JP2004512837A - Dna発現ベクター - Google Patents

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Abstract

本発明は、エキソン1を含むがイントロンAは含まない、ヒトサイトメガロウイルス主要前初期遺伝子由来の転写制御配列を含むDNAベクターに関する。ベクター、宿主細胞、そのような宿主細胞およびベクターを含む医薬およびワクチン組成物も含まれる。

Description

【0001】
発明の分野
本発明は、ヒトサイトメガロウイルス主要前初期遺伝子由来の転写制御配列を含むDNAベクター、そのようなベクターを含む宿主細胞、組換えポリペプチドの発現におけるそのようなベクターの使用、およびワクチンおよび医薬組成物および遺伝子治療におけるそのようなベクターの使用に関する。特に、本発明はヒトサイトメガロウイルス主要前初期遺伝子の最小プロモーター領域、およびエキソン1を含むがイントロンAは含まない5’非翻訳領域の断片を含むベクターを提供する。
【0002】
発明の背景
ヒトサイトメガロウイルス主要前初期遺伝子(以下、本明細書においてHCMV IE1と略称する)のプロモーターおよび上流エンハンサー領域を組換えタンパク質の発現を誘導するために使用することが知られている。例えば、欧州特許第EP0323997B号にはHCMV IE1遺伝子のプロモーター、上流エンハンサーおよび機能的に完全な5’非翻訳領域を組み込んだ発現ベクターが記載されており、これは第1イントロンを含むものである。そのようなコンストラクトにおいてHCMV IE1の5’UTRは異種遺伝子のコード領域に直接リンクしており、異種遺伝子の自然の5’UTRを置換する。全長5’UTRを含めることにより、最小HCMV IE1プロモーター単独によって観察されるものと比べて発現レベルが有意に上昇する。
【0003】
完全なHCMV IE1の5’UTRの存在下で観察される発現の促進は第1イントロン(以下、本明細書においてイントロンAまたはイントロン1と称する)を含めることに起因すると一般に考えられている。今回、本発明者らは驚くべきことに、エキソン1を含むが第1イントロンを含まない5’UTRの断片の使用の結果、HCMV IE1最小プロモーターのみによって達成される発現レベル以上に発現が促進されることを観察した。さらに、HCMV IE1の自然のイントロンAを異種イントロンと置換することによっても発現が促進される。イントロンAの不在下でのエキソン1の使用による発現の促進は、最小HCMVプロモーターおよび5’UTRの挙動についての従来の知識からは全く予想されないものであった。
【0004】
HCMV IE1遺伝子の自然の5’UTRは比較的大きい(1021塩基)。イントロンAの不在下でのエキソン1の使用により、組換えタンパク質の効率的な発現を維持しながら、プロモーター/5’UTRのサイズを最小化できる可能性がある。これは、DNAワクチン分野および複数の発現カセットを含むプラスミドベクターの分野において有用性を有するであろう。DNAワクチン分野では、DNAワクチンコンストラクトにおいて含まれる非コード配列の長さを最小化することが有利であり、複数の発現カセットを含むプラスミドベクターの分野では、これはプラスミド内の相同的な配列の組換えの可能性を最小限にするであろう。
【0005】
発明の説明
本発明は、第1の態様において、プロモーター、および実質的にエキソン1のすべてを含むが実質的にイントロンAのすべてを含まない、HCMV IE1遺伝子の5’UTRの断片を含むDNA配列を含有するベクターを提供する。
【0006】
本発明は、HCMV IE1のエキソン1を含むがイントロンAを含まない5’非翻訳領域の断片が、HCMV IE1最小プロモーターなどの基礎的プロモーターからの発現レベルを上昇させることが出来るという観察に基づく。
【0007】
プロモーターは一般にRNAポリメラーゼによる転写の開始の指令能を有するDNAの領域と定義することができる。本発明に用いるプロモーターは、本質的にいかなるRNAポリメラーゼII依存性プロモーターであってもよい。
【0008】
好適な態様において、プロモーターはHCMV IE1最小プロモーターである。HCMV IE1最小プロモーターは、自然の転写開始部位からの転写を引き起こす、プロモーターとして機能することが出来るHCMV IE1プロモーター領域の断片と定義される。例えば、ヌクレオチド−116から+1までを含むHCMV IE1遺伝子断片は、プロモーター活性を示す。ここでヌクレオチド+1はHCMV IE1転写開始部位である。
【0009】
HCMV IE1の5’非翻訳領域の断片は、HCMV5’非翻訳配列が、プロモーターに付随する転写開始部位において開始する転写産物に含まれるように、プロモーターの3’側(即ち下流)に隣接して位置するのが最も好ましい。HCMVのTowne株からのHCMV IE1エキソン1のヌクレオチド配列を添付の図5に示す。しかし、「HCMV IE1エキソン1」の語は、この正確な配列に限定されるものではない。この語は、AD169などのHCMVの他の株からのエキソン1配列を含む少数の変異体も含む。AD169からのエキソン1は、A Krigg. A. et al Virus research 2, 107−121 (1985)によって開示されている配列の514−634の間であり、塩基置換、挿入、付加および欠失を示す変異体配列も開示されている。当業者であればエキソン1の配列に、それに結合するプロモーターからのその発現促進能力に実質的に影響を及ぼすことなく少数の変異を作ることが出来ることを理解するであろう。実質的にエキソン1のすべてという語は、図5に示す完全なエキソン1を用いた場合に達成される増強の少なくとも80%まで発現を増強することができる配列を意味することが理解されよう。
【0010】
1つの態様においてベクターはさらに異種イントロン、即ち、HCMV IE1遺伝子のイントロンA以外のイントロンを、HCMV IE1のエキソン1の下流に隣接して含んでいてもよい。異種イントロンをHCMV IE1の5’UTRの自然のイントロンAと置換させてもよく、この場合、HCMV IE1エキソン2の非翻訳部分は該異種イントロンの下流に隣接して含まれる。異種イントロンは合成のものでもイントロンA以外の天然のイントロンでもよい。異種イントロンはHCMV IE1の5’非翻訳領域の断片と共に転写され、結果として得られる転写産物の5’UTR部分を形成する。イントロンAについて、実質的にすべてという語はコンストラクトにおいて50以下の連続する塩基、好ましくは25塩基未満、好ましくは10塩基未満が存在するか、最も好ましくは塩基がなく、および残りの配列が間違ったスプライシングを起こさず、不適切な翻訳開始を引き起こさないことを意味する。AD169のイントロンAは、前出のA Krigg. A. et al によって開示される配列の位置635−1461に位置する。
【0011】
後述の実施例において説明するように、異種イントロンを含めることにより、プロモーターとエキソン1のみを用いて達成されるものより発現レベルが上昇する。好ましくは異種イントロンは、ベクターにおいて存在する非コード配列の量を減らすために短い(好ましくは100塩基未満)ものがよい。好適な例は、87塩基長のヒトCD68遺伝子の第1イントロンであるが、その他の異種イントロンも同等の効果を持って用いられる。
【0012】
ベクターはさらに異種コード配列の挿入を可能にするために制限部位を含んでいてもよい。制限部位は、ベクター中に含まれていてもよいあらゆる異種イントロンを含む、HCMV IE1の5’非翻訳断片の下流に位置するのが好ましい。
【0013】
ベクターはプロモーターに加えて、エンハンサー要素などの1または複数のさらなる転写制御要素を含んでいてもよい。例えば、最小HCMV IE1プロモーターを含むベクターはさらにHCMV IE1エンハンサー要素を含んでいてもよい。エンハンサー要素は、最小HCMV IE1プロモーターの上流に隣接して位置するのが最も好ましい。
【0014】
好適な態様において、ベクターはプラスミドである。プラスミドベクターはさらに原核宿主細胞内での自律的複製を可能にするための複製開始点、および抗生物質耐性遺伝子などの選抜マーカーを含んでいてもよい。ベクターは転写終結のためのpol IIターミネーターおよび、プロモーターから転写されるmRNAの安定化および3’末端のプロセシングのためのポリ−アデニル化シグナルを含んでいてもよい。異種コード配列の挿入を容易にするために、HCMV IE1の5’UTR配列とポリ−アデニル化シグナルとの間に1または複数の制限部位を含むものにするのが好ましい。本発明によるプラスミドベクターは当業者に周知の、例えば、F. M. Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994)に記載されている標準的な組換え技術を用いて成分である配列要素から簡単に構築することが出来る。
【0015】
特に好適な態様において、ベクターは真核宿主細胞または真核生物体における組換えポリペプチドの発現に使用される発現ベクターである。この態様において、ベクターはさらに、HCMV IE1最小プロモーターおよび5’UTR配列に操作可能にリンクした組換えポリペプチドをコードするDNA配列を含んでいてもよい。「操作可能にリンクした」という語は、ポリペプチドをコードするDNA配列がプロモーターおよび5’UTRの下流に位置し、プロモーターに付随する転写開始部位における転写開始の結果、HCMV IE1の5’UTR断片(あらゆる異種イントロンを含む)および組換えポリペプチドをコードする配列を組み込んだmRNAの転写が起こるような並び方をいう。
