGS. 6A-6B are mutational analysis of the PEA3 and AP1 sites and the TATA box in PEG-Prom. (FIG. 6A) Schematic representation of specific mutants in PEG-Prom analyzed for activity in E11 and E11-NMT cells. Point mutations were performed using site-directed mutagenesis as described in Materials and Methods. (FIG. 6B) Fold activity of various PEG-Prom mutants in E11 and E11-NMT cells. Fold activity indicates that the PEG-Prom mutant (deleted at position -118) and mutants with point or deletion mutations that further affect the PEA3, AP1 site and / or TATA box region Compared to a specific PEG-Prom deletion construct containing the type TATA box and the AP1 element (deleted at position -40). The latter deletion construct arbitrarily gives a value of 1. The promoter-luciferase assay was performed as described in Materials and Methods.
FIGS. 7A-7B are analysis of nuclear protein binding to AP1 and PEA3 elements by EMSA. AP1 (FIG. 7A) and (FIG. 7B) PEA3 nucleoprotein complex in E11 and E11-NMT cells were identified using EMSA. Nuclear extracts were prepared from two cell types and γ³²Using P-ATP and T4 DNA kinase³²Incubated with P1 and PEA3 probes labeled with P. The reaction mixture was electrophoresed in a 5% native polyacrylamide gel as described in Materials and Methods. In E11 and E11-NMT cells, arrow 1 indicates supershifted AP1 (FIG. 7A) or PEA3 (FIG. 7B) DNA-protein-antibody complex, and arrow 2 indicates AP1 (FIG. 7A) or PEA3 (FIG. 7B) DNA. 3 shows a protein complex. All samples contain nuclear extracts from either E11 or E11-NMT cells. Mut-oligo samples contain mutant AP1 (FIG. 7A) or PEA3 (FIG. 7B) oligonucleotides. The WT-oligo samples contain wild-type AP1 (FIG. 7A) or PEA3 (FIG. 7B) oligonucleotides. Competitor means the presence of a 10X (10-fold) or 100X (100-fold) molar excess of unlabeled competitor oligonucleotide. The cJun-Ab (FIG. 7A) and PEA3-Ab (FIG. 7B) samples contain 1 or 5 μg of each antibody. Actin-Ab contains 5 μg of anti-actin antibody.
FIG. 8 shows the effect of ectopic expression of cJun (AP1) and PEA3 alone and in combination on FL-PEG-Prom activity in E11 cells. Various amounts (50-500 ng) of wild-type cJun (wtcjun), mutant TAM67 cJun (mutcjun), pcDNA3.1 (control vector), PEA3 (pEA3), pRC / RSV (control vector), PEA3 and wild-type cJun The (pEA3 + wtcjun) combination or the control vector (pRC / RSV + pCDNA3.1) combination was transfected into E11 cells with 5 μg pGL3 / PEG-Prom and 1 μg pSV-β-galactosidase vector. The results represent the mean fold activity for triplicate samples of two independent experiments, compared to E11 cells transfected with the vector, as experimental values ± SD.

Claims

配列番号１の位置−２７０のグアノシン（Ｇ）で始まりかつ位置＋１９４のシトシン（Ｃ）で終わるヌクレオチド配列を含有するＰＥＧ−３プロモーターを含んでなる、単離した核酸。An isolated nucleic acid comprising a PEG-3 promoter containing a nucleotide sequence beginning with a guanosine (G) at position -270 and ending with a cytosine (C) at position +194 of SEQ ID NO: 1.

長さが少なくとも１５個のヌクレオチドである請求項１に記載のヌクレオチド配列の断片を含んでなる、単離した核酸。2. An isolated nucleic acid comprising a fragment of the nucleotide sequence of claim 1 which is at least 15 nucleotides in length.

