KR20080108797A

KR20080108797A - Ｅｇｃｇ를 포함하는 트란스글루타미나제 억제제 및 그의제조방법

Info

Publication number: KR20080108797A
Application number: KR1020070056812A
Authority: KR
Inventors: 김수열; 정경채
Original assignee: 국립암센터
Priority date: 2007-06-11
Filing date: 2007-06-11
Publication date: 2008-12-16
Also published as: EP2155191A1; EP2155191A4; CN101686961A; WO2008153319A1; US20100144860A1; JP2010530226A

Abstract

본 발명은 에피갈로카테킨 갈레이트(epigallocatechin gallate, 이하 EGCG라 함)를 포함하는 트란스글루타미나제 억제제에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 이상 발현의 경우 질병의 병리적 기전에 관여하는 트란스글루타미나제의 작용을 억제하기 위한 EGCG를 포함하는 트란스글루타미나제 억제제와 이들의 신규한 용도에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, EGCG를 활성 성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 트란스글루타미나제 억제제 및 트란스글루타미나제의 억제방법을 제공할 수 있다. 본 발명에 따른 EGCG를 이용하여 트란스글루타미나제를 억제하는 신규한 방법은 트란스글루타미나제가 이상 발현되는 질환을 가진 대상에게 안전한 방법으로 부작용없이 용이하게 적용되어 트란스글루타미나제를 억제하는 효과를 얻을 수 있다.

에피갈로카테킨 갈레이트, EGCG, 트란스글루타미나제

Description

ＥＧＣＧ를 포함하는 트란스글루타미나제 억제제 및 그의 제조방법{Transglutaminase inhibitor comprising EGCG and a method for producing thereof}

도 1은 트란스글루타미나제가 [1,4,-¹⁴C] 푸트레신을 숙시닐레이티드 카제인에 결합시키는 것을 측정하여, EGCG가 푸트레신과 경쟁하여 그 반응을 억제하는 것을 관찰한 EGCG의 트란스글루타미나제 활성도 억제의 in vitro 시험에 대한 그래프이다.

본 발명은 에피갈로카테킨 갈레이트(EGCG)를 포함하는 트란스글루타미나제 억제제에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 이상 발현의 경우 질병의 병리적 기전에 관여하는 트란스글루타미나제의 작용을 억제하기 위한 EGCG를 포함하는 트란스글루타미나제 억제제와 이들의 신규한 용도에 관한 것이다.

트란스글루타미나제(Transglutaminase)는 정상적인 상황에서는 혈액 응고나 상처 치유 등의 보호적 작용을 하는 효소이다. 그러나, 그 발현이 조절 받지 못하는 경우에는 많은 질병의 병리적 기전에서 주요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다(종설. Soo-Youl Kim : New Target Against Inflammatory Diseases: Transglutaminase 2.　 Archivum Immunologiae & Therapiae Experimentalis 52, 332-337, 2004).

특히 염증을 동반하는 질병, 즉 퇴행성 관절염 (rheumatoid arthritis), 당뇨병 (diabetes), 자가면역 근육염 (inflammatory myositis), 동맥경화 (atherosclerosis), 뇌졸증 (stroke), 간경화 (liver cirrhosis), 유방암 (breast cancer), 알츠하이머 (Alzheimer), 파킨슨 (Parkinson), 헌팅턴 (Huntington), 뇌막염 (encephalitis) 및 염증성 위궤양 (Celiac disease) 등에서 트란스글루타미나제의 발현이 많이 증가 된다. 또한, 암의 전이(metastasis), 화학적 내성(chemo-resistance), 방사선내성(radio-resistance)에서도 NF-κB의 발현 증가 및 트란스글루타미나제의 발현 증가가 관찰되었다(Soo-Youl Kim. Transglutaminase 2 in inflammation. Front Biosci . 11, 3026-3035, 2006).

아직까지 암의 화학적 내성과 트란스글루타미나제가 어떻게 연관되어 있는지는 밝혀지지 않고 있으나, 화학적 내성을 가지는 유방암 세포주에 대해 트란스글루타미나제 발현을 억제하는 경,우 암세포가 항암제에 민감하게 반응하여 사멸되는 것으로 드러났다(Antonyak et al., Augmentation of tissue transglutaminase expression and activation by epidermal growth factor inhibit doxorubicin-induced apoptosis in human breast cancer cells. J Biol Chem. 2004 Oct 1;279(40):41461-7.; Dae-Seok Kim et al. Reversal of Drug Resistance in Breast Cancer Cells by Transglutaminase 2 Inhibition and Nuclear Factor-KB Inactivation. Cancer Res. 2006. in press).

