JP2004512344A - 食品用トランスグルタミナーゼ阻害剤及びそれを使用する方法 - Google Patents
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Abstract
乳から、特に脱脂乳から凝乳を形成し、遠心分離工程で前記凝乳をホエーから分離し、引き続き前記ホエーを限外濾過工程に付すことによってあるいは脱脂乳をダイアフィルトレーション工程に付すことによって、脱脂乳から得られうるホエー画分から得られうるトランスグルタミナーゼ阻害剤を含む組成物。トランスグルタミナーゼ阻害剤を生産する方法、及び食品又医薬組成物の生産においてトランスグルタミナーゼ阻害剤を使用する方法、並びに病理の治療のための薬剤の調製において使用する方法
Description
【0001】
【発明の属する技術分野】
本発明は、乳から得られうるトランスグルタミナーゼ阻害剤、乳から前記トランスグルタミナーゼ阻害剤を得るための方法、蛋白質の架橋化を調節する際に前記トランスグルタミナーゼ阻害剤を使用する方法、及び食品生産物又は医薬組成物においてそれを使用する方法、並びにある病気の治療のための薬剤の調製において前記トランスグルタミナーゼ阻害剤を使用する方法に向けられる。
【0002】
【従来の技術】
トランスグルタミナーゼ(プロテイン−グルタミン−γ−グルタミルトランスフェラーゼ、EC 2.3.2.13)は、蛋白質間に共有結合の架橋を導入し、それによって高分子量分子を生成するアシル転移反応を触媒する。トランスグルタミナーゼは、グルタミン残基とリシン残基の側鎖間のイソペプチド結合の形成を触媒する酵素群であり、それらの幾つかはCa2+依存である。蛋白質に結合したリシンが第1級アミン供与体として働く場合、該反応は蛋白質を架橋化するように働くε−(γ−グルタミル)−リスイソペプチド(ε−(γ−glutamyl)−lys isopeptide)結合の形成を結果として生じる。該生じた結合は、共有結合で、安定であり、かつ蛋白質分解に比較的に耐性があると考えられる。該酵素は、細菌、カビ、植物及びほ乳類などの種々の起源から単離されかつ精製されている(Zhu, Y., Rinzema, A., Tramper, J., J Appl. Microbial Biotechnol (1995年)、第44巻、第277〜第282頁)。種々の起源由来のトランスグルタミナーゼの生物学的役割及び構造的特徴は、非常に異なるが、それら全ては、架橋化反応を担う活性部位にシステインを含み、そしてそれ故に、蛋白質の架橋化はトランスグルタミナーゼの全ての型が共通に有している1つの特徴である。トランスグルタミナーゼのうち、ほ乳類及びヒト由来の血漿グルタミナーゼ(因子 XIIIa)は、最も研究された酵素の1つである。該酵素がフィブリン分子を架橋化して、血塊中のフィブリンネットワークの強さを増強する故に、この酵素は、血液凝固経路で重大な役割を果たす。同じくほ乳類及びヒトからの他の型のトランスグルタミナーゼは、一般に組織トランスグルタミナーゼとして記載されている。この型のトランスグルタミナーゼは、ハンチントン病、アポトーシス、セリアック病及びアルツハイマー病のような多くの過程に関与することが示されている。トランスグルタミナーゼが重要な役割を果たす他の過程は、皮膚の疾患、白内障、脊髄延髄の萎縮(ケネディー病)、(脊髄)小脳失調、室頂核脳幹の淡蒼球ルイ体萎縮、多発性硬化を含む中枢神経系の炎症性疾患、リウマチ様関節炎、糖尿病例えばインスリン依存性糖尿病、破傷風並びに他のクロストリジウム属に関連した症状、レッツ症候群、ヒト免疫不全ウィルス感染、及び炎症進行である。
【0003】
ストレプトベルティリウム(Streptovertillium)株由来のCa2+非依存性細菌のトランスグルタミナーゼの発見は、大量に該酵素を生産することの可能性の故に、トランスグルタミナーゼについての研究を大いに後押しした。該酵素が大量に利用可能になった故に、種々の技術分野で該酵素の応用への興味が現在増強している。
【0004】
トランスグルタミナーゼの応用の幾つかは、食品、及び食品のための蛋白質添加剤の調製にある。該酵素の蛋白質架橋化活性は、食品製品のテクスチャ及び構造並びに蛋白質の機能的特性を改善するために使用されることが出来る。欧州特許出願公開第0,610,649号明細書は、ヨーグルトの生産でトランスグルタミナーゼを使用することを記載している。国際公開第93/19,610号パンフレットは、乳にトランスグルタミナーゼを使用し、それによって改善された粘度を有する製品を提供することを記載している。
【0005】
トランスグルタミナーゼが関与する多くの生物学的工程及びトランスグルタミナーゼの増加する使用の故に、トランスグルタミナーゼの活性を修飾又は阻害する化合物に広範囲に及ぶ興味がある。いくつかの阻害剤、とりわけモノダンシルカダベリン、モノ−及びジアミン例えばシスタミン、プトレッシン、GABA(ガンマアミノ安息香酸)、N−ベンジルオキシカルボニル、5−デアゾ−4−オキソノルバリン、p−ニトロフェニルエステル、グリシンメチルエステル、硫酸銅及びトルブタミドが、種々の病理の治療で使用することが国際公開第99/65516号パンフレットに記載されている。アミン例えばスペルミン及びスペルミジンは、トランスグルタミナーゼの基質として言及されている。阻害剤例えばモノダンシルカダベリン、プトレッシン、スペルミン、スペルミジン及びグリシンメチルエステルは、競合反応を通じてトランスグルタミナーゼの蛋白質架橋化活性を阻害する第1アミンであり、それらはトランスグルタミナーゼ活性を阻害しない。他の周知のトランスグルタミナーゼ阻害剤例えばN−エチルマレイミド、ヨードアセテート、及びパラクロロ水銀安息香酸が、トランスグルタミナーゼの活性部位システインを共有結合してブロックすることによって働くことが知られている。しかしながら、これらの化合物は、毒性であるとして知られ、それ故に食品及び食品添加物の応用に適していない。特許文献に記載されている他のトランスグルタミナーゼ阻害剤は、イソキサゾール、イミダゾール(米国特許公報第5,098,707号明細書)、及びチアジアゾール(国際公開第99/45,027号パンフレット)である。
【0006】
トランスグルタミナーゼの天然の阻害剤は、少ない。ある特定の蛋白質が、トランスグルタミナーゼを阻害することが知られている(国際公開第95/17,426号パンフレット)。カビによって生成された抗菌薬剤、セルリニン(cerulinin)は、血漿トランスグルタミナーゼの天然の非蛋白質阻害剤として報告されている(Tymiak, A. A., Tuttle, J.G., Kimball, S.D., Wang, T. Lee, V.G. (1993年)、J. Antiobiot.、第46巻、第204〜206頁)。カビから単離されたアルタセノ酸(Alutacenoic acid)は、血漿トランスグルタミナーゼの強力な阻害剤としての活性をまた示す(Kogen, H., Kiho, T., Tago., K., Miyamoto, S., Fujioka, T., Otsuka, N., Suzuki−konagai, K., Ogita, T., (2000年)、J. Am. Chem. Soc. 第122巻、第18421〜第18430頁)。
【0007】
食品においてトランスグルタミナーゼを使用することの1つの不利点は、該酵素が活性型のままで存在する製品は、否定的な健康効果を有しうることである。従って、該酵素の活性は製品の消費の前に制御されることが好ましい。好ましくは、該酵素の制御は、該酵素が完全に阻害されるか又は不活性化される程度まで生じる。
【0008】
【発明が解決しようとする課題】