請求項２に記載の核酸であって、核酸断片が
（ｉ）配列番号１の位置−１０５のチミジン（Ｔ）で始まりかつ位置−１００のチミジン（Ｔ）で終わるヌクレオチド配列からなるＰＥＡ３タンパク質結合配列、
（ｉｉ）配列番号１の位置−２９のチミジン（Ｔ）で始まりかつ位置−２４のアデノシン（Ｔ）で終わるヌクレオチド配列からなるＴＡＴＡ配列、または
（ｉｉｉ）配列番号１に示したヌクレオチド配列の位置＋６のチミジン（Ｔ）で始まりかつ位置＋１２のアデノシン（Ｔ）で終わるヌクレオチド配列からなるＡＰ１タンパク質結合配列を含んでなる前記核酸。3. The PEA3 protein binding sequence of claim 2, wherein the nucleic acid fragment comprises (i) a nucleotide sequence beginning with a thymidine (T) at position -105 and ending with a thymidine (T) at position -100 in SEQ ID NO: 1. ,
(Ii) a TATA sequence consisting of a nucleotide sequence starting with thymidine (T) at position -29 and ending with adenosine (T) at position -24 of SEQ ID NO: 1, or (iii) position +6 of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 Said nucleic acid comprising an AP1 protein binding sequence consisting of a nucleotide sequence beginning with thymidine (T) and ending with adenosine (T) at position +12.

核酸が請求項３に記載のヌクレオチド配列の少なくとも２つを含んでなる、請求項３に記載の核酸。4. The nucleic acid of claim 3, wherein the nucleic acid comprises at least two of the nucleotide sequences of claim 3.

核酸が請求項３に記載の３つのヌクレオチド配列を含んでなる、請求項３に記載の核酸。4. A nucleic acid according to claim 3, wherein the nucleic acid comprises the three nucleotide sequences according to claim 3.

断片がプロモーター活性を有する、請求項２に記載の核酸。3. The nucleic acid according to claim 2, wherein the fragment has promoter activity.

断片は目的の遺伝子と機能的に連結されている、請求項２に記載の核酸。3. The nucleic acid according to claim 2, wherein the fragment is operably linked to the gene of interest.

目的の遺伝子がレポーター遺伝子である、請求項７に記載の核酸。The nucleic acid according to claim 7, wherein the gene of interest is a reporter gene.

レポーター遺伝子がβ−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコールトランスフェラーゼまたはアルカリホスファターゼをコードする、請求項８に記載の核酸。9. The nucleic acid according to claim 8, wherein the reporter gene encodes β-galactosidase, luciferase, chloramphenicol transferase or alkaline phosphatase.

目的の遺伝子が癌抑制遺伝子、発現すると細胞のアポトーシスを引き起こす遺伝子、または細胞傷害性遺伝子である、請求項７に記載の核酸。The nucleic acid according to claim 7, wherein the gene of interest is a tumor suppressor gene, a gene that causes cell apoptosis when expressed, or a cytotoxic gene.

請求項１〜１０のいずれか１つの核酸を含んでなるベクター。A vector comprising the nucleic acid according to any one of claims 1 to 10.

請求項１１に記載のベクターを含んでなる宿主細胞。A host cell comprising the vector of claim 11.

宿主細胞が腫瘍細胞である、請求項１２に記載の宿主細胞。13. The host cell according to claim 12, wherein the host cell is a tumor cell.

腫瘍細胞が黒色腫細胞、神経芽細胞腫細胞、子宮頚癌細胞、乳癌細胞、肺癌細胞、前立腺癌細胞、大腸癌細胞、またはグリア芽細胞腫多型細胞である、請求項１３に記載の宿主細胞。14. The host of claim 13, wherein the tumor cells are melanoma cells, neuroblastoma cells, cervical cancer cells, breast cancer cells, lung cancer cells, prostate cancer cells, colon cancer cells, or glioblastoma polymorphism cells. cell.