또한, 최근 트란스글루타미나제가 활성화되는 분자수준의 병리기전이 밝혀지면서, 트란스글루타미나제 억제의 타당성이 한층 더 구체화되었다(Key Chung Park, Kyung Cheon Chung, Yoon-Seong Kim, Jongmin Lee, Tong H. Joh, and　 Soo-Youl Kim. Transglutaminase 2 induces nitric oxide synthesis in BV-2 microglia.　 Biochem. Biophys . Res . Commun . 323, 1055-1062, 2004; Jongmin Lee,Yoon-Seong Kim, Dong-Hee Choi, Moon S. Bang, Tay R. Han , Tong H. Joh, and Soo-Youl Kim. Transglutaminase 2 induces NF-κB activation via a novel pathway in BV-2 microglia.　 J. Biol . Chem . 279, 53725-53735, 2004; ; Dae-Seok Kim et al. Reversal of Drug Resistance in Breast Cancer Cells by Transglutaminase 2 Inhibition and Nuclear Factor-KB Inactivation. Cancer Res. 2006. in press).

염증은 주로 NF-κB 전사 물질의 활성화에 기인한다. NF-κB는 신호 전달체계에 따른 카이네이즈(kinase)들에 의해 활성화되는 것으로 알려졌다. 하지만 카이네이즈의 도움없이도 NF-κB의 활성화가 이루어지는 것이 알려지면서, 카이네이즈 억제제(kinase inhibitor)들의 실효성이 감소하게 되었다(Tergaonkar et al., IkappaB kinase-independent IkappaBalpha degradation pathway: functional NF-kappaB activity and implications for cancer therapy. Mol Cell Biol. 2003 Nov;23(22):8070-83.).

본 발명자는, 이전의 연구에서 트란스글루타미나제가 카이네이즈들(IKK, NAK) 도움없이, I-κBα를 교결합하여 NF-κB를 활성화 시킨다는 것을 밝힌바 있다(Jongmin Lee, et al. Transglutaminase 2 induces NF-kB activation via a novel pathway in BV-2 microglia.　 J. Biol . Chem . 279, 53725-53735, 2004). 트란스글루타미나제는 칼슘의존성 효소이므로 세포 내 칼슘의 증가만으로도 NF-κB를 활성화시킬 수 있는 것이다.

염증반응에서 NF-κB 전사인자의 활성으로 트란스글루타미나제를 포함하는 염증성 인자들과 그 억제제인 I-κBα의 발현이 증가되므로, 정상적인 경우에는 I-κBα에 의해 NF-κB의 연속활성이 이루어지지 않지만, 만성 염증질환에서는 계속해서 NF-κB가 활성화된다. 흥미로운 현상은 TNF-a 또는 LPS(lipopolysaccharide) 등에 의한 NF-κB의 활성으로 트란스글루타미나제의 발현이 유도된다는 것이다. 따라서 비정상적으로 활성화된 트란스글루타미나제가 염증 세포에서 NF-κB를 직접 활성화시키거나, 활성화된 NF-κB를 더욱 유지시킴으로써 염증을 지속시키는 역할을 할 것으로 예상된다(도 1). 또한 이러한 악성 회로는 암 조직에서 암의 전이 및 약물저항성을 유발하는 주원인이 될 수 있다(Jongmin Lee, et al. Transglutaminase 2 induces NF-kB activation via a novel pathway in BV-2 microglia.　 J. Biol . Chem . 279, 53725-53735, 2004).

따라서, 트란스글루타미나제의 억제제는 NF-κB의 연속 고리를 끊는 중요한 물질이 될 수 있으며, 본 발명자가 보여 주었던 스테로이드제제를 대체할 만한 효과는 바로 여기에 근거한 것으로 사료 된다(Sohn, J., Kim, T.-I., Yoon, Y.-H., and Kim, S.-Y.: Transglutaminase Inhibitor: A New Anti-Inflammatory Approach in Allergic Conjunctivitis. J. Clin . Invest . 111, 121-8, 2003).