【0016】
発現ベクターは転写終結のためのpol IIターミネーターおよび、プロモーターから転写されるmRNAの安定化および3’末端のプロセシングのためのポリ−アデニル化シグナルを含んでいてもよい。好適なポリアデニル化シグナルには、例えばウサギベータグロビンポリアデニル化シグナルまたはウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルなどの哺乳類のポリアデニル化シグナル、およびSV40後期ポリ(A)領域などのウイルス起源のポリアデニル化シグナルが含まれる。ベクターはさらに例えばネオマイシンホスホトランスフェラーゼマーカーなどの真核宿主細胞における選抜を可能にするための選抜マーカーを含んでいてもよい。発現ベクターは、1つのベクターから複数の組換えポリペプチドの発現を可能にするために、1または複数のさらなる発現カセットを含んでいてもよい。最も好ましくは発現ベクターはプラスミド発現ベクターである。
【0017】
組換えポリペプチドをコードするDNA配列は本質的に、その境界が開始コドンおよび終止コドンであるいかなるタンパク質−コード化DNA配列であってもよい。該タンパク質−コード化DNA配列はイントロンを含んでいてもよい。特に好適な態様において、組換えポリペプチドは抗原ポリペプチドまたは治療用タンパク質である。
【0018】
好適な態様において抗原はヒト病原体に対して免疫応答を誘発することが出来、該抗原または抗原性組成物には、HIV−1由来のもの(例えば、tat、nef、gp120またはgp160、gp40、p24、gag、env、vif、vpr、vpu、revなど)、gH、gL、gM、gB、gC、gK、gEまたはgDあるいはその誘導体などのヒトヘルペスウイルス由来のもの、HSV1またはHSV2に由来するICP27、ICP47、ICP4、ICP36などの前初期タンパク質、サイトメガロウイルス、特にヒト由来のもの(例えば、gBまたはその誘導体など)、エプスタイン・バーウイルス由来のもの(例えばgp350またはその誘導体など)、バリセラゾスターウイスル(Varicella Zoster Virus)由来のもの(例えば、gpI、II、IIIおよびIE63)、または肝炎Bウイルス由来のもの(例えば、肝炎B表面抗原または肝炎core抗原またはpol)、肝炎Cウイルス抗原、および肝炎Eウイルス抗原などの肝炎ウイルスに由来するもの、あるいはパラミクソウイルスなどのその他のウイルス病原体に由来するものがある:呼吸器合胞体ウイルス由来のもの(例えばFおよびGタンパク質またはその誘導体)またはパラインフルエンザウイルス、麻疹ウイルス、おたふく風邪ウイルス、ヒトパピローマウイルス由来のもの(例えば、HPV6、11、16、18、例えば、L1、L2、E1、E2、E3、E4、E5、E6、E7など)、フラビウイルス(例えば黄熱病ウイルス、デング熱ウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルス、日本脳炎ウイルス)またはインフルエンザウイルス細胞などに由来の抗原(例えば、HA、NP、NAまたはMタンパク質またはその組み合わせ)、あるいは、以下の細菌病原体由来の抗原などがある。例えば、Neisseria spp、これは、N. gonorrhea および N. meningitidis,( 例えば、トランスフェリン−結合タンパク質、ラクトフェリン結合タンパク質、PilC、付着因子)を含む; S. pyogenes (例えば、Mタンパク質またはその断片)、C5Aプロテアーゼ、S. agalactiaeS. mutansH. ducreyiMoraxella spp 、これは、 catarrhalisを含み、Branhamella catarrhalisとしても知られている (例えば、高分子量および低分子量付着因子および侵入因子(invasins)); Bordetella spp, これは、B. pertussis (例えば、ペルタクチン(pertactin)、百日咳毒素またはその誘導体、繊維状血球凝集素、アデニル酸シクラーゼ、海馬采など)、B. parapertussis および B. bronchisepticaを含む; Mycobacterium spp.、これは、M. tuberculosis (例えば、ESAT6、抗原85A、−Bまたは−C、MPT44、MPT59、MPT45、HSP10、HSP65、HSP70、HSP75、HSP90、PPD19kDa[Rv3763]、PPD38kDa[Rv0934]など )、 M. bovisM. lepraeM. aviumM. paratuberculosis M. smegmatisを含む; L. pneumophila を含むLegionella sppEscherichia spp、これは、enterotoxic E. coli (例えば、コロニー形成因子、熱不安定性毒素またはその誘導体、熱安定性毒素またはその誘導体など)、腸管出血性E. coli、腸管病原性E. coli (例えば、シガ毒素様毒素またはその誘導体など)を含む; Vibrio spp、これは、V. cholera (例えば、コレラ毒素またはその誘導体)を含む; Shigella spp、これは、S. sonneiS. dysenteriaeS. flexneriiを含む; Yersinia spp、これは、Y. enterocolitica (例えば、Yopタンパク質など)、Y. pestisY. pseudotuberculosisを含む; Campylobacter spp、これは、C. jejuni (例えば、毒素、付着因子および侵入因子など)およびC. coliを含む; Salmonella spp、これは、S. typhiS. paratyphi S. choleraesuisS. enteritidisを含む; L. monocytogenesを含むListeria spp.; Helicobacter spp、これは、H. pylori (例えば、ウレアーゼ、カタラーゼ、空胞化毒素など)を含む; P. aeruginosaを含む Pseudomonas sppStaphylococcus spp. これは、S. aureus S. epidermidisを含む; Enterococcus spp. これは、E. faecalis E. faeciumを含む; Clostridium spp. これは、C. tetani (例えば、破傷風毒素およびその誘導体など)、C. botulinum (例えば、ボツリヌス毒素およびその誘導体など)、C. difficile (例えば、クロストリジウム毒素AまたはBおよびその誘導体など)を含む; Bacillus spp. これは、B. anthracis (例えば、ボツリヌス毒素およびその誘導体など)を含む; Corynebacterium spp. これは、C. diphtheriae (例えば、ジフテリア毒素およびその誘導体など)を含む; Borrelia spp. これは、B. burgdorferi (例えば、OspA、OspC、DbpA、DbpBなど)、 B. garinii (例えば、OspA、OspC、DbpA、DbpBなど)、 B. afzelii (例えば、OspA、OspC、DbpA、DbpBなど)、 B. andersonii (例えば、OspA、OspC、DbpA、DbpBなど)、 B. hermsiiを含む; E. equiを含む Ehrlichia spp.および、ヒト顆粒球エールリッヒ病(Human Granulocytic Ehrlichiosis)の薬剤; R. rickettsiiを含む Rickettsia sppChlamydia spp. これは、C. trachomatis (例えば、MOMP、ヘパリン結合タンパク質など)、 C. pneumoniae (例えば、MOMP、ヘパリン結合タンパク質など)、C. psittaciを含む; L. interrogansを含むLeptospira spp. Treponema spp. これは、T. pallidum (例えば、レア外膜タンパク質など)、T. denticolaT. hyodysenteriaeを含む; あるいは以下の寄生虫由来のものがある。例えば、P. falciparum を含むPlasmodium spp.T. gondii (例えば、SAG2、SAG3、Tg34など)を含むToxoplasma spp.E. histolyticaを含む Entamoeba spp.B. microtiを含む Babesia spp.,; T. cruzi を含むTrypanosoma spp. G. lamblia を含むGiardia sppL. major を含むLeshmania spp.P. cariniiを含む Pneumocystis spp.; T. vaginalisを含む Trichomonas spp.S. mansoni を含むSchisostoma spp.あるいは以下の酵母由来のものがある。C. albicansを含む Candida spp. C. neoformansを含む Cryptococcus spp.