該酵素の不活性化は、該製品の熱処理によって達成されうる。しかしながら、該製品の熱処理は、多くの場合、該製品の特性に好ましくない変化をもたらしうる。食品の場合、このことは消費者にとってより魅力のない製品をもたらしうる。当業者に現在知られているトランスグルタミナーゼ阻害剤は、一般に、主としてそれらの毒性の故に許可されていない又はさもなければ食品の応用に不適切であると考えられている化合物又は組成物である。従って、食品での応用(すなわち食品等級)に適切であり、かつトランスグルタミナーゼの活性の有効な阻害を同時に提供し、一方製品又は消費者のいずれかに対して阻害剤の不利な効果が、少なくとも実質的に減少され又は存在しないトランスグルタミナーゼ阻害剤へのニーズが存在する。
【0009】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、乳がトランスグルタミナーゼの阻害剤を含むことをいま見出した。本発明者は、トランスグルタミナーゼでの脱脂乳の架橋化実験で、高分子量カゼインポリマーの形成のほんの非常に小さい程度を発見した。脱脂乳の強い加熱処理は、大きいポリマーの形成及びカゼインモノマーの消失によって観察されたように、架橋化のはるかに高い程度をもたらした。乳からのカゼイン及びホエー蛋白質の除去は、トランスグルタミナーゼ阻害活性が維持された画分をもたらした。本発明者は、この阻害剤が細菌のトランスグルタミナーゼを阻害するだけでなく、血液中に存在する2つのトランスグルタミナーゼの活性を阻害することにも有効であることをまた発見した。単離及び精製工程の組み合わせによって、該阻害剤は、該阻害活性が維持されたままで部分的に精製されることができ、従って得られた該画分はトランスグルタミナーゼの阻害に使用されうる。
【0010】
第1の観点において、本発明は、乳から、特に、乳から好ましくは脱脂乳から得られうるホエー画分から得られうるトランスグルタミナーゼ阻害剤を含む組成物を提供する。第1の態様では、該阻害剤は、(i)乳を酸処理に付し、そして引き続き酸処理によって沈殿した蛋白質を除去してホエー画分を残すことによって、又は(ii)乳から凝乳を形成し(例えば微生物若しくはプロテアーゼの使用によって)、遠心分離工程で前記凝乳を該ホエーから分離し、引き続き得られた該ホエーを限外濾過工程に付すことによって得られるホエーから得られうる。代わりの実施態様では、該阻害剤は乳をダイアフィルトレーション工程に付すことによって得られうる。
【0011】
乳から得られうるホエー画分を限外濾過工程に付すことによって、トランスグルタミナーゼ阻害剤を含む望ましい画分が、ホエー蛋白質から分離される透過液中に得られる。好ましくは、該ホエー画分は10KDaのカット・オフを有する膜を使用し限外濾過される。膜のカット・オフの限界は、2つの主なホエー蛋白質 α−ラクトアルブミン(14.1kDa)及びβ−ラクトグロブリン(18kDa)を除去する能力によって決定される。本発明に従う阻害剤は、約200Daのオーダーの分子量を有すると考えられる故に、適切なカット・オフは1kDaからであり、しかし2、3、4または5〜10kDaのカット・オフがまた適切である。
【0012】
トランスグルタミナーゼ阻害剤を含む望ましい画分がダイアフィルトレーションによって得られる場合、ダイアフィルトレーション膜は約3kDaのカット・オフを有することが好ましい。しかしながら、ダイアフィルトレーションのための適切な膜は、1〜10kDaの範囲の限外濾過のための膜と同じ範囲のカット・オフを有する。
【0013】
第2の観点において、本発明は、乳から、特にホエー画分からトランスグルタミナーゼ阻害剤を含む組成物を得るための方法であって、乳から凝乳を形成し、遠心分離工程で前記凝乳をホエーから分離し、引き続き前記ホエーを限外濾過工程に付す工程を含む方法を提供する。好ましくは、凝乳は、乳を食品用の酸例えば塩酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、乳酸またはグルコン(デルタグルコン)で酸性化することによって、あるいは酸生成微生物の添加によって形成される。あるいは、工程は、脱脂乳をダイアフィルトレーション工程に付すことを含む。
【0014】
米国特許第5,198,213号明細書では、ホエーの最初の画分(該最初の画分は高分子量タンパク質を含む)は、測定可能であるが低いレベルの免疫学的に活性なイムノグロブリン及び他の病理特異的抗体を含むことが記載されている。トランスグルタミナーゼに関連づけられた低分子量化合物を含むホエー画分の何らかの有益な応用への言及はない。
【0015】
国際公開第98/48,640号パンフレットは、インスリンのない蛋白質画分を開示し、それはより大きい蛋白質からなる。これらの画分は、乳児用調製物及び他の栄養調製物で使用される。
【0016】
国際公開第98/09,717号パンフレットでは、特別の分離技術が記載されている。実施例3及び4では、蛋白質は乳及びホエーからそれぞれ回収される。前記生成物の本発明に従う特別の使用は記載されていず、特に低分子量画分について記載されていない。
【0017】
本発明に従うトランスグルタミナーゼ阻害剤を含む組成物(それはトランスグルタミナーゼ阻害剤とも呼ばれる)は、低分子量物質であり、好ましくは約200ダルトンのオーダーの分子量を有すると考えられている。
【0018】
本発明に従うトランスグルタミナーゼ阻害剤の特性に関して、該阻害剤は自由な金属イオンではないことが見出された。
【0019】
本発明に従う阻害剤は、カゼイン及び他の蛋白質の架橋化において、及びトランスグルタミナーゼのいくつかの活性アッセイにおいて、トランスグルタミナーゼの活性を阻害する。該阻害剤は、ホエー画分の形で使用されうる。該阻害剤を含む画分を濃縮工程に付すことが好ましい。適切な濃縮工程は、凍結乾燥又はスプレー乾燥である。本発明の実施態様では、該阻害剤は、濃縮された形で得られるが、該阻害剤の阻害能力は実質的に影響を受けない。凍結乾燥工程からの及び/又はスプレー乾燥工程からの乾燥した生成物の再溶解は、トランスグルタミナーゼに対する阻害活性がほとんど保持されているという結果を生じる。
【0020】
本発明の更なる実施態様では、該阻害剤は、さらに精製されうる。適切な精製工程は、ゲル濾過及び/又はイオン交換技術である。該阻害剤を精製する場合、好ましくは、ラクトースの少なくとも一部が除去される。
【0021】
本発明に従う阻害剤は、幅広い温度範囲で安定である。該阻害剤が得られる、単離及び精製及び濃縮工程は、約80℃までの温度で実施しうる。この温度範囲の上限を超えないように注意されるべきである。上限温度値を超すことは、トランスグルタミナーゼ阻害剤の活性の損失又は望ましくない減少の結果を一般に生じる。好ましくは、該阻害剤は70℃を超えた、より好ましくは60℃を超えた温度に加熱されない。
【0022】
本発明に従う阻害剤は、乳から単離されうる。本発明に従う阻害剤を含む画分が得られうる乳は、動物から、及び好ましくは家畜例えば乳牛、ヤギ、羊、馬、ラクダ、バッファロー、鹿、ロバ、トナカイに由来する。原理的に、適切な起源としてヒト乳を使用することもまた可能である。好ましい実施態様では、該阻害剤は、乳牛の乳から得られる。好ましくは、乳は、未処理又は少なくとも強く加熱処理されていない。脂肪画分は、例えば遠心分離によって好ましくは除去される。蛋白質は、好ましくは限外濾過、沈殿及び/又はダイアフィルトレーション又はそれらの技術の組み合わせを通じて除去される。該阻害剤組成物は、限外濾過及びダイアフィルトレーション工程の透過液内にある。
【0023】
本発明に従う阻害剤は、MALDI−TOF分析によって示されたように、トランスグルタミナーゼに実質的に共有結合の形で結合する。その上、該阻害剤は、トランスグルタミナーゼにほぼ当量で結合することがタイトレーション実験によりわかった。任意の特定の理論に拘束される事を望むことなしに、本発明に従う阻害剤は、トランスグルタミナーゼシステイン残基に結合されると考えられる。
【0024】
本発明は、食品及び食品生産物の生産に応用をみつける。トランスグルタミナーゼが、蛋白質を含む食品(例えば、乳製品(ヨーグルト)、肉又は魚)の構造を改善するために、蛋白質の架橋化で使用される場合、トランスグルタミナーゼ活性は、本発明に従う阻害剤の添加によって停止又は減少されうる。一つの観点では、本発明は、食品の生産におけるトランスグルタミナーゼ阻害剤の使用に関する。