트란스글루타미나제 활성을 억제하는 물질로는 아민 화합물(amine compound)이 알려져 있으며, 대표적으로 시스타민(cystamine, nature Genetics 18, 111-117, 1998; Nature Medicine 8, 143-149, 2002)과 푸트레신(putrescine)이다. 또한, 모노단실카다베린(monodansylcadaverine) (J. Med. Chem. 15, 674-675, 1972), w-디벤질아미노알킬아민(w-dibenzylaminoalkylamine)(J. Med. Chem. 18, 278-284, 1975), 3-할로-4,5-디하이드로이소자졸(3-halo-4,5-dihydroisoxazole)(Mol. Pharmacol. 35, 701-706, 1989), 2-[(2-oxopropyl)thio]imidazolium derivatives (Blood, 75, 1455-1459, 1990)등의 화학적 억제제들이 개발되어 있으나, 모두 생체에서 비특이적으로 다른 효소의 억제를 유발하는 독성이 알려져 있다.

따라서, 안전하고 효과적인 트란스글루타미나제 특이적인 억제제의 개발이 요구되고 있다. 최근, 손 등은 기니픽에 꽃가루를 이용한 눈 알레르기 모델에서, 펩타이드로 만든 트란스글루타미나제 억제제를 사용해 스테로이드 수준의 효과를 거두는데 성공했다(Sohn, J., Kim, T.-I., Yoon, Y.-H., and Kim, S.-Y.: Transglutaminase Inhibitor: A New Anti-Inflammatory Approach in Allergic Conjunctivitis. J. Clin . Invest . 111, 121-8, 2003). 안티플라민(anti-flammin) 단백질(PLA2 억제제)과 엘라핀(elafin)이라는 단백질(아주 강력한 트란스글루타미나제 기질, Nara, K., et al. 1994. Elastase inhibitor elafin is a new type of proteinase inhibitor which has a transglutaminase-mediated anchoring sequence termed "cementoin". J Biochem (Tokyo). 115:441-448)에서 트란스글루타미나제 촉매 부위를 흉내내어 합성한 펩타이드를 사용하였다. 특히 염증을 동반하는 질병들에서 트란스글루타미나제의 발현이 많이 증가되며, 이러한 질병의 예로서 퇴행성 관절염, 당뇨병, 자가 면역 근육염, 동맥경화, 뇌졸중, 간경화, 악성유방암, 뇌막염, 염증성 위궤양 등이 있다.

상기한 화합물들 외에도 다른 화학적 억제제들이 개발되었지만 모두 생체적으로 이용되는 경우 비특이적인 다른 효소의 억제를 유발하는 독성이 알려지고 있는 실정이다. 본 발명자에 의해 이전에 제조된 펩티드 억제제가 트란스글루타미나제의 억제제로 유효하나(대한민국 특허출원 제10-2006-98921호), 비용과 안전성면에서 그 실용화에는 여전히 문제들이 남아 있다.

한편, (-)-에피갈로카테킨 갈레이트((-)-epigallocatechin gallate : EGCG)는 차과(茶科)에 속하는 차나무에 함유되어 있는 여러 활성 성분 중 폴리페놀(polyphenol)류의 일종으로, 가장 활성도가 높은 주요 성분이며 녹차의 효과를 주로 담당하는 물질로 알려져 있다. 이러한 EGCG는 구조상 두 개의 트리페놀기(triphenolic group)을 가지고 있는데 이 구조가 강력한 약리 작용을 담당하는 것으로 알려져 있다(Matsuo,N. et al., Allergy, 52(1997) 58-64). 이러한 EGCG의 약리작용은 주로 강력한 항산화 작용(Guo.G. et al., Biochim. Biophys, Acta, 1304(1996) 210-222), 항균 및 항 돌연변이 작용이 알려져 있다.