【0019】
その他のM. tuberculosis に特異的な好適な抗原には、例えば、Rv2557、Rv2558、RPFs:Rv0837c、Rv1884c、Rv2389c、Rv2450、Rv1009、aceA(Rv0467)、PstS1、(Rv0932)、SodA(Rv3846)、Rv2031c16kDal.、Tb Ra12、Tb H9、Tb Ra35、Tb38−1、Erd14、DPV、MTI、MSL、mTTC2およびhTCC1が挙げられる(WO99/51748号)。M. tuberculosis についてのタンパク質には、融合タンパク質およびその変異体が含まれ、ここで、少なくとも2つ、好ましくは3つのM. tuberculosisのポリペプチドが融合してより大きなタンパク質となる。好適な融合タンパク質には以下のものが含まれる。Ra12−TbH9−Ra35、Erd14−DPV−MTI、DPV−MTI−MSL、Erd14−DPV−MTI−MSL−mTCC2、Erd14−DPV−MTI−MSL、DPV−MTI−MSL−mTCC2、TbH9−DPV−MTI(WO99/51748号)。
【0020】
クラミジアについての最も好適な抗原には、例えば、高分子量タンパク質(High Molecular Weight Protein)(HWMP)(WO99/17741号)、ORF3(EP366412号)、および推定膜タンパク質(Pmp(s))がある。ワクチン製剤用のその他のクラミジア抗原はWO99/28475号に記載された群から選択できる。
【0021】
好適な細菌性ワクチンには、S. pneumoniaeを含むStreptococcus spp由来の抗原(PsaA、PspP、ストレプトリシン、コリン結合タンパク質)およびタンパク質抗原ニューモリシン(Pneumolysin)(Biochem Biophys Acta, 1989, 67, 1007; Rubins et al., Microbial Pathogenesis, 25, 337−342)、およびその変異解毒誘導体(WO90/06951号;WO99/03884号)が含まれる。その他の好適な細菌性ワクチンには、H. influenzae type (例えば、PRPおよびその結合体)、non typeable H. influenzaeを含むHaemophilus spp.由来の抗原、例えば、OMP26、高分子量付着因子、P5、P6、タンパク質Dおよびリポタンパク質Dおよびフィンブリンおよびフィンブリン由来ペプチド(米国特許第5843464号)またはその多コピー変異体または融合タンパク質が含まれる。
【0022】
本発明において使用できる抗原にはさらに、マラリアを引き起こす寄生虫由来の抗原も含まれる。例えば、Plasmodia falciparumからの好適な抗原には、RTS,SおよびTRAPが含まれる。RTSは実質的にP.falciparumのサーカムスポロゾイト(CS)タンパク質のC−末端部分のすべてが、肝炎B表面抗原のpreS2部分の4つのアミノ酸を介して肝炎Bウイルスの表面(S)抗原に結合しているハイブリッドタンパク質である。その全長の構造は、国際特許出願PCT/EP92/02591号に記載されており、これは英国特許出願第9124390.7号から優先権を主張してWO93/10152号として公表されている。多段階マラリアワクチンの成分の候補であると考えられるその他のマラリア原虫抗原には、P. faciparum MSP1、AMA1、MSP3、EBA、GLURP、RAP1、RAP2、セクエストリン(Sequestrin)、PfEMP1、Pf332、LSA1、LSA3、STARP、SALSA、PfEXP1、Pfs25、Pfs28、PFS27/25、Pfs16、Pfs48/45、Pfs230およびPlasmodium spp.におけるそのアナログが挙げられる。
【0023】
本発明には、抗腫瘍抗原の使用も含まれ、これは癌の免疫療法による治療に有用である。例えば、前立腺癌、乳癌、結腸直腸癌、肺癌、膵臓癌、腎臓癌または黒色腫などの癌の腫瘍拒絶抗原が挙げられる。これら抗原には例えば、MAGE1、3およびMAGE4またはWO99/40188号に開示されているものなどのその他のMAGE抗原、PRAME、BAGE、Lage(NY Eos1としても知られている)、SAGEおよびHAGE(WO99/53061号)またはGAGE(Robbins and Kawakami, 1996, Current Opinions in Immunology 8, pps 628−636; Van den Eynde et al., International Journal of Clinical & Laboratory Research (1997提出); Correale et al. (1997), Journal of the National Cancer Institute 89, p293)が挙げられる。実際、これらの抗原は黒色腫、肺癌、肉腫および膀胱癌などの広範なタイプの腫瘍において発現している。
【0024】
本発明における使用のためのMAGE抗原は、発現エンハンサーまたは免疫学的融合パートナーとの融合タンパク質として発現させればよい。特に、Mageタンパク質はヘモフィルスインフルエンザB由来のタンパク質Dに融合させればよい。具体的には、該融合パートナーはタンパク質Dの最初の3分の1を含むようにすればよい。そのようなコンストラクトは、WO99/40188号に開示されている。癌特異的エピトープを含む融合タンパク質のその他の例としては、bcr/abl融合タンパク質が挙げられる。
【0025】
好適な態様において、前立腺抗原が用いられ、これには例えば、前立腺特異的抗原(PSA)、PAP、PSCA(PNAS 95(4) 1735 −1740 1998)、PSMAまたはプロスターゼとして知られている抗原がある。
【0026】
プロスターゼは、前立腺特異的セリンプロテアーゼ(トリプシン様)であり、254アミノ酸長であって、保存セリンプロテアーゼ触媒三連構造H−D−Sおよびアミノ末端プレプロペプチド配列を有している。これは分泌機能の可能性を示す(P. Nelson, Lu Gan, C. Ferguson, P. Moss, R. Gelinas, L. Hood & K. Wand, ”Molecular cloning and characterisation of prostase, an androgen−regulated serine protease with prostate restricted expression, In Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1999) 96, 3114−3119)。推定グリコシル化部位が記載されている。予測構造は、その他の既知のセリンプロテアーゼと非常によく似ており、成熟ポリペプチドはフォールディングされて単一のドメインとなることを示すものである。成熟タンパク質は224アミノ酸長であり、1つのA2エピトープが自然にプロセシングされることが示されている。
【0027】
プロスターゼヌクレオチド配列および推定ポリペプチド配列およびホモログはFerguson, et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999, 96, 3114−3119)および国際特許出願WO98/12302号(および対応する米国特許第5955306号)、WO98/20117号(および対応する米国特許第5840871号および米国特許第5786148号)(前立腺特異的カリクレイン)およびWO00/04149号(P703P)に開示されている。
【0028】
本発明は、プロスターゼタンパク質およびその断片およびホモログ(「誘導体」)に基づくプロスターゼタンパク質融合体を含む抗原をコードするベクターを提供する。そのような誘導体は前立腺腫瘍の治療に好適な治療用ワクチン製剤における使用に好適である。典型的には、断片は、上記の引用特許および特許出願に開示されている、少なくとも20、好ましくは50、より好ましくは100の連続するアミノ酸を含む。
【0029】