細胞内でＰＥＧ−３プロモーター活性をモジュレートする薬剤を同定する方法であって：
（ａ）レポーター遺伝子と機能的に連結されたＰＥＧ−３プロモーターを含んでなる核酸を含有する細胞を、薬剤と接触させること；
（ｂ）細胞内のレポーター遺伝子発現のレベルを測定すること；および
（ｃ）工程（ｂ）で測定した発現レベルを、薬剤の不在下で同一細胞で測定したレポーター遺伝子発現レベルと比較することからなり、薬剤の存在下で測定されるより低い発現レベルはＰＥＧ−３プロモーター活性を抑制する薬剤を示しかつ薬剤の存在下で測定されるより高いレベルはＰＥＧ−３プロモーター活性を増大する薬剤を示し、それによって細胞内でＰＥＧ−３プロモーター活性をモジュレートする薬剤を同定する方法。A method for identifying an agent that modulates PEG-3 promoter activity in a cell, comprising:
(A) contacting a cell containing a nucleic acid comprising a PEG-3 promoter operably linked to a reporter gene with an agent;
(B) measuring the level of reporter gene expression in the cell; and (c) comparing the expression level measured in step (b) with the reporter gene expression level measured in the same cell in the absence of the drug. Thus, a lower expression level measured in the presence of the drug indicates an agent that suppresses PEG-3 promoter activity and a higher level measured in the presence of the drug indicates an agent that increases PEG-3 promoter activity. A method for identifying an agent that modulates PEG-3 promoter activity in a cell.

細胞が、黒色腫細胞、神経芽細胞腫細胞、子宮頚癌細胞、乳癌細胞、肺癌細胞、前立腺癌細胞、大腸癌細胞、またはグリア芽細胞腫多型細胞である、請求項１５に記載の方法。16. The method of claim 15, wherein the cells are melanoma cells, neuroblastoma cells, cervical cancer cells, breast cancer cells, lung cancer cells, prostate cancer cells, colon cancer cells, or glioblastoma polymorphism cells. .

薬剤が約７キロダルトン以下の分子量を有する分子を含んでなる、請求項１５に記載の方法。16. The method of claim 15, wherein the agent comprises a molecule having a molecular weight of about 7 kilodaltons or less.

薬剤が配列番号１に示した配列の少なくとも一部分と相補的なヌクレオチド配列を含んでなるアンチセンス核酸でありかつ長さが少なくとも１５ヌクレオチドである、請求項１５に記載の方法。16. The method of claim 15, wherein the agent is an antisense nucleic acid comprising a nucleotide sequence complementary to at least a portion of the sequence set forth in SEQ ID NO: 1 and is at least 15 nucleotides in length.

薬剤がＤＮＡ分子、炭水化物、糖タンパク質、転写因子タンパク質または二本鎖ＲＮＡ分子である、請求項１５に記載の方法。16. The method of claim 15, wherein the agent is a DNA molecule, carbohydrate, glycoprotein, transcription factor protein or double-stranded RNA molecule.

薬剤が、０．１キロダルトンから１０キロダルトンまでの分子量を有する合成ヌクレオチド配列、ペプチド模倣物、または有機分子である、請求項１５に記載の方法。16. The method of claim 15, wherein the agent is a synthetic nucleotide sequence, peptidomimetic, or organic molecule having a molecular weight of from 0.1 kilodalton to 10 kilodalton.

レポーター遺伝子がβ−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコールトランスフェラーゼまたはアルカリホスファターゼをコードする、請求項１５に記載の方法。The method according to claim 15, wherein the reporter gene encodes β-galactosidase, luciferase, chloramphenicol transferase or alkaline phosphatase.

測定されるＰＥＧ−３プロモーター活性の発現が２．５〜３．５倍以上の増加または減少と同等かまたは大きい、請求項１５に記載の方法。16. The method of claim 15, wherein the measured expression of PEG-3 promoter activity is equal to or greater than a 2.5-3.5 fold increase or decrease.

ＰＥＧ−３プロモーターが請求項１、２、３、４または５に記載の核酸である、請求項１５に記載の方法。The method according to claim 15, wherein the PEG-3 promoter is the nucleic acid according to claim 1, 2, 3, 4 or 5.

被験者の癌を治療する方法であって、目的の遺伝子と機能的に連結されたＰＥＧ−３プロモーターを含んでなる核酸を投与することからなり、目的の遺伝子が被験者の癌細胞に選択的に発現されかつその発現がＰＥＧ−３の発現を調節して癌細胞の増殖を抑制または死滅してそれによって被験者の癌を治療する前記方法。A method for treating cancer in a subject, comprising administering a nucleic acid comprising a PEG-3 promoter operably linked to the gene of interest, wherein the gene of interest is selectively expressed in cancer cells of the subject. The method wherein the expression is regulated and the expression modulates PEG-3 expression to suppress or kill cancer cell growth, thereby treating cancer in a subject.