또한, 대한민국 공개 특허 제10-2005-45770호에는 EGCG를 MMP-9 발현과 파골세포형성을 억제하는 데 사용할 수 있음을 개시하고 있고, 대한민국 공개 특허 제10-2002-55735호에는 일과성 전뇌허혈에 대한 신경세포 손상 예방 또는 치료제로서 EGCG를 사용하는 것에 대해 개시하고 있으며, 대한민국 등록 특허 제10-540369호에는 EGCG를 아세틸콜린에스터라제 저해제로 사용하는 것에 대해 개시하고 있으며, 대한민국 등록 특허 제10-601080호에는 EGCG를 유효성분으로 하는 류마티스 관절염 치료제에 대해 개시하고 있다. 뿐만 아니라 대한민국 등록 특허 제10-449228호에는 니코틴산류와 EGCG를 반응시켜 제조한 EGCG의 유도체를 사용한 화장료 조성물에 대해서도 개시하고 있는 등, EGCG는 매우 다양한 분야에서 다양한 용도로 사용됨이 공지되어 있다. 그러나, 이러한 선행 문헌 모두 EGCG가 트란스글루타미나제를 억제하는 활성을 가지고 있어 그 억제제로서 트란스글루타미나제가 관련된 질환에 사용될 수 있음에 대해서는 전혀 개시하고 있지 않고 있다.

이에 본 발명자는 이미 안전성이 인정되어 상용화되고 있는 천연물질들 중에서 트란스글루타미나제 억제제로서 유용한 물질들을 스크리닝 한 결과, EGCG의 트란스글루타미나제 억제제로서의 활성을 새로이 발견하여 본 발명에 이르게 되었다.

본 발명의 목적은 EGCG를 포함하는 것을 특징으로 하는 트란스글루타미나제 억제제를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 활성 성분으로 EGCG를 사용하는 것을 특징으로 하는 트란스글루타미나제의 억제방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 EGCG를 포함하는 트란스글루타미나제 활성의 증가에 의해 초래되는 질병을 치료하기 위한 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 EGCG를 사용하여 트란스글루타미나제 활성의 증가에 의해 초래되는 질병을 치료하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 일 양태로서, 본 발명은 EGCG를 포함하는 트란스글루타미나제 억제제와 활성 성분으로 EGCG를 사용하여 트란스글루타미나제의 활성을 억제하는 방법에 관한 것이다.

에피갈로카테킨 갈레이트(epigallocatechin gallate, EGCG)는 상기에서 언급한 바와 같이 대부분 차나무 등에 존재하며, 그 분자식은 C₂₂H₁₈O₁₁이고, [2R, 3R]-2-[3,4,5-트리하이드록시페닐]-3,4-디하이드로-1[2H]-벤조피란-3,5,7-트리올 3-[3,4,5-트리하이드록시벤조에이트]로서 명명되며 하기 화학식 1과 같은 구조를 가진다.

본 발명에서 사용되는 EGCG는 녹차 등의 천연물에서 유래된 것을 사용할 수 있는데 이는 공지의 방법으로 추출 및 분리 정제하여 수득될 수 있다. 종래 다공성 극성 충진제에 의한 방법, HPLC를 사용하는 방법, 카페인을 첨가하여 분리하는 방법, 폴리아미드 충전제를 이용하는 방법, 전자이동을 사용하는 방법 등 다양한 EGCG의 제조방법(미국 공고 특허 제US4613672호(대한민국 공개 특허 제10-2001-50080호, N.S.Kumar et al., J. Chromatogr. A 1083(2005) 223-228, D. Labbe et al., Journal of Membrane Science 254(2005) 101-109 및 J.I.Kim et al., J. Chromatogr. A 949(2002) 275-280 등)이 알려져 있으며, 본 발명에서 사용되는 EGCG는 이러한 공지의 방법을 당업자가 적절히 선택하여 제조할 수 있다. 또한 이러한 EGCG는 직접 제조하는 외에 시판품의 사용이 가능하다.

또한, EGCG는 불안정하며, 친수성으로 인해 필요에 따라 그 효능은 유지하면서 안정화시킬 수도 있다. 이러한 안정화의 방법으로 고분자를 이용한 포접과 같은 물리적인 방법과, 보다 안정한 유도체로의 변형을 통한 화학적 방법이 당해 기술 분야에 잘 알려져 있다. 특히, 화학적인 방법은 안정화 및 용해도의 개선을 동시에 이룰 수 있어 많이 연구되어 왔으며, 구체적인 예로는 EGCG의 8개의 하이드록시기를 전체 또는 부분적으로 알킬기나 아실기로 치환시킬 수 있다. 따라서, 본 발명에 사용되는 EGCG는 천연에서 추출 및 분리 정제된 EGCG 자체뿐만 아니라, 상기 방법에 의해 보다 안정화시킨 EGCG 유도체를 포함한다.