さらに好適な前立腺抗原は、P501Sとして知られているものであり、これはWO98/37814号の配列番号113である。上記引用特許出願に開示されている、少なくとも20、好ましくは50、より好ましくは100の連続するアミノ酸を含む、その遺伝子にコードされる免疫原性の断片および部分が含まれる。特に好適な断片はPS108である(WO98/50567号)。
【0030】
その他の前立腺特異的抗原は、WO98/37418号およびWO/004149号に記載のものであり、その他にはSTEAPがある(PNAS 96 14523 14528 7 −12 1999)。
【0031】
その他の本発明に有用な腫瘍関連抗原には、Plu−1(J Biol. Chem 274 (22) 15633 −15645, 1999)、HASH−1、HasH−2、クリプト(Cripto) (Salomon et al Bioessays 199, 21 61 −70、米国特許第5654140号)、クリプチン(Criptin)(米国特許第5981215号)が含まれる。さらに、癌の治療におけるワクチンに特に関連する抗原には、チロシナーゼおよびサバイビンが含まれる。
【0032】
本発明は、Muc−1、Muc−2、EpCAM、her2/Neu、マンマグロビン(米国特許第5668267号)またはWO/0052165号、WO99/33869号、WO99/19479号、WO98/45328号に開示されているもののような、乳癌抗原と組み合わせても有用である。Her2neu抗原は特に、米国特許第5801005号にも開示されている。好ましくは、Her2neuは、細胞外ドメイン全体(およそアミノ酸1−645からなる)またはその断片およびC末端のおよそ580アミノ酸からなる細胞内ドメイン全体の少なくとも免疫原性部分を含む。特に、細胞内部分はリン酸化ドメインまたはその断片を含む。そのようなコンストラクトはWO00/44899号に開示されている。
【0033】
本明細書において用いるher2neuはラット、マウスまたはヒト由来のものである。
【0034】
ワクチンは、腫瘍を支持する機構(例えば、血管新生、腫瘍浸潤など)に関連する抗原、例えば、tie2、VEGFなどを含んでいてもよい。
【0035】
本発明のワクチンはアレルギー、癌または感染性疾患に加えて慢性疾患の予防または治療にも有用である。そのような慢性疾患は、例えば、喘息、アテローム性動脈硬化症、およびアルツハイマー病、およびその他の自己免疫疾患などの疾患である。避妊薬として使用されるワクチンも含まれる。
【0036】
アルツハイマー型神経変性疾患にかかりやすい、あるいはかかっている患者の予防および治療に関する抗原は、特に、βアミロイド前駆体タンパク質のN末端の39−43アミノ酸断片およびより小さい断片である。この抗原は、国際特許出願WO99/27944号 (Athena Neurosciences)に開示されている。
【0037】
自己免疫疾患に対するワクチンとして、あるいは避妊用ワクチンとしての可能性のある自己抗原には以下のものが含まれる:サイトカイン、ホルモン、成長因子または細胞外タンパク質、より好ましくは4−ヘリックスサイトカイン、最も好ましくはIL13である。サイトカインには例えば、IL1、IL2、IL3、IL4、IL5、IL6、IL7、IL8、IL9、IL10、IL11、IL12、IL13、IL14、IL15、IL16、IL17、IL18、IL20、IL21、TNF、TGF、GMCSF、MCSFおよびOSMが含まれる。4−ヘリックスサイトカインには、IL2、IL3、IL4、IL5、IL13、GMCSFおよびMCSFが含まれる。ホルモンには、例えば、黄体形成ホルモン(LH)、卵胞刺激ホルモン(FSH)、絨毛膜性腺刺激ホルモン(CG)、VGF、グレリン、アグーチ、アグーチ関連タンパク質および神経ペプチドYが含まれる。成長因子には例えば、VEGFが含まれる。
【0038】
本発明のワクチンは慢性疾患および癌などの疾患の免疫療法による治療に特に好適であるが、持続性感染の治療にも有用である。したがって本発明によるワクチンは特に、結核(TB)、AIDSなどのHIV感染、および肝炎B(HepB)ウイルス感染などの感染性疾患の免疫療法にも好適である。
【0039】
本発明の1つの態様において、抗原はポリヌクレオチドであり、「裸」のDNAとして投与/送達され、これは例えば、Ulmer et al., Science 259:1745−1749, 1993 に記載されており、Cohen, Science 259:1691−1692, 1993によって概説されている。ここでDNAは緩衝食塩水中に製剤される。裸のDNAの取り込みは、DNAを生分解性ビーズ表面にコーティングすることによって上昇し、ビーズは自然に排出され、DNAは細胞内に効率的に輸送される。あるいはその他の周知の形質移入促進剤を用いてもよい。抗原をコードするDNAは、例えばリポソームなどの担体と組み合わせて投与してもよい。典型的にはそのようなリポソームは陽イオン性であり、例えば、イミダゾリウム誘導体(WO95/14380号)、グアニジン誘導体(WO95/14381号)、ホスファチジルコリン誘導体(WO95/35301号)、ピペラジン誘導体(WO95/14651号)およびビグアニド誘導体が挙げられる。
【0040】
本発明による抗原ペプチドを発現するベクターは、DNAワクチン組成物および免疫治療用組成物の基礎として用いられる。同様に、治療用タンパク質をコードするベクターは、治療用組成物の基礎として用いられる。したがって、本発明はさらに、免疫治療剤、ワクチンまたはワクチン組成物の製造用の抗原ペプチドの発現に好適な、本発明による発現ベクターの使用を提供する。本発明はさらに、哺乳類対象にワクチン接種する方法を提供し、該方法は有効量のそのようなワクチンまたはワクチン組成物を対象に投与することを含む。もっとも好ましくは、DNAワクチン、ワクチン組成物および免疫治療に用いられる発現ベクターは、プラスミドベクターである。
【0041】
DNAワクチンは例えば、シリンジまたは高圧噴射を用いて液体製剤として投与したり、リポソームまたは刺激性形質移入エンハンサーを用いてDNAを製剤したり、あるいは、粒子媒介DNA送達(PMDD)によるなど、「裸のDNA」の形態で投与してもよい。これらの送達システムはすべて当該技術分野に周知である。ベクターは哺乳類に、例えばウイルスベクター送達システムによって導入してもよい。
【0042】
本発明の組成物は、筋肉内、皮下、腹腔内または静脈内などの多数の経路によって送達できる。
【0043】
好適な態様において、ベクターは皮内から送達される。特に、ベクターは遺伝子ガン(特にパーティクルガン)投与技術によって送達される。これはビーズ(例えば金)表面にベクターをコーティングして、高圧下で皮内に投与するものであり、例えば、Haynes et al, J Biotechnology 44: 37−42 (1996)に記載されている。
【0044】
1つの例示的な具体例においては、ガス−打ち込み粒子加速は、Powderject Pharmaceuticals PLC (Oxford, UK) および Powderject Vaccines Inc. (Madison, WI)によって製造されるものなどの装置によって達成され、これらには例えば、米国特許第5846796号;6010478号;5865796号;5584807号;および欧州特許第0500799号に記載されているものなどがある。このアプローチは針を用いない送達アプローチを提供し、ここで、ポリヌクレオチドなどの微小粒子の乾燥粉状製剤が、手動の装置によって生じるヘリウムガス噴射により高速に加速され、粒子が、典型的には皮膚である目的の標的組織へと推進される。粒子は好ましくは直径0.4−4.0μm、より好ましくは直径0.6−2.0μmの金ビーズであり、DNA結合体はその表面にコーティングされ、カートリッジまたはカセットに入れられて「遺伝子ガン」に用いられる。
【0045】
関連する態様において、本発明の組成物のガス−打ち込み、針不使用注入に有用なその他の装置および方法には、Bioject, Inc. (Portland, OR)によって提供されるものがあり、その例としては、米国特許第4790824号;5064413号;5312335号;5383851号;5399163号;5520639号および5993412号が挙げられる。
【0046】