核酸が本質的に、
（ｉ）配列番号１の位置−１０５のチミジン（Ｔ）で始まりかつ位置−１００のチミジン（Ｔ）で終わるヌクレオチド配列からなるＰＥＡ３タンパク質結合配列、
（ｉｉ）配列番号１の位置−２９のチミジン（Ｔ）で始まりかつ位置−２４のアデノシン（Ｔ）で終わるヌクレオチド配列からなるＴＡＴＡ配列、および
（ｉｉｉ）配列番号１に示したヌクレオチド配列の位置＋６のチミジン（Ｔ）で始まりかつ位置＋１２のアデノシン（Ｔ）で終わるヌクレオチド配列からなるＡＰ１タンパク質結合配列からなる、請求項２４に記載の方法。The nucleic acid is essentially
(I) a PEA3 protein binding sequence consisting of a nucleotide sequence beginning with a thymidine (T) at position -105 and ending with a thymidine (T) at position -100 in SEQ ID NO: 1,
(Ii) a TATA sequence consisting of a nucleotide sequence starting with thymidine (T) at position -29 and ending with adenosine (T) at position -24 of SEQ ID NO: 1, and (iii) position +6 of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 25. The method of claim 24, comprising an AP1 protein binding sequence consisting of a nucleotide sequence beginning with a thymidine (T) and ending with an adenosine (T) at position +12.

核酸が少なくとも２５個のヌクレオチド長の配列番号１の少なくとも一部分と相補的な配列を有する、請求項２４に記載の方法。25. The method of claim 24, wherein the nucleic acid has a sequence that is complementary to at least a portion of SEQ ID NO: 1 that is at least 25 nucleotides in length.

癌が黒色腫、神経芽細胞腫、星状細胞腫、グリア芽細胞腫多型、子宮頚癌、乳癌、大腸癌、前立腺癌、骨肉腫または軟骨肉腫である、請求項２４に記載の方法。25. The method of claim 24, wherein the cancer is a melanoma, neuroblastoma, astrocytoma, glioblastoma polymorphism, cervical cancer, breast cancer, colorectal cancer, prostate cancer, osteosarcoma or chondrosarcoma.

投与が注射、経口投与、局所投与、アデノウイルス感染、リポソームを介する導入、被験者の細胞への局所応用、またはマイクロインジェクションを経由して実施される、請求項２４に記載の方法。25. The method of claim 24, wherein the administration is performed via injection, oral administration, topical administration, adenovirus infection, transduction via liposomes, topical application to cells of the subject, or microinjection.

被験者が哺乳類である、請求項２４に記載の方法。25. The method of claim 24, wherein the subject is a mammal.

哺乳類がヒトである、請求項２９に記載の方法。30. The method of claim 29, wherein the mammal is a human.

目的の遺伝子が、発現すると細胞のアポトーシスを引き起こす遺伝子である、請求項２４に記載の方法。The method according to claim 24, wherein the gene of interest is a gene that, when expressed, causes apoptosis of the cell.

遺伝子がＭｄａ−７遺伝子またはｐ５３遺伝子を含んでなる、請求項２４に記載の方法。The method according to claim 24, wherein the gene comprises the Mda-7 gene or the p53 gene.

目的の遺伝子が腫瘍抑制遺伝子である、請求項２４に記載の方法。The method according to claim 24, wherein the gene of interest is a tumor suppressor gene.

抑制遺伝子がｍｄａ−７である、請求項３３に記載の方法。34. The method according to claim 33, wherein the suppressor gene is mda-7.

目的の遺伝子が細胞傷害性遺伝子である、請求項２４に記載の方法。The method according to claim 24, wherein the gene of interest is a cytotoxic gene.

細胞傷害性遺伝子が細胞死を引き起こす、請求項３５に記載の方法。36. The method of claim 35, wherein the cytotoxic gene causes cell death.

細胞傷害性遺伝子が、ＨＳＶ−ＴＫ、ｐ２１、ｐ２７、およびｐ１０からなる群から選択される、請求項３６に記載の方法。37. The method of claim 36, wherein the cytotoxic gene is selected from the group consisting of HSV-TK, p21, p27, and p10.