본 발명의 구체적인 일 실시예에서, 본 발명자는 트란스글루타미나제가 [1,4,-¹⁴C] 푸트레신(putrescine)을 숙시닐레이티트 카제인에 결합시키는 것을 측정하여, EGCG가 푸트레신과 경쟁하여 그 반응을 억제하는 것을 관찰하였다. in vitro에서 ¹⁴C로 표지된 푸트레신을 숙시닐레이티드 카제인과 결합시키는 트란스글루타미나제의 반응에 EGCG를 첨가하였을 때, 트란스글루타미나제의 활성은 EGCG의 농도가 증가할수록 감소되었다(도 1). 따라서, EGCG가 트란스글루타미나제의 억제제임을 알 수 있으며, 트란스글루타미나제가 과발현될 때 EGCG를 사용하여 증가된 트란스글루타미나제의 활성을 줄일 수 있음을 알 수 있다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 EGCG를 포함하는, 트란스글루타미나제의 활성의 증가에 의한 질병을 예방, 치료하기 위한 약제학적 조성물과 EGCG를 사용하여 상기 질병을 치료하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에서 용어 "예방"이란 EGCG를 포함하는 조성물의 투여로 트란스글루타미나제의 활성의 증가로 인한 모든 질병의 발병을 억제시키거나 발병을 지연하는 모든 행위를 말하며, "치료"란 상기 약제학적 조성물의 투여로 트란스글루타미나제의 활성의 증가로 인한 모든 질병을 호전시키거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에서 트란스글루타미나제 활성의 증가에 의한 질병은 트란스글루타미나제가 과발현되는 등 그 활성이 증가되어 초래되는 모든 질병을 포함하나, 구체적으로는 염증질환, 신경계질환과 암을 포함한다.

트란스글루타미나제 펩타이드 억제제는 트란스글루타미나제가 비정상적 활성화되어 유발되는 모든 질환을 예방 및 치료할 수 있다. 보다 구체적으로는 비정상적 트란스글루타미나제의 활성이 확인되는 신경계 질환 또는 암을 예방 또는 치료할 수 있다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기의 펩타이드를 하나 이상 포함하는 트란스글루타미나제 억제용 조성물에 관한 것이다.

신경계질환의 경우, 신경 세포의 사망 또는 손상과 관련되는 질환으로, 특히알츠하이머 질환, 다경색 치매, 알츠하이머 질환과 다경색 치매의 혼합형, 파킨슨씨 질환, 저갑상선증, 알코올성 치매 알츠하이머, 헌팅턴 병 등의 중추신경계 세포의 손상 및 사망에 따른 중추신경계 질환이 대표적이다. 이런 질병의 주요증상은 인지 기능 장애와 언어, 판단, 추상력, 공간시간적 증력 및 기타 새로운 기술 습득의 장애 등을 포함하며, 성격변화, 정서적 불안정 등의 증세가 나타나며 종국적으로는 사망에 이르게 된다. 이 중 본 발명의 약제학적 조성물은 신경 조직에서 트란스글루타미나제가 과발현되는 등 그 활성이 증가된 질병에 쓰일 수 있는데, 구체적으로는 뇌에서 트란스글루타미나제가 과발현되는 헌팅턴 병(Nature Medicine, Vol 8. Number 2 , February 2002 pp143-149), 소뇌와 대뇌 피질에서 트란스글루타미나제가 과발현되는 알츠하이머병(The Journal of Biological Chemistry, Vol. 274. No. 43. Issue Of October 22, pp 30715-30721), α 시누클레인(α synuclein)이 트란스글루타미나제에 의해 응집되는 파킨슨씨 병(PNAS, February 18,2003, Vol. 100, no.4, pp2047-2052) 등에 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 신경조직에서 트란스글루타미나제가 과발현되는 모든 질병의 치료에 사용될 수 있다.