【0025】
本発明に従う阻害剤の重要な観点は、架橋化の程度の調節で阻害剤を使用することである。β−カゼインの部分的な架橋化は、加熱された場合ゲルの形成を生じ、ところが架橋化されていないβ−カゼイン又は強度に架橋化されたβ−カゼインは加熱でゲルを形成しないことがわかった。架橋化の程度の調節は、本発明に従う阻害剤の添加によって簡単に達成されるが、活性の他の手段(例えば加熱を通じて)が蛋白質機能性を非常に良く破壊する。その上、本発明に従う阻害剤は、制御された放出例えばカプセル化を可能にする形で使用されうる。基質への(マイクロ)カプセル化された阻害剤と組み合わせたトランスグルタミナーゼの添加は、トランスグルタミナーゼ及び阻害剤の両方の均一な分散という結果を生じることが容易に理解される。すると、蛋白質の架橋化が、該阻害剤の放出特性によって左右される。架橋後の製品が粘性又はゲル状である場合、これは有利である。
【0026】
更なる観点で、本発明は、本発明に従うトランスグルタミナーゼ阻害剤を含む医薬組成物に関する。該医薬組成物は、何らか様式トランスグルタミナーゼ活性に伴う又は関連した病気の治療に有利に使用されうる。本発明に従う医薬組成物は、薬剤的に適用可能な形で少なくとも一つのトランスグルタミナーゼ阻害剤を、任意的に薬剤的に許容される担体と組合せて、含むことができる。これらの組成物は、それらの意図された目的を達成する任意の手段によって投与されうる。トランスグルタミナーゼ活性によって仲介される疾病の治療のための本発明に従うトランスグルタミナーゼ阻害剤の投与の量及び管理は、これらの疾病を治療する当業者によって容易に決定されうる。
【0027】
本発明は、トランスグルタミナーゼが役割を果たす疾病例えばアルツハイマー病、血友病、アポトーシス、セリアック病、ハンチントン病、皮膚の疾患、白内障、脊髄延髄の萎縮(ケネディー病)、(脊髄)小脳失調、室頂核脳幹の淡蒼球ルイ体萎縮、多発性硬化を含む、中枢神経系の炎症性疾患、リウマチ様関節炎、糖尿病例えばインスリン依存性糖尿病、破傷風並びに他のクロストリジウム属に関連した症状、レッツ症候群、ヒト免疫不全ウィルス感染、及び炎症進行の治療のための薬剤の調製でトランスグルタミナーゼ阻害剤を使用することにさらに関する。
【0028】
【実施例】
材料及び方法
材料
Source Q、Source S及びSuperdex peptide 30は、ファルマシア社(スウェーデン、ウプサラ)から購入された。Biogel P2は、バイオ・ラド社から買われた。N,N−ジメチルカゼイン、カゼイン、Cbz−グルタミニルグリシン、ヒドロキシルアミン及びテンジクネズミ肝臓トランスグルタミナーゼが、シグマ社から購入された。全ての他の試薬は、分析等級であった。脱脂乳は地元の商店から、新鮮な乳は農場から直接得られた。Streptovertillium mobaraenseは、文献1に記載されているように培養され、そしてトランスグルタミナーゼの精製が、文献2に従いおこなわれた。ヒト血漿トランスグルタミナーゼは、ベーリング・ヴェルケ(Behring Werke)社から得られた。
【0029】
脱脂乳蛋白質の架橋化
脱脂乳蛋白質は、1ml脱脂乳当たり30μgの細菌のトランスグルタミナーゼの添加によって架橋化された。対照として、脱脂乳は、トランスグルタミナーゼの添加の前に、80℃で、3時間インキュベートされた。インキュベーションは37℃で行われ、そしてサンプルは時間間隔を置いて採取された。架橋化反応は、80℃で5分間インキュベーションすることによって停止された。架橋化反応の分析は、ゲル電気泳動によって行われた。
【0030】
活性アッセイを使用したトランスグルタミナーゼ阻害の測定
細菌及びテンジクネズミのトランスグルタミナーゼ活性の阻害の定量分析は、ヒドロキサメート・アッセイ(文献3)で決定された。30μl (1mg/ml)トランスグルタミナーゼが、種々の量の阻害剤画分(0〜30μl)と共にインキュベートされた。該混合物は、トランスグルタミナーゼへの阻害剤の結合を確実にするために、室温で30分間インキュベートされた。活性測定は、阻害された画分で行われた。
【0031】
血漿トランスグルタミナーゼ活性の阻害の定量分析は、ローランド(文献4)に従い、ジメチル化されたカゼイン中にモノダンシルカダベリンを加えることによって決定された。この酵素はヒドロキサメート・アッセイで何ら活性を示さない故に、血漿トランスグルタミナーゼはこのアッセイで測定された。還元を通じるトランスグルタミナーゼからの阻害の起りうる除去を防ぐために、ジチオスレイトールが該反応混合物から除去された。阻害は、活性の相対的な減少から計算された。
【0032】
架橋化実験を使用したトランスグルタミナーゼ阻害の測定
細菌のトランスグルタミナーゼ活性の阻害の定性分析は、カゼインの架橋化で決定された。20μgのトランスグルタミナーゼが、200μlの限外濾過された阻害剤画分と共にインキュベートされた。該混合物は、トランスグルタミナーゼへの阻害剤の結合を確実にするために、室温で、30分間インキュベートされた。標準反応混合物(2mlの総体積)は、50mM 酢酸ナトリウム(pH6)、10mg/ml カゼイン及び10μgの予めインキュベートされたトランスグルタミナーゼを含んだ。インキュベーションは40℃で行われ、そしてサンプルは時間間隔を置いて採取された。該反応は、80℃で5分間インキュベーションすることによって停止された。架橋化反応の分析は、ゲル電気泳動によって行われた。
【0033】
ポリアクリルアミド−ゲル電気泳動(SDS−PAGE)。サブユニット分子量が、出来上がったゲル及びMini Protean 装置(バイオ・ラド社)を使用し、ラエムリ(文献5)に従い、SDS−PAGEによって、変性条件下で決定された。酵素又は反応混合物サンプルは、2%SDS及び1%ジチオスレイトール中で、5分間、100℃のインキュベーションによって変性された。ゲルは、Coomassie Brilliant Blue G250で蛋白質について染色された。高分子量検定キット(ファルマシア社)が、分子量を得るために使用された。
【0034】
実質的に蛋白質のない阻害剤画分の調製
手法1
脱脂乳が、塩酸の添加によってpH4.4にされた。沈殿したカゼインは、遠心分離(20分、25000g)によって除去された。澄んだ上清が、10kDa膜(アミコン社)を使用し限外濾過された。濃縮されたホエー蛋白質が除去され、そして膜を通過した溶液が、凍結されすなわち凍結乾燥された。
【0035】
阻害剤は、ラクトース及び他の非阻害剤成分を除去するために、Superdex 30ペプチドカラム又はBiogel P2でのゲル濾過によって更に精製されることができた。
【0036】
手法2
1リットルの脱脂乳が、3500 Daのカット・オフを有する透析チューブを使用し、5リットルの脱イオン化された水に対して透析された。24時間透析後、蛋白質画分を含む透析チューブが除去された。3500よりも小さい大きさの分子を含む溶液は、トランスグルタミナーゼ阻害剤を含んだ。この画分は、阻害剤を濃縮するために凍結乾燥されうる。該阻害剤の溶液は、該凍結乾燥されたサンプルを水に溶解することによって調製されうる。残りの非溶解性化合物は、遠心分離によって除去された。
【0037】
阻害の前及び後のトランスグルタミナーゼのMaldi TOF分析
細菌のトランスグルタミナーゼ(1mg)が、手法1によって得られた阻害画分の10mlでインキュベートされた。室温で30分間のインキュベーション後に、トランスグルタミナーゼの阻害は、ヒドロキサメート・アッセイで試験された。該阻害されたトランスグルタミナーゼは、結合していない成分を除き且つ細菌のトランスグルタミナーゼを濃縮するために、30kDa アミコン製フィルターを使用して限外濾過された。該阻害されたトランスグルタミナーゼ及びブランクの分子量が、Maldi TOFを使用し測定された。
【0038】
結果