抗原ペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むベクターは、予防または治療上有効な量、投与される。投与量は、概して用量当たり、粒子媒介送達については1ピコグラムから1ミリグラム、好ましくは1ピコグラムから10マイクログラム、その他のヌクレオチド経路については10マイクログラムから1ミリグラムの範囲である。正確な量は免疫される哺乳類の種および体重、投与経路によってかなり変動するであろう。
【0047】
抗原ペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む免疫原成分は、基準を離れて1回投与しても繰り返し投与してもよい。例えば、1から7回、好ましくは1から4回、約1日から約18ヶ月の間隔で投与してもよい。しかし、この治療投与計画は、目的の動物の大きさおよび種、治療/予防される疾患、ヌクレオチド配列の投与量、投与経路、および熟練の獣医師または医師にとって明白なその他の因子によってかなり変動する。
【0048】
本発明の1つの態様において、本発明のベクターは免疫賦活剤と共に用いられる。好ましくは免疫賦活剤は、本発明の核酸ベクターと同時に投与され、好適な態様においては共に製剤される。そのような免疫賦活剤には以下のものが含まれるが、これは網羅的なものではなく、その他の免疫賦活剤を排除する意図ではない:例えば、イミキモッド(imiquimod)[S−26308, R−837], (Harrison, et al. ’ Reduction of recurrent HSV disease using imiquimod alone or combined with a glycoprotein vaccine’, Vaccine 19: 1820−1826, (2001))およびレシキモッド(resiquimod)[S−28463, R−848] (Vasilakos, et al. ’ Adjuvant activites of immune response modifier R−848: Comparison with CpG ODN’, Cellular immunology 204: 64−74 (2000).)などの合成イミダゾキノロン類、ツカレソール(tucaresol)(Rhodes, J. et al. ’ Therapeutic potentiation of the immune system by costimulatory Schiff−base−forming drugs’, Nature 377: 71−75 (1995))などの、抗原提示細胞およびT−細胞表面に構成的に発現するカルボニル類とアミン類とのシッフ塩基、サイトカイン、ケモカインおよびタンパク質またはペプチドとの同時刺激分子が挙げられ、これには以下のものが含まれる。GM−CSF、IL−1α、IL−1β、TGF−αおよびTGF−βなどの炎症誘発性サイトカイン、インターフェロンガンマ、IL−2、IL−12、IL−15およびIL−18などのTh1インデューサー、IL−4、IL−5、IL−6、IL−10およびIL−13などのTh2インデューサー、およびMCP−1、MIP−1α、MIP−1β、RANTES、TCA−3、CD80、CD86およびCD40Lなどのその他のケモカインおよび同時刺激遺伝子、CTLA−4およびL−セレクチンなどのその他の免疫刺激標的リガンド、Fas,(49)などのアポトーシス刺激タンパク質およびペプチド、ヴァクスフェクチン(vaxfectin)(Reyes et al., ’Vaxfectin enhances antigen specific antibody titres and maintains Th1 type immune responses to plasmid DNA immunization’, Vaccine 19: 3778−3786)などの合成脂質ベースアジュバント、スクアレン、α−トコフェロール、ポリソルベート80、DOPCおよびコレステロール、エンドトキシン、[LPS]、(Beutler, B., ’Endotoxin, ’Toll−like receptor 4, and the afferent limb of innate immunity’, Current Opinion in Microbiology 3: 23−30 (2000));CpGオリゴ−およびジ−ヌクレオチド(Sato, Y. et al., ’Immunostimulatory DNA sequences necessary for effective intradermal gene immunization’, Science 273 (5273): 352−354 (1996). Hemmi, H. et al., ’A Toll−like receptor recognizes bacterial DNA’, Nature 408: 740−745, (2000))および、合成の微細菌リポタンパク質(Mycobacterial lipoproteins)、微細菌(Mycobacterial)タンパク質p19、ペプチドグリカン、タイコ酸およびリピドAなどのTh1−誘導性サイトカインを産生するためにToll受容体をトリガーする可能性のあるその他のリガンド。
【0049】
主にTh1−型応答を誘発する好適なアジュバントには例えば、モノホスホリルリピドA、または好ましくは3−デ−O−アシル化モノホスホリルリピドAなどのリピドA誘導体が含まれる。MPL(登録商標)アジュバントは、Corixa Corporation (Seattle, WA; 例えば、米国特許第4436727号;4877611号;4866034号および4912094号を参照されたい)から入手できる。CpG−含有オリゴヌクレオチド(ここでCpGジヌクレオチドはメチル化されていない)も主にTh1応答を誘発する。そのようなオリゴヌクレオチドは周知であり、例えば、WO96/02555号、WO99/33488号および米国特許第6008200号および5856462号に記載されている。免疫賦活性DNA配列も、例えば、Sato et al., Science 273:352, 1996に記載されている。その他の好適なアジュバントには、Quil Aなどのサポニン、QS21およびQS7 (Aquila Biopharmaceuticals Inc., Framingham, MA);エスシン(Escin); ジギトニン(Digitonin); または、 Gypsophila または Chenopo dium quinoa のサポニンなどのサポニン誘導体が含まれる。
【0050】
本発明はさらに、本発明による発現ベクターで形質転換または形質移入された宿主細胞を提供する。宿主細胞は基本的にいかなる真核細胞でもよいが、哺乳類細胞が最も好適である。
【0051】
本発明はさらに、本発明による発現ベクターを宿主細胞に導入する工程、および該細胞をポリペプチドを発現させることが出来る条件下で培養する工程を含む、真核宿主細胞における組換えポリペプチドの産生方法を提供する。
【0052】
本発明は以下の実験例および添付の図面を参照することによってさらに理解することが出来るであろう。
【0053】
図1:HBV coreまたはS抗原発現に用いられる標準的発現カセットの概略表示である。SまたはCore遺伝子を、最小HCMV IE1プロモーター(mCMV)およびイントロンA(転写開始部位からみてヌクレオチド−116から+958まで)の3’側、ウサギベータグロビンポリアデニル化シグナル(pA)の5’側となるように、プラスミドに挿入した。プラスミドバックボーンはさらにpUC19複製開始点およびカナマイシン選抜マーカーを含むものであった。
【0054】
図2:IE1 5’UTRが存在するベクターおよび存在しないベクターからの、293T細胞におけるHBV SおよびCore抗原の発現のグラフ表示である。Sの発現レベルは培地に分泌された可溶性Sをng/mlとして示す。coreの発現レベルはウエスタンブロットのデンシトメトリーによって測定し、任意ユニットとして示す。
キーワード:mCMV=最小CMVプロモーター;fCMV=全長CMVプロモーター;IA=エキソン1およびイントロンA;S=表面抗原;C=Core抗原。
【0055】
図3:イントロンAの不在下でのエキソン1の付加の効果を示す。S抗原の発現レベルは培地に分泌された可溶性S抗原をng/mlとして示す。coreの発現レベルはウエスタンブロットのデンシトメトリーによって測定し、任意ユニットとして示す。