암의 경우, 암의 전이, 화학적 내성, 방사성 내성을 가지는 암에서 트란스글루타미나제의 현저한 발현 증가가 확인되면서, 트란스글루타미나제의 억제는 암 예방 및 치료 측면에서도 중요하다. 본 발명의 EGCG를 포함하는 약제학적 조성물을 사용하여 예방 또는 치료될 수 있는 구체적 암은 트란스글루타미나제의 증가가 나타나는 암, 구체적으로는 대장암, 소장암, 직장암, 항문암, 식도암, 췌장암, 위암, 신장암, 자궁암, 유방암, 폐암, 임파선암, 갑상선암, 전립선암, 백혈병, 피부암, 결장암, 뇌종양, 방광암, 난소암, 담낭암 등을 포함하고, 이에 제한되지는 않는다.

본 발명의 EGCG를 포함하는 조성물 및 치료방법은 인간뿐만 아니라 트란스글루타미나제 활성의 증가로 인한 질병이 발병할 수 있는 소, 말, 양, 돼지, 염소, 낙타, 영양, 개, 고양이 등의 포유동물에게도 사용될 수 있다.

본 발명의 EGCG를 포함하는 약제학적 조성물은 단일제로도 사용할 수 있으며, 공인된 약학 조성물을 포함하여 복합제로 제조하여 사용할 수도 있다.

EGCG를 포함하는 약제학적 조성물은 EGCG를 캡슐에 부형제 없이 충전하거나 미립된 고체 담체, 액체 담체 또는 그 양자와 균일하게 충분히 접촉시켜 제조될 수 있다. 그 후에 필요한 경우 생성물을 바람직한 제제로 성형하여 사용할 수 있다. 적합한 담체 부형제의 예로서 전분, 물, 식염수, 에탄올, 글리세롤, 링거액 및 덱스트로스 용액 등을 들 수 있으며, 문헌(Remington`s Pharmaceutical Science, 19^thEd., 1995, Mack Publishing Company, Easton PA)등에 개시되어 있는 바에 따라 당해 기술 분야에 알려진 적합한 제제로 제제화할 수 있다.

본 발명의 EGCG를 포함하는 약제학적 조성물은 클로로제닉산을 유효성분으로 포함하는 어떠한 제형으로도 적용가능하며, 경구용 또는 비경구용으로도 제조할 수 있다. 비경구용 제형으로는 주사용, 도포용, 에어로졸 등의 스프레이 형일 수 있으며, 바람직하게는 주사용 또는 에어로졸 등의 스프레이 형태이고, 경구용 제형 또한 바람직하다.

본 발명의 약제학적 조성물을 포함하는 경구 투여용 제형으로는, 예를 들어 정제, 트로키제, 로렌지, 수용성 또는 유성현탁액, 조제분말 또는 과립, 에멀젼, 하드 또는 소프트 캡슐, 시럽 또는 엘릭시르제로 제제화 될 수 있다. 정제 및 캡슐 등의 제형으로 제제하기 위하여, 락토오스, 사카로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아밀로펙틴, 셀룰로오스 또는 젤라틴과 같은 결합제, 디칼슘 포스페이트와 같은 부형제, 옥수수 전분 또는 고구마 전분과 같은 붕괴제, 스테아르산 마스네슘, 스테아르산 칼슘, 스테아릴푸마르산 나트륨 또는 폴리에틸렌글리콜 왁스와 같은 윤활유, 수크로오스 또는 사카린과 같은 감미제 및 페퍼민트, 메틸 살리실산염 또는 과일향과 같은 향미제를 포함할 수 있으며, 캡슐 제형의 경우 상기 언급한 물질 외에도 폴리에틸렌 글리콜 또는 지방유와 같은 액체 담체를 더 함유할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물을 비경구로 투여하는 경우, 비경구 투여는 피하주사, 정맥주사 또는 근육내 주사 등의 주사용 형태, 좌제 주입방식 또는 호흡기를 통하여 흡입이 가능하도록 하는 에어로졸제 등 스프레이용으로 제제화할 수 있다. 주사용 제형으로 제제화하기 위해서는 안정제 또는 완충제와 함께 물에서 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고, 이를 앰플 또는 바이알의 단위 투여용으로 제제화한다. 좌제로 주입하기 위해서는, 코코아버터 또는 다른 글리세라이드 등 통상의 좌약 베이스를 포함하는 좌약 또는 체료 관장제와 같은 직장투여용 조성물로 제제화 할 수 있다. 에어로졸제 등의 스프레이용으로 제형화하는 경우, 수분산된 농축물 또는 습윤 분말이 분산되도록 추진제 등이 첨가제와 함께 배합될 수 있다.