脱脂乳蛋白質の架橋化
脱脂乳の架橋化後のSDS/PAGE分析は、ほんの少しの架橋の兆しを示した(図1)。しかしながら、80℃で3時間の加熱処理後の脱脂乳は、カゼインの通常の架橋化を示した。加熱されていない脱脂乳へのトランスグルタミナーゼの更なる添加は、加熱された脱脂乳と同等の架橋化の結果を生じた(データは示されていない)。
【0039】
活性アッセイを使用したトランスグルタミナーゼ阻害の測定
阻害剤画分でのインキュベーション後の細菌のトランスグルタミナーゼの活性は、ヒドロキサメート・アッセイで観察できたように、低下された(図2A)。使用された阻害剤画分のタイプに依存して、画分に存在する成分は活性測定で妨害の原因であった。これらの成分は、トランスグルタミナーゼ活性の吸収測定を邪魔する色形成を生じた。ゲル濾過上での阻害剤のさらなる精製は、妨害化合物を除去し、これは直線的な阻害カーブをもたらした(図2B)。
【0040】
テンジクネズミ肝臓トランスグルタミナーゼは、同様の結果を与えた(データは示されていない)。
【0041】
阻害剤画分でのインキュベーション後の血漿トランスグルタミナーゼの活性は、蛍光アッセイで観察できたように、低下された(データは示されていない)。この結果は、該阻害剤によって血漿トランスグルタミナーゼを完全に不活性化することが可能であることを明らかに示している。
【0042】
架橋化実験を使用したトランスグルタミナーゼ阻害の測定
カゼインの架橋化は、手法1の後に得られた画分での阻害後の細菌のトランスグルタミナーゼで観察されなかった(図3)。未処理のトランスグルタミナーゼでの対照は、正常な架橋化を示した。
【0043】
蛋白質不含の阻害剤画分の調製
手法1
カゼインは、pH 4.4で沈殿後に遠心分離によって除去された。ホエー蛋白質画分は、引き続き10kDa限外濾過ユニット(アミコン社)を使用し限外濾過された。該膜を通過した低分子量画分は、図2に示されるようにトランスグルタミナーゼ阻害を示した。この画分の濃縮は、溶液の凍結乾燥、そして該固形を少量の水に溶解することによって達成された。該濃縮された画分は、Biogel P2でさらに精製された(図4)。
【0044】
手法2
カゼイン及びホエー蛋白質は、脱脂乳の透析を通じて阻害剤画分から分離された。蛋白質は透析チューブ内に残ったが、一方、他の低分子量成分と共に阻害剤は、該透析膜を通過した。透析手法は、阻害剤の希釈を生じ、それ故に該溶液は凍結乾燥され、そしてその固形は少量の水に溶解された。
【0045】
トランスグルタミナーゼのMaldi TOF分析
Maldi TOFで決定された場合のトランスグルタミナーゼの分子量は、37,900 Daであり、阻害されたトランスグルタミナーゼの分子量は、38,064 Daであった。該阻害剤の一部分のみがトランスグルタミナーゼに結合されたことがありうる故に、得られた質量は、該阻害剤の質量に対応しなければならないことはない。
【0046】
文献1 Ando, H. Adachi, M., Umeda, K., Matsuura, A., Nonaka. M., Uchino, R., Tnakaka, H 及びMotoki, M.、(1989年)、Agric. Biol. Chem、第53巻、第2613〜第2617頁。
文献2 Zhu, Y., Rinzema, A., Tramper, J., Bruin, E.de. 及びBol, J., (1998年)、Appl. Micr. Biotech.、第49巻、第251〜257頁。
文献3 Folk, J.E. 及びCole, P.W (1965年)、J. Biol. Chem. 第241巻、第2951頁。
文献4 Lorand, L., Lockridge, O.M., Campbell, L. K., Myhrman, R. 及びBruner−Lorand, J.、(1972年)、Anal. Biochem.、第44巻、第221〜第231頁。
文献5 Laemuli, U.K.、(1970年)、Nature、第227巻、第680〜第685頁。
【図面の簡単な説明】
【図1】加熱処理(3時間、80℃)前及び後の、細菌のトランスグルタミナーゼ(30μg/ml)での脱脂乳の架橋化。
レーン1 分子量マーカー
レーン2 未処理の脱脂乳+トランスグルタミナーゼ、時間=0分;
レーン3 未処理の脱脂乳+トランスグルタミナーゼ、時間=10分;
レーン4 未処理の脱脂乳+トランスグルタミナーゼ、時間=30分;
レーン5 未処理の脱脂乳+トランスグルタミナーゼ、時間=120分;
レーン6 加熱された脱脂乳+トランスグルタミナーゼ、時間=0分;
レーン7 加熱された脱脂乳+トランスグルタミナーゼ、時間=10分;
レーン8 加熱された脱脂乳+トランスグルタミナーゼ、時間=30分;
レーン9 加熱された脱脂乳+トランスグルタミナーゼ、時間=120分。
【図2】阻害剤画分でインキュベーション後の細菌のトランスグルタミナーゼの活性アッセイ。
図2A ホエー画分の限外濾過を通じて得られた阻害剤画分でのインキュベーション後の細菌のトランスグルタミナーゼ。
図2B ホエー画分のゲル濾過を通じて得られた阻害剤画分でのインキュベーション後の細菌のトランスグルタミナーゼ。
【図3】Biogel P2上での蛋白質不含の阻害剤画分の分離。阻害剤画分は、手法1によって得られた。阻害剤が溶出された位置は、図に示されている。
【図4】未処理の細菌のトランスグルタミナーゼでの、並びに蛋白質不含の阻害剤画分で予めインキュベートされた細菌のトランスグルタミナーゼでのカゼインの架橋化。
図4A 未処理のトランスグルタミナーゼでのカゼインの架橋化
レーン1 分子量マーカー
レーン2 トランスグルタミナーゼで架橋化後のカゼイン、時間=0分;
レーン3 トランスグルタミナーゼで架橋化後のカゼイン、時間=10分;
レーン4 トランスグルタミナーゼで架橋化後のカゼイン、時間=20分;
レーン5 トランスグルタミナーゼで架橋化後のカゼイン、時間=40分。
図4B 阻害剤で予めインキュベーション後のトランスグルタミナーゼでのカゼインの架橋化。
レーン1 分子量マーカー
レーン2 トランスグルタミナーゼで架橋化後のカゼイン、時間=0分;
レーン3 トランスグルタミナーゼで架橋化後のカゼイン、時間=10分;
レーン4 トランスグルタミナーゼで架橋化後のカゼイン、時間=20分;
レーン5 トランスグルタミナーゼで架橋化後のカゼイン、時間=40分。
【発明の属する技術分野】
本発明は、乳から得られうるトランスグルタミナーゼ阻害剤、乳から前記トランスグルタミナーゼ阻害剤を得るための方法、蛋白質の架橋化を調節する際に前記トランスグルタミナーゼ阻害剤を使用する方法、及び食品生産物又は医薬組成物においてそれを使用する方法、並びにある病気の治療のための薬剤の調製において前記トランスグルタミナーゼ阻害剤を使用する方法に向けられる。
【0002】
【従来の技術】