キーワード:mCMV=最小CMVプロモーター;IA=エキソン1およびイントロンA;EX1=エキソン1;CD68I=CD68第1イントロン。
【0056】
図4:ルシフェラーゼ遺伝子の発現レベルに対するエキソン1の効果を示す。
【0057】
図5:HCMVのTowne株の主要前初期遺伝子の断片の配列を示す。プロモーターの19塩基、完全なエキソン1およびイントロンAの20塩基が含まれる。エキソン1を下線で示す。
【0058】
図6−8:粒子媒介送達によってDNAで免疫化されたマウスによって生じる、HIV抗原、NEF、RTおよびGagに対する細胞応答を示す。マウスに、イントロンAおよびエキソン1を含むHCMV IEプロモーター(fcmvプロモーター)またはエキソン1を含むがイントロンAを含まないHCMV IEプロモーター(I CMV)のいずれかによってその発現が誘導される抗原をコードするDNAを与えた。
【0059】
実施例1
通常はイントロンが組み込まれている、様々な長さのHCMV IE1プロモーターおよび5’非翻訳配列(UTR)を用いて、HBV SおよびCore抗原の発現効率を調べるために多数のプラスミドを構築した。典型的な発現カセットを図1に示す。いずれの抗原の発現も最小CMV IE1プロモーターを用いた場合は、タンパク質レベルが非常に低いことが示された。プロモーターの長さを長くして上流のエンハンサー領域を含めるか、CMV IE1の自然の5’UTRを付加することによって発現レベルを上昇させることが出来る(図2)。自然の5’UTR配列(転写開始部位からみてヌクレオチド+1から+958)には、第1非翻訳エキソン、イントロンAおよび第2エキソンの少数の非翻訳塩基が含まれる。
【0060】
CMV IE1の自然の5’UTRは比較的大きい(1021塩基)。5’UTRの存在下においてみられる発現の促進はイントロンを含むことに起因していると従来から示唆されているため、以下のようにイントロンの除去/置換の効果を評価するための実験を計画した。
【0061】
第1のセットにおいて、別のイントロン(87塩基のCD68第1イントロン)をCMV 5’UTRの代わりにクローニングしたコンストラクトを作成した。CD68イントロンを、5’UTR全体の替わりに用いるか、あるいはイントロンAの替わりに用いてエキソン1の3’側に位置させた。5’UTR全体をCD68イントロンによって置換した場合、SまたはCore抗原の発現レベルは非常に低かった。しかし、エキソン1は残したままでCD68イントロンを付加した場合は、Coreの発現が大幅に促進されたが、S抗原の発現レベルは比較的低いままであった(図3)。
【0062】
さらにイントロンA配列を完全に除去し、最小CMVプロモーターと組換え遺伝子の間にエキソン1のみを残したコンストラクトを作成した。このコンストラクトでは、S抗原の高レベルの発現が観察された。Core抗原の発現も最小プロモーターのみを用いた場合のレベルと比較すると上昇していたが、エキソン1に加えてイントロンAまたはCD68イントロンのいずれかを含むコンストラクトにおいて観察されるレベルと同程度には至らなかった(図3)。
【0063】
さらに別のコンストラクトでは、エキソン1を最小CMVプロモーターとルシフェラーゼ遺伝子の間に配置した場合、あるいはCD68エキソン1の上流に配置した場合では、ルシフェラーゼの発現レベルを上昇させることが見出された(図4)。これは、イントロンAの不在下でエキソン1を含めることによる発現の促進は、発現するコード配列の性質に依存するものではないことを示す。
【0064】
これらの実験の結果、イントロンAの不在下でエキソン1を含めることにより、最小CMVプロモーターからの組換え抗原の発現レベルが上昇すると結論される。この促進効果は、最小CMVプロモーターおよび5’UTRの挙動に関する従来の知見に基づいては予測されないものである。
【0065】
形質移入法および発現産物の検出
Corning CostarJ24穴組織培養シャーレ(Corning Incorporated, Corning NY 14831, USA)中の293T細胞単層(〜2x10細胞)に、2.5μlのLipofectAMINEJ2000 (Life Technologies, 3, Fountain Drive, Inchinnan Business Park Paisley, PA4 9RF) を用いて製造業者によるプロトコールにしたがって、1μlのDNAを形質移入した。24時間後、細胞を吸引により培地に再懸濁し、遠心分離によって回収し、細胞を洗浄して250μlのリン酸緩衝食塩水に再懸濁した。分泌されたS抗原のレベルを抗体捕獲によって組織培養上清中で測定するか、あるいは細胞中に残ったS−抗原のレベルを抗−HBV−S抗体(DAKO M3506, Dako Corporation, Carpinteria, CA 93013, USA)によって免疫染色し、FITC−結合抗−マウス抗体(Sigma F5897, Sigma−Aldrich Co. Ltd, Fancy Road, Pool, Dorset, BH12 4QH)で検出し、その後標準的プロトコール(Antibodies, a Laboratory Manual (1998), Ed Harlow and David Lane (Ed) Cold Spring Harbor ISBN:0−87969−314−2に記載)を用いて蛍光顕微鏡観察することによって測定した。細胞中のCore発現のレベルは、精製HBV Coreに対して作成された院内モルモット抗体、および抗−モルモット西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体 (DAKO P0141)を用いて、SDS Pageおよびウェスタンブロットによって測定した。
【0066】
S発現の定量データはOrigen M8装置を用いて測定した。表面抗原は形質移入細胞からの上清において測定した。上清を2種の表面抗原に対するモノクローナル抗体と混合した。1種はビオチン(C86312M from Biodesign International, 60 Industrial Park Road Saco, Maine 04072, USA)で標識したものであり、もう1種はTAG (C86132M from Biodesign)で標識したものであった。インキュベーション後、ストレプトアビジンでコーティングしたビーズをサンプルに添加した。表面抗原を、結合抗体を特異的に検出する、Origen M8分析器(Origen M8 Analyzer)(IGEN Europe, Inc. Oxford BioBusiness Centre, Littlemore Park, Littlemore, Oxford OX4 2SS United Kingdom)によってサンプルを分析することにより定量した。
【0067】
実施例2
「遺伝子ガン」DNAカートリッジ用のプラスミドでコーティングした「金スラリー」の調製
例えば100μgのプラスミドDNA(およそ1μg/μl)および例えば50mgの2μm金粒子 (PowderJect)を例えば100μlの0.05Mスペルミジン(Sigma)に懸濁した。例えば100μlの1M CaCl(American Pharmaceutical Partners, Inc., USA)を添加することによって金粒子表面にDNAを沈降させた。DNA/金複合体を室温で10分間インキュベートし、例えば(予め分子ふるい3A (BDH)で乾燥させておいた)3x1mlの無水エタノールで3回洗浄した。0.05mg/mlのポリビニルピロリドン ( PVP, Sigma)を含有する無水エタノールにサンプルを再懸濁し、3本の1.5mlマイクロチューブ(Eppendorf)の等量のアリコットに分けた。これらアリコットは、以下の分析用である。(a)「金スラリー」、(b)(a)から溶出した溶出−プラスミドおよび(c)「遺伝子ガン」用の金/プラスミドでコーティングしたテフゼルカートリッジの調製用(以下の実施例3を参照)。サンプル(a)と(b)の調製のために、エタノール/PVP中の、プラスミドDNA/「金スラリー」を含有するチューブを、Eppendorf 5418マイクロチューブで最高速で2分間遠心し、上清を除いて「金スラリー」を室温で10分間乾燥した。サンプル(a)をTE pH8.0中にプラスミドDNA0.5−1.0μg/μlとなるように再懸濁した。およそ50%がコーティングされたと推測された。溶出液用に、サンプル(b)をTE pH8.0中にプラスミドDNA0.5−1.0μg/μlとなるように再懸濁し、37℃で30分間インキュベートし、激しく振って、Eppendorf 5418マイクロチューブで最高速で2分間遠心し、上清、即ち溶出液を取って−20℃で保存した。溶出したDNAの正確な濃度をGenequant II(Pharmacia Biotech)を用いて分光測光定量により測定した。