전술한 약제학적으로 허용되는 보조제 또는 담체로는 약제학적으로 순수하고, 실질적으로 무독성이며, 활성 성분의 작용을 저해하지 않는 임의의 모든 보조 제 또는 담체를 사용할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 직장, 국소, 정맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 경피, 비측내, 흡입, 안구 내 또는 피내경로를 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있다. 비경구 투여는 정맥내, 근육내, 복강내, 흉골내, 경피 및 동맥내 주사 및 주입을 포함하는 투여 방식을 의미한다. 본 발명의 EGCG를 포함하는 약제학적 조성물의 비경구 투여는 바람직한 순도 하에 약제학적으로 허용가능한 담체, 즉 사용되는 농도와 투여량에서 수용체에게 비독성이고 다른 제제 성분과 화합할 수 있는 담체와 혼합하여 단위 투여량의 제형으로 조제하는 것이 바람직하다. 특히 제제는 산화제 및 인체에 유해한 것으로 알려진 기타 다른 화합물을 포함하지 않는 것이 바람직하다.

본 발명의 EGCG는 1 종 이상의 약제학적으로 허용가능한 부형제와 함께 약제학적 조성물로 투여될 수 있다. 인간 환자에게 투여되는 경우, 본 발명의 약제학적 조성물의 총 1일 사용량은 올바른 의학적 판단범위 내에서 처치의에 의해 결정될 수 있다는 것은 당업자에게 자명한 일이다. 특정 환자에 대한 구체적인 치료적 유효량은 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 경우에 따라 다른 제제가 사용되는지의 여부를 비롯한 구체적 조성물, 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료 기간, 구체적 조성물과 함께 사용되거나 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유 사 인자에 따라 다르게 적용하는 것이 바람직하다. 당해 기술 분야에 알려진 적합한 제제는 문헌 (Remington`s Pharmaceutical Science, 19^thEd., 1995, Mack Publishing Company, Easton PA) 에 기재되어 있다. 따라서 본 발명의 목적에 적합한 EGCG의 유효량은 전술한 사항을 고려하여 결정하는 것이 바람직하다. 본 발명의 약제학적 조성물은 EGCG의 유효량으로 1 내지 2000mg로 투여 가능하다.

이하, 본 발명을 하기 실시예를 참조하여 구체적으로 설명한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되지는 않는다.

실시예 1: 트란스글루타미나제 활성도 억제 in vitro 시험

트란스글루타미나제가 [1,4,-¹⁴C] 푸트레신을 숙시닐레이티드 카제인에 결합시키는 것을 측정하여, EGCG가 푸트레신과 경쟁하여 그 반응을 억제하는 것을 관찰하였다.

숙시닐화된 카제인은 Calbiochem(Cat. No. 573464)로부터 구입하고, 상기 분말 1g을 5mM DTT를 포함하는 반응 완충용액 50ml(0.1M Tris-acetate(pH 8.0), 10mM CaCl2, 0.15M NaCl, 1.0mM EDTA)에 용해시켰다. 이 용액은 사용 전에 Deep freezer에 보관한다. [1,4-¹⁴C] 푸트레신 디하이드로클로라이드는 GE Healthcare(Cat. No. CFA301)로부터 구입했고 그 스톡 용액(stock solution)을 방사선적 용량(radiological dosage)이 5μCi/ml에 달할 때까지 증류수로 희석하였다. 트란스글루타미나제 2는 Sigma-Aldrich(Cat. No.T5398)로부터 구입했고 최종 농도가 1 unit/ml가 되게 증류수로 희석했다. EGCG의 스톡 용액은 EGCG(Sigma-Aldrich, Cat. No. E4143)을 DMSO에 10mM 농도로 녹여 제조한 후, DMSO를 사용하여 이를 희석하여 각각의 농도로 제조하였다.