トランスグルタミナーゼ(プロテイン−グルタミン−γ−グルタミルトランスフェラーゼ、EC 2.3.2.13)は、蛋白質間に共有結合の架橋を導入し、それによって高分子量分子を生成するアシル転移反応を触媒する。トランスグルタミナーゼは、グルタミン残基とリシン残基の側鎖間のイソペプチド結合の形成を触媒する酵素群であり、それらの幾つかはCa2+依存である。蛋白質に結合したリシンが第1級アミン供与体として働く場合、該反応は蛋白質を架橋化するように働くε−(γ−グルタミル)−リスイソペプチド(ε−(γ−glutamyl)−lys isopeptide)結合の形成を結果として生じる。該生じた結合は、共有結合で、安定であり、かつ蛋白質分解に比較的に耐性があると考えられる。該酵素は、細菌、カビ、植物及びほ乳類などの種々の起源から単離されかつ精製されている(Zhu, Y., Rinzema, A., Tramper, J., J Appl. Microbial Biotechnol (1995年)、第44巻、第277〜第282頁)。種々の起源由来のトランスグルタミナーゼの生物学的役割及び構造的特徴は、非常に異なるが、それら全ては、架橋化反応を担う活性部位にシステインを含み、そしてそれ故に、蛋白質の架橋化はトランスグルタミナーゼの全ての型が共通に有している1つの特徴である。トランスグルタミナーゼのうち、ほ乳類及びヒト由来の血漿グルタミナーゼ(因子 XIIIa)は、最も研究された酵素の1つである。該酵素がフィブリン分子を架橋化して、血塊中のフィブリンネットワークの強さを増強する故に、この酵素は、血液凝固経路で重大な役割を果たす。同じくほ乳類及びヒトからの他の型のトランスグルタミナーゼは、一般に組織トランスグルタミナーゼとして記載されている。この型のトランスグルタミナーゼは、ハンチントン病、アポトーシス、セリアック病及びアルツハイマー病のような多くの過程に関与することが示されている。トランスグルタミナーゼが重要な役割を果たす他の過程は、皮膚の疾患、白内障、脊髄延髄の萎縮(ケネディー病)、(脊髄)小脳失調、室頂核脳幹の淡蒼球ルイ体萎縮、多発性硬化を含む中枢神経系の炎症性疾患、リウマチ様関節炎、糖尿病例えばインスリン依存性糖尿病、破傷風並びに他のクロストリジウム属に関連した症状、レッツ症候群、ヒト免疫不全ウィルス感染、及び炎症進行である。
【0003】
ストレプトベルティリウム(Streptovertillium)株由来のCa2+非依存性細菌のトランスグルタミナーゼの発見は、大量に該酵素を生産することの可能性の故に、トランスグルタミナーゼについての研究を大いに後押しした。該酵素が大量に利用可能になった故に、種々の技術分野で該酵素の応用への興味が現在増強している。
【0004】
トランスグルタミナーゼの応用の幾つかは、食品、及び食品のための蛋白質添加剤の調製にある。該酵素の蛋白質架橋化活性は、食品製品のテクスチャ及び構造並びに蛋白質の機能的特性を改善するために使用されることが出来る。欧州特許出願公開第0,610,649号明細書は、ヨーグルトの生産でトランスグルタミナーゼを使用することを記載している。国際公開第93/19,610号パンフレットは、乳にトランスグルタミナーゼを使用し、それによって改善された粘度を有する製品を提供することを記載している。
【0005】
トランスグルタミナーゼが関与する多くの生物学的工程及びトランスグルタミナーゼの増加する使用の故に、トランスグルタミナーゼの活性を修飾又は阻害する化合物に広範囲に及ぶ興味がある。いくつかの阻害剤、とりわけモノダンシルカダベリン、モノ−及びジアミン例えばシスタミン、プトレッシン、GABA(ガンマアミノ安息香酸)、N−ベンジルオキシカルボニル、5−デアゾ−4−オキソノルバリン、p−ニトロフェニルエステル、グリシンメチルエステル、硫酸銅及びトルブタミドが、種々の病理の治療で使用することが国際公開第99/65516号パンフレットに記載されている。アミン例えばスペルミン及びスペルミジンは、トランスグルタミナーゼの基質として言及されている。阻害剤例えばモノダンシルカダベリン、プトレッシン、スペルミン、スペルミジン及びグリシンメチルエステルは、競合反応を通じてトランスグルタミナーゼの蛋白質架橋化活性を阻害する第1アミンであり、それらはトランスグルタミナーゼ活性を阻害しない。他の周知のトランスグルタミナーゼ阻害剤例えばN−エチルマレイミド、ヨードアセテート、及びパラクロロ水銀安息香酸が、トランスグルタミナーゼの活性部位システインを共有結合してブロックすることによって働くことが知られている。しかしながら、これらの化合物は、毒性であるとして知られ、それ故に食品及び食品添加物の応用に適していない。特許文献に記載されている他のトランスグルタミナーゼ阻害剤は、イソキサゾール、イミダゾール(米国特許公報第5,098,707号明細書)、及びチアジアゾール(国際公開第99/45,027号パンフレット)である。
【0006】
トランスグルタミナーゼの天然の阻害剤は、少ない。ある特定の蛋白質が、トランスグルタミナーゼを阻害することが知られている(国際公開第95/17,426号パンフレット)。カビによって生成された抗菌薬剤、セルリニン(cerulinin)は、血漿トランスグルタミナーゼの天然の非蛋白質阻害剤として報告されている(Tymiak, A. A., Tuttle, J.G., Kimball, S.D., Wang, T. Lee, V.G. (1993年)、J. Antiobiot.、第46巻、第204〜206頁)。カビから単離されたアルタセノ酸(Alutacenoic acid)は、血漿トランスグルタミナーゼの強力な阻害剤としての活性をまた示す(Kogen, H., Kiho, T., Tago., K., Miyamoto, S., Fujioka, T., Otsuka, N., Suzuki−konagai, K., Ogita, T., (2000年)、J. Am. Chem. Soc. 第122巻、第18421〜第18430頁)。
【0007】
食品においてトランスグルタミナーゼを使用することの1つの不利点は、該酵素が活性型のままで存在する製品は、否定的な健康効果を有しうることである。従って、該酵素の活性は製品の消費の前に制御されることが好ましい。好ましくは、該酵素の制御は、該酵素が完全に阻害されるか又は不活性化される程度まで生じる。
【0008】
【発明が解決しようとする課題】
該酵素の不活性化は、該製品の熱処理によって達成されうる。しかしながら、該製品の熱処理は、多くの場合、該製品の特性に好ましくない変化をもたらしうる。食品の場合、このことは消費者にとってより魅力のない製品をもたらしうる。当業者に現在知られているトランスグルタミナーゼ阻害剤は、一般に、主としてそれらの毒性の故に許可されていない又はさもなければ食品の応用に不適切であると考えられている化合物又は組成物である。従って、食品での応用(すなわち食品等級)に適切であり、かつトランスグルタミナーゼの活性の有効な阻害を同時に提供し、一方製品又は消費者のいずれかに対して阻害剤の不利な効果が、少なくとも実質的に減少され又は存在しないトランスグルタミナーゼ阻害剤へのニーズが存在する。
【0009】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、乳がトランスグルタミナーゼの阻害剤を含むことをいま見出した。本発明者は、トランスグルタミナーゼでの脱脂乳の架橋化実験で、高分子量カゼインポリマーの形成のほんの非常に小さい程度を発見した。脱脂乳の強い加熱処理は、大きいポリマーの形成及びカゼインモノマーの消失によって観察されたように、架橋化のはるかに高い程度をもたらした。乳からのカゼイン及びホエー蛋白質の除去は、トランスグルタミナーゼ阻害活性が維持された画分をもたらした。本発明者は、この阻害剤が細菌のトランスグルタミナーゼを阻害するだけでなく、血液中に存在する2つのトランスグルタミナーゼの活性を阻害することにも有効であることをまた発見した。単離及び精製工程の組み合わせによって、該阻害剤は、該阻害活性が維持されたままで部分的に精製されることができ、従って得られた該画分はトランスグルタミナーゼの阻害に使用されうる。
【0010】
第1の観点において、本発明は、乳から、特に、乳から好ましくは脱脂乳から得られうるホエー画分から得られうるトランスグルタミナーゼ阻害剤を含む組成物を提供する。第1の態様では、該阻害剤は、(i)乳を酸処理に付し、そして引き続き酸処理によって沈殿した蛋白質を除去してホエー画分を残すことによって、又は(ii)乳から凝乳を形成し(例えば微生物若しくはプロテアーゼの使用によって)、遠心分離工程で前記凝乳を該ホエーから分離し、引き続き得られた該ホエーを限外濾過工程に付すことによって得られるホエーから得られうる。代わりの実施態様では、該阻害剤は乳をダイアフィルトレーション工程に付すことによって得られうる。
【0011】