【0068】
実施例3
DNA免疫化用カートリッジの調製
Accell遺伝子トランスファー装置用のカートリッジの調製を以前に記載されているように行った(Eisenbraun et al DNA and Cell Biology, 1993 Vol 12 No 9 pp 791−797; Pertner et al)。簡単に説明すると、プラスミドDNAを2μm金粒子(DeGussa Corp., South Plainfield, N.J., USA)にコーティングし、テフゼルチューブにローディングし、これを1.27cmの長さに切断してカートリッジとし、使用時まで4℃で乾燥保存した。典型的なワクチン接種において、各カートリッジは、合計0.5μgDNA/カートリッジでコーティングされた0.5mgの金を含んでいた。
【0069】
実施例4
イントロンAの不在下でHCMV Itプロモーターの制御下で発現したHIV抗原に対する免疫応答
イントロンAの不在下でエキソン1が、核酸ワクチン接種によって送達されたHIV抗原に対する免疫応答を増強するかを調べた。
【0070】
マウス(n=3/群)に2種のベクター中の核酸によってコードされる抗原をワクチン接種した。P7077にはイントロンAおよびエキソン1を含むHCMV IEプロモーター(fcmvプロモーター)を用いた。P73Iも同じ抗原を送達するが、イントロンAを含まずエキソン1を含むHCMV IEプロモーター(icmvプロモーター)を含むものとした。
【0071】
プラスミドをF1(C3HxBalb/c)マウスの腹部皮膚の剪毛した標的部位に送達した。マウスを0日目に2x0.5μgのDNAで一次免疫し、35日目に2x0.5μgのDNAで追加免疫し、40日目にIFN−ガンマElispotを用いて細胞応答を検出した。
*P73I     −空のベクター
*P7077    −空のベクター
*P7077 GRN−(fCMVプロモーター)Gag、RT、Nef
*P73I GRN −(iCMVプロモーター)Gag、RT、Nef
*P7077 GN −(fCMVプロモーター)Gag、Nef
*P73I GN  −(iCMVプロモーター)Gag、Nef
【0072】
細胞障害性T細胞応答
細胞障害性T細胞応答は、5日後に回収した脾細胞の、CD8+T細胞−拘束IFN−γELISPOTアッセイによって評価した。マウスを頚部脱臼によって殺し、脾臓を氷冷PBS中に収集した。脾細胞をリン酸緩衝食塩水(PBS)中に分散させ、赤血球を溶解した(155mM NHCl、10mM KHCO、0.1mM EDTAからなる緩衝液中で10分間)。PBSで2回洗浄して粒状物を除き単細胞懸濁液を、予め捕獲IFN−γ抗体でコーティングしておいたELISPOTプレートに分注し、CD8−拘束同族ペプチド(Gag、NefまたはRT)で刺激した。一晩培養した後、IFN−γ産生細胞を、抗−マウスIFN−γ−ビオチン標識化抗体(Pharmingen)の添加後、ストレプトアビジン結合アルカリホスファターゼを添加することによって可視化し、画像分析によって定量化した。
【0073】
この実験の結果を図6、7および8に示す。
【0074】
結論
イントロンAの不在下で実質的にエキソン1のすべてを含めることにより、最小CMVプロモーターからの組換え抗原の発現レベルが上昇する。この上昇は発現すべき抗原に依存しない。ベクターは、目的のタンパク質の生体内での発現を上昇させ、この発現により生体内で免疫応答を誘発することができるため、核酸ワクチン接種プロトコールおよび遺伝子治療プロトコールにおいて有用である。さらに、ベクターは培養中の組換えタンパク質のレベルを上昇させることが出来る。
【図面の簡単な説明】
【図1】HBV coreまたはS抗原発現に用いられる標準的発現カセットの概略図である。
【図2】IE1 5’UTRが存在するベクターおよび存在しないベクターからの、293T細胞におけるHBV SおよびCore抗原の発現のグラフを示す。
【図3】イントロンAの不在下でのエキソン1の付加の効果を示す。
【図4】ルシフェラーゼ遺伝子の発現レベルに対するエキソン1の効果を示す。
【図5】HCMVのTowne株の主要前初期遺伝子の断片の配列を示す。
【図6】粒子媒介送達によってDNAで免疫化されたマウスによって生じるHIV抗原、Gagに対する細胞応答を示す。
【図7】粒子媒介送達によってDNAで免疫化されたマウスによって生じるHIV抗原、NEFに対する細胞応答を示す。
【図8】粒子媒介送達によってDNAで免疫化されたマウスによって生じるHIV抗原、RTに対する細胞応答を示す。

Claims (16)

  1. プロモーターおよび、実質的にエキソン1のすべてを含むが実質的にイントロンAのすべてを含まないHCMV IE1遺伝子の5’非翻訳領域の断片を含む、DNA配列を含むベクター。
  2. プロモーターがHCMV IE1最小プロモーターである、請求項1に記載のベクター。
  3. HCMV IE1遺伝子の5’非翻訳領域の断片が、プロモーターの3’側に隣接している、請求項1または2に記載のベクター。
  4. 5’非翻訳領域中にHCMV IE1エキソン1の下流に隣接してHCMV IE1遺伝子のイントロンA以外の異種イントロン配列をさらに含む、請求項3に記載のベクター。
  5. 5’非翻訳領域の下流に位置する1または複数の制限部位をさらに含む、請求項3または4に記載のベクター。
  6. プラスミドベクターである、請求項1から5のいずれか1項に記載のベクター。
  7. 真核宿主細胞または生物体中でのポリペプチドの発現に使用される発現ベクターである、請求項1から6のいずれか1項に記載のベクター。
  8. プロモーターおよびHCMV IE1 5’非翻訳領域に操作可能にリンクした、ポリペプチドをコードするDNA配列を含む、請求項7に記載の発現ベクター。
  9. ポリペプチドが抗原ペプチドである、請求項8に記載の発現ベクター。
  10. ワクチンまたは免疫治療剤として、あるいはワクチン組成物または免疫治療用組成物の成分として使用される、請求項9に記載の発現ベクター。
  11. 請求項1から10のいずれかに記載のベクターおよび医薬上許容されるアジュバント、希釈剤、賦形剤または担体を含む、免疫原性組成物。
  12. 担体が、その表面にベクターがコーティングされるビーズを含む、請求項11に記載の組成物。
  13. ワクチン、免疫治療剤、ワクチン組成物または免疫治療用組成物の製造のための請求項9に記載の発現ベクターの使用。
  14. ヒト対象にワクチン接種する方法であって、該対象に、請求項9に記載の発現ベクターを含むワクチンまたはワクチン組成物、あるいは請求項11または12に記載の組成物を、有効な量投与することを含む方法。
  15. 請求項1から10のいずれかに記載の発現ベクターで形質転換または形質移入された宿主細胞。
  16. 請求項8または9に記載の発現ベクターを、ポリペプチドの発現を可能にするような条件下で宿主細胞に導入することを含む、真核宿主細胞において組換えポリペプチドを産生する方法。
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Families Citing this family (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006504413A (ja) * 2002-09-12 2006-02-09 ファーメクサ エイ/エス 自家グレリンに対する免疫化
GB0225788D0 (en) * 2002-11-05 2002-12-11 Glaxo Group Ltd Vaccine