기질 용액은 450μl의 숙시닐화된 카제인 용액 및 [1,4-¹⁴C] 푸트레신 디하이드로클로라이드 용액 50μl를 혼합하여 제조하였다. 각 샘플을 96μl의 반응 완충액, 3μl의 EGCG의 스톡 용액 및 1μl의 트란스글루타미나제 스톡 용액을 혼합하여 제조하였다. 10분 동안 37℃에서 샘플을 인큐베이션 한 후에, 기질 용액β 500μl 및 샘플 용액 100μl을 잘 혼합하였고, 이들 혼합물을 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션 하였다. 4.5ml의 차가운(4℃) 7.5% TCA를 부가하여 반응을 정지시키고 전체 용액을 1시간 동안 4℃에서 보관하였다. TCA-단백질 침전물을 GF/유리섬유 필터로 여과하여 차가운 5% TCA 25ml로 세척하고 건조하였다. 가교된 단백질의 방사능을 베타(β)-카운터(Beckman Coulter)로 측정하고 표준으로서 DMSO-대조군의 활성을 가지고 보정하였다. 측정된 수치를 트란스글루타미나제의 활성으로 나타내었다. 동일한 조건 하에서 이러한 어세이를 세 번 반복하였으며 그 값은 하기 표 1에 나타낸 바와 같다.

농도	어세이 1	어세이 2	어세이 3	평균	SD(표준편차)
0.0μM	1.0000	1.0000	1.0000	1.0000	0.0000
0.5μM	0.5166	0.5690	0.5295	0.5383	0.0273
1.0μM	0.3950	0.3873	0.3207	0.3677	0.0408
2.0μM	0.2009	0.2288	0.1707	0.2001	0.0291
3.0μM	0.1911	0.1902	0.1482	0.1765	0.0245
5.0μM	0.1246	0.0947	0.1000	0.1064	0.0159
10.0μM	0.1029	0.0726	0.0881	0.0879	0.0152
50.0μM	0.0861	0.0903	0.0849	0.0871	0.0028

또한, 그 평균값을 EGCG의 농도에 대하여 도시하였다. IC₅₀ 수치는 일반 비선형 회귀법에 의해 계산되었으며 이는 0.5169(±0.0298)μM로 결정되었다.

EGCG의 농도에 따라 측정된 상대적인 트란스글루타미나제 억제 활성을 도 1에 나타내었다. 도 1에서 나타난 바와 같이, 트란스글루타미나제의 활성은 EGCG의 농도에 의존적으로 억제되는 것을 알 수 있다.

본 발명에 따르면, EGCG를 활성 성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 트란스글루타미나제 억제제 및 트란스글루타미나제의 억제 방법을 제공할 수 있다.

본 발명에 따른 EGCG를 이용하여 트란스글루타미나제를 억제하는 신규한 방법은 트란스글루타미나제가 이상 발현되는 질환을 가진 대상에게 안정한 방법으로 부작용없이 용이하게 적용되어 트란스글루타미나제를 억제하는 효과를 얻을 수 있다.

Claims

에피갈로카테킨 갈레이트(EGCG) 또는 그의 유도체를 포함하는 트란스글루타미나제 억제제.
EGCG 또는 그의 유도체를 사용하여 트란스글루타미나제의 활성을 억제하는 방법.
EGCG 또는 그의 유도체를 포함하는, 트란스글루타미나제의 활성 증가에 의해 초래되는 질병을 치료 또는 예방하기 위한 약제학적 조성물.
제 3항에 있어서, 상기 질병은 신경계 질환 또는 암임을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제 4항에 있어서, 신경계 질환은 알츠하이머 병, 헌팅턴 병 및 파킨슨 병으로 구성되는 군으로부터 선택되는 질환인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
EGCG, 그의 유도체 및 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항의 약제학적 조성물로 구성되는 군으로부터 선택되는 물질을 투여하는 것을 포함하는, 트란스글루타미나제의 활성 증가에 의해 초래되는 질병의 치료 또는 예방 방법.
제 6항에 있어서, 상기 질병은 신경계질환 또는 암임을 특징으로 하는 방법.
제 7항에 있어서, 신경계 질환은 알츠하이머 병, 헌팅턴 병 및 파킨슨 병으로 구성되는 군으로부터 선택되는 질환인 것을 특징으로 하는 방법.