乳から得られうるホエー画分を限外濾過工程に付すことによって、トランスグルタミナーゼ阻害剤を含む望ましい画分が、ホエー蛋白質から分離される透過液中に得られる。好ましくは、該ホエー画分は10KDaのカット・オフを有する膜を使用し限外濾過される。膜のカット・オフの限界は、2つの主なホエー蛋白質 α−ラクトアルブミン(14.1kDa)及びβ−ラクトグロブリン(18kDa)を除去する能力によって決定される。本発明に従う阻害剤は、約200Daのオーダーの分子量を有すると考えられる故に、適切なカット・オフは1kDaからであり、しかし2、3、4または5〜10kDaのカット・オフがまた適切である。
【0012】
トランスグルタミナーゼ阻害剤を含む望ましい画分がダイアフィルトレーションによって得られる場合、ダイアフィルトレーション膜は約3kDaのカット・オフを有することが好ましい。しかしながら、ダイアフィルトレーションのための適切な膜は、1〜10kDaの範囲の限外濾過のための膜と同じ範囲のカット・オフを有する。
【0013】
第2の観点において、本発明は、乳から、特にホエー画分からトランスグルタミナーゼ阻害剤を含む組成物を得るための方法であって、乳から凝乳を形成し、遠心分離工程で前記凝乳をホエーから分離し、引き続き前記ホエーを限外濾過工程に付す工程を含む方法を提供する。好ましくは、凝乳は、乳を食品用の酸例えば塩酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、乳酸またはグルコン(デルタグルコン)で酸性化することによって、あるいは酸生成微生物の添加によって形成される。あるいは、工程は、脱脂乳をダイアフィルトレーション工程に付すことを含む。
【0014】
米国特許第5,198,213号明細書では、ホエーの最初の画分(該最初の画分は高分子量タンパク質を含む)は、測定可能であるが低いレベルの免疫学的に活性なイムノグロブリン及び他の病理特異的抗体を含むことが記載されている。トランスグルタミナーゼに関連づけられた低分子量化合物を含むホエー画分の何らかの有益な応用への言及はない。
【0015】
国際公開第98/48,640号パンフレットは、インスリンのない蛋白質画分を開示し、それはより大きい蛋白質からなる。これらの画分は、乳児用調製物及び他の栄養調製物で使用される。
【0016】
国際公開第98/09,717号パンフレットでは、特別の分離技術が記載されている。実施例3及び4では、蛋白質は乳及びホエーからそれぞれ回収される。前記生成物の本発明に従う特別の使用は記載されていず、特に低分子量画分について記載されていない。
【0017】
本発明に従うトランスグルタミナーゼ阻害剤を含む組成物(それはトランスグルタミナーゼ阻害剤とも呼ばれる)は、低分子量物質であり、好ましくは約200ダルトンのオーダーの分子量を有すると考えられている。
【0018】
本発明に従うトランスグルタミナーゼ阻害剤の特性に関して、該阻害剤は自由な金属イオンではないことが見出された。
【0019】
本発明に従う阻害剤は、カゼイン及び他の蛋白質の架橋化において、及びトランスグルタミナーゼのいくつかの活性アッセイにおいて、トランスグルタミナーゼの活性を阻害する。該阻害剤は、ホエー画分の形で使用されうる。該阻害剤を含む画分を濃縮工程に付すことが好ましい。適切な濃縮工程は、凍結乾燥又はスプレー乾燥である。本発明の実施態様では、該阻害剤は、濃縮された形で得られるが、該阻害剤の阻害能力は実質的に影響を受けない。凍結乾燥工程からの及び/又はスプレー乾燥工程からの乾燥した生成物の再溶解は、トランスグルタミナーゼに対する阻害活性がほとんど保持されているという結果を生じる。
【0020】
本発明の更なる実施態様では、該阻害剤は、さらに精製されうる。適切な精製工程は、ゲル濾過及び/又はイオン交換技術である。該阻害剤を精製する場合、好ましくは、ラクトースの少なくとも一部が除去される。
【0021】
本発明に従う阻害剤は、幅広い温度範囲で安定である。該阻害剤が得られる、単離及び精製及び濃縮工程は、約80℃までの温度で実施しうる。この温度範囲の上限を超えないように注意されるべきである。上限温度値を超すことは、トランスグルタミナーゼ阻害剤の活性の損失又は望ましくない減少の結果を一般に生じる。好ましくは、該阻害剤は70℃を超えた、より好ましくは60℃を超えた温度に加熱されない。
【0022】
本発明に従う阻害剤は、乳から単離されうる。本発明に従う阻害剤を含む画分が得られうる乳は、動物から、及び好ましくは家畜例えば乳牛、ヤギ、羊、馬、ラクダ、バッファロー、鹿、ロバ、トナカイに由来する。原理的に、適切な起源としてヒト乳を使用することもまた可能である。好ましい実施態様では、該阻害剤は、乳牛の乳から得られる。好ましくは、乳は、未処理又は少なくとも強く加熱処理されていない。脂肪画分は、例えば遠心分離によって好ましくは除去される。蛋白質は、好ましくは限外濾過、沈殿及び/又はダイアフィルトレーション又はそれらの技術の組み合わせを通じて除去される。該阻害剤組成物は、限外濾過及びダイアフィルトレーション工程の透過液内にある。
【0023】
本発明に従う阻害剤は、MALDI−TOF分析によって示されたように、トランスグルタミナーゼに実質的に共有結合の形で結合する。その上、該阻害剤は、トランスグルタミナーゼにほぼ当量で結合することがタイトレーション実験によりわかった。任意の特定の理論に拘束される事を望むことなしに、本発明に従う阻害剤は、トランスグルタミナーゼシステイン残基に結合されると考えられる。
【0024】
本発明は、食品及び食品生産物の生産に応用をみつける。トランスグルタミナーゼが、蛋白質を含む食品(例えば、乳製品(ヨーグルト)、肉又は魚)の構造を改善するために、蛋白質の架橋化で使用される場合、トランスグルタミナーゼ活性は、本発明に従う阻害剤の添加によって停止又は減少されうる。一つの観点では、本発明は、食品の生産におけるトランスグルタミナーゼ阻害剤の使用に関する。
【0025】
本発明に従う阻害剤の重要な観点は、架橋化の程度の調節で阻害剤を使用することである。β−カゼインの部分的な架橋化は、加熱された場合ゲルの形成を生じ、ところが架橋化されていないβ−カゼイン又は強度に架橋化されたβ−カゼインは加熱でゲルを形成しないことがわかった。架橋化の程度の調節は、本発明に従う阻害剤の添加によって簡単に達成されるが、活性の他の手段(例えば加熱を通じて)が蛋白質機能性を非常に良く破壊する。その上、本発明に従う阻害剤は、制御された放出例えばカプセル化を可能にする形で使用されうる。基質への(マイクロ)カプセル化された阻害剤と組み合わせたトランスグルタミナーゼの添加は、トランスグルタミナーゼ及び阻害剤の両方の均一な分散という結果を生じることが容易に理解される。すると、蛋白質の架橋化が、該阻害剤の放出特性によって左右される。架橋後の製品が粘性又はゲル状である場合、これは有利である。
【0026】
更なる観点で、本発明は、本発明に従うトランスグルタミナーゼ阻害剤を含む医薬組成物に関する。該医薬組成物は、何らか様式トランスグルタミナーゼ活性に伴う又は関連した病気の治療に有利に使用されうる。本発明に従う医薬組成物は、薬剤的に適用可能な形で少なくとも一つのトランスグルタミナーゼ阻害剤を、任意的に薬剤的に許容される担体と組合せて、含むことができる。これらの組成物は、それらの意図された目的を達成する任意の手段によって投与されうる。トランスグルタミナーゼ活性によって仲介される疾病の治療のための本発明に従うトランスグルタミナーゼ阻害剤の投与の量及び管理は、これらの疾病を治療する当業者によって容易に決定されうる。
【0027】
本発明は、トランスグルタミナーゼが役割を果たす疾病例えばアルツハイマー病、血友病、アポトーシス、セリアック病、ハンチントン病、皮膚の疾患、白内障、脊髄延髄の萎縮(ケネディー病)、(脊髄)小脳失調、室頂核脳幹の淡蒼球ルイ体萎縮、多発性硬化を含む、中枢神経系の炎症性疾患、リウマチ様関節炎、糖尿病例えばインスリン依存性糖尿病、破傷風並びに他のクロストリジウム属に関連した症状、レッツ症候群、ヒト免疫不全ウィルス感染、及び炎症進行の治療のための薬剤の調製でトランスグルタミナーゼ阻害剤を使用することにさらに関する。
【0028】
【実施例】
材料及び方法
材料