GB0225786D0 (en) * 2002-11-05 2002-12-11 Glaxo Group Ltd Vaccine
US20040146486A1 (en) * 2003-01-24 2004-07-29 Juan Sun Hybrid vector system for use as a vaccine
GB0321615D0 (en) 2003-09-15 2003-10-15 Glaxo Group Ltd Improvements in vaccination
ES2457022T3 (es) * 2003-10-10 2014-04-24 Powderject Vaccines, Inc. Construcciones de ácidos nucleicos
GB0400965D0 (en) * 2004-01-16 2004-02-18 Glaxo Group Ltd Promoter
US7785875B2 (en) * 2004-07-03 2010-08-31 Mogam Biotechnology Research Institute Polynucleotide encoding HCV epitopes which can bind to various HLA supertypes, immunogenic composition comprising same and method of inducing an HCV-specific immune response using same
US20060045886A1 (en) * 2004-08-27 2006-03-02 Kedl Ross M HIV immunostimulatory compositions
WO2006026394A2 (en) * 2004-08-27 2006-03-09 3M Innovative Properties Company Method of eliciting an immune response against hiv
US7429480B2 (en) * 2005-01-10 2008-09-30 National Taiwan University Promoter sequences from WSSV immediate early genes and their uses in recombinant DNA techniques
WO2006076678A2 (en) * 2005-01-13 2006-07-20 The Johns Hopkins University Prostate stem cell antigen vaccines and uses thereof
GB0507997D0 (en) * 2005-02-01 2005-05-25 Powderject Vaccines Inc Nucleic acid constructs
CN101906418B (zh) * 2005-09-08 2013-06-12 财团法人阪大微生物病研究会 用于将基因导入淋巴细胞或血细胞中的启动子及其应用
CA2657279A1 (en) 2006-07-18 2008-01-24 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Vaccines for malaria
CL2007003743A1 (es) 2006-12-22 2008-07-11 Bayer Cropscience Ag Composicion que comprende fenamidona y un compuesto insecticida; y metodo para controlar de forma curativa o preventiva hongos fitopatogenos de cultivos e insectos.
MX2009009342A (es) 2007-03-02 2009-09-11 Glaxosmithkline Biolog Sa Metodo novedoso y composiciones.
GB0710538D0 (en) * 2007-06-01 2007-07-11 Glaxo Group Ltd Vaccine

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH11507835A (ja) * 1995-06-23 1999-07-13 ローヌ−プーラン・ロレ・エス・アー 組換えアデノウイルス、aavを作製するためのその使用、相補的細胞系、及び、該アデノウイルスを含む医薬組成物
WO2000000629A1 (en) * 1998-06-26 2000-01-06 Viromed Limited High efficiency retroviral vectors that contain none of viral coding sequences
JP2004511229A (ja) * 2000-10-13 2004-04-15 カイロン コーポレイション サイトメガロウイルスイントロンaフラグメント

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5168062A (en) * 1985-01-30 1992-12-01 University Of Iowa Research Foundation Transfer vectors and microorganisms containing human cytomegalovirus immediate-early promoter-regulatory DNA sequence

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH11507835A (ja) * 1995-06-23 1999-07-13 ローヌ−プーラン・ロレ・エス・アー 組換えアデノウイルス、aavを作製するためのその使用、相補的細胞系、及び、該アデノウイルスを含む医薬組成物
WO2000000629A1 (en) * 1998-06-26 2000-01-06 Viromed Limited High efficiency retroviral vectors that contain none of viral coding sequences
JP2002519037A (ja) * 1998-06-26 2002-07-02 バイロメド リミテッド ウイルスコード配列を含有していない高い効率を有するレトロウイルスベクター
JP2004511229A (ja) * 2000-10-13 2004-04-15 カイロン コーポレイション サイトメガロウイルスイントロンaフラグメント

Non-Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JPN6008038861, Genomics, (1998), Vol. 54, p. 165−168 *
JPN6008038867, Mol. Cell. Biol., (1991), Vol. 11, No. 6, p.3070−3074 *
JPN6008038868, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (1991), Vol. 88, p. 478−482 *
JPN6008038869, Molecular Medicine, (1998), Vol. 4, p. 700−706 *
JPN6008038871, J. Virology, (1992), Vol. 66, No. 4, p. 2086−2095 *
JPN6008038873, Nucleic Acids Research, (1991), Vol. 19, No. 14, p. 3979−3986 *
JPN6009013707, Clinical Cancer Research, (1999), Vol. 5, p. 1708−1714 *
JPN7008006045, Int. J. Molecular Medicine, (1999), Vol. 4, p. 549−555 *

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