Source Q、Source S及びSuperdex peptide 30は、ファルマシア社(スウェーデン、ウプサラ)から購入された。Biogel P2は、バイオ・ラド社から買われた。N,N−ジメチルカゼイン、カゼイン、Cbz−グルタミニルグリシン、ヒドロキシルアミン及びテンジクネズミ肝臓トランスグルタミナーゼが、シグマ社から購入された。全ての他の試薬は、分析等級であった。脱脂乳は地元の商店から、新鮮な乳は農場から直接得られた。Streptovertillium mobaraenseは、文献1に記載されているように培養され、そしてトランスグルタミナーゼの精製が、文献2に従いおこなわれた。ヒト血漿トランスグルタミナーゼは、ベーリング・ヴェルケ(Behring Werke)社から得られた。
【0029】
脱脂乳蛋白質の架橋化
脱脂乳蛋白質は、1ml脱脂乳当たり30μgの細菌のトランスグルタミナーゼの添加によって架橋化された。対照として、脱脂乳は、トランスグルタミナーゼの添加の前に、80℃で、3時間インキュベートされた。インキュベーションは37℃で行われ、そしてサンプルは時間間隔を置いて採取された。架橋化反応は、80℃で5分間インキュベーションすることによって停止された。架橋化反応の分析は、ゲル電気泳動によって行われた。
【0030】
活性アッセイを使用したトランスグルタミナーゼ阻害の測定
細菌及びテンジクネズミのトランスグルタミナーゼ活性の阻害の定量分析は、ヒドロキサメート・アッセイ(文献3)で決定された。30μl (1mg/ml)トランスグルタミナーゼが、種々の量の阻害剤画分(0〜30μl)と共にインキュベートされた。該混合物は、トランスグルタミナーゼへの阻害剤の結合を確実にするために、室温で30分間インキュベートされた。活性測定は、阻害された画分で行われた。
【0031】
血漿トランスグルタミナーゼ活性の阻害の定量分析は、ローランド(文献4)に従い、ジメチル化されたカゼイン中にモノダンシルカダベリンを加えることによって決定された。この酵素はヒドロキサメート・アッセイで何ら活性を示さない故に、血漿トランスグルタミナーゼはこのアッセイで測定された。還元を通じるトランスグルタミナーゼからの阻害の起りうる除去を防ぐために、ジチオスレイトールが該反応混合物から除去された。阻害は、活性の相対的な減少から計算された。
【0032】
架橋化実験を使用したトランスグルタミナーゼ阻害の測定
細菌のトランスグルタミナーゼ活性の阻害の定性分析は、カゼインの架橋化で決定された。20μgのトランスグルタミナーゼが、200μlの限外濾過された阻害剤画分と共にインキュベートされた。該混合物は、トランスグルタミナーゼへの阻害剤の結合を確実にするために、室温で、30分間インキュベートされた。標準反応混合物(2mlの総体積)は、50mM 酢酸ナトリウム(pH6)、10mg/ml カゼイン及び10μgの予めインキュベートされたトランスグルタミナーゼを含んだ。インキュベーションは40℃で行われ、そしてサンプルは時間間隔を置いて採取された。該反応は、80℃で5分間インキュベーションすることによって停止された。架橋化反応の分析は、ゲル電気泳動によって行われた。
【0033】
ポリアクリルアミド−ゲル電気泳動(SDS−PAGE)。サブユニット分子量が、出来上がったゲル及びMini Protean 装置(バイオ・ラド社)を使用し、ラエムリ(文献5)に従い、SDS−PAGEによって、変性条件下で決定された。酵素又は反応混合物サンプルは、2%SDS及び1%ジチオスレイトール中で、5分間、100℃のインキュベーションによって変性された。ゲルは、Coomassie Brilliant Blue G250で蛋白質について染色された。高分子量検定キット(ファルマシア社)が、分子量を得るために使用された。
【0034】
実質的に蛋白質のない阻害剤画分の調製
手法1
脱脂乳が、塩酸の添加によってpH4.4にされた。沈殿したカゼインは、遠心分離(20分、25000g)によって除去された。澄んだ上清が、10kDa膜(アミコン社)を使用し限外濾過された。濃縮されたホエー蛋白質が除去され、そして膜を通過した溶液が、凍結されすなわち凍結乾燥された。
【0035】
阻害剤は、ラクトース及び他の非阻害剤成分を除去するために、Superdex 30ペプチドカラム又はBiogel P2でのゲル濾過によって更に精製されることができた。
【0036】
手法2
1リットルの脱脂乳が、3500 Daのカット・オフを有する透析チューブを使用し、5リットルの脱イオン化された水に対して透析された。24時間透析後、蛋白質画分を含む透析チューブが除去された。3500よりも小さい大きさの分子を含む溶液は、トランスグルタミナーゼ阻害剤を含んだ。この画分は、阻害剤を濃縮するために凍結乾燥されうる。該阻害剤の溶液は、該凍結乾燥されたサンプルを水に溶解することによって調製されうる。残りの非溶解性化合物は、遠心分離によって除去された。
【0037】
阻害の前及び後のトランスグルタミナーゼのMaldi TOF分析
細菌のトランスグルタミナーゼ(1mg)が、手法1によって得られた阻害画分の10mlでインキュベートされた。室温で30分間のインキュベーション後に、トランスグルタミナーゼの阻害は、ヒドロキサメート・アッセイで試験された。該阻害されたトランスグルタミナーゼは、結合していない成分を除き且つ細菌のトランスグルタミナーゼを濃縮するために、30kDa アミコン製フィルターを使用して限外濾過された。該阻害されたトランスグルタミナーゼ及びブランクの分子量が、Maldi TOFを使用し測定された。
【0038】
結果
脱脂乳蛋白質の架橋化
脱脂乳の架橋化後のSDS/PAGE分析は、ほんの少しの架橋の兆しを示した(図1)。しかしながら、80℃で3時間の加熱処理後の脱脂乳は、カゼインの通常の架橋化を示した。加熱されていない脱脂乳へのトランスグルタミナーゼの更なる添加は、加熱された脱脂乳と同等の架橋化の結果を生じた(データは示されていない)。
【0039】
活性アッセイを使用したトランスグルタミナーゼ阻害の測定
阻害剤画分でのインキュベーション後の細菌のトランスグルタミナーゼの活性は、ヒドロキサメート・アッセイで観察できたように、低下された(図2A)。使用された阻害剤画分のタイプに依存して、画分に存在する成分は活性測定で妨害の原因であった。これらの成分は、トランスグルタミナーゼ活性の吸収測定を邪魔する色形成を生じた。ゲル濾過上での阻害剤のさらなる精製は、妨害化合物を除去し、これは直線的な阻害カーブをもたらした(図2B)。
【0040】
テンジクネズミ肝臓トランスグルタミナーゼは、同様の結果を与えた(データは示されていない)。
【0041】
阻害剤画分でのインキュベーション後の血漿トランスグルタミナーゼの活性は、蛍光アッセイで観察できたように、低下された(データは示されていない)。この結果は、該阻害剤によって血漿トランスグルタミナーゼを完全に不活性化することが可能であることを明らかに示している。
【0042】
架橋化実験を使用したトランスグルタミナーゼ阻害の測定
カゼインの架橋化は、手法1の後に得られた画分での阻害後の細菌のトランスグルタミナーゼで観察されなかった(図3)。未処理のトランスグルタミナーゼでの対照は、正常な架橋化を示した。
【0043】
蛋白質不含の阻害剤画分の調製
手法1
カゼインは、pH 4.4で沈殿後に遠心分離によって除去された。ホエー蛋白質画分は、引き続き10kDa限外濾過ユニット(アミコン社)を使用し限外濾過された。該膜を通過した低分子量画分は、図2に示されるようにトランスグルタミナーゼ阻害を示した。この画分の濃縮は、溶液の凍結乾燥、そして該固形を少量の水に溶解することによって達成された。該濃縮された画分は、Biogel P2でさらに精製された(図4)。
【0044】
手法2
カゼイン及びホエー蛋白質は、脱脂乳の透析を通じて阻害剤画分から分離された。蛋白質は透析チューブ内に残ったが、一方、他の低分子量成分と共に阻害剤は、該透析膜を通過した。透析手法は、阻害剤の希釈を生じ、それ故に該溶液は凍結乾燥され、そしてその固形は少量の水に溶解された。
【0045】
トランスグルタミナーゼのMaldi TOF分析
Maldi TOFで決定された場合のトランスグルタミナーゼの分子量は、37,900 Daであり、阻害されたトランスグルタミナーゼの分子量は、38,064 Daであった。該阻害剤の一部分のみがトランスグルタミナーゼに結合されたことがありうる故に、得られた質量は、該阻害剤の質量に対応しなければならないことはない。
【0046】
文献1 Ando, H. Adachi, M., Umeda, K., Matsuura, A., Nonaka. M., Uchino, R., Tnakaka, H 及びMotoki, M.、(1989年)、Agric. Biol. Chem、第53巻、第2613〜第2617頁。
文献2 Zhu, Y., Rinzema, A., Tramper, J., Bruin, E.de. 及びBol, J., (1998年)、Appl. Micr. Biotech.、第49巻、第251〜257頁。
文献3 Folk, J.E. 及びCole, P.W (1965年)、J. Biol. Chem. 第241巻、第2951頁。
文献4 Lorand, L., Lockridge, O.M., Campbell, L. K., Myhrman, R. 及びBruner−Lorand, J.、(1972年)、Anal. Biochem.、第44巻、第221〜第231頁。
文献5 Laemuli, U.K.、(1970年)、Nature、第227巻、第680〜第685頁。
【図面の簡単な説明】
【図1】加熱処理(3時間、80℃)前及び後の、細菌のトランスグルタミナーゼ(30μg/ml)での脱脂乳の架橋化。
レーン1 分子量マーカー
レーン2 未処理の脱脂乳+トランスグルタミナーゼ、時間=0分;
レーン3 未処理の脱脂乳+トランスグルタミナーゼ、時間=10分;
レーン4 未処理の脱脂乳+トランスグルタミナーゼ、時間=30分;
レーン5 未処理の脱脂乳+トランスグルタミナーゼ、時間=120分;
レーン6 加熱された脱脂乳+トランスグルタミナーゼ、時間=0分;
レーン7 加熱された脱脂乳+トランスグルタミナーゼ、時間=10分;
レーン8 加熱された脱脂乳+トランスグルタミナーゼ、時間=30分;
レーン9 加熱された脱脂乳+トランスグルタミナーゼ、時間=120分。
【図2】阻害剤画分でインキュベーション後の細菌のトランスグルタミナーゼの活性アッセイ。
図2A ホエー画分の限外濾過を通じて得られた阻害剤画分でのインキュベーション後の細菌のトランスグルタミナーゼ。
図2B ホエー画分のゲル濾過を通じて得られた阻害剤画分でのインキュベーション後の細菌のトランスグルタミナーゼ。
【図3】Biogel P2上での蛋白質不含の阻害剤画分の分離。阻害剤画分は、手法1によって得られた。阻害剤が溶出された位置は、図に示されている。
【図4】未処理の細菌のトランスグルタミナーゼでの、並びに蛋白質不含の阻害剤画分で予めインキュベートされた細菌のトランスグルタミナーゼでのカゼインの架橋化。
図4A 未処理のトランスグルタミナーゼでのカゼインの架橋化
レーン1 分子量マーカー
レーン2 トランスグルタミナーゼで架橋化後のカゼイン、時間=0分;
レーン3 トランスグルタミナーゼで架橋化後のカゼイン、時間=10分;
レーン4 トランスグルタミナーゼで架橋化後のカゼイン、時間=20分;
レーン5 トランスグルタミナーゼで架橋化後のカゼイン、時間=40分。
図4B 阻害剤で予めインキュベーション後のトランスグルタミナーゼでのカゼインの架橋化。
レーン1 分子量マーカー
レーン2 トランスグルタミナーゼで架橋化後のカゼイン、時間=0分;
レーン3 トランスグルタミナーゼで架橋化後のカゼイン、時間=10分;
レーン4 トランスグルタミナーゼで架橋化後のカゼイン、時間=20分;
レーン5 トランスグルタミナーゼで架橋化後のカゼイン、時間=40分。
Claims (18)
- 乳から得られうるトランスグルタミナーゼ阻害剤を含む組成物。
- 請求項1に記載のトランスグルタミナーゼ阻害剤を含む組成物であって、脱脂乳から凝乳を形成し、遠心分離工程で前記凝乳をホエーから分離し、引き続き前記ホエーを限外濾過工程に付すことによって、脱脂乳から得られうるホエー画分から得られうる組成物。
- 請求項1に記載のトランスグルタミナーゼ阻害剤を含む組成物であって、脱脂乳をダイアフィルトレーション工程に付すことによって得られうる組成物。
- 請求項2または3に記載のトランスグルタミナーゼ阻害剤であって、前記限外濾過工程からまたはダイアフィルトレーション工程から得られた濾液が、濃縮工程にさらにふされるところのトランスグルタミナーゼ阻害剤。
- 請求項2に記載のトランスグルタミナーゼ阻害剤であって、前記濃縮工程が凍結乾燥を含むところのトランスグルタミナーゼ阻害剤。
- 請求項2または3に記載のトランスグルタミナーゼ阻害剤であって、前記ホエー画分が、ゲル濾過及び/又はイオン交換クロマトグラフィーを含む精製工程で少なくとも部分的にされに精製されているところのトランスグルタミナーゼ阻害剤。
- 請求項5または6に記載のトランスグルタミナーゼ阻害剤であって、前記精製がラクトースの少なくとも一部の除去を含むところのトランスグルタミナーゼ阻害剤。
- 請求項2に記載のトランスグルタミナーゼ阻害剤であって、凝乳が、食品用酸での前記乳の酸性化によって又は酸を精製する微生物の添加によって形成されるところのトランスグルタミナーゼ阻害剤。
- 請求項2に記載のトランスグルタミナーゼ阻害剤であって、前記乳が2.8〜5.2、好ましくは3〜5、より好ましくは4.0〜4.6のpHに酸性化されるところのトランスグルタミナーゼ阻害剤。
- 請求項2又は請求項3に記載のトランスグルタミナーゼ阻害剤であって、前記乳が、家畜好ましくは乳牛、ヤギ、羊、鹿、ロバ、トナカイ、又はヒトから得られるところのトランスグルタミナーゼ阻害剤。
- 請求項10に記載のトランスグルタミナーゼ阻害剤であって、前記乳が80℃未満の温度で加熱処理されているところのトランスグルタミナーゼ阻害剤。
- 請求項1〜11のいずれか一項に記載のトランスグルタミナーゼ阻害剤であって、約200ダルトンのオーダーの大きさの分子量を有するトランスグルタミナーゼ阻害剤。
- 乳から、特にホエー画分からのトランスグルタミナーゼ阻害剤を含む組成物を得るための方法であって、乳から凝乳を形成し、遠心分離工程で前記凝乳をホエーから分離するステップを含む方法。
- 脱脂乳をダイアフィルトレーション工程に付すことを含む、トランスグルタミナーゼ阻害剤を含む組成物を得る方法。
- 蛋白質の架橋化においてトランスグルタミナーゼの活性を制御するにおいて、請求項1〜12のいずれか一項に記載の又は請求項13若しくは14に記載の方法によって得られうるトランスグルタミナーゼ阻害剤を含む組成物を使用する方法。
- 請求項1〜12のいずれか一項に記載の又は請求項13若しくは14に記載の方法によって得られうるトランスグルタミナーゼ阻害剤を含む組成物を、食品の生産において使用する方法
- 請求項1〜12のいずれか一項に記載の又は請求項13若しくは14に記載の方法によって得られうるトランスグルタミナーゼ阻害剤を含む組成物を含む医薬組成物。
- 請求項1〜12のいずれか一項に記載の又は請求項13若しくは14に記載の方法によって得られうるトランスグルタミナーゼ阻害剤を含む組成物を、アルツハイマー病、血友病、アポトーシス、セリアック病、ハンチントン病、皮膚の疾患、白内障、脊髄延髄の萎縮(ケネディー病)、(脊髄)小脳失調、室頂核脳幹の淡蒼球ルイ体萎縮、多発性硬化を含む中枢神経系の炎症性疾患、リウマチ様関節炎、糖尿病例えばインスリン依存性糖尿病、破傷風並びに他のクロストリジウム属に関連した症状、レッツ症候群、ヒト免疫不全ウィルス感染、及び炎症進行の処置のための薬剤の調製において使用する方法。
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